WO1997037018A1

WO1997037018A1 - Novel gene

Info

Publication number: WO1997037018A1
Application number: PCT/JP1997/000919
Authority: WO
Inventors: Yoshio Takada; Chihiro Kato
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha
Priority date: 1996-04-03
Filing date: 1997-03-19
Publication date: 1997-10-09
Also published as: JPH11299487A

Description

明細書新規遺伝子技術分野

本発明は、新規遺伝子に関する。更に詳細には、血管内皮細胞のずり応力に応じて発現する新規遺伝子の D N Aに関する。本発明の D N Aを用いると、従来明確ではなかった、血管内皮細胞がずり応力が加わる正常な生理的環境にあるか否かについて検出することができる。これにより、血管内皮細胞機能障害のメカニズムの解明が可能となる。また、本発明は上記 D N Aの部分配列にハイブリダィズしうる D N A ；それら D N Aに相補的な D N A ；それら D N Aを複製可能なベクタ一に組み込んでなる組換え体 D N A ；それら組換え体 D N Aで形質転換された微生物又は細胞；上記 D N Aによりコ一ドされるぺプチド；及びそれらべプチドと結合しうる抗体に関する。さらに、本発明は上記 D N Aがコードするぺプチドに結合しうる物質又は上記べプチドとぺプチドに結合しうる物質との結合を阻害する物質を検出する方法に関する。本発明の検出方法を用いることにより、中枢における神経疾患に対する医薬品として展開しうる物質の検出が可能となる。従来技術近年、血管の機能についての研究はめざましい発展を遂げておリ、血管の機能について様々なことが解明されている。中でも血管内皮細胞が血管において果たす役割は非常に大きいことが知られ、その機能としては、血管内腔から組織への物質の透過性調節、抗血液凝固物質の発現による抗血栓作用の維持、血管腔の拡張や収縮の調節等が挙げられる。これらの機能が何らかの原因で働かなくなると、種々の脈管疾患発症へと至ることも指摘されている。

上記したような血管内皮細胞の機能に影響を与える因子の一つとして、物理的因子であるずリ応力が知られている〔Fro nt iers of Medica l and Biological Engineer ing, 5, 245-264 (1993)〕。ずリ応力は血流速度と血液の粘性、さらには血管の径ゃ形態によって規定される。生体內においては血管の分岐部側壁内側などのずり応力の低い部位に動脈硬化症がよく発生することが知られておリ〔Role of Blood Flow in At her ogenesis (Y . Yo s h i d a e t a 1. , Eds) Spr inger-Ver l ag, Toky o ( 1988)〕、これからもわかるように、ずり応力が血管内皮細胞の機能制御に重要であることが指摘されている。

しかしながら、このずリ応力と血管内皮細胞の関係についての研究はかならずしも十分ではなく、血管內皮細胞の機能がその生理環境下でどのように制御されているのかは明確ではなかった。

ずり応力が個々の細胞においてどの程度負荷されているかを測定することが可能になれば、個々の内皮細胞機能について詳細に解析することができ、さらには、血管内皮細胞機能障害を原因とする種種の脈管疾患発症メカニズムの解明を行うための効率的な発現物質解析並びに関連物質探索が可能となる。

一般に生理活性物質やレセプター等の蛋白は、それぞれの生物種にょリ配列が異なる。従って、関連した蛋白をそれぞれの生物が有するとしても、ある生物種に由来する該蛋白を異なる生物種に与えた場合に、反応性や効果に差があることが予想される。例えば、ヒトとゥシの γ — I F Nは、 R N A に強く結合してゥシの精子から単離した R N a s e Aダイマ一の活性を阻害するが、マウス Ύ一 I F Nにはその阻害能がないと報告されている [Biochemical Journal, 3 7, 123- 127 (1 995)〕。さらにまた、組換えラットプロテイン C とラット血漿由来プロテイン Cは、ラット血漿を用いた活性化部分トロンボプラスチン時間を用量依存的に延長するが、ヒト血漿由来プロティン Cは延長作用が弱いと報告されている CThrombo s is and Ha emo s I a s i s 54 - 61 ( 1994)〕。このように種差があることが予想される状況においては、ヒトに特異的な蛋白を取得することが、ヒ卜の医薬分野の将来の展開に極めて好ましいことは論を持たない。

従って、血管内皮細胞がずリ応力の加わる正常な生理的環境にあるか否かについての検出方法を提供する場合、種差というのは非常に大きな影響を与えるという可能性を予め考慮しなければならない。つまリ、ヒト生体内の血管內皮細胞あるいはヒト由来の血管内皮細胞について上記の検出を行なう際には、後述の方法によってある特定の D N Aあるいは蛋白質の発現量を測定することが最も効果的である。しかしながら、他の生物の組織や細胞から取得した D N A等は、ヒトにおいてその相同性が低い場合、またコードする蛋白質のアミノ酸配列もかなリ異なることがあリ、定量的あるいは定性的な検出が不可能なことがある。そのような可能性を考慮し、ヒトから単離した D N A等を利用して検出することが望まれる。

血管内皮細胞のおかれている環境や血管内皮細胞の機能等を測定し、血管内皮細胞の機能が生理的環境下でどのように制御されているのかを明確にする方法の一つとして、血管内皮細胞がずり応力の加わる正常な生理的環境にあるか否かについての検出方法を提供することが望まれていた。従って本発明の課題は、血管内皮細胞の機能が生理的環境下でどのように制御されているのかを明確にすることであり、さらに詳しくは血管内皮細胞のずリ応力に関する生理的環境の有無についての検出を可能にすることである。発明の概要

本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意研究した結果、ずリ応力を負荷した血管内皮細胞よリ抽出した m R N Aを用いて得た c D N Aライブラリーから、新規な遺伝子の D N A 断片を単離することに成功した。そしてその D N A断片を用いて、新規遺伝子（以下、しばしば H G I R遺伝子という）全長を含む D N Aを単離 · 取得するに至った。そしてさらにこの遺伝子の発現量が、血管内皮細胞が受けるずリ応力に応じて変化することを見いだし、その遺伝子を用いることによつて、血管內皮細胞がずり応力が加わる正常な生理的環境にあるか否かについての検出が可能であることを確認した。さらに上記遺伝子を組み込んだ発現可能な組換え体 D N Aを動物細胞へ導入して得た細胞抽出液中に上記遺伝子がコードするペプチドの存在を確認した。さらに、本発明の遺伝子の m R N Aの生体内分布を調べたところ、脳において高い分布を示すことを明かとし、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、図 1 の制限酵素地図に示される制限酵素切断部位によリ特徴付けられるヒト由来の全長 D N Aの少なくともぺプチドコード領域を包含する単離された D N Aとその形質転換体、その D N Aによリコードされる実質的に純粋なペプチド、そのペプチドと結合しうる抗体、さらに、上記 D N Aによリコードされるべプチドに結合しうる物質を検出する方法及び上記 D N Aによリコ一ドされるぺプチドとぺプチドに結合しうる物質との結合を阻害又は抑制する物質を検出する方法である。図 1 の斜線部は、ペプチドコード領域を D

示す。ペプチドコード領域としては、配列番号 1 の 1 一 4 2 3のアミノ酸配列をコードする塩基配列が好ましい例として挙げられる。さらに具体的には、このペプチドコード領域力配列番号 2の 1 — 1 2 6 9 の塩基配列であることが好ましい例として挙げられる。また、図 1 の制限酵素地図に示される制限酵素切断部位にょリ特徴付けられる D N Aが、配列番号 3の 1 — 1 5 6 2であることが好ましい例として挙げられる。また、その D N Aによりコードされるペプチドとしては、配列番号 1 の 1 一 4 2 3 のアミノ酸配列が好ましい例として举げられる。

従って、本発明の主な目的は、血管内皮細胞がずリ応力の加わる正常な生理的環境にあるか否かにについて検出することを可能にする D N A、その D N Aによリコ一ドされるぺプチド、及びそのペプチドと結合しうる抗体を提供することにある。

又、本発明の他の 1 つの目的は、上記 D N Aがコードするぺプチドに結合しうる物質を検出する方法及び上記 D N Aがコードするぺプチドと上記ぺプチドに結合しうる物質との結合を阻害又は抑制する物質を検出する方法を提供することにある。

本発明の上記及び他の諸目的、諸特徴並びに諸利益は、添付の配列表及び図面を参照しながら述べる次の詳細な説明及び請求の範囲の記載から明らかになる。配列表の簡単な説明

配列表において：

配列番号 1 は、 4 2 3のアミノ酸からなるぺプチドのアミノ酸配列であリ；

配列番号 2は、 1 2 6 9 の塩基からなるペプチドコード領域の塩基配列でぁリ；

配列番号 3 は、図 1 の制限酵素地図で表される全長 D N A の塩基配列の一例であリ；

配列番号 4及び 5 は、配列番号 2の 5 1 1 〜 1 0 2 1 の塩基配列を得るために用いた P C Rプライマーでぁリ；

配列番号 6 、 7及び 8 は、 H G I R発現プラスミドの構築に用いた P C Rプライマーである。図面の簡単な説明

図面において：

図 1 は、本発明の D N Aのぺプチドコード領域を含む制限酵素地図を示す。制限酵素地図中の斜線で示した領域はぺプチドコード領域を示し、左側がペプチドのァミノ末端、右側がカルボキシル末端を示す図である。

図 2 は、平行平板型ずリ応力負荷培養装置の構造を示す図である。

図 3 は、組換えプラスミド P G I R 1 0並びに P G I R 2 0の制限酵素切断部位並びに機能地図を示す図である。黒く塗リつぶした部分は、 H G I R遣伝子を示す。矢印はぺブチドコード領域に対応し、矢印の方向は、 5 ' 末端から 3 ' 末端を示す。

図 4 は、血管内皮細胞における H G I Rに対応する m R N A量をノーザンハイプリダイゼイションによリ検出した結果である。

図 5 は、組換えプラスミド p E G I R l 1並びに p E G I R 1 2 - F L A Gの制限酵素切断部位並びに機能地図を示す図である。黒く塗リつぶした部分は、 H G I R遣伝子を示す。矢印はペプチドコード領域に対応し、矢印の方向は、 5 ' 末端から 3 ' 末端を示す。発明の詳細な説明

本発明によれば、図 1 の制限酵素地図に示される制限酵素切断部位により特徴付けられるヒト由来の全長 D N Aの少なくともぺプチドコード領域を包含する D N Aが提供される。次に、本発明の理解を容易にするために、先ず本発明の基本的諸特徴及び好ましい態様を列挙する。

1 . 図 1 の制限酵素地図に示される制限酵素切断部位にょリ特徴付けられるヒト由来の全長 D N Aの少なくともペプチドコード領域を包含する D N A。

2. 該ペプチドコード領域が、配列番号 1 のアミノ酸配列を包含するペプチドをコードする塩基配列である前項 1 に記載の D N A。

3 . 該ペプチドコード領域が、配列番号 2の塩基配列である前項 1 に記載の D N A。

4 . 制限酵素地図にょリ特徴付けられるヒト由来の全長 D N Aが、配列番号 3の塩基配列である前項 1 に記載の D N A。

5 . 前項 1 から 4のいずれかに記載の D N Aに対する相補的な D N A。

6 . 前項 1 から 4のいずれかに記載の D NAを複製可能なベクタ一に組み込んでなる複製可能な組換え体 D N A。

7 . 配列番号 2の 1 一 1 3 5の塩基配列を含む D N Aにハイブリダィズしうる D N A。

8. 前項 7に記載の D N Aに対する相補的な D N A。

9. 前項 7に記載の D N Aを複製可能なベクターに組み込んでなる複製可能な組換え体 D N A。

1 0. 前項 6又は 9 に記載の複製可能な組換え体 D N Aで形質転換された微生物または細胞。

1 1 . 前項 1 または 7 に記載の D N Aによリコ一ドされる実質的に純粋なぺプチド。

1 2 . 配列番号 1 のアミノ酸配列を包含してなる前項 1 1 に記載のぺプチド。

1 3 . ( a ) 前項 1 または 7に記載の D N Aを複製可能な発現ベクターに結合して、該 D N Aと該複製可能な発現べクタ一とを含有する複製可能な組換え体 D N Aを得、

( b ) 該複製可能な組換え体 D N Aで微生物または細胞を形質転換させて形質転換体を形成せしめ、

( c ) 該形質転換体を該微生物または細胞の親細胞から選別し、

( d ) 該形質転換体を培養して、該形質転換体に該 D N Aを発現させ、

( e ) 該ペプチドを培養した形質転換体から実質的に単離する、ことを包含する方法によって製造されうるペプチド。 1 4. 少なくとも配列番号 1 のアミノ酸配列を包含してなるペプチドと結合しうる抗体。

1 5 . 図 1 の制限酵素地図に示される制限酵素切断部位によリ特徴付けられるヒト由来の全長 D NAの少なくともべプチドコ一ド領域を包含する D N A及び配列番号 2の 1 一 1 3 5 の塩基配列を含む D N Aにハイブリダイズしうる D N Aより成る群よリ選ばれる少なくとも 1種の D N Aがコードするベプチドを、該ペプチドに結合しうる物質を含有すると考えられる被検体と接触せしめ、該ペプチドと該ペプチドに結合しうる物質との結合に対応して起きる変化を指標として、該ぺプチドに結合しうる物質の検出を行うことを特徴とする検出方法。

1 6 . 図 1 の制限酵素地図に示される制限酵素切断部位によリ特徴付けられるヒト由来の全長 D N Aの少なくともぺプチドコード領域を包含する D N A及び配列番号 2 の 1 一 1 3 5 の塩基配列を含む D N Aにハイブリダィズしうる D N Aより成る群よリ選ばれる少なくとも 1種の D N Aがコードするぺプチド及び該ペプチドに結合しうる物質を、該ペプチドと該ぺプチドに結合しうる物質との結合を阻害しうる物質を含有すると考えられる被検体と接触せしめ、そして該ペプチドと該ぺプチドに結合しうる物質の結合に対応して起きる変化を指標として、該ペプチドと該ペプチドに結合しうる物質との結合を阻害しうる物質の検出を行うことを特徴とする検出方法。

以下、本発明について具体的に説明する。

尚、本発明において、塩基配列中の Aはデォキシアデニル残基、 Cはデォキシシチジル残基、 Gはデォキシグァニル残基、 Tはチミジル残基を示す。

また、 A l a はァラニン、 A r gはアルギニン、 A s nはァスパラギン、 A s p はァスパラギン酸、 C y s はシスティン、 G 1 nはグルタミン、 G 1 uはグルタミン酸、 G 1 yはグリシン、 H i s はヒスチジン、 I 1 e はイソロイシン、 L e uはロイシン、 L y s はリジン、 M e t はメチォニン、 P h e はフエ二ルァラニン、 P r o はプロリン、 S e r はセリン、 T h r はスレオニン、 T r p はトリプトファン、丁 y r はチロシン、 V a 1 はノリンである。

更に、本発明において「ペプチド」とは、一般的に当業者にペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、蛋白質等として理解されているものを含む。

本発明の D N Aは、図 1 の制限酵素地図に示される制限酵素切断部位にょリ特徴付けられる全長 D N Aの少なくともべプチドコード領域を包含する単離された D N Aである（以下 . 屡々、このペプチドコード領域を含む遺伝子を総称的に「H G I R」と呼ぶ）。本発明の D N Aの好ましい例としては、上記ペプチドコード領域が配列番号 1 の 1一 4 2 3のァミノ酸配列を包含するぺプチドをコ一ドする塩基配列である D N Aが挙げられる。ょリ具体的には、配列番号 1 のアミノ酸配列を包含するペプチドをコードする塩基配列が、配列番号 2 の塩基配列である D N Aが例示される。配列番号 1 のアミノ酸配列を包含するペプチドはその特徴を有する配列であればよく、従って上記べプチドをコ一ドする塩基配列に一個またはそれ以上の塩基の置換、欠損または付加があってもよい。例えば、公知のぺプチドをコ一ドする塩基配列を付加して融合蛋白とすることも可能であって、具体的には F L A Gぺプチドと称されるマーカーぺプチド CBioTechnology、 1205- 12 10(1988)〕との融合蛋白をコードする塩基配列が例示される。この融合蛋白は、 F L A Gぺプチドに対する抗体等で検出することができる点で好ましいものである。配列番号 1 の 1 ― 1 6 のァミノ酸配列をコードする塩基配列は、シグナルぺプチドをコ一ドしている可能性もあるので、本発明のぺブチドとしては、この部位が除去されたぺプチドも好ましい例として開示される。また、配列番号 1 のアミノ酸配列を包含するぺプチドをコ一ドする遺伝子の上流または下流に、各種のァミノ酸残基またはポリべプチド残基をコードする D N Aを含有してもよい。更に、上記制限酵素地図に示される制限酵素切断部位によリ特徴付けられる全長 D N Aの好ましい例としては、配列番号 2の塩基配列を含む配列番号 3 の塩基配列の D N Aが挙げられる。これらは、ヒ卜から取得しうる遺伝子情報を有するヒト由来の D N Aであることが好ましい。

本発明は、上記の種々の D N Aによリコードされる実質的に純粋なペプチドも包含する。好ましくは、配列番号 1 の 1 一 4 2 3のアミノ酸配列を包含するペプチドが例示される。本発明の D N Aを調製するに際して用いられる細胞は特に限定されないが、ずリ応力に対して応答を示す細胞が好ましく、特に接着性の細胞、例えば血管内皮細胞、好ましくはヒト血管内皮細胞、特に好ましくはヒトさい帯静脈内皮細胞 (H U V E C ) が挙げられる。この血管内皮細胞はヒトさレヽ帯よリ、細胞、 1、 329 ( 1988)または Human Cel l, 1, 188 ( 1988) に記載の方法に従って容易に分離できる。また、分離済みの二次培養細胞を入手し、利用することも可能である。血管内皮細胞の継代数は血管内皮細胞としての性質を保持するものであれば特に限定されないが、 1 0継代以内のものが好ましい。細胞は単独もしくは二種類以上を同時に用いることが可能である。

