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WO1997031101A1 - NOVEL OXIDOREDUCTASE AND PROCESSES FOR PRODUCING 3-(p-HYDROXYPHENYL)-2-PROPENOL DERIVATIVES AND OTHER COMPOUNDS USING THE SAME - Google Patents

NOVEL OXIDOREDUCTASE AND PROCESSES FOR PRODUCING 3-(p-HYDROXYPHENYL)-2-PROPENOL DERIVATIVES AND OTHER COMPOUNDS USING THE SAME Download PDF

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WO1997031101A1
WO1997031101A1 PCT/JP1997/000518 JP9700518W WO9731101A1 WO 1997031101 A1 WO1997031101 A1 WO 1997031101A1 JP 9700518 W JP9700518 W JP 9700518W WO 9731101 A1 WO9731101 A1 WO 9731101A1
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WO
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formula
reaction
represented
group
hydroxyl group
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP1997/000518
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English (en)
French (fr)
Inventor
Toru Nagasawa
Hiroshi Morita
Yumiko Iwasawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JNC Corp
Original Assignee
Chisso Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chisso Corp filed Critical Chisso Corp
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Priority to JP52999897A priority patent/JP4309969B2/ja
Priority to EP97904622A priority patent/EP0893497A4/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group

Definitions

  • the present invention relates to a novel enzyme obtained from cells of a strain belonging to the genus Pseudomonas fluorescens and catalyzing a reaction for oxidizing a substrate such as a p-hydroxytoluene derivative or a p-alkylphenol derivative, and a novel enzyme.
  • a substrate such as a p-hydroxytoluene derivative or a p-alkylphenol derivative
  • a novel enzyme Using the substrate, 3- (p-hydroxyphenyl) -2-propenol derivative, p-hydroxybenzaldehyde derivative, p-alkylphenol derivative, optically active S (-)-l- (4-hydr Mouth Xif)
  • the present invention relates to a method for producing an alcohol derivative or the like.
  • conifuryl alcohol a type of conventional 3- ( ⁇ -hydroxyphenyl) -12-propenol derivative
  • corniferyl alcohol can be produced as a by-product of the vanillin production process.
  • the amount of coniferyl alcohol produced in this process is small, coniferyl alcohol has become expensive and has prevented its widespread use.
  • Optically active 11- (4-hydroxyphenyl) alcohol derivatives are substances that are expected to be widely used as synthetic raw materials for pharmaceuticals, cosmetics, fragrances, agricultural chemicals, liquid crystals, and the like. In particular, it is used as a chiral 'synthon for vasodilators.
  • the problem to be solved by the present invention is to catalyze a reaction in which a double bond at the position of a substrate such as eugenol is moved to the next position in the presence of water and an electron acceptor to add a hydroxyl group to the ⁇ -position.
  • An object of the present invention is to provide a novel oxidoreductase and a method for efficiently producing useful compounds such as coniferyl alcohol using the enzyme. Furthermore, utilizing various organic reactions catalyzed by the enzyme, 3- ( ⁇ -hydroxyphenyl) -12-provenol derivative, ⁇ -hydroxybenzaldehyde derivative, optically active 1- (4-hydroxyphenyl) It is an object of the present invention to provide a method for producing a compound such as an alcohol derivative.
  • the present invention provides an oxidoreductase having the following properties.
  • Substrate affinity The myelitis constant for eugenol or phenazine methosulfate is 1.75 or 0.4 mM, respectively.
  • Stable pH range 30 and stable from pH 5 to 9 when treated for 30 minutes
  • (9) Molecular weight: Subunit with a molecular weight of 10.400, S-subunit with a molecular weight of 58.200, each of which is a heterodimer with a molecular weight of 68.600.
  • the present invention further provides an oxidoreductase having the following properties. It is obtained by culturing a strain belonging to Pseudomonas fluorescens in a nutrient medium containing eugenol and collecting the enzyme produced in the cells of the strain. At least the following reaction formulas A, B and C are obtained. Element that catalyzes the indicated reaction.
  • R 1 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or a methoxy group
  • R 2 represents a hydroxyl group or a methoxy group
  • R 3 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • R 4 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R 5 is shown to an alkyl group or an aminomethyl group having 1 to 1 0 carbon atoms.
  • a preferred enzyme of the present invention is an enzyme that catalyzes an asymmetric induction reaction when R 4 is a hydrogen atom in the reaction represented by Reaction Formula C.
  • a preferred enzyme of the present invention is the above enzyme, wherein the strain belonging to Pseudomonas fluorescens is Pseudomonas fluorescens E118 (FERM P-15185).
  • the present invention also provides a p-arylphenol derivative represented by a single-arm (1-a) by a reaction represented by the following reaction formula A in the presence of water and an electron acceptor, using the above enzyme as a catalyst.
  • the present invention provides a process for producing a 3- (p-hydroxyphenyl) -2-propanol derivative represented by a single-arm formula (2-a).
  • R 1 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or a methoxy group
  • R 2 represents a hydroxyl group or Indicates a methoxy group.
  • the present invention also provides a method using the above-mentioned enzyme as a catalyst, in the presence of water and an electron acceptor, by performing a reaction shown in the following reaction formula B from a p-hydroxytoluene derivative represented by the general formula (1-1b). It is intended to provide a method for producing a p-hydroquinbenzaldehyde derivative represented by the general formula (2-b).
  • R 1 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or a methoxy group
  • R 2 represents a hydroxyl group or a methoxy group
  • R 3 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group.
  • the present invention further provides a reaction represented by the following formula C in the presence of water and an electron acceptor, from the p-alkylphenol derivative represented by the single-branch formula (1-c), using the enzyme described above as a catalyst. It is intended to provide a method for producing a p-hydroxybenzyl alcohol derivative represented by the general formula (2-c).
