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WO1998059069A2 - Identifizierung kanzerogener agenzien durch säugetier mit hemmung der poly (adp-ribose) polymerase - Google Patents

Identifizierung kanzerogener agenzien durch säugetier mit hemmung der poly (adp-ribose) polymerase Download PDF

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WO1998059069A2
WO1998059069A2 PCT/DE1998/001797 DE9801797W WO9859069A2 WO 1998059069 A2 WO1998059069 A2 WO 1998059069A2 DE 9801797 W DE9801797 W DE 9801797W WO 9859069 A2 WO9859069 A2 WO 9859069A2
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WO
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polymerase
adp
ribose
poly
mammal
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PCT/DE1998/001797
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French (fr)
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Jan-Heiner KÜPPER
Alexander BÜRKLE
Leon Van Gool
Harald Zur Hausen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
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Priority to EP98941257A priority patent/EP1015573A2/de
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Publication of WO1998059069A3 publication Critical patent/WO1998059069A3/de
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying carcinogenic agents.
  • the very widespread Arnes test also called the Salmonella typhimurium test, is based on the mutagenicity of substances in bacteria (Clonfero et al., Med. Lav. 81, pp. 3-10 (1 990)).
  • Another well-known in vitro test is the SOS chromotest (Quillardet et al., Mutat. Res. 297, pp. 235-279 (1 993)), which is based on the induction of the bacterial SOS system by genotoxic agents.
  • the sensitivity of both tests is comparable, but they have the fundamental disadvantage that the genotoxic effects of substances in bacteria and higher organisms can be different and the results are therefore not transferable to the mammalian organism.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method with which carcinogenic agents can be reliably identified.
  • the method according to the invention is carried out using a mammal, preferably a rodent, particularly preferably using a mouse, in which there is a fault in the DNA repair.
  • the DNA repair disorder is based on the trans-dominant inhibition of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), an enzyme involved in DNA repair processes.
  • PARP poly (ADP-ribose) polymerase
  • the inhibition of PARP is preferably based on the expression of a dominant negative mutant of poly (ADP-ribose) polymerase, preferably the transgenic expression of such a mutant in a mammal, thereby producing a transgenic animal which is also the subject of the present invention.
  • the PARP has a DNA binding domain (abbreviated DBD), which enables binding to DNA strand breaks and leads to an enzyme activity of the PARP, which enables repair of the strand breaks.
  • DBD DNA binding domain
  • the dominant negative PARP mutant has a deletion, so that only the DNA binding domain of the PARP is expressed. This inhibits PARP enzyme function and thus DNA repair.
  • the expression of this PARP mutant has no influence on cell division and cell vitality in the absence of genotoxic stress. However, if genotoxic (chemical or physical) agents are applied, PARP inhibition leads to a considerable increase in the sensitivity of the cells to these treatments. The presence of the PARP mutant then leads to an increased genetic instability after carcinogen treatment, which manifests itself in increased recombination and increased gene amplification.
  • the disruption of the PARP function leads to an increased mutagenicity of genotoxic agents.
  • the disruption of cellular PARP function leads to an increased rate of various genetic changes (mutations, recombinations, gene amplification) after treatment with a carcinogen. These different genetic changes, depending on the nature of the carcinogenic agent and the type of its application, allow different ways of tumor development (eg oncogene amplification, tumor suppressor gene mutation or combinations thereof).
  • the mammal used in the method according to the invention advantageously has a skin-specific expression of the dominant-negative PARP mutant, although of course any other organ-specific expression is also possible.
  • the skin is the preferred organ for carcinogenesis studies because of its easy accessibility and controllability.
  • Any promoter known to the person skilled in the art that allows tissue-specific expression, preferably in the skin, can be used to control the transgene; the cytokeratin 14 promoter is preferably used, which allows expression in the cell-dividing basal layer, from which skin tumors preferably arise (Vassar et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 86, pp. 1,563-1,567 (1,989 )).