本発明においては、灌流培養を行って細胞にずリ応力を負荷する。培養細胞にかけるずり応力は、細胞が産生する遺伝子の発現が変化しうる程度の強度であれば特に限定されないが、通常は 0 . I d y n e Z c m² 以上であればよく、好ましくは 1 . 5 d y n e s Z c m² 以上、更に好ましくは 1 5 d y n e s / c m ² 以上である。また、上限としては細胞を破壊したり、培養装置の接着面に接着せずに浮遊させてしまう程の強度でなければ特に限定されず、また、動力的な経済効率も考慮して選択すればよいが、通常は 1 ， O O O d y n e s Z c m ² 以下、好ましくは 2 5 d y n e s Z c m ² 以下である。培養細胞にかけるずリ応力の値を変化させることによって、生体内の動脈系内皮細胞や静脈系内皮細胞が受けているずリ応力と同じずリ応力下で内皮細胞を培養することができる。ずり応力の値は次に示す方法にて求めることができる。

( 6 X灌流培養液の流量）

ずり応力 =灌流培養液の粘度 X

(培養装置の流路の幅 X流路の高さ ²) つまリ、培養液の粘度、培養液の流量、さらに流路の形状の変化により、容易にずり応力の値を変化させることができる , c D N Aライブラリーを作製するに際しては細胞に負荷するずり応力の平均値は、上記の範囲内にあることが好ましい。ずリ応力を負荷することができる培養装置としては、回転円板型！: Bio rheo logy、、 461 ( 1988)〕、平行平板型〔B i o I e c h n o logy and Bioengineer

1021 (1985)〕及びマイクロキヤリア型〔日本国特開平 4 — 1 7 9 4 7 6 号公報〕等が利用できるが、平行平板型が好ましい。流路の幅と高さが同じではない培養装置では、細胞の接着した面によってその細胞に負荷されるずリ応力は異なるが、流路の形状が平面に囲まれた四角柱である培養装置では接着面を選んで細胞にずり応力を均一に負荷することが可能である。例えば、いずれかの一面にのみ細胞を接着するか、またはいずれかの一面及びその面に相対する面の両面に細胞を接着し、その側面には接着しな 1

いことで、全ての細胞に均一なずリ応力を負荷することが可能となる。

細胞の培養に用いる培養液として公知の組成を用いることができる。例えば、血管内皮細胞の場合には、ゥシなどの動物の血淸を 0 〜 2 0 %添加した細胞培養用培地を用いることが好ましい。具体的には E — G M U V培地（ 2 %ゥシ胎児血清含有、日本国、クラボウ社製）あるいは M l 9 9培地にゥシ胎児血淸を 2 0 %添加したものが挙げられる。さらに、培養液中に E C G S 〔 Endothe l ia l cel l growth supp lemen门、 E G F [Ep i derma l growt h f acto r ! journa l o f Ce l l Bio lo y, 、 774- 788 (1978)〕あるいは b a s i c — F G F 〔 Fibrob l as t growth ί ac t o r； J ou r na 1 of Ce l l Bio logy, 7_7, 774-788 (1978) 〕等の細胞増殖因子を添加することにより、細胞の增殖を良くすることも可能である。また、デキストラン等を添加によリ培養液の粘性を上昇させ、培養細胞に高いずリ応力を負荷することも可能である。

血管内皮細胞の培養条件は特定されるものではないが、例えば、以下に示す条件で培養を行う。培養装置の細胞培養面に血管内皮細胞を敷石状に接着させ、培養条件を設定する。培養温度は細胞が培養可能な温度であるならば特に限定されないが、 3 7でが好ましく、更に 5 %の二酸化炭素ガスを満たしたふ卵器内にて行うことが好ましい。細胞数は銬型 c D N A調製に必要な m R N Aが抽出可能な数であれば特に限定されないが、通常の培養で行われる程度の数が挙げられ、好ましくは 1 X 1 0 ⁴ 個以上、特に好ましくは 1 X 1 0 ⁶ 個以上が挙げられる。培養時間は、静置培養に比べて明らかに発現状態が変化し、且つ細胞の生存状態が良い時間であれば特に限定されないが、好ましくは 6 時間以上 4 8時間以内が举げられる。

ずリ応力負荷された細胞から m R N Aを抽出する方法は特に限定されないが、 R N Aの物理的及び化学的な分解が少ない方法が好ましい。具体的には、例えば、グァニジンを含む溶液で細胞を破砕溶解後、塩化セシウム密度勾配による超遠心にて取得した全 R N Aを、 o l i g o ( d T ) カラムを用いて ρ ο 1 y (A) ⁺ R N Aとして精製する方法が挙げられる。得られた m R N Aを铸型にして c D N Aを合成する方法は特に限定されないが、例えば、 m R N Aの p o 1 y (A) 領域にァニールするプライマ一を用い、逆転写酵素にて一本鎖 c D N Aを合成する方法が挙げられる。この時使用する逆転写酵素は、踌型である m R N Aと同じ長さの c D N Aを合成可能な酵素であれば特に限定されないが、例えば SUPERSC RIPT II 逆転写酵素（米国、 GIBCO BRL社製）が挙げられる。得られた一本鎖 c D N Aは E. Co 1 i DNA po lymerase Iを用いて二本鎖 c D N Aとして取得することも可能である。

c D NAはそのままの状態で铸型として使用することも可能であるが、ベクタ ·挿入後、宿主細胞へ導入せしめ c D N Aライブラリーとすることが好ましい。 c D N Aライブラリーとすることによリ、 c D N Aの安定な保持とともに、導入した細胞を培養することで常に c D N Aを増幅して供給することが可能になる。 c D N Aライブラリー作製の方法は特に限定されないが、例えばリンカープライマー法が挙げられる。この場合の c D N A合成の際に使用するプライマーは、特に限定されないが、特定の制限酵素を用いて合成した c D N Aを消化することで、ベクターのクローユング部位と対合末端を生じ、 c D N Aのべクタ一への挿入を容易にするものが好ましく、例えば、「遺伝子ライブラリーの作製法」（野島博編、日本国、羊土社）に記載されたリンカ一プライマーが挙げられる。このリンカープライマーを用いると、合成した c D N Aを制限酵素 N o t I で消化した際に c D N Aの p 0 1 y (A) 領域下流の 3 ' 末端に N o t I 末端を生じるので、ベクターの N o ΐ I 部位への c D N Aの挿入が容易になる。この場合、 N o t I は認識配列中の特定のデォキシシチジン残基がメチル化を受けていると切断しないことから、 m R N A由来の c D N A配列中に N o t I 切断部位があっても c D N Aが消化されないように、一本鎖 c D N A合成の際に 5 —メチルデォキシシチジン一 5 ' —三リン酸をデォキシシチジン一 5 ' —三リン酸の代わりに供給することが好ましい。また、 c D N Aの 5 ' 末端と 3 ' 末端にそれぞれ異なる制限酵素末端を作製することでベクターへ一方向に挿入することが可能となる。この制限酵素末端作製の方法は限定されないが、制限酵素アダプターを用いる方法が好ましく、具体的には E c 0 R I アダプターが例示される。 c D N A合成後にこの E c 0 R I アダプターを連結することで、 c D N Aの 5 ' 末端に E c o R I 末端を生じ、ベクターの E c o R I 部位への挿入が容易になる。つまリ、 5 ' 末端に E c o R I 末端、 3 ' 末端に N o ΐ I 末端を有する c D N Aが得られ、ベクタ一の E c o R I と N o t I 部位に一方向に揷入することが可能となる。 c D N Aを保持するべクタ一は各 c D N Aを安定に保持するものであれば特に限定されないが、例えばプラスミドベクターが挙げられる。好ましくはプラスミドベクター P S I (米国、プロメガ社製）が挙げられる。 p S I を制限酵素 E c o R I と N o t I で消化して得たベクターアームと、 E c o R I と N o t I 末端を有する c D N Aをライゲ一ションさせ、大腸菌へ導入することで、多くの種類の c D N Aを保持する c D NAライブラリーが効率よく得られる。プラスミドベクター p s ！は動物細胞において発現可能なプロモーター S V 4 0 e a r 1 y を有する。このプロモーターの下流に c D N Aを 5 ' 側からの一方向に挿入して組換え体プラスミドを作成し、得られた組換え体プラスミドを動物細胞へ導入することで c D N Aの発現を可能とし、 c D N Aがコードするタンパク質を直接発現させ、取得することができる。上記のように c D N Aライブラリーを動物細胞に導入してム

作成したぺプチドを用い、ぺプチドに関連した活性を検出することで、活性物質の探索、さらにはその物質をコードする遣伝子を容易にクローン化することもできる。つまリ、活性物質と構造上相同性があるフアミリーに属する遺伝子をクロ一二ングする場合には、そのファミリーに属する既知の遺伝子からプローブ D N Aやプローブ R N A、 P C R (po lymeras e cha in react ion)ブライマー等を設計し、 c D N Aライブラリーを铸型にして、ずリ応力負荷時に発現する遣伝子を効率的に容易にクローン化することも可能である。

この c D N Aライブラリ一は、ずリ応力を負荷した血管内皮細胞の特徴を反映していることから、生体内血管の低ずリ応力部位に起こる疾患、具体的には動脈硬化等の発症に関わる生理活性因子やその他関連遺伝子の研究に大きく寄与する。更には、この c D N Aライブラリ一を用いた上記因子や遺伝子の単離、それら因子や遺伝子をコントロールする医薬品の開発の可能性も考えられる。また、この c D N Aライブラリ —は他の細胞、具体的にはずり応力を負荷していない血管內皮細胞から抽出した m R N Aを用いて作製した c D N Aライブラリー等とは、含有する遺伝子の種類及びその含有量が異なる。つまリ、その差を指標に前述の関連遺伝子、あるいはそれがコードするペプチドを単離することも可能である。ずリ応力を負荷した際に発現量が変化する遣伝子のクロ一ニングには、 Subt ract i v e Hybr i di zat ion [Proceed i ngs of t h e Nat iona l Academy of Sc i ences of the Un i t ed St at es o f A me r i ca, 8 > 2825- 2829 (1991)〕や Di f f erent i a l Di sp l ay〔Sc ien ce 257 967 - 971 (1992)〕等の方法を利用することができる。また、既知の生理活性因子の遺伝子発現量をこの c D N Aラィブラリーを用いて解析することも可能でぁリ、その因子の前述の疾患等への関与を解析することも可能である。

c D N Aライブラリ一から、本発明の D N Aを調製する方法としては、 D e g e n e r a t e P C Rプライマーを用いたファミリー遣伝子クローニング法 [Proceed ings o f the Nat iona l Academy o f Sc iences o f the Uni t ed St a tes of Amer i ca, 16, 1603- 1607 ( 1989), Sc iences, UA, 569 - 572 ( 1989 )) を参考に行うことができる。具体的には、例えば、配列番号 4 および 5 に記載された D N Aをプライマ一として、 P C R 法によリ遺伝子を增幅することができる。配列番号 4 および 5 に記載された D N Aをプライマーとした場合には、増幅後に調製される D N Aは本発明の遺伝子の一部断片でぁリ、該プライマーに挟まれる D N A断片（即ち、配列番号 2 の 5 1 1 一 1 0 2 1 の塩基配列）が得られる。増幅して得た断片はベクター上にクローン化することが好ましい。さらに、遺伝子全長をクローン化するには、例えば、先にク口一ン化した D N A断片の全てあるいは一部断片や、配列番号 2 あるいは 3 の塩基配列またはその断片をプローブ D N Aとして用い、ハイブリダイゼイション法にて c D N Aライブラリーより陽性クローンを取得する方法が挙げられる。この時用いられる c D N Aライブラリーは本発明の D N Aが含まれるものであれば特に限定されないが、例えば、具体的には Human Brain 5， - St retch Plus cDNA Library (米国、 CLO NTECH 社製）が挙げられる。また、ハイブリダィゼイシヨンの方法は用いる c D N Aライブラリ一の特徴によリ適宜選択して実施すればよいが、好ましくはプラークハイプリダイゼイシヨン法が挙げられる。また、本願により開示された配列番号 2 または配列番号 3 の塩基配列における 5 ' 末端側およぴ 3 ' 末端側のそれぞれの配列を有する D N Aをプライマーとして P C R法による増幅法によって調製してもよい。尚、本発明者らが調製した後述の Esche r i chia co l i 〗M109/pGlR 10株（FERM BP-5836)を原料とすれば、極めて簡単に本発明の D N Aが入手可能である。

前記した本発明の単離された D N Aは、図 1 の制限酵素地図に示される制限酵素切断部位によリ特徴付けられる全長 D N Aの少なくともぺプチドコード領域を包含する単離された D N Aである。更に本発明の単離された D N A として、前記 D N Aの部分配列を含有する D N Aが举げられる。この部分配列はハイブリダィゼイシヨンやアニーリング等の方法によつて遺伝子 H G I Rを特徴づけることができる長さの連続した配列であり、配列表に示された塩基配列、あるいはその塩基配列に相補的な塩基配列の断片を含む配列である。具体的には、配列番号 1 の 1 — 4 5 のアミノ酸配列をコードする塩基配列の中の少なくとも 1 5塩基の連続した配列を有した配列でぁリ、好ましくは少なくとも 2 0塩基、ょリ好ましくは少なくとも 3 0塩基の連続した配列が挙げられる。この断片において、さらに好ましい態様としては、配列番号 1 の 1 — 4 5 のアミノ酸配列における少なくとも 1 0個（さらに好ましくは 1 5個以上、特に好ましくは 2 0個以上、または 3 0 個以上）の連続したアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる D N A断片か、またはその塩基配列を含有する D N A断片が挙げられる。より具体的には、上記部分アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号 2 の 1 一 1 3 5 の塩基配列が挙げられる。

配列番号 2 の 1 一 1 3 5 の塩基配列の D N A断片にハイブリダイズしうる単離された D N Aについて、ハイブリダイゼイションの方法は特に限定されないが、ドットブロットハイブリダィゼイシヨン、サザンブロットハイブリダィゼイション、ブラ一クハイブリダィゼイシヨン、あるいはコロニ一ハイブリダィゼイシヨン等を利用することができる。

上記のハイブリダィズしうる単離された D N Aをプローブとして用い、ハイプリッドを形成させてターゲットとなる D N Aを検出することができる。その方法は特に限定されないが、例えば上記のハイプリダイゼイション法を挙げることができる。より具体的には、ターゲットとなる D N Aを固定したメンブランと標識したプローブ D N Aをハイブリダイゼィシヨン溶液中で一定温度にて一定時間保温後、プローブを検出することでターゲットとなる D N Aを検出する方法が挙げられる。また、ハイブリダィゼイシヨンの条件は特に限定されないが、例えば以下の条件で行うことができる。タ一ゲットとなる D N Aを固定したメンブランをプレハイブリダイゼイシヨン溶液〔 5倍瀵度 S S P E { 0. 9 M塩化ナトリウム、 5 0 mMリン酸ナトリウム及び 5 mMの E D T A ( p H 7 . 7 ) } 、 5倍濃度 D e n h a r d t ' s 液（各 0 . 1 %の：8 S A , フイコール及びポリビエルピロリドン）及び 0 . 5 % S D Sからなる液に終瀵度 1 0 0 μ g / m 1 となるように変性サケ精子 D N Aを加えたもの〕中にて 5 0 °Cで 3 時間保温後、変性した³² P標識プローブ D N Aを終濃度 1 X 1 0⁶ c p m/m 1 となるように添加し、さらに 5 0 °Cで 1 2時間保温し、保温後のメンブランを十分量の洗浄液〔 2倍濃度 3 3 C ( 0 . 3 M塩化ナトリウム及び 0 . 0 3 Mクェン酸ナトリゥム）及び 0 . 1 % S D S〕を用いて室温で二回洗浄後、十分量の新しい洗浄液中で 5 0 °Cにて 2 0分の振盪保温を二回行う。上記したメンブランは D N Aが固定するものであれば特に限定されないが、通常二トロセルロースやナイ口ン製のものが使用される。プローブ D N Aの標識は特に限定されないが、 ³² P、 ³³ Pあるいは³⁵ S といった R I 標識のほ力、ビォチン、ジゴキシゲニンなどの非 R I 標識を用いることができる。ハイプリダイゼイション反応後にそれぞれの標識に最適の検出法によリハイプリダイゼィションの有無を確認することができる。ハイプリダイゼイション溶液は特に限定されないが、ホノレムアミド、 S S P E、 S S C、 D e n h a r d t ' s 液、 S D S及びサケ精子 D N A等を用いて調製することができる。

本発明における上記 D N Aに対する相補的 D N Aは、周知の塩基対の法則（ Aと Tが対になリ、 C と Gが対になる）によって得ることができる。また、上記 D N A及びその相補的 D N Aに対する相補的 R N Aも、周知の塩基対の法則（Aと Uが対になリ、 C と Gが対になる）によって得ることができる。上記 D N Aあるいはその断片に対する相補的 D N Aまたは R N Aは、一般的にアンチセンスとして用レヽられる。具体的に配列番号 3の 1 一 1 5 6 2の D N Aあるいはその断片に対する相補的 D N Aまたは R N Aは、 H G I Rがコードするペプチドの発現を調節する分子として利用することができる。相補的 D N A又は R N Aをアンチセンスとして用いる方法は特に限定されないが、具体的には、例えば H G I Rを発現する培養細胞や実験動物に H G I Rのアンチセンスを添加し、 H G I Rの発現の抑制によって生じる変化から、 H G I 尺がコードするペプチドの機能を解析することができる。さらに、該ペプチドの合成を抑制することを目的としてアンチセンスをヒトに投与することは、該ペプチドの生理機能の異常に関係する疾患の治療に有用である。このアンチセンスの投与法は特に限定されないが、例えばアンチセンスを合成して適当な溶媒に溶解後、そのまま投与する方法や、アンチセンス配列を含む断片を適当なベクターに組み込み、その組換え体 D N Aを投与して細胞内、あるいは生体内でアンチセンスを合成するように設計して投与する方法も利用できる。

本発明者らは、血管內皮細胞のずリ応力に応じて発現する新規遗伝子についての研究を行うと同時に、ヒトに特異的な遣伝子を求めて検討も同時に行った。生理活性物質やレセプター等の蛋白は、通常生物種にょリ配列が異なり、関連した蛋白をそれぞれの生物が有するとしても、ある生物種に由来する該蛋白を異なる生物種に与えても反応性や効果に差があることが予想される。従ってヒトに特異な蛋白を取得することが、ヒ卜の医薬分野の将来の展開に極めて好ましいことは論を持たない。