  • R 1 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or a methoxy group
  • R 2 represents a hydroxyl group or a methoxy group
  • R 5 represents an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms. Or an aminoamino group.
  • the present invention also provides the use of the above enzyme as a catalyst, in the presence of water and an electron acceptor.
  • the optically active hydroxybenzyl alcohol derivative represented by the general formula (2-c ') is produced from the alkylphenol derivative represented by the general formula (1-1c') by the reaction represented by the following formula C ''. It provides a way to:
  • R ′ and R 2 independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group or a methoxy group, but R 1 and R 2 are not simultaneously a hydrogen atom, and R 5 has 1 to 10 carbon atoms. Represents an alkyl group or an aminomethyl group.
  • the present invention also provides a compound represented by the general formula (1-1d) from the compound represented by the general formula (1-1d) by a reaction represented by the following formula D in the presence of water and an electron acceptor, using the enzyme described above as a catalyst. ) Is provided.
  • a strain belonging to Pseudomonas-fluorescens which is a cell producing the enzyme, is aerobically cultured in a culture solution containing eugenol. If the culture solution contains eugenol and the bacteria grow, Preferably, eugenol is added at 0.1 force, such as 0.4% (vZv), sucrose 0.5 to 3% (w / v), peptone 05 karat 0.2% (w / v), magnesium sulfate 7 Water salt 0.0 1 to 0.1% (w / v), ferrous sulfate heptahydrate 0.05 to 0.2% (w / v), yeast extract 0.1 to 1% (w / v) and metal salt mixture 0 ⁇ Includes from 0.05 to 0.2% ( ⁇ / ⁇ ), ⁇ 6.5 force, etc.
  • the metal salt mixture is calcium chloride dihydrate 0.4 g, boric acid 0.3 g, copper sulfate pentahydrate 0.04 g, potassium iodide 0.1 g, manganese sulfate heptahydrate 0.4 g, sodium molybdate in 1 L of deionized water. What consists of the solution which melt
  • the obtained crude enzyme solution is subjected to salting-out treatment with ammonium sulfate, and various kinds of force column chromatography methods such as Z or ion exchange, gel filtration, and hydrophobicity to obtain a high-purity enzyme preparation.
  • force column chromatography methods such as Z or ion exchange, gel filtration, and hydrophobicity to obtain a high-purity enzyme preparation.
  • a purified enzyme preparation that is recognized as single by SDS polyacrylamide gel electrophoresis is obtained.
  • the enzymatic properties of this enzyme (this enzyme) are described below.
  • Substrate affinity The myelitis constant for eugenol or phenazine methosulfate is 1.75 or 0.4 mM, respectively.
  • Optimum pH around pH 5.5.
  • Stable pH range 30 to 30 minutes, pH is stable from 5 to 9.
  • EPNP 1,2-epoxy-1- (P-nitrophenoxy) propane
  • PMSF phenylmethanesulfonyl fluoride
  • One unit of the activity of this enzyme is 1 mo 1 of coniferyl alcohol per minute.
  • Is the enzyme activity that produces The method for producing the compound represented by the general formula (2-a) using the present enzyme will be described with reference to the method for producing conifuryl alcohol as an example.
  • Excluding the buffer from the reaction solution for enzyme activity measurement described above (50 ⁇ L of 200 mM eugenol n-octane solution, 200 ⁇ L of 50 mM phenazine methosulfate aqueous solution, and deionized water 675 ⁇ L) is added dropwise with dilute sulfuric acid or ammonia water to adjust ⁇ ⁇ from 5 to 7, and stirred at a temperature of 25 ° C to 55 for 15 to 180 minutes.
  • coniferyl alcohol is extracted from the reaction mixture with an organic solvent such as ethyl sulphate, chloroform, methylene chloride or ethyl ether, and purified by means such as silica gel chromatography, reverse phase liquid chromatography, or vacuum distillation. If necessary, decolorize with activated carbon and dry in vacuo to obtain a colorless coniduryl alcohol powder.
  • organic solvent such as ethyl sulphate, chloroform, methylene chloride or ethyl ether
  • the compound represented by the general formula (2-a) is converted from the compound represented by the single-arm formula (11-a) to the single-arm formula (2) from the compound represented by the general formula (11-b). from the compound represented by the general formula (1-1c) to the compound represented by the general formula (2-c) from the compound represented by the general formula (1-1c)
  • the compound represented by the general formula (2-c ':) can be produced from the compound represented by the general formula (1-1d), and the compound represented by the general formula (2-d) can be produced from the compound represented by the general formula (1-1d).
  • R 4 is a hydrogen atom in the general formula (1-c)
  • an asymmetric induction reaction occurs, and an optically active compound is generated.
  • the water used in producing each of the above compounds according to the present invention acts not only as a solvent and a source of oxygen atoms, but also as an electron donor in an enzymatic reaction.
  • the amounts of water and the receptor used are each equal to or greater than the number of moles of the substrate to be reacted.
  • water is used as a solvent, so it is used in a large excess.
  • Example 1
  • the mixed metal salt solution is 1 g of deionized water, 0.4 g of calcium chloride dihydrate, 0.3 g of boric acid, 0.04 g of copper sulphate pentahydrate, 0.1 g of lithium iodide, and 0.1 g of manganese sulfate.
  • a solution prepared by dissolving 0.4 g of sodium molybdate dihydrate 0.2 g was used.
  • the cells obtained by centrifuging the culture were washed with physiological saline, and suspended in 300 ml of 1 OmM potassium phosphate buffer ( ⁇ 7.0). This enzyme was extracted and purified from the cell suspension as described below. Table 3 shows the purification scheme.
