WO1998048012A1

WO1998048012A1 - Fibroblasts with a foreign gene-containing composition for treating wounds

Info

Publication number: WO1998048012A1
Application number: PCT/EP1998/002038
Authority: WO
Inventors: Roland Mertelsmann; Felicia Rosenthal; Peter Kulmburg; Björn G. STARK; Eszter Tanczos; Jürgen Kopp
Original assignee: Albert Ludwigs Universitaet Freiburg; Universitaetsklinikum Freiburg
Current assignee: Albert Ludwigs Universitaet Freiburg; Universitaetsklinikum Freiburg
Priority date: 1997-04-17
Filing date: 1998-04-08
Publication date: 1998-10-29
Anticipated expiration: 1999-10-17
Also published as: CA2286548A1; DE19716098A1; EP0975756A1; AU739125B2; JP2002501491A; AU7215098A; IL131636A0

Abstract

A composition for treating wounds comprises fibroblasts which contain at least one foreign gene coding for a cytokine that promotes wound healing and at least another component that promotes wound healing.

Description

Fibroblasten mit einem Fremdgen enthaltende Zusammensetzung zur Fibroblasts with a foreign gene containing composition for

Behandlung von WundenTreatment of wounds

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Behandlung von Schädigungen der Haut, die nur schwer behandelbar sind. Bei großflächigen Verbrennungen kann es ein erhebliches Problem darstellen, die durch die Schädigung zerstörten Hautbereiche wiederherzustellen, insbesondere wenn ganz überwiegende Teile der Haut schwer geschädigt sind. Auch bei anderen Erkrankungen wie beispielsweise Tumorerkrankungen oder chronischen Hautschädigungen stellt es häufig ein ganz erhebliches Problem dar, die geschädigten Hautbereiche wiederherzustellen.The present invention relates to a composition for the treatment of damage to the skin which is difficult to treat. In the case of large-scale burns, it can be a considerable problem to restore the skin areas destroyed by the damage, in particular if predominant parts of the skin are severely damaged. With other diseases such as tumor diseases or chronic skin damage, it is often a very significant problem to restore the damaged skin areas.

Gentransfizierte Fibroblasten per se sind bereits aus dem Stand der Technik bekannt. In der internationalen Patentanmeldung WO 95/07105 wird ein Verfahren zur Inhibierung oder Verhinderung des Wachstums von Tumorzellen im Zentralnervensystem eines Patienten beschrieben, bei dem die Immunantwort des Patienten stimuliert wird durch Immunisierung mit entweder gentransfizierten Tumorzellen oder unmodifizierten Tumorzellen und gentransfizierten autologen Fibroblasten. Bei den verwendeten Zytokinen handelt es sich in erster Linie um solche, die das Immunsystem stimulieren. Die DE-OS 44 06 073, die ebenfalls im Namen des Klinikums der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg eingereicht wurde, betrifft ein allgemeines Verfahren zur Herstellung von humanen, klonogenen Fibroblasten sowie ein Verfahren zur Gentransfizierung von Fibroblasten. Nicht offenbart wird in dieser Anmeldung die topische Applikation oder die Gentransfizierung speziell mit solchen Genen, die die Wundheilung fördern.Gene transfected fibroblasts per se are already known from the prior art. International patent application WO 95/07105 describes a method for inhibiting or preventing the growth of tumor cells in the central nervous system of a patient, in which the immune response of the patient is stimulated by immunization with either gene-transfected tumor cells or unmodified tumor cells and gene-transfected autologous fibroblasts. The cytokines used are primarily those that stimulate the immune system. DE-OS 44 06 073, which was also submitted in the name of the clinic of the Albert-Ludwigs-University Freiburg, relates to a general process for the production of human, clonogenic fibroblasts and a process for gene transfection of fibroblasts. This application does not disclose topical application or gene transfection specifically with genes that promote wound healing.

Die WO 92/15676 beschreibt die Verwendung von gentransfizierten Fibroblasten für die somatische Gentherapie. Dabei werden die transfizierten Fibroblasten in einer extrazellulären Kollagenmatrix fixiert und unter der Haut implantiert. Die Aufgabenstellung dieser Anmeldung zielt darauf hin, genetische Defekte in menschlichen Genom zu therapieren. Dabei wird ein funktioneil aktives "Ersatz"-Gen in eine somatische Zelle eingebracht und dazu verwendet, den durch das defekte Gen entstehenden Schaden auszugleichen. Nicht angesprochen ist in dieser Literaturstelle die Behandlung von Wunden oder dieWO 92/15676 describes the use of gene-transfected fibroblasts for somatic gene therapy. The transfected fibroblasts are fixed in an extracellular collagen matrix and implanted under the skin. The purpose of this application is to treat genetic defects in the human genome. A functionally active "replacement" gene is introduced into a somatic cell and used to compensate for the damage caused by the defective gene. This reference does not address the treatment of wounds or the

Wundheilung fördernde Zytokine, wie beispielsweise TGF-α, EGF oder b-FGF. In der Entgegenhaltung werden vor allem Zytokine mit anderen biologischen Eigenschaften erwähnt, wie GM-CSF, TNF oder EPO. Der in Anspruch 5 erwähnte "fibroblast growth factor" wird als Blutgefäße bildende Substanz eingesetzt.Cytokines that promote wound healing, such as TGF-α, EGF or b-FGF. The document mentions cytokines with other biological properties, such as GM-CSF, TNF or EPO. The "fibroblast growth factor" mentioned in claim 5 is used as a substance forming blood vessels.

Auch verschiedene auf Keratinozyten einwirkende Wachtumsfaktoren sind bekannt. Gegenstand der WO 90/08771 ist die gentechnologische Bereitstellung von Wachstumsfaktor-Proteinen, die epiteliale Zellen beeinflussen. Bei dieser Anmeldung wird der menschliche Keratinozyten-Wachstumsfaktor aber als im wesentlichen reines Protein eingesetzt.Various growth factors acting on keratinocytes are also known. The subject of WO 90/08771 is the genetic engineering provision of growth factor proteins which influence epitelial cells. In this application, the human keratinocyte growth factor is used as an essentially pure protein.

In der US-Patentschrift 5,302,701 wird die Entwicklung eines künstlichen Polypeptids beschrieben, das sowohl zelladhäsiv ist, wie auch zellwachstu sfordernde Aktivität hat. Es handelt sich hierbei um eine Kombination von Fibronektin und Fibroblast Growth Factor (FGF). Das US-Patent 5,196,196 betrifft zwar eine Wundauflage, die auch eine Trägermatrix umfaßt, jedoch besteht ein wesentlicher Unterschied zu der vorliegenden Erfindung hinsichtlich des Wirkungsprinzips und des aktiven Agens. In dem US-Patent wird bei der Wundauflage gereinigte Protease Nexin-I (PN-I) eingesetzt. Hierbei handelt es sich aber nicht um einen Wachstumsfaktor, sondern um ein Enzym mit bestimmten Eigenschaften. Die Protease Nexin-I ist ein Serin-Protease- Inhibitor; ein Mitglied der Serin-Protease-Superfamilie, die durch menschliche Fibroblasten in Kultur synthetisiert und sekretiert wird. Bei dem US-Patent wird das Protein in gereinigter Form eingesetzt und nicht in der Form eines Gens, das durch Fibroblasten, in die dieses Gen eingebaut wurde, exprimiert wird.U.S. Patent 5,302,701 describes the development of an artificial polypeptide that is both cell adhesive and has cell growth promoting activity. It is a combination of fibronectin and Fibroblast Growth Factor (FGF). Although US Pat. No. 5,196,196 relates to a wound dressing which also comprises a carrier matrix, there is an essential difference from the present invention with regard to the principle of action and the active agent. In the US patent, purified protease Nexin-I (PN-I) is used for the wound dressing. However, this is not a growth factor, but an enzyme with certain properties. The protease Nexin-I is a serine protease inhibitor; a member of the serine protease superfamily that is synthesized and secreted by human fibroblasts in culture. In the US patent, the protein is used in a purified form and not in the form of a gene which is expressed by fibroblasts into which this gene has been incorporated.