  • a fragment is preferably used to produce the transgenic mammal, which has the following structure (see FIG. 1):
  • the transgenic mammal is made according to the method described by Hogan et al. ("Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual", Cold Spring Habor Laboratory, New York (1986)). The microinjection of a corresponding DNA fragment into fertilized mouse oocytes and subsequent implantation into hypophysical females is particularly suitable for this. It offspring arise which contain the transgene and are passed on to their offspring (DBD line).
  • the method according to the invention is carried out in the form of an in vivo assay. 10-1 5-week-old transgenic animals from the DBD line are selected and acclimatized accordingly for the test. 1 0- 1 5 animals (female or male) are required for each treatment. Since the skin is an important target organ of the carcinogenesis studies, the potentially carcinogenic chemical agents are applied topically twice a week in 50-200 ⁇ ⁇ solvents, e.g. water, physiological saline, acetone or ethanol). For the investigation of potentially carcinogenic physical agents, corresponding applications are also carried out twice a week. These treatments can last up to 20 weeks. To enable tumor growth, an additional time of up to 40-80 weeks after the last application is estimated.
  • solvents e.g. water, physiological saline, acetone or ethanol
  • DMBA 2-dimethylbenzanthracene
  • the corresponding solvent which was also used to dissolve the test substance, can be applied as a negative control.
  • the animals are weighed regularly throughout the test period and the application site is examined. Papillomas and other skin tumors are examined macroscopically once a week and measured if necessary. When tumors have reached a critical size (depends on the species, location of the tumor and the national animal welfare conditions), the animals are killed and tumor tissue is removed for histological and molecular biological characterization. Primary cultures of the tumors can also be created.
  • a sensitivity gain can be achieved with the method according to the invention using the transgenic mammal which has a disturbance in DNA repair by trans-dominant inhibition of PARP activity, whereby the problem of overdosing and producing false positive results is reduced.
  • the method of the present invention circumvents the problem of the pathway towards a predetermined tumorigenesis.
  • the PARP inhibition leads to a fundamental disruption of the DNA repair with the consequence of an increase in the genetic instability (mutation, recombination, gene amplification rate) after carcinogen treatment, which then promotes tumor development in various ways.
  • Gene DBD coding sequence of the DNA binding domain of human poly (ADP-ribose) polymerase (EC 2.4.2.30)
  • p-A polyadenylation signal of human
  • the plasmid pKDinoDBD (see FIG. 1) was cut with the restriction enzyme Not I. After separation of the restriction fragments on a 1% agarose gel, a 3.6 kB fragment containing the expression cassette of pKDinoDBD was isolated and by means of a commercially available kit (for example "Gene Clean” R; Dianova, Hamburg) according to the manufacturer's instructions prepared. This fragment was adjusted to a concentration of 2 ng / ⁇ l in 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.25 mM EDTA. F1 females from the cross between the mouse strains C57BL / 6 x DBA2 were subjected to superovulation by hormone administration.
  • PCR cycles were carried out, each with 200 ng of genomic DNA, denaturing in each case 300 seconds at 95 ° C., annealing for 60 seconds at 60 ° C. and polymerizing at 72 ° C. for 20 seconds.
  • a positive female (ear tag # 354) was identified. Protein material was obtained from the tail biopsy of this animal and examined for expression of the transgene by means of Western blot. Both the monoclonal anti-DBD antibody CM 10 (Lamarre et al., Biochim. Biophys. Acta 950, S. 147-160 (1 988)) and the anti-FII rabbit serum directed against the DBD (Küpper et al., J. Biol. Chem. 265, p. 1 8721 -1 8724 (1 990)). With both antibodies, the 45 kDa DNA binding domain (DBD) was detectable in the Western blot, so that the evidence for the expression of the transgene was provided. The Founder-DBD-Mouse # 354 was mated with DBA2 males and the offspring were analyzed. The transgene is passed on to the offspring so that the line DBD # 354 is stable.