本明細書の実施例にも詳述しているが、本発明の H G I R 遣伝子を取得するに際して、本発明の H G I R遺伝子の全長を含む c D N A (即ち、配列番号 3の 1 — 1 5 6 2 の塩基配列）を取得した。この c D N Aの上流側の約 2 7 0 b p の断片からなる D N A断片（即ち、 p G I R 1 0 を常法に従って制限酵素 E c o R I および E a e I にて消化して得られる配列番号 3の 1 一 2 6 5の塩基配列を含む D N A断片）を作製し、マウス染色体 D N Aに対するハイブリダイゼイションを行ったが、陽性シグナルを検出することはできなかった。この結果、この H G I R遺伝子をヒトに特徴的なものであると判断した。ところが引き続き行ったこの H G I Rの塩基配列の決定の完了後、この決定されたアミノ酸配列を基に、既知の蛋白質データベース上でホモ口ジー検索を行ったところ、マウス由来の G蛋白質共役レセプタ一遣伝子 !: Molecular End ocrino logy、、 1331 - 1338 ( 1991 )〕がコードするアミノ酸配列と高い相同性が確認された。本発明の H G I R遺伝子の塩基配列を決定してから判明したことであるが、上記のハイプリダイゼイションにて、陽性シグナルを全く検出することができなかったという実験結果は、実験の誤リではなく、このマウス由来の G蛋白質共役レセプター遺伝子の塩基配列から考えて、当然の結果であることが認められた。両者の配列は完全に一致しているものではなく、上記実験結果からも、両者は相違する遣伝子と判断することが妥当である。

いずれにしても、従来公知のマウス由来の G蛋白質共役レセプター遺伝子と相違するヒト由来である本発明の H G I R 遺伝子は、今までに取得されていない新規な遺伝子であることが明らかとなった。さらに本発明は、上述した本発明のいずれかの D N Aを含有することを特徴とする組換え体 D NAである。

本発明における組換え体 D N Aを調製するために用いられるプラスミドとしては特に限定されないが、通常用いられるプラスミドを利用することができる。本発明の組換えプラスミドの具体的な例としては、 p G I R 1 0、 p G I R 2 0、 p E G I R l 1 、及び p E G I R l 2— F L A Gが举げられる。 P G I R 1 0及び P G I R 2 0 はクローニングベクター p U C l 1 8の E c 0 R I s i t e に本発明の遺伝子 H G I Rを含む約 1 . 5 k b p の D N A断片を挿入した組換えプラスミドであり、それぞれ D N A断片が逆方向に挿入されてレヽる。図 3 には、 p G I R 1 0並びに P G I R 2 0 の制限酵素切断部位並びに機能地図を示す。即ち、図 3 の H G I Rを含む D N Aに示す矢印は、それぞれ H G I Rの蛋白質をコードする領域約 1 . 2 k b p を蛋白質の N末端側から C末端側の方向で記載したものである。また、この H G I Rを含む D N A断片は図 1 に示す制限酵素切断部位を有することを特徴とする。組換えプラスミド P G I R 1 0 を導入して得た形質転換体は Escherichia co 1 i (ェシエリヒア ' コリ） J M 1 0 9 Z P G I R 1 0株（ F E RM B P— 5 8 3 6 ) として平成 8年 3月 2 9 日（原寄託日）に工業技術院生命工学工業技術研究所 [日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1番 3号（郵便番号 3 0 5 ) "1 に寄託されている。また、 p E G I R l l 及び P E G I R 1 2 — F L A Gは、 p G I R l O を原料に実施例に示した方法にょリ容易に構築することができる。具体的には、 p G I R l O に含まれる H G I R遺伝子の 5 ，側の非翻訳領域及び 3 ' 側の非翻訳領域を合成 P C Rブライマーを用いた P C R法によリ欠失した H G I Rのペプチドコード領域を含む約 1 . 3 k b pの断片を、動物細胞において働く発現べクタ一 p c D N A 3. 1 (+ ) に導入することによリ発現プラスミド p E G I R l 1 を構築することができる。また、 H G I Rの 3 ' 末端に F L A Gペプチドと称するマーカーぺプチドをコードする塩基配列を付加する様に設計した P C R プライマーを用いて、同様の方法にょリ改変体発現プラスミド P E G I R 1 2 — F L A Gを構築することができる。

また、本発明の組換え体 D N Aは公知の宿主に導入することが好ましい。即ち、本発明の組換え体 D N Aで形質転換された微生物または細胞である。

本発明の実質的に純粋なぺプチドとしては前記の D N Aあるいは D N A断片がコ一ドするアミノ酸配列からなるぺプチドが好ましい。特に、配列番号 1 の 1 — 4 5 のアミノ酸配列を包含するぺプチドが好ましい例として挙げられる。

本発明において配列番号 1 のァミノ酸配列を包含してなるぺプチドは、配列番号 1 のアミノ酸配列の上流または下流に各種のアミノ酸残基またはポリべプチド残基を含有してもよい。具体的には、配列番号 1 のアミノ酸配列において、アミノ末端側の M e t の上流にさらに一個または複数個のァミノ酸残基を有してもよく、そのアミノ酸残基としては、例えばシグナル様ペプチドが挙げられる。同様に、カルボキシル末端側の S e r の下流にさらに一個または複数個のアミノ酸残基を有してもよい。さらに本発明のペプチドは、配列番号 1 に示したアミノ酸配列を持つペプチドあるいはその一部断片として該ペプチドの特徴を保持する配列であればよく、好ましくは 5 アミノ酸以上、さらに好ましくは 1 0 アミノ酸以上、特に好ましくは 2 0 アミノ酸以上の連なった長さのアミノ酸が例示される。

本発明のペプチドを取得する方法は特に限定されないが、具体的には、例えばアミノ酸配列の情報をもとに合成ぺブチドを調製する方法またはペプチドをコ一ドする遺伝子を宿主細胞に導入してペプチドを合成する方法が挙げられる。合成ぺプチドを調製する方法は特に限定されないが、カルボキシル基を保護したアミノ酸に、アミノ基を保護したアミノ酸を順次縮合させていく方法や、オリゴぺプチドをカツプリングさせる方法などが挙げられる。またペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞に導入してぺプチドを作成することができる。この方法によって得たペプチドは、（ a ) 前述の本発明の D

N Aを複製可能な発現ベクターに結合して、該 D N Aと該複製可能な発現ベクターとを含有する複製可能な組換え体 D N

Aを得、

( e ) 該ペプチドを培養した形質転換体から実質的に単離する、ことを包含する方法によって製造されうるペプチドである。この方法は特に限定されないが、目的のペプチドをコードする遺伝子、具体的には、例えば配列番号 2 の塩基配列を含む D N Aを宿主細胞内で働くプロモータ一の下流につないで得た組換え体 D N Aを用いて、宿主細胞へ導入後発現させてぺプチドを得ることが好ましい。

宿主細胞としての微生物または細胞は特に限定されない力動物細胞であることが好ましく、具体的には、アフリカミドリザル腎由来の C O S — 7細胞や C O S— 1細胞、チヤィニーズハムスター卵巣由来の C H O— K 1 細胞等が挙げられる。

プロモーターは宿主細胞內で効率的に働くものであれば特に限定されず、例えばヒトサイトメガロウィルス（ C MV) の I E (immediate ear ）遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターの下流に H G I Rをつないだ組換え体 D N Aとしては特に限定されないが、例えば上記した p E G I R l 1 あるレヽは P E G I R 1 2 — F L A Gが挙げられる。組換え体 D N Aを宿主細胞へ導入し H G I Rを発現させることで、コードするペプチドを容易に取得することができる。取得したぺプチドは硫酸アンモニゥム分画やカラムクロマトグラフィーなどの方法を用いて単離精製することができる。

本発明の遣伝子 H G I Rによリ転写される m R N Aの量を調べたところ、静置培養した血管内皮細胞に比べ、ずリ応力負荷した血管内皮細胞において m R N Aの量が多いこと、さらに、血管内皮細胞にかかるずり応力の値に応じて m R N A の量が変化することが確認された。従って、血管内皮細胞における H G I Rより転写される m R N A量を測定することで、その内皮細胞にかかるずリ応力値を間接的に測定することが可能である。 m R N A量の解析法としては特に限定されないが、例えば配列番号 3 に示した H G I Rの c D N A配列から作成したプロ一ブ D N Aやプローブ R N A、 P C Rプライマ —等を用いた、ノーザンハイブリダィゼイシヨン、 i n s i t u ハイブリダィゼイシヨンや逆転写 P C R法などの解析法が用いられる。

また、遺伝子にょリ転写される m R N A量の増加は遺伝子がコードするペプチド量の増加を意味していることから、血管内皮細胞に存在する H G I Rがコードするぺプチドの量を測定することで、その内皮細胞にかかるずリ応力値を間接的に測定することも可能である。細胞または組織中の H G I R がコードするぺプチドの確認方法は特に限定されないが、例えば目的の細胞または組織よリ得られた抽出液をウェスタンブロッテイングに供し、抗体を用いて検出する方法、細胞膜表面上のぺプチドを直接免疫染色にて調べる方法ゃフローサィトメトリー法にょリ解析する方法が挙げられる。

本発明の抗体を取得する方法は特に限定されないが、例えば、上述の方法にょリ取得したペプチドを動物に接種し、そのペプチドに対する抗体を含む抗血清を取得する方法が簡便な方法として挙げられる。抗体を作製するためのぺプチドとしては、配列番号 1 のアミノ酸配列を包含してなるぺプチドあるいはその一部断片が挙げられ、これらべプチドは上述の方法にょリ合成することができる。ペプチドの長さは H G I Rがコードするペプチドとして特徴付けられる長さであれば特に限定されないが、例えば好ましくは 1 0アミノ酸以上、よリ好ましくは 2 0 アミノ酸以上のぺプチドが挙げられる。このペプチドをそのまま、または K L H (keyho 1 e-1 impet hemocyan in) や B S A (ゥシ血淸ァノレブミン）とレ、つたキヤリァ蛋白質と架橘した後に必要に応じてアジュバントと共に動物へ接種せしめ、その血清を回収することで H G I Rがコードするペプチドを認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血淸を得ることができる。また、抗血清よリ抗体を精製して使用することも可能である。接種する動物としては、ヒッジ、ゥシ、ャギ、ゥサギ、マウス、ラット等が挙げられ, ポリクローナル抗体作製にはヒッジまたはゥサギを用いることが好ましい。また、ハイプリドーマ細胞を作製する公知の方法によリモノク口一ナル抗体を得ることも可能であるが、この場合にはマウス由来の細胞が好ましい。

本発明の遺伝子を測定対象とした測定法、例えば上記した m R N A量またはべプチド量の測定法を用いれば、生体内血管の低ずリ応力部位に起こる疾患、具体的には動脈硬化等が発症しやすい領域を検知し、発症を未然に防ぐための予防対策、あるいはその領域の血管内皮細胞機能をコントロールすることによる早期の治療をも可能となる。さらに、 H G I R の発現状態からこの内皮細胞の機能を推測し、ずり応力が負荷された状態における生理活性物質の関与、あるいはずリ応力と関係のある新規な分子を探索することで、疾患発症のメ力二ズムの解明にもつながる。

本発明の遺伝子 H G I Rがコードするぺプチドはレセプタ一として細胞膜上に存在していることが本発明者らの研究にょリ明らかとなった。さらに、本発明の遣伝子 H G I Rの m R N Aの生体内分布、つまリ発現している組織あるいは細胞を、ノーザンハイブリダィゼイシヨンや i n s i t uハイブリダィゼイシヨンといった方法を用いて調べたところ、例えば、ノーザンハイブリダィゼイシヨンによるヒト組織における H G I Rの m R N A分布の解析によれば、本発明の遣伝子は脳において高い分布を示すことが明かとなった。即ち、 H G I Rがコードするペプチドは、生理的には脳において働いていると考えられる。尚、この結果は、本願実施例において H G I Rの全長のクローユングが、ヒト脳由来の c D N A ライブラリーを用いることによリ成功していることと合致するものと考えられる。又、脳における m R N Aの分布を詳細に解析することによリ、ペプチドの機能を更に詳細に解析することができるが、その目的には i n s i t uハイブリダィゼイシヨンが有用である。この方法は、生体由来の組織を約 1 Ο μ πι厚程度に薄くスライスしてスライドグラスに固定後、 H G I Rの m R N Aを検出可能な放射標識あるいは酵素標識等にょリ標識したプローブ D N Aまたは R N Aを適当なバッファ一中でハイブリダィズさせ、標識の種類に応じた最適の方法を用いて検出し、 H G I Rの m R N Aの存在する部位及び細胞を詳細に解析することを可能とするものである。この解析によると、 H G I Rの m R N Aは脳の中でも海馬、視床、視床下部、乳頭体、外側嗅索核、視床腹内側核、背側被蓋核を含む特定の部位に発現していることが認められる。つまリ、この H G I Rがコ一ドするペプチドは、これら部位における中枢神経系に関わる機能を有していると考えられる。特にこれらの発現部位は、中枢機能の中でも情動及び記憶に関与する部位といわれてぉリ、結局、本ペプチドは、中枢神経系において神経伝達物質に対するレセプターとしての生理機能を有しているもの、さらには、情動あるいは記憶に関わる生理機能を有しているものと考えられる。従って、上述の H G I Rがコードするレセプタ一は、該レセプターに結合し作用を引き起こす物質であるリガンド、即ち、該レセプターの機能を亢進する作用のある物質、又は該レセプターの機能を抑制又は阻害する物質を検出することに用いることができ、中枢における神経性疾患、さらに情動あるいは記憶における障害に対しての医薬品への応用を可能とする。

即ち、本発明は、前述したペプチド、即ち図 1 の制限酵素地図に示される制限酵素切断部位により特徴付けられるヒト由来の全長 D N Aの少なくともぺプチドコ一ド領域を包含する D N A及び配列番号 2 の 1 一 1 3 5 の塩基配列を含む D N Aにハイプリダイズしうる D N Aよリ成る群よリ選ばれる少なくとも 1 種の D N Aがコードするぺプチドを用い、該ぺプチドに結合しうる物質を含有すると考えられる被検体と接触せしめ、該ぺプチドと該ぺプチドに結合しうる物質の結合に対応して起きる変化を指標として、該ペプチドに結合しうる物質の検出を行うことを特徴とする検出方法、又は前述のぺプチド及ぴ該ペプチドに結合しうる物質を、該ペプチドと該ぺプチドに結合しうる物質との結合を阻害しうる物質を含有すると考えられる被検体と接触せしめ、そして該ペプチドと該ペプチドに結合しうる物質との結合に対応して起きる変化を指標として、該ペプチドと該ペプチドに結合しうる物質の結合を阻害しうる物質の検出を行うことを特徴とする検出方法である。

本発明の検出方法の典型的な例示としては、該ペプチドに結合しうる物質を含有すると考えられる被検体中の該物質に対して、前述した本発明のペプチドを接触せしめ、該物質に対応して起きる変化を指標として、該物質を検出する検出方法である。

また、本発明の検出方法の別の典型的な例示は、該ぺプチドと、ペプチドに結合しうる物質の存在下にて、該ペプチドとペプチドに結合しうる物質との結合を阻害しうる物質を含有すると考えられる被検体を接触せしめ、該ペプチドとぺプチドに結合しうる物質に対応して起きる変化を指標として、該ペプチドと該ペプチドに結合しうる物質との結合を抑制又は阻害しうる物質を検出する検出方法である。

さらに、本発明の検出方法の具体的態様を示せば、第一の態様としては、該ペプチドに結合する物質、あるいは該ぺプチドと該ぺプチドに結合しうる物質との結合を阻害しうる物質を選び出す為のスクリーユング方法が挙げられる。このスクリーニング方法によれば、中枢における神経性疾患に対する新規且つ有用な医薬品を見出すことが可能となると考えられる。

また第二の態様としては、該ぺプチドに結合しうる物質、あるいは該ぺプチドと該ぺプチドに結合する物質との結合を阻害しうる物質の存在量を測定する測定方法が挙げられる。存在量の測定としては、厳密に定量を行う場合と、その物質の有無を単に判断する場合もあるが、いずれであってもよい _c この測定法を用いることにより、中枢における神経性疾患に対する医薬品の研究のための、有用な測定手段を与えると考えられる。

前述の通リ、 H G I R遺伝子またはその D N A断片を用いて、その D N Aがコ一ドする本発明の実質的に純粋なぺプチドを取得することが可能である。場合によっては、アミノ酸の縮合反応を用いたぺプチド合成によリぺプチドを取得することもできる。本発明のペプチドとしては、細胞膜上に ¾現せしめられた形のペプチド、すなわち該ぺプチドを細胞膜上に発現している細胞自体、上記細胞の細胞膜のみの画分、または、さらに公知の方法によって精製されたペプチド等が考えられ、本発明の検出方法の具体的目的に基づいて各種のぺプチドが利用できる。

該ペプチドに結合しうる物質のスクリーニングに用いる被検体は、特に限定されないが、例えば生理的リガンドが含まれると考えられる生体由来の組織や細胞由来の抽出液又は培養上淸等を用いることができる。この場合、ヒト由来のものがよリ好ましい。また、生理的リガンドの他に、合成化合物や微生物の培養上淸等を用いることによリ、該ペプチドに結合しうる物質を探索することも可能である。また、該ぺプチドに結合しうる物質と該ぺプチドとの結合を阻害しうる物質を含有すると考えられる被検体としても、生体由来の組織や細胞由来の抽出液又は培養上清等、合成化合物や微生物の培養上清等を用いることができる。

該ペプチドに結合しうる物質を検出する方法としては、特に限定されないが、例えば、該ペプチドと検出の対象となる物質の結合によって起る現象を指標として検出する方法や、該ぺプチドを発現する細胞またはその細胞膜画分に、該ぺプチドに結合しうる物質が結合し、該ペプチドの機能に影響を与える際に起こる細胞內のシグナルの変化を指標として検出する方法等が挙げられる。該ぺプチドと該ぺプチドに結合しうる物質との結合を検出する方法としては、特に限定されないが、例えば、該ペプチドに結合しうる物質を予め標識し、該ぺプチド、該ぺプチドを発現する細胞又はその細胞膜画分に添加し、結合しなかった物質を洗浄にょリ除去し、該ぺブチド、細胞又は細胞膜画分に結合した標識量の変化を検出することができる。通常、この手法においては、該ペプチド、細胞あるいは細胞膜画分は、固定相に固定化しておくことが好ましい。この場合、標識の種類は特に限定されず、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、抗原標識、酵素標識等を用いることができる。検出方法は、標識の種類により最適の方法を適宜用いればよい。

