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WO1998003060A1 - Hepatitis c model animals - Google Patents

Hepatitis c model animals Download PDF

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WO1998003060A1
WO1998003060A1 PCT/JP1997/002575 JP9702575W WO9803060A1 WO 1998003060 A1 WO1998003060 A1 WO 1998003060A1 JP 9702575 W JP9702575 W JP 9702575W WO 9803060 A1 WO9803060 A1 WO 9803060A1
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WO
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hepatitis
hcv
cdna
derived
mice
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP1997/002575
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English (en)
French (fr)
Inventor
Michinori Kohara
Takaji Wakita
Hiromichi Yonekawa
Choji Taya
Izumu Saito
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science, Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Priority to US09/214,471 priority Critical patent/US6201166B1/en
Priority to AU36348/97A priority patent/AU719292B2/en
Priority to EP97933015A priority patent/EP0919122A4/en
Publication of WO1998003060A1 publication Critical patent/WO1998003060A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
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    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
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    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Definitions

  • the present invention relates to a hepatitis C model animal.
  • the model animal of the present invention is useful for elucidating the onset mechanism of hepatitis C, developing therapeutic means, and the like.
  • HCV hepatitis C virus
  • model animals that exhibit pathological conditions that closely resemble the disease play an important role.
  • the present invention has been made under such a technical background, and an object of the present invention is to provide a novel model animal showing the same disease state as human hepatitis C. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, by introducing HCV-derived cDNA into a mouse so as to express it in a switching manner, the mouse developed a pathological condition very similar to that of human hepatitis C. ⁇ found out that
  • the present invention is a hepatitis C model animal characterized in that cDNA derived from hepatitis C virus has been introduced.
  • switching expression refers to the expression of a specific gene at a desired time.
  • Switching expression refers to an expression system that can be expressed, for example, by interposing a sequence that can be removed at a desired time between a gene to be expressed and its promoter, or inducing by a drug or the like.
  • Specific examples of the former include the Cre / ioxP expression system (Nat Sternberg et al., J. Molecular Biology 150. p467-486 1981, Nat Sternberg et al., J. Molecular Biology 150. p487-507).
  • the Cre / lo xP expression system is a transgene inserted between two ⁇ sequences, which intervenes between the promoter and the gene of interest. Gene), and P1 phage Cre DNA recombinase (hereinafter simply referred to as “Cre”) that removes the inserted gene together with one ⁇ sequence.
  • the sequence is DNA derived from the gene of Escherichia coli P1 phage and is a 34 bp long DNA having the following nucleotide sequence.
  • Cre is a DNA recombinase derived from E. coli P1 phage with a molecular weight of about 38 kD.
  • An external characteristic of the hepatitis C model animal of the present invention is that it exhibits the same disease state as human hepatitis C.
  • Specific pathological conditions include elevated GPT in serum, appearance of eosinophils and loss of hepatocytes in liver tissue, hypertrophy and increase in Kupffer cells, and aggregation of lymphocytes as described in this example. Can be mentioned. However, these pathological conditions vary depending on the DNA fragment to be introduced, the type of model animal, and the like, and thus do not limit the technical scope of the present invention.
  • the hepatitis C model animal of the present invention can be produced, for example, as follows.
  • a vector capable of switching expression of HCV-derived cDNA is prepared.
  • Such a vector can be produced, for example, by introducing cDNA derived from HCV into a vector containing a promoter and a sequence, downstream of the sequence.
  • Examples of a vector containing a promoter and a sequence include PCALNLW produced by Yumi Kanegae et al., And pCALN / pBR produced by the present inventors.
  • Escherichia coli transfected with pCALN / pBR has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) under the deposit number FERM P-15753. Date: July 22, 1996).
  • the cDNA to be inserted into the vector for example, the ability to use CN2, N24, CR and the like described in Examples is not limited thereto.
  • Such cDNA can be prepared according to the method of Nobuyuki ato et al. (Proc. Nat 1. Acc. Sci. USA. 87, 9524-9528, 1990).
  • an expression cassette is cut out from the prepared vector, introduced into a fertilized egg, and the fertilized egg after the introduction is transplanted to a foster parent.
  • the introduction into a fertilized egg can be performed according to a conventional method such as a microinjection method.
  • a mouse using a mouse is not limited thereto, and may be a rat, a heron, a pig, a medaka, a zebrafish, or the like.
  • Hepatitis hepatitis model animals are obtained. Whether or not it has cDNA derived from HCV can be determined by the PCR method. That is, DNA is extracted from an animal to be selected, is converted into type II, oligonucleotides corresponding to both ends of the introduced cDNA are synthesized and used as primers, and PCR is performed. If the cDNA derived from HCV is introduced, the ability to detect the amplified fragment is detected. If the cDNA derived from HCV is not introduced, the wide fragment is not detected.