  • the cell suspension was treated with an ultrasonic homogenizer to disrupt the cells, and the supernatant obtained by centrifugation was used.
  • the supernatant (2 14 Omg, total activity: 270 units) was used as a cell-free extract.
  • ammonium sulfate was added to obtain a 30 to 50% (w / v) ammonium sulfate concentration fraction of 131 Omg (total activity: 228 units).
  • This fraction was applied to a column of DEAE-Sephacel (Pharmacia) to obtain 58 mg of the active fraction (total activity: 115 units).
  • Ammonium sulfate was added to the active fraction to obtain 37.2 mg (total activity: 102 units) of a 40 to 80% (wv) ammonium sulfate saturated concentration fraction. This fraction was applied to a column of Phenyl Sepharose, DEAE-Sepharose, and Octyl Sepharose (all manufactured by Pharmacia), and chromatographed. Finally, 0.4 mg (total activity 12.1) was obtained. Unit) of the enzyme preparation was obtained. This product was single by SDS-boriatharylamide gel electrophoresis.
  • Example 2 Prepared in accordance with Example 1 in a reaction vessel equipped with a reflux condenser containing 5 OmL of a 200 mM eugenol II-octane solution, 20 OmL of a 50 mM aqueous solution of phenazine methosulfate, and 725 mL of deionized water 2 After the second ammonium sulfate salting out, 25 mL (20 units) of the enzyme solution was added, and the pH was kept at 5.5 by automatically adding dilute sulfuric acid, and the mixture was stirred at 5 (TC for 2 hours.
  • Example 2 corresponding products were produced from each substrate as shown in Tables 4-5. Each product was identified by GCMS analysis, infrared absorption spectrum analysis and the like. The optical activity was determined by high-performance liquid chromatography using a chiral cell 0B column. The mobile phase was n-hexane: n-propanol (9 : 1), and the peak was detected using an ultraviolet detector and an optical rotation detector. went. The activity for each substrate was shown as a relative activity when 100 was obtained when eugenol was used as the substrate.
  • the enzyme of the present invention also shows an activity in the reaction represented by the following reaction formula D, and is represented by the formula (2-d) from the substrate represented by the formula (1-d) in the same manner as in Example 2. Compound was produced. This reaction was confirmed to be an asymmetric induction reaction.
  • the present invention relates to an enzyme that catalyzes a reaction for producing an unsaturated alcohol or the like by adding a hydroxyl group to the ⁇ -position accompanied by transfer of a double bond at the ⁇ -position of a substrate. Efficient production of alcohols and other 3- ( ⁇ -hydroxyphenyl) -2-provenol derivatives, ⁇ ⁇ -hydroxybenzaldehyde derivatives and optically active tri (4-hydroxyphenyl) alcohol derivatives. it can.