  • CM 10 Lamarre et al., Biochim. Biophys. Act
  • mice DBD line # 354 described in Example 1 1 2 week old animals of the mouse DBD line # 354 described in Example 1 are acclimated to the test site over three weeks.
  • Female animals are kept in groups of 5 animals / cage, male animals are kept individually under specific pathogen-free (SPF) conditions. The animals are fed according to standard (# D10010 feed from Research Diets, New Brunswick, New Jersey, USA and water ad libitum). 10-1 5 animals (male or female) are required for each treatment.
  • the putative carcinogenic chemicals to be tested are taken up in several dilution stages in physiological saline or acetone and 100 ⁇ l of each dilution is applied topically twice a week.
  • DMBA 2-dimethylbenzanthracene
  • Acetone is applied as a negative control.
  • the treatment is carried out for 1 5 weeks.
  • the animals are weighed weekly and examined at the application site. Visible tumor growth can be expected in the group of the positive control 1 2 weeks after the end of the treatments. Experience has shown that the tumors grow rapidly (within a further 1 2 weeks). After reaching a critical tumor size, the animals are killed by cervical dislocation and the tumor is removed. As expected, there was no tumor growth in the group of animals treated with solvent even after 60 weeks. Alternatively, a so-called initiation doctoral protocol can be used.
  • a very low dose of an initiating (mostly DNA-damaging) carcinogen is administered, followed by repeated applications of a non-carcinogenic tumor promoter (Becker et al., Cancer Res. 56, pp. 3244-3249, 1 996).
  • a non-carcinogenic tumor promoter Becker et al., Cancer Res. 56, pp. 3244-3249, 1 996
  • methyl nitrosourea (20 ⁇ mol in 100 ⁇ l acetone; applied topically once
  • TPA tumor promoter tetradecanoyl-phorbol acetate
  • negative controls are animals that have only been given acetone instead of the methyl nitrosourea, but then followed by the usual TPA treatment.
  • the chemicals to be tested for carcinogenicity are also applied instead of the methyl nitrosourea, again followed by the usual TPA treatment.
  • visible tumor growth in the mouse of the DBD line # 354 described in Example 1 is to be expected after 9 weeks at the latest.

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Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung kanzerogener Agenzien, wobei die potentiell kanzerogenen Agenzien einem Säugetier, das eine Störung in der DNA-Reparatur durch Hemmung der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase aufweist, verabreicht werden.

Description

Verfahren zur Identifizierung kanzerogener Agenzien
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung kanzerogener Agenzien.
In Nahrungsmitteln, Kosmetika, Textilien, Werkstoffen, Chemikalien sowie anderen künstlichen Erzeugnissen, aber auch in der Natur, kommen eine Vielzahl bisher unbekannter Substanzen mit kanzerogenem Gefährdungspotential vor, deren Zahl sich durch ständige Neuentwicklungen erhöht. Darüber hinaus können auch physikalische Agenzien (z.B. Röntgenstrahlen, UV-Strahlung) Krebs auslösen. Zur Identifikation dieser Stoffe und Abschätzung ihres kanzerogenen Potentials wurden bisher verschiedene in-vivo und in-vitro Tests durchgeführt.
Der sehr weit verbreitete Arnes-Test, auch Salmonella-typhimurium-Test genannt, beruht auf der Mutagenität von Substanzen in Bakterien (Clonfero et al., Med. Lav. 81, S. 3-10 ( 1 990)) . Ein ebenso bekannter in-vitro Test ist der SOS- Chromotest (Quillardet et al., Mutat. Res. 297. S. 235-279 ( 1 993)), der auf der Induktion des bakteriellen SOS-Systems durch genotoxische Agenzien beruht. Beide Tests sind in ihrer Sensitivität vergleichbar, haben aber den grundsätzlichen Nachteil, daß die genotoxische Wirkungen von Substanzen in Bakterien und höheren Organismen unterschiedlich sein können und somit die Ergebnisse nicht auf den Säugetierorganismus übertragbar sind. Daher wurden vor wenigen Jahren der Micronucleus-Test (Miller et al., Environ. Mol. Mutagen. 26, S. 240- 247 ( 1 995)), der Einzel-Zell-Geltest (SCG-Test, auch Kometen-Assay genannt) und der Test auf Schwester-Chromosomen-Austausch (Hartmann et al., Mutat. Res. 346, S. 49-56 ( 1 995) entwickelt, die alle auf eukaryontischen Zellsystemen basieren.
