[go: up one dir, main page]

WO1997032897A1 - Peptides radioactifs utiles pour le criblage d'inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'endotheline - Google Patents

Peptides radioactifs utiles pour le criblage d'inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'endotheline Download PDF

Info

Publication number
WO1997032897A1
WO1997032897A1 PCT/FR1997/000368 FR9700368W WO9732897A1 WO 1997032897 A1 WO1997032897 A1 WO 1997032897A1 FR 9700368 W FR9700368 W FR 9700368W WO 9732897 A1 WO9732897 A1 WO 9732897A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
formula
product
val
ile
pro
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1997/000368
Other languages
English (en)
Inventor
Jacques Dumas
Bernard Pierre Roques
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Sanofi Aventis France
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Roussel Uclaf SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Roussel Uclaf SA filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Publication of WO1997032897A1 publication Critical patent/WO1997032897A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57536—Endothelin, vasoactive intestinal contractor [VIC]

Definitions

  • the dilation and vasoconstriction factors are produced by endothelial cells in response to stimulation which can be produced for example by interleukin-1, thrombin, TGF- ⁇ , the phorbol ester, l 'angiotensin II, vasopressin or hypoxia-anoxia, to act on smooth muscle cells.
  • ET-1 endothelin-1
  • ET-l has a strong vasoconstrictive activity at concentrations lower than a nanomole on the coronary arteries in-vitro and increases the blood pressure after intravenous injection in vivo.
  • ET-1 is a member of a family of structurally close hormones which are endothelin-2 and endothelin-3.
  • the cloning of the pig gene made it possible to predict the sequence of a 212 amino acid preproendothelin which is successively cleaved twice first in proendothelin then in big-endothelin (b-ET-1) before being converted in active endothelin.
  • the sequence of b-ET-1 is recalled in Figure 1 below.
  • ET-1 has been shown to be a vasoconstrictor 100 times more active than b-ET-1.
  • ECE endothelin converting enzyme
  • One of the keys to the treatment of certain pathologies could be a treatment by inhibition of ECE: one can thus cite the treatment of congestive heart failure, myocardial infarction, reperfusion disorders or lesions, l angina pectoris, vascular spasms, vasospasm following cerebral hemorrhage, coronary spasms, peripheral vascular spasms, gastric ulcer induced by non-steroidal anti-inflammatory agents, nephrotoxicity induced by cyclosporine, kidney failure, the athéro ⁇ sclerosis, some forms of hypertension such as in particular pulmonary hypertension, asthma treatment, 1 • endothoxarte, Raynaud's disease, certain laor- dres diabetics, certain secretory endothelin tumors as well as the prevention of post-angioplasty restenosis, cardiac and vascular fibrosis.
  • HPLC requires a large amount of b-ET-1 and the enzyme.
  • the RIA lacks selectivity for the recognition of ET-l in the presence of b-ET-l.
  • AB FAWZI (as indicated in the publication Fawzi AB, Clemen RM and Wright DL (1994) Anal. Biochem. 222, 342-350), has developed a test based on the conversion of i-labeled b-ET 125 to 125 I-ET and the quantitative determination of 125 I-ET produced by fixation on the endothelin receptor. The authors do not use this test for inhibitor screening but for the identification of the enzyme in the tissues that contain it.
  • T. WARNER (as indicated in the publication Warner TD, Budzik JP, Mitchell JA, Juang ZJ., And Murad F. (1992) 20 (Sup 12): S19-S21), has developed a selective biotest based on ET-1-induced cGMP increase in kidney epithelial cells LLC-PK1. But this test requires a lot of time and is too elaborate for screening.
  • X represents a hydrocarbon radical comprising at least one radioactive atom
  • Z 1 # Z 2 , Z 4 , Z 5 and Z 6 identical or different represent amino acids
  • Z 3 represents either the amino acid Asn, or the paranitro- Phe
  • this inhibitory activity of ECE will therefore be all the greater that the quantity of product of formula (II) formed, determined by counting the radioactivity, will be lower.
  • test of the present invention is therefore based on the use of new peptides of formula (I) in which the N-terminal part is acylated, which has at least three advantages: protect from cleavage by aminopeptidases, strengthen the hydrophobicity of the fragment N-terminal which will be generated by hydrolysis and allow radioactive labeling by acylation providing at least one radioactive atom and in particular by tritiated propionylation.
  • a subject of the present invention is therefore the products of formula (I):
  • Z- ⁇ _, Z 2 , Z 4 , Z ⁇ and Zg are chosen from known amino acids such as for example those belonging to the big-endothelin sequence.
  • Z 3 represents either the amino acid Asn or paranitrophenylalanine (commercial).
  • the products of formula (I) are such that X represents a hydrocarbon radical comprising at least one radioactive atom,
  • Z 1 and Z 2 are such that: either Z 1 and z 2 represent a single bond, or z ⁇ represents a single bond and Z 2 represents the amino acid Asp, or Z 1 and Z 2 respectively represent the amino acids Leu and Asp,
  • Z 3 represents either the amino acid Asn or paranitro-Phe
  • Z 4 , Z 5 and Zg are such that: either Z 4 , Z 5 and Zg represent a single bond, or Z 5 and Zg represent a single bond and Z 4 represents the amino acid Pro, or Zg represents a single bond and Z 4 and Z 5 represent respectively the amino acids Pro and Arg, or Z 4 , Z 5 and Z 6 represent respectively the amino acids Pro , Arg and Ser.
  • the present invention more specifically relates to the products of formula (I) as defined above, corresponding to formula (I A ):
  • X represents a hydrocarbon radical comprising at least one radioactive atom.
  • X can be a linear or branched alkyl radical containing at most 4 carbon atoms such as the radical methyl, ethyl, propyl or butyl and preferably ethyl or a phenyl radical.
  • X can thus contain one or more radioactive atoms, in particular tritium substituted with one or more hydrogen atoms of the alkyl or phenyl radical that X represents.