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Description

明 細 書 新規酸化還元酵素及びそれを用いた 3— （p—ヒドロキシフエニル） 一 2—プロぺノ一ル誘導体等の製造法
〔技術分野〕
本発明は、 シユードモナス · フルォレツセンス属に属する菌株の菌体から得ら れ、 p—ヒドロキシトルエン誘導体、 p—アルキルフヱノール誘導体等の基質を 酸化する反応を触媒する新規な酵素、 及び該酵素を用いて、 該基質から 3— ( p —ヒドロキシフエニル） — 2—プロペノール誘導体、 p—ヒ ドロキシベンズアル デヒド誘導体、 p一アルキルフエノール誘導体、 光学活性 S (-)- l— ( 4—ヒド 口キシフ Xニル） アルコール誘導体等を製造する方法に関する。
〔従来の技術〕
水および電子受容体の存在下で、 オイゲノールに代表される p—ァリルフエノ ール誘導体等の基質の α位の二重結合を、 隣に移動させ、 この α位に水酸基を付 加させる反応を触媒する酸化還元酵素は報告された例がなく、 このような酵素を 用いたコニフェリルアルコールに代表される 3— （ρ—ヒドロキシフエニル） 一 2—ブロぺノール誘導体の製造法はいまだ知られていない。 さらに、 このような 酵素の触媒する様々な反応についても報告された例はない。
また、 従来 3— （ρ—ヒドロキシフエニル） 一 2—プロペノール誘導体の 1種 であるコニフヱリルアルコールは、 医薬品、 化粧品、 香料、 農薬、 食品添加物、 飼料添加物、 液晶等の原料として広範な用途が期待されている物質であり、 該コ 二フエリルアルコールはバニリン製造工程の副生成物として製造できることが知 られている。 しかしこの工程でできるコニフヱリルアルコールの生成量は少ない ため、 コニフェリルアルコールは高価となり、 広範な利用が妨げられてきた。
^iffiなオイゲノールを微生物に作用させてバニリン関連物質を製造する試みが なされているが （特開平 5 - 2 2 7 9 8 0号公報、 ァグリカリチュラル ·バイオ ロジカル 'ケミストリー 4 1巻 9 2 5 - 9 2 9頁 （ 1 9 7 7年） 及び同誌 4 7巻 2 6 39— 264 0頁 （1 9 83年） ） 、 いずれもバニリンまたはバニリン酸は 生成するものの、 コニフェリルアルコールの効率的な製造には成功していない。 水および電子受容体の存在下で、 p—アルキルフヱノール誘導体を酸化して効 率よく光学活性 1 - (4ーヒドロキシフヱニル） アルコール誘導体を生成する反 応を触媒する酸化還元酵素は報告された例がない。
光学活性 1一 （4ーヒドロキシフヱニル） アルコール誘導体は、 医薬品、 化粧 品、 香料、 農薬、 液晶等の合成原料として広範な用途が期待されている物質であ る。 特に血管拡張剤のキラル ' シントンとして用いられる。
〔発明の開示〕
本発明が解決しょうとする課題は、 水及び電子受容体の存在下で、 オイゲノー ル等の基質の 位の二重結合を隣に移動させ、 この α位に水酸基を付加させる反 応を触媒する新規な酸化還元酵素、 および該酵素を用いてコニフェリルアルコー ルをはじめとする有用な化合物を効率よく製造する方法を提供することである。 さらに、 該酵素が触媒する樣々な有機反応を利用して 3— （ρ—ヒドロキシフエ ニル） 一 2—プロべノール誘導体、 ρ—ヒドロキシベンズアルデヒド誘導体、 光 学活性 1— (4ーヒドロキシフエニル） アルコール誘導体等の化合物を製造する 方法を提供することである。 本発明は以下の性質を有する酸化還元酵素を提供するものである。
( 1 ) 作用：水の存在下で、 オイゲノールの α位の二重結合を隣に移動させ、 α 位に水酸基を付加することによってコニフヱリルアルコールを生成する。
(2) 基質特異性：一股式 （ 1一 a) 、 （ 1一! 3) 、 （1一 c) 、 ( 1 - c' ) ,
( 1一 d) で表される化合物に作用し、 一股式 （2— a) 、 (2-b) 、 (2— c) 、 （2— c' ) . (2— d) で表される化合物をそれぞれ生成 する。
(3) 基質親和性：オイゲノールまたはフエナジンメトサルフェートに対するミ 力エリス定数は、 それぞれ 1.75または 0.4 ミ リモル濃度である。
(4) 至適 ρΗ ·· pH5. 5付近。 ( 5 ) 至適温度： 50で。
(6) 安定 pH範囲： 30で、 30分間の処理では、 pH5から 9まで安定であ る
(7) 各種金属塩による影響：二価鉄、 銅、 銀、 水銀の塩により顕著に活性が阻 害される。
(8) 各種阻害剤の影響： P- (クロロメルクリ） 安息香酸、 フ ニルヒドラジン で活性が阻害される。
(9) 分子量：分子量 10.400の サブュニット、 分子量 58.200のSサブュニット 各 1個ずつからなる分子量 68.600のへテロダイマー。 本発明はさらに以下の性質を有する酸化還元酵素を提供するものである。 シユードモナス · フルォレツセンス（Pseudomonas f luorescens) に属する菌株 をオイゲノールを含む栄養培地で培養し、 該菌株の菌体中に産生した酵素を採取 することにより得られ、 少なくとも下記の反応式 A、 B、 Cに示す反応を触媒す る 素。
(反応式 A)
(反応式 B)
Figure imgf000005_0001
(1一 b) (反応式 c)
Figure imgf000006_0001
(1 -c)
(式中、 R1 は水素原子、 水酸基またはメ トキシ基を示し、 R2 は水酸基または メ トキシ基を示し、 R3 は水素原子または水酸基を示し、 R4 は水素原子または メチル基を示し、 R5 は炭素数 1〜1 0のアルキル基またはアミノメチル基を示 す。 ）
