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WO1997017994A1 - Tratamiento de la diabetes con un gen de glucoquinasa - Google Patents

Tratamiento de la diabetes con un gen de glucoquinasa Download PDF

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WO1997017994A1
WO1997017994A1 PCT/ES1996/000216 ES9600216W WO9717994A1 WO 1997017994 A1 WO1997017994 A1 WO 1997017994A1 ES 9600216 W ES9600216 W ES 9600216W WO 9717994 A1 WO9717994 A1 WO 9717994A1
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WO
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dna
vector
cells
promoter
glucoqumase
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/ES1996/000216
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English (en)
French (fr)
Inventor
Fátima BOSCH TUBERT
Alfons Valera Abril
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitat Autonoma de Barcelona UAB
Original Assignee
Universitat Autonoma de Barcelona UAB
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Publication date
Application filed by Universitat Autonoma de Barcelona UAB filed Critical Universitat Autonoma de Barcelona UAB
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Priority to AU75726/96A priority patent/AU7572696A/en
Priority to JP9518600A priority patent/JPH10512762A/ja
Publication of WO1997017994A1 publication Critical patent/WO1997017994A1/es
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
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    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus

Definitions

  • Hyperglycemia occurs in both insulin-dependent diabetes mellitus and non-insulin-dependent diabetes mellitus. Hyperglycemia develops when sugar entering the bloodstream after a meal is not adequately removed by the liver and peripheral tissues sensitive to insulin, such as muscles and fats (Bennet, PH, In Diabetes Mellitus, compiled by Ellenberg, et to the., 408-414 (3rd ed., Medical Exammation Publishmg Co. 1983)).
  • the liver collects the excess sugar from the circulation and stores it as glycogen.
  • glucose-6-P0 4 When glucose enters the liver cells, it is phosphorylated by the enzyme glucoqumase to form glucose-6-P0 4 .
  • Glucose-6-P0 4 constitutes the substrate for glycogen synthesis and glucose utilization. However, it is perceived that the storage of glucose in the liver responds only to a fraction of the glucose removed from the bloodstream (Flier, et al., N. Engl., J. Med. 327:
  • One aspect of the invention relates to a procedure for treating a diabetic patient.
  • the procedure includes the operation of administering to the patient a segment of DNA containing a glucoqumase gene and a promoter sequence, in which the promoter sequence is operatively linked to the glucokinase gene and is effective for the expression of a therapeutically effective amount. of glucoqumase in the diabetic patient. It was unexpected that glucokinase expression in a diabetic patient helped to normalize the glucose level of patients in the absence, or regardless of the level, of insulin.
  • the term "therapeutically effective amount” means an amount of the expressed glucokinase that is sufficient to effect glucose uptake in cells, tissues or organs of the patient, and can be determined without undue experimentation.
  • the glucoqumase coding sequence of the DNA segment may be the same, or substantially the same, as the endogenous glucokinase coding sequence, as long as it encodes functional glucoqumase proteins.
  • the DNA segment can be the same, or substantially the same, as the glucoqumase gene of a non-human species, as long as it encodes a functional glucokinase protein.
  • the transcription of the glucoqumase gene in the DNA segment is preferably under the control of a promoter sequence that is different from the promoter sequence that controls the transcription of the endogenous coding sequence, eg.
  • a promoter sequence that remains activated or induced during the presentation of diabetic conditions in the patient, such as elevated levels of glucose, glucagon, t-glycerides, or free fatty acids.
  • promoter sequences include the phosphoenolpyruvate carboxymamase promoter.
  • PEPCK myosma light chain promoter
  • the DNA segment is introduced into the diabetic patient into the cells, whereby the cells are treated to incorporate the DNA segment therein and, as a result, the cells express microbial in the diabetic patient a therapeutically effective amount of glucoqumase.
  • the DNA segment can be introduced into the cells by a viral vector, eg, a retroviral vector.
  • the cells can also express a glucose transporter, eg, GLUT-1, GLUT-2, GLUT-3, GLUT-4, or GLUT-5. Examples of cells expressing GLUT-2 are liver cells, kidney cells, intestinal cells, and cells transcribed to express GLUT-2.
  • Examples of cells expressing GLUT-4 are muscle cells, fat cells, and cells transcribed to express GLUT-4.
