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WO1998010073A1 - Procede et materiau de detection de champignons - Google Patents

Procede et materiau de detection de champignons Download PDF

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Publication number
WO1998010073A1
WO1998010073A1 PCT/JP1997/003164 JP9703164W WO9810073A1 WO 1998010073 A1 WO1998010073 A1 WO 1998010073A1 JP 9703164 W JP9703164 W JP 9703164W WO 9810073 A1 WO9810073 A1 WO 9810073A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
sequence
seq
bases
complementary
Prior art date
Application number
PCT/JP1997/003164
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Koji Yokoyama
Li Wang
Original Assignee
Ss Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ss Pharmaceutical Co., Ltd. filed Critical Ss Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority to EP97939226A priority Critical patent/EP0860503A4/en
Priority to KR1019980703458A priority patent/KR20000064350A/ko
Publication of WO1998010073A1 publication Critical patent/WO1998010073A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid for detection of various fungi and a method for detecting various fungi using the same.
  • the main pathogens of deep mycosis include Candida (hereinafter abbreviated as C.) ⁇ fungi, Aspergillus (hereinafter abbreviated as A.), Cryptococcus (hereinafter abbreviated as Cr.) Abbreviations.) Genus fungi are known.
  • the main pathogens of Candida are Candida albicans (G. albicans), Candida albicans (G. kefyr), Candida albicans (C. glabrata) Candida tropicalis (C. tropical is)
  • Cryptococcus' neoformans (Cr. Neoformans) is known.
  • the causative fungi of deep-seated mycosis include Aspergillus' A. fumigatus and A. flavus. ), A. niger and A. niger groups, A. niger urans, A. terreus, etc., and quickly detect and classify these strains. ⁇ It is desired to identify.
  • An object of the present invention is to provide a nucleic acid used for detecting a causative bacterium of deep mycosis, and also a fungus of Aspergillus ⁇ , and to use the nucleic acid in a simple, rapid, specific and highly sensitive manner. It is an object of the present invention to provide a method for detecting a fungus causing deep mycosis and a fungus belonging to the genus Aspergillus.
  • the inventors of the present invention have conducted various studies on the genes of various fungal pathogens, especially Aspergillus fungi, and found that the gene for cytochrome b present in the mitochondria of the fungi causing these various mycosis cases. And synthesized various nucleic acids in order to expand a part of the gene.
  • a primer capable of amplifying the fungal cytochrome b gene was searched from among these nucleic acids, and the nucleic acids of SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing were found. Then, using the nucleic acids of SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing, a part of the cytochrome b gene present in mitochondria of various fungi was amplified, and the sequence was successfully decoded.
  • the present invention relates to a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 57 in the sequence listing (however, thymine at any position may be substituted with peracyl) or at least a continuous nucleotide sequence complementary thereto.
  • a primer for amplifying a fungal mitochondrial cytochrome b gene fragment comprising a nucleic acid fragment having a base sequence of 10 bases.
  • the present invention relates to the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 3, 58 to 61 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with peracyl) or its complementary nucleotide sequence.
  • a primer for the width of a fungal mitochondrial cytochrome b gene fragment consisting of a nucleic acid fragment having a continuous nucleotide sequence of at least 10 bases.
  • the present invention relates to the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8 and 9 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with peracyl) or its complementary
  • SEQ ID NO: 5 Aspergillus fumigatus
  • SEQ ID NO: 6 for detecting Aspergillus flavus
  • Aspergillus' 2 Provided are nucleic acids for detection of ger (SEQ ID NO: 7), for detection of Aspergillus nidulans (SEQ ID NO: 8), and for detection of Aspergillus teleus (SEQ ID NO: 9).
  • the present invention relates to the sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, 24th claw, 9.9th T, 144th claw, 25 2nd C, 277 Gth, 3 0
  • a nucleic acid of at least 10 bases or a complementary sequence of the sequence shown in SEQ ID NO: 5 with the 4th G, 31 2nd A or 39 3rd G at the 3 'end
  • a nucleic acid for detecting Aspergillus fumigatus comprising a nucleic acid having at least 10 bases and having a 3 ′ end as the base to be used.
  • the present invention relates to a nucleic acid having at least 10 bases or more having Y at the 17th position of the sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing as a 3 'end, or a complementary sequence of the sequence shown in SEQ ID NO: 6
  • a nucleic acid for detection of Aspergillus 2 flavus comprising a nucleic acid having at least 10 bases or more and having a base corresponding to 3 ′ as a 3 ′ end.
  • the present invention relates to A and B of the sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, C and 12 A nucleic acid having at least 10 bases or more, with the 6th C, the 207th A, the 21st A, the 24th A or the 396th G as the 3 'end, or a SEQ ID NO. 7.
  • a nucleic acid for detecting Aspergillus niger comprising at least a 10- base or more nucleic acid having a base corresponding to the above of the sequence complementary to the sequence shown in 7 at the 3 ′ end.
  • the present invention relates to the 60th sequence, the 22nd C, the 271st A, the 285th A, the 366th T, or the 60th sequence of the sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
  • the 3A at the 3 'end is the 3' end
  • the nucleic acid of at least 10 bases or the complementary base of the sequence shown in SEQ ID NO: 8 is the 3 'end
  • the 3' end is at least 10 bases or more
  • the present invention provides a nucleic acid for detecting Aspergillus transdrans comprising the nucleic acid of (1).
  • the present invention relates to the 25th claw, the 48th claw, the 16th second claw, the 25th C, the 26th C, and the 3rd C of the sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.
  • a nucleic acid for detecting Aspergillus perureus comprising a nucleic acid having at least 10 bases or more and having a base corresponding to the above of the complementary sequence at the 3 ′ end.
  • the present invention provides a method for preparing a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOS: 1, 2 and 57 in the sequence listing (wherein thymine at any position may be substituted with peracyl). And a forward primer consisting of at least one of the nucleic acid fragments having the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 11 to 15 and 62 to 65 (however, thymine at any position is replaced with peracyl) And a reverse primer consisting of at least one of a nucleic acid fragment having a base sequence consisting of at least 10 contiguous bases of the complementary base sequence of It is intended to provide a method for detecting and / or identifying a Riaspergillus fungus by expanding a cytochrome b gene fragment of a fungus belonging to the genus Aspergillus.
  • the present invention comprises at least 10 contiguous bases in the base sequence shown in SEQ ID NOs: 66 to 75 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with peracyl).
  • a forward primer consisting of at least one of the nucleic acid fragments having a base sequence and the base sequence shown in SEQ ID NOs: 3, 4, 58 to 61 (provided that thymine at any position is substituted with peracyl.
  • a reverse primer consisting of at least one of a nucleic acid fragment having at least 10 contiguous base sequences among the complementary base sequences of the R. sp.
  • the present invention relates to a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOS: 1, 2 and 57 in the sequence listing (wherein thymine at any position may be substituted with peracyl).
  • a forward primer comprising at least one of a nucleic acid fragment having a nucleotide sequence consisting of: and a nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 3, 4, 58 to 61 (provided that thymine at any position is replaced with peracyl)
  • a reverse primer comprising at least one of nucleic acid fragments having at least 10 contiguous nucleotides among the complementary nucleotide sequences of the fungal cytochrome b gene by a gene amplification method.
  • a method for detecting a fungus by amplifying a fragment is provided.
  • the nucleic acid of the present invention can be used as a primer for an amplification reaction or as a probe for direct detection.
  • the sensitivity and specificity can be further increased by detecting the product that has been added to the primer with a probe or restriction enzyme, and its clinical significance is great.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an electrophoresis pattern obtained by subjecting the mitochondrial cytochrome b gene of various fungi to amplification by PCR using various primers of Examples of the present invention and subjecting the amplified product to electrophoresis.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an electrophoresis pattern obtained by subjecting the mitochondrial cytochrome b gene of various fungi to amplification by PCR using various primers of Examples of the present invention and subjecting the amplified product to electrophoresis.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of an electrophoresis pattern obtained by amplifying the cytochrome b gene of mitochondria of various fungi by PCR using various primers of another embodiment of the present invention and subjecting the amplified product to electrophoresis. is there.
  • FIG. 3 shows that the mitochondrial cytochrome b gene of various fungi was amplified by PCR using various primers according to still another embodiment of the present invention, and the amplified product was subjected to electrophoresis. It is a schematic diagram of the electrophoresis pattern obtained by performing.
  • FIG. 4 shows that the mitochondrial cytochrome b gene of various fungi was re-amplified by PCR using various primers of still another example of the present invention, and the amplified product was obtained by electrophoresis.
  • FIG. 3 is a schematic view of an electrophoresis pattern.
  • the fungal mitochondrial A cytochrome b gene fragment can be amplified.
  • those described in SEQ ID NOs: 1, 2, and 4 correspond to the mitochondrial cytochrome b gene sequence of Aspergillus nidulans (Warng, RB et al., Cell 27, 4-111).
  • nucleic acids having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 57, 3, 58 to 61 (the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 57, 3, 58 to 61 are represented by the general formula).
  • the nucleic acids shown in each of the SEQ ID NOs may be used alone, it is preferable to use each as a mixture.
  • mitochondria of fungi other than Aspergillus fungi excluding A. sp.
  • nucleic acids having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 57, 3, 58 to 61 can be used as primers as long as they have at least 10 consecutive nucleotides or more. However, it is preferable to have the entire sequence shown in each SEQ ID NO.
  • Mitochondrial cytochrome b gene fragments of many strains of various fungi were amplified using the various nucleic acids as primers, and their nucleotide sequences were determined. ⁇ ⁇ The nucleotide sequences common to each fungal species of the broadened DNA fragments are shown in SEQ ID NOS: 5 to 9. The sequence shown in SEQ ID NO: 5 is Aspergillus ⁇ derived from Fumigatus, SEQ ID NO: No.
  • SEQ ID NO: 6 is from Aspergillus flavus
  • SEQ ID NO: 7 is from Aspergillus niger
  • SEQ ID NO: 8 is from Aspergillus nidulans
  • SEQ ID NO: 9 is from Aspergillus This is the sequence of the amplified DNA fragment.
  • nucleic acid amplification can be further performed using primers specific to each fungal species described below.
  • primer amplification products can be detected by fragmenting these amplification products with restriction enzymes and comparing the production patterns of the fragments (PCR-RFLP).
  • nucleic acids having a sequence consisting of arbitrary 100 to 100 bases, preferably 15 to 30 bases, of these amplified fragments may be used as nucleic acids for detecting each of the above-described fungal species. it can.
  • the nucleic acid for detection includes primers and probes for nucleic acid amplification. When used as a probe, a nucleic acid labeled by a well-known method is used.
  • the present inventors performed gene amplification for a large number of strains of fungi belonging to the genus Aspergillus as described above, determined their nucleotide sequences, and determined their sequences. Careful comparisons revealed specific sites for each species.
  • These specific sites include, for example, Aspergillus fumigatus in the sequence shown in SEQ ID NO: 5 at the 24th place, 99th T, 144th ⁇ , 252th C, 277
  • a at position 42, C at position 69, C at position 126, A at position 207, A at position 213, A at position 246, and G at position 396 are shown in SEQ ID NO: 8 for Aspergillus nidrans.
  • the 60th T, the 221st C, the 271st A, the 285th A, the 366th T, and the 387th ⁇ are the sequences shown in SEQ ID NO: 9 for Aspergillus Pereus.
  • the 25th, 48th, 162nd, 225th, 261st, 339th, 360 Eye A, 375-th A, 41 1 th A is equivalent.
  • These specific sites also exist as complementary bases in the complementary sequences of the sequences shown in SEQ ID NOS: 5 to 9.
  • These specific sites (1 base ) Is used as a primer for nucleic acid amplification, only the mitochondrial cytochrome b gene fragment of each species is amplified, and therefore, each species is specifically detected.
  • Examples of the base sequence are shown in SEQ ID NOs: 10 to 15 and 62 to 65 in the sequence listing. These are oligonucleotides having a 3 'end at any of the above specific sites in the complementary sequence of the sequences shown in SEQ ID NOS: 5 to 9, and are nucleic acids having at least 10 bases or more.
  • nucleic acid having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOS: 10 and 65 (both having the 3 'end as the C paired with the 304 G of SEQ ID NO: 5 and the complementary strand of SEQ ID NO: 5) is Aspergillus 'For detection of fumigatus, SEQ ID NOS: 11 and 12 (both G or A paired with the 17th Y (C or T) of SEQ ID NO.
  • the nucleic acid having the nucleotide sequence shown in each of (6 complementary strands) is for detection of Aspergillus flavus, and SEQ ID NO: 13 (G corresponding to C at position 126 of SEQ ID NO: 7 is the 3 ′ end, The nucleic acid having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7) and SEQ ID NO: 64 (complementary strand of SEQ ID NO: 7 having a 3 'end at T corresponding to A at position 207 of SEQ ID NO: 7) Aspergillus 'for detecting niger, SEQ ID NO: 14 (G corresponding to C at position 22 of SEQ ID NO: 8 is 3' The complementary strand of SEQ ID NO: 8) and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 63 (the complementary strand of SEQ ID NO: 8 having a 3 ′ end at T corresponding to the 27th A of SEQ ID NO: 8)
  • the nucleic acid is used for detection of Aspergillus
  • nucleic acid having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, 4, 58, 59, 60 and / or 6 "I (used as a reverse primer) and the above-described specific site (one salt ) can be combined with an oligonucleotide (used as a forward primer) having a 3 ′ end to design a nucleic acid amplification primer capable of identifying species.
  • the Aspergillus flavus has the following sequence: Aspergillus niger contains at least the 10'-terminal oligonucleotide at the 3 'end, and A. 69, C, 126, and 207 in the sequence shown in SEQ ID NO: 7 from Aspergillus niger.
  • SEQ ID NOs: 66 to 75 Examples of preferred sequences used as these forward primers are shown in SEQ ID NOs: 66 to 75.
  • the nucleic acid having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 66 and 67 (both 17 (4) Y (C or T) in SEQ ID NO: 6 is the 3 'end) is for detecting Aspergillus'flavus;
  • the base sequences shown in SEQ ID NO: 6 (the G at the 304th position of SEQ ID NO: 5 as the 3 'end) and SEQ ID NO: 69 (the 3'I of the SEQ ID NO: 5 as the 3' end)
  • the nucleic acids used were for detection of Aspergillus fumigatus;
  • SEQ ID NO: 71 A at position 113 of SEQ ID NO: 7) Is used for detection of Aspergillus niger
  • these oligonucleotides can be used not only as primers but also as probes specific to each species with appropriate knowledge.
  • the above nucleic acid used as a primer or a probe can be used as a primer or a probe as long as it is at least 10 bases continuous from the 3 ′ end.
  • the number of bases of the nucleic acid is preferably from 10 bases to 100 bases, and particularly preferably "! 5 bases to 30 bases. Also shown in SEQ ID NOs: 10 to 15 and 62 to 75 The sequence preferably has the entire base sequence of these sequences.
  • the thymine (T) in the nucleotide sequence shown in each SEQ ID NO of the nucleic acid of the present invention may be peracil (U). That is, the nucleic acid of the present invention includes both deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA). Further, the nucleic acid of the present invention may be a DNA containing a peridine residue in which T at any position in the base sequence is U, or a thymidine in which U at any position is T in the same manner. It may be RNA containing residues. Furthermore, the complementary strand of each nucleic acid is also included in the scope of the present invention.
  • each nucleic acid can also hybridize to the complementary strand of the strand to which each nucleic acid hybridizes.
  • point mutations such as deletion, insertion or substitution, or modified nucleotides may be present in the nucleic acid, and these are also within the scope of the present invention. included.
  • the method for obtaining the nucleic acid of the present invention is not particularly limited.
  • it is a chemical synthesis, whereby a nucleic acid of constant quality can be obtained easily, in large quantities and at low cost.
  • Such chemical synthesis can be performed according to a conventional method such as a phosphite method (phosphoramidite method) or a phosphotriester method (phosphate triester method).
  • the detection / classification / identification method of the fungus of the genus Aspergillus of the present invention is a detection / classification / identification method characterized by using the detection / classification / identification nucleic acid of Aspergillus urine fungus.
  • This method includes (1) a method for detecting, classifying and identifying Aspergillus fungi using the nucleic acid as a probe, or (2) PCR using the nucleic acid as a primer and the like.
  • a method for detecting, classifying, and identifying fungi belonging to the genus Aspergillus by measuring an amplified primer extension product by performing an extension reaction.
  • the nucleic acid used in these detection methods may be a so-called labeled nucleic acid into which a labeling agent has been introduced.
  • the nucleic acid is a labeling nucleic acid.
  • the labeling agent include an antigen, a hapten, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, an enzyme substrate, a radioactive substance, and an insoluble carrier. Labeling may be performed at the end of a nucleic acid or in the middle of a nucleic acid sequence.
  • the labeling agent may be bound to any of the nucleotide sugar, phosphate group and base moiety.
  • the following (1) and (2) are examples of methods for detecting, classifying and identifying Aspergillus fungi using the nucleic acid for detection / classification / identification of Aspergillus fungi of the present invention as a probe or primer.
  • a nucleic acid for detecting / classifying / identifying Aspergillus fungi of the present invention is used as a probe, the nucleic acid probe is hybridized with the sample, and then the sample in the sample is detected using the probe as an index. .
  • This detection method uses the labeled nucleic acid as a probe, hybridizes the Aspergillus fungal gene in a test sample with the labeled probe, and then binds or unbinds the labeled probe with the Aspergillus fungal gene and the labeled probe. Can be detected by an appropriate detection method suitable for the labeling agent.