  • the present invention particularly relates to the products of formula (I) as defined above, in which the radical X comprises at least one tritium atom.
  • X-C can in particular represent the propionyl radical,
  • III o which may contain from 1 to 5 atoms of tritium 3 H and in particular 4 or 2 atoms of tritium such as the radical (2,3) 3 H-propionyl.
  • a more particular subject of the present invention is the products of formula (I) as defined above, in which XC- represents the (2,3) 3 H-propionyl radical.
  • the present invention also relates to a process for preparing the products of formula (I), as defined above, characterized in that a product of formula (III) is subjected:
  • R represents for example the succinimidyl radical, a norbornene radical or else any esterification compound of the carboxy radical
  • R represents for example the succinimidyl radical, a norbornene radical or else any esterification compound of the carboxy radical
  • the radical X can thus contain one or more tritium atoms.
  • Mention may be made, for example, of the X-COOR compounds, of the N-hydroxy-5-norbornene- (2,3) -dicarboximide-propionate compound formed from N-hydroxy-5-norbornene- (2,3) acid.
  • -dicar- boximide and propionic acid which can thus, depending on the labeling of propionic acid, contain 1 to 5 tritium atoms and in particular 4 or 2.
  • the acylation reaction of the product of formula (III) into the product of formula (I) can be carried out under the usual conditions known to those skilled in the art.
  • B-ET-1 (19-35) used as starting material can be prepared according to the usual methods such as in particular by an automatic solid phase synthesizer such as the model, for example, 431A from Applied Biosystems using the technology Fmoc, as described in the reference: ATHERTON, E. and SHEPPARD, RC (1989) Solid phase peptide synthesis: a pratical approach, IRL Press, Oxford. Such a process is illustrated below in point I of the experiential part.
  • the present invention particularly relates to the use of a product of formula (I), as defined above, for the identification of inhibitors of the endothelin converting enzyme.
  • the present invention more particularly relates to the use as defined above of a radioactive product of formula (I) as defined above, characterized in that the enzyme is brought into contact conversion of endothelin, a product P for which it is desired to determine the inhibitory activity of the endo ⁇ thelin converting enzyme, and the product of formula (I) as defined above above ; and after incubation, the cleavage reaction is stopped, the product formed of formula (II) is selectively extracted:
  • the product P as defined above to which the test defined above is applied to determine its ECE inhibiting activity can be of various nature, without limitation, and for example, can be chosen from phosphoni - mides, phosphamides and derivatives of these products, or even metalloproteinase inhibitors such as thiol derivatives, carboxylates or hydroxamates. Mention may also be made, as product P, of phosphoramidone (public domain) which is called here PI and N- (phenylethylphosphonyl) -Leu-Trp (TAKEDA) which is called here P2, whose inhibitory activities of the ECE are known and to which the test of the present invention can be applied, as is shown below in point II of the experimental part.
  • PI phosphoramidone
  • TAKEDA N- (phenylethylphosphonyl) -Leu-Trp
  • ECE can be obtained, for example, according to the preparations and purification from rat lung as indicated in the reference: Takahashi M., Matsushita Y., Iijima Y. and Tanzawa K. (1993) J. Biol . Chem. 268, 21394-21398.
  • a very particular subject of the present invention is the use as defined above, characterized in that the solvent product used to stop the cleavage reaction and selectively extract the product of formula (II), as defined above is l 1 ethyl acetate.
  • a more particular subject of the present invention is the use as defined above caracté ⁇ ized in that a product of formula (I) is used such as defined above in which XC- represents
  • II o preferably a 3 H-propionyl radical and in particular (2,3) 3 H-propionyl.
  • test as defined above may in particular have as starting material the product of formula (I):
  • a subject of the present invention is thus the test for the identification of inhibitors of the endo ⁇ thelin converting enzyme, characterized in that this test comprises a product of formula (I) as defined above .
  • TRK.556 is in solution in 5 ml of toluene at 1 mCi / ml
  • the toluene is evaporated until a 10 ⁇ l solution is obtained and then 25 ⁇ l of a DMSO solution containing
  • Elution is carried out with a flow rate of 0.8 ml / min per a gradient from 0 to 20% acetonitrile in 20 min then 20 to
  • the analysis of the fractions is carried out by counting the tritium on the liquid scintillation counter (1 ⁇ l in 5 ml of HiSafe3 scintillant) for 60 seconds.
  • ECE Endothelin converting enzyme
  • the reaction is initiated by adding 10 ⁇ l of
  • Each measurement is carried out in triplicate except for the ECE control (enzyme control, without product of which one wants to test the inhibiting activity of the ECE), for which the measurement is carried out in sextuplet.
  • the percentage inhibition is calculated by doing the report: product tested - enzyme blank control - blank
  • the blank is made from the solution obtained without enzyme.
  • the table below gives the results obtained by using known inhibitors as P products, namely PI which is phosphoramidon and P2 which is N- (phenylethylphosphonyl) -Leu-Trp (TAKEDA), the inhibitory activities of which we want to test from ECE. From this table and by plotting the graph of the percentage of inhibition relative to the inhibitor concentration (nM), the IC 50 is calculated which therefore corresponds to the concentration causing a 50% inhibition of the ECE.
  • the inhibition constant (Kl) of a product can be obtained by using the value of the constant

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

L'invention a notamment pour objet les produits de formule (IA) dans laquelle X représente notamment le radical (2,3)3H-propionyle, leur utilisation dans un test d'identification d'inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'endothéline et la détermination rapide du pouvoir inhibiteur de ces composés. Utilisé en routine, ce test permet la réalisation d'un grand nombre d'essais.

