WO1998047518A9 - Verwendung von cholesterinsenkenden mitteln zur beeinflussing von signaltransduktionsvorgängen an der zellmembran, in die prophylaxe oder behandlung von prion-assorzierte- oder alzheimerische krankheit - Google Patents
Verwendung von cholesterinsenkenden mitteln zur beeinflussing von signaltransduktionsvorgängen an der zellmembran, in die prophylaxe oder behandlung von prion-assorzierte- oder alzheimerische krankheitInfo
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Definitions
- the present invention relates to the use of cholesterol-lowering agents for the prophylaxis or treatment of diseases which are associated with a change in the conformation of prions or of Alzheimer's disease.
- lipids mainly lies in their ability to serve as solvents for proteins (Singer & Nicolson, Science 1 75 (1 972), 720-731). However, this is certainly not their only role.
- the different types of lipids are not only arranged in a fluid double layer, but are also asymmetrically distributed over the exoplasmic and cytoplasmic membrane areas (Bretscher and Raff, Nature 258 (1 975), 43-49; Roelofsen & Op den Kamp, Plasma Membrane Phospholipid Asymmetry and its Maintenance: The Human Erythrocyte as a Model 1-7-46 (1,994)).
- lipids are also organized in a certain way and thus perform more regulatory tasks than previously known (Glaser, Curr. Op. Struct. Biol. 3 (1 993), 475-481, Thomas et al., J. Cell Biol. 1 25 (1 994), 1 95-802, Kusumi & Sako, Curr. Opin. Cell Bio. 8 (1 996), 566-574). It has now been shown that a lateral organization of lipids results from the connection of sphingolipids and cholesterol to moving clods or rafts, to which proteins can specifically attach themselves within the double layer. The existence of such sphingolipid-cholesterol rafts leads to a fundamentally different assessment of the membrane organization and allows new insights into the function of cell membranes.
- Sphingolipid head groups which occupy larger areas of the plane of the exoplasmic part of the membrane than the carbon chains of the hydrogen Lipids in the membrane layer, creating gaps that are filled by cholesterol molecules that act as spacers, so to speak (FIG. 1B).
- a close connection of these sphingolipid cholesterol clusters on the exoplasmic part of the membrane allows them to function as an overall arrangement within the membrane double layer.
- the sphingolipids normally have a long fatty acid (C 20 -C 26 ) attached to the sphingosine base via an amide bond, which due to the length of the fatty acid connects it to the cytoplasmic part of the double layer of the membrane can kick.
- the object of the present invention was therefore to provide a possibility of being able to have a positive effect on diseases such as Alzheimer's disease or other diseases in which a change in proteins on sphingolipid-cholesterol rafts takes place.
- this object is achieved by the use of cholesterol-lowering agents for the prophylaxis or treatment of diseases which are based on a change in the conformation of prions, or of
- cholesterol-lowering agent As a cholesterol-lowering agent, all agents can are used, which lower the cholesterol content in the blood and can be used for this purpose for the prophylaxis of other diseases, especially arteriosclerosis and heart attack.
- cholesterol-lowering agents include the active ingredient lovastatin (Mevinacor, mevinolin, Monacolin-K, MK-803), as well as further medicaments for hypercholesterolemia, such as pravastatin sodium, simvastatin, bezafibrate, clofibrate, etofyllinclofibrate, xenofibrate, gemfibrozyl, etipololate, etofolibrate, etofolibrate HCI, colestyramine, xantinol nicotinate, icositol nicotinate, probucol and the like.
- Lovastatin inhibits cholesterol biosynthesis based on mevalonic acid. It is already used as a medicine for hypercholesterolemia, where it is administered in doses of up to 20 mg / day.
- the dosages of cholesterol-lowering agents according to the invention are known or can be easily determined by a person skilled in the art.
- Another possible way to lower cholesterol is to influence the regulation of cholesterol metabolism.
- the distribution of cholesterol on sphingoiipid cholesterol rafts is much higher than its distribution in areas where there are no rafts. In the endoplasmic reticulum, where the cellular cholesterol content is perceived and regulated, there are practically none. Rafts. Sphingoiipid cholesterol rafts do not flow back from the Golgi apparatus to the endoplasmic reticulum. Lowering cholesterol initially affects cholesterol not found in rafts, which means that less cholesterol flows back into the endoplasmic reticulum. For example, by reducing the sphingolipid content, it would then be possible to simultaneously lower the cholesterol synthesis in the cell, since more cholesterol can flow back into the endoplasmic reticulum. This can be done, for example, by sphingolipid synthesis inhibitors.