  • Hybridization of a sample i.e., the Aspergillus fungal gene in a test sample with a probe is performed by pretreating and purifying the sample by a usual method to obtain a test sample, mixing it with a labeled nucleic acid as a probe, and increasing the temperature from room temperature to 70%. This can be achieved by treating at 10 ° C for 10 minutes to 48 hours.
  • the sample may be subjected to an amplification reaction in advance using the nucleic acid of the present invention as a primer.
  • nucleic acid for detection of a fungus of the genus Aspergillus of the present invention is an extension reaction using DNA polymerase or the like is performed to specifically amplify only the cytochrome b gene fragment of the fungus of the genus Aspergillus. Measure product This is a method for detecting, classifying, and identifying fungi belonging to the genus Aspergillus.
  • a labeled nucleic acid obtained by labeling the nucleic acid of the present invention with a discriminating agent as described above may be used as a primer.
  • the gene amplification method used here specifically,
  • the PCR method is exemplified, but the method is not particularly limited. Any gene amplification method using a short-chain oligonucleotide as a primer to start gene synthesis can be used.
  • the method for detecting a fungus of the genus Aspergillus of the present invention can be performed by detecting a broad product, ie, a cytochrome b gene fragment, which has been broadened according to the above method. Alternatively, it can also be performed by fragmenting the amplified cytochrome b gene fragment with a restriction enzyme and comparing the production patterns of the fragment.
  • the restriction enzymes used here are used alone or in combination.
  • the means for detecting the broadened cytochrome b gene fragment or the gene fragment further fragmented with a restriction enzyme is not particularly limited, and ordinary gene detection methods (eg, electrophoresis) can be used.
  • the width product is fractionated, for example, by electrophoresis and can be easily detected as a specific and sufficiently sharp band for detection.
  • fractionation is performed by electrophoresis.
  • the detected bands are located at different molecular weight positions for each pathogenic fungus.
  • the primers should be designed so that is detected and the pathogenic fungi are classified and identified.
  • the primer also converts deoxyribonucleotides (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) or ribonucleotides (ATP, UTP, GTP, CTP) identified with an appropriate labeling agent into DMA or RNA.
  • dATP deoxyribonucleotides
  • dGTP dGTP
  • dCTP ribonucleotides
  • ATP UTP, GTP, CTP
  • the labeling agent used for the identification is preferably a radioactive substance, a fluorescent substance, a luminescent substance, a luminescence inducing substance or the like.
  • SEQ ID NO: 2 nucleic acid and SEQ ID NO: 10 to 15 nucleic acid
  • a nucleic acid elongation reaction such as PCR is performed using the above mixture as a primer, Aspergillus ⁇
  • Fumigatus is present, a nucleic acid having a length of 323 base pairs is amplified, and Aspergillus flavus is present.
  • nucleic acid with a length of 244 base pairs is amplified, and in the presence of Aspergillus perus, a nucleic acid with a length of 379 base pairs is amplified.
  • nucleic acid extension reaction such as PCR is performed using a mixture of the nucleic acid of SEQ ID NO: 2 and the nucleic acids of SEQ ID NOs: 62 to 65 in the sequence listing as primers
  • Aspergillus fumigatus 32
  • Aspergillus flavus 32
  • a 193-base pair or 194 bp-long nucleic acid is present, and Aspergillus' niger is present.
  • nucleic acid with a length of 2 31 base pairs is Aspergillus
  • a nucleic acid with a length of 294 base pairs is present if 2ndrance is present
  • a nucleic acid with a length of 34 base pairs is 37 if the nucleic acid is Aspergillus teleus is present.
  • Nucleic acids of 9 base pairs in length are each amplified.
  • nucleic acid extension reaction such as PCR is performed using a mixture of the nucleic acid of SEQ ID NO: 57 (mixture) and the nucleic acid of SEQ ID NOs: 62 to 65 as primers, if Aspergillus fumigatus is present, 3
  • a nucleic acid with a length of 30 base pairs is amplified and Aspergillus flavus is present, a nucleic acid with a length of 194 base pairs or 195 base pairs is present, and Aspergillus niger is present.
  • a nucleic acid with a length of 2 32 base pairs is Aspergillus.
  • nucleic acid with a length of 95 base pairs is present. Nucleic acids with a length of 80 base pairs are each extended.
  • a nucleic acid elongation reaction such as PCR is carried out using primers of SEQ ID NOs: 3, 58, 59, 60 and / or 61 (each sequence is a mixture) and a nucleic acid of SEQ ID NOs: 66 to 75 as primers, Aspergillus ⁇
  • Fumigatus is present, a nucleic acid with a length of 163 base pairs (according to SEQ ID NO: 68) and 1 46 base pairs (according to SEQ ID NO: 69) is amplified, and Aspergillus flavus is present.
  • nucleic acid is 287 base pairs long, In the presence of Spergillus niger, a nucleic acid having a length of 337 base pairs (according to SEQ ID NO: 70) and a length of 245 base pairs (according to SEQ ID NO: 71) is recognized as having Aspergillus nidrans. If the nucleic acid is 2336 base pairs (according to SEQ ID NO: 72) and 180 base pairs (according to SEQ ID NO: 73), it is 86 base pairs if Aspergillus' Teleus is present. Nucleic acids with a length of (according to SEQ ID NO: 74) and 83 base pairs (according to SEQ ID NO: 75) are amplified, respectively.
  • SEQ ID NOs: 66 to 75 include two primers each for widening each Aspergillus bacterial species, so that one primer was selected for each Aspergillus bacterium and a total of 5 primers was selected. By using the mixture of the four primers on the side, the above five kinds of Aspergillus bacteria can be detected and identified simultaneously.
  • a reagent kit for detecting an Aspergillus fungus utilizing the present invention is characterized by containing the nucleic acid for detecting a fungus of the genus Aspergillus of the present invention or a labeled nucleic acid obtained by recognizing the nucleic acid with an appropriate discriminating agent. Things.
  • the reagent kit of the present invention may contain the above-described nucleic acid, and may contain a label detection reagent, a buffer, and the like as other components.
  • the nucleic acid in the reagent kit of the present invention can be used as a primer or a probe.
  • a nucleic acid is used as a primer or a probe is different only in the means, and is basically the same with respect to detection of a fungus of the genus Aspergillus.
  • the reagent kit is used as a reagent kit for detecting a fungus of the genus Aspergillus by the method (I) described above, and when the nucleic acid is used as a primer, the method described in the above (2) is used.
  • the reagent kit of the present invention may be a nucleic acid for detecting an Aspergillus fungus or a nucleic acid for detecting an A. sp. It may contain a liquid or the like.
  • the reagent kit of the present invention includes, in addition to the nucleic acid for detecting Aspergillus fungi or the nucleic acid for detecting fungal Aspergillus sp.
  • the nucleic acid of the present invention can be bound to a solid phase carrier and used as a capture probe.
  • the sandwich probe may be used in combination with the capture probe and the labeled probe.
  • There is also a method of labeling and capturing a target nucleic acid There is also a method of labeling nucleic acids with biotin, hybridization, and capturing with an avidin-conjugated carrier. If the nucleic acid of the present invention is used for either one of the nucleic acids of the present invention, specific measurement of the nucleic acid of the present invention is possible, and there is no problem even if the specificity of the other nucleic acid is slightly lower.
  • DNAs having sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4, 10 to 15 and 5 to 75 in the sequence listing were synthesized using a commercial contract DNA synthesis service.
  • the various DNAs shown in SEQ ID NOs: 1 to 4, 10 to 15 and 57 to 75 in the sequence listing are referred to as 1 to 4, 10 to 15 and 57 to 75, respectively.
  • Example 2 (Aspergillus. Fumigatus Cytochrome b Gene Amplification Reaction) Aspergillus obtained by culturing in a potato dextros liquid medium ⁇ Fumigatus strains 45917, 46980, 5355) were treated with 75% ethanol and sterilized. The cells were obtained by centrifugation at 1500 g for 10 minutes, and about 40 ml of an extraction buffer (0.9 Sorbi !, 10 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl buffer, pH 7.1) was added to each of the cells. After shaking, the mixture was centrifuged at 1500 g for 10 minutes, the supernatant was discarded, and 30 ml of the same buffer was added.
  • an extraction buffer 0. Sorbi !, 10 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl buffer, pH 7.1
  • the supernatant was discarded after centrifugation, and 9 ml of the same buffer was added.
  • 1 ml of zymolyase (10 mg / ml) manufactured by Seikagaku Kogyo Co., Ltd. dissolved in the same buffer solution the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • 0.9-1.3 mm glass beads were added and treated with a vortex mixer for 1-2 minutes to break the cell wall. This was centrifuged at 1500 g for 10 minutes to obtain a supernatant, and further centrifuged at 20000 g for 15 minutes to obtain a precipitate. The precipitate is washed with extraction buffer and centrifuged again at 20000 g for 15 minutes.
  • the mitochondrial fraction of each strain of Aspergillus fumigatus was obtained.
  • 0.5 ml of 1 mg / ml protease K (Protease K) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • add 1 ml of a mixture of phenol, black form, and isoamyl alcohol (25: 24: 1) shake, and remove the upper layer by centrifugation at 1500 g for 10 minutes.
  • DNAs were converted into type II, and the DNA "1 (SEQ ID NO: 1) obtained in Example 1 was taken and NA 3 (SEQ ID NO: 3) (for IFM 40804, 40819) or 4 (IFM 40806, 40807, 412 06, 41392, PCR using the TaKaRa PCR Amplification Kit (R0) of Takara Shuzo Co., Ltd., with Sanoichi's DNA amplification device (Ml R-D30) The reaction was performed to amplify a part of the cytochrome b gene.
  • the composition of the reaction solution is as follows.
  • the whole volume was rubbed with water.
  • the reaction conditions are as follows.
  • Example 3 (Aspergillus flavus cytochrome b gene amplification reaction)
  • cytochrome b gene was obtained from Aspergillus flavus strains (Aspergi Ilus flavus IFM 40603, 40800, 41087, 41933, 45909, 45910, 45911, 46870, 5364, 5366).
  • Aspergillus flavus IFM 40603, 40800, 41087, 41933, 45909, 45910, 45911, 46870, 5364, 5366 was amplified by PCR and its nucleotide sequence was determined.
  • DNA 2 and DNA 3 for IF 41933, 45910, 5366
  • 4 for IFM 40603, 40800, 41087, 45909, 4591 K 46870, 5364 were used as primers.
  • the determined nucleotide sequence was determined by using SEQ ID NOs: 26 to 35 in Sequence Listing Example 4 (Aspergillus niger cytochrome b gene amplification reaction)
  • cytochrome b gene was amplified by PCR reaction from each strain of Aspergillus niger (Aspergilus niger IFM 40606, 41398, 41399, 46897, 5367, 5368). The base sequence was determined. DNA 2 and DNA 3 (for IFM 41399) or 4 (for IFM 40606, 41398, 46897, 5367, 5368) were used as primers. DNA 2 (for IFM 41399) or 4 (for IF 40606, 41398, 46897, 5367, 5368) was used as a primer for nucleotide sequence analysis on the forward side and DNA 3 (for IFM 41399) on the reverse side.
  • Example 5 (Amplification reaction of Aspergillus nidulans cytochrome b gene) In the same manner as in Example 2, each strain of Aspergillus nidulans (Aspergilus nidus) was used. urans IFM 41094, 46999, 47004, 47006, 41395), a part of the cytochrome b gene was amplified by PCR reaction, and its nucleotide sequence was determined. As primers, DNA 2 and DNA3 (for IFM 47004, 47006) or 4 (for IFM 41094, 46999, 41395) were used.
  • DNA 2 (for IFM 47004, 47006) or 4 (for IFM 41094, 46999, 41395) was used as the primer for nucleotide sequence analysis on the forward side and DNA 3 (for IFM 41094, 46999, 41395) on the reverse side.
  • the determined nucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 42 to 46 in the sequence listing.
  • Example 6 (Aspergillus perileus cytochrome b gene width response)
  • cytochrome b gene was amplified from Aspergillus terreus strains (Aspergillus terreus IFM 40851, 40852, 41092, 5372, 40850) by PCR, and the nucleotide sequence was analyzed. Were determined. DNA 2 and DNA 3 were used as primers. DNA 2 was used on the forward side and DNA 3 was used on the reverse side as primers for nucleotide sequence analysis. The determined base sequence is shown in SEQ ID NOs: 47 to 51 in the sequence listing.
  • Example 7 (Candida kefil cytochrome b gene amplification reaction)
  • Example 2 DNA 1 and DNA 3 obtained in Example 1 were used, and a part of the cytochrome b gene from Candida kefyl (Candida kefyl IFM 5773, 5800) was subjected to a PCR reaction. ⁇ The base sequence was determined. For the base sequence analysis primer, DNA2 was used on the forward side and DNA3 was used on the reverse side. The base sequence is shown in SEQ ID NOs: 52 to 53 in the sequence listing.
  • Example 8 Candida's tropicalis cytochrome b ⁇ gene amplification reaction
  • Example 2 In the same manner as in Example 2, using DNA 1 and DNA 3 obtained in Example 1, a part of the cytochrome b gene was obtained from Candida tropical is IFM 40018 (46816) by PCR. ⁇ The base sequence was determined. For the sequencer, DNA2 was used on the forward side and DNA3 was used on the reverse side. The nucleotide sequence is shown in SEQ ID NOs: 54 to 55 in the sequence listing.
  • Example 9 (Trichophyton rubrum IFM 45593) using the DNA1 and DNA3 obtained in Example 1 in the same manner as in Example 2, using the method of Example 2 (Trichophyton rubrum IFM 45593). ) From cytochrome A part of the b gene was amplified by a PCR reaction, and its nucleotide sequence was determined. DNA 2 was used on the forward side and DNA 3 was used on the reverse side as primers for nucleotide sequence analysis. The nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO: 56 in the sequence listing.
  • a TaKaRa PCR Amplification Kit (R011) of Takara Shuzo Co., Ltd. was used, and the DNA amplification device (MIR-D30) of Sanyo was used.
  • a PCR reaction was carried out in the same manner as in Example 2 to amplify a part of the cytochrome b gene of Aspergillus fumigatus. Aspergillus ⁇ DNA of Fumigatus was extracted by phenol extraction.
  • the reaction solution containing the I01 I amplification product was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, stained with ethidium bromide, and the fluorescence due to ultraviolet irradiation was detected (Fig.
  • Example 1 (Identification of Aspergillus flavus by PCR)
  • Example 10 Using the DNA 2 solution of Example 1 and the solutions of DNAs 11 and 12 (SEQ ID NOS: 11 and 12 respectively), one of the cytochrome b genes of Aspergillus flavus was prepared in the same manner as in Example 10.
  • the amplified part was subjected to PCR and the amplified product was detected by electrophoresis ( Figure 1, lanes 3, 4, and 5). When the length of the detected DNA fragment was calculated, it was identified as about 193 or about 194 base pairs.
  • Example 1 2 (Identification of Aspergillus niger by PCR)
  • Example 10 Using the DNA 2 solution of Example 1 and the DNA 13 (SEQ ID NO: 13) solution, a part of the Aspergillus niger cytochrome b gene was converted into PC by the same method as in Example 10. Amplification was performed by the R method, and the amplification product was detected by electrophoresis ( Figure 1, lanes 6, 7, and 8). When the length of the detected DNA fragment was calculated, it was identified as about 148 base pairs.
  • Example 10 Using the DNA 2 solution of Example 1 and the DNA 14 (SEQ ID NO: 14) solution, in the same manner as in Example 10, a part of the Aspergillus .2ndrans cytochrome b gene was amplified by the PCR method, and the amplified product was detected by electrophoresis (FIG. 1, lanes 9 and 10). When the length of the detected DNA fragment was calculated, it was determined to be approximately 244 base pairs.
  • Example 1 Using the DNA 2 solution of Example 1 and the DNA 15 (SEQ ID NO: 15) solution, a portion of the Aspergillus terreus cytochrome b gene was amplified by PCR in the same manner as in Example 10. The amplified product was detected by electrophoresis ( Figure 1, lanes 11 and 12). When the length of the detected DNA fragment was calculated, it was identified as about 397 base pairs.
  • strains in each lane of FIG. 1 are specifically as follows.
  • Region 1 Asperug i us fumigatus IFM 40819
  • Reno 1 Asperug ⁇ us fumigatus IFM 40806
  • Lane 12 Asperug I us terreus IFM 41092
  • Lane 13.Size marker (100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1 000, 1500 bp)
  • Example 15 (Amplification reaction of cytochrome b gene of Cunninghame veletrichae)
  • DNA 57 and DNA 58 were used as primers. DNA57 was used on the forward side and DNA58 was used on the reverse side as primers for nucleotide sequence analysis.
  • the determined nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 76 in the sequence listing.
  • Example 16 (Mucor circinel loides cytochrome b gene width reaction) A part of the cytochrome b gene from Mucor circinel loides IFM 40507 was amplified by PCR in the same manner as in Example 2. Then, the base sequence was determined. DNA 57, DNA 60 and DNA 61 were used as primers. As primers for nucleotide sequence analysis, DNA57 was used on the forward side, and DNA60 and DNA61 were used on the reverse side. The determined nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 77 of the sequence listing.