Aus dem Stand der Technik ist weiterhin die Verwendung von kultivierten autologen Keratinozyten, die in Fibrinkleber suspendiert sind, zur Behandlung von großflächigen Verbrennungswunden bekannt [Stark et al., Eur. J.Plast. Surg. (1995) 18, S. 267-271]. Es wurde auch bereits im Schweinemodell versucht, bei der Wundheilung Keratinozyten einzusetzen, die in situ mit Hilfe von Partikel-DNA-Transfer transfiziert wurden [Andree et al . , Proc.Natl .Acad.Sci. USA, (1994) 91, S. 12188- 12192] .The use of cultured autologous keratinocytes, which are suspended in fibrin glue, for the treatment of large-area burn wounds is also known from the prior art [Stark et al., Eur. J.Plast. Surg. (1995) 18, pp. 267-271]. Attempts have also already been made in the pig model to use keratinocytes for wound healing, which were transfected in situ with the aid of particle DNA transfer [Andree et al. , Proc.Natl .Acad.Sci. USA, (1994) 91, pp. 12188-12192].

Andreatta-van Leyen et al. [J. Biomedical Materials Res., Vol. 27 (1993), S. 1201-1208] beschreiben eine Wundbandage, die gentransfizierte Keratinozyten umfaßt, die Rinderwachstumshormon (bGH) produzieren.Andreatta-van Leyen et al. [J. Biomedical Materials Res., Vol. 27 (1993), pp. 1201-1208] describe a wound bandage which comprises gene-transfected keratinocytes which produce bovine growth hormone (bGH).

Die aus dem Stand der Technik bekannten Lösungsvorschläge greifen zum Teil auf Keratinozytenpräparationen (z.B. sog. Keratinozyten-Sheets) zurück, die sehr schwierig zu handhaben sind und oft erst dann verwendet werden können, wenn sich bei der Zellkultivierung räumliche Strukturen gebildet haben. Es besteht die Gefahr, daß allogene Präparate, insbesondere solche, die von verschiedenen Spendern stammen und nicht charakterisiert sind, mit Viren (HIV, HCV oder noch nicht charakterisierte Viren) kontaminiert sind und, daß dadurch der zu behandelnde Patient infiziert werden kann.The proposed solutions known from the prior art sometimes use keratinocyte preparations (for example so-called keratinocyte sheets), which are very difficult to handle and can often only be used when spatial structures have formed during cell cultivation. There is a risk that allogeneic preparations, in particular those which come from different donors and are not characterized are contaminated with viruses (HIV, HCV or viruses that have not yet been characterized) and that the patient to be treated can thereby be infected.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Zusammensetzungen zur Behandlung von Wunden enthaltend Fibroblasten, die wenigstens ein Fremdgen kodierend für ein die Wundheilung förderndes Zytokin enthalten und wenigstens eine weitere die Wundheilung fördernde Komponente. Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung weitere Bestandteile aufweisen, die üblicherweise in derartigen Zusammensetzungen verwendet werden.The present invention therefore relates to compositions for the treatment of wounds containing fibroblasts which contain at least one foreign gene coding for a cytokine which promotes wound healing and at least one further component which promotes wound healing. In addition, the composition according to the invention can have further constituents which are usually used in such compositions.

Bei der weiteren die Wundheilung fördernden Komponente kann es sich um einen sogenannten Fibrinkleber handeln. Derartige Fibrinkleber sind kommerziell erhältlich und werden in verschiedenen Bereichen der Medizin, insbesondere in der Chirurgie eingesetzt.The further component that promotes wound healing can be a so-called fibrin glue. Fibrin adhesives of this type are commercially available and are used in various fields of medicine, in particular in surgery.

Bei der Fibrinklebung wird im Prinzip die letzte Phase der Blutgerinnung benutzt. Der Fibrinkleber beinhaltet Fibrinogen, das vom Thrombin zum monomeren Fibrin umgesetzt wird. Dieses wiederum bildet durch End-zu-End- bzw. Seit-zu-Seit-Anlagerung aggregiertes Fibrin. Außerdem beinhaltet der Fibrinkleber in bevorzugter Ausführungsform Fibronectin. Gleichzeitig aktiviert Thrombin den Faktor XIII, der üblicherweise bei dem Fibrinkleber in ausreichender Menge vorhanden ist. Der Fibrinkleber beinhaltet als weitere Komponente eine Thrombinlösung, die häufig zusammen mit Kalziumchlorid als separate Komponente zugefügt wird.In principle, the last phase of blood coagulation is used in fibrin gluing. The fibrin glue contains fibrinogen, which is converted from thrombin to monomeric fibrin. This in turn forms aggregated fibrin through end-to-end or side-to-side attachment. In a preferred embodiment, the fibrin glue also contains fibronectin. At the same time, thrombin activates factor XIII, which is usually present in sufficient quantities in fibrin glue. The fibrin glue contains a thrombin solution as a further component, which is often added together with calcium chloride as a separate component.

Darüber hinaus kann der Fibrinkleber auch ausreichende Mengen an Albumin oder Plasminogen enthalten.The fibrin glue can also contain sufficient amounts of albumin or plasminogen.

Bei der weiteren die Wundheilung fördernden Komponente kann es sich in einer bevorzugten Ausführungsform auch um einen festen Bestandteil handeln, der als Trägermatrix dient. Derartige Träger für "künstliche Haut" sind kommerziell erhältlich (beispielsweise Laserskin® oder Biobrane®). Bei den festen Komponenten kann es sich bevorzugt um eine Matrix aus einem Derivat der Hyaluronsäure handeln, vorzugsweise um einen Hyaluronsäureester. Bei der Hyaluronsäure handelt es sich um einen körpereigenen Bestandteil im Bindegewebe, der einer außerordentlich hohen Umsatzrate unterliegt. Wenn also die Matrix aus Hyaluronsäure besteht, wird sie in der Wunde sehr rasch von der körpereigenen Hyaluronidase abgebaut. Daher werden erfindungsgemäß bevorzugt solche Derivate der Hyaluronsäure eingesetzt, die etwas langsamer im Körper abgebaut werden.In a preferred embodiment, the further component that promotes wound healing can also be a solid component that serves as a carrier matrix. Such Carriers for "artificial skin" are commercially available (for example Laserskin® or Biobrane®). The solid components can preferably be a matrix of a derivative of hyaluronic acid, preferably a hyaluronic acid ester. Hyaluronic acid is an endogenous component in the connective tissue that is subject to an extremely high turnover rate. If the matrix consists of hyaluronic acid, it is quickly broken down in the wound by the body's own hyaluronidase. Therefore, according to the invention, preference is given to using derivatives of hyaluronic acid which are broken down somewhat more slowly in the body.