- the scrapie prion protein PrP sc is the only known component of a transferable prion. It is derived from a protein PrP c which is normally anchored to glycosylphosphatidylinositol (GPI) and which is expressed in neurons, the prion protein PrP sc being formed by a change in the conformation of PrP °, which is protease-resistant. This conformational change probably takes place on sphingolipid-cholesterol rafts. The conformational change appears to be dependent on the GPI anchorage, since chimeric proteins that contain their own transmembrane domain are not subject to the conformational change.
- GPI glycosylphosphatidylinositol
- PrP c is insoluble in Triton X-100 at 4 ° C during the conformational change, and depletion of cellular cholesterol prevents the formation of PrP sc .
- PrP ° can be introduced into the cell through clathrin-coated vesicles using endocytosis, presumably due to binding to a previously unknown transmembrane protein with a so-called coated pit signal. This bond may keep PrP c away from the rafts where the as yet unexplained PrP c -PrP sc transformation appears to take place.
- Aß amyloid y ⁇ peptide
- APP amyloid precursor protein
- the split from APP to Aß happens in two steps. First, a so-called ⁇ -cleavage generates a fragment of 10 kDa from APP, which is then cleaved again within the transmembrane domain (y-cleavage), resulting in Aß. Like PrP c , part of the APP is insoluble in Triton X-1 00 neurons, a property that also has GPI-anchored and transmembrane proteins that bind to sphingolipid rafts. Exactly where A /?
- Peptide is located in the APP molecule exactly where it can be expected if one assumes that this region binds to a glycosphingolipid.
- Another interesting connection to the sphingolipid cholesterol rafts is the recent discovery that Aß binds to the glycanation end-product receptor (Yan et al., Nature 382 (1 996), 685-691), which were found to associate them with DIGs and caveoles in endothelial cells (Lisanti et al., Developm. Biol. 6 (1 995), 47-58).
- cholesterol-lowering agents has a positive effect on the abovementioned diseases. This may be due to a reduction in the number of rafts in the plasma membranes and thus a reduction in the number of possible anchor points at which a conformational change in proteins then takes place.
- cholesterol-lowering agents have a positive effect on Alzheimer's disease or diseases, such as Creutzfeld-Jacob Illness, which affects, is the first time that a treatment option has emerged that attacks the cause of the disease.
- sphingolipid-cholesterol rafts results in sub-compartmentalization on the cell membrane, which leads to the formation of different structures, i.e. rafts of different sizes, and 15 spaces without a raft structure.
- T-cell receptor signaling processes are immunoglobulin E signaling processes in allergic reactions, T-cell receptor signaling processes, LPS-endotoxin signaling processes, signaling processes of endothelial NO synthase, signaling processes by tyrosine kinases, such as Lyn and Fyn, which are doubly aylated and transimeric G- Proteins that contain doubly aylated subunits and transmit signals via GPI-anchored proteins.
- tyrosine kinases such as Lyn and Fyn
- Another object of the present invention is therefore the use of cholesterol-lowering agents for influencing signal transduction processes on the cell membrane.
- FIG. 1 shows a cell membrane in cross section.
- A shows a section with
- B shows an enlargement of a sphingolipid-cholesterol raft.
- Fig.2 shows that the removal of cholesterol reduces production
- Lovastatin / Mevalonat were cultivated. Cyclodextrin was added for 0, 5 and 20 min (0, 20, 5). b shows an immunoprecipitation assay similar to a, with CD cholesterol added for the indicated time in minutes (0 and 15, respectively), c shows the relative A? secretion in cells in which the cholesterol was produced by lovastatin and cyclodextrin was removed or added again, in comparison with untreated control cells (mean from 3-1 1 experiments). The digits next to cyclodextrin and CD cholesterol indicate the time in minutes.
