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WO1998042843A1 - SONDES POUR LE DIAGNOSTIC D'INFECTIONS DUES AU $i(KLEBSIELLA PNEUMONIAE) - Google Patents

SONDES POUR LE DIAGNOSTIC D'INFECTIONS DUES AU $i(KLEBSIELLA PNEUMONIAE) Download PDF

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WO1998042843A1
WO1998042843A1 PCT/JP1998/001286 JP9801286W WO9842843A1 WO 1998042843 A1 WO1998042843 A1 WO 1998042843A1 JP 9801286 W JP9801286 W JP 9801286W WO 9842843 A1 WO9842843 A1 WO 9842843A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bacteria
dna
probe
probes
klebsiella
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1998/001286
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Ueyama
Kanako Abe
Hiroyuki Keshi
Akio Matsuhisa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Original Assignee
Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fuso Pharmaceutical Industries Ltd filed Critical Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Priority to US09/402,002 priority Critical patent/US6225453B1/en
Priority to DK98909854T priority patent/DK0972833T3/da
Priority to EP98909854A priority patent/EP0972833B1/en
Priority to CA002284858A priority patent/CA2284858C/en
Priority to DE69821341T priority patent/DE69821341T2/de
Priority to KR1019997008734A priority patent/KR100343105B1/ko
Priority to AT98909854T priority patent/ATE258600T1/de
Priority to AU64229/98A priority patent/AU716947B2/en
Publication of WO1998042843A1 publication Critical patent/WO1998042843A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a probe useful for the detection and identification of Klebsiella pneumoniae, which is a causative bacterium of infectious disease, particularly a representative causative bacterium of sepsis, and which is a causative bacterium of Klebsiella pneumonia.
  • infection refers to the invasion of a pathogenic microorganism (hereinafter referred to as the "bacteria”) into the organism to establish a foothold for growth.
  • bacteria pathogenic microorganism
  • it depends on the correlation between host resistance and fungal virulence.
  • infectious diseases Diseases caused by the infection of pathogenic microorganisms are collectively referred to as infectious diseases.
  • infectious diseases are those in which the phagocytosis of cells does not reach the reproductive power of the pathogenic bacteria and the bacteria spread in the systemic bloodstream. It is defined as a blood disease, in which pathogens are continuously or intermittently pumped into the blood from certain foci (infectious foci) in the body, causing new foci to spread to other parts of the body.
  • a condition that presents a severe systemic condition is called sepsis.
  • the underlying infection defense mechanism is reduced for the treatment of the underlying diseases and the diseases, the disease progresses to sepsis, shock, DIC (generalized intravascular coagulation syndrome), Complications such as ARDS (adult respiratory distress syndrome) often lead to death.
  • neutrophils when infected, neutrophils, monocytes and macrophage phagocytic cells play a primary role in living tissue, and the predominant bacteria become phagocytic tissue. It is thought that bacteria can appear in blood due to their infiltration into blood.
  • Klebsiella pneumonia is a pneumonia caused by Klebsiella pneumoniae, which causes viscous capsular substances to be produced in large quantities and causes the causative bacteria to acquire drug resistance.
  • the prognosis is poor and septic shock often results in death.
  • Bacteremia (including sepsis) is a condition in which bacteria infiltrate into the blood.
  • antibiotics sensitive to the causative bacteria are administered in large amounts.
  • antibiotics generally impair the function of organs such as the liver, and the administration of ineffective antimicrobial agents to patients at risk should be avoided as much as possible. Therefore, in clinical practice, rapid and reliable bacterial Identification is desired.
  • the basis of bacteremia (sepsis) treatment is to administer appropriate antibiotics early. To do so, it is first necessary to know the causative bacteria.
  • the blood of a patient suspected of having bacteremia is cultured by the culture and bottle method, and the specimen that shows a positive result in this test is cultured in a selective medium to cultivate the bacterial species. Is identified.
  • at least two types of culture bottles containing media for aerobic bacteria and anaerobic bacteria are required. If there is a risk of contamination by bacteria, etc., and if antibiotics are administered in large quantities at the time of suspected bacteremia, even if the sample contains bacteria, the bacteria will be increased. In many cases, they cannot grow, and in fact, the success rate of culturing bacteria from specimens is extremely low.
  • subroutine methods include instrumental analysis of bacterial components and metabolites of bacteria (Yoshimi Benno, "Accelerated identification of bacteria by gas chromatography," Clinical Laboratory, vol. 29, No. 12, pp. 1618-1623, November 1985, Medical School), a method using a specific antibody (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-224068), and a method using hybridization using the specificity of DNA.
  • Yoshimi Benno "Accelerated identification of bacteria by gas chromatography," Clinical Laboratory, vol. 29, No. 12, pp. 1618-1623, November 1985, Medical School
  • a method using a specific antibody see Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-224068
  • a method using hybridization using the specificity of DNA are required.
  • At least one to two days for selective separation of bacteria from the sample, one day for enrichment, one day or more for fixation, and a total of three to four days are sufficient as pretreatment operations.
  • this culture is actually continued until the bacteria grow, so that the pretreatment operation often requires one week or more, and even if bacteria other than the disease-causing bacteria are mixed during the culture of the bacteria. In some cases, they cannot be distinguished.
  • many of the bacteria in the specimens to be cultured are taken up by phagocytic cells and are either dead or quiescent due to antibiotics, making it possible for them to grow under culture conditions. The number is small, and the actual bacterial detection rate by cultivation using clinical specimens is very low, around 10%.
  • the present invention has been completed in view of the above-mentioned problems in the technical field, and the gist of the present invention is to provide bacteria that cause infectious diseases, in particular, Klebsiella numonie, a representative causative bacterium of sepsis. DNA or R possessed
  • An object of the present invention is to elucidate a probe having specific reactivity with NA and a base sequence of a gene portion essentially contained in Klebsiella pneumoniae contained in the probe.
  • the DNA of a bacterium that is still maintained in a bacterium that is being taken up and destroyed by a phagocyte by the probe of the present invention is significantly detected based on its specificity using a hybridization method.
  • the causative bacteria of the infectious disease can be detected quickly and reliably without culturing and growing the bacteria. If the primers are designed with reference to the nucleotide sequence information of these probes, the causative bacteria of the infectious disease can be identified by the amplification of DNA by the PCR method without performing hybridization.
  • the probe used for hybridization is non-radioactive, for example, if a probe that has been biotinylated is used, it can be detected using an optical microscope even in a general laboratory that does not have a facility using radioisotopes. It can be done easily.