Description

PEPTIDES RADIOACTIFS UTILES POUR LE CRIBLAGE D'INHIBITEURS DE L'ENZYME DE CONVERSION DE L'ENDOTHELINE
Depuis 1980, on sait que les facteurs de dilatation et vasoconstriction sont produits par les cellules endothéliales en réponse à une stimulation qui peut être produite par exemple par 1 'interleukine-l, la thrombine, le TGF-β, l'ester phorbol, l'angiotensine II, la vasopressine ou encore l'hypoxie-anoxie, pour agir sur les cellules des muscles lisses.
En 1988, M. YANAGISAWA découvrit l'endothéline-1 (ET-1) qui est un peptide bicyclique de 21 acides aminés sécrété par les cellules endothéliales vasculaires. ET-l possède une forte activité vasoconstrictive à des concentrations infé¬ rieures à une nanomole sur les artères coronaires in-vitro et augmente la pression sanguine après injection intraveineuse in vivo. ET-l est un membre d'une famille d'hormones proches structuralement qui sont l'endothéline-2 et endothéline-3. Le clonage du gène de porc a permis de prédire la séquence d'une préproendothéline de 212 acides aminés qui est clivée succes¬ sivement deux fois d'abord en proendothéline puis en big-endothéline (b-ET-1) avant d'être convertie en endothé- line active. La séquence de la b-ET-1 est rappelée dans la figure 1 ci-après.
Il a été montré que ET-l est un agent vasoconstricteur 100 fois plus actif que b-ET-1.
La dernière étape de formation de ET-l est opérée par l'intermédiaire d'une enzyme de conversion de l'endothéline (ECE) : ECE clive spécifiquement la liaison Trp21-Val22 de b-ET-l (1-38) soit entre les acides aminés 21 et 22 de b-ET-l qui comporte 38 acides aminés, générant ainsi deux fragments l'un, N-terminal, ET-l (1-21) et l'autre, C-terminal, CTF (22-38).
De nombreux enzymes ont été décrits comme possédant l'activité ECE : les deux principaux sont d'une part une aspartyl-protéase ou cathepsin-like qui est active à pH acide et inhibée par la pepstatine A et d'autre part une métallo- protéase active à pH neutre et inhibée par le phosphoramidon. Les b-ET-l et ET-l ont été détectées dans le surnageant de culture de cellules endothéliales et dans le plasma alors qu'elles n'existent qu'à très faible concentration dans le milieu intracellulaire, suggérant que la conversion de b-ET-l en ET-l pourrait se produire dans le milieu extracellulaire. D'autres travaux tendraient à prouver que la conversion se ferait majoritairement à l'intérieur de la cellule. L'existence de ECE clivant la b-ET-l est attestée par des expériences démontrant in-vivo que l'administration de b-ET-l est immédiatement accompagnée d'une augmentation de la quantité d'ET-1 plasmatique. Cependant, il n'a pas été possi¬ ble de convertir b-ET-l en ET-l in vitro dans le plasma. De l'avis général, l'enzyme physiologique semble être la métalloprotéase.
Une des clés du traitement de certaines pathologies pourrait être un traitement par inhibition de l'ECE : on peut ainsi citer le traitement de l'insuffisance cardiaque congés- tive, de l'infarctus du myocarde, de troubles ou lésions de reperfusion, de l'angine de poitrine, des spasmes vascu- laires, du vasospasme consécutif à une hémorragie cérébrale, des spasmes coronariens, des spasmes vasculaires périphéri¬ ques, de l'ulcère gastrique induit par des agents anti- inflammatoires non stéroidiens, de la nephrotoxicite induite par la cyclosporine, des insuffisances rénales, de l'athéro¬ sclérose, de certaines formes d'hypertension comme notamment l'hypertension pulmonaire, le traitement de l'asthme, de 1•endothoxémie, de la maladie de Raynaud, de certains désor- dres diabétiques, de certaines tumeurs secrétrices d'endo- théline ainsi que la prévention des resténoses post-angio- plasties, des fibroses cardiaques et vasculaires.
Ainsi disposer d'un bon test de screening paraissait crucial au regard du développement de ces inhibiteurs de l'ECE.
De plus, les progrès dans l'identification de l'ECE physiologique et sa purification ont été limités par l'absence d'un test efficace permettant une détection à la fois rapide, sélective et sensible.
Les tests connus utilisant b-ET-l et l'analyse du frag¬ ment peptidique obtenu à partir de b-ET-l par HPLC, RIA ou SPA qui sont des techniques utilisées couramment sont soit très lents, soit peu spécifiques, ce qui les rend non adaptés au screening d'un inhibiteur.
L'HPLC nécessite une grande quantité de b-ET-l et d'enzyme. Le RIA manque de sélectivité pour la reconnaissance de ET-l en présence de b-ET-l. A.B. FAWZI (comme l'indique la publication Fawzi A.B., Clemen R.M. and Wright D.L. (1994) Anal. Biochem. 222, 342-350) , a mis au point un test basé sur la conversion de b-ET marquée à l'iode 125 en 125I-ET et la détermination quantitative de 125I-ET produite par fixation sur le récep- teur de l'endothéline. Les auteurs n'utilisent pas ce test pour le screening d'inhibiteur mais pour l'identification de l'enzyme dans les tissus qui le contiennent.