  • the cells can also be administered to the diabetic patient in an intact mass as a neo-organ. For example, see Mueckler, J. Diab. Comp. 7: 130-141 (1993).
  • the DNA segment is introduced directly into the diabetic patient, eg, it is not contained within a cell.
  • the DNA segment can be introduced into a vector.
  • appropriate vectors include viral vectors (eg, retroviral vectors, adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors, smdbis viral vectors, and viral herpes vectors), plasmids, cosmids, and artificial yeast chromosomes.
  • the DNA segment can also be introduced as infectious particles, eg, DNA conjugates and a ligand, precipitated with calcium phosphate and liposomes.
  • DNA segments described herein as well as vectors and cells containing such a DNA segment.
  • Figure 1 is a schematic representation of the construction of a DNA vector that carries a glucoqumase gene for expression within liver cells.
  • Figure 2 is a schematic representation of the construction of a DNA vector carrying a glucoqumase gene for expression within muscle cells.
  • the therapeutic method of the invention allows overexpression (eg, at a higher level than pretreatment) of glucoqumase in a diabetic patient.
  • Overexpression of glucoqumase in the diabetic patient results in the absorption of glucose in the cells that express the glucokinase DNA segment.
  • DNA segment in the present context is any exogenous artificial entity (construct) of DNA, which includes a sequence encoding a functional glucochemase, and the glucoqumase is expressed by the cells within which it is Enter the segment of DNA.
  • the DNA segment can be introduced both in the somatic cells such as germ cells or only in some of the patient's somatic cells, or cells that express the segment of DNA can be introduced ex vivo into the patient.
  • the DNA segment therefore, may or may not be an integral part of the patient's chromosome, and if the DNA segment is integrated into a chromosome, it may or may not be located at the same site as its corresponding sequence of endogenous gene.
  • the segment of DNA used to implement the therapeutic procedure includes a glucoqumase gene or its complementary DNA (“cDNA”), whose expression is driven by a promoter that is expressed during the presentation of diabetic conditions.
  • suitable promoters include the general constitutively active promoters / mtensifiers, eg, the ⁇ -actma promoter (Kawamoto, et al., Mol. Cell Biol. 8: 267-272 (1988); Mo ⁇ shita, et al. , Biochem. Biophys. Acta 1090: 216-222 (1991)), cytomegalovirus ("CMV”) and SV40 promoters, (Okayama, et al., Mol. Cell Biol.
  • tissue specific constitutive promoters eg, muscle-specific myosma light chain promoters (Lee, et al., J. Biol. Chem. 267: 15875-15885 (1992); Greishammer, et al., Cell 69: 79-93 (1992) and the liver-specific albumin promoter (Heckel, et al., Cell 62: 447-456 (1991)).
  • the promoter is composed of a cis-acting DNA sequence, which is capable of directing the transcription of a gene in the appropriate environment, tissue, context and in response to physiological regulators, e.g. hormones, glucose and biochemical metabolizers. intermediaries
  • physiological regulators e.g. hormones, glucose and biochemical metabolizers.
  • intermediaries The expression of a transgene (eg, a glucoqumase gene or its cDNA sequence) can be regulated.
  • measurable promoters include the glucagon-inducible phosphoenolpyruvatecarboxyquinase promoter (Valera, et al., Proc. Nati. Acad. Sci.
  • Examples of these include the glucoqumase DNA sequence in a human being (Koranyi, et al., Diabetes 41: 807-811 (1992); Nishi, et al., Diabetology 35: 743-747 (1992); Stoffel, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 7294-7297 (1991); and
  • Examples of cells that serve as a target for glucokinase overexpression include hepatocytes from the liver (Peng, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 8146 (1988); Wolff, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 3344 (1987); and Wilson, et al., Proc. Nati. Acad. Sci.
  • myoblasts and myocytes proceed ⁇ te of the muscles (Salmmer, et al., Human Gene Therapy 2: 15-26 (1991)), bone marrow stem cells (Bakx, et al., Human Gene Therapy 2: 301-306 (1991); Williams, et al., Nature 310: 476-480 (1984); Lim, et al., Proc. Nati. Acad.
  • vectors can both be used viral as non-viral, eg, plasmids, cosmids, and artificial yeast chromosomes) and other available gene delivery systems, or for viral expression within cells used in ex vivo implantation or direct delivery of a glucoqumase gene to the cells or tissues of a patient.