- Figure 3 shows that cholesterol removal reduces APP attachment to DIGs. Neurons were extracted according to Example 2 and centrifuged through an OptiPrep gradient, after which larger molecules and complexes (A? -DIG) are more at the upper end of the test tube (above) and uncomplexed, smaller ones
- - Depletion or + Depletion refers to the cholesterol that has been removed (+) or not removed (-) as described above.
- the neurons were then infected for 1 hour at 37 ° C. and 5% CO 2 with recombinant SFV, which codes for the human APP 695 protein, as is already known from the prior art.
- the cells were incubated in Lovastatin / Mevalonate for 2 hours and then incubated for 5-20 min with 5 mM methyl /? - cyclodextrin (Sigma) in a methionine-free labeling medium (MEM with 1/10 N2 addition).
- MEM methionine-free labeling medium
- the cells were labeled with 1 50 ⁇ C ⁇ [ 35 S] methionine for 2.5 hours.
- Lovastatin inhibits cholesterol biosynthesis in the presence of small amounts of mevalonate.
- MethylJ? -Cyclodextrin specifically removes cellular cholesterol.
- the culture medium was collected and cell extracts were prepared (2% NP-40, 0.2% SDS, 5 mM EDTA, with protease inhibitors as an additive).
- the immunoprecipitates were on A-Sepharose
- Extracts of neuronal cells were prepared as in Example 1, except that they were pulse-labeled for 20 minutes and then chased in normal medium for 100 minutes. The cells were then kept on ice for 30 min with 1% Triton X-100 in TEX (1 50 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.4, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 25 ⁇ g / ml each from chymostatin, leupeptin , Antipain, Pepstatin A) extracted. The extracts were then mixed with an equivalent amount of OptiPrep (Nycomed) and overlaid in TEX with a gradual gradient of 30%, 25% and 3% OptiPrep. The samples were then centrifuged at 4 ° C.
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Abstract
Zur Prophylaxe oder Behandlung von Krankheiten, die auf einer Konformationsänderung von Prionen beruhen, und von Alzheimer'scher Krankheit werden im Rahmen der Erfindung cholesterinsenkende Mittel ebenso eingesetzt wie zur Beeinflussung von Signaltransduktionsvorgängen an der Zellmembran.
Description
VERWENDUNG VON CHOLESTERINSENKENDEN MITTELN ZUR BEEINFLUSSING VON SIGNALTRANS- DUKΗONSVORGÄNGEN AN DER ZELLMEMBRAN, IN DIE PROPHYLAXE ODER BEHANDLUNG VON PRION-ASSORZIERTE- ODER ALZHEIMERISCHE KRANKHEIT
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von cholesterinsenkenden Mitteln zur Prophylaxe oder Behandlung von Erkrankungen, die mit einer Konformationsänderung von Prionen einhergehen, oder von Alzheimer'scher Krankheit.
Für die meisten Molekularbiologen, die sich mit Membranproteinen beschäftigen, liegt die Funktion von Lipiden hauptsächlich in ihrer Eigenschaft, als Solvens für Proteine zu dienen (Singer & Nicolson, Science 1 75 ( 1 972), 720-731 ) . Dies ist jedoch sicher nicht ihre einzige Rolle. Die verschiedenen Lipidarten sind nicht nur in einer fluiden Doppelschicht angeordnet, sondern sie sind auch über die exoplasmatischen und cytoplasmatischen Membranbereiche asymmetrisch verteilt (Bretscher und Raff, Nature 258 ( 1 975), 43-49; Roelofsen & Op den Kamp, Plasma Membrane Phospholipid Asymmetry and its Maintenance: The Human Erythrocyte as a Model 1 -7-46 ( 1 994)) . Außerdem hat man festgestellt, dass die Lipide auch in bestimmter Weise organisiert sind und damit mehr Regulierungsaufgaben erfüllen als bisher bekannt (Glaser, Curr. Op. Struct. Biol. 3 ( 1 993), 475-481 , Thomas et al., J. Cell Biol. 1 25 ( 1 994), 1 95-802, Kusumi & Sako, Curr. Opin. Cell Bio. 8 ( 1 996) , 566-574) . Es hat sich nun gezeigt, dass eine laterale Organisation von Lipiden entsteht durch Verbindung von Sphingolipiden und Cholesterin zu sich bewegenden Schollen oder Flößen, an welche sich Proteine innerhalb der Doppelschicht spezifisch anlagern können. Die Existenz solcher Sphingolipid-Cholesterin-Flöße führt zu einer grundsätzlich anderen Beurteilung der Membranorganisation und erlaubt neue Einblicke in die Funktion von Zellmembranen.