T. WARNER (comme l'indique la publication Warner T.D., Budzik J.P., Mitchell J.A. , Juang Z-J., and Murad F. (1992) 20 (Sup 12) : S19-S21), a mis au point un biotest sélectif basé sur l'augmentation de GMPc induite par ET-l dans les cellules épithéliales de rein LLC-PK1. Mais ce test nécessite beaucoup de temps et est trop élaboré pour un screening.
Il a maintenant été mis au point et c'est l'objet de la présente invention un test nouveau, simple et rapide qui est sélectif pour le screening d'inhibiteurs de l'ECE.
Lors de la mise en oeuvre du test, objet de la présente invention, un produit de formule (I) :
X-C- ^ - ^2-Ile-He-Trp-Val-Z3-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val- || 21 22
0 (I)
Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-Z4-Z5-Z6-COOH
dans laquelle X représente un radical hydrocarboné comportant au moins un atome radioactif, Z1# Z2, Z4, Z5 et Z6 identiques ou différents représentent des acides aminés et Z3 représente soit l'acide aminé Asn, soit la paranitro-Phe, est clivé par l'ECE en produit de formule (II) :
X-C-Z1-Z2-Ile-Ile-Trp-COOH
Il (ID 0
dans laquelle X, Z-^ et Z2 ont les significations indiquées ci-dessus, en présence du produit P dont on veut déterminer l'activité inhibitrice de l'ECE : cette activité inhibitrice de l'ECE sera donc d'autant plus grande que la quantité de produit de formule (II) formé, déterminée par comptage de la radioactivité, sera plus faible.
Le test de la présente invention est donc basé sur l'utilisation de nouveaux peptides de formule (I) dont la partie N-terminale est acylée ce qui présente au moins trois avantages : protéger du clivage par les aminopeptidases, renforcer l'hydrophobicité du fragment N-terminal qui sera généré par l'hydrolyse et permettre un marquage radioactif par acylation apportant au moins un atome radioactif et notamment par propionylation tritiée.
La présente invention a ainsi pour objet les produits de formule (I) :
X-C-Z1-Z2-Ile-Ile-Trp-Val-Z3-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-
II
O (I)
Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-Z4-Z5-Z6-COOH
dans laquelle X, Z1# Z2, Z3, Z4, Zj et Zg ont les significa- tions indiquées ci-dessus.
Z-ι_, Z2, Z4, Zζ et Zg sont choisis parmi les acides aminés connus tels que par exemple ceux appartenant à la séquence de la big-endothéline. Z3 représente soit l'acide aminé Asn soit la paranitrophénylalanine (commerciale) . Notamment les produits de formule (I) sont tels que X représente un radical hydrocarboné comportant au moins un atome radioactif,
Z1 et Z2 sont tels que : soit Z1 et z2 représentent une simple liaison, soit z± représente une simple liaison et Z2 représente l'acide aminé Asp, soit Z1 et Z2 représentent respectivement les acides aminés Leu et Asp,
Z3 représente soit l'acide aminé Asn, soit la paranitro-Phe, et Z4, Z5 et Zg sont tels que : soit Z4, Z5 et Zg représentent une simple liaison, soit Z5 et Zg représentent une simple liaison et Z4 repré¬ sente l'acide aminé Pro, soit Zg représente une simple liaison et Z4 et Z5 représen¬ tent respectivement les acides aminés Pro et Arg, soit Z4, Z5 et Z6 représentent respectivement les acides aminés Pro, Arg et Ser.
La présente invention a plus précisément pour objet les produits de formule (I) telle que définie ci-dessus, répon¬ dant à la formule (IA) :
X-C-Ile-Ile-Trp-Val-Asn-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-
0 (IA)
Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-COOH
dans laquelle X représente un radical hydrocarboné comportant au moins un atome radioactif.
De tels produits de formule (I) peuvent aussi s'écrire :
X-C-b-ET-1 (19-35)
Dans le radical X-C, le radical hydrocarboné que
II O
représente X peut être un radical alkyle linéaire ou ramifié renfermant au plus 4 atomes de carbone tel que le radical méthyle, éthyle, propyle ou butyle et de préférence éthyle ou encore un radical phényle.
X peut ainsi renfermer un ou plusieurs atomes radio¬ actifs notamment de tritium substitué à un ou plusieurs atomes d'hydrogène du radical alkyle ou phényle que repré¬ sente X.
La présente invention a particulièrement pour objet les produits de formule (I) telle que définie ci-dessus, dans laquelle le radical X comporte au moins un atome de tritium. X-C peut notamment représenter le radical propionyle,
II o qui peut renfermer de 1 à 5 atomes de tritium 3H et notamment 4 ou 2 atomes de tritium tel que le radical (2,3)3H-propionyle.
La présente invention a plus particulièrement pour objet les produits de formule (I) telle que définie ci-dessus, dans laquelle X-C- représente le radical (2,3)3H-propionyle.
Il O
On définit ainsi le produit de formule (I) qui peut s'écrire :
( (2,3) 3H) -propionyl-b-ET-1 (19-35) ou ( (2,3)3H) -prop-b-ET-1 (19-35).
La présente invention a aussi pour objet un procédé de préparation des produits de formule (I) , telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce que l'on soumet un produit de formule (III) :
Z1-Z2-Ile-Ile-Trp-Val-Z3-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val- Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-Z4-Z5-Z6-COOH (III)