  • whether or not the HCV-derived cDNA is expressed by switching can be determined by removing the sequence that inhibits the expression of HCV-derived cDNA and in vitro or in vivo, by detecting the protein corresponding to the cDNA in vitro or in vivo. It is only necessary to check whether it is produced. Whether or not a protein corresponding to HCV-derived cDNA is produced can be examined by, for example, a ⁇ ⁇ stanbult method ⁇ or a fluorescent antibody staining method.
  • the hepatitis C model animal of the present invention does not develop hepatitis as it is, and in order to develop hepatitis, the expression of cDNA is suppressed. It is necessary to remove the existing sequence.
  • a DNA recombinase may be used.For example, if the suppressor sequence is a ⁇ sequence, it is infected with an adenovirus AxNCre that expresses Cre, an enzyme that removes the ⁇ sequence. It should be done. Cre and AxNCre can be prepared as described in Yumi Kanegae et al., Nucl. Acids Res. 23, 19, 38 16-21.1995.
  • Example 1 Example 1
  • CN2 is a 3160 bp cDNA corresponding to nucleotides 294 to 3435 of the HCV gene
  • N24 is a 4055 bp cDNA corresponding to nucleotides 2769 to 6823 of the HCV gene.
  • Ha ⁇ ! This is a 9162 bp cDNA corresponding to nucleotides 294 to 9455 of the same gene.
  • This HCV-derived cDNA was confirmed by Ohara et al. To have infectivity for chimpanzees and HPBMa cells in R6 serum (Yohko K. Shimizu et al. Pro Natl. Acad. Sci. USA. 90, 6037-6041. A serum obtained by RT-PCR was used (Nobuyuki ato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 9524-9528, 1990).
  • mice Female mice (BALB / cCrSlc and C57Bl / 10SnSlc, both manufactured by Japan SLC, Inc.) were administered with an ovulation-inducing agent, then mated with males of the same strain, and the pronuclear fertilized eggs were collected from the oviduct of the female mice the next day. About 2 pl of the DNA fragment solution (1-5 ⁇ l) prepared in Example 1 was injected into the pronucleus of a fertilized egg using a micro glass tube. This procedure is described in [Manual for Injecting DNA into Fertilized Eggs, Developmental Engineering Experiments] (edited by Tatsuji Nomura, Motoya Katsuki, pp.
  • the fertilized eggs into which the DNA was injected were transplanted into the oviducts of pseudopregnant foster female mice (Slc: iCR, manufactured by Nippon S.L.I. Co., Ltd.) and born about 20 days later by spontaneous delivery or cesarean section.
  • Example 3 Screening of transgenic mice The integration of the transgene into the somatic cell gene of the obtained mouse was screened by PCR using primers having a sequence specific to the HCV gene. Auricular slices of mice are placed in a 125 mg / ml proteinase K solution (50 mM KCl / 10 mM Tris-HCl pH8.3 / 1.5 mM MgC "/0.1% gelatin / 0.453 ⁇ 4! NP40 / 0.553 ⁇ 4 Tween20) at 55 ° C for 1 h.
  • a / ml proteinase K solution 50 mM KCl / 10 mM Tris-HCl pH8.3 / 1.5 mM MgC "/0.1% gelatin / 0.453 ⁇ 4! NP40 / 0.553 ⁇ 4 Tween20
  • the obtained DNA solution 51 was used for PCR
  • the PCR primers for mouse screening using CN 2 were 6-294-S20 (5 '-TGATAGGGTGCTTGCGAGTG-3'), 6-604-R18 (5, -TTGCCATAGAGGGGCCAA-3 ') was used as an antisense primer at a final concentration of 1 ⁇ .
  • the reaction was performed 40 times for 1 minute, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 2 minutes on a thermal cycler (Perkin Elmer) .
  • the obtained PCR product was electrophoresed on 3% agarose and mixed with an ethidium.
  • FIG. 3 shows an example of detection of PCR products by agarose gel electrophoresis
  • a and C in the figure are negative mice, B is a positive mouse, N is a negative control (BALB / c mouse), M is a PCR product from a positive control (pCALN-CN2 plasmid DNA), and M is a DNA size marker. Seven out of 28 mice obtained from BALB / cCrSlc were positive, and one out of three mice obtained from C57Bl / 10SnSlc was positive. It was used for the following examination.
  • 6-4269-S20 (5 * -TA TGACATCATAATATGTGA-3 ') as a sense primer and 6-4599-R20 (5 * -CCCGA TAATATGCTACAGCA-3') as an antisense primer.