本発明の好ましい酵素は、 反応式 Cで示される反応において、 R4 が水素原子 である場合に不斉誘起反応を触媒する酵素である。
本発明の好ましい酵素は、 シユードモナス 'フルォレツセンスに属する菌株が シユードモナス - フルォレツセンス E118(FERM P-15185) である上記の酵素であ る。
本発明はまた、 上述の酵素を触媒として使用し、 水および電子受容体の存在下、 下記反応式 Aに示す反応により、一股式 ( 1 -a) で表される p—ァリルフエノ ール誘導体から、 一股式 (2-a) で表される 3— (p—ヒドロキシフエニル） — 2—プロぺノ一ル誘導体を製造する方法を提供するものである。
(反応式 A)
Figure imgf000006_0002
(式中、 R1 は水素原子、 水酸基またはメ トキシ基を示し、 R2 は水酸基または メ トキシ基を示す。 ）
本発明はまた、 上述の酵素を触媒として使用し、 水および電子受容体の存在下、 下記反応式 Bに示す反応により、 一般式 （1一 b)で表される p—ヒドロキシト ルェン誘導体から、 一般式 (2-b)で表される p—ヒドロキンべンズアルデヒ ド誘導体を製造する方法を提供するものである。
(反応式 B)
Figure imgf000007_0001
(式中、 R1 は水素原子、 水酸基またはメ トキシ基を示し、 R2 は水酸基または メ トキシ基を示し、 R3 は水素原子または水酸基を示す。 ）
本発明はさらにまた、 上述の酵素を触媒として使用し、 水および電子受容体の 存在下、 下記式 Cに示す反応により、 一股式 （1 -c)で表される p -アルキル フエノール誘導体から、 一般式 (2-c)で表される p—ヒドロキシベンジルァ ルコール誘導体を製造する方法を提供するものである。
(反応式 C)
Figure imgf000007_0002
(式中、 R1 は水素原子、 水酸基またはメ トキシ基を示し、 R2 は水酸基または メ トキシ基を示し、 は水素原子またはメチル基を示し、 R5 は炭素数 1〜 1 0のアルキル基またはァミノメチル基を示す。 ）
本発明はまた、 上述の酵素を触媒として使用し、 水および電子受容体の存在下、 下記式 C'' に示す反応により、 一般式（1一 c' )で表されるアルキルフエノー ル誘導体から一般式 （2— c' )で表される光学活性ヒドロキシベンジルアルコ ール誘導体を製造する方法を提供するものである。
(反応式 C' )
Figure imgf000008_0001
(1一 c' ) (2-c' )
(式中、 R' および R2 は相互に独立して水素原子、 水酸基またはメトキシ基を 示すが、 R1 と R2 が同時に水素原子であることはなく、 R5 は炭素数 1〜10 のアルキル基またはァミノメチル基を示す。 )
本発明はまた、 上述の酵素を触媒として使用し、 水および電子受容体の存在下、 下記式 Dに示す反応により、 一般式（1一 d)で表される化合物から一般式（2 一 d )で表される化合物を製造する方法を提供するものである。
(反応式 D)
Figure imgf000008_0002
〔発明を実施するための最良の形憨〕
本発明の酵素を得るには、 まず、 該酵素を生産する菌体であるシユードモナス -フルォレツセンスに属する菌株を、 オイゲノールを含んだ培養液で好気的に培 養する。 培養液は、 オイゲノールを含んでいて本菌が生育するものであればいか なるものでも良いが、 好ましくは、 オイゲノールを 0. 1力、ら 0.4 % (vZv) 、 しょ糖 0.5から 3% (w/v) 、 ペプトン 05カヽら 0.2% (w/v)、 硫酸マ グネシゥム 7水塩 0.0 1から 0. 1 % (w/v) 、 硫酸第一鉄 7水塩 0.05から 0.2% (w/v) 、 酵母エキス 0. 1から 1 % (w/v) 及び金属塩混液 0· 05か ら 0.2% (ν/ν) を含み、 ρΗ6.5力、ら 8.0のものが用いられる。 金属塩混液 は脱イオン水 1 L中に塩化カルシウム 2水塩 0.4 g、 ほう酸 0.3 g, 硫酸銅 5水 塩 0.04 g, よう化カリウム 0. 1 g, 硫酸マンガン 7水塩 0.4 g, モリブデン酸 ナトリウム 2水塩 0.2 gを溶かした溶液からなるものが好ましい。 培養は 20〜 35でで 1 8ないし 72時間通気撹拌培養する。 得られた培養液を遠心分離また はろ過などして得られた菌体を 1Mリン酸カリウム緩衝液 （pH7.0) に懸濁し、 この菌体懸濁液を超音波破砕機、 もしくは菌体破砕機にかけて菌体を破砕し、 粗 酵素液を得る。
得られた粗酵素液を硫酸アンモニゥムによる塩析処理、 および Zまたはイオン 交換、 ゲル濂過、 疎水性などの各種の力ラムクロマトグラフィ一法で処理し、 高 純度の酵素標品を得る。 こうして、 S D Sポリアクリルァミ ド ·ゲル電気泳動で 単一と認められる精製酵素標品が得られる。 この酵素 （本酵素） の酵素化学的諸 性質を以下に述べる。
〔本酵素の酵素化学的性質〕
(1) 作用：水の存在下で、 オイゲノールの α位の二重結合を隣に移動させ、 α 位に水酸基を付加することによってコニフ Xリルアルコールを生成する作 用を持つ。
(2)基質特異性：反応式 A〜Dに示すように一股式 （1—a) 、 (1一 b)、
(1一 c) 、 （1一 c' ) 、 （ 1一 d) で表される化合物に作用し、 一般 式 （2 - a) 、 （2 - b) 、 （2— c) 、 (2 - c' ) , (2 - d) で表 される化合物をそれぞれ生成する。 電子受容体としてチトクローム C、 2. 6-ジクロロインドフエノール、 フエナジンメ トサルフエ一トなどが用いら れる。
(3) 基質親和性：オイゲノールまたはフエナジンメトサルフエ一トに対するミ 力エリス定数は、 それぞれ 1.75または 0.4 ミ リモル濃度である。 (4) 至適 pH： pH5. 5付近。
( 5 ) 至適温度： 50 '
( 6 ) 安定 p H範囲： 30て、 30分間の処理では、 p H 5から 9まで安定であ る。