Zur Untersuchung der mutagenen Wirkung von Substanzen oder physikalischen Agenzien in lebenden Organismen (in vivo) wurden Assays entwickelt, die auf der Mutation bakterieller Reportergene (Lad- oder lac Z-Gen) beruhen, welche als Transgen in Mäuse eingebracht wurden (Gossen et al., Mutat. Res. 307, S. 451 -459 ( 1 994) . Daraus entstanden die sog. Muta-Maus sowie die Big-Blue- Maus.
Da die Tumorentstehung ein multifaktorieller und in allen Einzelheiten bisher nicht aufgeklärter Vorgang ist, sind Verfahren unzureichend, die nur einzelne Aspekte (z.B. Mutationserzeugung) der Tumorentstehung analysieren. Im Falle eines negativen Ergebnisses kann damit a priori die Kanzerogenität eines Stoffes oder physikalischen Agens nicht ausgeschlossen werden. Zudem sind die für den Genotoxizitätsnachweis von chemischen und physikalischen Agenzien zumeist verwendeten bakteriellen Systeme nur mit Einschränkungen auf höhere Organismen übertragbar. Es gilt daher festzuhalten, daß nach heutigem Stand der Technik nur die Tumorentstehung selbst ein sicherer Parameter ist, um das kanzerogene Gefährdungspotential eines chemischen oder physikalischen Agens zu ermitteln. Aus diesem Grund wurden schon vor vielen Jahren direkte Kanze- rogenitäts-Tests an Nagetieren eingeführt. Bei diesen in vielen Ländern für die Zulassung neuer Substanzen vorgeschriebenen Tests müssen jedoch oft sehr hohe Dosen der betreffenden Substanz appliziert werden, um keine falsch negativen Ergebnisse zu erhalten. Es wurde daher der wichtige Einwand erhoben, daß die erzielten positiven Ergebisse nicht durch eine echte Kanzerogenität der Substanzen ausgelöst werden, sondern daß lediglich eine unspezifische Stimulierung der Zellteilung infolge der Überdosierung vorliegt. Erst durch diese mitogene Aktivierung würden Mutationen und in der Folge Krebs entstehen, so daß auch mit diesen Tests, die falsch positive Ergebnisse liefern, keine verlässlichen Ergebnisse über die Kanzerogenität von Substanzen erhalten werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem kanzerogene Agenzien zuverlässig identifiziert werden können.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Gegenstände der Patentansprüche. Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Verwendung eines Säugetiers, bevorzugt eines Nagetiers, besonders bevorzugt unter Verwendung einer Maus, durchgeführt, bei welchem eine Störung in der DNA-Reparatur vorliegt. Die Störung in der DNA-Reparatur basiert auf der trans-dominanten Hemmung der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase (abgekürzt PARP), einem an DNA-Reparaturvorgängen beteiligten Enzym. Die Hemmung der PARP beruht bevorzugt auf Expression einer dominant negativen Mutante der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase, bevorzugt der transgenen Expression einer solchen Mutante in einem Säugetier, wodurch ein transgenes Tier entsteht, das auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Die PARP besitzt eine DNA-Bindungsdomäne (abgekürzt DBD), welche die Bindung an DNA-Strangbrüche ermöglicht und zu einer Enzymaktivität der PARP führt, wodurch eine Reparatur der Strangbrüche ermöglicht wird.