Ein besonderer Vorteil, der durch die Verwendung einer Trägermatrix erzielt werden kann, ist, daß Zellen auf die Wunde aufgebracht werden können, die noch keinen zusammengewachsenen Zellverband bilden. Wenn bei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung auch Keratinozyten eingesetzt werden, können diese mit Hilfe der Trägermatrix im subkonfluenten Zustand verwendet werden. Zu diesem Zeitpunkt befinden sie sich in ihrer optimalen Wachstumsphase , teilen sich noch sehr häufig und reagieren besonders gut auf die Zytokine, die von den gentransfizierten Fibroblasten produziert werden.A particular advantage that can be achieved by using a carrier matrix is that cells can be applied to the wound that do not yet form a cell cluster that has grown together. If keratinocytes are also used in the composition according to the invention, these can be used in the subconfluent state with the aid of the carrier matrix. At this point, they are in their optimal growth phase, still divide very often and react particularly well to the cytokines that are produced by the gene-transfected fibroblasts.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann in einer bevorzugten Ausführungsfor auch Keratinozyten, und zwar bevorzugt autologe Keratinozyten umfassen. Die Keratinozyten bilden insbesondere die äußere Hautschicht, die sogenannte Epidermis. Keratinozytenkulturen können nach einer an sich bekannten Routinetechnik kultiviert werden [z.B. Rheinwald et al. Nature 265 (1977) S. 421-424]. Hierbei wird üblicherweise ein kleines Stück der Haut mittels Biopsie entfernt und dann werden Epidermis und Der is voneinander getrennt. Aus der Epidermis wird eine Zellsuspension hergestellt, vorzugsweise durch Behandlung mit einem proteolytischen Enzym. Die so erhaltenen einzelnen Zellen werden dann in Kulturbehältern (Flaschen oder Schalen) unter sterilen Bedingungen angezogen und zu einem geeigneten Zeitpunkt von den Kultivierungsbehältern abgelöst. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung weist genetisch veränderte Fibroblasten auf. Fibroblasten sind dem Mesenc ym entstammende Zellen mit einem großen Zelleib und einem etwas abgeplatteten Kern. Die Fibroblasten sind insbesondere an der Bildung der Interzellularsubstanz des Bindegewebes beteiligt. Erfindungsgemäß können entweder autologe Fibroblasten eingesetzt werden oder in einer bevorzugten Form werden allogene Fibroblasten verwendet, die von einem anderen Individuum, also nicht dem zu behandelnden Patienten stammen. Ganz besonders bevorzugt werden solche Fibroblasten eingesetzt, die klonal selektiert wurden, d.h. von einem Klon abstammen.In a preferred embodiment, the composition according to the invention can also comprise keratinocytes, specifically preferably autologous keratinocytes. The keratinocytes form in particular the outer skin layer, the so-called epidermis. Keratinocyte cultures can be cultivated according to a routine technique known per se [eg Rheinwald et al. Nature 265 (1977) pp. 421-424]. Usually a small piece of the skin is removed by biopsy and then the epidermis and the der is separated. A cell suspension is produced from the epidermis, preferably by treatment with a proteolytic enzyme. The individual cells thus obtained are then grown in culture containers (bottles or dishes) under sterile conditions and detached from the cultivation containers at a suitable time. The composition according to the invention has genetically modified fibroblasts. Fibroblasts are cells from the mesenc ym with a large cell body and a somewhat flattened nucleus. The fibroblasts are particularly involved in the formation of the intercellular substance of the connective tissue. According to the invention, either autologous fibroblasts can be used or, in a preferred form, allogeneic fibroblasts are used which originate from another individual, ie not from the patient to be treated. Those fibroblasts that have been selected clonally, that is, derived from a clone, are very particularly preferably used.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die gentransfizierten Fibroblasten mit einer derartigen Dosis ionisierender Strahlen behandelt worden, daß sich die Fibroblasten nicht mehr vermehren können und nach einer gewissen Zeit absterben. Diese Bestrahlung hat den Vorteil, daß die gentransfizierten Zellen im Körper absterben, und zwar nach einer überschaubaren Zeit (< 3 Wochen). Ein weiterer Vorteil der Verwendung bestrahlter Fibroblasten besteht darin, daß die so behandelten Zellen das Zytokin weiterhin gut exprimieren.In a particularly preferred embodiment, the gene-transfected fibroblasts have been treated with a dose of ionizing radiation such that the fibroblasts can no longer multiply and die after a certain time. This radiation has the advantage that the gene-transfected cells in the body die after a reasonable time (<3 weeks). Another advantage of using irradiated fibroblasts is that the cells treated in this way continue to express the cytokine well.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden erfindungsgemäß Zellen von immortalisierten Fibroblastenzellinien verwendet, wobei sich eine Zellinie, die die Bezeichnung KMST-6 erhalten hat, besonders bewährt hat. Immortalisierte Fibroblastenzellinien sind vorteilhaft, da sie kontinuierlich kultiviert und biologisch genau charakterisiert verwendet werden können. Ohne Schwierigkeiten können aber auch andere geeignete immortalisierte Fibroblastenzellinien verwendet werden.In a particularly preferred embodiment, cells of immortalized fibroblast cell lines are used according to the invention, a cell line which has been given the name KMST-6 having proven particularly useful. Immortalized fibroblast cell lines are advantageous because they can be continuously cultivated and used in a biologically precise manner. However, other suitable immortalized fibroblast cell lines can also be used without difficulty.

In die erfindungsgemäß eingesetzten Fibroblasten wird ein Fremdgen, das für ein geeignetes Zytokin kodiert, eingebracht. Bevorzugt handelt es sich bei diesem Fremdgen um ein Gen, das für ein Zytokin wie EGF, TGF-α oder KGF kodiert. Der epidermale Wachstumsfaktor (epidermal growth factor) wird kurz als EGF bezeichnet. Es handelt sich hierbei um ein globuläres Protein von etwa 6,2 kDa, das 53 Aminosäuren aufweist. Erfindungsgemäß ist es nicht unbedingt erforderlich, daß das vollständige Gen in die transfizierten Fibroblasten eingebracht wird; es ist ausreichend, wenn derjenige Teil eingeführt wird, der die biologische Aktivität aufweist. Um eine Sekretion des biologisch aktiven Peptids zu ermöglichen, ist der entsprechende cDNA-Anteil bevorzugt In-Leserahmen mit der sekretorischen Signalsequenz des humanen G-CSF fusioniert. Erfindungsgemäß werden bevorzugt auch EGF-ähnliche Proteine, wie beispielsweise der transformierende WachstumsfaktorA foreign gene which codes for a suitable cytokine is introduced into the fibroblasts used according to the invention. This foreign gene is preferably a gene which codes for a cytokine such as EGF, TGF-α or KGF. The epidermal growth factor is briefly referred to as EGF. It is a globular protein of approximately 6.2 kDa, which has 53 amino acids. According to the invention, it is not absolutely necessary for the complete gene to be introduced into the transfected fibroblasts; it is sufficient if the part which has the biological activity is introduced. In order to enable secretion of the biologically active peptide, the corresponding cDNA portion is preferably fused in-reading frame with the secretory signal sequence of the human G-CSF. EGF-like proteins, such as the transforming growth factor, are also preferred according to the invention

( transforming growth factor) TGF-α, der eine hohe Homologie zu EGF aufweist, eingesetzt. Die biologische Aktivität von EGF und TGF-α ist vergleichbar. Beide Zytokine haben einen Einfluß auf die epidermale Entwicklung und die Differenzierung der Zellen.(transforming growth factor) TGF-α, which has a high homology to EGF. The biological activity of EGF and TGF-α is comparable. Both cytokines have an influence on the epidermal development and the differentiation of the cells.