  • Fig. 1 (a) is a diagram showing the arrangement of DNA strains in each file of dot 'blot' hybridization.
  • Fig. 1 (b) is a diagram showing the hybridization using each probe for color development.
  • FIG. 9 is a diagram showing the result after the [Best mode for carrying out the invention]
  • the clinical strain Klebsiella 'Pneumoniae was cultured overnight in a BHI (Brain Heart Infusion) medium, the cultured cells were collected, and N-Acetyl-muramidase SG was caloried in the lysis step.
  • Genomic DNA was extracted according to "Transforming deoxyribonucleic acid by phenol treatment", Biochem. Bio-phys. Acta vol. 72, pp. 619-629 (1963)).
  • the extracted DNA is completely digested with the restriction enzyme Hindlll and randomly cloned into the vector pGEM-3Z. Five types of blobs containing DNA fragments showing specific reactivity with were selected.
  • Table 1 Clinical isolates and deposited strains listed in Table 1 below were prepared as strains to be examined.
  • the sources of human genomic DNA and control samples in Table 1 were leukocytes collected from four healthy adult males.
  • Example i the DNA contained in each strain was extracted from each clinical strain, and a fixed amount of the extracted DNA (for example, 10 to
  • the human genomic DNA sample was prepared by applying the previously obtained leukocyte to the modified Saito-Miura method described above.
  • the Escherichia coli K-12, JM109 transformant containing the plasmid pGEM-3Z obtained previously is applied to the method for preparing plasmid DNA described in Example 2 (1) described below.
  • using a DNA probe derived from Klebsiella 'N. monnier, labeled with Digoxigenin-1 dUTP (manufactured by BRL), a manual of T. Maniatis, et al. Edition) ", Cold Spring Harbor Laboratory (1989) hybridization was performed overnight at 45% formamide, 5xSSC and 42 ° C.
  • FIG. Figure 1 shows the location of the DNA strains spotted on each of the files subjected to dot'blot hybridization and Fig. 1 (b) shows the KP- The results after hybridization and color development using 77-46, KP-85-43, KP-98-22, KP-98-33 and KP-110-32 are shown.
  • the hybridization signal is f l
  • the nucleotide sequences of the DNA probes (total of 5) whose species specificity was confirmed in Example 1 were determined according to the following method.
  • Escherichia coli K-12, JM109 transformants containing the subcloned insert (to be sequenced) in pGEM-3Z (Promega) were added to 5 ml of Luria-Bactani Medium (bacto-tryptone, 10 g / lL; bacto-yeast extract, 5 g / lL; NaCl, lOg / lL; adjusted to pH 7.0 with 5 N NaOH) and cultured overnight.
  • the culture was collected by centrifugation (5,000 rpm, 5 min.). 100 il of a 50 mM glucose / 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) / 10 mM EDTA solution containing lysozyme (Sigma) at a concentration of 2.5 mg / ml was added to the precipitate, and the mixture was left at room temperature for 5 minutes. A 0.2 M aqueous sodium hydroxide solution containing sodium dodecyl sulfate (Sigma) at a concentration of 1% was added to the obtained suspension and mixed. A 150M aqueous solution of 5M acetic acid solution (pH 4.8) was further added and mixed, followed by cooling on ice for 15 minutes.
  • Type III DNA 32 ⁇ 1 was transferred to a 1.5 ml minitube (Eppendorf), and 8 M 1 of a 2 M aqueous sodium hydroxide solution was added and mixed gently. After light centrifugation, the mixture was left at room temperature for 10 minutes.
  • the precipitate was dissolved in distilled water 10 ⁇ 1, Fluorescent primer one fluorescent Primer, Universal Primer; 5 5 -Fluoresce in-d [CGACGTTGTAAAACGACGGCC AGT ( SEQ ID NO: 6)] -3 '(LGprnol / zl; 0.42 . ⁇ 26 unit / ml); Reverse Primer, 5, -Fluorescein- d [CAGGAAACAGCTATGAC ( SEQ ID NO: 7)].
  • the solution was incubated at 37 ° C for 5 minutes, and the stop solution was added to each reaction solution.
  • the determination of the nucleotide sequence of each probe having specificity for the DNA possessed by Klebsiella 'Pneumoniae disclosed in Examples 1 and 2 was performed at an electrophoresis temperature of 45 ° C and an electrophoresis time of 6 hours, and the ALF DNA Sequencer system was used. This was performed using a system (Pharmacia). The primers were designed sequentially from the sequences identified from each upstream and downstream, and the above operation was repeated.
  • probe KP-77-46 SEQ ID NO: 1
  • probe KP-85-43 SEQ ID NO: 2
  • probe KP-98-22 SEQ ID NO: 3
  • probe KP-98-33 SEQ ID NO: 4
  • probe KP-110-32 SEQ ID NO: 5
  • an infectious disease-causing bacterium incorporated into a phagocyte can be directly detected without multiplying by the hybridization method, and the bacterium can be quickly and accurately identified. That is, in the diagnosis using the probe of the present invention, bacteria can be identified in one sample, and the time required for diagnosis is about 1 to 4 days (the detection rate is low), which is 3 to 4 days of the conventional method. The time can be dramatically reduced to two days, and the detection rate is extremely high. Therefore, in addition to providing technological guidelines for the treatment of bacterial pneumonia, it is expected that patients with infectious diseases will be able to be treated early and effectively, and that mortality will be reduced.
  • the present invention not only provides a probe for diagnosing infectious diseases, which was the intended purpose, but also as a guide for preparing primers for PCR, and in comparison with Genomic DNA contained in clinical samples. It is expected to have excellent utility as a standard sequence suitable for use in the field, and will provide valuable clues in the future search and development of probes that specifically react with DNA carried by infectious disease-causing bacteria. It has excellent effects. , paragraph
  • nucleotide sequence disclosed in the present application was obtained by randomly cloning Genomic DNA of a clinical isolate, and therefore, the usefulness of the nucleotide sequence of the present invention extends to its complementary strand. Reach.
  • the DNA mutated portion is used for hybridization for infectious disease diagnosis.
  • the specificity of the probe of the present invention or the nucleotide sequence information disclosed in the present application can be used to design primers for PCR for the purpose of rapid diagnosis of infectious diseases. It has no effect on the usefulness of the present invention.