Auf Basis von Untersuchungen zu solchen Sphingolipid-Cholesterin-Flößen sind die in Figur 1 B gezeigten Modelle entstanden. Man geht davon aus, dass die
Sphingolipidkopfgruppen, welche größere Bereiche der Ebene des exoplasmatischen Teils der Membran belegen als die Kohlen Wasserstoff ketten der
Lipide in der Membranschicht, Zwischenräume entstehen lassen, die durch Cholesterinmoleküle gefüllt werden, die sozusagen als Abstandhalter fungieren (Figur 1 B) . Eine dichte Aneinanderfügung dieser Sphingolipid-Cholesterinklaster auf dem exoplasmatischen Teil der Membran lässt sie als Gesamtanordnung innerhalb der Membrandoppelschicht fungieren. Es ist dabei wichtig, festzustellen, dass die Sphingolipide normalerweise eine lange Fettsäure (C20-C26) aufweisen, die über eine Amidbindung an die Sphingosinbasis angeheftet ist, wobei aufgrund der Länge der Fettsäure diese mit dem cytoplasmatischen Teil der Doppelschicht der Membran in Verbindung treten kann. Da Cholesterin in beiden Membranschichten vorhanden ist, ist es auch möglich, dass das Molekül als Spacer im cytoplasmatischen Teil der Membran fungiert und dabei Zwischenräume ausfüllt zwischen dort vorhandenen Fettsäuren (Figur 1 B) . Die neuen Erkenntnisse über die Organisation von Sphingolipiden und Cholesterin in der Zellmembran führten nun zu der Erkenntnis, dass hierin auch eine Grundlage liegen könnte für die Behandlung oder Verhinderung von Krankheiten, welche mit einer Konformationsänderung von Prionproteinen einhergehen, oder aber der Alzheimer'schen Krankheit. Derartige Krankheiten sind bisher noch nicht behandelbar, meist ist auch ihre Erkennung sehr schwierig, eine letztendliche Sicherheit kann meist nur durch Autopsie nach dem Tode des Patienten erhalten werden. Insofern besteht ein dringendes Bedürfnis an einer Möglichkeit, derartige Krankheiten, zumindest im Verdachtsfall, zu behandeln oder ihre Entstehung zu verhindern.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, eine Möglichkeit bereitzustellen, auf Krankheiten wie die Alzheimer'sche Krankheit oder andere Krankheiten, bei welchen eine Veränderung von Proteinen an Sphingolipid- Cholesterin-Flößen stattfindet, positiv einwirken zu können.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch die Verwendung von cholesterinsenkenden Mitteln zur Prophylaxe oder Behandlung von Erkrankungen, die auf einer Konformationsänderung von Prionen beruhen, oder von
Alzheimer'scher Krankheit. Als cholesterinsenkende Mittel können alle Mittel
verwendet werden, welche den Cholesteringehalt im Blut senken und zu diesem Zweck zur Prophylaxe anderer Erkrankungen, vor allem der Arteriosklerose und des Herzinfarkts eingesetzt werden oder werden können. Beispiele von cholesterinsenkenden Mitteln umfassen den Wirkstoff Lovastatin (Mevinacor, Mevinolin, Monacolin-K, MK-803), sowie weitere Arzneimittel gegen Hypercholesterinämie, wie etwa Pravastatin-Natrium, Simvastatin, Bezafibrat, Clofibrat, Etofyllinclofibrat, Xenofibrat, Gemfibrozyl, Etofibrat, Colestipol-HCI, Colestyramin, Xantinolnicotinat, Icositolnicotinat, Probucol und dergleichen. Lovastatin hemmt die Cholesterinbiosynthese auf der Basis der Mevalonsäure. Es wird bereits als Arzneimittel bei Hypercholesterinämie verwendet, wo es in Dosen von bis zu 20 mg/Tag verabreicht wird. Die erfindungsgemäßen Dosierungen von cholesterinsenkenden Mitteln sind bekannt oder können vom Fachmann leicht ermittelt werden.