dans laquelle Zl t Z2, Z3, Z4, Z5 et Zg ont les significations indiquées ci-dessus, à une réaction d'acylation par un dérivé réactif de l'acide carboxylique de formule X-COOH dans laquelle X a la signification indiquée ci-dessus.
Le dérivé réactif de l'acide carboxylique de formule : X- COOR
dans lequel R représente par exemple le radical succinimi- dyle, un radical norbornène ou encore tout composé d'estéri- fication du radical carboxy, peut être trouvé dans le commerce, tel que notamment le N-succinimidyle- (2,3) 3H-pro- pionate, ou encore préparé selon les méthodes usuelles connues de l'homme du métier. Le radical X peut ainsi renfer¬ mer un ou plusieurs atomes de tritium. On peut citer par exemple parmi les composés X-COOR, le composé N-hydroxy-5-norbornène- (2,3) -dicarboximide-propionate formé à partir de l'acide N-hydroxy-5-norbornène- (2,3) -dicar- boximide et de l'acide propionique, qui peut ainsi selon le marquage de l'acide propionique, comporter 1 à 5 atomes de tritium et notamment 4 ou 2.
La réaction d'acylation du produit de formule (III) en produit de formule (I) peut être réalisée dans les conditions usuelles connues de l'homme du métier.
La b-ET-l (19-35) utilisée comme produit de départ peut être préparée selon les méthodes usuelles telles que notam¬ ment par un synthétiseur automatique en phase solide tel que le modèle, par exemple, 431A de Applied Biosystems utilisant la technologie Fmoc, tel que décrit dans la référence : ATHERTON, E. et SHEPPARD, R.C. (1989) Solid phase peptide synthesis : a pratical approach, IRL Press, Oxford. Un tel procédé est illustré ci-après au point I de la partie expéri¬ mentale.
La présente invention a particulièrement pour objet l'utilisation d'un produit de formule (I), telle que définie ci-dessus, pour l'identification des inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'endothéline.
La présente invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation telle que définie ci-dessus d'un produit radioactif de formule (I) telle que définie ci-dessus, carac- térisée en ce que l'on met en contact l'enzyme de conversion de l'endothéline, un produit P dont on veut déterminer l'activité inhibitrice de l'enzyme de conversion de l'endo¬ théline, et le produit de formule (I) telle que définie ci- dessus ; et après incubation, on arrête la réaction de clivage, extrait sélectivement le produit formé de formule (II) :
X-C-Z1-Z2-Ile-Ile-Trp-COOH
Il (ID
dans laquelle X, Zχ et Z2 ont les significations indiquées ci-dessus, et détermine par comptage l'activité inhibitrice du produit P à tester.
Le produit P tel que défini ci-dessus auquel on applique le test défini ci-dessus pour déterminer son activité inhi- bitrice de l'ECE peut être de nature diverse, sans limita¬ tion, et par exemple, peut être choisi parmi les phosphoni- mides, les phosphamides et les dérivés de ces produits, ou encore les inhibiteurs de métalloprotéinases tels que les dérivés thiol, carboxylates ou hydroxamates. On peut également citer comme produit P le phosphorami- don (domaine public) que l'on appelle ici PI et le N- (phényl- éthylphosphonyl) -Leu-Trp (TAKEDA) que l'on appelle ici P2, dont les activités inhibitrices de l'ECE sont connues et auxquels peut être appliqué le test de la présente invention, ainsi qu'il est montré ci-après au point II de la partie expérimentale.
L'ECE peut être obtenu, par exemple, selon les prépara¬ tion et purification à partir de poumon de rat comme indiqué dans la référence : Takahashi M., Matsushita Y., Iijima Y. and Tanzawa K. (1993) J. Biol. Chem. 268, 21394-21398.
La présente invention a tout particulièrement pour objet l'utilisation telle que définie ci-dessus caractérisée en ce que le produit solvant utilisé pour arrêter la réaction de clivage et extraire sélectivement le produit de formule (II) , telle que définie ci-dessus est l'acétate d1éthyle.
La présente invention a encore plus particulièrement pour objet l'utilisation telle que définie ci-dessus caracté¬ risée en ce que l'on utilise un produit de formule (I) telle que définie ci-dessus dans laquelle X-C- représente de
II o préférence un radical 3H-propionyle et notamment (2,3)3H-propionyle.
On obtient ainsi le produit de formule (II) telle que définie ci-dessus dans laquelle X-C- représente le radical
II o 3H-propionyle et qui peut s'écrire 3H-prop-b-ET-1 (19-21). Le test tel que défini ci-dessus peut notamment avoir pour produit de départ le produit de formule (I) :
3H-prop-b-ET-l (19-35)
pour obtenir le produit de formule (II) :
3H-prop-b-ET-l (19-21) dont on détermine la quantité par comptage de sa radioactivité. La présente invention a ainsi pour objet le test d'iden¬ tification d'inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'endo¬ théline, caractérisé en ce que ce test comprend un produit de formule (I) telle que définie ci-dessus.