(7) 各種金属塩による影響 .表 1に示すように、 二価鉄、 銅、 銀、 水銀の塩に より顕著に活性が阻害される。
表 1 各種金属塩による影響
£ m 相対活性 (%)
1 00
Na C 1 99. 8
Figure imgf000010_0001
FeC 13 • 6 H2 76. 9
gC 12 • 6H2 u 96. 2
Figure imgf000010_0002
ZnC 12 1 1 3
MnC 12 • 4H2 〇 82. 7
Figure imgf000010_0003
PbC 12 90. 4 (8) 各種阻害剤の影響：表 2に示すように、 p -（クロロメルクリ） 安息香酸、 フエニルヒ ドラジンで活性が阻害される。
表 2 各種阻害剤の影響 阻 害 剤 相対活性 ) 無添加 1 00
5.5' - ジチ才ビス (2-ニト!]安息香酸） 79. 8
Ν-ェチルマレイミ ド 1 05
ョ―ド酢酸 93. 9
Ρ- (クロロメルクリ） 安息香酸 4 1. 8
ヒ ドロキシルァミ ン 84. 4
フエニルヒドラジン 4 6. 2
セミカルバジド 93. 9
システアミン 1 1 0
L-ぺニシラミ ン 77. 1
D-ぺニシラミン 82. 4
D-シクロセリン 9 6. 6
0-フエナント口リン 1 1 5
, α'-ジピリジル 1 1 3
チロン 1 00
EDTA 92. 0
8-ヒドロキシキノ リン 92. 2
アジ化ナトリウム 8 7. 0
シアン化カリウム 72. 5
ジェチルジチォカルバメート 87. 3
ジチオスレィ トール 95. 5
2-メルカブトエタノール 87. 3
L -ァスコルビン酸 6 9. 3 Na2 S2 0 97. 6
H2 02 94. 8
過硫酸アンモニゥム 1 00
クブリゾン 95. 1
EPNP 83. 4
P SF 83. 9
EDTA：エチレンジアミン四醉酸
EPNP ： 1, 2—エポキシ一 3— (P—ニトロフエノキシ） ブロパン PMSF ： フエニルメタンスルホニルフルオリ ド
(9) 分子量： SDS—ボリアクリルアミ ド 'ゲル電気泳動により 59, 000、 超遠 心分析により 110.000 であり、 同一サブュニット 2個から成るダイマ一で あると推察されたが、 TO F— MSを使用したより精密な分析の結果、 分 子量 10.400の aサブュニット、 分子量 58.200のSサブュニット各 1個ずつ からなる分子量 68, 600のへテロダイマーであることが判明した。
(1 0) 酵素活性の測定：
20 0 ミリモル濃度のオイゲノールの η-オクタン溶液 50 j( L、 50ミ リモル濃度のフエナジンメ トサルフエ一ト水溶液 200〃L、 1モル濃度 のリン酸カリウム緩衝液 （pH7.0) 50〃L、 および脱イオン水 675 Lからなる酵素活性測定用反応液の入った試験管に、 酵素液 25 Lを 加えて 3 O'Cで 20分間振通し、 メタノールを lmL加えることで反応を 停止させ、 ついで得られた反応液を遠心分離し、 上清を高速液体クロマト グラフィ一にかけて、 コニフヱリルアルコールのピークを検出し定量する。 高速液体クロマトグラフィーは、 サイズが 4. 6 1 5 Omm0ODS
C 1 8カラムを用い、 メタノール：脱イオン水：酢酸- 4 5 : 52 : 3 の成分比 （容積比） の溶出液を毎分 1. OmLの流速で流して展開し、 280 nmでの吸光度を検出する。 標準のコニフヱリルアルコールの保持 時間である 3.6分付近のピークをコニフェリルアルコールとする。
本酵素の活性の 1単位は 1分間に 1 mo 1のコニフエリルアルコール を生成させる酵素活性のことである。 本酵素を用いる一般式 (2-a) で表される化合物の製造法をコニフヱリルァ ルコールの製造法を例として説明する。
前記の酵素活性測定用反応液から緩衝液を除いた組成のもの （200ミ リモル 濃度のオイゲノールの n-オクタン溶液 50〃L、 50ミリモル濃度のフエナジン メトサルフエ一ト水溶液 200〃L、 および脱イオン水 675〃L) を、 希硫酸 あるいはアンモニア水を滴下して ρΗを 5から 7に調節し、 25°Cから 55での 温度で 1 5分間から 1 80分間、 攪拌する。 反応終了後、 酔酸ェチル、 クロロホ ルム、 塩化メチレンもしくはェチルエーテル等の有機溶媒で反応液からコニフエ リルアルコールを抽出し、 シリカゲルクロマトグラフィー、 逆相液体クロマトグ ラフィ一、 もしくは真空蒸留等の手段で精製し、 必要ならば活性炭で脱色し、 真 空乾燥して無色のコニフヱリルアルコール粉末を得る。
同様にして、 一股式 （ 1一 a) で表される化合物から一般式 (2-a) で表さ れる化合物を、 一般式 （1一 b) で表される化合物から一股式 (2-b) で表さ れる化合物を、 一般式 （ 1一 c) で表される化合物から一 式 (2-c) で表さ れる化合物を、 一般式 （1一 c' ) で表される化合物から一般式 （2— c' ：) で 表される化合物を、 一般式 （ 1一 d) で表される化合物から一般式 （2— d) で 表される化合物をそれぞれ製造することができる。 また、 一般式 ( 1 - c) にお いて R4 が水素原子である場合は、 不斉誘起反応となり、 光学活性化合物を生成 する。
本発明により上記各化合物を製造する際に使用される水は、 溶媒および酸素原 子供給源としてだけでなく、 酵素反応における電子供与体として作用する。 本発明において、 水および鬈子受容体の使用量は、 それぞれ反応させる基質の モル数と等しいかそれ以上のモル数である。 通常水は溶媒として使用するので大 過剰で使用される。 〔実施例〕
つぎに、 実施例により本発明を具体的に説明する。 本発明はこれらの実施例に のみ限定されるものではない。 実施例 1