  • the present invention can be used to rapidly, simply and specifically detect and classify pathogenic fungi, particularly fungi of the genus Aspergillus, with high sensitivity. This makes it possible to identify the pathogenic bacteria early and treat them appropriately for patients infected with the pathogenic fungus.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • TGA6GTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATA6G TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 1 20 TTAGATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180 CAC6ATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA 6TTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAG6TGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425
  • Sequence length 425 Sequence type: nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGAYATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATYGCTATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 ⁇ TGCTGCAT ATTTCATATT TAAAGA ⁇ TA GTWACTATCT ⁇ A ⁇ TTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTYAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATYGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 SEQ ID NO:
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CATGAATAG6 TCAAGATATA 60 GTTGAGTTCA TATGAGGWGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACACTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCACTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCAGG TAATCCATTA GGAATATCA6 GTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTTGCACCAT ATTTTATATT TAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCA TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AAYCCAATGC AAACTCCACC TGCWATTGTA CCAGAGTGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 SEQ ID NO: 8
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTAATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATT 60 GTTGAGTTTA TTTGAG6AGG TTTYTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCTTTAGCAT TAATGCATTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCA6G KAATGCTTTA GGTATTTCAG CTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTT6CTCCTT ATTTTATATT TAAAGATTTA ATAACTATAT TTATATTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCTATGC AAACTCCACC TGCTATAGTT CCAGAATGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420 ATTTTA 425 SEQ ID NO: 9
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • T6A6GTGCTA CA6TTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60 6TTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTA6CT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TGTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAG6TGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTTAAGAT CTATACC 437
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 SEQ ID NO: 1 8
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 1 20 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CA6TTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTT6AATAGG TCAAGATATA 60
  • TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TG ⁇ TTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCGTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 SEQ ID NO: 2 1
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCT ⁇ GCA 120 TTACATTTCT TA ⁇ ACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 SEQ ID NO: 2 2
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC T6CTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 SEQ ID NO: 2 3
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60
  • TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAG6TGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG A6TGCTATAC CTTGAATAG6 TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATA6 ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATA6CAATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA 6TTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 SEQ ID NO: 25
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAA6ATATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 ⁇ ACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTA6CTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGACATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTA6CTT TAATGTCGATC TAG ATCTCGATCTAG TAG ATCTCGATCTAG TAG TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTTACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTGCACC TGCTATCGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATG420
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATT6CTATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TA6ATTACCT 240 TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTTACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTCAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATCGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTTAAGAT CTATACC 437
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTAT6 AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGACATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA G6TATATCT6 GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTT6CTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTTACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAAT6CT TTA6GAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATCGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 SEQ ID NO: 3 1
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGACATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTTACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAAT6CT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATCGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTTAAGAT CTATACC 437 SEQ ID NO: 3 2
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGACATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180.
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGACATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATCGCTATG CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGT6CTATAC CTTGAATAGG TCAAGACATA 60 GTT6AATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTTACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATCGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 SEQ ID NO: 3 5
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTGTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCAGAATGAT AC ⁇ ATTACG TTTCTATGCT 420 ATTTTAAGAT CTATACC 437
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CATGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAGTTCA TATGAGGTGG TTTGTCTGTA AATAATGCAA CATTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACACTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCACTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCAG6 TAATCCATTA GGAATATCAG GTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTTGCACCAT ATTTTATATT TAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTT6 TTTTCTTTAT GCCTAATGCA TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AACCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTA CCAGAGTGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 SEQ ID NO: 3 7
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CATGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAGTTCA TATGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACACTTCT TATTACGTTT TGTATTA6CT GCATTAGCTT TAATGCACTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCAGG TAATCCATTA GGAATATCAG GTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTTGCACCAT ATTTTATATT TAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCA TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATG6CT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCAATTGTA CCAGAGTGAT ATCTHTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 SEQ ID NO: 3 8
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CATGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAGTTCA TATGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACACTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCACTT AATAGCTATG 180
  • Sequence type nucleic acid
  • TGA6GTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CATGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAGTTCA TATGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACACTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCACTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCAGG TAATCCATTA GGAATATCAG GTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTTGCACCAT ATTTTATATT TAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCA TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCAATTGTA CCAGAGTGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425
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  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTAATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATT 60 GTTGAGTTTA TTTGAGGAGG TTTTTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCTTTAGCAT TAATGCATTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCAGG TAATCCTTTA GGTATTTCAG CTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTTGCTCCTT ATTTTATATT TAAAGATTTA ATAACTATAT TTATATTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCTATGC AAACTCCACC TGCTATA6TT CCAGAATGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 SEQ ID NO: 4 3
  • Sequence type nucleic acid
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  • Sequence type nucleic acid
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  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTAATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATT 60 GTTGAGTTTA TTTGAGGAGG TTTTTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCTTTAGCAT TAATGCATTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCAGG TAATCCTTTA GGTATTTCAG CTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTTGCTCCTT ATTTTATATT TAAAGATTTA ATAACTATAT TTATATTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCTATGC AAACTCCACC TGCTATAGTT CCAGAATGAT ATCTTTTACC TTTCTAT6CT 420 ATTTT 425
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACTTAATG AGTGCTATAC CTTGAATTGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGTTA TTATGCACTT AATAGCAATG 180 CACGATACTG TAGGATCAGG TAATCCTTTA GGTATATCAG GTAACTACGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCAT ATTTCGTATT CAAA6ATTTA 6TAACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTCAT GCCTAACGCA 7TAGGAGACA GTGAAAATTA TGTTATGGCA 360 AACCGAATGC AAACACCAGC TGCTATTGTA CCAGAATGAT ACTTATTACC ATTCTATGCT 420 ATTKTAAGAT CTMTACC 437 SEQ ID NO: 4 8
  • Sequence type nucleic acid
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  • TGA6GTGCTA CAGTTATTAC TAAGTTAATG AGTGCTATAC CTT6AATTGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGTTA TTATGCACTT AATAGCAATG 180 CACGATACTG TAGGATCAGG TAATCCTTTA GGTATATCAG GTAACTACGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCAT ATTTCGTATT CAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGAGACA 6TGAAAATTA TGTTATGGCA 360 AACCCAATGC AAACACCACC TGCTATTGTA CCAGAATGAT ACTTATTACC ATTCTATGCT 420 ATTKTAAGAT CT TACC 437 SEQ ID NO: 5 1
  • Sequence type nucleic acid
  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACTTAATG AGTGCTATAC CTTGAATTGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGTTA TTATGCACTT AATAGCAATG 180 CACGATACTG TAGGATCAGG TAATCCTTTA GGTATATCAG GTAACTACGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCAT ATTTCGTATT CAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGAGACA GTGAAAATTA TGTTATGGCA 360
  • AACCCAATGC AAACACCACCACC TGCTATTGTA CCAGAATGAT ACTTATTACC ATTCTATGCT 420 ATTKTAAGAT CTMTACC 437
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
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  • TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACTTATTA TCAGCTATAC CATTTATAGG TAATGATATA 60 GTACCATTTA TAT6A6GAGG TTTCTCTGTA TCAAATCCTA CAATACAAAG ATTTTTTGCA 120 TTACATTATT TATTACCATT TATTTTAGCA GCATTAGTAG TAATGCATTT TATAGCATTA 180 CATACTCATG GATCATCTAA TCCTGTAGGA ATATCAAGTA ATTTAGATAG AATACCAATG 240 CATAGTTACT TTATATTTAA AGATTTAATT ACTGTATTTG TATTTATATT AGTATTTAGT 300 TTATTTGTAT TCTTCTCACC TAATACTTTA GGACATCCTG ATAACTATAT ACCAGGTAAT 360 CCTATGGTTA CACCTGCATC TATAGTACCT GAATGATATT TATTACCATT CTATGCTATA 420 TTAAGATCTA TACC 434
  • Sequence type nucleic acid
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  • AATCCTAT6C AAACACCAGC TGCTATTGTT CCTGAATGAT ATTTATTAGC TTTTTATGCT 420
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
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  • Sequence type nucleic acid
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  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
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Description

明細書
真菌類の検出用材料及び検出法
技術分野
本発明は、 各種真菌を検出するための検出用核酸及びそれを用いた各種真菌の 検出方法に関する。
従来技術
深在性真菌症の主要な病原菌としては、 カンジダ （Candida, 以下 C.と略す。 ) 厲真菌、 ァスペルギルス属真菌 （Aspergi l lus, 以下 A.と略す） 、 クリプトコ ッカス （Cryptococcus、 以下 Cr.と略す。 ） 属真菌などが知られている。 カンジ ダ厲の主要な病原菌としては、 カンジダ 'アルビカンス （G. albicans) 、 カン ジダ 'ケフィール （G. kefyr) 、 カンジダ ' グラブラ一タ （C. glabrata) カン ジダ · トロピカリス （C. tropical is) などが、 クリプトコッカス属の主要な病 原菌としては、 クリプトコッカス ' ネオフォルマンス （Cr. neoformans) が知ら れている。 カンジダ属真菌と並んで重要な病原菌であるァスペルギルス属真菌の 中で、 深在性真菌症の原因菌となる菌種には、 ァスペルギルス ' フミガタス （A. fumigatus) 、 ァスペルギルス · フラバス （A. f lavus) 、 ァスペルギルス ' 二 ガー （A. niger) および二ガーグループ、 ァスペルギルス '二ドランス （A. nid urans) 、 ァスペルギルス '亍レウス （A. terreus) などがあり、 これらの菌種 を迅速に検出 ·分類 ·同定することが望まれている。
近年、 深在性真菌症は免疫不全患者に日和見感染症として増加しているが、 そ の患者は重篤な基礎疾患を持つことが多く、 ·早期に起炎菌を明らかにして的確な 治療をすることが必要である。 深在性真菌症の診断は血液培養法が基本であるが 検出感度などに問題がある。 これまでに抗体による診断薬が市販されているが、 抗体による診断は免疫不全状態の患者には役立たない。 このような現状で、 近年、 抗原やその他の菌体成分を直接検出する方法が開発されてきている。 たとえば、 マンナン、 D—ァラビ二トル、 グルカンなどを検出して感染を診断する方法が開 発されている。 一方、 分子生物学の発展につれて、 結核菌やクラミジァなど各種 病原菌の D N Aを抽出し、 いわゆる P C R法などによって核酸を検出することに よって診断する方法が開発されている。 深在性真菌症の分野でもリボゾーム R N