Un tel test qui permet d'identifier un inhibiteur de l'ECE par une évaluation à la fois qualitative et quantita¬ tive de l'effet inhibiteur de ce produit, est décrit et illustré ci-après au point II de la partie expérimentale. On peut noter que la sensibilité du test tel que défini ci- dessus est augmentée lorsque dans les produits de formule (I) telle que définie ci-dessus, Z3 représente la paranitro-Phe et ce grâce à une augmentation de la vitesse de dégradation du substrat.
La présente invention a ainsi pour objet à titre de pro¬ duits industriels nouveaux : - les produits de formule (III) :
Z1-Z2-Ile-Ile-Trp-Val-Z3-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val- Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-Z4-Z5-Z6-COOH (III) - les produits de formule (II) :
X-C-Z1-Z2-Ile-Ile-Trp-COOH (II)
parmi lesquels de préférence le produit de formule (II) dans lequel X-C- représente le radical (2, 3) 3H-propionyle,
dans lesquelles formules, Z1# Z2, Z3, Z4, Z5, Zg et X ont les significations indiquées ci-dessus.
Les exemples suivants de préparation d'un produit de formule (I) et de mise en oeuvre du test illustrent l'inven¬ tion sans toutefois la limiter.
PARTIE EXPERIMENTALE
I - Préparation du peptide tritié ( (2,3)3H) -propionyl-b-ET-l
19-35) a - Synthèse de ( (2.3) 3H) -oropionyl-b-ET-l (19-35)
Le N-succinimidyl- (2, 3- H) -propionate (Amersham code
TRK.556) est en solution dans 5 ml de toluène à 1 mCi/ml,
99 mCi/mmol ==> 5 mCi et 50 nmoles.
On évapore le toluène jusqu'à obtenir une solution de 10 μl puis ajoute 25 μl d'une solution de DMSO contenant
0,2 mg de b-ET-l (19-35) , la b-ET-l(19-35) (MW=2014,2) ayant été préalablement séchée sur potasse une nuit. On continue à évaporer durant 10 mn puis agite la solution sous courant d'azote pendant 15 mn afin d'éliminer le toluène résiduel. On agite alors doucement durant 4 jours.
Lorsqu'on est prêt à purifier, on ajoute 225 μl de tampon phosphate pH 6,5 et 50 μl d'acétonitrile puis agite
10 mn. b - Purification de ( (2.3) 3H) -propionyl-b-ET-l (19-35) La solution radioactive obtenue ci-dessus en a) est séparée en 2 injections de 150 μl sur une colonne de
Nucléosil C1Q (150 x 4,6 mm) .
L'élution est effectuée avec un débit de 0,8 ml/mn par un gradient de 0 à 20 % d'acétonitrile en 20 mn puis 20 à
35 % en 50 mn.
Analyses :
L'analyse des fractions est effectuée par comptage du tritium au compteur à scintillation liquide (1 μl dans 5 ml de scintillant HiSafe3) durant 60 secondes.
Les fractions radioactives sont réunies et fractionnées en échantillons de 200 μl dans des tubes eppendorf siliconnés que l'on peut conserver à -80°C ou -20°C. Caractéristiques du produit obtenu : dpm = 1 067 274 560 correspondant à 0,5 mCi soit 18,5 MBq.
Rendement radioactif : 10 %.
Activité spécifique : (99 x 10)/30,5 = 32,5 Ci/mmol.
II - Test d'identification d'inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'endothéline (ECE)
10 μl d'ECE soit l à 2 μg d'ECE purifié sont pré-incubés pendant 30 minutes à 37°C, dans 400 μl d'un tampon de Tris- maléate 50 mM pH = 6,5, 20 μl de chlorure de sodium 5M et
5 μl de produit P dont on veut tester l'activité inhibitrice, en solution à différentes concentrations comprises entre 1 μM et 100 mM (soit des concentrations finales en produit P entre
10 nM et 1 mM) .
La réaction est initiée par addition de 10 μl de
( (2,3)3H) -propionyl-b-ET-l (19-35) préparé comme indiqué ci- dessus en I, à la concentration finale de 1,8.10"12M.
Après une heure d'incubation à 37°C, la réaction est arrêtée par addition de 600 μl d'acétate d'éthyle et le
( (2,3)3H) -propionyl-b-ET-l (19-21) est extrait par agitation mécanique pendant 2 minutes. On prélève 300 μl de la phase organique et ajoute 5 ml de liquide scintillant et compte la radioactivité pendant
1 minute au compteur à scintillation liquide.
Chaque mesure est réalisée en triplicate excepté pour le témoin d'ECE (témoin enzyme, sans produit dont on veut tester l'activité inhibitrice de l'ECE), pour lequel la mesure est réalisée en sextuplet.
le pourcentage d'inhibition est calculé en faisant le rapport : produit testé - blanc témoin enzyme - blanc Le blanc est effectué à partir de la solution obtenue sans enzyme. Le tableau ci-après donne les résultats obtenus en utilisant comme produits P des inhibiteurs connus soit PI qui est le phosphoramidon et P2 qui est le N- (phényléthylphos- phonyl) -Leu-Trp (TAKEDA) , dont on veut tester les activités inhibitrices de l'ECE. A partir de ce tableau et par tracé du graphique du pourcentage d'inhibition par rapport à la concentration en inhibiteur (nM) , on calcule la CI50 qui correspond donc à la concentration provoquant une inhibition de 50 % de l'ECE. La constante d'inhibition (Kl) d'un produit peut être obtenue par utilisation de la valeur de la constante de
Michaelis KM qui est égale à 12,8 μM pour le substrat la ou X = (2,3) 3H-propionyle.
Les résultats chiffrés obtenus sont indiqués dans le tableau ci-dessous :
Figure imgf000015_0001
Conclusion : le présent test permet donc d'identifier des inhibiteurs de l'ECE car les résultats obtenus confirment l'activité des produits connus P^ et p2*