—方、該ペプチドをコードする D N Aを発現する細胞または細胞膜画分に結合し、該ペプチドの機能に影響を与える物質を検出する場合には、そのシグナルの変化を捉えることで該ペプチドの生理的機能への影響の有無や強弱を測定することができ、それらを指標にした測定系を構築することも可能である。そのシグナルは細胞内でのシグナル伝達物質の変化等を通して細胞全体へと伝わる。細胞內のシグナルを検出する方法としては特に限定されず、該ペプチドに結合しうる物質が該ペプチドを介して引き起こす細胞内のシグナル変化を検出する方法であればよいが、具体的にはカルシウムイオン濃度、 c A M P濃度、イノシトールリン酸放出量、ホスホリパーゼ C活性等を検出する方法が举げられる。それぞれの検出法は特に限定されず、例えば、カルシウムイオン濃度の測定の場合は、カルシウムイオン感受性蛍光色素 f u r a 2 を用いて蛍光強度を測定する方法や、カルシウムイオン結合性の発光蛋白エタオリンを用いた検出法が挙げられる。

上記検出法の具体的例として、以下に細胞のィノシトールリン酸放出量の測定法について例示する。

H G I Rがコ一ドするぺプチドを発現する細胞をコンフルェント程度に接着培養したものを用意し、リン酸緩衝生理食塩水 C P B S (― ) ( 1 3 7 mM塩化ナトリウム、 2 . 7 m M塩化カリウム、 4 . 3 mMリン酸水素ニナトリウム及び

1 . 4 mMリン酸二水素カリウム）〕にて細胞を洗浄後、 l O C i Zm l の m y o — [ 2 - ³ H ) i n o s i t o 1 及び 1 0 %ゥシ胎児血淸を添加した i n o s i t o 1 非含有培養液にて 2 4時間培養する。培養液を除き、細胞を P B S (一）を用いて洗浄後、 1 0 mM塩化リチウムを含む i n 0 s i t o 1 非含有培養液にて 1 0分間培養する。培養液を除いた細胞に、適当量の該ペプチドに結合しうる物質を含む検体並びに 1 O mM塩化リチウムを添加した i n o s i t o 1 非含有培養液を加え、約 2 0分間培養する。培養液を除き、直ちに 1 O mMの氷冷蟻酸を加えて氷上に 2 0分間静置する <

1 O mMアンモニア液を加えて中和した後、この全細胞抽出物を 5 mM四ほう酸ナトリゥム及び 6 O mM蟻酸ナトリゥムからなる溶液にて平衡化した陰イオン交換カラム A G 1 - X 8 (米国、 B I 0- RAD 社製）に放出したイノシトールリン酸を吸着させる。カラムを、カラム担体の 1 0倍量の水、つづいて 1 0倍量の 5 m M四ほう酸ナトリゥム及び 6 O m M蟻酸ナトリゥムからなる溶液を用いて洗浄後、イノシトールリン酸を 1 M蟻酸アンモニゥム及び 0 . 1 M蟻酸からなる溶液を用いて溶出する。溶出液の一部に液体シンチレーシヨンカクテルを加えてよく混合し、液体シンチレーシヨンカウンターを用いて放射量を測定する。

また、これら測定法は定量的解析が可能であるため、測定値の変化から該ペプチドに結合しうる物質の存在量やその活性の強弱を解析することができる。

さらに、該ペプチドと該ペプチドに結合しうる物質との結合を検出する系や、該ペプチドに結合しうる物質による細胞内シグナル変化を検出する系を用いることにより、該ぺプチドと該ペプチドに結合しうる物質の存在下に、該ペプチドに結合しうる物質と該ペプチドとの結合を阻害しうる物質を含有すると考えられる被検体を添加し、被検体無添加群と被検体添加群の測定値の比較から、該ぺプチドと該ぺプチドに結合しうる物質との結合を阻害しうる物質の探索やその存在量の測定、さらにその活性の強弱を解析することができる。添加される該ペプチドに結合しうる物質としては、前述の該ぺプチドに結合しうる物質が用いられる。また、該ペプチドに結合しうる物質と該ぺプチドとの結合を阻害しうる物質を含有すると考えられる被検体としては、特に限定されないが、生体由来の組織や細胞の抽出物や培養上淸、あるいは合成化合物や微生物の培養上清、さらには上述した方法にょリ取得した該ぺプチドに対する抗体等が挙げられる。

かくして得られた該ペプチドに結合しうる物質、あるいは該ペプチドに結合しうる物質と該ペプチドとの結合を阻害しうる物質は、このべプチドの生理的機能をコントロールする医薬品への応用を可能にする。

発明を実施するための最良の形態

以下、実施例に基づいて本発明をよリ詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。実施例 1

ヒトさい帯静脈内皮細胞（H U V E C ) のずリ応力負荷と m R N A 〔 p o 1 y (A) ⁺R N A〕の調製

( 1 ) H U V E Cの培養

HU V E C ( E n d o c e l 1 — U V、日本国、クラボウ社製）は 3次継代細胞を用いた。細胞培養装置は図 2 に示した日本国特開平 7 - 2 7 4 9 9 4号公報に記載の平行平板型ずリ応力負荷培養装置の大型のものを使用した。 1 5 0 mm φ のプラスチック製ディッシュ（デンマーク国、 nunc 社製）にガラス製カバースリップ（ P Y R E X、 9 4 X 5 2 X 1 . 0 mm、米国、 Corning 社製）を静置し、 1 %のゼラチン

(ゥシスキン由来、米国、シグマ社製）を含む生理食塩水 5 m l を注ぎ、 4 °Cにてー晚放置し、ゼラチンコート処理カバースリップとした。新しい 1 5 0 m m φディッシュに培養液

( E - G M U V、日本国、クラボウ社製）で洗浄したゼラチンコート処理カバースリップを静置し、 1 . 0 X 1 0⁴ 個 / c m ² となるように H U V E Cを植え付けた。平行平板型ずり応力負荷培養装置にカバースリップをセットし、 5 %の二酸化炭素ガスを満たした 3 7 °Cのふ卵器内で 1 5 d y n e s / c m² のずリ応力を負荷するように 8時間灌流培養を行なった。

( 2 ) 細胞からの m R N Aの抽出

ずり応力負荷した細胞はカバースリッブごと装置よリ取リだし、予め 3 7 °Cに保温しておいたリン酸緩衝生理食塩水

C P B S (一）（ 1 3 7 mM塩化ナトリウム、 2 . 7 mM塩化カリウム、 4 . 3 mMリン酸水素ニナトリウム及び 1 . 4 mMリン酸二水素カリウム）〕にて洗浄後、 0 . 7 m l のグァニジン溶液〔 4 Mグァニジンチォシアン酸塩（スイス国、 Fluka Chenie AG 社製）、 2 0 mM酢酸ナトリウム（ p H 5 . 2 ) 、 0 . I mMジチオスレィトール（D T T、米国、シグマ社製）及び 0 . 5 % N— ラウロイルサルコシンナトリウム

(米国、シグマ社製）〕を用いて付着細胞を剥がした。 2 1 Gの注射針を装着した 1 m 1 の注射筒を用いて細胞を含む溶液を 1 0回ほど出し入れし、細胞を完全に破砕した。この溶液を 1 . 5 m l 容のマイクロチューブに移し、一 8 0 °Cにて凍結保存した。

高圧蒸気滅菌済みのポリアロマー製超遠心チューブ（ N o . 3 3 1 3 7 2 、米国、ベックマン社製）に 3 . 5 m l の塩化セシウム溶液〔 0 . 1 Mエチレンジァミン四酢酸（ E D T A) 溶液（ P H 8 . 0 ) に塩化セシウム（米国、 G1BC0 BRL 社製）を 5. 7 Mの澳度になるように溶解し、 0 . 2 %のピロ炭酸ジェチル（D E P C、日本国、和光純薬工業社製）を加えて激しく撹拌後一晚放置し、 1 2 0 °Cで 2 0分間高圧滅菌したもの〕を入れ、その上に溶解した 1 . 2 X 1 0⁷ 個分の細胞破砕溶液にグァニジン溶液を加え、全容量を 8 . 2 m l に合わせたものを静かに重層した。超遠心ローター（ S W 4 1 T i 、米国、ベックマン社製）を用いて 1 8 °C、 1 5 0 , 0 0 0 X g にて 2 0時間遠心分離を行った。

滅菌パスツールピぺットを用いて上清を底から約 0. 5 c mのところまで静かに除去し、滅菌済みのメスを用いて遠心チューブの下から約 1 c mのところを切断した。遠心チューブの底に沈殿となった R N A画分が流れ出ないように注意しながら、滅菌ペーパーの上に転倒静篚し、上淸を完全に除去した。室温にて 5分間静置後、沈殿を 3 6 0 1 の T E— S D S溶液〔 1 0 mM トリス—塩酸緩衝液（ P H 7 . 4 ) 、 5 mMの E D T A及び 1 % ドデシル硫酸ナトリウム（ S D S ) 〕に溶解し、 1 . 5 m l 容のマイクロチューブに移し入れた。 R N A溶液に等量のクロ口ホルム / 1 ーブタノール混液（ 4 ： 1 ) を加えて激しく撹拌後、室温、 1 5 , O O O r p mにて 5分間の遠心分離〔 TMA— 2 ロータ一（日本国、トミー社製）使用、ローター半径： 6 2 . 9 mm。特に記載がないかぎリ、以下の遠心分離についても同じローターを使用した）〕を行ない、水層を別の 1 . 5 m l 容マイクロチューブに移した。 1 / 1 0量の 3 M酢酸ナトリウム及び 2 . 5倍量のエタノールを加えて撹拌し、 — 8 0 °Cに 3 0分間静置後、 4 °C、 1 5， 0 0 0 r p mにて 2 0分間の遠心を行ない、沈殿を回収した（以後この操作をエタノール沈殿と言う）。沈殿を 3 6 0 μ 1 の滅菌精製水に溶解し、再度エタノール沈殿で R N Αを回収した後、沈殿を 1 0 0 μ 1 の滅菌精製水に溶解し、全 R N A溶液とした。

全 R N Aからの m R N A [ p o 1 y (A) ⁺ R N A] の分離精製は、 mRNA puri f icat ion kit (スウェーデン国、ファルマシア社製）を使用し、添付のマニュアルに従って操作した。実施例 2

c D N Aライブラリーの作製

c D N Aライブラリ一の作製は、「遺伝子ライブラリ一の作製法」（野島博編、日本国、羊土社）に示されるリンカ一プライマー法に準じて行なった。

( 1 ) 発現ベクターアームの調製

1 0 0 / gの p S I ベクター（米国、プロメガ社製）を 5 0 Uの制限酵素 N o t I ( 日本国、宝酒造社製）を含む 2 0 0 1 の N o t l b u f f e r 〔 1 0 mM トリス —塩酸緩衝液（ P H 7 . 5 ) 、 1 5 0 mM塩化ナトリウム、 7 mM塩化マグネシウム、 1 m Mの D T T、 0 . 0 1 %牛血清アルブミン（ B S A) 及び 0 . 0 1 %の T r i t o n X— 1 0 0〕に溶解し、 3 7 °Cで 1 2 0分間保温後、さらに 2 0 Uの N o t I を加えて 3 7 °Cで 6 0分間保温して完全消化した。等量のフエノール Zクロ口ホルム混液〔 5 0 0 m 1 のクロロホノレムと 5 0 0 gのフユノール（日本国、和光純薬工業社製）及び l g の 8 — ヒドロキシキノリン（日本国、ナカライテスク社製）をよく混合した後、 2 0 0 m 1 の精製水を加えることによって得られた下層を用いた〕を加えよく愫拌した後、室温、 1 2， 0 0 0 r p mにて 5分間の遠心分離を行ない、上淸を別の 1 . 5 m l 容マイクロチューブに移した（以後この操作をフエノール/クロ口ホルム抽出と言う）。等量のクロ口ホルムを加えよく攪拌した後、室温、 1 2， 0 0 0 r p m にて 5分間の遠心分離を行ない、上淸を別の 1 . 5 m l 容マイク口チューブに移した（以後この操作をク口口ホルム抽出と言う）。エタノール沈殿で D N Aを回収後、 7 5 %ェタノールで沈殿を洗浄した。得られた沈殿を 1 Uの Bacter ia l a lkal ine phosphatase (E^_ co 1 i C75、日本国、宝酒造社製）を含む 2 0 0 μ 1 の Bacter ial alkal ine phosphatase buf f er [ 5 0 mM トリス —塩酸緩衝液（ p H 8 . 0 ) 及び I mM 塩化マグネシウム〕に溶解し、 3 7 °Cで 3 0分間保温した。 2度のフエノーノレ/クロ口ホルム抽出、クロ口ホルム抽出後エタノール沈殿で D N Aを回収後、 7 5 %エタノールで沈殿を洗浄した。得られた沈殿を 1 0 0 Uの制限酵素 E c 0 R I (日本国、宝酒造社製）を含む 2 0 0 μ 1 の H b u f f e r 〔 5 0 mM トリス—塩酸緩衝液（ p H 7 . 5 ) 、 1 0 m M 塩化マグネシウム、 1 mMの D T T及び 1 0 O mM塩化ナトリウム〕に溶解し、 3 7 °Cで 1 2 0分間保温した。フエノール Zクロ口ホルム抽出、クロロホノレム抽出後、エタノール沈殿にて D N Aを回収してベクタ一アームとした。

( 2 ) c D N A断片の調製

実施例 1 にて得られた 2 μ gの m R N A ( 0 . 5 μ g / μ 】を 4 l ) に 3 . 5 μ 1 の 5 mM トリスー塩酸緩衝液（ P H 7 . 5 ) を加え、 6 5 °Cに 5分間保温した後、氷上に置いた。この m R N A溶液を 2 0 0 U の SUPERSCRIPT II 逆転写酵素（米国、 GIBCO BRL 社製）、「遺伝子ライブラリ一の作製法 J に記載された 1 . 6 μ §のリンカープライマー（日本国、日本バイオサービス社製）、 1 O mMの D T T、各 0. 6 mMの 2 ' —デォキシアデノシン一 5 ' —三リン酸 ( d A T P ) 、 2 ' —デォキシグアノシン一 5 ，一三リン酸 ( d G T P ) 及びチミジン— 5 ' —三リン酸（ d T T P ) (共にスウェーデン国、フアルマシア社製）、 0 . 3 mMの 5 —メチルデォキシシチジン— 5 ' —三リン酸（スウェーデン国、フアルマシア社製）及び 2 0 Uの RNase inhibitor

( 日本国、東洋紡績社製）を含む 2 5 μ 1 の cDNA f irst si rand buf fer 〔 5 O mM トリス —塩酸緩衝液（ p H 8 . 3 ) 、 7 5 mM塩化力リゥム及び 3 mM塩化マグネシウム〕中で 3 7 °Cで 6 0分間保温し、さらに 2 0 0 Uの SUPERSCRIPT 1 I 逆転写酵素を加えて 4 5 °Cで 3 0分間保温して一本鎖 c D N Aを合成した。

合成した一本鎖 c D N Aを 2 Uの R N a s e H (スゥェ —デン国、フアルマシア社製）、 5 0 Uの ^ col i DNA po 1 ym erase I (スウェーデン国、ファノレマシア社製）、各 2 2 5 μ Μの d A T P、 d G T P及び d T T P、 3 7 5 μ Μの 2 ' 一デォキシシチジン一 5 ' —三リン酸（ d C T P、スウェーデン国、フアルマシア社製）、 5 mMの D T Tを含む cDNA second strand buf fer 〔 2 5 mM トリス -塩酸緩衝液 ( p H 8 . 3 ) 、 1 0 0 mM塩化カリウムおよび 5 mM塩化マグネシゥム〕中で、 1 6 °Cで 1 5 0分間の保温によリニ本鎖 c D N Aを合成した。フエノールノクロロホノレム抽出、クロロホルム抽出後の上淸 2 0 0 /i l をミリポアフイノレター（U F C P 3 T K 5 0、米国、ミリポア社製）に移し、室温、 7 , 5 0 0 r p mにて 1 0分間、溶液がほとんどなくなるまで遠心を行なった。フィルタ一カップに 1 0 0 μ 1 の T E溶液〔 1 O mM トリス —塩酸緩衝液（ P H 8 . 0 ) 及び I mMの E D T A〕を加え、室温、 7， 5 0 0 r p mにて 1 0分間、溶液がほとんどなくなるまで遠心を行なった。再度フィルタ一力ップに 1 0 0 1 の T E溶液を加え、室温、 7 , 5 0 0 r p mにて 1 0分間、溶液がほとんどなくなるまで遠心を行なつた。その後、 3 0 // 1 の 1 1 0濃度の T E溶液を加え、ピベッティングによリフィルターを洗浄した後、フイノレター力ップを逆さにして 1 . 5 m 1 容マイクロチューブにはめ込み室温、 5 ， 0 0 0 r p mにて 1 0秒間の遠心操作によリニ本鎖 c D N A溶液を回収した（以後この操作をミリポアフィルターによる精製と言う）。

得られた二本鎖 c D N A溶液を 5 Uの T4 DNA po l yme r a s e ( 日本国、宝酒造社製）、各 1 2 5 μ Μの d A T P 、 d C T P 、 d G T P及び d T T P を含む 1 0 0 // 1 の T4 DNA po l y me ra s e buf f e r 〔 5 O m M トリス —塩酸緩衝液（ p H 8 . 3 ) 、 5 O m M塩化ナトリウム、 1 O mM塩化マグネシウム及び 1 0 m Mの D T T〕中で 3 7 °Cで 3 0分間保温した。フエノールノクロ口ホルム抽出、クロ口ホルム抽出の後、上清 1 0