  • viral eg, plasmids, cosmids, and artificial yeast chromosomes
  • Viral vectors can be used for the delivery of a glucoqumase gene.
  • examples of viral vectors include recombinant retroviral vectors, recombinant adenoviral vectors, recombinant adeno-associated viral vectors, smdbis viral vectors, and recombinant herpes viral vectors.
  • the genome of a recombinant retroviral vector consists of long terminal repeat sequences ("LTR") at both ends, which serve as a viral promoter / mtensifier, and a transcription initiation site as well as a Psi site that serves as a packaging signal for vi ⁇ ons and a selectable marker gene (eg, a neomicma resistance gene).
  • LTR long terminal repeat sequences
  • Psi site eg, a neomicma resistance gene.
  • An example of such a vector is pZIP-NeoSV (Cepko, et al., Cell 53: 103-1062
  • the glucoqumase gene can be cloned into an appropriate cloning site in the retroviral genome.
  • the expression is under the control of transcription of retroviral LTR.
  • the vector will drive the constitutive expression of glucoqumase in the appropriate cell type.
  • the level of expression is dictated by the promoter force of the LTR. Tissue selectivity is determined both by the origin of the viral genome (eg, sarcoma virus, leukemia virus or tumor virus breast) and the cell lineage used to package the virus.
  • the glucoqumase gene can also be cloned into the vector set to an internal promoter as an expression sequence (Crystal, R.G., Science 270: 404-410 (1995)).
  • an internal promoter confers an additional level of control over gene expression (Lai, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10006-10010 (1989) ; and Scharfmann, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 4626-4630 (1991)).
  • Examples of internal promoters are strong constitutive promoters, eg, the ⁇ -actin promoter (Kawamoto, et al., Mol. Cell Biol. 8: 267-272 (1988); Morishita, et al., Biochem. Biophys Acta 1090: 216-222 (1991); Lai, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86-10006-10010 (1989)), the H-2k promoter (Schuh, et al. ., Nature 345: 757-760 (1990);
  • the promoter may also be an adjustable-mducible promoter, eg, the mouse metallothionein promoter (Ka ⁇ n, et al., Pro. Nati. Acad. Sci. USA 80: 4040-4044 (1983)) , the tetracycline mducible promoter (Gossen, et al., Science 1766-1769 (1995); Efrat, et al., Proc. Nati. Acad. Sci.
  • adjustable-mducible promoter eg, the mouse metallothionein promoter (Ka ⁇ n, et al., Pro. Nati. Acad. Sci. USA 80: 4040-4044 (1983)
  • the tetracycline mducible promoter Gossen, et al., Science 1766-1769 (1995); Efrat, et al., Proc. Nati. Acad. Sci.
  • tissue specific promoter / enhancer eg, the liver-specific mouse albumin promoter (Heckel, et al., Cell 62: 447-456 (1991)) and the PEPCK promoter (Valera, et al. ., FASEB J. 8: 440-447
  • muscle-specific myosin light chain promoters (Lee, et al., J. Biol. Chem. 267: 15875-15885 (1992); Shen, et al., Mol. Cell Biol 11: 1676-1685 (1991); Lee, et al., Mol. Cell Biol. 14: 1220- 1229 (1994); Grieshammer, et al., Cell 69: 79-93 (1992); and Donoghue, et al., Gene Dev. 2: 1779-1790 (1988)), the alpha-miosma heavy chain promoter (Molkentm, et al., J. Biol. Chem.
  • Recombinant retroviruses capable of transducing the glucoqumase gene are produced by transfecting the recombinant retroviral genome (s) within an appropriate lineage of amphotropic packaging cells (free of helper viruses).
  • virus packaging cell lineages include PA317 and Psi CRIP (Cornetta, et al., Human Gene Therapy 2: 5-14 (1991), Miller, et al., Mol. Cell Biol. 6: 2895-2902 (1986 ); Cone, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6349-6353 (1984)).
  • the lineage of transiected virus packaging cells will package and produce recombinant retroviruses, spilling them into tissue culture media.
  • Retroviruses are collected and recovered from the culture media by centrifugation (Compere, et al., Mol. Cell Biol. 9: 6-14 (1989)). Viruses are resuspended in an appropriate buffer, eg, 10 mM HEPES, and stored at -70 ° C or in liquid nitrogen.