Eine weitere mögliche Art und Weise zur Senkung des Cholesteringehalts ist, auf die Regulierung des Cholesterinmetabolismus Einfluß zu nehmen. Die Verteilung von Cholesterin auf Sphingoiipid-Cholesterinflöße ist viel höher als dessen Verteilung auf Gebiete, in denen sich keine Flöße befinden. Im endoplasmatischen Retikulum, wo der zelluläre Cholesteringehalt wahrgenommen und reguliert wird, gibt es praktisch keine. Flöße. Sphingoiipid-Cholesterinflöße fließen vom Golgi- Apparat nicht zum endoplasmatischen Retikulum zurück. Das Senken des Cholesteringehalts beeinflußt zunächst das nicht in Flößen enthaltene Cholesterin, was dazu führt, daß weniger Cholesterin in das endoplasmatische Retikulum zurückfließt. Indem beispielsweise der Sphingolipidgehalt reduziert wird, wäre es dann möglich, gleichzeitig die Cholesterinsynthese in der Zelle zu senken, da mehr Cholesterin in das endoplasmatische Retikulum zurückfließen kann. Dies kann beispielsweise durch Sphingolipidsynthese-Inhibitoren geschehen.
Als Krankheiten, die auf einer Konformationsänderung von Prionproteinen beruhen, wird derzeit vor allem die beim Schaf auftretende Krankheit Scrapie angesehen. Auch für die BSE-Problematik könnte die vorliegende Erfindung von
Bedeutung sein, wenn sich erhärtet, dass der auslösende Faktor für die letztendlich zum Tode führende Krankheit ebenfalls die Konformationsänderung von Prionproteinen ist und diese Erkrankung der Rinder auf den Menschen übertragbar ist. Somit wäre auch die Behandlung der Creutzfeld-Jacob-Krankheit ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Das Scrapie-Prionenprotein PrPsc ist die bisher einzige bekannte Komponente eines übertragbaren Prions. Es ist abgeleitet von einem normalerweise an Glycosylphosphatidylinositol (GPI) verankerten Protein PrPc, das in Neuronen exprimiert wird, wobei durch eine Konformationsänderung des PrP° das Prionprotein PrPsc entsteht, welches proteaseresistent ist. Vermutlich findet diese Konformationsänderung an Sphingolipid-Cholesterin-Flößen statt. Die Konformationsänderung scheint abhängig zu sein von der GPI-Verankerung, da chimäre Proteine, die eine eigene Transmembrandomäne enthalten, nicht der Konformationsänderung unterliegen. PrPc ist unlöslich in Triton X-1 00 bei 4°C während der Konformationsänderung, und eine Verarmung an zellulärem Cholesterin verhindert die Bildung von PrPsc. Interessanterweise kann PrP° durch clathrinbeschichtete Vesikel mittels Endocytose in die Zelle eingeschleust werden, vermutlich aufgrund von Bindung an ein bisher unbekanntes Transmembranprotein mit einem sogenannten coated pit-Signal. Diese Bindung hält PrPc möglicherweise von den Flößen entfernt, wo die bisher noch ungeklärte PrPc-PrPsc-Transformation stattzufinden scheint.