0 μ 1 をミリポアフィルターによる精製を行ない、最終的に

2 0 μ 1 の T E溶液に溶解した平滑末端 c D N A溶液を回収した。

4 μ 1 の得られた平滑末端 c D N A溶液を 4 Uの T4 DNA l i gas e (米国、 GIBC0 BRL社製）、 0 . 3 5 § の £ (： 0 1^ I アダプタ一〔 2 5 g の E c o R I — S m a l a d a p t o r ( N o . 4 5 0 2 、日本国、宝酒造社製）と 1 4 . 2 の p S m a l 1 i n k e r ( N o . 4 5 8 5 P 、日本国、宝酒造社製）を 1 ： 1 のモル比で 1 1 2 μ 1 の 1 O m M トリス —塩酸緩衝液（ P H 7 . 5 ) 、 l m Mの E D 丁 A及び 1 0 m M塩化マグネシウムに懸濁し、 6 5 °Cで 2分間、

3 7 °Cで 1 0 分間、室温で 5分間反応させることによってァニーリングさせた後、一 2 0。Cで保存したもの〕を含む 2 0 μ 1 の Τ4 DNA 1 i gas e buf fer 〔 5 0 m M トリス —塩酸緩衝液（ p H 7 . 6 ) 、 1 0 mM塩化マグネシウム、 I mMアデノシン一 5 ' —三リン酸、 I mMの D T T及び 5 %ポリェチレンダリコール一 8 0 0 0〕中で 8 °Cにー晚保温し、ァダプターを連結させた。 7 0 °Cで 3 0分間保温して T4 DNA 1 iga s e を失活させ、氷上に置いた後、引き続き 2 4 Uの N o t I 及び 2 7 / 1 の N o t I 補充液（ 2 7 8 mM塩化ナトリウム、 8 mM塩化マグネシウム、 1 . 8 mMの D T T、 0 . 0 1 8 %の B S A及び 0 . 0 1 8 %の丁 r i t o n X— 1 0 0 ) を加えて全量 5 0 μ 1 とし、 3 7 °Cで 9 0分間保温した ₍ 5 μ 1 の 1 0倍濃度 S T E溶液〔 1 0 0 mM トリス —塩酸緩衝液（ p H 8 . 0 ) 1 M塩化ナトリウム及び 1 0 mMの E D 丁 A〕及び 1 0 gの t R N Aを加えた後、 Chroma Spin- 40 0スピンカラム（米国、 CL0NTECH 社製）を用いて分画し、小断片を除去した。エタノール沈殿後、 7 5 %エタノールで沈殿を洗浄回収して c D N A断片とした。

( 3 ) ベクターと c D N A断片の連結および大腸菌の形質転換

N o t I 消化した c D N A断片の沈殿を 3 1 3 . 6 μ のベクタ一アーム及び 4 Uの Τ4 DNA l igase を含む 3 0 μ 1 の Τ4 DNA l igase buf fer に溶解し、 1 2 °Cで一晚保温した 7 0 °Cで 3 0分間保温して T4 DNA l igase を失活させ、 T E溶液を加えて 1 0 Ο μ ΐ とした後、フエノール/クロロホルム抽出、クロ口ホルム抽出後の上清をミリポアフィルタ一による精製を行ない、最終的に 3 0 μ 〗の Τ Ε溶液に D N A を回収し、ライゲーシヨン混液とした。

大腸菌の形質転換は G E N E P U L S E R (米国、 BI0- RAD 社製）を用いたエレクトロポレーシヨン法にて行なった, また「遺伝子ライブラリ一作製法」に記載された方法に従い宿主大腸菌 Esche r i ch i a co 1 i DH11S 株（米国、 GI BCO BRL 社製）をコンビテントセルとなして使用した。氷中で溶解した 5 0 1 のコンビテントセルに 3 μ 1 のライゲーシヨン混液を加えて泡立たないように混ぜ合わせた。予め氷中で冷却しておいたキュベット（電極間距離： 0 . l c m、米国、 B I 0-RAD 社製）内に菌液を移し、チャンバ一スライドにセット後、キャパシタンス： 2 5 iu F 、抵抗： 2 0 0 Ω 、電圧：

2 . O k Vの条件下で電圧パルスを加えた。その直後予め

3 7 °Cに保温しておいた 0 . 8 m 1 の S O C培地〔 2 %の Bac 10 Tr yp tone (米国、ディフコ社製）、 0 . 5 %の Bac t o

Yea s t Ex t r ac t (米国、ディフコ社製）、 1 0 m M塩化ナトリウム、 2 . 5 m M塩化カリウム、 1 0 m M硫酸マグネシゥム、 1 0 m M塩化マグネシウム及び 2 0 m Mグルコース〕を加えてピペッティングによリ混合し、 1 5 m l の遠心管に移した。キュベット內を 0 . 2 m l の S O C培地にてすすいで上記菌液に合わせ、 3 7 °Cにて 1 時間振盪培養した。菌液を 5 0 0 m l の L B /Am p培地〔 L B培地（ 1 %の Bacto T r y p t。 n e、 0 . 5 %の Bacto Yeast Extract 及び 1 %塩化ナトリウム）に 5 0 /i g Zm l となるようにアンピシリンを添加したもの〕に移し、さらに 3 7 °Cで 1 6 時間振盪培養した。菌液 5 0 m 1 あたり 3 . 5 m 1 のジメチノレスノレフォキシド（ DM S O、日本国、和光純薬工業社製）を加えて — 8 0 °Cにて保存、 c D N Aライブラリ一菌液とした。

実施例 3 新規遺伝子 H G I Rの一部断片のクロ一ニング

( 1 ) c D N Aライブラリ一テンプレートの調製 c D N Aライブラリーテンプレート用プラスミド D N Aの調製は QIAGEN P 1 asmi d Max i Kit ( ドイツ国、 Q1AGEN 社製）を用いて行なった。 c D N Aライブラリー菌液 1 5 0 m 1 を出発材料とし、添付マニュアルに従ってプラスミド D N Aを抽出精製し、最終的に l m 1 の T E溶液に溶解した。

( 2 ) D e g e n e r a t e P C Rプライマ一を用いた D N Aの增幅と增幅産物のクローン化

0. 5 m l 容のマイクロチューブ內に調製した 2 . 5 Uの Taq DNA polymerase ( 日本国、宝酒造社製）、各 0 . 2 mM の d A T P、 d C T P、 d G T P及び d T T P、並びに下記に示す配列からなる各 1 μ g の一組のプライマー（配列番号

4 に示されるセンスプライマ一混合物及び配列番号： 5 に示

) されるアンチセンスプライマー混合物、共に日本国、日本バィォサービス社製）を含む 1 0 0 μ 1 の Taq DNA po l yme r as e bu f f e r 〔 1 0 m M トリス—塩酸緩衝液（ p H 8 . 3 ) 、 5 0 m M塩化カリウム及び 1 . 5 m M塩化マグネシウム〕に上記（ 1 ) において調製した 2 g の c D N Aライブラリ一テンプレート用プラスミド D N Aを加え、 1 0 0 / 1 のミネラルオイル（米国、シグマ社製）を重層し、 P C R装置（DNA Therma l Cyc l e r , 日本国、宝酒造社製）を用いて、 9 5 °Cで 2分間保温した後に、 9 5 °Cで 1 分、 4 2 °Cで 2分及び 7 2 °Cで 3分を 1 サイクルとする増幅反応（以下 P C R増幅反応とする）を 4 0サイクル行なった後、 7 2 °Cで 7分間、 4 °C で 5分間保温した。

Mo l ecu l a r C l on i ng , A Labo r a t o r y M a n u a 1 Second Ed i t i on ( 1989) に記載の方法にて、ァガロースゲル電気泳動を行なった。 1 0 1 の增幅反応液をァガロースゲル電気泳動に供し、臭化工チジゥム染色後の U V照射にて検出される約 5 0 0 〜 8 0 0 b p の D N A断片を含むァガロースゲルを切リ出した。ァガロースゲルからの D N A断片の精製は D N A回収用ガラスパウダー E A S Y T R A P ( 日本国、宝酒造社製）を用いて行なった。回収後の D N A溶液をフエノール/クロ口ホルム抽出後、エタノール沈殿にて D N A断片を回収した。回収した D N A断片 5 0 n g を上記と同様のプライマー及び同じ条件で P C R増幅反応を行なった後、フエノール Zクロロホルム抽出、エタノール沈殿にて D N Aを回収し、 7 5 %エタノールで沈殿を洗浄した。この沈殿を各 5 0 Uの制限酵素 S a 1 I (日本国、宝酒造社製）及び E c o R I を含む 2 0 0 1 の H b u f f e r に溶解し、 3 7 °Cで 2 時間保温して完全消化した。フエノール/クロ口ホルム抽出、エタノール沈殿後、 7 5 %エタノールにて沈殿を洗浄した。沈殿を 5 0 /u 1 の T E溶液に溶解後、 5 μ 1 の 1 0倍濃度 S T E 及び 1 0 g の t R N Aを加えた後、 Chr oma Sp i n- 100 スピンカラム（米国、 CL0NTECH 社製）を用いて分画し、小断片を除去した。フエノール /クロ口ホルム抽出、エタノール沈殿後、 7 5 %エタノールで沈殿を洗浄回収し、增幅 D N A断片とした。

1 0 μ g のプラスミドベクター p c D N A I I (オランダ国、 I n V i t r 0 g e n 社製）を各 1 0 Uの制限酵素 X h o I ( 日本国、宝酒造社製）及び E c o R I を含む Ι Ο Ο μ 1 の Η b u f f e r に溶解し、 3 7 °Cにて 2 時間保温して完全消化した。ァガロースゲル電気泳動を行ない、臭化工チジゥム染色後の U V照射にて検出される約 3 . O k b p の D N A断片を含むァガロースゲルを切リ出した。切リ出したァガロースゲルからの D N A断片の精製は、 D N A回収用ガラスパウダ一 E A S Y T R A P を用いて行ない、フエノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿によリ回収した D N A断片を pcDNAI I Xho I-EcoRl アームとした。

0 . 5 m l 容のマイクロチューブに 0 . 5 μ もの pcDNAII

Xho I-EcoRI アーム及び 0 . 4 μ gの増幅 c D N A断片を移し、全容量を滅菌精製水で 1 0 μ 1 に合わせた。これに DNA l igat ion kit ver. 2 (日本国、宝酒造社製）の I 液を 1 0 μ 1 加え、よく混合してから 1 6でにて 1 時間反応を行なつた。 7 0 °Cにて 3 0分間保温して反応を止め、フエノールノク口口ホルム抽出、エタノール沈殿にて D N Aを回収した。大腸菌の形質転換は、実施例 2 に示したエレクトロポレーション法にて行ない、形質転換後の菌液を 5 0 μ g /m 1 のァンピシリン、 0. 0 2 %の X— G a 1 ( 5 — ブロモー 4 — クロロ一 3 —インドリノレー —ガラクトシド、日本国、和光純薬工業社製）及び 5 0 mMの I P T G (イソプロピル— /3 — D—チオーガラクトピラノシド、日本国、和光純薬工業社製）を含む L B寒天培地〔 L B培地に 1 . 5 %の B a c t 0 Agar ( 米国、ディフコ社製）を加えて高圧蒸気滅菌後にシャーレにまき拡げて固化したもの〕に塗リ拡げて 3 7 °Cにて 1 6 時間静置してコロニーを形成させた。

出現した単一の白色コロニーを 2 m 1 の L B /Am p で一晚振！ [培養し、 1 2， 0 0 0 r p mにて 3分間の遠心分離により菌体を回収した。菌体を l m gZm lのリゾチーム（日本国、生化学工業社製）を含む 2 5 mM トリス —塩酸緩衝液

( P H 8 . 0 ) 、 1 0 mMの E D T A及び 5 0 mMダルコ一 5 o

スからなるリゾチーム溶液 3 0 0 1 に懸濁して、 3 7でにて 5分間反応した後、 2 %の S D S を含む 0 . 3 N水酸化ナトリウム溶液 1 8 0 l を加えて激しく撹拌し、大腸菌を溶菌させた。 6 5 °Cで 2 0 分間保温後、室温に放置することにょリ冷却した溶菌液に、 1 2 0 ^ 1 のフエノールクロロホルム混液を加えて激しく撹拌し、 D N Aの抽出を行った。遠心分離後の水層に 1 ノ 1 0量の 3 M酢酸ナトリウム、等量のィソプロパノールを加えて室温に 5分間静置し、

1 5， 0 0 0 r p mにて 5 分間の遠心分離で沈殿を回収した。沈殿を l O g Zm l の R N a s e A (米国、シグマ社製）を含む T E溶液 5 0 μ 1 に溶解し、 3 7 °Cで 3 時間保温して混入 R N Aを除去した。 3 の 2 . 5 M塩化ナトリウムを含む 2 0 %ポリエチレンダリコール— 6 0 0 0溶液を加えて 1 5分間氷中にて冷却後、 4 °C、 1 5 , O O O r p mにて 2 0分間の遠心を行なって沈殿を回収し、 7 5 %エタノールで沈殿を洗浄してシークェンス用錄型 D N Aとした。

( 3 ) クローンの塩基配列の決定

挿入 c D N A断片の塩基配列の決定は Appl ied Biosys t e ms 社製の蛍光シークェンサ一を用いて実施した。シ一クェンスサンプゾレの調製は PRISM、 Ready React ion Dye Termina tor Cyc le Sequencing Ki t (米国、 Appl i ed B i o s y s t ems 社製）を用いて行なった。 0 . 5 m l 容のマイクロチューブに 9 . 5 l の反応ストック液、 4 , O ju l の 0 . 8 p m o l / μ 1 の丁 7 プロモータープライマー（米国、 GIBCO BRL 社製）及び 6 . 5 1 の 0 . 1 6 i g μ ΐ シークェンス用铸型 D N Aを加えて混合し、 5 0 μ 1 のミネラルオイルを重層後、 9 6 °Cで 3 0秒、 5 5 °Cで 1 5秒及び 6 0 °Cで 4分を 1 サイクルとする P C R增幅反応を 2 5 サイクル行ない、 4 °C で 5分間保温した。反応後、 8 0 1 の滅菌精製水を加えて撹拌し、遠心分離後の水層に対して 3 回のフエノール/クロ口ホルム抽出を行なった。 1 0 0 μ 1 の水層に 1 0 μ 1 の 3 Μ酢酸ナトリウム（ Ρ Η 5 . 2 ) 及び 3 0 0 1 エタノールを加えて撹拌後、室温、 1 4 ， 0 0 0 r p mにて 1 5分間の遠心を行ない沈殿を回収した。沈殿を 7 5 %エタノールで洗浄後、真空下に 2分間静置して乾燥させ、シークェンス用サンプルとした。シークェンス用サンプルは、 4 1 の 1 O m Mの E D T Aを含むホルムアミドに溶解して 9 0 °C、 2分間で変性後、氷中で冷却してシークェンスに供した。その結果、配列番号 2 の配列の遺伝子 H G I Rの一部からなる塩基配列を確認した。実施例 4

遺伝子 H G I R全長のクローニング

( 1 ) H G I Rプローブ D N Aの調製

実施例 3 にて得られた H G I Rの一部断片を含むプラスミド D N Aを保持する大腸菌コロニーを 1 5 0 m 1 の L B , A m p に移植し、 3 7 °Cにてー晚振盪培養した。プラスミド D N Aの調製は Q I A G E N P l a s m i d M a x i K i t を用いて行なった。

調製した 1 Ο μ g のプラスミド D N Aを各 1 0 Uの制限酵素 S p h l ( 日本国、宝酒造社製）及び E c o R I を含む 1 O O l の H b u f f e r に溶解し、 3 7 °Cにて 2 時間保温して完全消化した。ァガロースゲル電気泳動を行ない、臭化工チジゥム染色後の U V照射にて検出される約 5 0 0 b p の D N A断片を含むァガロースゲルを切り出した。ァガロースゲルからの D N A断片の精製は D N A回収用ガラスノウダ一 E A S Y T R A P を用いて行ない、フエノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿によリ回収した D N A断片を H G I Rプローブ D N Aとした。

プローブ D N Aの標識は〔ひ一 ³² P〕 d C T P ( 1 1 I T B q / m m o 1 、米国、 E. I . Du p o n t d e Nemours & し o.， Inc. 社製）を用いて Random Primer DNA Label ing Ki t ( 日本国、宝酒造社製）にて行なった。

( 2 ) プラークハイブリダイゼイションによる陽性クローンの取得

c D N Aライブラリ一は、 Human Brain 5'-St retch Plus cDNA Library (HL3002 a、米国、 CLONTECH 社製）を使用した。宿主大腸菌 Escher ichia col i C600Hf 1 株を 1 O mM硫酸マグネシゥム及び 0 . 2 %マルトースを含む L B培地で 1 6時間振盪培養し、宿主菌液とした。 c D N Aライブラリーを宿主菌液に加えて感染後、 1 O mM硫酸マグネシウムを含む L B寒天培地上にまき拡げ、 3 7 °Cで 8時間静置して約 1 2 0 万個の単一プラークを形成させた。プラークを形成した寒天上に H y b o n d— N +メンブラン（英国、アマシャム社製）を静かに置き、約 1 分間静置した。メンブランを静かに剥がし、ブラークと接触した面を上にして変性溶液（ 1 . 5 M塩ィ匕ナトリウム及び 0 . 5 M水酸化ナトリウム）に浸した濾紙上に 7分間静置した。同様にメンブランを中和溶液〔 1 . 5 M塩化ナトリウム及び 0 . 5 M トリスー塩酸緩衝液（ p H 7 . 5 ) ] を含む濾紙上に移した。 3分間放置後、新たに中和溶液でしめらせた新しい濾紙を用いてこの操作を繰リ返した後、メンブランを 2倍濃度 S S C ( 0 . 3 M塩化ナトリウム及び 0. 0 3 Mクェン酸三ナトリウム）で洗浄し、菌体の残查を取り除いた。プラーク側を上にして乾いた濾紙上に置いて風乾したメンブランをサランラップ（日本国、旭化成ェ業社製）で包み、プラーク側を下にして U V トランスイルミネーター上に置き 5分間 2 5 4 n mの U Vを照射した。プラークを形成させた培地は 4 °Cに保存した。