  • an appropriate buffer eg, 10 mM HEPES
  • Retroviral vectors can offer a wide range of hosts and a broad tropism for tissues through the appropriate choice of internal promoter and virus packaging cell lineage. Selective targeting is achieved by modifying the envelope protein produced by the lineage of packaging cells. For example, by generating a chimeric envelope protein with a single stranded variable fragment from a monoclonal antibody that Recognizing the human low-density lipoprotein receptor, it was possible to effectively target the infection of the cells expressing the receptor (Somia, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92: 7570-7574 ( nineteen ninety five)) .
  • An adenovirus can be used as a vector to transduce a glucoqumase expression sequence.
  • a number of adenoviral vectors have been developed for transduction of genes within cells (Berkner, et al., BioTechniques 6: 616-629 (1988)). A high level constitutive expression of the transduced gene products has been achieved. These vectors have the inherent advantage, in relation to retroviral vectors, of not requiring replicating cells for infection, making them appropriate vectors for somatic gene therapy (Mulligan, R.C., Science 260: 926-932 (1993)).
  • Replication-defective adenoviruses have been developed, lacking the El region of the genome, which will accommodate an insertion of 7.5 kilobases of foreign DNA (Crystal, RG, Science 270: 404-410 (1995); Logan, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659 (1994); Freidman, et al., Mol. Cell Biol. 6: 3791-3797 (1986); Levrero, et al., Gene 101: 195-202 (1991); and Imler, et al., Human Gene Therapy 6: 71-721 (1995)).
  • replication-defective recombinant adenoviruses can be propagated by transfecting the genome within cells treated by genetic engineering to express the El genes (Jones, et al., Cell 16: 683 (1979); and Berkner, et al., BioTechniques, 6: 616-629 (1988)).
  • This system allows the production of high-titre adenovirus particles (eg, up to 10 13 / ml), which greatly intensifies the efficiency of infection making possible a greater multiplicity of infection (Crystal, RG, Science 270: 404-410 (1995)).
  • An expression sequence can be cloned into the plasmid of Adenovirus 5 containing a region of regulated tissue-specific promoter, eg, the PEPCK promoter (Valera, et al., PHASEB 8: 440-447 (1994)) linked to a DNA fragment encoding glucoqumase with 3 'ends and 5 'compatible (modified by appropriate linkers with crimpers and then subjected to proper digestion with restriction endonucleases as described in Maniatis, et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1989 )).
  • tissue-specific promoter eg, the PEPCK promoter (Valera, et al., PHASEB 8: 440-447 (1994)
  • the entire recombinant adenoviral genome is then generated by mixing the limealized Adenovirus 5-PEPCK-glucokinase plasmid with a subgenomic fragment of Adenovirus DNA representing the 3.85-100 map units (prepared by digesting the In340 viral genome with Clal or Xbal) (NE Biolabs, Beverly, MA)
  • the adeno-associated virus can also be used as a vector to transduce a glucokinase expression sequence.
  • the AAV offers the advantage that it has not been implicated in the etiology of any disease, and it has been shown that its specific integration of a site on human chromosome 19 does not interfere with host gene expression or promote gene overhauls (Kotin , et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 2211-2155 (1990); Samulski, et al., Euro. Mol. Biol. Org. J. 10: 3941-3950 (1991) ).
  • AAV is capable of infecting post-mitotic cells, thereby becoming an appropriate vector for gene delivery to somatic cells.
  • the AAV genome contains two genes, rep and cap, and inverted terminal repeat (ITR) sequences (Hermonat, et al., J. Virol. 51: 329-339 (1984)).
  • Recombinant AAV vectors are constructed by replacing the rep gene, the cap gene, or both, with a glucoqumase gene expression sequence (Hermonat, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6466 -6470 (1984)).
  • the only one The sequence required for integration into the AAV vector is the ITR of the terminal base 145 (Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158 (97): 97-129 (1992)).
  • Such vectors are available in the form of a plasmid (Tratschin, et al., Mol. Cell Biol. 5: 3251-3260 (1985); Lebkowski, et al., Mol. Cell Biol. 8: 3988-3996 (1988) ; and McLaughlin, et al., J. Virol. 62: 1963-1973 (1988)).