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Klebsiel la pneumoniae
  • Organism name Klebsiella pneumoniae
  • GGCATATTCG CAAATATAAT GGAGGCAAGT CCGGAACTGA CATAGGTTTC ACCATAAATC 1200
  • ATAGCCAGCC ATGTGGTTCC CCAGGTCATT GCAACCAGCA GGAATAATAT CAATATTGTC 1440
  • Sequence type nucleic acid
  • TCCGGTGCTA TTGATGTGTC TATATCAGCT TTATTAGATT ATGGAATCAA AAAAATATTA 960
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Klebsiella pneumoniae
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)

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Description

J 明 細 書 クレブシエラ ·ニュ一モニエ菌に起因する感染症の診断用プローブ 〔技術分野〕
本発明は、 感染症疾患の原因菌、 特に敗血症の代表的起因菌であ——り、 また、 クレブシエラ肺炎の起因菌であるクレブシエラ 'ニューモニエ (Klebsiella pneumoniae )菌の検出および同定に有用なプローブに関する c 〔背景技術〕
病理学的に、 感染とは病原性の微生物 （以下、 「菌」 と称する） が生 体内に侵入し、 増殖の足がかりを確立することを指し、 生体内での菌の 増殖に起因する発症は、 宿主の抵抗力と菌の毒力との相互関係に依存す るものである。
病原微生物の感染によって起こる疾患を総称して感染症というが、 一 般に、 細胞の食菌力が病原菌の繁殖力に及ばず、 菌が全身の血流中に拡 がる場合を広義の菌血症と定義し、 その中でも、 体内の一定の病巣 （感 染巣） から持続的あるいは間欠的に病原菌が血液中に送り出され、 それ が原因となって、 さらに他の部位に新たな感染巣を作り、 重篤な全身症 状を呈する状態を敗血症と称する。 特に悪性腫瘍、 白血病、 膠原病など で原疾患およびそれらに対する治療のために生体の感染防衛機構が低下 していると、 敗血症へ進展し、 さらにショックや D I C (汎発性血管内 凝固症候群)、 A R D S (成人呼吸促進症候群） などを合併し、 死に至る 場合も多い。
このように、 感染症については、 特に、 的確な早期診断のもとに、 適 切な早期治療を実施することが必要であることから、 迅速な治療方法の 改善が待望されている。
さらに、 感染症に羅病すると、 生体組織内では第一義的には好中球、 単球及びマクロファージ系の食細胞がその防御機能を果たし、 また、 優 勢になつた菌が食細胞組織から血液中に侵出したことにより、 血液中に 菌が出現するものと考えられている。
敗血症の診断の確立および治療においては、 ①臨床症状の検討、 ②検 体から病原菌の培養、 ③検体から分離された病原菌の同定、 および④シ ョック状態の確認が必須であり、 これらの項目が確認されて初めて治療 方針が決定される。 確定診断のためには、 血液などの検体から起因菌を 検索 ·確定した上で、 菌の種類に応じた適切な抗生物質などを投与し、 治療しなければならない。 とくに、 耐性菌の存在や難治性の菌交代症を 誘発させる可能性を考慮し、 病原体の分離 ·同定ならびに薬剤感受性試 験に基づいた適切な薬剤の選択を早期に実施することが重要である。 敗血症の原因菌の多くはグラム陰性桿菌であるが、 なかでも、 緑膿菌、 クレブシエラ、 大腸菌などの好気性グラム陰性桿菌が全体の 6 0〜7 0 %を占めている。 なかでも、 クレブシエラ ·ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae)菌は、 代表的な敗血症の起炎菌である。
一方、 クレブシエラ肺炎は、 このクレブシエラ 'ニュ一モニエ菌を起 炎菌とする肺炎で、 粘稠な莢膜物質が大量に産生されることと起炎菌が 薬剤耐性を獲得することのために、 予後は不良であり、 敗血症性ショッ クを併発して死に至る場合も多い。
また、 菌血症（敗血症を含む）は、 菌が血液中に侵出した状態であり、 治療においては、 起因菌に感受性のある抗生物質を大量に投与する。 と ころが、 抗生物質は一般に肝臓などの臓器の機能を低下させるため、 有 効でない抗菌剤を危険な状態にある患者に投与することは極力避けなけ ればならない。 したがって、 臨床現場においては、 迅速かつ確実な菌の 同定が望まれているのである。
このように、 菌血症（敗血症）の治療の基本は、 早期に適切な抗生物質 を投与することにある。 そのためには、 第一に起因菌を知ることが必要 である。 一般的には、 菌血症が疑われる患者の血液をカルチヤ一，ボト ル法で培養し、 この検査で陽性を示した検体について、 選択培地を用い て菌を培養することで、 起因菌種の同定が行われる。 ところが、 この方 法によると、 好気性菌用と嫌気性菌用の培地の入った少なくとも 2種類 のカルチャー ·ボトルを必要とする上に、 菌の培養に長期間を要し、 ま た、 皮膚常在菌等の混入のおそれもあり、 さらに、 菌血症が疑われた時 点で大量に抗生物質を投与されている場合には、 たとえ検体中に菌が含 まれていても、 増菌 ·増殖できない場合が多く、 実際には、 検体からの 菌の培養の成功率は極めて低いものとなっている。
さらに、 サブルーチンとしての方法に、 菌体成分ゃ菌の代謝産物の機 器分析法 （辨野義己、 「ガスクロマトグラフィーによる細菌同定の迅速 化」 、 臨床検査、 vol .29, No. 12, pp. 1618-1623 、 1985年 11月、 医学書 院参照） 、 特異抗体を利用した方法 （特開昭 60— 224068号参照） 、 さら には、 D N Aの特異性を利用したハイブリダィゼ一シヨンによる方法 (特表昭 61— 502376号） 等があるが、 いずれも、 菌の分離及び増菌培養 が必須とされている。