5倍濃度 S S P E 〔 0 . 9 M塩化ナトリウム、 5 O mMリン酸ナトリウム及び 5 mMの E D T A ( p H 7 . 7 ) 〕、 5 倍濃度 D e n h a r d t ' s 液（各 0 . 1 %の B S A、フィコール及びポリビニルピロリドン）及び 0 . 5 %の S D S力らなる液に終澳度 1 0 0 μ g Z m 1 となるように変性サケ精子 D N A 〔サケ精子 D N A (米国、シグマ社製）を滅菌精製水に溶解し、 1 7 G注射針を取り付けたシリンジを用いて溶液を出し入れし、 D N Aを細かく裁断した。フエノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿後、滅菌精製水に 1 O m g / m 1 となるように溶解し、必要量を 1 0 0 °Cにて 5 分間の保温後に氷中で急冷して使用した〕を加えてブレーハイプリダイゼイシヨン液とした。先に調製した約 1 2 0 万個のブラークの D N Aを固定したメンブランをハイブリダイゼイションバッグに入れ、メンブラン 1 c m ² あたリ 0 . 1 m l のプレーハイブリダィゼイシヨン液を入れてシールし、 6 5 °Cの水浴中で 3時間振盪保温した。このバッグに、 1 0 0 °Cにて 5分間の保温後に氷中で急冷した標識 H G I Rプローブ D N Aを終濃度 1 X 1 0 ⁶ c P m / m 1 となるように加えてシールし、さらに 6 5 °Cの水浴中で 2 4 時間振盪保温した。メンブランを取リ出し、室温で洗浄液 1 ( 2倍濃度 S S P E及び 0 . 1 %の S D S ) を用いて 1 0分間洗浄した。引き続き、 6 5 °Cで洗浄液 2 ( 1 倍濃度 S S P E及び 0 . 1 %の S D S ) を用いて 1 5 分間洗浄後、さらに 6 5 °Cで洗浄液 3 ( 1 / 1 0倍濃度 S S P E及び 0 . 1 %の S D S ) を用いて 1 5分間洗浄した。メンブランは一枚ずつサランラップに包んでカセッ卜に固定し、增感紙 1 枚を用いて一 8 0 °Cで X線フィルムに焼き付けた。 6 時間後に X線フィルムを現像して陽性のシグナルを検出し、 4 °Cに保存しておいて培地よリ陽性クローンを分離した。

次に以下の方法によリ、陽性クローンから； I ファージ D N Aを抽出した。滅菌パスツールピぺットを用いて陽性クローンを打ち抜き、予め 5 0 m 1 の遠心管に分注しておいた 2 0 0 ju 1 の Escher i ch i a co 1 i C600Hf 1 株の宿主菌液に懸濁した。 3 7 °Cにて 1 5分間保温した後、 1 0 m M硫酸マグネシゥムを含む L B培地 1 2 m l を加えて、 3 7 °Cにて 1 6 時間振盪培養した。菌液を 1 5 m l 容の遠心管に移し、 7， 0 0 0 r p mにて 1 0分間遠心し残査を除去した。上淸 1 1 m l を超遠心用チューブ（ N o . 3 3 1 3 7 2 ) に移し、ベックマン社製超遠心ローター（ S W 4 1 T i ) を用いて 1 8 °C、 3 0， 0 0 0 r p mにて 3 5 分間遠心分離した。上清を完全に除いた残査に 4 0 0 μ 1 の _S i s buf f er ( 1 0 0 g /m l の proteinase K、 0 . 2 Μ塩化ナトリウム及び 0 . 1 %の S D S ) を加えて 5 5 °Cにて 9 0分間反応させた。等量の水飽和フエノール溶液〔 5 0 0 g のフエノール（日本国和光純薬工業社製）及び 0 . 5 g の 8 — ヒドロキシキノリン

( 日本国、ナカライテスク社製）をよく混合した後 2 0 0 m 1 の精製水を加えて振って得た下層を用いた〕を加えよく攪拌した後、室温、 1 2， 0 0 0 r p mにて 5分間の遠心分離を行ない、上淸を別の 1 . 5 m 1 容マイクロチューブに移した。フエノール/クロ口ホルム抽出、エタノール沈殿を行なレヽ、陽性クローンえ D N A とした。

( 3 ) 組換えプラスミドの作製と塩基配列の決定調製した 1 μ gの陽性クローン A D N Aを 1 Uの制限酵素 E c o R I を含む 5 0 】の}^ b u f f e r に溶解し、 3 7 °Cにて 2時間保温して完全消化した。ァガロースゲル電気泳動を行ない、臭化工チジゥム染色後の U V照射にて検出される約 1 . 5 k b p の D N A断片を含むァガロースゲルを切リ出した。ァガロースゲルからの D N A断片の精製は D N A 回収用ガラスパウダー E A S Y T R A Pを用いて行ない、フエノ一ル /クロロホノレム抽出、エタノール沈殿によリ回収した D N A断片を H G I R断片（ 1 . 5 k b p ) とした。

1 μ gのプラスミドベクター P U C 1 1 8 ( 日本国、宝酒造社製）を 1 Uの制限酵素 E c 0 R I を含む 5 0 μ 1 の Η b u f f e r に溶解し、 3 7 °Cにて 2時間の保温にょリ完全消化した。フエノールクロ口ホルム抽出、エタノール沈殿によリ回収した D N Aを p U C l 1 8 E c o R I ベクターとした。

0. 5 m l 容のマイクロチューブに 0 . 2 g の p U C l 1 8 E c o R I ベクター及び 0 . l x gの H G I R断片 ( 1 . 5 k b p ) を移し、滅菌精製水で 5 / l に合わせた。これに DNA l i at ion ki t ve r . 2 の I 液を 5 μ 1 加え、よく混合してから 1 6 °Cにて 1 時間反応を行なった。 7 0 °Cにて 3 0分間保温することによリ反応を停止し、フノール/ クロ口ホルム抽出、エタノール沈殿にて D N Aを回収後、 5 μ 1 の Τ Ε溶液に溶解してライゲ一シヨン混液とした。大腸菌の形質転換はコンピテントセル Esche r i ch i a co 1 i JM10 9 ( 日本国、東洋紡績社製）を用いて行なった。氷中で溶解した 1 0 0 μ 1 のコンビテントセルと 5 μ 1 のライゲ一ション混液を混合し、引き続き氷中で 3 0分間静置した。 4 2 °C にて 3 0秒間保温後、予め 3 7 °Cに保温しておいた 0 . 9 m 1 の S O C培地を加えて 1 5 m 1 の遠心管に移し、 3 7 。Cにて 1 時間振！!培養した。この菌液を 5 0 μ §ノ m l のアンピシリン、 0 . 0 2 %のー 0 3 1 及ぴ 5 0

の 1 ? 丁 0を含む L B寒天培地に塗り拡げて 3 7 °Cにて 1 6 時間静置培養し、コロニーを形成させた。出現した単一の白色コロニーより、実施例 3 と同様の方法を用いてプラスミド D N Aを抽出して、 H G I R断片

( 1 . 5 k b p ) がそれぞれ逆向きに挿入した組換えプラスミド P G I R 1 0及び P G I R 2 0 を取得した。即ち、出現した単一の白色コロニーを 2 m 1 の L B Z A m p で一晚振盪培養し、 1 2 ， 0 0 0 r p mにて 3分間の遠心分離により菌体を回収した。菌体をリゾチーム溶液 [ l m g Zm l のリゾチームを含む 2 5 m M トリス—塩酸緩衝液（ P H 8 . 0 ) 、 1 O mMの E D T A及び 5 O mMグルコース〕 3 0 0 μ 1 に懸濁し、 3 7 °Cにて 5分間反応後、 2 %の S D S を含む 0 . 3 N水酸化ナトリゥム溶液 1 8 0 μ 1 を加えて激しく撹拌し、大腸菌を溶菌させた。 6 5 °Cで 2 0 分間保温後、室温に放置することにより冷却した溶菌液に対して 1 2 0 μ 1 のフエノーノレノク口口ホルム混液を用いてフエノーノレク口口ホルム抽出を行った。遠心分離後の水層に 1 / 1 0量の 3 M 酢酸ナトリウム、等量のイソプロパノールを加え室温に 5分間静置し、 1 5， 0 0 0 r p mにて 5分間の遠心分離で沈殿となったプラスミド D N Aを回収した。

これらプラスミドの制限酵素地図並びに機能地図を図 3に示した。また、 P G I R 1 0 を保持する形質転換体は Esche r i ch i a col i JM109/pGIR10 株（ F E R M B P— 5 8 3 6 ) と命名して工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。 P G I R 1 0 あるいは P G I R 2 0 を保持する大腸菌コロニ一をそれぞれ 1 5 0 m 1 の L B /Am p に移植し、 3 7 °Cにてー晚振盪培養後、プラスミド D N Aを Q1AGEN PI asmi d Ma xi Ki t を用いて調製した。実施例 5

マウス染色体 D N Aを用いた相同遺伝子の解析

( 1 ) プローブ D N A断片の調製

1 0 μ gの組換えプラスミド p G I R 1 0を各 1 0 Uの制限酵素 E c o R I 及び E a e l ( 日本国、宝酒造社製）を含む 1 0 0 1 の M b u f f e r 〔 1 0 mM トリス —塩酸緩衝液（ p H 7 . 5 ) 、 1 0 m M塩化マグネシウム、 1 m Mの D T T及び 5 0 mM塩化ナトリウム〕に溶解し、 3 7。Cで 2 時間保温して完全消化した。 b o

続いて、ァガロース電気泳動を行い、臭化工チジゥム染色後の U V照射にて検出される約 2 7 0 b P の D N A断片を含むァガロースゲルを切リ出した。ァガロースゲルからの D N A断片の精製は、 D N A回収用ガラスノ、。ウダ一 E A S Y T R A P を用いて行い、フエノーノレ Zクロロホノレム抽出、ェタノール沈殿によリ D N A断片を回収した。得られた約 2 7 0 b p の D N A断片を、〔 a — ³² P〕 d C T Pを用いて Random Pr imer DNA Label ing Ki t にて標識し、プローブ D N A断片とした。

( 2 ) マウス染色体 D N Aのサザンハイブリダイゼイション各 5 / g のマウス染色体 D N A (米国、 CL0NTECH 社製）を 5 Uの制限酵素 E c o R I を含む 1 O O j 1 の H b u f f e r 、あるいは 5 Uの制限酵素 H i n d I I I ( 日本国、宝酒造社製）を含む 1 0 0 / 1 の M b u f f e r に溶解し .

3 7 °Cで 2 時間保温して完全消化した。それぞれ、フエノ一ル //クロ口ホルム抽出、クロ口ホルム抽出後、ェタノ一ノレ沈殿にて D N Aを回収した。

得られた制限酵素消化 D N Aをァガロースゲル電気泳動に供した後、電気泳動後のゲルを 2 0 0 m l の 0 . 5 N水酸化ナトリゥム及び 1 . 5 M塩化ナトリゥム溶液中で 2 0分間室温に放置した。ゲルをバキュームトランスファー装置（ B C 一 6 0 0型、日本国、バイオクラフト社製）に移し、トランスファ一バッファ一として 0 . 4 N水酸化ナトリゥム溶液を用い、 7 c m ZH g にて 4 0分間吸引し、 D N Aを H y b o n d — N +メンブランへトランスファ一した。メンブランを静かに剥がし、 2倍濃度 S S C 中にて 3 0秒間緩やかに洗浄後、濾紙上に移して約 1 時間風乾させた。メンブランに対し上記（ 1 ) にて調製した約 2 7 0 b p のプローブ D N A断片を用いて、以下に示す方法にてハイプリダイゼイションを行つた。即ち、 5 0 %ホルムアミド（日本国、和光純薬工業社製）、 5倍濃度 S S P E、 5倍濃度 D e n h a r d t ' s 液及び 2 %の S D S からなる液に最終濃度 1 0 0 μ g / m 1 となるように変性サケ精子 D N Aを加えてプレーハイブリダイゼイション液とした。先に調製したメンプランをハイブリダィゼイシヨンバッグに入れ、メンブラン 1 c m ² 当たリ 0 . 1 m l のブレーハイブリダィゼイシヨン液を加えてシ一ルし、 4 2 °Cの水浴中で 4 時間振遨保温した。このバッグに 1 0 0 °C、 5 分間の保温後に氷中で急冷した上記（ 1 ) にて調製済のプローブ D N A断片を、最終濃度 1 X 1 0⁶ c p m / m 1 となるように加えてシールし、さらに 4 2 °Cの水浴中で 2 4 時間振盪保温した。メンブランを取り出し、室温で洗浄液 1 にて 1 0分間洗浄した。引き続き、 5 0 でで洗浄液 1 を用いて 3 0分間洗浄後、さらに 5 0 °Cで洗浄液 3 を用いて 3 0分間洗浄した。メンブランは、 B A S 2 0 0 0 イメージングアナライザー（富士写真フィルム社製）にて放射活性の読み取リ並びに検出を行った。その結果、マウス染色体 D N Aからは陽性シグナルは検出できなかった。つまり、今回取得した H G I R遺伝子はヒト特有のものであると考えられた。実施例 6

H G I R全塩基配列の決定

組換えブラスミド p G I R l 0並びに P G I R 2 0 を材料に、 Ki lo- Sequence 用 De let ion Kit ( 日本国、宝酒造社製）を用いて様々なィンサート長のデレーションミユータントを作製し、 H G I R遺伝子全長を含む D N A塩基配列を決定するために使用した。即ち、 1 0 gの p G I R 1 0 あるいは P G I R 2 0 を、それぞれ 2 0 Uの制限酵素 S p h I 及び B a m H I ( 日本国、宝酒造社製）を含む H b u f f e r に溶解して 3 7 °Cにて 2 時間保温して完全消化した。添付のプ口トコ一ノレ (■こ従つて、 Exonuc lease I II、 u n g Bean Nu c 1 e a s e 及び Klenow Fragment による D N Aの欠失、平滑末端化を行なった。それぞれライゲーシヨンによりプラスミドを環状にした後に Escher i ch i a col i J 109 株を形質転換して各種長さの D N A断片を保持したクローンを取得した。各クローンは、実施例 3 ( 3 ) と同様の方法、即ち、 PRISM, Ready

React ion Dye Terminator し yc le Sequenc ing ki t ¾ 用レヽ" ブライマ一として M 1 3 (— 2 1 ) 及び M 1 3 r e v e r s e シークェンスプライマ一 (米国、 App l ied B i o s y s t ems 社製）にてシークェンスサンプルを調製後、 Appl ied Biosys terns 社製の蛍光シークェンサ一を用いて塩基配列を決定した。

その結果、配列番号 3の塩基配列からなる H G I R遺伝子を含む c D N Aの塩基配列を決定した。実施例 7

ノーザンハイブリダイゼイション法による m R N A量の解析

実施例 1 にてずリ応力負荷培養 H U V E C、並びに静置培養 HU V E Cより抽出した m R N A各 2 ; g を、 Molecular し loning、 A Laboratory Manual、 Second Edi t ion ( 1989 ) こ記載の方法にて、ホルムアルデヒドゲルによる電気泳動を行なった。電気泳動後のゲルを、 2 0 0 m l の 0 . 0 5 N水酸化ナトリゥム溶液中で 2 0分間室温に放置した。ゲルをバキユームトランスファー装置に移し、トランスファーバッファ一として 0 . 0 5 N水酸化ナトリウム溶液を用いて、 7 c m ZH g にて 4 0分間吸引して、 m R N Aを H y b o n d — N +メンブランへトランスファーした。メンブランを静かに剥がし、 2倍濃度 S S C中にて 3 0秒間緩やかに洗浄後、濾紙上に移して約 1 時間風乾させた。 m R N Aをトランスファーした側を下にして U V トランスイルミネーター上に置き、 2 5 4 n mの U Vを 5分間照射した。メンブランは実施例 5 と同様の方法にてハイプリダイゼイションを行なった。即ち .

5 0 %ホルムアミド、 5倍濃度 S S P E 、 5倍澳度 D e n h a r d t ' s 液及び 2 %の S D S からなる液に終濃度 1 0 0 μ g / τα \ となるように変性サケ精子 D N Aを加えてプレーハイブリダィゼイション液とした。先に調製した m R N Aを固定したメンブランをハイプリダイゼィションバッグに入れ, メンブラン l c m ² あたリ 0 . 1 m l のブレーノヽイブリダィゼイシヨン液を加えてシールし、 4 2 °Cの水浴中で 4 時間振盪保温した。このバッグに、 1 0 0 °Cにて 5分間の保温後に氷中で急冷した実施例 4 にて作製した標識 H G I Rプローブ D N Aを終濃度 1 X 1 0 ⁶ c p m/m 1 となるように加えてシールし、さらに 4 2 °Cの水浴中で 2 4 時間振盪保温した。メンブランを取り出し、室温で洗浄液 1 にて 1 0 分間洗浄した。引き続き、 5 0 °Cで洗浄液 1 を用いて 3 0 分間洗浄後、さらに 5 0 °Cで洗浄液 3 を用いて 3 0分間洗浄した。ハイブリダィゼイシヨン後のメンブランは、 B A S 2 0 0 0 ィメージングアナライザ一にて放射活性の読み取リ並びに検出を行つた。その結果、図 4 に示すように、静置培養 H U V E C よリ抽出した m R N Aを用いた場合と比べ、ずリ応力負荷培養した H U V E C よリ抽出した m R N Aを用いた場合には、明らかなシグナルが検出された。つまリ、血管内皮細胞においては、ずり応力負荷した際に H G I R遺伝子の発現量が增加することが明らカゝとなった。実施例 8

抗 H G I Rペプチド抗血清の作製

実施例 6 にて決定した H G I R遺伝子の塩基配列よリ予想されるァミノ酸配列のうち、配列番号 1 の 1 7 — 3 0 に示される 1 4個アミノ酸を選び、該ペプチドを合成し、ゥサギの免疫および採血、力価確認を実施し、抗 H G I Rペプチド抗血清を調製した。

ペプチド合成は、 F m o c 固相合成法（新生化学実験講座 1 · タンパク質 V I 合成および発現、東京化学同人発行）にて行ない、 2 m gの合成ペプチドと等量のキャリア蛋白質 K L H (keyho le-1 impet hemocyan in , 米国、 PIERCE 社製）をマレイミド法にてコンジユゲートしたものを抗原として使用した。約 2. 1 k gのゥサギ 1 羽に 0 . 5 m g の抗原を背部皮下投与し、その 2 1 日後、 4 2 日後および 6 3 日後にもそれぞれ等量の抗原を同様に投与した。最初の投与から 7 3 日目にゥサギょリ血液を麻酔下類動脈採血により採取後、血清を分離し、抗血清とした。実施例 9