Bevorzugt eingesetzt werden kann auch NGF (nerve growth factor). Dieses Zytokin ist vor allem verantwortlich für das Überleben, die Differenzierung und die funktioneile Aktivität von sensorischen und sympathischen Neuronen im peripheren Nervensystem. Der beschleunigende Effekt auf die Wundheilung dürfte auf die Fähigkeit von NGF zurückzuführen sein, das Überleben und die funktionellen Aktivitäten verschiedener immunkompetenter Zellen, wie Granulozyten, Mastzellen, Makrophagen und Ly phozyten zu steigern.NGF (nerve growth factor) can also be used with preference. This cytokine is primarily responsible for the survival, differentiation and functional activity of sensory and sympathetic neurons in the peripheral nervous system. The accelerating effect on wound healing may be due to the ability of NGF to increase the survival and functional activities of various immunocompetent cells, such as granulocytes, mast cells, macrophages and lymphocytes.

Ein weiteres bevorzugt eingesetztes Zytokin ist der Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF), der insbesondere die Teilung von teilungsfähigen Keratinozyten stimuliert. Erfindungsgemäß können auch Varianten der Gene eingesetzt werden. Derartige Varianten können Deletionen oder Anfügungen aufweisen und die Sequenz kann gezielt verändert sein. Es ist auch durchaus möglich, solche Varianten von Zytokinen einzusetzen, die eine höhere biologische Aktivität aufweisen als die natürlich vorkommenden Zytokine, wie insbesondere Fusionskonstrukte von zwei oder mehr Zytokinen. Die erfindungsgemäß eingesetzten Fibroblasten enthalten ein Fremdgen, das für ein die Wundheilung förderndes Zytokin kodiert. Dieses Fremdgen kann bevorzugt vom Menschen, aber auch von einem Tier, wie beispielsweise Maus oder Rind stammen. Voraussetzung ist aber, daß das Zytokin dann nicht Speziesspezifisch ist, wenn das Fremdgen von einer anderen Spezies herstammt.Another preferred cytokine is the keratinocyte growth factor (KGF), which in particular stimulates the division of keratinocytes that are capable of division. Variants of the genes can also be used according to the invention. Such variants can have deletions or additions and the sequence can be changed in a targeted manner. It is also entirely possible to use variants of cytokines which have a higher biological activity than the naturally occurring cytokines, such as, in particular, fusion constructs of two or more cytokines. The fibroblasts used according to the invention contain a foreign gene which codes for a cytokine which promotes wound healing. This foreign gene can preferably come from humans, but also from an animal, such as, for example, mice or cattle. However, the prerequisite is that the cytokine is not species-specific if the foreign gene comes from another species.

Es ist erforderlich, daß das Fremdgen in die Fibroblasten eingebracht wird. Dies kann dadurch bewirkt werden, daß das gewünschte Gen in einen geeigneten Vektor eingebaut wird und dann in die Fibroblasten transfiziert wird. Als Vektoren eignen sich virale Vektoren oder Plasmidvektoren, wobei die Plasmidvektoren besonders bevorzugt sind, da bei viralen Vektoren zusätzliche Untersuchungen zum Ausschluß von Kontamination mit replikationskompetenten Viren durchgeführt werden müssen.The foreign gene is required to be introduced into the fibroblasts. This can be accomplished by incorporating the desired gene into a suitable vector and then transfecting it into the fibroblasts. Viral vectors or plasmid vectors are suitable as vectors, the plasmid vectors being particularly preferred, since additional tests have to be carried out on viral vectors to rule out contamination with replication-competent viruses.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen weisen verschiedene Vorteile auf gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Lösungen.The compositions according to the invention have various advantages over the solutions known from the prior art.

Durch die genveränderten Fibroblasten, die in bevorzugter Ausführungsform lethal bestrahlt wurden, kann für eine vorbestimmte Zeit das oder die gewünschten Zytokine exprimiert und in das Gewebe abgegeben werden. Aufgrund der kontinuierlichen Produktion des Zytokins können die Probleme umgangen werden, die auf die kurze Halbwertszeit von Zytokinen bei lokaler externer Applikation zurückzuführen sind. Bei den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können verschiedene Zelltypen (Keratinozyten/Fibroblasten) miteinander kombiniert werden, wobei die gentransfizierten Fibroblasten auch unterschiedliche Zytokine beinhalten können. Dadurch können gezielt verschiedene Wachstumsfaktoren in den Wundbereich eingebracht werden. Wenn autologe Keratinozyten verwendet werden, kann die Histoinkompatibilitätsabstoßungsreaktion vermieden werden. Es ist auch denkbar, zusätzlich Gene für Wachstumsfaktoren einzuführen, die auf weiße Blutkörperchen wirken, wie beispielsweise G-CSF oder GM-CSF, um dadurch die körpereigene Immunabwehr in den Wundbereichen zu stimulieren. Dadurch kann die körpereigene Abwehr gegenüber Infektionen gestärkt werden, was insbesondere bei Verbrennungswunden relevant ist.The gene-modified fibroblasts, which in a preferred embodiment were lethally irradiated, can express the desired cytokine or s for a predetermined time and release them into the tissue. Due to the continuous production of the cytokine, the problems that can be attributed to the short half-life of cytokines with local external application can be avoided. In the compositions according to the invention, different cell types (keratinocytes / fibroblasts) can be combined with one another, and the gene-transfected fibroblasts can also contain different cytokines. This enables various growth factors to be introduced into the wound area in a targeted manner. If autologous keratinocytes are used, the histoin incompatibility rejection reaction can be avoided. It is also conceivable to additionally introduce genes for growth factors that act on white blood cells, such as G-CSF or GM-CSF, in order to stimulate the body's immune defense in the wound areas. This can strengthen the body's defense against infections, which is particularly relevant for burn wounds.

Es ist auch durchaus möglich, die erfindungsgemäße Zusammensetzung ohne Keratinozyten einzusetzen. In diesem Fall wird durch die genveränderten Fibroblasten das Zytokin in die Umgebung abgegeben und es werden diejenigen Keratinozyten des behandelten Patienten stimuliert, die sich beispielsweise in den Randbereichen der Wunde finden.It is also entirely possible to use the composition according to the invention without keratinocytes. In this case, the gene-modified fibroblasts release the cytokine into the environment and stimulate those keratinocytes of the treated patient that are found, for example, in the marginal areas of the wound.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen liegen bevorzugt in Form von pharmazeutisch annehmbaren Formulierungen vor. Hierbei kann es sich entweder um Suspensionen von Fibrinkleber und gentransfizierten Fibroblasten handeln, die als Lösungen, Suspensionen, Salben oder in Form von Gelen auf die Wunde aufgebracht werden können. Wenn es sich um eine Zusammensetzung handelt, die eine feste Komponente, also eine Trägermatrix aufweist, dann liegen diese Zusammensetzungen bevorzugt in Form von sterilen Einheiten vor, die in geeigneter Art und Weise konserviert werden. Derartige Präparate können beispielsweise in Form von tiefgefrorenen, sterilen Auflagen vorliegen.The compositions according to the invention are preferably in the form of pharmaceutically acceptable formulations. These can either be suspensions of fibrin glue and gene-transfected fibroblasts, which can be applied to the wound as solutions, suspensions, ointments or in the form of gels. If it is a composition which has a solid component, that is to say a carrier matrix, then these compositions are preferably in the form of sterile units which are preserved in a suitable manner. Such preparations can, for example, be in the form of frozen, sterile pads.