  • PCR was performed in the same manner as for CN2. As a result, 8 out of 55 mice obtained from BALB / cCrSlc were positive, and 4 out of 16 mice obtained from C57Bl / 10Sn Sic were positive.
  • Example 4 Expression screening of transgenic mice using cultured cells Since the transgenic mice of the present invention use the switching expression system, they do not express the HCV gene in a normal state. Cre must be activated to initiate expression. For this reason, the present inventor created a recombinant adenovirus AxNCre that expresses Cre.
  • Adenovirus AxNCre was prepared by Yumi Kanegae et al. (Ucl. Acids Res. 23, 19, 38 16-21.1995).
  • the spleen was surgically removed from transgenic mice (CN2-introduced, BALB / cCrSlc-derived), and splenocytes and fibroblasts were separated and cultured.
  • the obtained spleen cells were centrifuged, RNA was extracted by the acidic phenol-guanidine method, and cDNA was synthesized using the RNA as a ⁇ type and 6-604-R20 as a primer.
  • RNA derived from HCV (Une8 and linel3) was confirmed in 2 out of 2 mice (Fig. 4).
  • the blot blot method and the fluorescent antibody staining method were performed.
  • AxNCre-infected 3 X10 7 splenocytes were transferred to 1 x Sample buf fer (50 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% 2 ME) 60
  • the monoclonal antibody used in this example was prepared by recombinantly producing core, El, and E2 proteins from HCV genes and immunizing BALB / c mice (Masahiko Ka o et al. J. General
  • the fixed cells were reacted with an anti-core monoclonal antibody, an anti-E1 monoclonal antibody, and an anti-E2 monoclonal antibody, and detected by an indirect fluorescence method.
  • Positive findings were obtained in 2 out of 8 mice (line8 and line29) as in the blot blot method (Fig. 6 [line8]), and the positive mice (line8 and line29) were the same in the blot blot method and the fluorescent antibody method.
  • mice line8 and line29
  • AxNCre was administered intravenously via the tail vein of mice or injected directly into the spleen. Three days later, the livers of the mice were excised and analyzed for the expression of HCV protein.
  • Lml of RIPA buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.4 / 1% SDS / 0.53 ⁇ 4 NP40 / 0.15M NaCl / lmM PMSF) was added to the mouse liver section and homogenized for 20 strokes in a Dounce homogenizer. The solution was heated at 100 ° C for 5 minutes and then sonicated at 4 ° C for 15 minutes.
  • the supernatant was separated by centrifugation at 14,000 rpm for 10 minutes.
  • the protein concentration of the obtained supernatant was measured, and EIA of the core protein (Takeshi Tanaka et al., J. Hepatology 23: 742-745.1995) and blood blotting were performed.
  • transgenic mouse a 21 kDa core protein, a 37-38 kDa E1 protein, and a 67-69 kDa E2 protein were detected in the transgenic mouse (line 8 and line 29). A force that was not detected in nick mice.
  • HCV structural proteins core, E1, E2 were expressed in transgenic mice (line8 and line29), and HCV protein expression in liver The expression and changes in liver histology and serum GPT were observed over time.
  • AxNCre 10 ⁇ pfu was administered via the tail vein of mice. Mice were sacrificed on days 3, 5, 7, and 10 after AxNCre administration.
  • HCV core protein in the transgenic mouse liver was quantitatively measured by the EIA method, it increased until day 7 and decreased on day 10 (Fig. 7). Serum GPT levels were low until day 5, but rose sharply on day 7 and rose until day 10 ( Figure 7).
  • the present invention provides a novel human disease model animal. Since this model animal shows a pathological condition very similar to that of human hepatitis C, it is useful for elucidating the pathogenesis of hepatitis C and establishing therapeutic means.
  • Figure 1 Diagram showing the structure of a pCALN / pBR vector.
  • FIG. 2 is a diagram showing the site of insertion of cDNA derived from HCV into pCALN / pBR.
  • Fig. 3 Photograph showing the results of agarose electrophoresis of the PCR product.
  • Figure 4 Photographs showing the results of agarose electrophoresis of the PCR product.
  • Figure 5 Photograph showing the results of a Western plot of a mouse spleen cell-derived protein.
  • Figure 6 Photo showing the results of fluorescent antibody staining of mouse fibroblast-derived protein
  • FIG. 7 is a graph showing changes over time in serum GPT value and HCV coprotein in mice into which cDNA derived from HCV has been introduced.
  • Figure 8 Photomicrograph of hepatocytes from a mouse transfected with HCV-derived cDNA before AxNCre administration.
  • Figure 9 Photomicrograph of hepatocytes from a mouse transfected with cDNA derived from HCV 5 days after AxNCre administration.