Eines der wichtigen Merkmale der Pathogenese der Alzheimer'schen Krankheit ist die fortschreitende zerebrale Anhäufung des Amyloid-yδ-Peptids (Aß), einem proteolytischen Spaltprodukt aus einem Amyloidvorläuferprotein (APP) . Neu synthetisiertes APP wird in den Neuronen in die Axone geleitet und dann durch Transzytose an die Dendriten weitergeführt. APP wird während des intrazellulären Transports einer Reihe von Spaltungen unterzogen, wobei entweder das amyloide Fragment Aß oder eine nicht amyloide, sekretierte Form APPsec (secreted) freigesetzt wird. Bei der Spaltung zu APPsec durch σ-Sekretase (σ-Spaltung) verbleibt ein Transmembranfragment von 8 kDa in der Zellmembran. Die Spaltung
von APP zu Aß geschieht in zwei Schritten. Zunächst wird durch die sog. ß- Spaltung ein Fragment von 1 0 kDa von APP erzeugt, welches dann innerhalb der Transmembrandomäne noch einmal gespalten wird (y-Spaltung), wobei Aß entsteht. Wie PrPc ist auch ein Teil des APP in Neuronen in Triton X-1 00 unlöslich, eine Eigenschaft, die auch GPI-verankerte und Transmembranproteine aufweisen, welche an Sphingolipid-Flöße binden. Wo genau die A/?-Produktion stattfindet, ist nicht klar, jedoch weisen kürzlich erhaltene Resultate darauf hin, dass Aß komplexiert an ein Lipid in Sphingolipid-Cholesterin-Flößen, das GM 1 - Gangliosid, vorgefunden wird in den frühesten Krankheitsmanifestationen im Gehirn. Interessanterweise wird ein kleinerTeil APP auch in detergensunlöεlichen, glycolipidangereicherten Komplexen, sogenannten DIGs (Brown & Rose, J. Cell 68 ( 1 992), 533-544; Parton & Simons, Science 269 ( 1 995), 1 398-1 399) aufgefunden. Möglicherweise wird APP durch die Bindung an GM 1 an die Flöße fixiert und die Proteolyse könnte möglicherweise in den Sphingolipid-Cholesterin- Mikrodomänen stattfinden, wobei Aß entsteht, das an GM 1 gebunden ist. Das A/?-Peptid ist im APP-Molekül genau dort lokalisiert, wo es auch zu erwarten ist, wenn man davon ausgeht, dass diese Region an ein Glycosphingolipid bindet. Eine weitere interessante Verbindung zu den Sphingolipid-Cholesterin-Flößen ist die kürzlich erhaltene Erkenntnis, dass Aß an den Rezeptor für Glycani ierungsendprodukte bindet (Yan et al. , Nature 382 ( 1 996), 685-691 ), von denen festgestellt wurde, dass sie mit DIGs und Caveolen in Endothelzellen assoziieren (Lisanti et al., Developm. Biol. 6 ( 1 995), 47-58) .
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass die Verwendung cholesterinsenkender Mittel einen positiven Effekt auf die obengenannten Krankheiten ausübt. Dies beruht möglicherweise auf einer Verringerung der Zahl der Flöße in den Plasmamembranen und damit einer Verringerung der Anzahl an möglichen Ankerpunkten, an denen dann eine Konformationsänderung von Proteinen stattfindet.
Die erfindungsgemäße Erkenntnis, dass cholesterinsenkende Mittel sich positiv auf die Alzheimer'sche Krankheit oder Krankheiten, wie z.B. Creutzfeld-Jacob-
Krankheit, auswirkt, lässt erstmals eine Behandlungsmöglichkeit entstehen, die an der Ursache der Krankheit angreift.
Des Weiteren erscheint durch die erfindungsgemäße Verwendung 5 cholesterinsenkender Mittel auch allgemein eine Einflussnahme auf Signaltransduktionsvorgänge von außen in Zellen möglich. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass zahlreiche Proteine, die in Sphingolipid-Cholesterin-Flößen enthalten sind, in der Signaltransduktion eine wichtige Rolle spielen (Parton & Simons, Science 269 (1995), 1398-1399; Anderson, Proc. Natrl. Acad. Sei. USA 10 90 (1993), 10909-10913; Lisanti et al., Trends Cell Biol.4 (1994), 231-235).
Durch die Entstehung von Sphingolipid-Cholesterin-Flößen wird auf der Zellmembran eine Subkompartimentierung bewirkt, die dazu führt, dass unterschiedliche Strukturen entstehen, also Flöße verschiedener Größe, und 15 Zwischenräume ohne Floßstruktur.
Ohne Cholesterin ist die Floßbildung nicht möglich und insofern sind also viele Signaltransduktionsvorgänge abhängig von der Anwesenheit von Cholesterin. Beispielhaft für solche Vorgänge können genannt werden: Signaltransduktion
20 über Heterotrimere G Proteine (Li et al., J. Biol. Chem. 270 (1995), 15693- 15701 ), Ras (Song et al., J. Biol. Chem.271 (1996), 9690-9697; Mineo et al., J. Biol. Chem.217 (1996), 11930-11935) und Ceramide (Liu & Anderson, J. Biol. Chem. 270 (1995), 27179-27185). Beispiele für Signaltransduktionsprozesse, in denen Flöße als Plattformen eine Rolle spielen,
25 sind Immunoglobulin-E-Signalprozesse in allergischen Reaktionen, T-Zell-Rezeptor- Signalprozesse, LPS-Endotoxin-Signalprozesse, Signalprozesse der endothelischen NO-Synthase, Signalprozesse durch Tyrosinkinasen, wie etwa Lyn und Fyn, welche doppelt aeyliert sind und übertrimerische G-Proteine, die doppelt aeylierte Untereinheiten enthalten, sowie über GPI-verankerte Proteine Signale übertragen.