Beschreibung der FigureDescription of the figure

Figur 1 zeigt die Struktur des Expressionsvektors für humanes EGF. Teil (A) zeigt die Plasmidkonstruktion mit dem Chimären EGF-Gen. Teil (B) zeigt die Sequenz der Fusion im Leserahmen zwischen der humanen G-CSF-Signalsequenz (unterstrichen) und der reifen für humanes EGF kodierenden Region (Asn Ser Asp ...).Figure 1 shows the structure of the expression vector for human EGF. Part (A) shows the plasmid construction with the chimeric EGF gene. Part (B) shows the sequence of the fusion in the reading frame between the human G-CSF signal sequence (underlined) and the mature region coding for human EGF (Asn Ser Asp ...).

Figur 2 zeigt die Sekretion von EGF von Fibroblasten, die mit dem Plas id pCMV-EGF-IRES-TKNeo transfizierten wurden. Es handelt sich hierbei um Fibroblasten der Zellinie KMST-6 nach Bestrahlung (100 Gy) . Bei dem Versuch wurden 2 x 10 bestrahlte Zellen in Kulturplatten mit sechs Löchern ausgesät und die EGF- Konzentration wurde in Kulturüberständen nach 24 Stunden bestimmt. Die Werte stellen Durchschnittswerte dar.FIG. 2 shows the secretion of EGF from fibroblasts which were transfected with the plas id pCMV-EGF-IRES-TKNeo. These are fibroblasts from the KMST-6 cell line after irradiation (100 Gy). In the experiment, 2 x 10 were irradiated Cells were seeded in six well culture plates and the EGF concentration was determined in culture supernatants after 24 hours. The values represent average values.

Figur 3 zeigt die Bioaktivität von chimären EGF-Polypeptiden, die von den Klonen #3 und #6 von gentransfizierten KMST-6- Fibroblasten erhalten wurden.Figure 3 shows the bioactivity of EGF chimeric polypeptides obtained from clones # 3 and # 6 from gene transfected KMST-6 fibroblasts.

Teil (A) zeigt die Bioaktivität an Mäusekeratinozyten vom Stamm BALB/MK.Part (A) shows the bioactivity on mouse keratinocytes from the BALB / MK strain.

Teil (B) zeigt die Ergebnisse, die mit Hilfe von menschlichen primären Keratinozyten erhalten wurden. Die Werte geben die Durchschnittsergebnisse von acht Messungen mit Standardabweichung an. Die gepunkteten Balken stellen die Eichkurve dar, die mit rekombinantem EGF erhalten wurden. Die leeren Balken stellen die Kontrollwerte dar, erhalten mit Fibroblasten der Zellinie KMST-6. Die gestreiften und grauen Balken stellen die Ergebnisse dar, die mit Kulturüberständen beider Klone 3 bzw. 6 erhalten wurden.Part (B) shows the results obtained using human primary keratinocytes. The values give the average results of eight measurements with standard deviation. The dotted bars represent the calibration curve obtained with recombinant EGF. The empty bars represent the control values obtained with fibroblasts from the KMST-6 cell line. The striped and gray bars represent the results obtained with culture supernatants from both clones 3 and 6, respectively.

Figur 4 zeigt die Proliferation von primären menschlichen Keratinozyten im Kulturtest mit bestrahlten Fibroblasten der Zellinie KMST-6 , die gentransfiziert wurden.FIG. 4 shows the proliferation of primary human keratinocytes in the culture test with irradiated fibroblasts of the KMST-6 cell line, which were gene-transfected.

Teil (A) zeigt die Ergebnisse nach vier Tagen Co-Kultur.Part (A) shows the results after four days of co-culture.

Teil (B) zeigt die Ergebnisse nach 10 Tagen Co-Kultur.Part (B) shows the results after 10 days of co-culture.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgend aufgeführten Beispiele weiter erläutert:The present invention is further illustrated by the examples listed below:

Beispiel 1example 1

Konstruktion eines Plasmids enthaltend ein Gen für EGF und Transfektion In den meisten menschlichen Zellen wird EGF als ein 130 kDa Transme branglycoprotein-Precursormolekül synthetisiert, das proteolytisch gespalten wird in das biologisch aktive 6,2 kDa EGF-Peptid mit 53 Aminosäuren. Erfindungsgemäß wurde daher ein chimäres Konstrukt hergestellt, das für eine In-Leserah en-Fusion des reifen EGF-Peptids und die menschliche G-CSF sekretorische Signalsequenz kodiert. Der Aufbau ist schematisch in Figur 1 (A) dargestellt. Das dabei entstandene DNA-Fusionsfragment wurde unter die transkriptioneile Kontrolle des menschlichen CMV (Cytomegalievirus) -Promotors gestellt und in einen dicistronischen Vektor eingebaut, um die Expression des Transgens an die des Selektionsmarkers Neomycin-Phosphor- Transferase zu binden.Construction of a plasmid containing a gene for EGF and transfection In most human cells, EGF is synthesized as a 130 kDa transme branglycoprotein precursor molecule that is proteolytically cleaved into the biologically active 6.2 kDa EGF peptide with 53 amino acids. According to the invention, a chimeric construct was therefore produced which codes for an in-reading fusion of the mature EGF peptide and the human G-CSF secretory signal sequence. The structure is shown schematically in Figure 1 (A). The resulting DNA fusion fragment was placed under the transcriptional control of the human CMV (cytomegalovirus) promoter and inserted into a dicistronic vector in order to bind the expression of the transgene to that of the selection marker neomycin phosphorus transferase.

Bei der Klonierung wurde die für das reife menschliche EGF- Peptid kodierende Sequenz mit Hilfe der PCR-Technologie amplifiziert und das dabei erhaltene Produkt in dem Vektor pBluescript (Stratagene) subkloniert und anschließend sequenziert. Ebenso wurde die menschliche G-CSF-Signalsequenz aus menschlicher G-CSF cDNA mit Hilfe der PCR-Technologie amplifiziert, wobei eine verbesserte Kozak-Konsensus-Sequenz am 5 ' -Ende und eine einzelne Nhel Restriktionsschnittstelle geschaffen wurden. Die relevante Sequenz ist in Figur 1 (B) dargestellt.During the cloning, the sequence coding for the mature human EGF peptide was amplified with the aid of PCR technology and the product obtained was subcloned in the vector pBluescript (Stratagene) and then sequenced. Similarly, the human G-CSF signal sequence from human G-CSF cDNA was amplified using PCR technology, creating an improved Kozak consensus sequence at the 5 'end and a single Nhel restriction site. The relevant sequence is shown in Figure 1 (B).

Das so erzeugte Plasmid wurde in menschliche Fibroblasten der Zellinie KMST-6 transfiziert und alle Neomycin-resistenten Klone sekretierten menschliches EGF, was durch einen ELISA-Test nachgewiesen wurde. Die Kontrolle zeigte, daß nicht transfizierte menschliche Fibroblasten der Zellinie KMST-6 keine nachweisbare Mengen an hEGF sowohl vor als auch nach Bestrahlung sekretierten.The plasmid thus generated was transfected into human fibroblasts of the KMST-6 cell line and all neomycin-resistant clones secreted human EGF, which was demonstrated by an ELISA test. The control showed that non-transfected human fibroblasts from the KMST-6 cell line did not secrete detectable levels of hEGF either before or after radiation.