Aを検出して診断する方法 （臨床病理、 4 3卷補冊、 1 1 9頁、 1 9 9 5年） な どが提示されている。
発明の開示
本発明の目的は、 深在性真菌症の原因菌、 さらにはァスペルギルス厲真菌を検 出するために用いられる核酸を提供し、 さらにそれを用いることによる簡便、 迅 速、 特異的かつ高感度な深在性真菌症の原因菌、 さらにはァスペルギルス属真菌 の検出方法を提供することである。
本願発明者らは、 各種真菌症の原因菌、 なかでもァスペルギルス厲真菌の遺伝 子に関する種々の検討を重ねた結果、 これら各種真菌症の原因となる真菌のミ ト コンドリアに存在するチトクローム bの遺伝子に着目し、 その遺伝子の一部を增 幅するために各種核酸を合成した。 それらの核酸の中から真菌のチトクローム b の遺伝子を増幅できるプライマーを検索し、 配列表の配列番号 1 ~ 4の核酸を見 出した。 そして配列表の配列番号 1〜4の核酸を用いて各種真菌のミ トコンドリ ァに存在するチトクローム bの遺伝子の一部を増幅し、 その配列を解読すること に成功した。 本発明者らは、 その配列をもとにさらに研究を重ねた結果、 ァスぺ ルギルス尿真菌の各種ごとに特異的な配列を見出し、 それらを基にそれぞれの種 に特異的なプライマーを設計した。 例えば、 ァスペルギルス · フミガタスに特異 的なプライマーとして配列表の配列番号 1 0、 6 5、 6 8、 6 9を、 ァスペルギ ルス ' フラバスに特異的なプライマーとして配列表の配列番号 1 1 、 1 2、 6 6、 6 7を、 ァスペルギルス ·二ガーに特異的なプライマーとして配列表の配列番号 1 3、 6 4、 7 0、 7 1 を、 ァスペルギルス ' ニドランスに特異的なプライマー として配列表の配列番号 1 4、 6 3、 7 2、 7 3を、 ァスペルギルス '亍レウス に特異的なプライマーとして配列表の配列番号 1 5、 6 2、 7 4、 7 5などを見 出した。
これらを基に、 簡便、 迅速、 特異的かつ高感度にァスペルギルス尿真菌を検出 •分類■ 同定するための核酸を取得し、 更にそれを用いた検出法を確立して本発 明を完成するに至った。 さらに、 配列番号 1及び 2で表わされる塩基配列を有す るプライマーを改良した、 配列番号 5 7で表わされる塩基配列を有するプライマ 一を提供し、 これによつて、 上記真菌類に加え、 さらにカニングハメラ 'ベルト レチアェ及びムコール■ シルシネロイデスを検出することが可能になった。
すなわち、 本発明は、 配列表の配列番号 5 7に示される塩基配列 （ただし、 任 意の位置のチミンはゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配 列のうち連続する少なくとも 1 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片から成 る真菌のミ トコンドリアのチトクロム b遺伝子断片増幅用プライマーを提供する。 また、 本発明は、 配列表の配列番号 3、 5 8〜6 1に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミンはゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基 配列のうち連続する少なくとも 1 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片から 成る真菌のミ トコンドリアのチトクロム b遺伝子断片增幅用プライマーを提供す る。 また、 本発明は、 配列表の配列番号 5、 6、 7、 8及び 9にそれぞれ示され る塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミンはゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列の連続する 1 0ないし 1 0 0塩基から成る塩基配列を 有する核酸断片からそれぞれ成る、 ァスペルギルス · フミガタス検出用 （配列番 号 5 ) 、 ァスペルギルス · フラバス検出用 （配列番号 6 ) 、 ァスペルギルス '二 ガー検出用 （配列番号 7 ) 、 ァスペルギルス ·二ドランス検出用 （配列番号 8 ) 、 及びァスペルギルス ·テレウス検出用 （配列番号 9 ) 核酸を提供する。 さらに、 本発明は、 配列表の配列番号 5に示す配列の 2 4番目の丁、 9 9番目の T、 1 4 4番目の丁、 2 5 2番目の C、 2 7 7番目の G、 3 0 4番目の G、 3 1 2番目の A又は 3 9 3番目の Gを 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸、 また は配列番号 5に示す配列の相補的配列の上記に対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスペルギルス · フミガタス検出用核酸 を提供する。 さらに、 本発明は、 配列表の配列番号 6に示す配列の 1 7 4番目の Yを 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 6に示す 配列の相補的配列の上記に対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基 以上の核酸から成るァスペルギルス ■ フラバス検出用核酸を提供する。 さらに、 本発明は、 配列表の配列番号 7に示す配列の 4 2番目の A、 6 9番目の C、 1 2 6番目の C、 2 0 7番目の A、 2 1 3番目の A、 2 4 6番目の A又は 3 9 6番目 の Gを 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 7に示 す配列の相補的配列の上記に対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩 基以上の核酸から成るァスペルギルス · 二ガー検出用核酸を提供する。 さらに、 本発明は、 配列表の配列番号 8に示す配列の 6 0番目の丁、 2 2 1番目の C、 2 7 1番目の A、 2 8 5番目の A、 3 6 6番目の T又は 3 8 7番目の Aを 3 '末端 とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 8に示す配列の相補的 配列の上記に対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸か ら成るァスペルギルス ·二ドランス検出用核酸を提供する。 さらに、 本発明は、 配列表の配列番号 9に示す配列の 2 5番目の丁、 4 8番目の丁、 1 6 2番目の丁、 2 2 5番目の C、 2 6 1番目の C、 3 3 9番目の C、 3 6 0番目の A、 3 7 5番 目の A又は 4 1 1番目の Aを 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 9に示す配列の相補的配列の上記に対応する塩基を 3 '末端とす る、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスペルギルス ·亍レウス検出用核 酸を提供する。 さらにまた、 本発明は、 配列表の配列番号 1 、 2及び 5 7に示さ れる塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミンはゥラシルに置換されていてもよい ) のうち連続する少なくとも 1 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片の少な くともいずれかからなるフォワード側プライマーと、 配列番号 1 1 ~ 1 5及び 6 2〜6 5に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミンはゥラシルに置換さ れていてもよい） の相補的な塩基配列のうち連続する少なくとも 1 0塩基から成 る塩基配列を有する核酸断片の少なくともいずれかからなるリバース側プライマ 一とを用いて遺伝子増幅法によリアスペルギルス属真菌のチトクロム b遺伝子断 片を增幅することによリアスペルギルス厲真菌を検出及びノ又は同定する方法を 提供する。 さらにまた、 本発明は、 配列表の配列番号 6 6ないし 7 5に示される 塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミンはゥラシルに置換されていてもよい） の うち連続する少なくとも 1 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片の少なくと もいずれかからなるフォワード側プライマーと、 配列番号 3、 4、 5 8〜6 1に 示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミンはゥラシルに置換されていても よい） の相補的な塩基配列のうち連続する少なくとも 1 0塩基から成る塩基配列 を有する核酸断片の少なくともいずれかからなるリバース側プライマーとを用い て遺伝子増幅法によリアスペルギルス属真菌のチトクロム b遣伝子断片を増幅す ることによリアスペルギルス属真菌を検出及び 又は同定する方法を提供する。 さらにまた、 本発明は、 配列表の配列番号 1 、 2及び 5 7に示される塩基配列 （ ただし、 任意の位置のチミンはゥラシルに置換されていてもよい） のうち連続す る少なくとも 1 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片の少なくともいずれか からなるフォワード側プライマーと、 配列番号 3、 4、 5 8〜6 1のいずれかに 示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミンはゥラシルに置換されていても よい） の相補的な塩基配列のうち連続する少なくとも 1 0塩基から成る塩基配列 を有する核酸断片の少なくともいずれかからなるリバース側プライマーとを用い て遺伝子増幅法により真菌のチトクロム b遺伝子断片を増幅することにより真菌 を検出する方法を提供する。
本発明により従来、 分類 .同定に時問のかかっていた病原真菌、 ことにァスぺ ルギルス属真菌を迅速、 簡便に特異的且つ高感度で検出■分類■同定することが 可能となった。 本発明の核酸は増幅反応のプライマーとしても、 直接検出用のプ ローブとしても用いることが可能である。 また、 プライマーにょリ增幅した産物 をプローブや制限酵素で検出することにより、 感度、 特異性をさらに高くするこ とも可能であり、 その臨床的意義は大きい。
図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の実施例の各種プライマーを用いて各種真菌のミ 卜コンドリア のチ卜クロム b遺伝子を P C Rによリ增幅し、 増幅産物を電気泳動にかけて得ら れた電気泳動パターンの模式図である。
図 2は、 本発明の他の実施例の各種プライマーを用いて各種真菌のミ 卜コンド リアのチトクロム b遺伝子を P C Rにより増幅し、 増幅産物を電気泳動にかけて 得られた電気泳動パターンの模式図である。
図 3は、 本発明のさらに他の実施例の各種プライマーを用いて各種真菌のミ ト コンドリアのチ卜クロム b遺伝子を P C Rによリ增幅し、 増幅産物を電気泳動に かけて得られた電気泳動パターンの模式図である。
図 4は、 本発明のさらに他の実施例の各種プライマーを用いて各種真菌のミ 卜 コンドリアのチ卜クロム b遗伝子を P C Rによリ増幅し、 増幅産物を電気泳動に かけて得られた電気泳動パターンの模式図である。
発明を実施するための最良の形態
配列表の配列番号 1 、 2及び 5 7の少なくともいずれかの核酸と、 配列番号 3、 4、 及び 5 8 ~ 6 1の相補的配列から成る核酸の少なくともいずれかとの組み合 わせから選択される核酸の対をプライマーとして、 ァスペルギルス属ゃカンジダ 厲などの真菌のミ トコンドリア中のチトクローム b遺伝子とハイブリダィズ （hy br i d i ze) させ、 プライマー伸長反応を行うサイクルを繰り返すことにより、 真 菌類のミ トコンドリアのチトクロム b遺伝子断片を増幅することができる。 なお、 これらの配列のうち、 配列番号 1 、 2及び 4に記載のものは、 ァスペルギルス - ニドランスのミ トコンドリアのチトクロム b遺伝子配列 （War i ng, R. B. et a l . , Ce l l 27, 4-1 1 (1 981 ) )を基にして設定したものである。 一方、 配列番号 5 7、 3、 5 8〜6 1で示される塩基配列を有する核酸は複数あり （配列番号 5 7、 3、 5 8〜6 1の塩基配列は一般式で示される） 、 各配列番号のそれぞれに示される 核酸はそれぞれ単独で用いてもよいが、 それぞれ混合物として用いることが好ま しい。 これらを混合物として用いることにより、 ァスペルギルス属真菌以外 （ァ スペルギルス 'テレウスを除く） の真菌、 例えぱァスペルギルス 'テレウスや、 カンジダ属真菌、 卜リコフィートン厲真菌、 カニングハメラ属真菌、 厶コール属 真菌のミ トコンドリアのチトクロム b遺伝子断片を初めて增幅できるようになつ た。 なお、 配列番号 5 7、 3、 5 8〜6 1に示す塩基配列を有する核酸は、 少な くとも連続する 1 0塩基以上を有するものであればプライマーとして用いること ができる。 もっとも、 各配列番号に示す全配列を有することが好ましい。
上記各種の核酸をプライマーとして用いて各種真菌類の多数の株のミ トコンド リアのチトクロム b遺伝子断片を増幅し、 その塩基配列を決定した。 增幅された D N A断片の、 それぞれの真菌種に共通する塩基配列が配列番号 5ないし 9に示 されている。 配列番号 5に示すものはァスペルギルス ■ フミガタス由来、 配列番 号 6に示すものはァスペルギルス ' フラバス由来、 配列番号 7に示すものはァス ペルギルス ·二ガー由来、 配列番号 8に示すものはァスペルギルス ·ニドランス 由来、 配列番号 9に示すものはァスペルギルス ■テレウス由来の増幅された D N A断片の配列である。 これらの増幅断片を錶型として、 後述する、 各真菌の種に 特異的なプライマーを用いてさらに核酸増幅を行なうことができる。 あるいは、 これらの増幅産物を制限酵素によって断片化し、 その断片の生成パターンを比較 することによつてもプライマー伸長物を検出することができる （P C R— R F L P ) 。
また、 これらの増幅断片の任意の連続する 1 0〜 1 0 0塩基、 好ましくは 1 5 ~ 3 0塩基から成る配列を有する核酸は、 上記したそれぞれの真菌種の検出用核 酸として用いることができる。 ここで、 検出用核酸とは、 核酸増幅用プライマー 及びプローブを包含する。 プローブとして用いる場合には、 周知の方法により核 酸を標識したものを用いる。
下記実施例において具体的に記載するように、 本願発明者らは、 ァスペルギル ス属に属する真菌の多数の株について上記のようにして遺伝子の増幅を行ない、 その塩基配列を決定し、 それらの配列を注意深く比較することにより、 それぞれ の種にとって特異的な部位を見出した。 これらの特異的な部位 （1塩基） は、 例え ば、 ァスペルギルス ' フミガタスには配列番号 5に示す配列の中で 24番目の丁、 99 番目の T、 144番目の Τ、 252番目の C、 277番目の G、 304番目の G、 312番目の A 、 393番目の Gが、 ァスペルギルス ·フラバスには配列番号 6に示す配列の中で 174 番目の Yが、 ァスペルギルス ·二ガーには配列番号 7に示す配列の中で 42番目の A 、 69番目の C、 126番目の C、 207番目の A、 213番目の A、 246番目の A、 396番目 の Gが、 ァスペルギルス 'ニドランスには配列番号 8に示す配列の中で 60番目の T 、 221番目の C、 271番目の A、 285番目の A、 366番目の T、 387番目の Αが、 ァス ペルギルス ·亍レウスには配列番号 9に示す配列の中で 25番目の丁、 48番目の丁、 1 62番目の丁、 225番目の C、 261番目の C、 339番目の C、 360番目の A、 375番目の A、 41 1番目の Aが、 相当する。 これらの特異的な部位は配列番号 5〜 9に示す配列 の相補的配列の中にも相補的塩基として存在する。 これらの特異的な部位 （1塩基 ) を 3 ' 末端とするオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマーとして用いると 、 それぞれの種のミ トコンドリアのチトクロム b遺伝子断片のみが増幅され、 従 つて、 それぞれの種を特異的に検出すること、 すなわち、 種の同定が可能になる 配列番号 1 、 2及び 又は 5 7に示す塩基配列を有する核酸 （フォワード側プ ライマ一として用いる） と組み合わせて、 上記のようなプライマーとして用いる ことができる核酸 （リバース側プライマーとして用いる） の塩基配列の例を配列 表の配列番号 1 0〜 1 5、 6 2〜6 5に示す。 これらは配列番号 5 ~ 9に示す配 列の相補的配列中の、 上記の特異的な部位のいずれかを 3 ' 末端とするオリゴヌ クレオチドであり、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸である。 すなわち、 配列番号 1 0及び 6 5 (いずれも配列番号 5の 3 0 4番目の Gと対合する Cを 3 ' 末端と する、 配列番号 5の相補鎖） に示す塩基配列を有する核酸はァスペルギルス ' フ ミガタス検出用であり、 配列番号 1 1及び 1 2 (いずれも配列番号 6の 1 7 4番 目の Y ( C又は T ) と対合する G又は Aを 3 ' 末端とする、 配列番号 6の相補鎖 ) にそれぞれ示す塩基配列を有する核酸はァスペルギルス · フラバス検出用であ リ、 配列番号 1 3 (配列番号 7の 1 2 6番目の Cと対合する Gを 3 ' 末端とする 、 配列番号 7の相補鎖） 及び配列番号 6 4 (配列番号 7の 2 0 7番目の Aと対合 する Tを 3 ' 末端とする、 配列番号 7の相補鎖） に示す塩基配列を有する核酸は ァスペルギルス '二ガー検出用であり、 配列番号 1 4 (配列番号 8の 2 2 1番目 の Cと対合する Gを 3 ' 末端とする、 配列番号 8の相補鎖） 及び配列番号 6 3 ( 配列番号 8の 2 7 1番目の Aと対合する Tを 3 ' 末端とする、 配列番号 8の相補 鎖） に示す塩基配列を有する核酸はァスペルギルス■ ニドランス検出用であり、 配列番号 1 5 (配列番号 9の 3 7 5番目の Αと対合する Τを 3 ' 末端とする、 配 列番号 9の相補鎖） 及び配列番号 6 2 (配列番号 9の 3 6 0番目の Aと対合する Tを 3 ' 末端とする、 配列番号 9の相補鎖） に示す塩基配列を有する核酸はァス ペルギルス ·亍レウス検出用である。
—方、 配列番号 3、 4、 5 8、 5 9、 6 0及び 又は 6 "Iに示す塩基配列を有 する核酸 （リバース側プライマーとして用いる） と、 上記の特異的な部位 （1塩 基） を 3 ' 末端とするオリゴヌクレオチド （フォワード側プライマーとして用い る） と組み合わせて、 種の同定を行い得る核酸増幅用プライマーを設計すること ができる。 これらは例えば、 ァスペルギルス ' フミガタスには配列番号 5に示す 配列の中で、 24番目の丁、 99番目の T、 144番目の Τ、 252番目の C、 277番目の G 、 304番目の G、 312番目の A及び 393番目の Gのいずれかを 3 ' 末端とする少なく とも 1 0塩基以上のオリゴヌクレオチドから、 ァスペルギルス■ フラバスには配 列番号 6に示す配列の中で、 1 7 4番目の Yを 3 ' 末端とする少なくとも 1 0塩 基以上のオリゴヌクレオチドから、 ァスペルギルス ·二ガーには配列番号 7に示 す配列の中で 42番目の A、 69番目の C、 126番目の C、 207番目の A、 213番目の A 、 246番目の A及び 396番目の Gのいずれかを 3 ' 末端とする少なくとも 1 0塩基 以上のオリゴヌクレオチドから、 ァスペルギルス■ニドランスには配列番号 8に示 す配列の中で 60番目の丁、 221番目の C、 271番目の A、 285番目の A、 366番目の T 及び 387番目の Aのいずれかを 3 ' 末端とする少なくとも 1 0塩基以上のオリゴ ヌクレオチドから、 ァスペルギルス ·亍レウスには配列番号 9に示す配列の中で 25 番目の T、 48番目の Τ、 162番目の丁、 225番目の C、 261番目の C、 339番目の C、 360番目の A、 375番目の A及び 41 1番目の Aのいずれかを 3 ' 末端とする少なくと も 1 0塩基以上のオリゴヌクレオチドから選択される。 これらのフォワード側プ ライマーとして用いられる好ましい配列の例を配列番号 6 6ないし 7 5に示す。 配列番号 6 6及び 6 7 (いずれも配列番号 6の 1 7 4番目の Y ( C又は T ) を 3 ' 末端とする） に示す塩基配列を有する核酸はァスペルギルス ' フラバス検出用 であり、 配列番号 6 8 (配列番号 5の 3 0 4番目の Gを 3 ' 末端とする） 及び配 列番号 6 9 (配列番号 5の 3 "I 2番目の Aを 3 ' 末端とする） に示す塩基配列を 有する核酸はァスペルギルス · フミガタス検出用であり、 配列番号 7 0 (配列番 号 7の 1 2 6番目の Cを 3 ' 末端とする） 及び配列番号 7 1 (配列番号 7の 2 1 3番目の Aを 3 ' 末端とする） に示す塩基配列を有する核酸はァスペルギルス■ 二ガー検出用であり、 配列番号 7 2 (配列番号 8の 2 2 1番目の Cを 3 ' 末端と する） 及び配列番号 7 3 (配列番号 8の 2 8 5番目の Aを 3 ' 末端とする） に示 す塩基配列を有する核酸はァスペルギルス ·二ドランス検出用であり、 配列番号 7 4及び 7 5 (いずれも配列番号 9の 3 7 5番目の Aを 3 ' 末端とする） に示す 塩基配列を有する核酸はァスペルギルス ■亍レウス検出用である。
また、 これらの才リゴヌクレオチドは、 プライマーとしてのみならず、 適当な 棵識を付してそれぞれの種に特異的なプローブとして用いることもできる。 ブラ イマ一又はプローブとして用いられる上記核酸は、 3 ' 末端から連続する 1 0塩 基以上あればプライマ一又はプローブとして用いることができる。 もっとも、 核 酸の塩基数は 1 0塩基ないし 1 0 0塩基が好ましく、 特には"！ 5塩基から 3 0塩 基が好ましい。 また、 配列番号 1 0 ~ 1 5、 6 2〜 7 5に示す配列では、 これら の配列の全塩基配列を有していることが好ましい。
上記した本発明の核酸の各配列番号に示す塩基配列中のチミン （T) は、 ゥラシ ル （U) であってもよい。 すなわち、 本発明の核酸はデォキシリボ核酸 （D N A ) およびリボ核酸 （R N A ) の両方を包含するものである。 また、 本発明の核酸は、 塩基配列中、 任意の位置の Tが Uであるようなゥリジン残基を含む D N Aであって もよいし、 同様に任意の位置の Uが Tであるようなチミジン残基を含む R N Aであ つてもよい。 さらに、 各核酸の相補鎖も本発明の範囲内に含まれる。 これは、 真菌 の D N Aが二本鎖であるので、 各核酸の相補鎖も各核酸がハイブリダィズする鎖の 相補鎖に対してハイブリダィズすることができるからである。 また、 各核酸が上記 した用途に用いることができる限り、 核酸中に欠失、 挿入あるいは置換といった点 突然変異や、 修飾ヌクレオチドが存在していてもよく、 これらのものも本発明の範 囲に含まれる。
本発明の核酸の取得方法は、 特に限定されない。 好ましくは、 化学合成であり、 これにより容易、 大量かつ安価に一定品質の核酸を得ることができる。 かかる化学 合成は、 ホスフアイ ト法 （ホスホアミダイト法） やホスホトリエステル法 （リン酸 卜リエステル法） などの常法に従つて行うことができる。
本発明のァスペルギルス属真菌の検出 ·分類 ·同定法は、 上記のァスペルギルス 尿真菌の検出■分類 ·同定核酸を用いることを特徴とする検出 '分類 ·同定法であ る。 この方法として、 （1 ) 該核酸をプローブとしてァスペルギルス厲真菌を検出 ,分類 '同定する方法、 または （2 ) 該核酸をプライマーとして P C Rなどにより 伸長反応を行い増幅されたプライマー伸長物を測定することによってァスペルギル ス属真菌を検出 ·分類 ·同定する方法が挙げられる。 これらの検出方法で使用され る核酸は、 標識剤が導入されたいわゆる標識核酸であってもよい。 好ましくは、 標 識核酸であり、 これを用いることによりァスペルギルス属真菌はよリ一層検出が容 易となる。 標識剤としては、 具体的には抗原、 ハプテン、 酵素、 蛍光物質、 発光物 質、 酵素基質、 放射性物質、 不溶性担体などが例示される。 また標識化は核酸の末 端でも、 また核酸配列の途中に行ってもよい。 また、 標識剤はヌクレオチドの糖、 リン酸基、 塩基部分のいずれに結合していてもよい。
本発明ァスペルギルス属真菌検出■分類■同定用核酸をプローブ又はプライマー としてァスペルギルス属真菌を検出 '分類 ·同定する方法として、 以下の（1 )、 (2) が例示される。
(1 )本発明のァスペルギルス属真菌検出■分類■同定用核酸をプローブとして用 し、、 該核酸プローブと検体とをハイブリダィズさせた後、 プローブを指標として試 料中の検体を検出するものである。 この方法においては、 プローブとして、 本発明 のァスペルギルス属真菌検出■分類 ·同定用核酸を前述した標識剤で標識した標識 核酸を用いることが好ましい。 この検出法は、 該標識核酸をプローブとし、 被験試 料中のァスペルギルス厲真菌遺伝子と該標識プローブをハイブリダィズさせた後に、 ァスペルギルス属真菌遺伝子と標識プローブとの結合物もしくは非結合の標識プロ ーブを、 標識剤に適した適当な検出法で検出することによって実施することができ る。
検体、 すなわち被験試料中のァスペルギルス属真菌遺伝子とプローブとのハイブ リダィゼーシヨンは、 検体を通常の方法で前処理、 精製したものを被験試料とし、 それとプローブとしての標識核酸とを混合し、 室温から 70°Cで 10分から 48時間処 理することにより実施できる。 また、 検体はあらかじめ本発明の核酸をプライマー として増幅反応を行っておいてもよい。
(2) 本発明のァスペルギルス属真菌検出用核酸をプライマーとして、 D N Aポ リメラーゼ等による伸長反応を行い遺伝子培幅することによりァスペルギルス属真 菌のチトクローム b遺伝子断片のみを特異的に増幅させ、 この増幅産物を測定する ことによってァスペルギルス属真菌を検出 ·分類 ·同定する方法である。 またこの 場合、 プライマーとして本発明の核酸を前述したごとく檁識剤で標識化して得られ る標識核酸を用いてもよい。 ここで用いられる遺伝子増幅法としては、 具体的には
P C R法が例示されるが、 特にこの方法に限定されるものではなく、 短鎖のオリゴ ヌクレオチドをプライマーとして遺伝子合成の開始のために用いるいずれの遺伝子 增幅法をも用いることができる。 本発明のァスペルギルス属真菌の検出法は、 上記 方法にょリ增幅された增幅産物すなわちチ卜クローム b遗伝子断片を検出すること により行われ得る。 あるいは増幅されたチトクローム b遺伝子断片を制限酵素によ つて断片化し、 その断片の生成パターンを比較することによつても行われ得る。 こ こで用いる制限酵素は単独、 あるいは組み合わせて使用される。 增幅されたチトク ローム b遺伝子断片、 または制限酵素でさらに断片化された遺伝子断片の検出手段 は特に限定されることはなく、 通常の遺伝子の検出方法 （例えば電気泳動法など） が使用できる。 增幅産物は、 例えば電気泳動により分画され、 特異的かつ検出に十 分な程度に鮮明なバンドとして容易に検出できる。 複数の病原真菌を検出 ·分類 · 同定する目的で、 複数のプライマーが混合されている場合には、 電気泳動により分 画 ·検出されるバンドは、 各病原真菌ごとに異なった分子量の位置にバンドが検出 されて、 各病原真菌が分類 ·同定されるようにプライマーを設計すればよい。 ブラ イマ一がまた増幅反応時に、 適当な標識剤で檁識化されたデォキシリボヌクレオチ ド （dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP) もしくはリボヌクレオチド （ATP、 UTP、 GTP、 CTP) を D M Aもしくは R N A合成の原料として使用することにより、 増幅産物を高感度 に直接検出することが可能である。 もし〈は、 プライマーとして本発明のァスペル ギルス属真菌検出 ·分類 ·同定用核酸を標識化して得られる標識核酸を用いること により、 増幅産物を同様に高感度に直接検出することができる。 かかる場合、 棵識 化に用いられる標識剤として、 好ましくは放射性物質、 蛍光物質、 発光物質、 発光 誘導物質などである。