—方、 感染症における食細胞の機能に着目したものとして、 血液試料 中の白血球成分が集中しているバフィ一コート （Buffy coat) の塗抹染 色標本を検鏡する方法がある。 一般にパフィ一コ一ト標本で菌が検出さ れる頻度は、 成人菌血症では耳朶血の頻度と同様に 30%程度にとどまる が、 新生児の場合、 10例中 7例 （70% ) で菌を検出している報告もあり、 塗抹標本の検鏡により末梢血中菌の有無に関する情報は治療における大 きな指針となっている。 上記従来技術においては、 その前処理操作として、 少なくとも検体か らの菌の選択的分離に 1〜2日、 増菌に 1日、 固定操作に 1日以上、 合 計で 3〜 4日は十分かかり、 現実にはこの培養を菌が発育するまで続け ることになるので、 前処理操作に一週間以上要する場合が多く、 さらに、 菌の培養時に疾患の原因菌以外の菌が混入しても区別できない場合もあ る。 . そして重要なことは、 前述した事情から、 培養すべき検体中の多くの 菌は食細胞に取り込まれ、 抗生物質投与のため死んでいるか静止状態に あるため、 培養条件下でも増殖できる菌の数は少なく、 臨床検体を用い た培養による実際の菌の検出率は 10%前後と、 非常に低い。 換言すれば、 臨床的に感染症の可能性が疑われた患者の血液をさらに一昼夜以上培養 して検査しても結局、 その 90%は菌の存在すら判明しないのが現状であ このような状況から、 現在は起因菌の確定と、 それに即した抗生物質 の選択が要求されているにもかかわらず、 臨床的に感染症の可能性が疑 われた段階で、 検出結果が出るのを待たずに治療、 すなわち、 起因菌不 明のまま、 最も広範囲な種類の菌に有効な抗生物質を投与し、 1、 2日 間様子を見て、 効果が現れないと別の抗生物質に切換えるという試行錯 誤的な方法に頼っているのである。
また、 検体中の菌を染色により検出する方法では、 生体成分も菌と同 様に染色されるため、 検鏡して認められる形態によつてのみ迅速に菌を 判別するのは、 熟練が必要であり、 判定が困難な場合もある。
このように、 感染症は迅速 ·確実な診断が求められる疾患であるにも かかわらず、 従来の診断方法では十分対応できていなかったのが実情で ある。 〔発明の開示〕
本発明は上記当該技術分野が抱えている課題に鑑みて完成されたもの であり、 その要旨とするところは、 感染症原因菌、 特に敗血症の代表的 起因菌であるクレブシエラ ·ニュ一モニエ菌が保有する D N Aまたは R
N Aと特異的な反応性を有するプローブ、 および、 当該プローブに含ま れるクレブシヱラ · ニューモニエ菌が本質的に保有している遺伝子部分 の塩基配列を解明することにある。
すなわち、 本発明のプローブにより、 例えば、 食細胞に取り込まれて 破壊されつつある菌においてなお維持されている菌の D N Aを、 ハイブ リダィゼ—シヨン法を用いてその特異性に基づいて有為に検出でき、 こ れにより、 菌を培養 ·増殖せずに、 感染症疾患の原因菌が迅速かつ確実 に検出できる。 また、 これらのプローブの塩基配列情報を参照してブラ イマ一をデザィンすれば、 ハイブリダィゼ一シヨンを行わなくとも、 P C R法による D N Aの増幅により、 感染症原因菌を同定することがで きる。
また、 ハイブリダィゼ一シヨンに用いるプロ一ブを非放射性のもの、 例えば、 ピオチン化したプローブを用いれば、 放射性同位元素使用施設 のない一般検査室でも光学顕微鏡を用いて検出でき、 検出作業が迅速、 簡便に行える。
〔図面の簡単な説明〕
第 1図（a)は、 ドッ ト 'ブロッ ト 'ハイブリダイゼ一ションの各フィル 夕一における D N Aの菌株の配置を示す図であり、 （b)は各プローブを用 いてハイプリダイゼーシヨンを行ない発色させた後の結果を示す図であ る 〔発明を実施するための最良の形態〕
本発明をさらに詳細に説述するため、 感染症疾患起因菌であるクレブ シエラ 'ニュ一モニエ菌に由来するプロ一ブの実施例を示す。
実施例 1 ：クレブシエラ 'ニューモニエ菌由来 DN Aプロ一ブ
(1) クレブシエラ 'ニューモニエ菌由来 DNAプローブの調製
臨床菌株クレブシヱラ 'ニューモニエを BHI (Brain Heart Infusion) 培地で一晩培養し、 培養菌体を集菌して、 溶菌ステップで N- Acetyl- muramidase SG をカロえた、 Saito - Miura変法 ("Preparation of transforming deoxyribonucleicacid by phenol treatment" , Biochem. Bio - phys. Acta vol. 72, pp.619-629 (1963))に準じて、 Genomic DNAを 抽出した。
抽出した DNAを、 制限酵素 Hindlllで完全消化し、 ベクター pGEM- 3Z にランダムクロ一ニングし、 得られたクローンからクレブシエラ ·ニュ —モニエ菌特有の、 すなわち、 天然のクレブシエラ 'ニューモニエ菌が 保有する DNAとの特異反応性を示した DNA断片を含む 5種のブロー ブを選抜した。
そして選抜された各プロ一ブを、 プロ一ブ KP- 77- 46、 プロ一ブ KP-85 - 43、 プロ一ブ KP- 98- 22、 プローブ KP- 98- 33、 およびプロ一ブ KP- 110- 32と 命名した。
(2) クレブシヱラ ·ニューモニエ菌由来 DNAプローブの種特異性の 鍾
各プローブと各種感染症原因菌株の D N Aとの反応性を、 以下の方法 により検討した。
まず、 検討対象菌株として、 下記表 1に列挙した臨床単離株および寄 託菌株を準備した。 なお、 表 1中の、 ヒト 'ゲノミック DNAおよび対 照試料の入手源として、 4名の健康な成人男子から採取した白血球、 な らびにプラスミド pGEM- 3Zを含んだ Escherichia colj K-12, JM109形質 転換体をそれぞれ準備した。
mo.嚇 菌 名
Figure imgf000009_0001
2 SA W M-mK Staphylococcus aureus) ATCC 25923
3 SE スタフィΏ、リカス ·ιヒ。テ、、ルミテ、、イス (Staphylococcus epidennidis) ATCC 12228
4 EC 滅ァ 'コリ (Escherichia coli) ATO 25922
5 EBC 、、、クタ -'クロ-力ェ (Merobacter cloacae) 臣^
6 EF iテロコ 'ファ工カリス (Merococcus faecalis) &
7 PA -ド tス ·¾)1Τノ-サ (Pseudai as aerusinosa) ATCC 27583
8 BF 八、、^ Dィテ、、ス'フテン、、リス (Bacteroides fragilis) ^W^
9 SP ストレフ0トコ、 ス'ビオケ、、ネス (Streptococcus pyogenes) ^W^W^
10 SAG ストレフ。トコ、リカス ラ ( Streptococcus agalactiae) &
11 SPN ストレフ0トコ ·:α~Ε ( Streptococcus me丽 iae) NYSDH DP-2
12 HI へ€ィリス 'イ ル iyfi(Haenghms influenzae) 臣^ »
13 HPA へ ィリス 'ハ。ライカル； i>fi(HafiTOhills 難 influenzae) 臣^ 3» 14 匪 U937ヒト'ケリミ DNA 画