- Bei der dominant negativen PARP-Mutante liegt jedoch eine Deletion vor, so daß nur die DNA-Bindungsdomäne der PARP exprimiert wird. Dies bewirkt eine Hemmung der PARP-Enzymfunktion und damit der DNA-Reparatur. Die Expression dieser PARP-Mutante hat keinen Einfluß auf Zellteilung und Zellvitalität in Abwesenheit von genotoxischem Stress. Werden aber genotoxische (chemische oder physikalische) Agenzien appliziert, führt die PARP-Hemmung zu einer erheblichen Steigerung der Sensitivität der Zellen gegen diese Behandlungen. Die Anwesenheit der PARP-Mutante führt dann zu einer gesteigerten genetischen Instabilität nach Kanzerogenbehandlung, die sich in erhöhter Rekombination sowie verstärkter Genamplifikation äußert. Außerdem führt die Störung der PARP-Funktion zu einer gesteigerten Mutagenität genotoxischer Agentien. Damit führt die Störung der zellulären PARP-Funktion zu einer erhöhten Rate verschiedener genetischer Veränderungen (Mutationen, Rekombinationen, Genamplifikation) nach Behandlung mit einem Kanzerogen. Diese verschiedenen genetischen Veränderungen lassen, in Abhängigkeit von der Natur des kanzerogenen Agens und der Art seiner Applikation, verschiedene Wege der Tumorentstehung zu (z.B. Onkogenamplifikation, Tumorsuppressorgen-Mutation oder Kombinationen davon).
Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Säugetier, bevorzugt die transgene Maus, hat vorteilhafterweise eine Haut-spezifische Expression der dominant-negativen PARP-Mutante, wobei selbstverständlich auch jede andere organspezifische Expression möglich ist. Die Haut ist aber wegen der guten Erreichbarkeit und Kontrollierbarkeit das bevorzugte Organ für Kanzerogenese- Untersuchungen. Zur Steuerung des Transgens kann jeder dem Fachmann bekannte Promotor, der eine gewebespezifische Expression, bevorzugt in der Haut, erlaubt, verwendet werden; bevorzugt wird der Zytokeratin-14-Promotor verwendet, der eine Expression in der zellteilungsaktiven Basalschicht gestattet, aus welcher bevorzugt Hauttumoren entstehen (Vassar et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 86, S. 1 563-1 567 ( 1 989)).
In bevorzugter Weise wird zur Herstellung des transgenen Säugetiers ein Fragment verwendet, das folgenden Aufbau hat (s. Fig. 1 ):
1 ,946 kB Aval-Fragment des humanen Zytokeratinpromotors (Vassar et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, S. 1 563-1 567 ( 1 989)) 1 , 1 56 kB DBD-Fragment von Position -29 bis zur internen Nla IV- Stelle bei 1 1 27 der humanen Poly (ADP-Ribose)-Polymerase (Cher- ney et al., Proc. natl. Acad. Sei. USA 84, S. 8370-8374 ( 1 987)) 0,486 kB des Polyadenylierungssignals des humanen Zytokeratinpromotors (Vassar et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, S. 1 563- 1 567 ( 1 989))
Ein dieses Fragment enthaltender Vektor (pKDinoDBD) wurde am 1 1 . Juni 1 997 unter der Nummer DSM 1 1 594 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig) hinterlegt.
Das transgene Säugetier wird nach der von Hogan et al. ("Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual", Cold Spring Habor Laboratory, New York (1986)) allgemein beschriebenen Methode hergestellt. Dazu eignet sich besonders die Mikroinjektion eines entsprechenden DNA-Fragments in befruchtete Maus-Oozyten und nachfolgende Implantation in scheinträchtige Weibchen. Es entstehen Nachkommen, die das Transgen enthalten und an ihre Nachkommen weitergegeben (DBD-Linie) .