本発明のァスペルギルス厲真菌検出 ·分類■同定用核酸を用いて、 ァスペルギ ルス属真菌を検出 ·分類 ·同定する方法の一例をさらに詳細に説明すると、 被検 物から核酸を抽出し、 配列表の配列番号 2の核酸と、 配列番号 1 0〜 1 5の核酸 の混合物をプライマ一にして、 P C Rなどの核酸伸長反応を行うと、 ァスペルギ ルス ■ フミガタスが存在している場合は 3 2 3塩基対の長さの核酸が増幅され、 ァスペルギルス . フラバスが存在している場合は 1 9 3塩基対又は 1 9 4塩基対 の長さの核酸が、 ァスペルギルス '二ガーが存在している場合は 1 4 8塩基対の 長さの核酸が、 ァスペルギルス 'ニドランスが存在している場合は 2 4 4塩基対 の長さの核酸が、 ァスペルギルス■亍レウスが存在している場合は 3 9 7塩基対 の長さの核酸が、 それぞれ増幅され、 これらの分子量の異なった核酸を各種電気 泳動法などによって分離 ·検出することによって、 どの種のァスペルギルス属真 菌が存在するかを判定できる。 また、 配列表の配列番号 2の核酸と、 配列番号 6 2〜6 5の核酸の混合物をプライマーにして、 P C Rなどの核酸伸長反応を行う と、 ァスペルギルス · フミガタスが存在している場合は 3 2 9塩基対の長さの核 酸が増幅され、 ァスペルギルス■ フラバスが存在している場合は 1 9 3塩基対又 は 1 9 4塩基対の長さの核酸が、 ァスペルギルス '二ガーが存在している場合は 2 3 1塩基対の長さの核酸が、 ァスペルギルス .二ドランスが存在している場合 は 2 9 4塩基対の長さの核酸が、 ァスペルギルス ·テレウスが存在している場合 は 3 7 9塩基対の長さの核酸が、 それぞれ増幅される。 配列番号 5 7の核酸 （混 合物） と、 配列番号 6 2〜6 5の核酸の混合物をプライマーにして、 P C Rなど の核酸伸長反応を行うと、 ァスペルギルス■ フミガタスが存在している場合は 3 3 0塩基対の長さの核酸が増幅され、 ァスペルギルス · フラバスが存在している 場合は 1 9 4塩基対又は 1 9 5塩基対の長さの核酸が、 ァスペルギルス ■二ガー が存在している場合は 2 3 2塩基対の長さの核酸が、 ァスペルギルス ■二ドラン スが存在している場合は 2 9 5塩基対の長さの核酸が、 ァスペルギルス ·テレゥ スが存在している場合は 3 8 0塩基対の長さの核酸が、 それぞれ增幅される。 配 列表 3、 5 8、 5 9、 6 0及び 又は 6 1 (各配列は混合物） と、 配列番号 6 6 〜 7 5の核酸の混合物をプライマーにして、 P C Rなどの核酸伸長反応を行うと、 ァスペルギルス ■ フミガタスが存在している場合は 1 6 3塩基対 （配列番号 6 8 による） 及び 1 4 6塩基対 （配列番号 6 9による） の長さの核酸が増幅され、 ァ スペルギルス · フラバスが存在している場合は 2 8 7塩基対の長さの核酸が、 ァ スペルギルス ·二ガーが存在している場合は 3 3 7塩基対 （配列番号 7 0による ) 及び 2 4 5塩基対 （配列番号 7 1 による） の長さの核酸が、 ァスペルギルス · 二ドランスが存在している場合は 2 3 6塩基対 （配列番号 7 2による） 及び 1 8 0塩基対 （配列番号 7 3による） の長さの核酸が、 ァスペルギルス 'テレウスが 存在している場合は 8 6塩基対 （配列番号 7 4による） 及び 8 3塩基対 （配列番 号 7 5による） の長さの核酸が、 それぞれ増幅される。 なお、 配列番号 6 6〜 7 5には、 各ァスペルギルス厲細菌種を增幅するためのプライマ一が 2個ずつ包含 されているので、 各ァスペルギルス属細菌につき各 1個のプライマーを選んで、 合計 5個のフォヮ一ド側プライマーの混合物を用いることにより、 上記の 5種類 のァスペルギルス厲細菌種を同時に検出及び同定することができる。
本発明を利用したァスペルギルス厲真菌検出用の試薬キッ トは、 本発明のァス ペルギルス属真菌検出用核酸もしくはこの核酸を適当な摞識剤で摞識した標識核 酸を含むことを特徴とするものである。 本発明の試薬キッ トは上記核酸を含んで いればよく、 他の成分として標識検出用試薬や緩衝液などを含んでいてもよい。 本発明の試薬キッ ト中の核酸は、 プライマーとして用いることもできるし、 また プローブとして用いることもできる。 核酸をプライマーとして用いるかプローブ として用いるかは、 その手段が異なるのみであって、 ァスペルギルス属真菌の検 出に関しては本質的には同じである。 当該試薬キッ トは、 核酸をプローブとして 使用する場合は、 上述の （I ) の方法によるァスペルギルス属真菌検出のための 試薬キッ トとして、 またプライマーとして使用する場合は、 上述の （2) の方法 によるァスペルギルス厲真菌検出のための試薬キッ 卜として用いることができる。 試薬キッ ト中の核酸をプローブとして用いる場合の本発明の試薬キッ トは、 本 発明のァスペルギルス厲真菌検出用核酸もしくは檁識化されたァスペルギルス厲 真菌検出用核酸以外に、 標識検出用試薬、 緩衝液などを含んていてもよい。 試薬 キット中の核酸をプライマーとして用いる場合の本発明の試薬キットは、 本発明 のァスペルギルス厲真菌検出用核酸もしくは榡識化されたァスペルギルス属真菌 検出用核酸以外に、 核酸合成酵素 （例えば、 D N Aポリメラーゼ， R N Aポリメ ラーゼ， 逆転写酵素など） 、 デォキシリボヌクレオチド （dATP、 dTTP、 dGTP、 dC TP) 、 リボヌクレオチド （ATP、 UTP、 GTP、 CTP) 、 制限酵素、 緩衝液などを含ん でいてもよい。 また、 本発明の核酸は固相担体に結合して、 捕捉プローブとして 用いることもできる。 この場合、 捕捉プローブと標識プローブの 2つを組合せて サンドィツチアツセィを行ってもよい。 また標的核酸を標識して捕捉する方法も ある。 さらに核酸をビォチンで標識し、 ハイブリダィゼーシヨン後、 アビジン結 合担体で捕捉する方法もある。 サンドイツチアッセィにおいてはどちらか一方に 本発明の核酸を用いれば、 本発明の核酸にて特異的な測定が可能となり、 他方の 核酸の特異性は若干低くてもなんら問題はない。
以下、 本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。 もっとも、 本発明は下 記実施例に限定されるものではない。
実施例 1 (各種 D N Aの合成）
配列表の配列番号 1 ~4、 1 0〜1 5および 5フ〜 7 5で表される配列を有す る D N Aは、 商業用受託 DN A合成サービスを利用して合成した。 以下、 配列表 の配列番号 1〜 4、 1 0〜1 5及び 57~ 75に示される各種 D N Aを、 それぞ れり 1〜4、 1 0〜 1 5及び 57〜 7 5と呼ぶ。
実施例 2 (ァスペルギルス . フミガタスのチトクローム b遺伝子増幅反応） ポテトデキス卜ロース液体培地で培養して得たァスペルギルス ■ フミガタス各 株 (Aspergi l lus fumigatus IFM 40804、 40806、 40807、 40819、 41206、 41392、 45916、 45917、 46980、 5355) の菌体を、 75 %エタノール処理し殺菌した。 150 0g、 10分間の遠心分離で菌体を得、 これらにそれぞれ約 40mlの抽出用緩衝液 （0 .9 ソルビ！ ^一ル、 10mM E D T A、 10mM トリス塩酸緩衝液 pH7.1 ) を加え 、 良く振り混ぜた後、 1500g、 10分間、 遠心分離して上澄みを捨て、 30mlの同緩 衝液を加え、 同様に遠心分離後上澄みを捨て、 9mlの同緩衝液を加えた。 これに 同緩衝液に溶解したザィモリエイス （zymolyase) 生化学工業（株）製 （10mg/ml) を 1ml加え、 37°Cで 1時間保温した後。 0. 9〜 1 . 3 mmのガラスビーズを加え 、 ボルテックスミキサーで 1〜2分間処理して細胞壁を破壊した。 これを 1500g 、 10分間の遠心分離で上澄みを得、 さらに 20000 gで 15分間、 遠心分離して沈殿 を得た。 この沈殿を抽出用緩衝液で洗浄し、 再度 20000gで 15分間、 遠心分離し てァスペルギルス · フミガタス各株のミ トコンドリア画分を得た。 これらのミ ト コンドリア画分にそれぞれ 1mg/mlのプロテアーゼ K (Protease K) を 0.5ml加え 、 37°Cで 1時間保温した。 これにフエノール、 クロ口ホルム、 イソアミルアルコ ール混合液 （25:24:1) を 1ml加え、 振り混ぜた後、 1500g、 10分間の遠心分離で 上層を取り、 これに水飽和フ： tノールを 1ml加え、 振り混ぜた後、 1500g、 10分 間の遠心分離で上層を取った。 これに 0.1mlの 3 M齚酸ナトリウム、 0.1M塩化マ グネシゥ厶溶液を加え、 3mlのエタノールを加えて、 -20°Cにー晚放置した。 これ を 20，000g、 10分間遠心分離して沈殿を得、 この沈殿を - 20°Cの 75<½エタノール で洗浄し、 1500g、 10分間遠心分雜後、 上清を捨て、 D N Aを得、 乾燥後、 -20 °Cに保存した。
これらの D N Aを錶型にし、 実施例 1で得られた D N A "1 (配列番号 1 ) とり N A 3 (配列番号 3) (IFM 40804、 40819用） または 4 (IFM40806, 40807、 412 06、 41392、 45916、 45917、 46980、 5355用） をプライマーとして、 宝酒造 （株） の TaKaRa PCR Ampl ification Kit(R0 ）を用い、 サンョ一の D N A增幅装置（Ml R - D30)を使用して以下の方法で P C R反応を行い、 チトクローム b遺伝子の一部 を増幅した。
反応液の組成は次の通リである。
x10 PGR緩衝液 （キッ 卜の試薬） 5
PCR dNTP混合液 （キッ 卜の試薬） 4μ
Taq DNA合成酵素 （キッ 卜の試薬） 1 I (2.5U)
D N A 1 1 μ
D NA 3または 4 1 μ
ミ トコンドリア D NA 1 μ
水にて全量を 50 こした。
反応条件は次の通りである。
熱変性： 94°C、 I分
ァニーリング： 50°C、 1分
重合反応 ： 72°C、 2分 增幅された D N Aをァガロースゲル電気泳動法で分離精製し、 以下の方法で塩 基配列を解析した。
パーキンエルマ一社製 DN Aシーケンサー （ABI Prism 377) を用い、 同社の 操作ガイ ドに従い、 ダイターミネータ一法により解析した。 塩基配列解析用ブラ イマ一にはフォワード側に DN A 2 (配列番号 2) を、 リバース側に D N A 3 ( IFM 40804、 40819用） または 4 (IFM40806, 40807、 41206、 41392、 45916、 4591 7、 46980、 5355用） を用いた。 決定された塩基配列を、 配列表の配列番号 1 6〜 2 5に示した。
実施例 3 (ァスペルギルス■ フラバスのチトクローム b遺伝子増幅反応）
実施例 2と同様な方法で、 ァスペルギルス ' フラバス各株（Aspergi I lus flavu s IFM 40603、 40800、 41087、 41933、 45909、 45910、 45911、 46870、 5364、 5366 )からチトクローム b遗伝子の一部を P C R反応で増幅し、 その塩基配列を決定 した。 プライマーには D N A 2と D N A 3 (IF 41933, 45910、 5366用）または 4 (IFM 40603、 40800、 41087、 45909、 4591 K 46870、 5364用) を用いた。 塩基配 列解析用プライマーにはフォワード側に D N A 2を、 リバース側に D N A 3 (IF 41933, 45910、 5366用）または 4 (IFM 40603、 40800、 41087、 45909、 45911、 4 6870、 5364用） を用いた。 決定された塩基配列を、 配列表の配列番号 26〜 35 実施例 4 (ァスペルギルス■二ガーのチトクローム b遺伝子増幅反応）
実施例 2と同様な方法で、 ァスペルギルス '二ガー各株（Aspergi I lus niger I FM 40606、 41398、 41399、 46897、 5367、 5368)からチトクローム b遗伝子の一部 を PC R反応で増幅し、 その塩基配列を決定した。 プライマーには D N A 2と D N A 3 (IFM 41399用）または 4 (IFM 40606、 41398、 46897、 5367、 5368用） を 用いた。 塩基配列解析用プライマーにはフォワード側に DN A 2を、 リバース側 に D N A 3 (IFM 41399用）または 4 (IF 40606、 41398、 46897、 5367、 5368用 ) を用いた。 決定された塩基配列を、 配列表の配列番号 36〜4 1 に示した。 実施例 5 (ァスペルギルス■ 二ドランスのチトクローム b遺伝子増幅反応） 実施例 2と同様な方法で、 ァスペルギルス '二ドランス各株（Aspergi I lus nid urans IFM 41094、 46999、 47004、 47006、 41395)からチ卜クローム b遺伝子の一 部を PC R反応で増幅し、 その塩基配列を決定した。.プライマーには DN A 2と DNA3 (IFM 47004、 47006用）または 4 (IFM 41094、 46999、 41395用） を用い た。 塩基配列解析用プライマーにはフォワード側に DN A 2を、 リバース側に D N A 3 (IFM 47004、 47006用）または 4 (IFM 41094、 46999、 41395用） を用いた 。 決定された塩基配列を、 配列表の配列番号 42〜46に示した。
実施例 6 (ァスペルギルス ·亍レウスのチトクローム b遺伝子增幅反応）
実施例 2と同様な方法で、 ァスペルギルス ·亍レウス各株 （Aspergillus terr eus IFM 40851、 40852、 41092、 5372、 40850) からチ卜クローム b遺伝子の一部 を PCR反応で増幅し、 その塩基配列を決定した。 プライマーには DNA 2と D NA 3を用いた。 塩基配列解析用プライマーにはフォワード側に DNA 2を、 リ バース側に DN A3を用いた。 決定されたその塩基配列を、 配列表の配列番号 4 7〜51に示した。
実施例 7 (カンジダ■ ケフィ一ルのチトクローム b遺伝子増幅反応）
実施例 2と同様な方法で、 実施例1で得られたDNA 1 とDNA 3を用ぃ、 力 ンジダ ·ケフィール （Candida kefyl IFM 5773、 5800) からチトクローム b遺伝 子の一部を PC R反応で增幅し、 その塩基配列を決定した。 塩基配列解析用ブラ イマ一にはフォワード側に DN A 2を、 リバース側に D N A 3を用いた。 その塩 基配列を、 配列表の配列番号 52 ~ 53に示した。
実施例 8 (カンジダ ' トロピカリスのチトクローム b遗伝子増幅反応）
実施例 2と同様な方法で、 実施例 1で得られた DNA 1 と DNA3を用い、 力 ンジダ ' トロピカリス （Candida tropical is IFM 40018、 46816) からチトクロ —ム b遺伝子の一部を PCR反応で增幅し、 その塩基配列を決定した。 塩基配列 解析用ブラィマーにはフォヮード側に D N A 2を、 リバース側に D N A 3を用い た。 その塩基配列を、 配列表の配列番号 54~ 55に示した。
実施例 9 (トリコフイートン 'ルブラムのチトクローム b遺伝子增幅反応） 実施例 2と同様な方法で、 実施例 1で得られた DN A 1 と DN A3を用い、 ト リコフィートン 'ルブラム （Trichophyton rubrum IFM 45593) からチトクロー ム b遺伝子の一部を PC R反応で増幅し、 その塩基配列を決定した。 塩基配列解 析用プライマーにはフォヮ一ド側に D N A 2を、 リバース側に D N A 3を用いた 。 その塩基配列を、 配列表の配列番号 56に示した。
実施例 1 0 (ァスペルギルス · フミガタスの PC Rによる同定）
実施例 1の D N A 2溶液と、 D N A 1 0溶液を使用して、 宝酒造 （株） の TaK aRa PCR Ampl ification K i t (R011)を用い、 サンョ一の D N A增幅装置（MIR- D30) を使用して実施例 2と同様の方法で PC R反応を行い、 ァスペルギルス ' フミガ タスのチ卜クローム b遺伝子の一部を増幅した。 ァスペルギルス ■ フミガタスの D N Aはフ Iノール抽出法により行った。 〗0 Iの增幅産物を含む反応液を 1 %ァガロースゲル電気泳動し、 ェチジゥムブロマイ ド染色した後、 紫外線照射に よる蛍光を検出した （図 1、 レーン 1および 2) 。 泳動の電気的条件は、 定電圧 肌 時問は 45分間行った。 反応液の他に分子量マーカも同時に泳動し、 相対泳 動度の比較により、 検出された D N A断片の長さを算出したところ、 約 32 3塩 基対と同定された。
実施例 1 1 (ァスペルギルス · フラバスの PC Rによる同定）
実施例 1の D N A 2溶液と、 D N A 1 1 と 1 2 (それぞれ配列番号 1 1 と 1 2 ) 溶液を使用して、 実施例 1 0と同様の方法でァスペルギルス ' フラバスのチト クローム b遺伝子の一部を PC R法で塘幅し、 増幅産物を電気泳動で検出した （ 図 1、 レーン 3、 4および 5) 。 検出された D N A断片の長さを算出したところ、 約 1 93又は約 1 94塩基対と同定された。
実施例 1 2 (ァスペルギルス ·二ガーの PC Rによる同定）
実施例 1の DN A 2溶液と、 DNA 1 3 (配列番号 1 3 ) 溶液を使用して、 実 施例 1 0と同様の方法でァスペルギルス '二ガーのチ卜クローム b遺伝子の一部 を PC R法で増幅し、 増幅産物を電気泳動で検出した （図 1、 レーン 6、 7およ び 8) 。 検出された D N A断片の長さを算出したところ、 約 1 48塩基対と同定 された。
実施例 1 3 (ァスペルギルス · 二ドランスの PC Rによる同定）
実施例 1の D N A 2溶液と、 D NA 1 4 (配列番号 1 4) 溶液を使用して、 実 施例 1 0と同様の方法でァスペルギルス .二ドランスのチトクローム b遺伝子の 一部を PC R法で増幅し、 增幅産物を電気泳動で検出した （図 1、 レーン 9およ び 1 0) 。 検出された D N A断片の長さを算出したところ、 約 2 44塩基対と同 定された。
実施例 1 4 (ァスペルギルス■テレウスの P C Rによる同定）
実施例 1の D NA 2溶液と、 D NA 1 5 (配列番号 1 5) 溶液を使用して、 実施例 1 0と同様の方法でァスペルギルス■テレウスのチトクローム b遺伝子の 一部を PCR法で増幅し、 増幅産物を電気泳動で検出した （図 1、 レーン 1 1お よび 1 2) 。 検出された DN A断片の長さを算出したところ、 約 3 97塩基対と 同定された。
なお、 上記した図 1の各レーンの菌株は具体的には次の通りである。
レ一ン 1 ： Asperug i us fumigatus IFM 40819
レ一ノ 1： Asperug ι us fumigatus IFM 40806
レ一ノ 3： Asperug i us f lavus IFM 41933
レ一ノ 4： Asperugi us f lavus IFM 5366
レ一ノ 5： asperug ι us f lavus IFM 45910
レ一ノ 0： Asperug ι us niger IFM 41398
レ一ン 7： Asperugi us niger IFM 41399
レ一ン 8： Asperugi us niger IFM 46897
レ一ノ 9： Asperug ι us nidurans IFM 7004
レ一ン 10： Asperug I us nidurans IFM 41094
レ―ン 11 ·· Asperug I us terreus IFM 40850
レ一ン 12： Asperug I us terreus IFM 41092
レーン 13.サイズマーカ (100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900、 1 000、 1500 bp)
実施例 1 5 (カニングハメ ベル卜レチアェのチ卜クローム b遺伝子増幅反 応）
実施例 2と同様な方法でカニングハメ ベリレ卜レチアェ (Cunninghamel la be rthol letiae IF 46114) からチトクローム b遺伝子の一部を P C R反応で増幅 し、 その塩基配列を決定した。 プライマーには DNA 57と DNA 58を用いた。 塩基配列解析用プライマーにはフォヮ一ド側に DN A 57を、 リバース側に DN A 58を用いた。 決定された塩基配列を、 配列表の配列番号 76に示した。
実施例 1 6 (ムコール ' シルシネロイデスのチ卜クローム b遺伝子增幅反応） 実施例 2と同様な方法で厶コール 'シルシネロイデス （Mucor circinel loides IFM 40507) からチ卜クローム b遺伝子の一部を PCR反応で增幅し、 その塩基配 列を決定した。 プライマーには DNA 57と DNA60および DNA6 1 を用いた。 塩基配列解析用プライマーにはフォワード側に DNA57を、 リバース側に DN A 60及び DNA 6 1を用いた。 決定された塩基配列を、 配列表の配列番号 77に示 した。
実施例 1 7
実施例 1 0~ 1 4と同様な方法でァスペルギルス各種の PCRによる同定を行 つた。 プライマーには D N A 5 7と、 ァスペルギルス'フミガタスには D N A 6 5を、 ァスペルギルス · フラバスには D N A 1 1 と D N A 1 2を、 ァスペルギル ス ■二ガーには D N A 64を、 ァスペルギルス ■二ドランスには D N A 6 3を、 ァスペルギルス ·テレウスには D NA 6 2を用いた。 電気泳動の結果を図 2に示 した。 図 2の各レーンの菌株は図 1の場合と同じである。
実施例 1 8
実施例 1 0〜1 4と同様な方法でァスペルギルス各種の PC Rによる同定を 行った。 プライマーには D N A 3と、 ァスペルギルス'フミガタスには D N A6 8を、 ァスペルギルス ' フラバスには D N A 66と D N A 6 7を、 ァスペルギル ス ■二ガーには D N A 70を、 ァスペルギルス■二ドランスには D N A 7 2を、 ァスペルギルス ·テレウスには D N A 74を用いた。 電気泳動の結果を図 3に示 した。 図 3の各レーンの菌株は図 1の場合と同じである。 w
実施例 1 9
実施例 1 0~ 1 4と同様な方法でァスペルギルス各種の PC Rによる同定を行 つた。 プライマーには D N A 58と、 ァスペルギルス'フミガタスには D N A 6 9を、 ァスペルギルス ' フラバスには D N A 6 6と D N A 6 7を、 ァスペルギル ス '二ガーには D N A 7 1 を、 ァスペルギルス ·二ドランスには D N A 7 3を、 ァスペルギルス ·テレウスには D N A 7 5を用いた。 電気泳動の結果を図 4に示 した。 図 4の各レーンの菌株は図 1の場合と同じである。
産業上の利用可能性
本発明は、 病原真菌、 ことにァスペルギルス属真菌を迅速、 簡便に特異的且つ 高感度で検出 '分類 '同定することに用いることができる。 このため、 病原真菌 に感染した患者について、 早期に起炎菌を明らかにして的確な治療をすることが 可能になる。
配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
配列
TGAGGT6CTA CAGTTATTAC 20
配列番号： 2
配列の長さ ： 21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
配列
GAGGTGCTAC AGTTATTACT A 21
配列番号： 3
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
配列
GGTATAGMTC TTAAWATAGC 20 配列番号： 4
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
配列
AAAATAGCAT A6AAA6GTAA 20 配列番号： 5
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列 ： N o
起源 ： ァスへ レチ レス フミ力タス (Asperg i l l us fum i gatus;
配列
TGA6GTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATA6G TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 1 20 TTAGATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180 CAC6ATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA 6TTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAG6TGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425
配列番号： 6
配列の長さ ： 425 配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセ亍ィカル配列： N o
起源 ： ァスぺゾレキノレス フラ /ヽ Λ (Asperg i I l us f l avus)
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGAYATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATYGCTATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 丌 TGCTGCAT ATTTCATATT TAAAGA丌 TA GTWACTATCT 丌 A丌 TTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTYAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATYGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 配列番号： フ
配列の長さ ： 425
配列の型 ：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列 N o
起源： ァスペルギルス 二ガー （Asperg i l l us n i ger)
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CATGAATAG6 TCAAGATATA 60 GTTGAGTTCA TATGAGGWGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACACTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCACTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCAGG TAATCCATTA GGAATATCA6 GTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTTGCACCAT ATTTTATATT TAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCA TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AAYCCAATGC AAACTCCACC TGCWATTGTA CCAGAGTGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 配列番号 8
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列 ： N o
源 ： ァスへノレキノレス ニトランス (Asperg i l l us n i du l ansノ
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTAATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATT 60 GTTGAGTTTA TTTGAG6AGG TTTYTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCTTTAGCAT TAATGCATTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCA6G KAATGCTTTA GGTATTTCAG CTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTT6CTCCTT ATTTTATATT TAAAGATTTA ATAACTATAT TTATATTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCTATGC AAACTCCACC TGCTATAGTT CCAGAATGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420 ATTTTA 425 配列番号： 9
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセ亍ィカル配列： N o
起源： ァスペルギルス 亍レウス （Asperg i l l us terreus) 配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACTTAATG AGTGCTATAC CTT6AATTGG TCAAGATATA 60
GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAATAG ATTCTTTGCA 120
TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCWTTAGTTA TTATGCACTT AATAGCAATG 180
CACGATACTG TAGGATGAGG TAATCCTTTA GGTATATCAG GTAACTACGA TAGATTACCT 240
TTCGCTCCAT ATTTCGTATT CAAA6ATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300
TCTATATTTG TTTTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGAGACA GTGAAAATTA TGTTATGGCA 360
AACCCAATGC AAACACCACC TGCTATTGTA CCAGAATGAT ACTTATTACC ATTCTATGCT 420 ATTTTA 425
配列番号： 1 0
配列の長さ ： 21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
配列
AGGCATGAAG AATACAAATA C 21 配列番号： 1 1
配列の長さ ： 22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
配列
TCCTACAGTA TCGTGCATAG CG 22 配列番号： 1 2
配列の長さ ： 21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
配列
CCTACAGTAT CGTGCATAGC A 21
配列番号： 1 3
配列の長さ ： 24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列 ： N o
配列
GCTAATACAA AAGGTAATAA GAA6 24
配列番号： 1 4
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
配列
GCAAAAGGTA ATCTATCGTA ATTA6 25
配列番号： 1 5 配列の長さ ： 24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
配列
CATTCTGGTA CAATAGCAGG TGGT 24
配列番号： 1 6
配列の長さ ： 4 3 7
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源：ァスペルギルス ' フミガタス I F M 4 0 8 0 4
配列
T6A6GTGCTA CA6TTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60 6TTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTA6CT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TGTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAG6TGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTTAAGAT CTATACC 437
配列番号： 1 7
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸 鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源： ァスペルギルス ' フミガタス I F M 4 0 8 0 6
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 配列番号： 1 8
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列 ： N o
起源：ァスペルギルス ' フミガタス I F M 4 0 8 0 7
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 1 20 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420
ATTTT 425 配列番号： 1 9
配列の長さ ： 4 3 7
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列 ： N o
起源： ァスペルギルス ' フミガタス I F M 4 0 8 1 9
配列
TGAGGTGCTA CA6TTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTT6AATAGG TCAAGATATA 60
GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120
TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180
CACGATACTG TAGGATGTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240
TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300
TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360
AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTTAAGAT CTATACC 437 配列番号： 2 0
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源： ァスペルギルス · フミガタス I F M 4 1 2 0 6
配列 TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TG丌 TTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCGTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 配列番号： 2 1
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源： ァスペルギルス ' フミガタス I F M 4 1 3 9 2
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCT丌 GCA 120 TTACATTTCT TA丌 ACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 配列番号： 2 2
配列の長さ 425 配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源：ァスペルギルス · フミガタス I F M 4 5 9 1 6
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC T6CTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 配列番号： 2 3
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源：ァスペルギルス · フミガタス I F M 4 5 9 1 7
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60
GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120
TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180
CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240
TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGT6ATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360
AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTA丌 GTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425
配列番号： 2 4
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源： ァスペルギルス . フミガタス I F M 4 6 9 8 0
配列
TGAG6TGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG A6TGCTATAC CTTGAATAG6 TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATA6 ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATA6CAATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA 6TTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 配列番号： 2 5
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源：ァスペルギルス■ フミガタス I F M 5 3 5 5 配列
TGAGGTGCTA GAGTTA丌 AC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TATGA6GTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTA6CT GCATTAGTAA TAAT6CATTT AATAGCAATG 180 CAGGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTGTATTTG TATTCTTCAT 6CCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCG6AATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425
配列番号： 2 6
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源：ァスペルギルス - フラバス I F M 4 0 6 0 3
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAA6ACATA 60
GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGGAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120
TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180
CAGGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240
TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTTACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300
TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360
AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATCGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425
配列番号： 2 7 配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源：ァスペルギルス ' フラバス I F M 4 0 8 0 0
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAA6ATATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 丌 ACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTA6CTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425
配列番号： 2 8
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源：ァスペルギルス■ フラバス I F M 4 1 0 8 7
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGACATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTA6CTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTTACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTGCACC TGCTATCGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425
配列番号： 2 9
配列の長さ ： 4 3 7
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセ亍ィカル配列： N o
起源： ァスペルギルス ' フラバス I F M 4 1 9 3 3
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATT6CTATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TA6ATTACCT 240 TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTTACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTCAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATCGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTTAAGAT CTATACC 437
配列番号： 3 0
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o 起源： ァスペルギルス ' フラバス I F M 4 5 9 0 9
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTAT6 AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGACATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA G6TATATCT6 GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTT6CTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTTACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAAT6CT TTA6GAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATCGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 配列番号： 3 1
配列の長さ ： 4 3 7
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源：ァスペルギルス■ フラバス I F M 4 5 9 1 0
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGACATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTTACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAAT6CT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATCGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTTAAGAT CTATACC 437 配列番号： 3 2
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源： ァスペルギルス ' フラバス I M 4 5 9 1 1
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGACATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180. CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTTACTATCT TTATTTTC丌 TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTAT6GCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATCGTT CCAGAATGAT AG丌 ATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425
配列番号： 3 3
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源：ァスペルギルス■ フラバス I F M 4 6 8 7 0
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGACATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240
TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTTACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300
TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360
AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATCGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 配列番号： 3 4
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源：ァスペルギルス ' フラバス I F M 5 3 6 4
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGT6CTATAC CTTGAATAGG TCAAGACATA 60 GTT6AATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTTACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATCGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 配列番号： 3 5
配列の長さ ： 4 3 7
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状 4 ハイポセティカル配列： N o
起源：ァスペルギルス■ フラバス I F M 5 3 6 6
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTGTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180 CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240 TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCAGAATGAT AC丌 ATTACG TTTCTATGCT 420 ATTTTAAGAT CTATACC 437
配列番号： 3 6
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー： 直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源：ァスペルギルス■二ガー F M 4 0 6 0 6
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CATGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAGTTCA TATGAGGTGG TTTGTCTGTA AATAATGCAA CATTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACACTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCACTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCAG6 TAATCCATTA GGAATATCAG GTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTTGCACCAT ATTTTATATT TAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTT6 TTTTCTTTAT GCCTAATGCA TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AACCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTA CCAGAGTGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 配列番号： 3 7
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源： ァスペルギルス ·二ガー I F M 4 1 3 9 8
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CATGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAGTTCA TATGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACACTTCT TATTACGTTT TGTATTA6CT GCATTAGCTT TAATGCACTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCAGG TAATCCATTA GGAATATCAG GTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTTGCACCAT ATTTTATATT TAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCA TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATG6CT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCAATTGTA CCAGAGTGAT ATCTHTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 配列番号： 3 8
配列の長さ ： 4 3 7
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源：ァスペルギルス .二ガー I F M 4 1 3 9 9
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CATGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAGTTCA TATGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACACTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCACTT AATAGCTATG 180
CACGATACAG TAGGATCAGG TAATCCATTA GGAATATCAG GTAATTACGA TAGATTACCT 240
TTTGCACCAT ATTTTATATT TAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTG丌 TATTGTATTA 300
TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCA TTAG6A6ATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360
AATCCAATGC AAACTCCACC TGCAATTGTA CCAGAGTGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420 ATTTTAA6AT CTATACC 437 配列番号： 3 9
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列 ： N o
起源： ァスペルギルス -二ガー I F M 4 6 8 9 7
配列
TGA6GTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CATGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAGTTCA TATGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACACTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCACTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCAGG TAATCCATTA GGAATATCAG GTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTTGCACCAT ATTTTATATT TAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCA TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCAATTGTA CCAGAGTGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425
配列番号： 4 0
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源： ァスペルギルス '二ガー I F M 5 3 6 7
配列
TGAGGTGGTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CATGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAGTTGA TATGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACACTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCACTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCAGG TAATCCATTA GGAATATCAG GTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTTGCACCAT ATTTTATATT TAAA6ATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCA TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCAATTGTA CCAGAGTGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 配列番号： 4 1
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列 ： N o
起源： ァスペルギルス ·二ガー I F M 5 3 6 8
配列
TGAGGTGGTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CATGAATAGG TCAAGATATA 60 GTTGAGTTGA TATGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACACTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCACTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCAGG TAATCCATTA GGAATATCAG GTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTTGCACCAT ATTTTATATT TAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCA TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCAATGC AAACTCCACC TGCAATTGTA CCAGAGTGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 配列番号： 4 2
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源：ァスペルギルス，ニドランス I F M 4 1 0 9 4
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTAATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATT 60 GTTGAGTTTA TTTGAGGAGG TTTTTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCTTTAGCAT TAATGCATTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCAGG TAATCCTTTA GGTATTTCAG CTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTTGCTCCTT ATTTTATATT TAAAGATTTA ATAACTATAT TTATATTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCTATGC AAACTCCACC TGCTATA6TT CCAGAATGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 配列番号： 4 3
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー： 直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源：ァスペルギルス ' ニドランス I F M 4 6 9 9 9
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTAATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATT 60 GTTGAGTTTA TTTGAGGAGG TTTTTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCTTTAGCAT TAATGCATTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCAGG TAATCCTTTA GGTATTTCAG CTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTTGCTCCTT ATTTTATATT TAAAGATTTA ATAACTATAT TTATATTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCTATGC AAACTCCACC TGCTATA6TT CCAGAATGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420 ATTTT 425 配列番号： 4 4
配列の長さ ： 4 3 7
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源：ァスペルギルス 'ニドランス I F M 4 7 0 0 4
配列
TGAG6TGCTA CAGTTATTAC TAACCTAATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATT 60 GTTGAGTTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCTTTAGCAT TAATGCATTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCAGG GAATCCTTTA GGTATTTCAG CTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTTGCTCCTT ATTTTATATT TAAAGATTTA ATAACTATAT TTATATTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCTATGC AAACTCCACC TGCTATAGTT CCAGAATGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420 ATTTTAAGAT CTATACC 437 配列番号： 4 5
配列の長さ ： 4 3 7
配列の型：核酸 鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N O
起源： ァスペルギルス - 二ドランス I F M 4 7 0 0 6
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTAATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATT 60 GTTGAGTTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCTTTAGCAT TAATGCATTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCAGG GAATCCTTTA GGTATTTCAG CTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTTGCTCCTT ATTTTATATT TAAAGATTTA ATAACTATAT TTATATTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCTATGC AAACTCCACC TGCTATAGTT CCAGAATGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420 ATTTTAAGAT CTATACC 437 配列番号： 4 6
配列の長さ ： 425
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列 ： N o
起源： ァスペルギルス -二ドランス I F M 4 1 3 9 5
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTAATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATT 60 GTTGAGTTTA TTTGAGGAGG TTTTTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAACAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCTTTAGCAT TAATGCATTT AATAGCTATG 180 CACGATACAG TAGGATCAGG TAATCCTTTA GGTATTTCAG CTAATTACGA TAGATTACCT 240 TTTGCTCCTT ATTTTATATT TAAAGATTTA ATAACTATAT TTATATTCTT TATTGTATTA 300 TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360 AATCCTATGC AAACTCCACC TGCTATAGTT CCAGAATGAT ATCTTTTACC TTTCTAT6CT 420 ATTTT 425
配列番号 4 7
配列の長さ ： 4 3 7
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列 ： N o
起源：ァスペルギルス 'テレウス I F M 4 0 8 5 1
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACTTAATG AGTGCTATAC CTTGAATTGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGTTA TTATGCACTT AATAGCAATG 180 CACGATACTG TAGGATCAGG TAATCCTTTA GGTATATCAG GTAACTACGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCAT ATTTCGTATT CAAA6ATTTA 6TAACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTCAT GCCTAACGCA 7TAGGAGACA GTGAAAATTA TGTTATGGCA 360 AACCGAATGC AAACACCAGC TGCTATTGTA CCAGAATGAT ACTTATTACC ATTCTATGCT 420 ATTKTAAGAT CTMTACC 437 配列番号： 4 8
配列の長さ ： 4 3 7
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列 ： N o
起源：ァスペルギルス 'テレウス I F M 4 0 8 5 2
配列 TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACTTAATG A6TGCTATAC CTTGAATT6G TCAAGATATA 60
GTTGAA丌 TA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAATAG ATTCTTTGCA 120
TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGTTA TTATGCACTT AATAGCAATG 180
CACGATACTG TAGGATCAGG TAATCCTTTA GGTATATCAG GTAACTACGA TAGATTACCT 240
TTCGCTCCAT ATTTCGTA丌 GAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300
TCTATATTTG TTTTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGAGACA GTGAAAATTA TGTTATGGCA 360
AACCCAATGC AAACACCACC TGCTATTGTA CCAGAATGAT ACTTATTACC ATTCTATGCT 420 ATTKTAAGAT CT TACC 437 配列番号： 4 9
配列の長さ ： 4 3 7
配列の型 ：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源 ： ァスペルギルス ' テレウス I F M 4 1 0 9 2
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACTTAATG AGTGCTATAC CTTGAATTGG TCAAGATATA 60
GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAATAG ATTCTTTGCA 120
TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCTTTAGTTA TTATGCACTT AATAGCAATG 180
CACGATACTG TAGGATCAGG TAATCCTTTA GGTATATCAG GTAACTACGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCAT ATTTCGTATT CAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTC丌 TATAGTATTA 300
TCTATATTTG TTTTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGAGACA GTGAAAATTA TGTTATGGCA 360
AACCCAATGC AAACACCACC TGCTATTGTA CCAGAATGAT ACTTATTACC ATTCTATGCT 420 ATTKTAAGAT CTMTACC 437 配列番号： 5 0
配列の長さ ： 4 3 7 配列の型：核酸
鎖の数： 両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源： ァスペルギルス ·テレウス I F M 5 3 7 2
配列
TGA6GTGCTA CAGTTATTAC TAAGTTAATG AGTGCTATAC CTT6AATTGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGTTA TTATGCACTT AATAGCAATG 180 CACGATACTG TAGGATCAGG TAATCCTTTA GGTATATCAG GTAACTACGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCAT ATTTCGTATT CAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGAGACA 6TGAAAATTA TGTTATGGCA 360 AACCCAATGC AAACACCACC TGCTATTGTA CCAGAATGAT ACTTATTACC ATTCTATGCT 420 ATTKTAAGAT CT TACC 437 配列番号： 5 1
配列の長さ ： 4 3 7
配列の型：核酸
鎖の数： 両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源： ァスペルギルス 'テレウス I F M 4 0 8 5 0
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACTTAATG AGTGCTATAC CTTGAATTGG TCAAGATATA 60 GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAATAG ATTCTTTGCA 120 TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGTTA TTATGCACTT AATAGCAATG 180 CACGATACTG TAGGATCAGG TAATCCTTTA GGTATATCAG GTAACTACGA TAGATTACCT 240 TTCGCTCCAT ATTTCGTATT CAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300 TCTATATTTG TTTTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGAGACA GTGAAAATTA TGTTATGGCA 360
AACCCAATGC AAACACCACC TGCTATTGTA CCAGAATGAT ACTTATTACC ATTCTATGCT 420 ATTKTAAGAT CTMTACC 437
配列番号： 5 2
配列の長さ ： 4 3 4
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源： カンジダ 'ケフィール I F M 5 7 7 3
配列
TGA6GTGCTA CAGTTATTAC TAATTTATTC TCA6CTATTC CATTAATTGG ACAAGATATT 60
6TATTATGAT TATGAGGAGG TTTCTCAGTA TCTAACCCTA CAATTCAAAG ATTCTTTGCA 120
TTCCATTACT TAGTACCATT TATTATTGCT GCTTGTGTAA TTATGCATTT AATGGCTTTA 180
CATACACATG GTTCATCAAA TCCTTTAGGT GTAACAGGTA ATTTAGATAG ATTACCAATG 240
CATG6ATACT TTATTTTTAA AGATTTAATT ACAGTATTTG TATTCTTAAT TTTCTTCTCA 300
TTATTTGTAT TCTTCTCACC TAATACATTA GGACATCCTG ATAACTATAT TCCAGGTAAT 360
GCATTAGTAA CACCAGCATC AATTGTACCT GAATGATACT TATTACCATT TTATGCTATW 420 TTAAGATCTA TACC 434 配列番号： 5 3
配列の長さ ： 4 3 4
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源： カンジダ 'ケフィール I F M 5 8 0 0 配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATTTATTC TCAGCTATTC CATTAATTGG ACAAGATATT 60
6TATTATGAT TATGAG6AGG TTTCTCAGTA TCTAACCCTA CAATTCAAAG ATTCTTTGCA 120
TTCCATTACT TAGTACCATT TATTATT6CT GCTTGTGTAA TTATGCATTT AATGGCTTTA 180
CATACACATG GTTCATCAAA TCCTTTAGGT GTAAGAGGTA ATTTAGATAG ATTACCAATG 240
CATGGATACT TTATTTTTAA AGATTTAATT ACAGTATTTG TATTCTTAAT TTTCTTCTCA 300
TTATTTGTAT TCTTCTCACC TAATACATTA GGACATCCTG ATAACTATAT TCCAGGTAAT 360
CCATTAGTAA CACCAGCATC AATTGTACCT GAATGATACT TATTACCATT TTATGCTATT 420 TTAAGATCTA TACC 434 配列番号： 5 4
配列の長さ ： 4 3 4
配列の型：核酸
核酸鎖の数：両形態
トポロジー： 直鎖状
ハイポセ亍ィカル配列 ： N o
起源： カンジダ■ トロピカリス I F M 4 0 0 1 8
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACTTATTA TCAGCTATAC CATTTATAGG TAATGATATA 60 GTACCATTTA TAT6A6GAGG TTTCTCTGTA TCAAATCCTA CAATACAAAG ATTTTTTGCA 120 TTACATTATT TATTACCATT TATTTTAGCA GCATTAGTAG TAATGCATTT TATAGCATTA 180 CATACTCATG GATCATCTAA TCCTGTAGGA ATATCAAGTA ATTTAGATAG AATACCAATG 240 CATAGTTACT TTATATTTAA AGATTTAATT ACTGTATTTG TATTTATATT AGTATTTAGT 300 TTATTTGTAT TCTTCTCACC TAATACTTTA GGACATCCTG ATAACTATAT ACCAGGTAAT 360 CCTATGGTTA CACCTGCATC TATAGTACCT GAATGATATT TATTACCATT CTATGCTATA 420 TTAAGATCTA TACC 434
配列番号： 5 5 配列の長さ ： 4 3 4
配列の型：核酸
核酸鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源： カンジダ ' トロピカリス I F M 4 6 8 1 6
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC WAACTTATTA TCAGCTATAC CATTTATAGG TAATGATATA 60 GTACCATTTA TATGAGGAGG TTTCTCTGTA TCAAATCCTA CAATACAAAG ATTTTTTGCA 120 TTACATTATT TATTACCATT TATTTTAGCA GCATTAGTAG TAATGCATTT TATAGCATTA 180 CATACTCATG GATCATCTAA TCCTGTAG6A ATATCAAGTA ATTTAGATAG AATACCAATG 240 CATAGTTACT TTATATTTAA AGATTTAATT ACTGTATTTG TATTTATATT AGTATTTAGT 300 TTATTTGTAT TCTTCTCACC TAATACTTTA GGACATCCTG ATAACTATAT ACCAGGTAAT 360 CCTATGGTTA CACCTGCATC TATAGTACCT GAATGATATT TATTACCATT CTATGCTATW 420 TTAAGATCTA TACC 434 配列番号： 5 6
配列の長さ ： 4 3 7
配列の型：核酸
核酸鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源： トリコフイートン ·ルブラム I F M 4 5 5 9 3
配列
TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATTTATTA AGTGCTATAC GTTGAATT6G TCAAGATTTA 60
GTAGAATTTA TTTGA6GAGG TTTTTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTTTTTTCT 120
TTACATTATT TATTACCTTT TATATTAGCT GCTTTAGTTT TAATGCATTT AATAGCATTA 180
CATGATACTG TTGGTTCTAG TAATCCTTTA GGTATTTCAG GTAATTAT6A TA6ATTACCT 240 TTTGCTCCTT ACTTTTTATT TAAAGATTTA GTTACTATTT TCTTATTTAT GCTTGGTTTA 300
TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGTGACT GTGAAAATTA TGTAATGGCT 360
AATCCTAT6C AAACACCAGC TGCTATTGTT CCTGAATGAT ATTTATTAGC TTTTTATGCT 420
ATATTAAGAT CTATACC 437
配列番号： 57
配列の長さ ： 22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列 ： N o
配列
TGRGGWGCWA CWGTTATTAC TA 22
配列番号： 58
配列の長さ ： 22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセ亍ィカル配列： N o
配列
GGWATAGMWS KTAAWAYAGC ATA 22
配列番号： 59
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状 ハイポセ亍ィカル配列： N o
配列
GGTATAGMWS KTAAWAYAGC 20
配列番号： 60
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列 ： N o
配列
GGTATAG WG TTAAWATAGC 20
配列番号： 61
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
配列
GGTATAGATC TTAAWATAGC 20
配列番号： 62
配列の長さ ： 21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセ亍ィカル配列： N o 配列
GGTGGTGTTT GCATTGGGTT 21
配列番号： 63
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
配列
CAATAAAGAA TATAAATATA GTTAT 25
配列番号： 64
配列の長さ ： 26
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
配列
TATCGTAATT ACCTGATATT CCTAAT 26
配列番号： 65
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセ亍ィカル配列： N o
配列 T6CGTTAG6C ATGAAGAATA CAAATAC 27
配列番号： 66
配列の長さ ： 24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセ亍ィカル配列： N o
配列
GCATTAGCTT TAAT6CATTT AATC 24
配列番号： 67
配列の長さ ： 24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列 ： N o
配列
GCATTAGCTT TAATGCATTT AATT 24
配列番号： 68
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列 ： N o
配列
CTGTATTTAT TTTCTTTATA GTATTATCTG 30 配列番号： 69
配列の長さ ： 21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
配列
ATAGTATTAT CTGTATTTGT A 21
配列番号： 70
配列の長さ ： 26
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
配列
CATTAAACAG ATTCTTTGCA TTACAC 26 配列番号： 71
配列の長さ ： 21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列 ： N o
配列
GGATCAGGTA ATCCATTAGG A 21 配列番号： 72
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列 ： N o
配列
AATCCTTTAG GTATTTCAGC 20
配列番号： 73
配列の長さ ： 28
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
配列
ATTTAAAGAT TTAATAACTA TATTTATA 28 配列番号： 74
配列の長さ ： 24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
配列
6TTATGGCAA ACCCAATGCA AACA 24 配列番号： 75 配列の長さ ： 21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
配列
ATGGCAAACC CAATGCAAAC A 21 配列番号： 7 6
配列の長さ ： 434
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列： N o
起源： カニングハメラ ベルトレチアェ （Cunn i nghame l l a bertho i l et i ae) 配列
TGGGGAGCAA CAGTTATTAC TAATTTATTA TCTGCTATTC CTTGGATTGG TAAA6ATCTT 60
GTAGAATTTA TTTGGGGTGG TTTCAGTGTT GATAATGCTA CTTTAAATCG ATTCTTTAGT 120
CTACATTATT TATTACCATT CATTCTTGCT GCTTTAGCAG TTATGCATTT AATTGCAAAA 180
GAAGAAAATG GATCAAGTAA TCCATTAGGA ATTACAGCTA ATGCTGATAT GATTTATATG 240
CATCCATATT ATATCTTTAA AGATTTAGTA ACTATTTTCT TATTCTTCTT AGTATTAGGA 300
TTATTCTTAT TTTATGCTCC TAATAAATTA GGACATCCTG ATAATTATAT TCCAGCTAAT 360
CCAATGCAAA CTCCAGCTTC TATTGTTCCT GAGTGGTATC TATTACCATT TTATGCTATT 420
TTAASWKCTA TWCC 434
配列番号： 7 7
配列の長さ ： 434
配列の型：核酸 鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル配列 N o
Jgjfe ： ムコ一ノレ シノレンネロ 了ス (Mucor c i rc i ne l l o i des)
配列