NYSDH:New York State Department of Health (Albany, New York,USA) そして、 各臨床菌株を実施例 i (i)に記載の方法に従って、 各菌株が保 有する DNAを抽出し、 この抽出した DNAの一定量 （例えば、 10〜
100 ng) をナイロンフィルタ一にスポッ トし、 アルカリ変性したものを ドット . プロヅト ·ハイプリダイゼ―ションの試料とした。 なお、 ヒト 'ゲノミック DNA試料は、 前出の Saito- Miura変法に、 先に入手した白 血球を適用することで調製した。 一方、 対照試料は、 後述する実施例 2 (1)に記載のプラスミ ド DNAの調製方法に、 先に入手したプラスミ ド pGEM- 3Zを含んだ Escherichia coli K- 12， JM109形質転換体を適用する ことで調製した。 次いで、 Digoxigenin- 1卜 dUTP (BRL社製） でラベルし たクレブシエラ 'ニュ一モニエ菌由来の DNAプローブで、 マニアティ スのマニュアル (T. Maniatis,et al. , "Molecular Cloning (A Laboratory Manual Second Edition)", Cold Spring Harbour Laboratory (1989))に従い、 45%ホルムアミ ド、 5xSSC、 42°Cの条件下で、 終夜ハ ィプリダイゼーシヨンを実施した。
終夜ハイブリダィゼ一シヨンを終えた試料を、 マニュアルに従い、 55 °Cにて O.lxSSC、 0.1¾SDSによる 20分間の洗浄を 2回行った後に、 Anti-Dig-ALP conjugates (BRL社製) で検出 ·発色させ、 ハイブリダイセ' —シヨンの状況を確認した。 得られた結果は図 1に示すとおりである。 図 1 (a)は、 ドット ' ブロット ·ハイプリダイゼ一シヨンを行った各フィ ル夕一にスポットしておいた DNAの菌株の配置を示し、 図 1(b)は上記 のそれそれのプローブ KP- 77-46、 KP- 85- 43、 KP- 98- 22、 KP- 98- 33および KP- 110- 32を用いてハイブリダィゼ一シヨンを行ない発色させた後の結果 を示す。
各プローブと各臨床菌株の D N Aとの反応性に関する実験結果を、 下 記表 2に示した。 表 2
フ ーブ (言 fff:KP- ) 菌 No.噺尔 菌 名 77 - 4685-4398-2298-33110 - 32
1 Ρ クレフ、、 ¾：ラ.一 コ
2 SV
3 SE ス イ!]コ、 ν¾ス ·Ιヒ。テ、、ルミテ、、イス
4 ルァ 'リ
5 EBC 1テロハ、、ク夕 -'クロ-カェ
6 EF I iDコッカス'ファェカリス
7 PA シユ-ド、 itス 、、ノ-サ
8 BF ； V、^ロイデス 'フテン、、リス
9 SP ストレフ °トコ 'ヒ。オケ、、ネス
10 SAG ストレフ0トコ、 · 、、ラ ェ
11 SPN ストレフ。トコッカス ·: τΕ
12 HI へ Ϊ7ィリス 'ィ ル! fl
13 HPA ぺモフィリス ライ ル I fェ
14 匪 U937ヒトケ、リミ、 DN A 画
+：ハイブリダイズのシグナルを f l
一：ハイプリダイズのシグナルを lせず 上記図 1および表 2から明らかなように、 いずれのプローブもクレブ シエラ 'ニューモニエ菌に由来する DNAに対してのみ反応性 （ハイブ リツドの形成） を示し、 それ以外の菌種に対しては反応性が認められず、 その種特異性が確認された。
実施例 2 ：塩基配列の解析
実施例 1にて種特異性が確認された DNAプローブ （計 5本） の塩基 配列を下記の方法に従って決定した。
(1) プラスミ ド DNAの調製
サブクローン化された （塩基配列を決定すべき） 挿入断片を pGEM - 3Z (Promega)に含んだ Escherichia coli K- 12, JM109形質転換体を、 5ml の Luria-Bactani Medium (bacto-tryptone, 10g/lL; bacto-yeast extract, 5g/lL; NaCl, lOg/lL; 5 N NaOH で pH 7.0に調整) に植菌し、 一晩培養した。
培養液を遠心分離（5,000rpm, 5min.) して集菌した。 沈澱物に 2.5mg/ mlの濃度でリゾチーム（Sigma) を含む 50mM グルコース /50mM Tris-HCl (pH8.0)/10mM EDTA溶液を 100 il 加え、 室温で 5分間放置した。 得られ た懸濁液に 1 %の濃度でドデシル硫酸ナトリゥム（Sigma) を含む 0.2M 水酸化ナトリゥム水溶液を加えて混合した。 5M酢酸力リゥム水溶液 (pH 4.8) 150〃1 をさらに加えて混合し、 15分間氷冷した。
そして、 遠心分離 （15,000rpm, 15min. )して得た上清を、 フエノール /CHC13処理し、 上清に 2倍量のエタノールを加え、 さらに遠心分離 (12,000rpm, 5min.) して沈澱を得た。 この沈澱物を、 lOmM Tris- HC1 (pH7.5)/0.1mM EDTA溶液 100 1 に溶解し、 10mg/ml RNaseA (Sigma)溶 液を加え、 室温で 15分間放置した。
この調製物に 0.1M酢酸ナトリゥム水溶液 （pH4.8) を 300 il 加え、 フヱノール/ CHC13処理し、 上清にエタノールを加えて沈澱を得た。 この ^ 沈澱物を乾燥し、 10〃1 の蒸留水に溶解したものを DN Α試料とした。
(2) 塩基配列決定の前処理
塩基配列決定の前処理を AutoRead (登録商標） Sequencing Kit (Pharmacia)を用いて行った。
すなわち、 錶型となる DNAが 32〃1 溶液中に 5〜10〃g の濃度にな るように調整した。 1.5mlのミニチューブ （エツペンドルフ） に、 銪型 DNA 32^1 を移し、 2 M水酸化ナトリウム水溶液を 8〃1 加えて穏やか に混合した。 そして、 軽く遠心した後、 室温で 10分間放置した。
3M酢酸ナトリウム（pH4.8) 7〃1 と蒸留水 4〃1 を加え、 さらにェ 夕ノールを 120 /1 加えて混合し、 エタノール ' ドライアイス上で 15分 間放置した。 そして、 15分間遠心分離して沈澱した DNAを集め、 注意 しながら上清を除去した。 得られた沈澱物を 70%エタノールで洗浄し、 10分間遠心分離した。 そして、 注意しながら再度上清を除去し、 減圧条 件下で沈澱物を乾燥した。
沈澱物を蒸留水 10〃 1 に溶解し、 螢光性のプライマ一 fluorescent Primer, Universal Primer; 55 -Fluoresce in-d[CGACGTTGTAAAACGACGGCC AGT (配列番号： 6) ]-3' (LGprnol/z l; 0.42 Α26。 unit/ml); Reverse Primer, 5， -Fluorescein- d[CAGGAAACAGCTATGAC (配列番号： 7) ]-3' (2.1pmol/ /l; 0.42 A26。 unit/ml)〕 2〃1 (0.42 A26。 unit/ml, 4〜 6pmol) とアニーリング用緩衝液 2〃1 を加え穏やかに混合した。