30
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung cholesterinsenkender Mittel zur Beeinflussung von Signaltransduktionsvorgängen an der Zellmembran.
Figurenbeschreibung
Fig.1 zeigt eine Zellmembran im Querschnitt. A zeigt einen Ausschnitt mit
Flößen, die mittels ihrer GPI-Anker an die exoplasmatische Schicht der Membran gebundene Proteine enthalten. B zeigt eine Vergrößerung eines Sphingolipid-Cholesterin-Floßes.
Fig.2 zeigt, dass das Entfernen von Cholesterin die Produktion und die
Sekretion von Aß hemmt, a zeigt einen Immunopräzipitations-Assay von Neuronen aus dem Hippokampus, welche für 4 Tage entweder in Gegenwart von ( + ) oder in Abwesenheit von (-)
Lovastatin/Mevalonat kultiviert wurden. Cyclodextrin wurde für 0 bzw. 5 bzw. 20 Min zugegeben (0, 20, 5) . b zeigt einen ähnlichen Immunopräzipitations-Assay wie a, wobei hier CD-Cholesterin für die angegebene Zeit in Min (0 bzw. 1 5) hinzugegeben wurde, c zeigt die relative A ?-Sekretion in Zellen, in denen das Cholesterin durch Lovastatin und Cyclodextrin entfernt bzw. wieder hinzugegeben wurde, im Vergleich mit unbehandelten Kontrollzellen (Mittel aus 3-1 1 Experimenten) . Die Ziffern neben Cyclodextrin und CD-Cholesterin geben die Zeit der Zugabe in Minuten an.
Fig.3 zeigt, dass das Entfernen von Cholesterin die Anlagerung von APP an DIGs reduziert. Neuronen wurden gemäß Beispiel 2 extrahiert und durch einen OptiPrep-Gradienten zentrifugiert, wonach größere Moleküle und Komplexe (A ?-DIG) sich mehr am oberen Ende des Teströhrchens befinden (oben) und nicht komplexierte, kleinere
Moleküle (Aß) nach unten wandern (unten) . - Depletion bzw. +
Depletion beziehen sich auf das Cholesterin, das, wie oben beschrieben, entfernt wurde ( + ) oder nicht entfernt wurde (-) .
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, wobei die Mengenangaben und andere Einzelheiten beispielhaft und nicht erschöpfend zu verstehen sind.
Beispiele
Beispiel 1
Primäre Zellkulturen von Neuronen aus dem Hippokampus der Ratte wurden plattiert und nach herkömmlichen Verfahren kultiviert (minimales essentielles Medium (MEM) mit 1 0% Pferdeserum, 5% C02, 36,5°C) . Die Zugabe von 5 mM Cytosinarabinose verhinderte die Vermehrung von nicht neuronalen Zellen. Nach 5-7 Tagen wurden 4 μM Lovastatin und 0,25 mM Mevalonat für 4 Tage hinzugegeben.
Die Neuronen wurden dann für 1 Std bei 37 °C und 5% C02 mit rekombinantem SFV infiziert, welcher für das menschliche APP 695-Protein kodiert, wie bereits aus dem Stand der Technik bekannt. Die Zellen wurden für 2 Std in Lovastatin/Mevalonat inkubiert und anschließend für 5-20 Min mit 5 mM Methyl- /?-Cyclodextrin (Sigma) in einem Methionin-freien Markierungsmedium inkubiert (MEM mit 1 /1 0 N2-Zusatz) . Die Zellen wurden für 2,5 Std mit 1 50 μC\ [35S]- Methionin markiert. Lovastatin hemmt bei Vorhandensein von geringen Mengen Mevalonat die Cholesterinbiosynthese. MethylJ?-Cyclodextrin entfernt speziell zelluläres Cholesterin.