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in Form eines in-vivo-Assays durchgeführt. Es werden 10-1 5 Wochen alte transgene Tiere der DBD-Linie ausgesucht und für den Test entsprechend akklimatisiert. Für jede Behandlung werden 1 0- 1 5 Tiere (weiblich oder männlich) benötigt. Da ein wichtiges Zielorgan der Kanzerogenesestudien die Haut ist, werden die potentiell kanzerogenen chemischen Agenzien in jeweils 50-200 μ\ Lösungsmittel, z.B. Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Aceton oder Ethanol) zweimal pro Woche topisch aufgetragen. Zur Untersuchung von potentiell karzinogenen physikalischen Agenzien werden entsprechende Applikationen ebenfalls zweimal pro Woche durchgeführt. Diese Behandlungen können bis zu 20 Wochen dauern. Um Tumorwachstum zu ermöglichen, wird eine zusätzliche Zeit von bis zu 40-80 Wochen nach der letzten Applikation veranschlagt. Als Positivkontrolle für die Tumorerzeugung kann 5-50 μg 7, 1 2-Dimethylbenzanthracen (DMBA) in derselben Versuchsanordnung verwendet werden. Als Negativkontrolle kann das entsprechende Lösungsmittel, das auch zur Auflösung der Testsubstanz verwendet worden war, aufgetragen werden. Die Tiere werden während der gesamten Versuchszeit regelmäßig gewogen und die Applikationsstelle untersucht. Entstehende Papillome bzw. andere Hauttumoren werden einmal pro Woche makroskopisch untersucht und ggf. vermessen. Wenn Tumore eine kritische Größe erreicht haben (hängt von Tierart, Lage des Tumors und den nationalen Tierschutzbedingungen ab), werden die Tiere getötet und Tumorgewebe wird zur histologischen und molekularbiologischen Charakterisierung entnommen. Außerdem können Primärkulturen der Tumoren angelegt werden. Die Ergebnisse des Kanzerogenitätsversuche werden statistisch ausgewertet, wobei Dosis-Wirkungs-Beziehungen ermittelt werden können. Zur weiteren Analyse können Unterschiede der Turmorentstehung in den Geschlechtern sowie zu Wildtyp-Mäusen ermittelt werden. Weitere Einzelheiten zu in-vivo Kanzerogenitätsassays finden sich in Tennant et al., Environ. Health Perspect. 103. S. 942-950 ( 1 995) . Im Vergleich zu allen in-vitro-Modellen, welche einzelne Vorgänge der Tumorentstehung herausgreifen (z.B. DNA-Schädigung, Mutationserzeugung) ist ein in- vivo-Assay aussagekräftiger, dessen biologischer Endpunkt die Tumorentstehung selbst ist. Im Vergleich zu dem oben beschriebenen direkten Kanzerogenitäts- Modell mit Nagetieren kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung des transgenen Säugetiers, das eine Störung in der DNA-Reparatur durch trans-dominante Hemmung der PARP-Aktivität aufweist, ein Sensitivitäts- gewinn erzielt werden, wodurch das Problem der Überdosierung und Erzeugung falsch positiver Ergebnisse verringert wird. Im Gegensatz zu den bekannten transgenen Mausmodellen umgeht das Verfahren der vorliegenden Erfindung das Problem der Bahnung in Richtung einer vorgegebenen Tumorgenese. Die PARP- Hemmung führt zu einer grundlegenden Störung der DNA-Reparatur mit der Konsequenz einer Verstärkung der genetischen Instabilität (Mutations-, Rekom- binations-, Genamplifikationsrate) nach Kanzerogenbehandlung, wodurch dann über verschiedene Wege die Tumorentstehung begünstigt wird.
Die Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschrieben.