そして、 軽く遠心した後、 65°Cで 5分間熱処理を行い、 素早く 37°C条 件下に置き、 そこで 10分間保温した。 保温後 10分以上室温で放置し、 軽 く遠心した。
そして、 延長用緩衝液 とジメチルスルホキシド 3 //1 を加えた ものを試料とした。
4本のミニチューブに A、 C、 Gおよび Tと記入し、 それぞれのチュ —ブに AMix (ddATPを dATP、 dCTP、 c7dGTPおよび dTTPと共に溶解したも の） 、 C Mix (ddCTP を dATPヽ dCTP、 c 7 dGTPおよび dTTPと共に溶解した もの） 、 G Mix (ddGTP を dATP、 dCTP、 c 7 dGTPおよび dTTPと共に溶解し たもの） および T Mix(ddTTPを dATP、 dCTP、 c GTPおよび dTTPと共に溶 解したもの） を 2.5 1 ずつ分注した。 なお、 それそれの溶液は使用時 までは氷中で保存し、 使用時には 37°Cで 1分間以上保温してから使用し た。
希釈した T7DNA ポリメラ一ゼ （Pharmacia; 6〜 8 units/ 2 JUL \ ) 2 j l を D N A試料に加え、 ピペッティングもしくは穏やかな混合により、 完 全に混合した。
混合後すぐに、 この混合液を 4.5 1 ずつ保温しておいた 4種の溶液に 分注した。 なお、 分注に際しては新しいチップを用いた。
37°Cで 5分間保温し、 停止溶液を ずつそれそれの反応液に加え た。
この分注においても、 新しいチップを用いた。 90°Cで 2〜3分間保温 し、 すぐに氷中で冷却した。 電気泳動には 1レーンあたり 4〜6 / 1 を 泳動した。
( 3 ) 塩基配列の决定
実施例 1および 2に開示した、 クレブシエラ 'ニューモニエ菌が保有 する D N Aに対して特異性を有するプローブそれそれの塩基配列の決定 を、 泳動温度 45°C、 泳動時間 6時間として、 A.L. F. DNA Sequencer シス テム（Pharmacia) を用いて行った。 各上流と下流から明らかになった配 列から順次ブライマーをデザインし、 上記の操作を繰り返した。
その結果、 プローブ KP- 77- 46 (配列番号： 1 ) 、 プローブ KP- 85-43 (配列番号： 2 ) 、 プローブ KP- 98- 22 (配列番号： 3 ) 、 プロ一ブ KP- 98-33 (配列番号： 4 ) およびプローブ KP- 110- 32 (配列番号： 5 ) それ それの塩基配列の全容が明らかになつた。 〔産業上の利用可能性〕
本発明のプローブを用いれば、 例えば、 食細胞に取り込まれた感染症 原因菌をハイブリダィゼ一シヨン法を用いて、 増殖することなく直接検 出し、 かつ菌を迅速にしかも正確に同定できる。 すなわち、 本発明のプ ローブを用いた診断では、 1回分の検体で菌の同定まで行え、 診断に要 する時間も従来法の 3〜4日 （検出される率は低い） から、 約 1〜2日 と飛躍的に短縮でき、 しかもその検出率は格段と高い。 それ故、 細菌性 肺炎の治療に対して画期的な指針を与えるばかりでなく、 感染症患者に 早期の内に有効な治療が実施でき、 ひいては死亡率の低減も期待される。 また、 感染症疾患起因菌の中でも、 特にクレブシエラ ·ニューモニエ 菌が保有する D N Aに特異的に反応するプロ一ブの塩基配列を明らかに したことにより、 これらプローブを人工的に調製することを可能とした。 さらに、 解析した塩基配列の情報の一部を利用して作製したプライマ一 を用いて、 臨床検体に含まれる感染症原因菌の D N Aを P C R法によつ て増幅して、 原因菌の迅速な診断に役立てることができる。
さらに、 臨床検体に含まれる Genomic D N Aの塩基配列と本発明によ つて解析された塩基配列とを比較参照することにより、 感染症や肺炎の 起因菌種の迅速な同定が行える。
上記したように、 本発明は、 所期の目的であった感染症診断用プロ一 ブを提供するのみならず、 P C R用プライマー作製の指針として、 また 臨床検体に含まれる Genomic D N Aとの比較参照用に適した標準配列と して優れた有用性が期待され、 さらには感染症疾患起因菌が保有する D N Aに特異的に反応するプローブの今後の探究 ·開発における貴重な手 がかりをもたらすなどの優れた効果を奏するものである。 , „
1 4 また、 本願出願にて開示した塩基配列は、 臨床分離株の Genomic D N Aをランダムにクローニングして得られたものであり、 それ故、 本発明 の塩基配列の有用性はその相補鎖にまで及ぶものである。
さらに、 野性株が保有する D N Aに変異部分が存在することは当然考 えられるが、 上記実施例の開示から明らかなように、 当該 D N A変異部 分が、 感染症診断のためのハイプリダイゼ一シヨンへ利用する際め本発 明プロ一ブの特異性、 あるいは本願出願にて開示した塩基配列情報を感 染症の迅速診断を目的とした P C R法のプライマ一をデザィンするため に利用できる等の、 本発明が奏する有用性には何ら影響を与えるもので はない。
配 列 表
( 1 ) 出願人名称：抉桑薬品工業株式会社
(2) 発明の名称：クレブシヱラ ·ニューモニエ菌に起因する感染症の診断用プロ ーブ
( 3 ) 書類記号： 9 8 P 0 5 7 W O
(4) 優先権のもととなった出願をした国名及び出願番号：
国 名： 日本国
出願番号：平成 9 ( 1997)年特許願第 7 1 0 8 2号
( 5 ) 優 先 日 ：平成 9年 3月 2 5日
(6) 配列の数： 7 配列番号： 1
配列の長さ ： 1941
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名 ：クレブシエラ ·ニューモニエ (Klebsiel la pneumoniae)
株名 ：臨床分離株 KP-77 - 46
配列：
AAGCTTATCC CGCATCACCT GCCAGAGTGT TTCCGCATCC TCGTGCAGCC GCTCGCACAT 60 GTCGGCCGGG GTATCCATAT CCAGCTCGTT CAGTTTCTCG AGCAACAGCA GCGACTGGTC 120 CTTAATGAAT TTAGCCATAT TGAGGGCGGT TTTTTCCTGC TTCGTCATGT TCTCCATTCC 180 CTTCGGTAAG TTCTCAGCTA AACCAGCCGG ACCAGAAGCG TTTTTTCTTC TGTGTCAGTT 240 } il¾w3Mv 3JlvJi JlV33
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¾39 t}¾}3¾33i3G3 s¾}vuvvvi