  • Figure 10 Photomicrograph of hepatocytes from a mouse transfected with HCV-derived cDNA on day 7 after AxNCre administration.

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Description

曰月糸田
C型肝炎モデル動物 発明の技術分野
本発明は、 C型肝炎モデル動物に関する。 本発明のモデル動物は、 C型肝炎の 発症機構の解明、 治療手段の開発等に有用である。 発明の背景技術
C型肝炎ウィルス （以下、 「HCV」 という） の遺伝子をマウスなどの小動物 に導入し、 導入した遺伝子を発現させて肝炎の発症モデルをつくろうという試み はこれまでも多く行われてきた （C. Pasquinelli ら Abstract book of 2nd inte rnational meeting on hepatitis C virus and related viruses(July 31-Augus t 5, 1994 San Diego, USA)、 Pasquinelli ら Abstract book of 3nd internat ional meeting on hepatitis C virus and related vi rusesCAugust 28-Septemb er 3, 1995 Gold coast, Austral ia) 、 Kazuhiko Koikeら J. General Virology 76 P3031-3038 1995、 T. Kato Arch Virol 141 p951- 958 1996 ) 。 しかし、 ほかの 多くの遗伝子と異なり、 H C V遺伝子はマウス個体への組み込みが困難であり、 また、 うまく組み込まれても HCV蛋白質の産生が認められない例がほとんどで あった。 さらに、 HCV蛋白質の産生が認められたきわめて稀な例でも胎児期よ り蛋白質が産生され、 免疫寛容になるために、 生後も典型的な肝炎症状を呈する ものはなく、 肝炎モデルにはなりえていなかった。 発明が解決しょうとする課題
ヒ トの疾患の発症機構を解明し、 その治療手段を開発するにあたっては、 その 疾患と酷似した病態を示すモデル動物が重要な役割を果たす。
しかし、 上記のように C型肝炎に関しては、 そのようなモデル動物が未だに作 りだされておらず、 このことが C型肝炎の発症機構を解明する上での一つの障害 となっている。 本発明は、 このような技術的背景の下になされたものであり、 その目的は、 ヒ 卜 C型肝炎と同様の病態を示す新規なモデル動物を提供することにある。 発明の開示
本発明者は、 上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、 HCV由来の c DNAをスィツチング発現するようにマウスに導入することにより、 マウスにヒ 卜の C型肝炎と酷似した病態を発症させることができるのを見いだし、 本発明を £成した ο
即ち、 本発明は、 C型肝炎ウィルス由来の c DNAが導入されていることを特 徽とする C型肝炎モデル動物である。
以下、 本発明を詳細に説明する。
最初に、 本発明のモデル動物の特徵について説明する。
本発明の C型肝炎モデル動物の一例では、 ^1(：¥由来のじ DNAがスィッチン グ発現するように導入さている。 ここで 「スイ ッチング発現」 とは、 所望の時期 に特定の遺伝子を発現させることができる発現システムをいう。 スィツチング発 現は、 例えば、 発現させようとする遺伝子とそのプロモーターの間に、 所望の時 期に除去可能な配列を介在させることや薬物などにより誘導可能なプロモーター を使用することにより構築できる。 前者の具体例としては、 Cre/ioxP発現システ ム （Nat Sternberg ら J. Molecular Biology 150. p467-486 1981、 Nat Sternber g ら J. Molecular Biology 150. p487-507 1981) を挙げることができる。 Cre/lo xP発現システムは、 2つの ΙοχΡ配列にはさまれた揷入遺伝子 （これが、 プローモ 一ターと目的とする遺伝子の間に介在し、 その遗伝子の発現を抑制する） と、 挿 入遺伝子を 1つの ΙοχΡ配列とともに除去する P1ファージ Cre DNA組換え酵素 （ 以下、 単に 「Cre 」 という） とからなり、 Cre を作用させることにより任意の時 期に目的の遺伝子を発現させることができる。 ΙοχΡ配列は、 大腸菌 P1ファージの 遺伝子に由来する D N Aであって、 下記のような塩基配列を有する長さ 34bpの D NAである。
ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT
Cre は、 大腸菌 P1ファージに由来する分子量約 38kDの DN A組換え酵素である。 HC V由来の c DNAをスィツチング発現させることにより、 動物がある程度 成長した段階で HCV由来のタンパク質を産生させることができる。 このため、 従来の C型肝炎モデル動物で問題となっていた免疫寛容の問題を回避することが できる。
本発明の C型肝炎モデル動物の外形的な特徴は、 ヒ 卜の C型肝炎と同様の病態 を示すことである。 具体的な病態としては、 本実施例にあるように血清中の G P Tの上昇、 肝組織での好酸体の出現と肝細胞の脱落、 クッパー細胞の肥大と増加 、 リ ンパ球の集簇などを挙げることができる。 但し、 これらの病態は、 導入する DNA断片、 モデル動物の種類などにより変動するので、 本発明の技術的範囲を 限定的に定めるものではない。
次に、 本発明のモデル動物の作出方法について説明する。
本発明の C型肝炎モデル動物は、 例えば、 以下のようにして作出することがで きる。 まず、 HCV由来の c DNAをスイッチング発現させることのできるべク 夕一を作製する。 このようなベクターは、 例えば、 プロモーターと ΙοχΡ配列を含 むベクターに、 H C V由来の c DN Aを ΙοχΡ配列の下流に揷入することにより作 製できる。 プロモーターと ΙοχΡ配列を含むベクタ一としては、 Yumi Kanegaeらが 作製した PCALNLW 、 本発明者が作製した pCALN/pBR などがある。 なお、 pCALN/pB R を導入した大腸菌は、 工業技術院生命工学工業技術研究所 （日本国茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3号） に寄託番号 FERM P-15753として寄託されている （寄託日 ：平成 8年 7月 22日） 。 ベクターに挿入する c DNAとしては、 例えば、 実施例 にある CN 2、 N 2 4、 C Rなどを用いることができる力 これらに限定される わけではない。 このような c DNAは、 Nobuyuki ato らの方法 （Proc. Nat 1. Ac ad. Sci. USA.87, 9524-9528, 1990) に従って作製することができる。
次に、 作製したベクタ一から発現カセッ トを切り出し、 これを受精卵に導入し 、 導入後の受精卵を仮親に移植する。 受精卵への導入は、 例えば、 マイクロイン ジヱクシヨン法など常法に従って行い得る。 また、 c DNA導入の対象とする動 物の種類は、 トランスジェニック動物の作出技術が確立されている動物であれば 特に制限はない。 実施例では、 マウスを用いているカ^ これに限定されることな く、 ラッ ト、 ゥサギ、 ブタ、 メダカ、 ゼブラフィ ッシュなどでもよい。 次に、 仮親から得られた動物の中から HCV由来の c DNAを有しているもの を選抜し、 さらに、 HC V由来の c DNAがスイ ッチング発現するものを選抜し て、 本発明の C型肝炎モデル動物を得る。 HC V由来の c DNAを有しているか どうかは、 P CR法により判断できる。 即ち、 選抜しょうとする動物から DNA を抽出し、 それを铸型とし、 導入した c DN Aの両末端に対応するオリゴヌクレ ォチドを合成してプライマーとし、 P CRを行う。 HC V由来の c DNAが導入 されてレ、れば増幅断片が検出される力 HCV由来の c DNAが導入されていな ければ增幅断片は検出されない。 また、 HC V由来の c DNAがスイ ッチング発 現しているかどうかは、 H C V由来の c DN Aの発現を阻害している配列を除去 し、 in vitro又は in vivo で該 c D N Aに対応するタンパク質が産生されている かどうかを調べればよい。 HCV由来の c DN Aに対応するタンパク質が産生さ れているかどうかは、 ゥヱスタンブロッ ト法ゃ蛍光抗体染色法などにより調べる ことができる。
HC V由来の c DN Aは、 スィツチング発現するので本発明の C型肝炎モデル 動物は、 そのままの状態では肝炎を発症せず、 肝炎を発症させるためには、 当該 c DN Aの発現を抑制している配列を除去することが必要である。 そのような抑 制配列を除去するには、 DNA組換え酵素を用いればよく、 例えば、 抑制配列が 、 ΙοχΡ配列であれば、 ΙοχΡ配列を除去する酵素である Cre を発現するアデノウィ ルス AxNCreを感染させればよい。 Cre 及び AxNCreは、 Yumi Kanegaeら Nucl. Acid s Res.23, 19, 38 16-21.1995 の記載に従って作製できる。 実施例
以下、 実施例を用いて本発明を更に詳細に説明する。 但し、 本発明の技術的範 囲は、 実施例により限定されるものではない。
〔実施例 1〕 Cre/1 oxP発現システムを利用した発現ベクターの構築