Claims

REVENDICATIONS
1) Produits de formule (I) :
X-C-Z1-Z2-Ile-Ile-Trp-Val-Z3-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-
II o (I)
Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-Z4-Z5-Zg-COOH
dans laquelle X représente un radical hydrocarboné comportant au moins un atome radioactif, Z1# Z2, Z4, Z5 et Zg identiques ou différents représentent des acides aminés et Z3 représente soit l'acide aminé Asn, soit la paranitro-Phe. 2) Produits de formule (I) telle que définie à la revendica¬ tion 1 dans laquelle X représente un radical hydrocarboné comportant au moins un atome radioactif, Z1 et Z2 sont tels que : soit Z^_ et Z2 représentent une simple liaison, soit Z^ représente une simple liaison et Z2 représente l'acide aminé Asp, soit Z^- et Z2 représentent respectivement les acides aminés Leu et Asp, Z3 représente soit l'acide aminé Asn, soit la paranitro-Phe, et Z4, Zc et Zg sont tels que : soit Z4, Z5 et Zg représentent une simple liaison, soit Z5 et Zg représentent une simple liaison et Z4 repré¬ sente l'acide aminé Pro, soit Zg représente une simple liaison et Z4 et Z5 représen¬ tent respectivement les acides aminés Pro et Arg, soit Z4, Z5 et Zg représentent respectivement les acides aminés Pro, Arg et Ser. 3) Produits de formule (I) telle que définie à la revendica- tion 1 ou 2, répondant à la formule (IA) : X- C- Ile- Ile - Trp-Val -Asn-Thr- Pro-Glu-His -Val -Val -
0 ( IA)
Pro - Tyr- Gly - Leu - Gly - Ser - COOH
dans laquelle X représente un radical hydrocarboné comportant au moins un atome radioactif.
4) Produits de formule (I) telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans laquelle le radical X comporte au moins un atome de tritium.
5) Produits de formule (I) telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans laquelle X-C-
II o représente le radical (2,3) 3H-propionyle.
6) Procédé de préparation des produits de formule (I) , telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que 1 'on soumet un produit de formule (III) :
Z1-Z2-Ile-Ile-Trp-Val-Z3-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val- Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-Z4-Z5-Z6-COOH (III)
dans laquelle Z1# Z2, Z3 , Z4, Z5 et Zg ont les significations indiquées à la revendication 1, à une réaction d'acylation par un dérivé réactif de l'acide carboxylique de formule X-COOH dans laquelle X a la signification indiquée à la revendication 1.
7) Utilisation d'un produit de formule (I) , telle que définie à l'une quelconque des revendications l à 5 pour l'identification des inhibiteurs de l'enzyme de conversion de 1 'endothéline.
8) Utilisation selon la revendication 7 d'un produit radioactif de formule (I) telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'on met en contact l'enzyme de conversion de l'endothéline, un produit P dont on veut déterminer l'activité inhibitrice de l'enzyme de conversion de l'endothéline, et le produit de formule (I) telle que définie ci-dessus ; et après incubation, on arrête la réaction de clivage, extrait sélectivement le produit formé de formule (II) :
X-C-Z1-Z2-Ile-Ile-Trp-COOH
Il (II)
0
dans laquelle X, Z-j_ et Z2 ont les significations indiquées à la revendication 1, et détermine par comptage l'activité inhibitrice du produit P à tester.
9) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le produit solvant utilisé pour arrêter la réaction de clivage et extraire sélectivement le produit de formule (II) , telle que définie à la revendication 8 est l'acétate d'éthyle.
10) Utilisation selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce que l'on utilise un produit de formule (I) telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans laquelle X-C- représente de préférence un radical
II o
3H-propionyle et notamment (2,3) 3H-propionyle.
11) Test d'identification d'inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'endothéline, caractérisé en ce que ce test comprend un produit de formule (I) telle que définie à l'une des revendications 1 à 5.
12) A titre de produits industriels nouveaux : - les produits de formule (III) :
Z1-Z2-Ile-Ile-Trp-Val-Z3-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val- Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-Z4-Z5-Z6-COOH (III)
les produits de formule (II) :
X-C-Z1-Z2-Ile-Ile-Trp-COOH (II)
II o parmi lesquels de préférence le produit de formule (II) dans lequel X-C- représente le radical (2,3) -3H-propionyle,
II o dans lesquelles formules, Z1# Z2, Z3, Z4, Z5, Zg et X ont les significations indiquées à l'une des revendications 1 à 5.
PCT/FR1997/000368 1996-03-04 1997-03-03 Peptides radioactifs utiles pour le criblage d'inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'endotheline Ceased WO1997032897A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9602673A FR2745576B1 (fr) 1996-03-04 1996-03-04 Nouveaux peptides radioactifs, leur preparation, et leur utilisation pour le test de selection d'inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'endotheline
FR96/02673 1996-03-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1997032897A1 true WO1997032897A1 (fr) 1997-09-12

Family

ID=9489806

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1997/000368 Ceased WO1997032897A1 (fr) 1996-03-04 1997-03-03 Peptides radioactifs utiles pour le criblage d'inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'endotheline