{ 7
ACGTGGCGGT CACCTGACCT TCGATGCGTT TTGCTGCGGC CTGTACCGGG TAGGTTGGCT 1860 GCAGTGTGGT TACGGGTTTT AGTGGTATCG CATGTACCGG AGTGAGGAAC ATGGCCGCCA 1920 GCACTGTCAG AGTAAAAGCT T 1941 配列番号： 2
配列の長さ： 1747 ' ' 配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名：クレブシエラ .ニューモニエ (Klebsiella pneumoniae)
株名：臨床分離株 KP-85- 43
配列：
AAGCTTTTCT TTCAACCCTG GACAAGATGG CTGAAAAGCA GAAGAACACA GGTAAAGAAA 60 TGTTCGTGGG TGTCAACCGG GTACTGAGCG ATGCAGAATC AAAATCATTT TTCGAAGAAA 120 ACAGAACGCA GTACCCAAAG ATGGACATTA AAATACCGTT TCTTACGGTG CGCGAAACTC 180 TTCTGTACAA ACCCGCATTG AATGCCTCAC AGGTGATGTG CCCGACCCTG ATCGTTATTG 240 CTGGTCAGGA TACGGTTAAT CCACCGGAGC AGGGACGGGC CTTATTTGAC GCGGTGGGGG 300 CCAAAGAAAA AAGGCTATAT GAGGAAAGCA GTGCCCGCCA TTACGACATT TATGCAGGAG 360 AGCACTTTAA GCAGGTTATC AGCATTCAGA CAGAATGGTT TAAAACGCAC TTGTAATTTT 420 AGATAACGAC TTACGGTGGG TTCAACAGAG CCCGCCGTTA TGATAGACGT CAAATGTCGC 480 ATTTTGTAGC TTCGCTTCCG CTGGGCCCTG TAAGGCGCTA CGTTCTCAGG AAGTCTCAGT 540 ATGCTCAGGA ATACTATCCC GATGTCTGTT GGTTACAGGC ACTCGCCGTG AGAAAAGAGT 600 AAGAAATATC CCGGTAACTA ACGGTATAAT AAACAGCATT GATTGAGTTG AAAGTGCATA 660 TCCATATATA TAGCTCTCCA GGCTTACCGC AATCAGAGGA AAAATAAGGA AAACAAGTGA 720 1 g
AGCCTGAAAG CACTGGCCTT TTGCTGAAGT GCAAAGTAGC ATAATATTCC AAAAACTCCG 780
GCAAAAGCAC CGAGATACAG GGTGGCCAGT ATTGAGTGCG CTGAGAAGGC TGACACCTGT 840
GGTCTTTCGA AGAGCCATCC TGCCGCAGAA AGTATCAATC CTGCCAGAAA ACACGGTAGC 900
GCGTTAAACG TTATAACAGA GACAGTACAG CTTCTTTTCT TGCATTGGGT GTATATTATG 960
GCATGGATGA TTACGGCTGA AACAAGCGCA AGGATCCCCT GCCAGTGGCT CTCTGTACTT 1020
GTTTTCGTTT CTTCGAGAAG AATACCCGCC AGTGCAACTA TTGCAACAGT TAATCCCGCA 1080
ATCTGCATTG AGTTCGTTTT TTCATTCAAA AATATCACAG AAGCTATCAA AACAGCCACA 1140
GGCATATTCG CAAATATAAT GGAGGCAAGT CCGGAACTGA CATAGGTTTC ACCATAAATC 1200
ATTAATGAAA AAGGAATGGC GAAATAAAAA ATACAGATTC CAAACTGAAA TAATCGTTGT 1260
CCAGGTGGAA ATAAAAGTGG TGTTTTTCTT AACCATGCAA TGCCCATTAA TAATGGTGCC 1320
GCGAACATAA ATCTCATTCC GGTTGCAAAC ACCGGAGGGA TCGTTTCAGC GGCTATCCGC 1380
ATAGCCAGCC ATGTGGTTCC CCAGGTCATT GCAACCAGCA GGAATAATAT CAATATTGTC 1440
ACTCTGCGCA TAAGACGCTC CCAGTAAAAG GAATTAATTT AACTTTTTAG CTGGAGAAAA 1500
ATATTTTTTT CTTTACTGTT TTTTCATACT TTTAGAGAAA ATATTTCTCT TTCAGAAGGG 1560
TGAGATTATG CTGGAAAAAA AAGATAAAGA GCTACTCAGG CTGTTATAGC GCGACTGTAC 1620
CCTGTGTTTG CAGGATCTGG CTGCGGCTGT CGATTTAACG CCTAATCCCT GCTGGAAGCG 1680
CATAAAACGG CTTGAAGATG AGGGGATCAT CACTGGTCGG GTCGCCCTGT TGAGCAAGGA 1740
CAAGCTT 1747 配列番号： 3
配列の長さ ： 1988
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源 生物名：クレブシェラ .ニューモニエ (Klebsiella pneumoniae) 株名：臨床分離株 KP- 98- 22
配列：
AAGCTTAGAA TAAAAAGATT TTTCTTCTTC ATAACTTTCT CCATTTTGTA TGTTTATTTG 60 TTTCGTATCC TTATTATTTT TATTTGGCTT ACATATAAAT AAATACAACA ATAATTAATA 120 TAGTCAAGAT GTGTATAATA TTATTGACAA ATATATTTTA ATTAGCTAAT TAATAAATGA 180
ACAGAAAACA AAGGAGAATA AAATGAAATA TTATATGCTA AAACCATTTC GAATAGGAAT 240
CTTAGAGAAC GATATAACTG TTAAAGAATC AGAACAATAT GTGATTATTG ATATAATTAG 300
CGGAGAGGAA ATACTTTATT GTGATGATAA TTGTTATTTA ATTACTCCAA CTTTATTGAA 360
ATCTCTTAAA GATAGCAATC TTACAGGTGT TAATGTTGTA AAGCCTAAAA ATATGAAATT 4Z0
CAGTATTGAA CACAACATGA AACATCCTAA TAAAAGTTTA AGGGAATGGT ATAGACTAAT 480