CAGプロモーター下流の 2つの 1 oxP配列にはされまれたネオマイシン耐性遺 伝子を挿入した発現カセッ トを pCALNU (Yumi Kanegaeら Nucl. Acids Res.23, 1 9,38 16-21.1995 ) から切り出し、 pBR322に組み込み pCALN/pBR を作成した （図 1 ) o ネオマイシン耐性遺伝子および ΙοχΡ配列の下流の Swal切断部位で pCALN/pBR を 開裂し、 3種類の HC V由来の c DNA (CN 2, N 2 4 , C R) を挿入した （ 図 2) 。
CN 2は HC V遺伝子の 294番から 3435番の塩基に対応する 3160bpの c DN A であり、 N24は H C V遺伝子の 2769番から 6823番の塩基に対応する 4055bpの c D NAであり、 じ尺は^！じ 遺伝子の 294番から 9455番の塩基に対応する 9162bpの c DNAである。 この H C V由来の c DN Aは小原らによって、 チンパンジーお よび HP BM a細胞に感染性が確認された R 6血清 （Yohko K. Shimizu ら Pro Natl. Acad. Sci. USA.90, 6037- 6041中の 「plasma Kj に相当する血清である。 ) か ら RT— P CR法により分離したものを使用した （Nobuyuki ato ら Proc.Natl . Acad. Sci. USA.87, 9524-9528, 1990 ) 。
HCV由来の c DNAを挿入した発現ベクターから Hindlll切断により、 発 現カセッ トを切り出し、 ァガロースゲル電気泳動により分離精製した。 この DN Aをさらに塩化セシウムを用いた比重遠心法にて精製した。 得られた DNAを脱 塩、 エタノール沈殿後 TE buffer (lOm Tris-HCl, ImM BDTA) に溶解した。 〔実施例 2〕 トランスジヱニックマウスの作出
雌マウス （BALB/cCrSlc 及び C57Bl/10SnSlc 、 共に日本エスエルシー株式会社 製） に排卵誘起剤投与後、 同系統の雄と交配し、 翌日雌マウスの卵管より前核受 精卵を採取した。 実施例 1で調製した DN A断片溶液 （1-5 ug l) を微小ガラ ス管を用いて受精卵の前核に約 2 pl注人した。 この操作は、 〔 「受精卵への DN Aの注入、 発生工学実験マニュアル」 （野村達次 監修、 勝木元也 編） 41-76 頁、 講談社 1987年〕 及び 〔 「前核への DN Aのマイクロインジヱクシヨ ン、 マウ ス胚の操作マ二ユアノレ」 (Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory anua 1 ) (B.Hogan, F. Costantini and B. Lacy/ 著、 山内一也、 豊田裕、 森庸厚、 岩 倉洋一郎 訳） 、 155-173 頁、 近代出版 1989年〕 の記載に従って行った。
DNAを注入した受精卵は、 偽妊娠仮親雌マウス （Slc:iCR 、 日本エスエルシ 一株式会社製） の卵管に移植し、 約 20日後に自然分娩又は帝王切開により出生さ せた。
〔実施例 3〕 卜ランスジエニックマウスのスク リーニング H C V遺伝子に特異的な配列をもつプライマーを用いた P C Rにより、 得られ たマウスの体細胞遺伝子へのトランスジーンの組み込みをスクリ一ニングした。 マウスの耳介切片を 125mg/mlプロティネース K溶液 （50mM KCl/10mM Tris-HCl pH8.3/1.5mM MgC" /0.1% ゲラチン /0.45¾! NP40/0.55¾ Tween20)中で 55°C 1 hィ ンキュペート後 96°C10分間加熱した。 得られた DNA溶液 5 1 を P CRに使用 した。 CN 2を使用したマウスのスクリーニングのための P C Rのプライマーに はセンスプライマ一として 6- 294-S20 (5' -TGATAGGGTGCTTGCGAGTG- 3' )、 アンチセ ンスプライマ一として 6-604-R18 (5， -TTGCCATAGAGGGGCCAA- 3' )を各最終濃度 1 β Μ で用いた。 P C Rは 94°C 2分加熱後、 94°C 1分、 55°C 2分、 72°C 2分の反応を 40回、 サーマルサイクラ一 （パーキンエルマ一） で行った。 得られた P C R産物 を 3 %ァガロースに電気泳動し、 ェチジゥムブロマイ ド染色にて、 目的の DNA 産物 （311bp)の有無を判定した。 図 3に P C R産物のァガロース電気泳動による 検出の例を示す。 図中の Aおよび Cは陰性マウス、 Bは陽性マウス、 Nは陰性対 照 （BALB/cマウス） 、 Mは陽性対照 （pCALN- CN2 プラスミ ド DNA) からの P C R産物、 Mは DNAサイズマーカ一を示す。 BALB/cCrSlc から得られたマウス 28 匹のうち 7匹が陽性であり、 C57Bl/10SnSlc から得られたマウス 3匹のうち 1匹 が陽性であった。 それぞれの陽性マウスを繁殖し、 以後の検討に用いた。