TGGGGA6CAA CAGTTATTAC TAACCTATTA TCGGCTATCC CTTGGATTG6 TAAAGATTTA 60 GTAGAATTCA TCTGGGGAGG TTTCTCTGTA GATAATGCGA CATTAAACCG ATTCTTCAGT 120 CTTCACTACT TATTACCATT CATCTTAGCA GCTTTATCTT TAATGCATTT AATTGCTAAA 180 GAAGAAAATG GATCTAATAA TCCACTAGGA ATTACAGCAA ACACTGATAT GGTTTATCTT 240 CATCCTTATT ACGTATTTAA AGATTTAGTA ACAATTTTCT TATTCTTCTT AGTATTAGCT 300 TTATTCTTAT TCTAT6CACC TAATAAA丌 A 6GTCATCCTG ATAATTATAT TCCAGCTAAC 360 CCAATGCAAA CTCCTGCATC TATTGTACCA 6AATGGTATC TATTACCTTT CTATGCTATT 420 TTAASWKCTA TWCC 434

Claims

請求の範囲
1 . 配列表の配列番号 5 7に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミンは ゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列のうち連続する少 なくとも 1 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片から成る真菌のミ トコンド リアのチトクロム b遺伝子断片増幅用プライマー。
2 . 配列表の配列番号 5 7 (ただし、 任意の位置のチミンはゥラシルに置換され ていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断片から成る請求項 1記 載のプライマ一。
3 . 配列表の配列番号 3に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミンはゥ ラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列のうち連続する少な くとも 1 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片から成る真菌のミ トコンドリ ァのチトクロム b遗伝子断片増幅用プライマー。
4 . 配列表の配列番号 3 (ただし、 任意の位置のチミンはゥラシルに置換されて いてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断片から成る請求項 3記載 のプライマー。
5 . 配列表の配列番号 5 8に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミンは ゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列のうち連続する少 なくとも 1 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片から成る真菌のミ トコンド リアのチトクロム b遺伝子断片増幅用プライマー。
6 . 配列表の配列番号 5 8 (ただし、 任意の位置のチミンはゥラシルに置換され ていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断片から成る請求項 5記 載のプライマー。
7 . 配列表の配列番号 5 9に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミンは ゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列のうち連続する少 なくとも 1 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片から成る真菌のミ トコンド リアのチ卜クロム b遺伝子断片増幅用プライマー。
8 . 配列表の配列番号 5 9 (ただし、 任意の位置のチミンはゥラシルに置換され ていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断片から成る讅求項 7記 載のプライマ一。
9 . 配列表の配列番号 6 0に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミンは ゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列のうち連続する少 なくとも 1 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片から成る真菌のミ トコンド リアのチトクロム b遺伝子断片増幅用プライマー。
1 0 . 配列表の配列番号 6 0 (ただし、 任意の位置のチミンはゥラシルに置換さ れていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断片から成る請求項 9 記載のプライマー。
1 1 . 配列表の配列番号 6 1に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列のうち連続する 少なくとも 1 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片から成る真菌のミ トコン ドリアのチトクロム b遺伝子断片増幅用プライマー。
1 2 . 配列表の配列番号 6 1 (ただし、 任意の位置のチミンはゥラシルに置換さ れていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断片から成る請求項 1 1記載のプライマー。
1 3 . 各配列番号に示される一般式で表わされる塩基配列を有する核酸断片の混 合物から成る請求項 1ないし 1 2のいずれか 1項に記載のプライマー。
1 4 . 前記真菌は、 ァスペルギルス属真菌である請求項 1ないし 1 3のいずれか 1項記載のプライマー。
1 5 . 前記真菌は、 カンディダ厲真菌である請求項 1ないし 1 3のいずれか 1項 記載のプライマー。
1 6 . 前記真菌は、 カニングハメラ属真菌である請求項 1ないし 1 3のいずれか 1項記載のプライマー。
1 7 . 前記真菌は、 ムコール厲真菌である請求項 1ないし 1 3のいずれか 1項記 載のプライマー。
1 8 . 前記ァスペルギルス属真菌は、 ァスペルギルス ' フミガタス、 ァスペルギ ルス 'フラバス、 ァスペルギルス■二ガー、 ァスペルギルス■二ドランス及びァ スペルギルス ■亍レウスから成る群より選ばれる請求項 1 4記載のプライマー。
1 9 . 配列表の配列番号 5に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミンは ゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列の連続する 1 0な いし 1 0 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片から成るァスペルギルス · フ ミガタス検出用核酸。
2 0 . 配列表の配列番号 6に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミンは ゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列の連続する 1 0な いし 1 0 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片から成るァスペルギルス · フ ラバス検出用核酸。
2 1 . 配列表の配列番号 7に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミンは ゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列の連続する 1 0な いし 1 0 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片から成るァスペルギルス -二 ガー検出用核酸。
2 2 . 配列表の配列番号 8に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミンは ゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列の連続する 1 0な いし 1 0 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片から成るァスペルギルス '二 ドランス検出用核酸。
2 3 . 配列表の配列番号 9に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミンは ゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列の連続する 1 0な いし 1 0 0塩基から成る塩基配列を有す^)核酸断片から成るァスペルギルス■テ レウス検出用核酸。
2 4 . 前記連続する 1 0ないし 1 0 0塩基は、 1 5ないし 3 0塩基である請求項 1 9ないし 2 3のいずれか 1項記載の検出用核酸。
2 5 . 配列表の配列番号 5に示す配列の 2 4番目の Tを 3 '末端とする、 少なく とも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 5に示す配列の相補的配列の上記に対 応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスペル ギルス · フミガタス検出用核酸。
2 6 . 配列表の配列番号 5に示す配列の 9 9番目の Tを 3 '末端とする、 少なく とも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 5に示す配列の相補的配列の上記に対 応ずる塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスペル ギルス · フミガタス検出用核酸。
2 7 . 配列表の配列番号 5に示す配列の 1 4 4番目の Tを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 5に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス · フミガタス検出用核酸。
2 8 . 配列表の配列番号 5に示す配列の 2 5 2番目の Cを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 5に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス · フミガタス検出用核酸。
2 9 . 配列表の配列番号 5に示す配列の 2 7 7番目の Gを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 5に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス ' フミガタス検出用核酸。
3 0 . 配列表の配列番号 5に示す配列の 3 0 4番目の Gを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 5に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス · フミガタス検出用核酸。
3 1 . 配列表の配列番号 5に示す配列の 3 1 2番目の Aを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 5に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス · フミガタス検出用核酸。
3 2 . 配列表の配列番号 5に示す配列の 3 9 3番目の Gを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 5に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス · フミガタス検出用核酸。
3 3 . 配列表の配列番号 6に示す配列の 1 7 4番目の Yを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 6に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス · フラバス検出用核酸。
3 4 . 配列表の配列番号 7に示す配列の 4 2番目の Aを 3 '末端とする、 少なく とも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 7に示す配列の相補的配列の上記に対 応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスペル ギルス ·二ガー検出用核酸。
3 5 . 配列表の配列番号 7に示す配列の 6 9番目の Cを 3 '末端とする、 少なく とも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 7に示す配列の相補的配列の上記に対 応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスペル ギルス■二ガー検出用核酸。
3 6 . 配列表の配列番号 7に示す配列の 1 2 6番目の Cを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 7に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス · 二ガー検出用核酸。
3 7 . 配列表の配列番号 7に示す配列の 2 0 7番目の Aを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 7に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス ·二ガー検出用核酸。
3 8 . 配列表の配列番号 7に示す配列の 2 1 3番目の Aを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 7に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス · 二ガー検出用核酸。
3 9 . 配列表の配列番号 7に示す配列の 2 4 6番目の Aを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 7に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス■ 二ガー検出用核酸。
4 0 . 配列表の配列番号 7に示す配列の 3 9 6番目の Gを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 7に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス ■ 二ガー検出用核酸。
4 1 . 配列表の配列番号 8に示す配列の 6 0番目の Tを 3 '末端とする、 少なく とも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 8に示す配列の相補的配列の上記に対 応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスペル ギルス■二ドランス検出用核酸。
4 2 . 配列表の配列番号 8に示す配列の 2 2 1番目の Cを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 8に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス■二ドランス検出用核酸。
4 3 . 配列表の配列番号 8に示す配列の 2 7 1番目の Aを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 8に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス ·二ドランス検出用核酸。
4 4 . 配列表の配列番号 8に示す配列の 2 8 5番目の Aを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 8に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス '二ドランス検出用核酸。
4 5 . 配列表の配列番号 8に示す配列の 3 6 6番目の Tを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 8に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス ·二ドランス検出用核酸。
4 6 . 配列表の配列番号 8に示す配列の 3 8 7番目の Aを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 8に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス■二ドランス検出用核酸。
4 7 . 配列表の配列番号 9に示す配列の 2 5番目の Tを 3 '末端とする、 少なく とも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 9に示す配列の相補的配列の上記に対 応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスペル ギルス■テレウス検出用核酸。
4 8 . 配列表の配列番号 9に示す配列の 4 8番目の Tを 3 '末端とする、 少なく とも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 9に示す配列の相補的配列の上記に対 応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスペル ギルス■テレウス検出用核酸。
4 9 . 配列表の配列番号 9に示す配列の 1 6 2番目の Tを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 9に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス■テレウス検出用核酸。
5 0 . 配列表の配列番号 9に示す配列の 2 2 5番目の Cを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 9に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス ·テレウス検出用核酸。
5 1 . 配列表の配列番号 9に示す配列の 2 6 1番目の Cを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 9に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス■テレウス検出用核酸。
5 2 . 配列表の配列番号 9に示す配列の 3 3 9番目の Cを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 9に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス■テレウス検出用核酸。
5 3 . 配列表の配列番号 9に示す配列の 3 6 0番目の Aを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 9に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス ·テレウス検出用核酸。
5 4 . 配列表の配列番号 9に示す配列の 3 7 5番目の Aを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 9に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス ·テレウス検出用核酸。
5 5 . 配列表の配列番号 9に示す配列の 4 1 1番目の Aを 3 '末端とする、 少な くとも 1 0塩基以上の核酸、 または配列番号 9に示す配列の相補的配列の上記に 対応する塩基を 3 '末端とする、 少なくとも 1 0塩基以上の核酸から成るァスぺ ルギルス ■テレウス検出用核酸。
5 6 . 核酸の塩基数が 1 0ないし 1 0 0である請求項 2 5ないし 5 5のいずれか 1項に記載の核酸。
5 7 , 核酸の塩基数が 1 5ないし 3 0である請求項 5 6記載の核酸。
5 8 . 前記検出用核酸は核酸増幅用プライマーである請求項 2 5ないし 5 7のい ずれか 1項記載の検出用核酸。
5 9 . 前記検出用核酸は標識されたプローブである請求項 2 5ないし 5 7のいず れか 1項記載の検出用核酸。
6 0 . 配列表の配列番号 1 0に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 3 0記載のァスペルギルス · フミガタス検出用核酸。
6 1 . 配列表の配列番号 1 1に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 3 3記載のァスペルギルス■ フラバス検出用核酸。
6 2 . 配列表の配列番号 1 2に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又は'その相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 3 3記載のァスペルギルス ■ フラバス検出用核酸。
6 3 . 配列表の配列番号 1 3に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 3 6記載のァスペルギルス■ニガ一検出用核酸。
6 4 . 配列表の配列番号 1 4に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 4 2記載のァスペルギルス■二ドランス検出用核酸。
6 5 . 配列表の配列番号 1 5に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 5 4記載のァスペルギルス ·テレウス検出用核酸。
6 6 . 配列表の配列番号 6 2に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 5 3記載のァスペルギルス ·テレウス検出用核酸。
6 7 . 配列表の配列番号 6 3に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 4 3記戴のァスペルギルス ，二ドランス検出用核酸。
6 8 . 配列表の配列番号 6 4に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 3 7記載のァスペルギルス ·二ガー検出用核酸。
6 9 . 配列表の配列番号 6 5に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 3 0記載のァスペルギルス · フミガタス検出用核酸。
7 0 . 配列表の配列番号 6 6に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 3 7記載のァスペルギルス · フラバス検出用核酸。
7 1 . 配列表の配列番号 6 7に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 3 7記載のァスペルギルス■ フラバス検出用核酸。
7 2 . 配列表の配列番号 6 8に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 3 0記載のァスペルギルス■ フミガタス検出用核酸。
7 3 . 配列表の配列番号 6 9に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 3 1記載のァスペルギルス■ フミガタス検出用核酸。
フ 4 . 配列表の配列番号 7 0に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 3 6記載のァスペルギルス ·二ガー検出用核酸。
7 5 . 配列表の配列番号 7 1に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 3 8記載のァスペルギルス ·二ガー検出用核酸。
7 6 . 配列表の配列番号 7 2に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 4 2記載のァスペルギルス ·二ドランス検出用核酸。
7 7 . 配列表の配列番号 7 3に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 4 4記載のァスペルギルス ·二ドランス検出用核酸。
7 8 . 配列表の配列番号 7 4に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 5 4記載のァスペルギルス■亍レウス検出用核酸。
7 9 . 配列表の配列番号 7 5に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチミン はゥラシルに置換されていてもよい） 又はその相補的な塩基配列を有する核酸断 片から成る請求項 5 4記載のァスペルギルス■亍レウス検出用核酸。
8 0 . フォヮ一ド側プライマーである請求項 1又は 2記載のプライマー。
8 1 . フォヮ一ド側プライマーである請求項 7 0ないし 7 9記載の核酸。
8 2 . リバース側プライマ一である請求項 3ないし 1 1のいずれか 1項に記載の プライマー。
8 3 . リバース側プライマーである請求項 6 0ないし 6 9のいずれか 1項に記載 の核酸。
8 4 . 配列表の配列番号 1及び 2に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチ ミンはゥラシルに置換されていてもよい） のうち連続する少なくとも 1 0塩基か ら成る塩基配列を有する核酸断片からなるフォヮ一ド側プライマー並びに請求項 8 0記載のフォワード側プライマーの少なくともいずれかと、 請求項 8 3記載の リバース側プライマーの少なくともいずれかとを用いて遺伝子増幅法によリアス ペルギルス属真菌のチトクロム b遣伝子断片を増幅することによリアスペルギル ス属真菌を検出及び Z又は同定する方法。
8 5 . 請求項 8 1記載のフォワード側プライマーの少なくともいずれかと、 請求 項 8 2記載のリバース側プライマー及び配列表の配列番号 4に示される塩基配列 (ただし、 任意の位置のチミンはゥラシルに置換されていてもよい） の相補的配 列のうち連続する少なくとも 1 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片からな るリバース側プライマーの少なくともいずれかとを用いて遺伝子增幅法によリア スペルギルス属真菌のチトクロム b遺伝子断片を増幅することによりァスペルギ ルス属真菌を検出及び Z又は同定する方法。
8 6 . 配列表の配列番号 1及び 2に示される塩基配列 （ただし、 任意の位 Sのチ ミンはゥラシルに置換されていてもよい） のうち連続する少なくとも 1 0塩基か ら成る塩基配列を有する核酸断片からなるフォヮ一ド側プライマー並びに請求項 8 0記載のフォヮ一ド側プライマーの少なくともいずれかと、 請求項 8 2記載の リバース側プライマー及び配列表の配列番号 4に示される塩基配列 （ただし、 任 意の位置のチミンはゥラシルに置換されていてもよい） の相補的配列のうち連続 する少なくとも 1 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片からなるリバース側 プライマーの少なくともいずれかとを用いて遺伝子增幅法により真菌のチトク口 ム b遺伝子断片を増幅することにより真菌を検出する方法。
8 7 . 配列表の配列番号 5ないし 9のいずれかに記載の塩基配列を有する D N A 断片。
補正書の請求の範囲
[ 1 9 9 8年 2月 1 3日 （1 3 . 0 2 . 9 8 ) 国際事務局受理：出願当初の請求の範囲 8 7 は取り下げられた；他の請求の範囲は変更なし。 （ 1頁） ]
ス厲真菌を検出及び Z又は同定する方法。
8 5 . 請求項 8 1記載のフォワード側プライマーの少なくともいずれかと、 請求 項 8 2記載のリバース側プライマー及び配列表の配列番号 4に示される塩基配列 5 (ただし、 任意の位置のチミンはゥラシルに置換されていてもよい） の相補的配 列のうち連続する少なくとも 1 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片からな るリバース側プライマーの少なくともいずれかとを用いて遺伝子增幅法によリァ スペルギルス属真菌のチトクロム b遗伝子断片を增幅することによリアスペルギ ルス属真菌を検出及びノ又は同定する方法。
! 0 8 6 . 配列表の配列番号 1及び 2に示される塩基配列 （ただし、 任意の位置のチ ミンはゥラシルに置換されていてもよい） のうち連続する少なくとも 1 0塩基か ら成る塩基配列を有する核酸断片からなるフォワード側プライマー並びに請求項
8 0記載のフォヮ一ド側プライマーの少なくともいずれかと、 請求項 8 2記載の リバース側プライマー及び配列表の配列番号 4に示される塩基配列 （ただし、 任 I 意の位置のチミンはゥラシルに置換されていてもよい） の相補的配列のうち連続 する少なくとも 1 0塩基から成る塩基配列を有する核酸断片からなるリバース側 プライマーの少なくともいずれかとを用いて遺伝子増幅法により真菌のチトク口 ム b遺伝子断片を増幅することにより真菌を検出する方法。
補正きれだ 衹 (条約第 19条)
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