Für die weiteren Untersuchungen wurden die Klone #3 und #6 verwendet, die 37 bzw. 8 ng EGF/10⁶ Zellen und 24 Stunden sekretierten. Die Sekretion von menschlichem EGF in den Überstand durch transfizierte Fibroblasten wurde mit Hilfe der ELISA-Technik (Quantikine, R & D Systems) bestimmt. Es wurde der Überstand von bestrahlten oder nicht bestrahlten Ausgangszellen oder EGF-gentransfizierten Zellen nach 24 Stunden entnommen und hinsichtlich der EGF-Produktion untersucht, nachdem die Anzahl der lebensfähigen Zellen bestimmt wurde.Clones # 3 and # 6, which secreted 37 and 8 ng EGF / 10 ⁶ cells and 24 hours, were used for the further investigations. The secretion of human EGF into the supernatant by transfected fibroblasts was determined using the ELISA technique (Quantikine, R & D Systems). The supernatant from irradiated or non-irradiated parent cells or EGF gene transfected cells was removed after 24 hours and examined for EGF production after the number of viable cells was determined.

Eine Bestrahlung wurde bei Raumtemperatur mit einer 137Cs- Bestrahlungsquelle mit einer Dosisrate von 3 Gy/Minute durchgeführt.Irradiation was carried out at room temperature with a 137 CS radiation source at a dose rate of 3 Gy / minute.

Beispiel 2Example 2

Einfluß einer lethalen Bestrahlung auf die Expression von chimärem EGF-Protein durch gentransf izierte FibroblastenInfluence of lethal radiation on the expression of chimeric EGF protein by gene-transfected fibroblasts

Für optimale Wundheilungsergebnisse ist es erforderlich, daß EGF in den ersten Tagen der Behandlung zur Verfügung steht. Andererseits kann durch eine lethale Bestrahlung das unkontrollierte in vivo-Wachstum von genetisch modifizierten Zellen verhindert werden. Es wurde daher der Einfluß einer lethalen Bestrahlung auf die Expression von EGF untersucht, wobei KMST-6 Fibroblasten (Klon #3, transfiziert mit dem Plasmid pCMV-EGF-IRES-TKNeo) untersucht wurden. Es wurde gefunden, daß nach Bestrahlung mit 100 Gy die Sekretion von EGF langsam absank, aber im Überstand über mindestens sieben Tage in vitro nachweisbar war. Die Ergebnisse sind in Figur 2 zusammengefaßt.For optimal wound healing results, EGF must be available for the first few days of treatment. On the other hand, lethal radiation can prevent the uncontrolled in vivo growth of genetically modified cells. The influence of lethal radiation on the expression of EGF was therefore investigated, KMST-6 fibroblasts (clone # 3, transfected with the plasmid pCMV-EGF-IRES-TKNeo) being examined. It was found that EGF secretion slowly decreased after irradiation with 100 Gy, but was detectable in the supernatant for at least seven days in vitro. The results are summarized in Figure 2.

Beispiel 3Example 3

Biologische Aktivität des Chimären EGF-PolypeptidsBiological activity of the EGF polypeptide chimeric

Um nachzuweisen, daß das EGF-Protein, das von den transfizierten Fibroblasten sekretiert wird, auch tatsächlich die biologische Aktivität aufweist, wurden die Überstände der Medien von den EGF-gentransfizierten Klonen auf die mitogene Aktivität überprüft an permanenten Mäusekeratinozyten-Zellinien und an primären humanen Keratinozyten. Zur Kontrolle wurden verschiedene Konzentration von rekombinantem humanem EGF eingesetzt. Beide Zelltypen wurden sowohl durch das rekombinante Protein als auch durch die Kulturüberstände der Klone #3 und #6 in dosisabhängiger Weise stimuliert. Eine optimale Stimulation der Mäusekeratinozyten wurde bei einer Konzentration zwischen 2 und 20 ng/ml rekombinantem hEGF beobachtet. Dies entspricht der Stimulation, erreichbar durch eine 1:5 Verdünnung des Kulturüberstandes. Die Ergebnisse sind in Figur 3 (A) dargestellt.In order to demonstrate that the EGF protein secreted by the transfected fibroblasts does indeed have the biological activity, the media supernatants from the EGF-gene transfected clones were checked for mitogenic activity checked on permanent mouse keratinocyte cell lines and on primary human keratinocytes. Various concentrations of recombinant human EGF were used as controls. Both cell types were stimulated in a dose-dependent manner both by the recombinant protein and by the culture supernatants of clones # 3 and # 6. Optimal stimulation of the mouse keratinocytes was observed at a concentration between 2 and 20 ng / ml recombinant hEGF. This corresponds to the stimulation, which can be achieved by diluting the culture supernatant 1: 5. The results are shown in Figure 3 (A).

Bei Verwendung von primären humanen Keratinozyten war die effektive Dosis geringfügig niedriger und es wurde eine optimale Proliferation bereits bei 0,2 ng/ml an rEGF und bei einer 1:50 Verdünnung des Kulturüberstandes des Klons pCMV-EGF-IRES- TKNeo/KMST6#3 beobachtet. Die Ergebnisse sind in Figur 3 (B) dargestellt. Bei beiden Tests konnte die Tendenz beobachtet werden, daß das Zellwachstu bei höheren Konzentrationen inhibiert wurde. Kulturüberstände von nicht transfizierten Fibroblasten der Zellinie KMST-6 zeigten keine Stimulierung der Proliferation im Vergleich mit Zellkulturüberständen ohne zugesetzten Wachstumsfaktor. Um die therapeutische Wirksamkeit bei der Wundheilung genauer zu untersuchen, wurden lethal bestrahlte EGF-gentransfizierte Fibroblasten in vitro co- kultiviert mit primären humanen Keratinozyten. Bei den Versuchen zeigte sich, daß nach einer Inkubationszeit von vier Tagen mit verschiedenen Konzentrationen von bestrahlten EGF sezernierenden Fibroblasten eine dosisabhängige Stimulation der Keratinozytenproliferation ähnlich derjenigen erhalten werden konnte, die durch rekombinanten Wachstumsfaktor induziert wurde. Dies ist in Figur 4 dargestellt, wobei Figur 4 (A) die Werte zeigt nach vier Tagen Co-Kultivierung und die Figur 4 (B) zeigt die Werte nach 10 Tagen Co-Kultivierung. Beispiel 4When using primary human keratinocytes, the effective dose was slightly lower and there was an optimal proliferation at 0.2 ng / ml of rEGF and at a 1:50 dilution of the culture supernatant of the clone pCMV-EGF-IRES-TKNeo / KMST6 # 3 observed. The results are shown in Figure 3 (B). In both tests, the tendency was observed that cell growth was inhibited at higher concentrations. Culture supernatants from non-transfected fibroblasts of the KMST-6 cell line showed no stimulation of proliferation in comparison with cell culture supernatants without added growth factor. In order to investigate the therapeutic effectiveness in wound healing in more detail, lethally irradiated EGF-transfected fibroblasts were co-cultivated in vitro with primary human keratinocytes. The experiments showed that after an incubation period of four days with different concentrations of irradiated EGF-secreting fibroblasts, dose-dependent stimulation of keratinocyte proliferation similar to that which was induced by recombinant growth factor could be obtained. This is shown in Figure 4, with Figure 4 (A) showing the values after four days of co-cultivation and Figure 4 (B) showing the values after 10 days of co-cultivation. Example 4

Nachweis der in vivo EGF -Produktion durch in vitro liposomal transfizierte KMST-6 ZellenDetection of in vivo EGF production by in vitro liposomally transfected KMST-6 cells

Versuchsauf bauExperimental setup

1,5 x 1,5 cm große Vollhautwunden wurden auf dem Rücken von 42 Nacktmäusen erzeugt. 9,4 x 10 hEGF-transfizierte und letal bestrahlte KMST-6 Zellen wurden in 2,8 ml Fibrinkleber suspendiert und auf die Vollhautwunden von 14 NacktmäusenWhole skin wounds measuring 1.5 x 1.5 cm were created on the backs of 42 nude mice. 9.4 x 10 hEGF-transfected and lethally irradiated KMST-6 cells were suspended in 2.8 ml of fibrin glue and on the whole skin wounds of 14 nude mice

2 transplantiert (300 000 Zellen/cm , Gruppe I).2 transplanted (300,000 cells / cm, group I).