Fig. 1 zeigt das Expressionsfragment aus pKDinoDBD
K14-Prom. = Promotor des humanen Zytokeratin-14-
Gens DBD = kodierende Sequenz der DNA-Bindungsdomäne der humanen Poly(ADP-Ribose)- Polymerase (EC 2.4.2.30) p-A = Polyadenylierungssignal des humanen
Zytokeratin-1 4-Gens
Die Erfindung wird weiter anhand der nachfolgenden Beispiele beschrieben. BEISPIEL 1 : Herstellung der transgenen Mauslinie DBD # 354
Das Plasmid pKDinoDBD (s. Fig. 1 ) wurde mit dem Restriktionsenzym Not I geschnitten. Nach Auftrennung der Restriktionsfragmente auf einem 1 %igen Agarosegel wurde ein 3,6 kB großes Fragment, welches die Expressionskassette von pKDinoDBD enthielt, isoliert und mittels eines kommerziell erhältlichen Kits (z.B. "Gene Clean"R; Dianova, Hamburg) nach den Angaben des Herstellers präpariert. Dieses Fragment wurde auf eine Konzentration von 2 ng/μl in 1 0 mM Tris-HCI (pH 7,6), 0,25 mM EDTA eingestellt. F1 -Weibchen aus der Kreuzung der Mäusestämme C57BL/6 x DBA2 wurden durch Hormongaben einer Supero- vulation unterzogen. Nach der Verpaarung mit F1 -Männchen (ebenfalls durch Kreuzung von C57BL/6 x DBA2) wurden befruchtete Eizellen aus den Weibchen präpariert, in die das vorstehend beschriebene DNA-Fragment mikroinjiziert wurde. Die Embryonen wurden in die Eileiter scheinträchtiger NMRI-Mäuse (Ammenmütter; zuvor verpaart mit vasektomierten Männchen) implantiert. Die nach ca. 21 Tagen geborenen Tiere wurden anhand von DNA-Material aus Schwanz-Biopsien auf Anwesenheit des Transgens überprüft. Dazu wurde die Technik der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit folgenden Primern aus der kodierenden Sequenz der humanen PARP (Cherney et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, S. 8370-8374 (1 987)) eingesetzt:
5'-ATG GCG GAG TCT TCG GAT AAG CTC TA-3' (Primer 1 , # 1 -26) 5'-GCC AGG CGT GGC CGC CAC GGA GG-3' (Primer 2, # 1 1 10-1088)
Es wurden 22 PCR-Zyklen mit jeweils 200 ng genomischer DNA durchgeführt, wobei jeweils 300 sec. bei 95°C denaturiert, 60 sec. bei 60°C angelagert und 1 20 sec. bei 72°C polymerisiert wurde.
Ein positives Weibchen (Ohrmarke #354) wurde identifiziert. Aus der Schwanz- Biopsie dieses Tieres wurde Protein-Material gewonnen und mittels Western Blot auf Expression des Transgens untersucht. Dabei wurden sowohl der monoklona- le anti-DBD-Antikörper CM 10 (Lamarre et al., Biochim. Biophys. Acta 950, S. 147-160 (1 988)) als auch das gegen die DBD gerichtete anti-FII-Kaninchenserum (Küpper et al., J. Biol. Chem. 265, S. 1 8721 -1 8724 ( 1 990)) eingesetzt. Mit beiden Antikörpern war die 45 kDa große DNA-Bindungsdomäne (DBD) im Western Blot nachweisbar, so daß der Beweis für die Expression des Transgens erbracht wurde. Die Founder-DBD-Maus #354 wurde mit DBA2-Männchen verpaart und die Nachkommenschaft analysiert. Das Transgen wird an die Nachkommen weitergegeben, so daß die Linie DBD #354 stabil vorhanden ist.