N24遗伝子のスクリーニングにはセンスプライマーとして 6- 4269-S20 (5* -TA TGACATCATAATATGTGA-3' )、 アンチセンスプライマーとして 6-4599- R20 (5* -CCCGA TAATATGCTACAGCA-3' ) を使用して C N 2と同様の方法で P C Rを行った。 この結 果、 BALB/cCrSlc から得られたマウス 55匹のうち 8匹が陽性であり、 C57Bl/10Sn Sic から得られたマウス 16匹のうち 4匹が陽性だった。
CR遺伝子のスクリーニングは CN 2と同じプライマーを使用した。 BALB/cCr Sic から得られたマウス 16匹のうち 1匹が陽性だった。
〔実施例 4〕 培養細胞による トランスジヱニックマウスの発現スクリーニング 本発明のトランスジエニックマウスはスィツチング発現システムを用いている ので通常の状態では HCV遣伝子は発現しない。 発現を開始させるために Cre を 作用させる必要がある。 このため本発明者は、 Cre を発現する組み換えアデノウ ィルス AxNCreを作成した。 アデノウイルス AxNCreの作成は、 Yumi Kanegaeらの方 法に従った ( ucl. Acids Res.23, 19, 38 16-21.1995 ) 。
トランスジヱニックマウス （CN 2導入、 BALB/cCrSlc 由来） より脾臓を外科 的に摘出し、 脾細胞と線維芽細胞を分離培養した。 培養した脾細胞および線維芽 細胞に AxNCreを moi=0， 10， 100で感染させ、 48時間、 5 %C02 、 37°Cで培養し た後細胞を回収した。 得られた脾細胞を遠心し、 酸性フエノール · グァニジン法 にて RNAを抽出し、 この RN Aを铸型として 6-604-R20 をプライマーとして c DNA合成を行った。 c DNA合成終了後 6- 294Sプライマーを追加し、 PCRを 行い、 P CR産物の有無により HCV由来の RNA産生の有無を調べた。 この方 法で 2マウス中 2マウスに （Une8 と linel3) H C V由来の R N Aの産生を確認 した （図 4) 。
さらに、 HCV蛋白質の発現を確認するためにゥヱスタンブロッ 卜法と蛍光抗 体染色法を行った。 AxNCreを感染させた 3 X107 細胞の脾細胞を 1 xSample buf fer (50mM Tris-HCl pH6.8, 2 %S D S, 10%グリセロール、 5 %2 ME) 60
1で溶解し 100°C 5分間加熱した。 得られたサンプルを 10— 20%グラジェント S DS— PAGEゲルにて泳動した。 泳動終了後セミ ドライブロッ 卜装置 （ミ リポ ァ） にて P VD F膜 （ミ リポア） に転写した。 転写した膜を抗コアモノクロ一ナ ル抗体および抗 E 2モノクローナル抗体と反応させた。 8マウス中 2マウス （li ne8 と line29) に陽性反応を得た （図 5 ) 。 なお、 本実施例で用いたモノクロ一 ナル抗体は、 HCVの遺伝子からコア、 E l、 E 2の蛋白質を遗伝子組み換えに より作製し、 BALB/cマウスに免疫して、 作製した （Masahiko Ka oら J. General
Virology 75 pl775-1760 1994、 Tomiko Kashiwakuraら J. Immunological Metho ds 190 p78-89 1996) 。
またスライ ドグラス上で培養した線維芽細胞にも AxNCreを moi = 100 で感染さ せ、 48時間培養後、 アセトン ： メタノール = 1 ： 1溶液中で 20°C、 10分間、 固定 した。 固定した細胞を抗コアモノクロ一ナル抗体、 抗 E 1モノクローナル抗体お よび抗 E 2モノ クローナル抗体と反応させ、 間接蛍光法にて検出した。 ゥヱスタ ンブロッ 卜法と同様に 8マウス中 2マウス （line8 と line29) に陽性所見が得ら れ （図 6 [line8 〕 ) 、 陽性マウス （line8 と line29) はゥヱスタンブロッ 卜法 と蛍光抗体法で同じだった。 〔実施例 5〕 in vivo での HCV蛋白質発現