シユードモナス ' フルォレツセンス E118 FER P- 185をオイゲノール 0. 1 5 % (v/v) 、 しょ糖 1 % (wZv)、 ペプトン 0. 1 % (wZv) 、 りん酸 2 カリウム 0, 2% (w/v) 、 硫酸マグネシウム 7水塩 0.05%、 酵母エキス 0.0 396 (w/v) 、 硫酸第一鉄 7水塩 0. 1 % (w/v) 及び金属塩混合液 0. 1 % (v/v) を含み pHを 7.0に調整した培養液 20 Lを、 54時間、 通気撹拌培 養した。 金属塩混液は、 脱イオン水 1 L中に、 塩化カルシウム 2水塩 0.4 g、 ほ う酸 0.3 g、 硫酸銅 5水塩 0.04 g、 よう化力リゥ厶 0. 1 g、 硫酸マンガン 7水 塩 0.4 g、 モリブデン酸ナトリウム 2水塩 0.2 gを溶かしたものを用いた。 培養 液を遠心分離して得られた菌体を生理食塩水で洗浄し、 1 OmMりん酸カリウム 緩衝液（ρΗ7.0) 300m lに懸濁した。 この菌体懸濁液から以下に記述する ように、 本酵素を抽出し精製した。 表 3に精製のスキームを示す。
菌体懸濁液を超音波破碎機で処理し菌体を破砕し、 遠心分離して得られた上清 2 1 4 Omg (総活性 270単位） を無細胞抽出液とした。 これに硫酸アンモニ ゥ厶を加えて 30から 50% (w/v) の硫安 和濃度画分 1 3 1 Omg (総活 性 228単位） を得た。 この画分を、 DEAE—セファセル （フアルマシア社製 品） のカラムにかけ、 活性画分 58mg (総活性 1 1 5単位） を得た。 活性画分 に硫酸アンモニゥムを加えて 40から 80%(w v)の硫安飽和¾度画分37.2 mg (総活性 1 02単位） を得た。 この画分を、 フヱニルセファロ一ズ、 DEAE—セファローズ、 ォクチルセファローズ（いずれもフアルマシア社製品） のカラムに順次かけて、 クロマトグラフィーを行い、 最終的に、 0.4mg (総活 性 12. 1単位） の酵素標品を得た。 この摞品は S D S -ボリアタリルァミ ド ·ゲ ル電気泳動で単一であった。
なお、 無細胞抽出液から、 最終的に比活性は 209倍上昇し、 回収率は 4.5% であった。 表 3 本酵素の精製スキーム 総タンパク量 比活性 総活性 回収率 純度 mg
Figure imgf000015_0001
ひ 虽 ffr % 倍口 無細胞抽出液 2140 0.13 270 100 1 0 硫 塩析 30-50% 1310 0 17 228 «44 1 4
DEAEセファセル 58.0 1.98 115 42.6 15.7 硫安塩析 40-80% 37.2 2.74 108 37.8 21.7 フエ二ルセファ口ーズ 11.8 6.88 81.6 30.2 54.6
DEAEセファローズ 1.98 14.1 27.5 10.3 112 ォクチルセファローズ 0.46 26.3 12.1 4.48 209
実施例 2
200ミリモル濃度のオイゲノールの II-オクタン溶液 5 OmL、 50ミリモル 濃度のフエナジンメ トサルフエ一ト水溶液 20 OmL及び脱イオン水 725mL の入った還流器付きの反応容器に、 実施例 1に準拠して作製した 2回目の硫安塩 析を終えた酵素液 25mL (20単位） を加えて、 希硫酸を自動的に滴下するこ とで pHを 5. 5に維持しながら、 5 (TCで 2時間攪拌した。 反応液に酢酸ェチ ルを 8 0 OmL加えて抽出し、 得られた醉酸ェチル層を口一タリーエバボレー夕 一で 2 OmLに濃縮してシリカゲルカラムにかけた。 メタノール： クロ口ホルム ( 1 : 1 ) の溶媒で流出してくる画分を集めて、 室温で真空乾燥し、 融解温度 74°Cの無色粉末 1. 6 gを得た。 収率は 8 9%であった。 この粉末を GCMS 分析にかけ、 親ピークを測定したところ、 1 8 Om/zで、 標準のコニフェリル アルコールと一致した。 赤外吸収スぺクトルも標準のコニフェリルアルコールと 一致し、 コニフェリルアルコールと同定した。 実施例 3
実施例 2と同様にして、 表 4〜5に示すように各基質から対応する生成物を製 造した。 各生成物は G CMS分析、 赤外吸収スぺクトル分析等で同定した。 光学 活性はキラルセル 0B力ラムを用いる高速液体クロマトグラフィーで、 移動相に n —へキサン ： n—プロパノール （9 : 1 ) を、 ピークの検出には紫外線検出器お よび旋光度検出器を用いて行った。 各基質に対する活性は、 オイゲノールを基質 とした場合を 1 0 0とした相対活性で示した。
表 4 基 質 生 成 物 相対
活性
—般式 R1 R2 R3 一般式 R' R2
(1-a) 0CH3 OH (2-a) OCH3 OH 100 実施例 2
(1-a) OCHa OCH3 (2-a) OCH3 0CH3 42.5
(1-b) H OH H (2-b) H OH 7.93 基質： ρ-クレゾ-ル
(1-b) H OH OH (2-b) H OH 122
(1-b) OCH3 OH OH (2-b) OCHa OH 90.4 生成物：バニリン
表 5 基質 /一 -般式 a-c/ト c') 生成物/-一般式 (2- C/2-c' ) 相対 活性
R' R2 R4 R5 R' R2 R4 R5 立体配置 /ee(%)
H OH H CH3 H OH H CH3 S(-) /91.5 78.0
H OH H C2H5 H OH H C2H5 S(-) /91.1 72.8
H OH H Q3H7 H OH H C «Η7 S(-) /90.8 66.4
H OH H C5H11 H OH H CBHI ] S(-) /90< 38.1
OH H H CH3 OH H H CH3 S(-) /90く 18.8
H OH CH3 CH3 H OH CH3 CH3 /— 6.25
H OH CH3 C2H5 H OH CH3 C2H5 12.1
OH OH H CH具 OH OH H CH 10く
実施例 4
さらに本発明の酵素は、 下記の反応式 Dで示される反応にも活性を示し、 実施 例 2と同様にして式（ 1 -d) で表される基質から式（2— d) で表される化合 物を製造することができた。 またこの反応は不斉誘起反応であることが確認され た。
(反応式 D)
Figure imgf000017_0001
〔産業上の利用可能性〕