  • Recombinant AAV genomes can be packaged within AAV particles by co-transfection of the vector plasmid and a second packaging plasmid that carries the rep and cap genes into an adenovirus infected cell. It has been shown that such particles effectively transduce heterologous genes in a number of mammalian cell lineages (Tratschin, et al., Mol. Cell Biol. 5: 3251-3260 (1985); Lebkowski, et al., Mol. Cell Biol .8: 3988-3996 (1988); McLaughlin, et al., J. Virol. 62: 1963-1973 (1988); Flotte, et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7: 349 -356 (1992)).
  • HSV vectors constitute a unique system for the delivery of genes to neuronal lineage cells (Anderson, et al., Cell Mol. Neurobiol. 13: 503-515 (1993)). HSV-derived vectors infect post-mitotic neurons and produce an established latent infection in some cell types, becoming an appropriate system for somatic gene therapy (Leib, et al., BioEssays 15: 547-554 (1993)).
  • the glucoqumase expression sequence is cloned into a plasmid containing a portion of the HSV genome, such that at least 300 bp flank the 5 'and 3' ends of the sequence (Breakfield, et al., New Biol 3: 203-218 (1991); and Efstathiou, et al., Brit. Med. Bull. 51: 45-55 (1995)).
  • the plasmid is transfected into permissive cells in the course of culture, together with the full length HSV DNA (Geller, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 8950-8954 (1990 )).
  • Homologous recombination and DNA replication will result in the generation of recombinant HSV genomes, which are packaged into new virus particles by the cell. Throughout several rounds of bald purification, a recombinant virus that carries the glucoqumase expression sequence can be identified for large-scale production.
  • HSV vectors have been used successfully to transfer exogenous genes to neurons in vitro and in vivo (Geller, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 1149-1153 (1990 ); Geller, et al., Science 241: 1667-1669 (1988); and Efstathiou, et al., Brit. Med. Bull. 51: 45-55 (1995)).
  • a variety of constitutive promoters have been used, including lytic cycle HSV promoters, Rous sarcoma virus LTRs, human cytomegallovirus IE (HCMV) promoters and neurofilament and PGK promoters for transient expression.
  • HCMV human cytomegallovirus IE
  • Smdbis virus-based vectors are designed as self-amplifying systems to intensify the expression of exogenous genes in mammalian cells (Herweijer, et al., Human Gene Therapy 6: 1161-1167 (1995)).
  • the subgenomic sequences encoding structural proteins are replaced by the transgene expression sequence, eg, glucoqumase (Huang, et al., Virus Genes 3: 85-91 (1989); and Bredenbeek, et al., J. Virol. 67: 6439-6446 (1993)).
  • the recombinant syndbis virus is generated by placing the entire genome under the control of T7 or SP6 bacteriophage promoters in order to make transcription of the (+) stranded RNA possible.
  • RNA genomes are then used to transfect target cells (Xiong, et al., Science 243: 1188-1191 (1989)). Infectious viruses are produced by infecting with a cooperating virus (Bredenbeek, et al., J. Virol. 67: 6439-6446 (1993)). Modifications of this design have been described using Rous sarcoma virus LTRs to direct transcription of non-structural genes (Herweijer, et al., Human Gene Therapy 6: 1161-1167 (1995)).
  • the luciferase gene cloned into the singular Xbal site in the pSm-Lux vector (Herweijer, et al., Human Gene Therapy 6: 1161-1167 (1995)), is replaced by the glucoqumase cDNA or by an expression sequence encoding glucoqumase after appropriate modifications of the restriction endonucleases. See Sambrook, et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor
  • the smdbis virus vectors have been used successfully to transduce foreign genes in 3T3 cells
  • Viral vectors can be used to deliver the glucoqumase coding sequence to the cells, tissues and organs of diabetic patients through a live infection.
  • the recombinant viral vector is administered to the organism in order to result in a general systemic infection or a specific infection for organs / tissues of the patient.
  • an intravenous injection of a recombinant retrovirus or an aerosol administration of recombinant adenoviral vectors results in an infection of the epithelial lining of the respiratory tract (Rosenfield, et al., Science 252: 431-434 (1991) ; and Hsu, et al., J. Infectious Dis.