Nach der metabolischen Markierung wurde das Kulturmedium gesammelt und Zellextrakte hergestellt (2% NP-40, 0,2% SDS, 5 mM EDTA, mit Protease- inhibitoren als Zusatz) . Die Immunopräzipitate wurden auf A-Sepharose
(Boehringer) rückgewonnen und auf 1 0-20%-igen Tris-Tricin-Polyacrylamidgelen
analysiert (Novex) . Die Radioaktivität wurde anhand eines Phosphorlmagers (Molecular Dynamics) bestimmt. Die verwendeten Antikörper waren Fd-APP gegen APP 695, B1 2/4 gegen die 20C-terminalen Aminosäuren von APP und B7/6 gegen die Aminosäuren 1 -1 6 des synthetischen humanen A/?-Peptids 1 -40. Fig.2 zeigt die Ergebnisse solcher Immunopräzipitations-Assays. In a wurden Zellen analysiert, die mit oder ohne Lovastatin kultiviert worden waren ("-" bzw. " + ") sowie mit Cyclodextrin für 0 bzw. 20 bzw. 5 Min. Die sichtbaren Banden entsprechen Aß. Hierdurch wird deutlich gezeigt, dass die Sekretion von Aß durch das Entfernen von Cholesterin, was durch die Zugabe von Lovastatin und Cyclodextrin bewirkt wird, reduziert werden kann. Zu einigen Zellen wurde Cholesterin wieder hinzugegeben (CD-Cholesterin). b zeigt einen ähnlichen Immunopräzipitations-Assay, bei dem jedoch zu den Zellen, die in den beiden rechten Bahnen dargestellt sind, Cholesterin wieder hinzugegeben wurde. Dort sind auch die A/?-Banden sichtbar. Das Diagramm c zeigt die relative A ?-Sekretion unter verschiedenen experimentellen Bedingungen, die oben bereits beschrieben wurden.
Beispiel 2
Extrakte von neuronalen Zellen wurden wie in Beispiel 1 hergestellt, bis auf die Tatsache, dass sie für 20 Min pulsmarkiert wurden und dann für 100 Min in normalem Medium gechased wurden. Anschließend wurden die Zellen für 30 Min auf Eis mit 1 % Triton X-1 00 in TEX ( 1 50 mM NaCI, 50 mM Tris pH 7,4, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 25 μg/ml jeweils von Chymostatin, Leupeptin, Antipain, Pepstatin A) extrahiert. Die Extrakte wurden dann mit einer äquivalenten Menge OptiPrep (Nycomed) vermischt und mit einem schrittweisen Gradienten von 30%, 25% und 3% OptiPrep in TEX überlagert. Danach wurden die Proben 3 Std bei 4°C und 50,000 U/Min zentrifugiert, die Fraktionen wurden gesammelt und immunopräzipitiert. Das Ergebnis ist in Fig.3 dargestellt. Unter "- Depletion" sind Kontrollzellen dargestellt, in denen Cholesterin nicht entfernt wurde, während die Zellen von " + Depletion" mit Lovastatin/Cyclodextrin behandelt worden waren, um Cholesterin-Depletion zu erzielen, "oben" bezeichnet den oberen Teil des
Teströhrchens, "unten" bezeichnet den unteren Teil des Teströhrchens. Bei dieser Art von Gradient wandern Komplexe und größere Moleküle, wie etwa Aß-D\G nicht bis zum Boden des Röhrchens, finden sich also mehr in den Bahnen, die mit "oben" überschrieben sind, während die nicht mit DIGs assoziierten A ?-Moleküle nach unten wandern. Dieses Experiment zeigt also deutlich, dass in Zellen, die mit cholesterindepletierenden Mitteln behandelt worden waren, eine A ?-DIG- Assoziierung reduziert wird.
Claims
1 . Verwendung von cholesterinsenkenden Mitteln zur Prophylaxe oder Behandlung von Erkrankungen, die auf einer Konformationsänderung von
Prionen beruhen, und von Alzheimer'scher Krankheit.
2. Verwendung von cholesterinsenkenden Mitteln zur Beeinflussung von Signaltransduktionsvorgängen an der Zellmembran.
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