BEISPIEL 2: Identifizierung des kanzerogenen Potentials von fünf verschiedenen Chemikalien
1 2 Wochen alte Tiere der in Beispiel 1 beschriebenen Maus-DBD-Linie #354 werden über drei Wochen einer Akklimatisation an den Versuchsort unterzogen. Weibliche Tiere werden in Gruppen zu jeweils 5 Tieren/Käfig, männliche Tiere werden einzeln unter spezifisch pathogenfreien (SPF)-Bedingungen gehalten. Die Ernährung der Tiere erfolgt nach Standard (#D10010 Futter von Research Diets, New Brunswick, New Jersey, USA sowie Wasser ad libitum) . Für jede Behandlung werden 10-1 5 Tiere (männlich oder weiblich) benötigt. Die zu testenden putativ karzinogenen Chemikalien werden in mehreren Verdünnungsstufen in physiologischer Kochsalzlösung bzw. Aceton aufgenommen und 100 μl jeder Verdünnung jeweils zweimal pro Woche topisch aufgetragen. Als Positivkontrolle werden 20 μg 7, 1 2-Dimethylbenzanthracen (DMBA) in 100 μl Aceton verwendet. Als Negativkontrolle wird Aceton appliziert. Die Behandlung wird für 1 5 Wochen durchgeführt. Die Tiere werden wöchentlich gewogen und an der Applikationsstelle untersucht. 1 2 Wochen nach Ende der Behandlungen kann in der Gruppe der Positivkontrolle mit einem sichtbaren Tumorwachstum gerechnet werden, wobei erfahrungsgemäß die Tumoren rasch (innerhalb weiterer 1 2 Wochen) an Größe zunehmen. Nach Erreichen einer kritischen Tumorgröße werden die Tiere jeweils durch zervikale Dislokation getötet und der Tumor entnommen. Erwartungsgemäß zeigt sich in der Gruppe der mit Lösungsmittelbehandelten Tiere auch nach 60 Wochen kein Tumorwachstum. Alternativ kann ein sogenanntes Initiations-Promotionsprotokoll zur Anwendung kommen. Im Prinzip wird hierbei einmalig eine sehr niedrige Dosis eines initiierenden (zumeist DNA-schädigenden) Karzinogens verabreicht, gefolgt von wiederholten Anwendungen eines für sich allein nicht-karzinogenen Tumorpromotors (Becker et al., Cancer Res. 56, S. 3244-3249, 1 996) . Hier wird als Positivkontrolle beispielsweise Methylnitrosoharnstoff (20 μmol in 100 μl Aceton; einmalig topisch appliziert) verwendet. Sieben Tage später wird dann mit dem Tumorpromotor Tetradecanoyl-Phorbol-Acetat (TPA) zweimal wöchentlich über einen Zeitraum von 22 Wochen weiterbehandelt (je 10 mmol in 100 l Aceton) . Negativkontrollen sind hier Tiere, die anstelle des Methylnitrosoharnstoff lediglich Aceton erhalten haben, dann jedoch gefolgt von der üblichen TPA-Be- handlung. Die auf Kanzerogenität zu testenden Chemikalien werden ebenfalls anstelle des Methylnitrosoharnstoffs appliziert, wiederum gefolgt von der üblichen TPA-Behandlung. Bei diesem Protokoll ist bei der Positivkontrolle nach spätestens 9 Wochen mit einem sichtbaren Tumorwachstum bei in Beispiel 1 beschriebenen Maus der DBD-Linie #354 zu rechnen.

Claims

Patentansprüche
1 ) Verfahren zur Identifizierung kanzerogener Agenzien, wobei die potentiell kanzerogenen Agenzien einem Säugetier, das eine Störung in der DNA- Reparatur durch Hemmung der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase aufweist, verabreicht werden.
2) Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Hemmung der Poly(ADP-Ribose)- Polymerase durch Expression einer dominant negativen Poly (ADP-Ribo- se)-Polymerase verursacht wird.
3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Hemmung der Poly(ADP- Ribose)-Polymerase durch einen transgenen Eingriff vorgenommen wird.
4) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei als Säugetier eine transgene Maus verwendet wird.
5) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Verabreichung der potentiell kanzerogenen Agentien durch topische Applikation erfolgt.
6) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Säugetier das in Fig. 1 gezeigte DNA-Konstrukt transgen exprimiert.
7) Verwendung eines Säugetiers, das eine Störung in der DNA-Reparatur durch Hemmung der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase aufweist, zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
8) Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Hemmung der Poly(ADP-Ribo- se)-Polymerase durch Expression einer dominant negativen Poly (ADP- Ribose)-Polymerase verursacht wird. 9) Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei es sich bei dem Säugetier um eine transgene Maus handelt.
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