ACCATTTAAG TATGATAGCG GTAAGAATCA GGAAATATTT CTTGATCAAT ACGACAATCT 540
AATCATAAAT GAACGCATAA AAAATATAAT ATATAATAAG GATGTTCATA GGGTAAAGAG 600
AGCTTTTATA ACAGAATATG AGATTGATAA AGTAGAGCAT CATGATGAAG AAATAATCGA 660
GCAACCTGTT TTTAAGAAGG AAAATAAAAC CACTTTTAAA GATTGGTGTG TTTTCATGTT 720
TATTCTTATA ACTATCATTT ATTTGTTTTT TAAATAAGAG GCTGAAAGAT GAATATCAAA 780
ATCAATGATG GTATTACAGG CGAGATCTTA GTGTTAAATC AAACAACGTT TAACAATGAT 840
GTGGATACTA TACAGTTAAG AATGACACCA GAGTTTTTAG CCCTTATCAA AAGACATTGT 900
TCCGGTGCTA TTGATGTGTC TATATCAGCT TTATTAGATT ATGGAATCAA AAAAATATTA 960
GATGAAAACA TTTCAATCTC AATACAACAA GTTGAGAAAG AAATCGTAAT TGAATCAGTA 1020
AAGCGTGATA GTAGCATTAT TCCATTTACT ACAGTTAACT ATAGAGCATC AAGAAAAGAC 1080
ACACGCCCCG TATTCGTGAG ATTGTGTAAA GATCTAAAAT ATAGGTTAAA AGAAATATCT 1140
CCGACTAAAT ATACACTTTC CGCAATTGGT ATAATAAAGT ATTCGATTGA TACCTTGCTT 1200
AAAAACAATC AGTGCCTGAT AATAAAAAGT GAGGTTATTT ATGAAAAATA AAAACATTGA 1260
ATTTATGCTT AATGCTATTC TTTTTGCTAA GTTTCTTTTA TATCAGGATG AGTTCACAAA 1320
TGAAGAGCTT GAACGTGGTG AAGATGTTCG AAACATAAAA GAGCTTTTCG TATTAAAAAA 1380 2 Q
TAAAGAATGG ATTAATGATA TTAATACAAT AAGATTAAAG GATATTAACC AAGATATTCA 1440
TATATCATCA ACATACATCA TGTCATTAGA TGGAGTGGGT TATTATGCTT TTTCTAATAA 1500
GTCAGAAGAT GAGTTATACC AATATTTAGT TAATGACCTT TGCGATCATT ATATCGCTGT 1560
AAGTGAAATG TCATTGGAAG ACATAGAGGG AGCTTTAGAG GCAATCGAAG AAGATTTGTT 1620
TGATATATAC CGAAGTAATC TATCTTTAGC CAACAAAATG ATTTTAGATG TTTCAAACAG 1680
ATTTAAAATA AAACCTGATT TGAAAAGACC ATTACTCACC ATCGTTTAAA AAGGGCTGTT 1740
AAGCCCCTTT TATATTGTTC ACTGTTTTAT GATGTGCTAT GTTTACCTTC TAACTTAAAT 1800
GTTGAAAAGG ATAAAACATG AGCGCATTAG GGCATTTTAA TAACATTCGC ACTATCAGAA 1860
AAGAAGCCCA TGAGATGGGC TATGACACCT TCCTTGAGTT CGCTGAAAAG GTTCAAACCG 1920
TTAAGGATGN GTTCCTAAAA GAAGCAGAAG AGGAAAAAGC GAAACAGGCA CTGGTAGAAG 1980
AAAAGCTT 1988 配列番号： 4
配列の長さ ： 1484
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名：クレブシエラ ·ニューモニエ (Klebsiella pneumoniae)
株名 ：臨床分離株 KP-98-33
配列：
AAGCTTTTAA TGGAATGAGC GTATTTTTAA ACTAAAAAAA GGATTACATT ATGAATATAT 60 TATCAATAGC ATCAGGCGAA ATAGTGTTTT GTTTATTTAT AGCGTTTTTT ATTTATACAG 120 GCATTAAAAT CAAAAGCAGT AAGAAATTAA CAAAGATATA TAAAAATATA GGATGGGTAG 180 GAGTTGCTTT ATTAGCCTCT TTATTTATAT CAGTTCATTT ATCAAGAGAG GTTCACATTG 240 0/ 286fcvJC一 ΟΛν . ο 寸 寸 寸 寸 寸 寸 寸 to ' ,co ト CO 寸 寸
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000023_0002
< O < > O
O oo 寸 OO 寸
oo Z> - H
Figure imgf000024_0001
應 J 3 V ATTATAAGGG CGTGGTTTAA AAGGAATATA ATAGTTGTTG AAAAGCTT 1248 配列番号： 6
配列の長さ： 24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖 -— トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列：
CGACGTTGTA AAACGACGGC CAGT 24 配列番号： 7
配列の長さ ： 17
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列：
CAGGAAACAG CTATGAC 17

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 感染症疾患起因菌であるクレブシエラ 'ニュ一モニエ
( Klebsiella pneumoniae )菌が保有する D N Aを制限酵素 Hind 111で処理 して得ることができる D N A断片を含み、 およびクレブシエラ 'ニュー モニエ菌が保有する D N Aと特異的にハイプリッド形成することを-特徴 とする感染症診断用プロ一ブ。
2 . 前記感染症診断用プローブが、 配列番号 1乃至 5に記載の少なく とも一つの塩基配列を含む請求項 1に記載の感染症診断用プローブ。
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