H G I R発現ブラスミドの構築

( 1 〉 5 ' 及び 3 ' 非翻訳領域欠失発現プラスミドの構築

H G I R遺伝子の 5 ' 側の非翻訳領域及び 3 ' 側の非翻訳領域を除去した発現プラスミドを以下の手順に従って構築した。

まず、 5 0 n g の P G I R 1 0 を 2 . 5 U (D Taq DNA po I ymerase 及び各 0 . l n m o 1 の P C Rプライマ一（配列番号： 6 に示されるセンスプライマー及び配列番号： 7 に示されるアンチセンスプライマー、日本国、日本バイオサービス社製）を含む 1 0 0 μ 1 の Taq DNA po lymerase buf f er に溶解し、 Ι Ο Ο μ Ι のミネラルオイルを重層後、 9 5 °。で 1 分、 6 8 °Cで 2分及び 7 2 °Cで 3 分を 1 サイクノレとする P C R増幅反応を 3 0サイクル行なった。反応後の溶液よりフユノール Zクロ口ホルム抽出、エタノール沈殿後、 7 5 %エタノールを用いて沈殿を洗浄して D N Aを回収した。

得られた P C R増幅産物並びに 1 0 μ g のクローユングべクタ一 pBlueScr ipt l l KS+ (米国、 STRATAGENE CLONING SYST EMS 社製）をそれぞれ 1 0 Uの制限酵素 K p n l ( 日本国、宝酒造社製）を含む 1 0 0 /z l の L b u f f e r [ 1 0 m M トリスー塩酸緩衝液（ p H 7 . 5 ) 、 1 0 m M塩化マグネシゥム及び I mMの D T T〕に溶解し、 3 7 °Cにて 2 時間の保温にょリ完全消化した後、引き続き 1 0 Uの制限酵素 E c o R I を含む Ι Ο Ο μ Ι の H b u f f e r に溶解し、 3 7 °Cにて 2 時間保温して完全消化した。それぞれ 1 0 g の t R N Aを加えた後、 Ch roma Sp ί η-400 スピンカラムを用いて分画して小断片を除去した。フエノール/ク口口ホルム抽出エタノール沈殿後、 7 5 %エタノールにて沈殿を洗浄して D N Aを回収し、それぞれ HGIR(EcoRI- Kpnl) 断片並びに pBl ueSc r！ p t I I KS+ EcoRI— Kpnl アームとした。

0 . 5 の pBlueScript ll KS+ EcoRI— Kpnl アームおよび 0. 2 gの HGIR(EcoRI- Kpnl) 断片を 2 0 μ 1 の反応系にてライゲーシヨン反応後、反応液を用いて大腸菌を形質転換した。

大腸菌の形質転換はコンビテントセル Escher i ch i a col i J 109 を用いて行なった。氷中で溶解した 1 0 0 μ 1 のコンピテントセルに 5 1 のライゲーシヨン混液を加えて混ぜ合わせ、引き続き氷中で 3 0分間静置した。 4 2 °Cにて 3 0秒間保温した後、予め 3 7 °Cに保温しておいた 0 . 9 m 1 の S O C培地を加えて 1 5 m 1 の遠心管に移し、 3 7 °Cにて：！時間振逸培養した。この菌液を 5 0 μ g / m 1 のアンピシリン 0 . 0 2 %のー 0 3 1 及び 5 0

の 1 ?丁 0を含むし 8 寒天培地に塗リ拡げて 3 7 °Cにて 1 6時間静置培養し、コロニーを形成させた。出現した単一の白色コロニーを 2 m 1 の L B ZAm p を用いてー晚振盪培養し、得られた菌体よリブラスミド D N Aを抽出し、 p B S ZH G I Rを得た。インサート D N Aの塩基配列は、実施例 6 と同様の方法により、 p B S ZHG I Rを材料に、 Ki lo- Sequence 用 Delet ion Ki t を用いて様々なィンサ一ト長のデレーションミユータントを作製取得して決定した。但し、デレーシヨンミュータントを作製する際の制限酵素は P s t I (日本国、宝酒造社製）及び B a mH I を用いた。その結果、インサートに含まれる H G I Rぺプチドコード領域の塩基配列が、配列番号 2 の塩基配列でぁリ、変異が無いことを確認した。

引き続き、 5 gの P B S ZH G I Rを 5 Uの制限酵素 K p n l を含む 5 0 μ 1 の L b u f f e r に溶解し、 3 7 °C にて 2時間の保温にょリ完全消化した。フユノール Zクロ口ホルム抽出、エタノール沈殿後、 7 5 %エタノールにて沈殿を洗浄して D N Aを回収後、 5 Uの T4 DNA po 1 me r as e , 各 1 2 5 μ Μの d A T P、 d C T P、 d G T P及び d T T Pを含む T4 DNA polymerase buf fer 中にて 3 7 °Cで 3 0分間保温し、平滑末端 D N Aを作製した。フエノール Zクロ口ホルム抽出、エタノール沈殿後、 7 5 %エタノールにて沈殿を洗浄して回収した D N Aを、 5 Uの制限酵素 E c o R I を含む 5 0 1 の H b u f f e r に溶解し、 3 7 °Cにて 2時間の保温により完全消化した。ァガロースゲル電気泳動を行ない臭化工チジゥム染色後の U V照射にて検出される約 1 . 3 k b p の D N A断片を含むァガ口一スゲルを切リ出して回収精製を行ない、 HGIR (EcoRI-BLUNT) 断片とした。

また、 1 0 i g の動物細胞用発現べクタ一 p c D N A 3 . 1 ( + ) (オランダ国、 Invi ogen 社製）を各 1 0 Uの制限酵素 E c o R I 及び E c o R V (日本国、宝酒造社製）を含む Ι Ο Ο μ Ι の H b u f f e r に溶解し、 3 7 °Cにて 2 時間の保温にょリ完全消化した。 1 Q μ g の t R N Aを加えた後、 Ch roma Sp i n-400 スピンカラムを用いて分画し、小断片を除去した。フエノール/クロ口ホルム抽出、エタノール沈殿後、 7 5 %エタノールにて沈殿を洗浄して D N Aを回収し、 pcDNA3. 1 ( + ) EcoRI-EcoRV アームとした。

0 . 5 μ g の pcDNA3. 1 (+ ) Ec cRI-EcoRV アーム及び 0 . 2 μ もの HGIR (EcoRI -BLUNT) 断片を 2 0 μ 1 にてライゲーシヨン反応後、反応液を用いて大腸菌を形質転換した。大腸菌の形質転換はコンビテントセル Es che r i ch i a co 1 i JM109 を用いて行なった。氷中で溶解した 1 0 0 μ 1 のコンビテントセルに 5 μ 1 のライゲーション反応液を加えて混合し、引き続き氷中で 3 0分間静置した。 4 2 °Cにて 3 0秒間保温後、予め 3 7 °Cに保温しておいた 0 . 9 m 1 の S O C培地を加えて 1 5 m 】の遠心管に移し、 3 7 °Cにて 1 時間振盪培養した。この菌液を 5 0 g / m l のアンピシリンを含む L B寒天培地に塗リ拡げて 3 7 °Cにて 1 6 時間静置培養してコロニ一を形成させた。出現した単一のコロニーを 2 m l の L B / A m p に移植し、一晩振盪培養して得た菌体よリブラスミド D N Aを抽出し、 p E G I R l l を得た。構築した発現プラスミド p E G I R 1 1 の制限酵素切断部位並びに機能地図を図 5 に示した。

( 2 ) 改変体発現プラスミドの構築

( 1 ) と同様の方法にて、産物の検出を容易にする目的で H G I Rペプチドのカルボキシル末端に F L A Gペプチドと称されるマーカーペプチド〔BioTechno logy, 6 1205- 1210 ( 1 988 ) 〕を付けた発現プラスミドの作製を行なった。

即ち、 5 0 n g の P G I R 1 0 を 2 . 5 Uの T a q D N A p o l y m e r a s e および各 0. l n m o l の P C R プライマー（配列番号： 6 に示されるセンスプライマー及び配列番号： 8 に示されるアンチセンスプライマー、日本国、日本バイオサービス社製）を含む 1 0 0 】の Taq DNA p o 1 ymer ase buf fer 中で、 P C R装置を用いて P C R増幅反応を 3 0サイクル行なった。但し、この時の増幅反応の条件は 9 5 °Cで 1 分、 6 8 °Cで 2分、 7 2 °Cで 3分とした。反応後の溶液よリフエノールノクロ口ホルム抽出、エタノール沈殿後、 7 5 %エタノールにて沈殿を洗浄して D N Aを回収した, 得られた P C R增幅産物を 1 0 Uの制限酵素 K p n I を含む Ι Ο Ο μ Ι の L b u f f e r に溶解し、 3 7 °Cにて 2時間の保温にょリ完全消化した後、引き続き 1 0 Uの制限酵素 E c o R I を含む Ι Ο Ο μ Ι の H b u f f e r に溶解し、 3 7 °Cにて 2時間の保温にょリ完全消化した。 1 0 μ g の t R N Aを加えた後、 Chroma Spin- 400 スピンカラムを用いて分画して小断片を除去した。フエノール/ク口口ホルム抽出エタノール沈殿後、 7 5 %エタノールにて沈殿を洗浄して D N Aを回収し、 HGIR- FLAG(EcoR卜 Kpnl) 断片とした。 0 . 5 μ g ( pB l ueSc r i p t 1 I KS+ EcoRI-Kpn I アーム及び 0 . 2 μ g の HGIR-FLAG (EcoR I-Kpn l) 断片を 2 0 1 にてライゲーシヨン反応後、反応液を用いて大腸菌を形質転換した。大腸菌の形質転換はコンビテントセル Es che r i ch i a £ 01 i JM109 を用いて行なった。氷中で溶解した 1 0 0 μ 1 のコンビテントセルに 5 μ 1 のライゲ一シヨン混液を加えて混ぜ合わせ、引き続き氷中で 3 0分間静置した。 4 2 °Cにて 3 0秒間保温した後、予め 3 7 °Cに保温しておいた 0 . 9 m l の S O C培地を加えて 1 5 m 1 の遠心管に移し、 3 7 °Cにて 1 時間振盪培養した。この菌液を 5 0 μ g / m 1 のアンピシリン、 0 . 0 2 %のー 0 3 1 及び 5 0 111 ]^の 1 ? 丁 0を含む L B寒天培地に塗リ拡げて 3 7 °Cにて 1 6 時間静置培養しコロニーを形成させた。出現した単一の白色コロニーを 2 m 1 の L B / A m p を用いてー晚振盪培養し、得られた菌体よリプラスミド D N Aを抽出し、 p B S Z H G I R — F L A G を得た。インサート D N Aの塩基配列は、実施例 6 と同様の方法にょリ、 pBS/HGIR- FLAG を材料に、 K i 1 o - S e q u e n c e 用 D e 1 e t i on Ki t を用いて様々なィンサ一ト長のデレ一ションミユータントを作製取得して決定した。但し、デレーシヨンミユータントを作製する際の制限酵素は P s t I 及び B a m H I を用いた。その結果、インサートに含まれる H G I Rぺプチドコード領域の塩基配列が配列番号 2 の塩基配列であり変異が無いことを確認した。引き続き、 5 g の p B S /H G I R— F L A Gを 5 Uの制限酵素 K p n l を含む 5 0 /χ 1 の L b u f f e r に溶解し、 3 7 °Cにて 2 時間保温して完全消化した。フエノール/ クロ口ホルム抽出、エタノール沈殿後、 7 5 。/。エタノールにて沈殿を洗浄して D N Aを回収した後、 5 Uの T4 DNA poly merase、各 1 2 5 Mの dATP、 dCTP、 dGTP 及び dTTP を含む T4 DNA polymerase buf fer 中で 3 7 °Cで 3 0分間保温して平滑末端 D N Aを作製した。フエノールクロ口ホルム抽出、エタノール沈殿後、 7 5 %エタノールにて沈殿を洗浄して回収した D N Aを、 5 Uの制限酵素 E c 0 R I を含む 5 0 μ 1 の H b u f f e r に溶解し、 3 7 °Cにて 2 時間の保温により完全消化した。ァガ口一スゲル電気泳動を行ない、臭化工チジゥム染色後の U V照射にて検出される約 1 . 3 k b P の D N A断片を含むァガロースゲルを切リ出して回収精製を行ない、 HGIR- FLAG (EcoRI - BLUNT) 断片とした。

次に、 0 . 5 μ g の pcDNA3.1 (+ ) EccRI-EcoRV アーム及び 0 . 2 μ g の HGIR-FLAG(EcoRI- BLUNT) 断片を 2 0 μ 1 にてライゲ一ション反応後、反応液を用いて大腸菌を形質転換した。大腸菌の形質転換はコンビテントセル Escher i ch i a c_ o 1 i JM109 を用いて行なった。氷中で溶解した 1 0 0 μ 1 のコンビテントセルに 5 μ 1 のライゲーション反応液を加えて混合し、引き続き氷中で 3 0分間静置した。 4 2 °Cにて 3 0 秒間保温した後、予め 3 7 °Cに保温しておいた 0 . 9 m 1 の S O C培地を加えて 1 5 m 1 の遠心管に移し、 3 7 tにて 1 時間振盪培養した。この菌液を 5 0 μ g /m 1 のアンピシリンを含む L B寒天培地に塗り拡げて 3 7 °Cにて 1 6時間静置培養してコロニ一を形成させた。出現した単一のコロニーを 2 m 1 の L B /Am p に移植して一晚振盪培養して得た菌体ょリプラスミド D N Aを抽出し、 P E G I R 1 2 — F L A G を得た。構築した発現プラスミド p E G I R l 2 — F L A G の制限酵素切断部位並びに機能地図を図 5 に示した。

実施例 1 0

H G I R遺伝子産物の確認

実施例 9 において作製した H G I R及びその改変体発現プラスミドを LI POFECTAMINE Reagent (米国、 GIBCO BRL 社製）を用いて C O S — 1 細胞（日本国、大日本製薬よリ入手）に導入し、その遣伝子産物を抗 H G I R抗血清並びに抗 F L A G M 2抗体（米国、 KODAK 社製）を用いたウエスタンブロッティングにて解析した。

( 1 ) 発現プラスミドの細胞への導入

培地は 1 0 %ゥシ胎児血清（ F C S ) 、 5 0 I U / m 1 ぺニシリン、 5 0 g Zm l ストレプトマイシンを含む D M D M (日本国、大日本製薬社製）を使用した。導入に用いた各発現プラスミド（ P E G I R 1 1 及び P E G I R 1 2 — F L A G ) は、各プラスミドを保持する大腸菌コロニーを 1 5 0 m 1 の L B / A m p に移植し、 3 7 °Cにて一晚振璧培養して得た菌体よリ QIAGEN P l asm i d Max i Ki t を用いて調製した。また、陰性コントロールとして H G I Rを含まない pcDNA3. 1 (+ ) ベクターについても、以後同様に操作した。これら各 2 μ g の発現プラスミドをそれぞれ 4 1 の L I POFECTAMINE

Reagen t と 2 0 0 1 の OPT I -MEM I Re duc ed Se rum Me d i urn (米国、 GIBCO BRL社製）中で室温で 4 5分間静置した。反応液に 8 0 0 μ \ ( OPTト MEM I Reduc e d Se r um Med i uniを加えて導入反応液とした。 O

まず C O S 1 細胞を 3 5 m m φディッシュあたリ 2 X

1 0⁵細胞の密度でまきこみ、 5 % C O _zを満たした 3 7 °Cのインキュベータ一にて 2 4時間培養した。培養後の細胞を OPTI- E I Reduced Serum Medium にて洗浄後、前述の導入反応液を添加し、上記インキュベータ一にて 5時間培養した後、 2 0 %の F C S を含む培地を l m l 添加し、さらに上記インキュベータ一にて 1 8時間培養後導入反応液を除いた, その後、 2 m 1 の新しい培地を添加してさらに 3 日間培養した。

( 2 ) 細胞抽出液の調製

プラスミド導入後 3 日目に培地を除き、氷冷した P B S (一）にて細胞を洗浄後、氷冷した 1 0 % トリクロ口酢酸 ( T C A ) を 1 m I 添力 Dし、氷上に 3 0分間放置した。次にシリコン製スクレーパーを用いて細胞を剥がして 1 . 5 m 1 容のマイクロチューブへ移し、 4 °Cにて 3， 0 0 0 r p m · 1 0分間の遠心分離後の上淸を除いた。沈殿に 8 0 1 の尿素/ T r i t o n ZD T T溶液（ 9 M尿素、 2 %の T r i t o n X— 1 0 0及び 1 %の D T T ) を加えて、タイテック社製超音波ホモジナイザー U S— 5 S型を用い、目盛 2 にて 1秒間超音波処理を行なった。次に 2 0 μ 1 のし i D S溶液〔 1 0 % ドデシル硫酸リチウムにブロモフエノールブルー ( B P B ) が色が付く程度添加したもの〕を加え、さらに 1