Als Kontrollen dienten 14 Vollhautwunden, transplantiert mit untransfizierten KMST-6 Zellen (300 000 Zellen/cm², Gruppe II) sowie 14 unbehandelte Vollhautwunden (Gruppe III).14 whole skin wounds, transplanted with untransfected KMST-6 cells (300,000 cells / cm ² , group II) and 14 untreated full skin wounds (group III) served as controls.

Am Tag 1, 2, 3, 4, 5, 7 und 14 wurden aus jeder Gruppe jeweils zwei Tiere nekropsiert und 0,8 g Wundgewebe mit einem Triton-X- PBS Puffer homogenisiert. Die Homogenisate wurden zentrifugiert und die EGF-Konzentration der Überstände mit Hilfe eines anti- human-EGF ELISA ausgewertet.On day 1, 2, 3, 4, 5, 7 and 14 two animals from each group were necropsed and 0.8 g wound tissue was homogenized with a Triton-X-PBS buffer. The homogenates were centrifuged and the EGF concentration of the supernatants was evaluated using an anti-human EGF ELISA.

.Ergebnisse.Results

In vivo waren in der Gruppe I (erfindungsgemäß) am Tag 1 470 pg/ml detektierbar, verglichen mit 18 pg/ml in Gruppe II und 1,3 pg/ml in Gruppe III. An den Tagen 2-7 sanken die EGF- Konzentrationen in der Gruppe I, waren jedoch significant höher als in den Kontrollgruppen. Am Tag 14 war kein EGF in allen drei Gruppen detektierbar.In vivo, in group I (according to the invention) 470 pg / ml were detectable on day 1, compared with 18 pg / ml in group II and 1.3 pg / ml in group III. On days 2-7, EGF concentrations decreased in group I, but were significantly higher than in the control groups. No EGF was detectable in all three groups on day 14.

Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, daß in vitro EGF- transfizierte Fibroblasten in einer Fibrinkleber-Suspension erfolgreich transplantiert werden konnten. Das transgene Protein war zumindest bis Tag 7 in vivo nachweisbar. Die bei dem Versuch erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammengefaßt.In summary, these results show that in vitro EGF-transfected fibroblasts were successfully transplanted in a suspension of fibrin glue. The transgenic protein was detectable in vivo at least until day 7. The results obtained in the experiment are summarized in Table I below.

Tabelle ITable I

Tage pCMV-EGF-IRES- KMST6 unbehandelte TKNeo/KMST6#3 Kontrolle Vollhaut¬Days pCMV-EGF-IRES-KMST6 untreated TKNeo / KMST6 # 3 control whole skin

(transplantiert wunden erfindungsgemäß mit untransfizierten (Gruppe III)(transplanted wounds according to the invention with untransfected (group III)

KMST6-Zellen,KMST6 cells,

Gruppe II )Group II)

1 470 18 1,31 470 18 1.3

2 393 58 1,62 393 58 1.6

3 330 28 2,33 330 28 2.3

4 150 8 6,54 150 8 6.5

5 180 8,5 85 180 8.5 8

7 140 8,3 2,67 140 8.3 2.6

14 0,4 0 014 0.4 0 0

Tabelle I zeigt die hEGF-Freisetzung in pg/ml in vivo in Wunden durch bestrahlte KMST6-Fibroblasten, die mit chimärem hEGF-Gen transfiziert wurden.Table I shows the hEGF release in pg / ml in vivo in wounds from irradiated KMST6 fibroblasts transfected with the chimeric hEGF gene.

Beispiel 5Example 5

Wundheilungs fördernder Effekt nach Transplantation von in vitro EGF -transf izierten KMST-6 Zellen in Kombination mit humanen Keratinozyten (Mischzelltransplantation)Wound healing promoting effect after transplantation of in vitro EGF-transfected KMST-6 cells in combination with human keratinocytes (mixed cell transplantation)

VersuchsaufbauExperimental setup

1,5 x 1,5 cm große Vollhautwunden wurden auf den Rücken von 72 Nacktmäusen erzeugt. 1,0125 x 10 EGF-transfizierte und letal bestrahlte KMST-6 Zellen wurden in Kombination mit 2,025 x 10 humanen Keratinozyten in 3,6 ml Fibrinkleber suspendiert und auf Vollhautwunden von 18 Nacktmäusen transplantiert (Ratio 1:2, 75 000 Zellen/cm², Gruppe I). Als Kontrolle dienten 18 Vollhautwunden, transplantiert mit EGF-transfizierten KMST-6 Zellen alleine (25 000 Zellen/cm, Gruppe II), 18 Vollhautwunden, transplantiert mit humanenerWhole skin wounds measuring 1.5 x 1.5 cm were created on the backs of 72 nude mice. 1.0125 x 10 EGF-transfected and lethally irradiated KMST-6 cells in combination with 2.025 x 10 human keratinocytes were suspended in 3.6 ml fibrin glue and transplanted onto whole skin wounds of 18 nude mice (ratio 1: 2, 75,000 cells / cm ² , Group I). 18 whole skin wounds, transplanted with EGF-transfected KMST-6 cells alone (25,000 cells / cm, group II), 18 whole skin wounds, transplanted with human, were used as controls

22

Keratinozyten alleine (50 000 Zellen/cm , Gruppe III) sowie 18 Vollhautwunden transplantiert mit nicht transfizierten KMST-6Keratinocytes alone (50,000 cells / cm, group III) and 18 whole skin wounds transplanted with non-transfected KMST-6

Zellen in Kombination mit humaner Keratinozyten (Ratio 1:2, 7 755 000000 ZZeelllleenn//ccm², Gruppe IV). Tabelle II zeigt die Gruppenaufteilung.Cells in combination with human keratinocytes (ratio 1: 2, 7 755 000 000 ZZeelllleenn // ccm ² , group IV). Table II shows the group breakdown.

Tabelle IITable II

Am Tag 1, 3, 5, 7, 10 und 12 wurde aus jeder Gruppe jeweils ein Tier nekropsiert und 0 , 8g Wundgewebe mit einem Triton-X-PBS Puffer homogenisiert. Die Homogenisate wurden zentrifugiert und die EGF-Konzentration der Überstände mit Hilfe eines anti-human- EGF ELISA ausgewertet. Die andere Hälfte der Biopsien wurde beginnend mit Tag 5 für die histologischen Untersuchungen verwendet .On day 1, 3, 5, 7, 10 and 12, one animal from each group was necropsed and 0.8 g of wound tissue was homogenized with a Triton-X-PBS buffer. The homogenates were centrifuged and the EGF concentration of the supernatants was evaluated using an anti-human EGF ELISA. The other half of the biopsies were used for histological examinations beginning on day 5.

An den post-OP-Tagen 7, 10, 12, 14, 17 und 21 wurden jeweils Biopsien von zwei weiteren Tieren aus jeder Gruppe histologisch untersucht.On postoperative days 7, 10, 12, 14, 17 and 21, biopsies of two other animals from each group were examined histologically.

ErgebnisseResults

Es war in der Gruppe I und II EGF detektierbar, jedoch nicht in Gruppe III und IV.It was detectable in groups I and II EGF, but not in groups III and IV.