細胞培養実験で HCV蛋白質発現陽性だったマウス （line8 と line29) を用い て in vivo での発現実験を行った。 AxNCreは、 マウスの尾静脈から静注により投 与、 または脾臓に直接注入した。 3日後にマウスの肝臓を摘出し、 HCV蛋白質 の発現を解析した。 マウス肝切片に lmlの R I P Aバッファ一 （10mM Tris-HCl pH7.4/ 1 % SDS/0.5¾ NP40/0.15M NaCl/lmM PMSF)を加えダウンスホモゲナイザー 中で 20ストロークホモゲナイズした。 溶液を 100°C、 5分間加熱後、 4°C、 15分 間超音波処理をした。 1万 4千回転で 10分間遠心し、 上清を分離した。 得られた 上清の蛋白濃度を測定し、 また、 コア蛋白質の E I A (Takeshi Tanakaら J. Hep atology23:742-745.1995) 及びゥヱス夕ンブロッティ ングを行った。
上清 5 1 に、 コア蛋白質 E I A用の分散液 （20 クェン酸 Na、 0.5¾NaCK 10 N Urea) 50 1 、 さらにコア蛋白質に対する変性液 （0.5!¾Na0H) 50/ 1 を加え室 温で 10分間反応させた。 中和液 （0.5M NaH2P04、 5¾ Triton X- 100 ) を 50 1 加 えた後、 E I A反応を行った。 AxNCreを投与したトランスジ ニックマウス （li ne8 と line29) の肝サンプルでは E I A陽性となったが、 非トランスジヱニック マウスでは陰性だった。 ウェス夕ンブロッ ト法でも同様にトランスジエニックマ ウスでは 21kDa のコア蛋白質、 37〜38kDa の E 1蛋白質、 67〜69kDa の E 2蛋白 質が検出されたが （line8 と line29) 、 非トランスジヱニックマウスでは検出さ れな力、つた。
〔実施例 6〕 トランスジヱニックマウスにおける HCV蛋白質発現による肝障害 トランスジヱニックマウス （line8 と line29) に HCV構造蛋白質 （コア、 E 1、 E 2) を発現させて、 肝臓における HCV蛋白質の発現と肝臓組織像および 血清 G PT値の変化を経時的に観察した。 AxNCre 10β pfu をマウスの尾静脈よ り投与した。 AxNCre投与後 3、 5、 7、 10日目にマウスをと殺した。 トランスジ エニックマウス肝臓における HCVコア蛋白質の発現を定量的に E I A法で測定 すると、 7日目まで増加し、 10日目には減少した （図 7) 。 血清 GPT値は 5日 目まで低値だが、 7日目に急激に上昇し、 10日目まで上昇した （図 7) 。 肝組織 では好酸体の出現と肝細胞の脱落、 クッパー細胞の肥大と増加、 リンパ球の集族 像が 3日目から観察でき、 その所見は 7日目および 10日目に急激に増強した。 7 日目、 10日目にはこれらの所見に加え、 肝細胞の再生像が強く見られた （図 8、 図 9、 図 1 0) 。 これらの所見はヒ 卜の急性肝炎とよく似ており、 HCV構造蛋 白質の発現により急性肝障害が誘導されたと考えられた。 また好酸体がアポトー シスをおこした肝細胞であることを確認するために Tunnel法 （R.Gold し ab. inves t 71 p219-225 1994) により断裂化した D N Aを染色、 陽性所見を得た。
発明の効果
本発明は、 新規なヒ ト疾患モデル動物を提供する。 このモデル動物は、 ヒ 卜の C型肝炎に酷似した病態を示すので、 C型肝炎の発症機構の解明、 治療手段の確 立に有用である。 図面の簡単な説明
図 1 ： pCALN/pBR ベクタ一の構造を示す図である。
図 2 ： HC V由来の c DNAの pCALN/pBR への揷入部位を示す図である。
図 3 ： P C R産物のァガロース電気泳動の結果を示す写真である。
図 4 ： P CR産物のァガロース電気泳動の結果を示す写真である。
図 5 ：マウス脾細胞由来のタンパク質のウェスタンプロッ 卜の結果を示す写真 乙"ある。
図 6 ： マウス繊維芽細胞由来のタンパク質の蛍光抗体染色の結果を示す写真で める
図 7 ： HCV由来の c DNAを導入したマウス中の血清 G PT値及び HCVコ ァタンパク質の経時的な変化を示す図である。
図 8 ： AxNCre投与前の HCV由来の c D N Aを導入したマウスの肝細胞の顕微 鏡写真である。
図 9 ： AxNCre投与後 5日目の H C V由来の c DN Aを導入したマウスの肝細胞 の顕微鏡写真である。
図 10： AxNCre投与後 7日目の HC V由来の c D N Aを導入したマウスの肝細胞 の顕微鏡写真である。

Claims

請求の範囲
1. C型肝炎ウィルス由来の c DN Aが導入されていることを特徴とする C型肝 炎モデル動物。
2. C型肝炎ウィルス由来の c DN A力 スイ ッチング発現するように導入され ていることを特徴とする請求項 1記載の C型肝炎モデル動物。
3. C型肝炎ウィルス由来の c DN Aをスイッチング発現させる手段が、 C型肝 炎ウィルス由来の c DN Aとプロモーターの間に loxP配列を介在させることであ る請求項 2記載の C型肝炎モデル動物。
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