M リスを溶液が黄色から青色になるまで約 5 μ 1 加えた。これを沈殿が完全に無くなリ溶液の粘張性が無くなるまで再度超音波処理を行なって細胞抽出液とした。

( 3 ) ウェスタンプロッティングによる遣伝子発現産物の解析

S D S — P A G E用ゲル（Mul t igel4/20、日本国、第一化学社製）を用い、 1 レーン当たリ 1 X 1 0⁴細胞分の細胞抽出液を添付の試料に従って S D S — P A G Eを行なった。但し、このときサンプルの加熱処理は行なわず、また 2種類の抗体による検出を行なう目的で、ゲル 2枚を用いて同じサンプルを電気泳動した。電気泳動終了後、各ゲルを H y b o n d - E C L (英国、アマシャム社製）フイノレターに Bio- R ad 社製ミニトランスプロットセルを用いて転写した。この様にして作製した 2枚のフィルタ一をブロッキング溶液〔 5 %スキムミルク（米国、ディフコ社製）及び 0 . 1 %の T w e e n 2 0 を含む T B S溶液（ 2 0 mM トリスー塩酸緩衝液（ P H 7. 6 ) 及び 1 3 7 mM塩化ナトリウム）〕に浸し、室温にて揺すりながら 1 時間反応させた。次に 0 . 1 %の T w e e n 2 0 を含む T B S溶液にて 3 回洗浄した後、抗体希釈液 ( 2 %スキムミルク及び 0 . 1 %の T w e e n 2 0 を含む T B S溶液）にて 1 0 0 0倍に希釈して得た一次抗体溶液（ 1 枚を抗 H G I R抗血淸溶液、もう 1枚を抗 F L A G M 2抗体溶液）に浸して室温にて摇すリながら 1 時間反応させた。 0 . 1 %の T w e e n 2 0 を含む T B S溶液にて 3 回洗浄した後、前述の抗体希釈液にて 1 0 0 0倍に希釈した二次抗体溶液〔抗 H G I R抗血清を一次抗体に用いた場合は H R P標識抗ゥサギ抗体（英国、アマシャム社製）、抗 F L A G M 2抗体を一次抗体に用いた場合は H R P標識抗マウス抗体 (英国、アマシャム社製）をそれぞれ用いた〕に浸して室温にて摇すリながら 1 時間反応させた。これをさらに 0 . 1 % の T w e e n 2 0 を含む T B S溶液にて 3回洗浄した。最後の洗浄の後、 E C L ウェスタンブロッテイング検出試薬（英国、アマシャム社製）に 1 分間浸した後、ハイブリダィゼィションバッグに封じてハイノーフイノレム E C Lに感光させた _c その結果、 P E G I R 1 2— F L A Gを導入した C O S 1 細胞由来の抽出液中には、抗 H G I R抗血清、抗 F L A G抗体いずれを一次抗体に用いた場合にも検出されるシグナルが観察された。このシグナルはその挙動が同じであることから導入した発現プラスミドの遺伝子発現産物は H G I R— F L A G融合ペプチドであることが確認できた。一方、 p E G I R 1 1 を導入した C O S 1 細胞由来の抽出液では、抗 H G I R抗血淸を一次抗体に用いた場合にのみシグナルが認められた。このシグナルは前述の融合べプチドと全く同じ挙動を示すことから、これは H G I Rにより作られたペプチドであることが確認できた。一方、陰性コントロールとして用いて p c D N A 3 . 1 ( + ) ベクターを導入した C O S 1 細胞由来の抽出液にはいずれの抗体によるシグナルも検出されなかつた。

以上の手順によリ、 H G I R 1 遺伝子がコードするぺプチドを免疫化学的に確認することができた。実施例 1 1

ノーザンハイブリダイゼィション法によるヒト組織における H G I Rの m R N Aの分布の解析

ヒトの各組織よリ抽出された m R N Aを固定したメンブランとして、 Human Mu l t i p l e T i s s ue No r t he rn B l o t (米国、 C LONTECH 社製）を使用した。このメンブランに固定されている m R N Aは、ヒトの心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、脾臓の各組織由来のものである。このメンブランを実施例 5 と同様の方法にて処理し、ノーザンハイブリダィゼィション法によリメンブランに固定された m R N Aの解析を行なった。即ち、 5 0 %ホルムアミド、 5倍濃度 S S P E 、 5 倍濃度 D e n h a r d t ' s 液及び 2 %の S D Sからなる液に終澳度 1 0 0 μ g / m 1 となるように変性サケ精子 D N A を加えてプレーハイプリダイゼイション液を調製した。上記の m R N Aを固定したメンブランをハイプリダイゼイションバッグに入れ、メンブラン 1 c m ² あたリ 0 . 1 m 1 のプレ一ハイブリダィゼイシヨン液を入れてシールし、 4 2 °Cの水浴中で 4時間振盪保温した。このバッグに、 1 0 0 °Cにて 5 分間の保温後に氷中で急冷した実施例 4 にて作製した標識 H G I Rプローブ D N Aを終濃度 1 X 1 0 ⁶ c p m / m 1 となるように加えてシールし、さらに 4 2 °Cの水浴中で 2 4 時間振盪保温した。メンブランを取り出し、室温で洗浄液 1 にて 1 0分間洗浄した。引き続き、 5 0 °Cで洗浄液 1 を用いて 3 0分間洗浄後、さらに 5 0 °Cで洗浄液 3 を用いて 3 0分間洗浄した。ハイブリダィゼイシヨン後のメンブランは、 B A S 2 0 0 0イメージングアナライザ一にて放射活性の読み取り並びに検出を行った。その結果、ヒト脳よリ抽出した m R N Aを固定したレーンにおいて明かなシグナルが検出された。つまリ、 H G I Rはヒト由来の組織においては脳で高い発現をしていることが明らかとなった。

産業上の利用可能性

本発明の新規遺伝子 H G I R又はその遣伝子がコードするペプチドを用いると、従来明確ではなかった、血管内皮細胞機能をコントロールしているずリ応力が、個々の細胞においてどの程度負荷しているかを発現量に置き換えて簡便に測定することが可能となリ、個々の內皮細胞機能について詳細に解析することができる。血管内皮細胞の機能とずり応力との関係をさらに詳細に解析し、血管内皮細胞機能障害からなる種々の脈管疾患発症メカニズムの解明を行なうための効率的な発現物質解析並びに関連物質探索も可能となる。

更に、本発明の遣伝子はヒトの脳組織において高い発現をしていることが明らかとなリ、神経伝達物質のレセプターとしての生理機能を有する可能性も見出された。従って、本発明の遺伝子によりコードされるペプチドを利用し、上記ぺプチドに結合しうる物質、及び上記べプチドとぺプチドに結合しうる物質との結合を抑制又は阻害する物質を検出することができ、例えば、本発明の前記検出する方法にょリ取得された物質は、中枢における神経性疾患に対する医薬品として展開しうる。配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 4 2 3

配列の型：ぺプチド

配列の種類：アミノ酸

配列

Me t Va 1 Pro His Leu Leu Leu Leu Cys Leu Leu Pro Leu Va 1 Ai A 1 a

1 5 10 15

Th r Gl u Pro His Glu Gl y Ar g Ala Asp Gl u Gin Ser Ala Gl u Ala Ala

20 25 30

Leu Ala Va 1 Pro Asn Ala Set His Phe Phe Se i Trp Asn Asn Tyr Thr

35 40 45

Phe Set Asp Trp Gin Asn Phe Va 1 Gly Ai g Atg Arg Tyr Gl Ala Glu

50 55 60

Ser Gin Asn Pro Thr Va 1 Lys Ala Leu Leu l ie Va 1 Ala Tyr Sei Phe 65 70 75 80 lie I 1 e Val Phe Ser Leu Pbe Gly Asn Va 1 Leu Va 1 Cys His Va ! lie

85 90 95

Phe Lys Asn Gin Arg Met Hi s Ser Ala Thr Ser Leu Phe l ie Va 1 Asn

100 105 110

Leu Ala Val Ala Asp lie Met l ie Thr Leu Leu Asn Thr Pro Phe Thr

115 120 125

Leu Val Aig Phe Val Asn Se i Thr Trp 11 e Phe Gly Lys Gly Met Cys

130 135 140

His Val Se【 Arg Phe Ala Gin Tyr Cys Ser Leu His Val Se i Ala Leu 145 150 155 160

Thr Leu Thr Ma 【le Ala Va 1 Asp Arg His Gin Val lie Met His Pro >

Leu Pro Thr Ser Gin Leu Gin Ser Gly Lys Thr Asp Leu Sei Se r Va 1

405 410 15

Glu Pro l ie Va I Thi Met Sei

420 423

配列番号： 2

配列の長さ： 1 2 6 9

配列の型：核酸

配列の種類： DN A

配列

ATGGTCCCTC ACCTCTTGCT GCTCTGTCTC CTCCCCTTGG TGCGAGCCAC CGAGCCCCAC 60 GAGGGCCGGG CCGACGAGCA GAGCGCGGAG GCGGCCCTGG CCGTGCCCAA TGCCTCGCAC 120 TTCTTCTCTT GGAACAACTA CACCTTCTCC GACTGGCAGA ACTTTGTGGG CAGGAGGCGC 180

TACGGCGCTG AGTCCCAGAA CCCCACGGTG AAAGCCCTGC TCATTGTGGC TTACTCCTTC 240

ATCATTGTCT TCTCACTCTT TGGCAACGTC CTGGTCTGTC ATGTCATCTT CAAGAACCAG 300

CGAATGCACT CGGCCACCAG CCTCTTCATC GTCAACCTGG CAGTTGCCGA CATAATGATC 360

ACGCTGCTCA ACACCCCCTT CACTTTGGTT CGCTTTGTGA ACAGCACATG GATATTTGGG 420

AACGGCATGT GCCATGTCAG CCGCTTTGCC CAGTACTGCT CACTGCACGT CTCAGCACTG 480

ACACTGACAG CCATTGCGGT GGATCGCCAC CAGGTCATCA TGCACCCCTT GAAACCCCGG 540

ATCTCAATCA CAAAGGGTGT CATCTACATC GCTGTCATCT GGACCATGGC TACGTTCTTT 600

TCACTCCCAC ATGCTATCTG CCAGAAATTA TTTACCTTCA AATACAGTGA GGACATTGTG 660

CGCTCCCTCT GCCTGCCAGA CTTCCCTGAG CCAGCTGACC TCTTCTGGAA GTACCTGGAC 720

TTGGCCACCT TCATCCTGCT CTACATCCTG CCCCTCCTCA TCATCTCTGT GGCCTACGCT 780

CGTGTGGCCA AGAAACTGTG GCTGTGTAAT ATGATTGGCG ATGTGACCAC AGAGCAGTAC 840

TTTGCCCTGC GGCGCAAAAA GAAGAAGACC ATCAAGATGT TGATGCTGGT GGTAGTCCTC 900

TTTGCCCTCT GCTGGTTCCC CCTCAACTCC TACGTCCTCC TCCTGTCCAG CAAGGTCATC 960

CGCACCAACA ATGCCCTCTA CTTTGCCTTC CACTGGTTTG CCATGAGCAG CACCTGCTAT 1020 AACCCCTTCA TATACTGCTG GCTGAACGAG AACTTCAGGA TTGAGCTAAA GGCATTACTG 1080

AGCATGTGTC AAAGACCTCC CAAGCCTCAG GAGGACAGGC CACCCTCCCC AGTTCCTTCC 1140

TTCAGGGTGG CCTGGACAGA GAAGAATGAT GGCCAGAGGG CTCCCCTTGC CAATAACCTC 1200

CTGCCCACCT CCCAACTCCA GTCTGGGAAG ACAGACCTGT CATCTGTGGA ACCCATTGTG 1260

ACGATGAGT 1269 配列番号： 3

配列の長さ： 1 5 6 2

配列の型：核酸

配列の種類： D N A

配列

GTCCCGAGGA GCCAGGGAGC CCGGACGCGC GGAGCACCGC GCCGCCCGCC ACCAGCCCGC 60

GGTCGGCCTT GTATGCTGTG CGCCCCGCAC CCCGGCTGCG CGCTCCGATC CCAGCGGGAG 120

GGGACGCCCG GCCCGCAGGC TCCCAGGGGA GGGGTGGCTC CTGCAAAATG GTCCCTCACC 180

TCTTGCTGCT CTGTCTCCTC CCCTTGGTGC GAGCCACCGA GCCCCACGAG GGCCGGGCCG 240

ACGAGCAGAG CGCGGAGGCG GCCCTGGCCG TGCCCAATGC CTCGCACTTC TTCTCTTGGA 300

ACAACTACAC CTTCTCCGAC TGGCAGAACT TTGTGGGCAG GAGGCGCTAC GGCGCTGAGT 360

CCCAGAACCC CACGGTGAAA GCCCTGCTCA TTGTGGCTTA CTCCTTCATC ATTGTCTTCT 420

CACTCTTTGG CAACGTCCTG GTCTGTCATG TCATCTTCAA GAACCAGCGA ATGCACTCGG 480

CCACCAGCCT CTTCATCGTC AACCTGGCAG TTGCCGACAT AATGATCACG CTGCTCAACA 540

CCCCCTTCAC TTTGGTTCGC TTTGTGAACA GCACATGGAT ATTTGGGAAG GGCATGTGCC 600

ATGTCAGCCG CTTTCCCCAG TACTGCTCAC TGCACGTCTC AGCACTGACA CTGACAGCCA 660

TTGCGGTGGA TCGCCACCAG GTCATCATGC ACCCCTTGAA ACCCCGGATC TCAATCACAA 720

AGGGTCTCAT CTACATCGCT GTCATCTGGA CCATGGCTAC GTTCTTTTCA CTCCCACATG 780

CTATCTGCCA GAAATTATTT ACCTTCAAAT ACAGTGAGGA CATTGTGCGC TCCCTCTGCC 840

TGCCAGACTT CCCTGAGCCA GCTGACCTCT TCTGGAAGTA CCTGGACTTG GCCACCTTCA 900

TCCTCCTCTA CATCCTGCCC CTCCTCATCA TCTCTCTGGC CTACGCTCGT GTGGCCAAGA 960 AACTGTGGCT GTGTAATATG ATTGGCGATG TGACCACAGA GCAGTACTTT GCCCTGCGGC 1020

GCAAAAAGAA GAAGACCATC AAGATGTTGA TGCTGGTGGT AGTCCTCTTT GCCCTCTGCT 1080

GGTTCCCCCT CAACTGCTAC GTCCTCCTCC TGTCCAGCAA GGTCATCCGC ACCAACAATG 1140

CCCTCTACTT TGCCTTCCAC TGGTTTGCCA TGAGCAGCAC CTGCTATAAC CCCTTCATAT 1200

ACTGCTGGCT GAACGAGAAC TTCAGGATTG AGCTAAAGGC ATTACTGAGC ATGTGTCAAA 1260

GACCTCCCAA GCCTCAGGAG GACAGGCCAC CCTCCCCAGT TCCTTCCTTC AGGGTGGCCT 1320

GGACAGAGAA GAATGATGGC CAGAGGGCTC CCCTTGCCAA TAACCTCCTG CCCACCTCCC 1380

AACTCCAGTC TGGGAAGACA GACCTGTCAT CTGTGGAACC CATTGTGACG ATGAGTTAGA 1440

AGAGGTTGGG AAGAGGGAGT GGGAGGGGTC TGTCTCCACC TGAGGCAGGG AAAGAGAGCC 1500

TATTCTCACA CATGATCTTC AGAGTGCTGG AAACACACTC CTGCAGAAGC TGTAGGACTC 1560

TT 1562 配列番号： 4

配列の長さ： 3 8

配列の型：核酸

配列の種類： D N A

配列

TAGTCGACWK YCT1ACIGYI MTIRSIRTIG AYMGITWY 38 配列番号： 5

配列の長さ： 3 6

配列の型：核酸

配列の種類： D N A

配列

TGGAATTCTT RYTIAA AAI SCRTAIATIA VIGGRT 36 配列番号： 6

配列の長さ： 3 6

配列の型：核酸

配列の種類： D N A

配列

GAATTCGGAT CCGGAGGGGT GGCTC CTGCA AAATGG 36 配列番号： 7

配列の長さ： 2 9

配列の型：核酸

配列の種類： D N A

配列

GGTAC CTAAC TCATCGTCAC AATGGGTTC 29 配列番号： 8

配列の長さ： 5 3

配列の型：核酸

配列の種類： D N A

配列

GGTACCTA CT TGTCATCCTC GTCCTTGTAG TCACTCATCG TCACAATGGG TTC 53

Claims

請求の範囲

2. 該ペプチドコード領域が、配列番号 1 のアミノ酸配列を包含するべプチドをコ一ドする塩基配列である請求項 1 に記載の D N A。

3 . 該ペプチドコード領域が、配列番号 2 の塩基配列である請求項 1 に記載の D N A。

4. 制限酵素地図にょリ特徴付けられるヒト由来の全長 D N Aが、配列番号 3 の塩基配列である請求項 1 に記載の D N A

5 . 請求項 1 から 4 のいずれかに記載の D N Aに対する相補的な D N A。

6 . 請求項 1 から 4 のいずれかに記載の D N Aを複製可能なベクターに組み込んでなる複製可能な組換え体 D N A。

7 . 配列番号 2の 1 一 1 3 5の塩基配列を含む D N Aにハイブリダイズしうる D N A。

8 . 請求項 7 に記載の D N Aに対する相補的な D N A。

9 . 請求項 7 に記載の D N Aを複製可能なべクターに組み込んでなる複製可能な組換え体 D N A。

1 0 . 請求項 6又は 9 に記載の複製可能な組換え体 D N Aで形質転換された微生物または細胞。

1 1 . 請求項 1 または 7 に記載の D N Aによりコードされる実質的に純粋なぺプチド。

1 2 . 配列番号 1 のアミノ酸配列を包含してなる請求項 1 1 に記載のぺプチド。

1 3 . ( a ) 請求項 1 または 7 に記載の D N Aを複製可能な発現ベクターに結合して、該 D N Aと該複製可能な発現べクターとを含有する複製可能な組換え体 D N Aを得、

( e ) 該ペプチドを培養した形質転換体から実質的に単離する、ことを包含する方法によって製造されうるペプチド。

1 4 . 少なくとも配列番号 1 のアミノ酸配列を包含してなるペプチドと結合しうる抗体。

1 5 . 図 1 の制限酵素地図に示される制限酵素切断部位によリ特徴付けられるヒト由来の全長 D N Aの少なくともべプチドコ一ド領域を包含する D N A及び配列番号 2 の 1 一 1 3 5 の塩基配列を含む D N Aにハイプリダイズしうる D N Aよリ成る群よリ選ばれる少なくとも 1 種の D N Aがコ一ドするぺブチドを、該ペプチドに結合しうる物質を含有すると考えられる被検体と接触せしめ、該ペプチドと該ペプチドに結合しうる物質との結合に対応して起きる変化を指標として、該ぺプチドに結合しうる物質の検出を行うことを特徴とする検出方法。

1 6 . 図 1 の制限酵素地図に示される制限酵素切断部位によリ特徴付けられるヒト由来の全長 D N Aの少なくともべプチドコード領域を包含する D N A及び配列番号 2 の 1 一 1 3 5 の塩基配列を含む D N Aにハイプリダイズしうる D N Aよリ成る群よリ選ばれる少なくとも 1 種の D N Aがコードするぺブチド及び該ペプチドに結合しうる物質を、該ペプチドと該ぺプチドに結合しうる物質との結合を阻害しうる物質を含有すると考えられる被検体と接触せしめ、そして該ペプチドと該ぺプチドに結合しうる物質の結合に対応して起きる変化を指標として、該ペプチドと該ペプチドに結合しうる物質との結合を阻害しうる物質の検出を行うことを特徴とする検出方法。