本発明は、 基質の α位の二重結合の転移を伴ってこの α位に水酸基を付加させ て不飽和アルコール等を製造する反応を触媒する酵素であり、 かかる酵素を用い て、 コニフヱリルアルコールを始めとする各種の 3-(ρ- ヒドロキシフヱニル） -2- プロべノール誘導体、 Ρ-ヒドロキシベンズアルデヒド誘導体や光学活性卜 (4- ヒ ドロキシフヱニル） アルコール誘導体を効率的に製造することができる。
〔寄託された微生物への言及〕
寄託機関の名称 日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 宛て名 （住所） 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号
寄託日 平成 7年 9月 1 4日
受託番号 FERM P-15185

Claims

請求の範囲
1. 下記の性質を有する酸化還元酵素。
( 1 ) 作用：水の存在下で、 オイゲノールの α位の二重結合を隣に移動させ、 ひ 位に水酸基を付加することによってコニフヱリルアルコールを生成する。
(2) 基質特異性：一般式 （ 1一 a)、 (1 -b) . (1 - c) 、 （1一 c' ) 、
(1 -d) で表される化合物に作用し、 一股式 （2— a) 、 （2— b) 、 (2-c) 、 (2-c' ) , (2— d) で表される化合物をそれぞれ生成 する。
(3) 基質親和性：オイゲノールまたはフエナジンメトサルフエ一トに対するミ 力エリス定数は、 それぞれ 1.75または 0.4 ミリモル濃度である。
(4) 至適 pH： pH5. 5付近。
(5)至適温度： 50。C。
(6) 安定 pH範囲： 30eC、 30分間の処理では、 pH5から 9まで安定であ る。
(7) 各種金属塩による影響：二価鉄、 銅、 銀、 水銀の塩により顕著に活性が阻 害される。
( 8 ) 各種阻害剤の影響： p -（クロロメルクリ） 安息香酸、 フヱニルヒ ドラジン で活性が阻害される。
(9) 分子量：分子量 10.400の サブュニット、 分子量 58.200の/ Sサブュニット 各 1個ずつからなる分子量 68.600のへテロダイマー。
2. シユードモナス ' フルォレツセンス（Pseudomonas fluorescens) に属する菌 株を、 オイゲノールを含む栄養培地で培養し、 該菌株の菌体中に産生した酵素 を採取することにより得られ、 少なくとも下記の反応式 A、 B、 Cに示す反応 を触媒する酵素。 (反応式 A)
(反応式 B)
(反応式 C)
Figure imgf000020_0001
(式中、 R1 は水素原子、 水酸基またはメトキシ基を示し、 R2 は水酸基また はメトキシ基を示し、 R3 は水素原子または水酸基を示し、 R4 は水素原子ま たはメチル基を示し、 R5 は炭素数 1〜1 0のアルキル基またはアミノメチル 基を示す。 ）
3. 反応式 Cで示される反応において、 R4 が水素原子である場合に不斉誘起反 応を触媒する酵素である請求項 2に記載の酵素。
4. シユードモナス · フルォレツセンスに属する菌株がシュ一ド乇ナス · フルォ レツセンス E118(FERM P-15185) である請求項 1または 2に記載の酵素。
5. 請求項 1〜 4のレ、ずれか 1項記載の酵素を触媒として使用し、 水および電子 受容体の存在下、 下記式 Aに示す反応により、 一般式（1— a) で表される p ーァリルフヱノール誘導体から一般式 （2— a) で表される 3— (p—ヒドロ キシフヱニル） 一 2—プロべノール誘導体を製造する方法。
(反応式 A)
Figure imgf000021_0001
(式中、 R' は水素原子、 水酸基またはメ 卜キン基を示し、 R2 は水酸基また はメ トキシ基を示す。 ）
6. 請求項 1〜4のいずれか 1項記載の酵素を触媒として使用し、 水および電子 受容体の存在下、 下記式 Bに示す反応により、 一般式 (1一 b) で表される p ーヒドロキシトルエン誘導体から一般式 (2-b) で表される p—ヒドロキン ベンズアルデヒド誘導体を製造する方法。
(反応式 B)
Figure imgf000021_0002
(式中、 R1 は水素原子、 水酸基またはメ トキシ基を示し、 R2 は水酸基また はメ トキシ基を示し、 R3 は水素原子または水酸基を示す。 )
7. 請求項 1〜4のいずれか 1項記載の酵素を触媒として使用し、 水および電子 受容体の存在下、 下記式 Cに示す反応により、 一般式 （1一 c) で表される p 一アルキルフエノール誘導体から一股式 （2— c) で表される p—ヒドロキシ ベンジルアルコ一ル誘導体を製造する方法。 (反応式 C)
Figure imgf000022_0001
(式中、 R1 は水素原子、 水酸基またはメトキシ基を示し、 R2 は水酸基また はメ トキシ基を示し、 R4 は水素原子またはメチル基を示し、 R5 は炭素数 1 〜1 0のアルキル基またはアミノメチル基を示す。 ）
8. 請求項 1〜4のいずれか 1項記載の酵素を触媒として使用し、 水および電子 受容体の存在下、 下記式 C' に示す反応により、 一般式 (1 -c* ) で表され るアルキルフヱノール誘導体から一般式 （2— c' ) で表される光学活性ヒド ロキシベンジルアルコール誘導体を製造する方法。
(反応式 C' )
Figure imgf000022_0002
(1一 c' ) (2— c' )
(式中、 R1 および R2 は相互に独立して水素原子、 水酸基またはメ トキシ基 を示すが、 R' と R2 が同時に水素原子であることはなく、 R5 は炭素数 1〜 1 0のアルキル基またはアミノメチル基を示す。 ）
9. 請求項 1〜 4のいずれか 1項記載の酵素を触媒として使用し、 水および電子 受容体の存在下、 下記式 Dに示す反応により一般式 (1 -d) で表される化合 物から一般式 (2-d) で表される化合物を製造する方法。 (反応式 D)
Figure imgf000023_0001
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