Bezüglich des Wundverschlusses zeigten die Ergebnisse in Gruppe I am Tag 7 bis 12 kontinuierlich eine fast komplette, ausgeprägte, ab Tag 14 eine komplette Epithelialisation. Die besten Ergebnisse bezüglich der Rekonstitutionsqualitat der Epidermis (Zellagigkeit des Epithels) zeigten auch die Wunden der Gruppe I. Die Kontrollgruppen dagegen zeigten erst am Tag 14 eine ausgeprägte Epithelialisation und am Tag 21 zeigten sie noch immer keine hochwertige Epithelialisation. In der Tabelle III ist die Epithelialisation tabellarisch dargestellt.Regarding wound closure, the results in group I continuously showed an almost complete, pronounced epithelialization on day 7 to 12, and a complete epithelialization on day 14. The wounds also showed the best results with regard to the reconstitution quality of the epidermis (cell activity of the epithelium) of group I. The control groups, on the other hand, only showed pronounced epithelialization on day 14 and on day 21 they still showed no high-quality epithelialization. Table III shows the epithelialization in a table.

Tabelle III: Tabellarische Darstellung der EpithelialisationTable III: Tabular representation of the epithelialization

Epithelialisation / DifferentiationEpithelialization / Differentiation

keine Epithelialisation nachweisbar + beginnende Epithelialisation

no epithelialization detectable + beginning epithelialization

++ ausgeprägte aber nicht vollständige Epithelialisation +++ vollständige Epithelialisation++ pronounced but not complete epithelialization +++ complete epithelialization

Beispiel 6Example 6

Wundheilungsfördernder Effekt nach Transplantation von in vitro EGF-transf izierten KMST-6 Zellen im GroßtiermodellEffect of wound healing after transplantation of in vitro EGF-transfected KMST-6 cells in the large animal model

VersuchsaufbauExperimental setup

In einem Großtierversuch wurden Versuche an insgesamt 3 Schweinen (Pl, P2 , P3 ) mit insgesamt je 21 standardisiertenIn a large animal experiment, experiments were carried out on a total of 3 pigs (Pl, P2, P3) with a total of 21 standardized

Verbrennungswunden (5 cm 2 groß, Grad 2a) durchgeführt. Bei einem Schwein (Pl) wurden 7 standardisierte Verbrennungswunden mit EGF-transfizierten KMST-6 Zellen in Fibrinkleber transplantiert (Therapiegruppe). Hier dienten 7 unbehandelte standardisierte Verbrennungswunden (Kontrollgruppe I) sowie 7 standardisierte Verbrennungswunden, die mit Fibrinkleber behandelt wurden (Kontrollgruppe III), als Kontrolle. Bei zwei weiteren Schweinen (P2, P3) wurden ebenfalls je 7 standardisierte Verbrennungswunden mit EGF-transfizierten KMST-6 Zellen in Fibrinkleber transplantiert (Therapiegruppe). Als Kontrolle dienten je 7 unbehandelte standardisierte Verbrennungswunden (Kontrollgruppe I) sowie je 7 standardisierte Verbrennungswunden, die mit nicht transfizierten KMST-6 Zellen transplantiert wurden (Kontrollgruppe II). Tabelle IV zeigt die Gruppenaufteilung.Burn wounds (5 cm 2, grade 2a) performed. In a pig (PI), 7 standardized burns with EGF-transfected KMST-6 cells were transplanted into fibrin glue (therapy group). 7 untreated standardized burns (control group I) and 7 standardized ones were used here Burns treated with fibrin glue (control group III) as a control. In two other pigs (P2, P3), 7 standardized burns with EGF-transfected KMST-6 cells were transplanted into fibrin glue (therapy group). 7 untreated standardized burn wounds (control group I) and 7 standardized burn wounds, which were transplanted with non-transfected KMST-6 cells (control group II), served as controls. Table IV shows the group breakdown.

Tabelle IVTable IV

Am Tag 1, 3, 5, 7, 10, 21 und 35 wurde aus jeder Gruppe jeweils eine Wunde biopsiert. 0,8g Wundgewebe von den Biopsien bis Tag 10 wurden mit einem Triton-X-PBS Puffer homogenisiert. Die Homogenisate wurden zentrifugiert und die EGF Konzentration der Überstände mit Hilfe eines anti-human-EGF ELISA ausgewertet. Weiterhin wurden die Biopsien histologisch ausgewertet.On day 1, 3, 5, 7, 10, 21 and 35, one wound was biopsied from each group. 0.8g of wound tissue from the biopsies up to day 10 were homogenized with a Triton-X-PBS buffer. The homogenates were centrifuged and the EGF concentration of the supernatants was evaluated using an anti-human EGF ELISA. The biopsies were also evaluated histologically.

ErgebnisseResults

Tabelle V zeigt EGF-Konzentrationswerte in von jeweils einer Wunde der Gruppen. Tabelle V EGF-Gewebekonzentrationen in pg / ml im GroBtierversuchTable V shows EGF concentration values in one wound each of the groups. Table V EGF tissue concentrations in pg / ml in the large animal experiment

Claims

claims

1) A composition for the treatment of wounds which comprises fibroblasts which contain at least one foreign gene coding for a cytokine which promotes wound healing and which comprises at least one further component which promotes wound healing.

2) Composition according to claim 1, characterized in that the component promoting wound healing is a fibrin glue.

3) Composition according to claim 2, characterized in that the fibrin glue comprises fibrinogen and fibronectin as well as given all albumin, factor XIII and plasminogen.

4) Composition according to claim 1, characterized in that the further component promoting wound healing is a solid component which serves as a carrier matrix.

5) Composition according to claim 4, characterized in that the solid component is a carrier matrix consisting of a hyaluronic acid ester.

6) Composition according to one of the preceding claims, characterized in that it also comprises keratinocytes.

7) Composition according to one of the preceding claims, characterized in that the gene coding for the cytokine is selected from the group comprising the gene coding for the transforming growth factor α (TGF-α), the gene coding for the epidermal growth factor (EGF ), the gene coding for the basic fibroblast growth factor (b-FGF), the gene coding for the nerve growth factor (NGF) and the gene coding for the keratinocyte growth factor (KGF). 8) Composition according to one of the preceding claims, characterized in that the fibroblasts comprises at least one further foreign gene coding for a cytokine which acts on blood cells.

9) Composition according to one of the preceding claims, characterized in that the gene coding for the cytokine was introduced into the fibroblasts with the aid of a plasmid vector.

10) Composition according to claim 9, characterized in that the plasmid vector has an in-frame reading of the gene coding for the mature cytokine and a secretory signal sequence.

11) Composition according to claim 10, characterized in that the secretory signal sequence is that of the human G-CSF gene.

12) Composition according to one of the preceding claims, characterized in that it is autologous fibroblasts.

13) Composition according to one of claims 1 to 11, characterized in that it is allogeneic fibroblasts.

14) Composition according to one of the preceding claims, characterized in that the fibroblasts have been irradiated.

15) Composition according to one of the preceding claims, characterized in that it is clonally selected fibroblasts.

16) Composition according to one of claims 13 to 15, characterized in that the allogeneic fibroblasts are fibroblasts of the KMST-6 cell line. 17) Use of fibroblasts containing at least one foreign gene coding for a cytokine which promotes wound healing for the manufacture of a medicament for the treatment of wounds.

18) Use according to claim 17, characterized in that the foreign gene is selected from the genes coding for the epidermal growth factor (EGF), the transforming

Growth factor α (TGF-α), the nerve growth factor, the basic fibroblast growth factor (b-FGF) and the keratinocyte growth factor (KGF).