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2745576B1 (fr)
WO (1) WO1997032897A1 (fr)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2807523B1 (fr) * 2000-04-07 2002-08-30 Inst Nat Sante Rech Med UTILISATION D'UN RESTE PyA-(Z)x-pNF A DES FINS DE DETECTION, IDENTIFICATION ET/OU DOSAGE PAR FLUORESCENCE

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4251628A (en) * 1978-03-14 1981-02-17 Ryan James W Substrates for angiotensin converting enzyme
FR2687680A1 (fr) * 1992-02-20 1993-08-27 Centre Nat Rech Scient Procede de marquage de proteines et de peptides par acylation de leur fonction alpha aminee par un reactif comportant une fonction carboxylique activee.
WO1994022906A1 (fr) * 1993-03-26 1994-10-13 Warner-Lambert Company Inhibiteurs de l'enzyme convertissant l'endotheline
DE4313232A1 (de) * 1993-04-22 1994-10-27 Basf Ag Methode zur Bestimmung der Aktivität des Endothelin-Konversionsenzyms (ECE)

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4251628A (en) * 1978-03-14 1981-02-17 Ryan James W Substrates for angiotensin converting enzyme
FR2687680A1 (fr) * 1992-02-20 1993-08-27 Centre Nat Rech Scient Procede de marquage de proteines et de peptides par acylation de leur fonction alpha aminee par un reactif comportant une fonction carboxylique activee.
WO1994022906A1 (fr) * 1993-03-26 1994-10-13 Warner-Lambert Company Inhibiteurs de l'enzyme convertissant l'endotheline
DE4313232A1 (de) * 1993-04-22 1994-10-27 Basf Ag Methode zur Bestimmung der Aktivität des Endothelin-Konversionsenzyms (ECE)

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OKADA, KENJI ET AL: "Big endothelin-1 structure is important for specific processing by endothelin-converting enzyme of bovine endothelial cells", EUR. J. BIOCHEM. (1993), 218(2), 493-8 CODEN: EJBCAI;ISSN: 0014-2956, 1993, XP000611574 *
T.J. OPGENORTH ET AL.: "Endothelin-converting enzymes", FASEB JOURNAL FOR EXPERIMENTAL BIOLOGY, vol. 6, no. 9, June 1992 (1992-06-01), BETHESDA, MD US, pages 2653 - 2659, XP002019980 *

Also Published As

Publication number Publication date
FR2745576A1 (fr) 1997-09-05
FR2745576B1 (fr) 1998-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6130315A (en) Peptidase inhibitors
JP4943837B2 (ja) 可溶性エポキシド加水分解酵素の改良インヒビター
TWI295996B (en) Dipeptide derivatives
EP0193445B1 (fr) Dérivés peptidiques, analogues de la pepstatine, inhibiteurs de la rénine et des protéases acides
EP0104964B1 (fr) Dérivés peptidiques inhibiteurs de protéases acides
EP0272671A2 (fr) Aryloxy et arylacyloxy méthyl cétones comme inhibiteurs de thiol protéase
JPS5890536A (ja) レニン抑制ペプチド類
FR2577557A1 (fr) Peptides et derives peptidiques, leur preparation, leur utilisation en therapeutique et compositions pharmaceutiques les contenant
EP0126009B1 (fr) Nouveaux dérivés de peptides, leur préparation et leur application comme inhibiteurs de l'élastase
EP0457701B1 (fr) Nouveaux dérivés de médiateurs endogènes, leurs sels, procédé de préparation, applications, et compositions les renfermant
EP0211744A1 (fr) Dérivés aminoalcools peptidiques contenant un atome de carbone tetrasubstitué inhibiteurs de la rénine et des protéases acides - Procédé d'obtention et compositions pharmaceutiques
JPH089591B2 (ja) 新規なプロリナール誘導体
US6479265B1 (en) Catalytic antibodies which hydrolyze primary amides and methods for eliciting and use of such antibodies
WO1997032897A1 (fr) Peptides radioactifs utiles pour le criblage d'inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'endotheline
EP0262053A2 (fr) Nouveaux dérivés d'amino-acides, leur procédé de préparation et compositions pharmaceutiques les contenant
FR2471411A1 (fr) Nouveaux substrats a-hydroxytripeptidiques utiles notamment comme reactifs pour la determination d'enzymes proteolytiques
EP2389356B1 (fr) Nouveaux composes de type azapeptide ou azapeptidomimetrique, inhibiteurs de bcrp et/ou p-gp
CA2308780C (fr) Nouveaux derives de 2,3-methano-aminoacides, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
EP0357510A1 (fr) Dérivés de cyclopeptides utilisables comme inhibiteurs sélectifs, vis-à-vis de protéases à sérine active
EP1268850B1 (fr) Detection de proteases ou peptidases par fluorescence
Shiosaki et al. Potent and selective inhibitors of an aspartyl protease-like endothelin converting enzyme identified in rat lung
FR2730235A1 (fr) Nouveaux derives de peptides utilisables comme inhibiteur de l'endopeptidase a zinc 24-15
US5900237A (en) Catalytic antibodies which hydrolyze primary amides and methods for eliciting such antibodies
EP0722460B1 (fr) Derives de peptides therapeutiquement actifs dans la cascade de coagulation sanguine, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
JP3306571B2 (ja) エンドセリン変換酵素阻害剤

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 97531512

Format of ref document f/p: F

122 Ep: pct application non-entry in european phase