  • Recombinant DNA expression sequences are prepared and purified, comprising regions of cellular promoters / mtensifiers and regulatory regions operatively linked to the glucoquase genes and cDNAs designed for expression in mammalian target tissues in the form of plasmids, lmealized DNA fragments, or viral DNA / RNA vectors, as described in Sambrook, et al. , Molecular Cloning - A Laboratory Manual
  • a DNA can be introduced into cells by a DNA-mediated transduction following one of the following methods: precipitation with calcium phosphate, DEAE-dextran method, electroporation (Ausudel, et al., Current Protocols m Molecular Biology
  • the cultured cells are trypsed and plated on selection media at a density of 1/10.
  • Clonal cell lineages which have inherited the selectable marker, are captured by cloning in rings, expanded in culture, and analyzed for the inheritance of the transfected gene of interest by PCR (Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, 1990)) and Southern blot analysis (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503
  • glucoqumase transfected gene is examined by Northern blot analysis (Sambrook, et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) of total RNA by immunoblot analysis with specific antisera for glucoqumasa and by analysis of glucoqumasa activity (Valera, et al., Eur. J. Biochem. 222: 533-539 (1994); Dav ⁇ dson, et al., Arch. Biochem. Biophys. 253: 156-157 (1987 )).
  • hepatocytes can be isolated from the liver (Ponder, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1217-
  • hepatocytes are collected and transplanted into a patient or by infusion of the cells in the portal vein (Wilson, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 6437-8441 (1990 )) or by intrasplenic introduction (Ponder, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 1217-1221 (1991)).
  • mice In mice, it was shown that genetically modified hepatocytes, introduced mtraesplenically, replaced up to 80% of the diseased liver (Rhim, et al., Science 263: 1149-1152 (1994)). In dogs, a 5% replacement of the liver mass with hepatocytes transduced with the retrovirus expressing human ⁇ -antit ⁇ psin resulted in human peptide expression for up to 30 days (Kay, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 89-93 (1992)).
  • hypercholesterolemias in inherited hyperlipidemic rabbits from Watanabe were transiently corrected by implantation of hepatocytes transduced with a retrovirus capable of directing the expression of a functional low-density lipoprotein ("LDL") receptor (Wilson, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 8437-8441 (1990)).
  • LDL low-density lipoprotein
  • a specific internal liver promoter could intensify a sustained level of transgene expression.
  • myoblasts can be isolated from muscle biopsies (Mendell, et al., N. Engl. J. Med. 832-838 (1995)), can be expanded in culture and genetically modified to express high levels of glucokinase by transfection with a DNA comprising the glucokinase gene under the control of the transcription of a specific promoter / intensifier of strong muscles or can be infected with a recombinant muscle-specific retrovirus (Ferrari, et al., Human Gene Therapy 6: 733-742
  • Myoblasts that express glucokinase can then be transferred to a muscle by direct injection of the cells.
  • Previous experience with murine myoblasts has shown that injected myoblasts will fuse to form preexisting multinucleated myofibrils (Dhawan, et al., Science 254: 1509-1512 (1991); and Barr, et al., Science 254: 1507-1509 (1991)).
  • Differentiated muscle fibers will maintain a high level of transgene expression (Yao, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 3357-3361 (1992)).
  • human fibroblasts can be modified by gene transfer, receptor-mediated or retrovirus-mediated (Veelken, et al., Human Gene Therapy 5: 1203-1210 (1994); and Chen, et al., Human Gene Therapy 6: 917-926 (1995)) to overexpress glucoquinase.
  • the cells are then embedded in collagen-coated latexes of expanded poly (tetrafluoroethylene) fibers (Gore-Tex), as described above (Thompson, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 7928-7932 (1989); and Moullier, et al., Nature Genetics 4: 154-159 (1993)).
  • neo-organs produced sustained expression of transgenes in mice (Salvetti, et al., Human Gene Therapy 6: 1153-1159 (1995)) and dogs (Moullier, et al., Nature Med. 1: 353- 357 (1995)).
  • Such neo-organs which comprise fibroblasts or other types of cells that overexpress glucoqumase, can serve to normalize blood sugars in the msulinopenic state.
  • Non-viral glucoqumase genes can also be targeted in vivo to specific tissues or organs, eg, the liver or muscles, in patients.
  • delivery systems may include a receptor-mediated endocytotis, an encapsulation of liposomes or a direct insertion of non-viral expression vectors.
  • the glucokinase gene can be delivered to specific cells, eg, hepatocytes in the liver (Wu, et al., J. Biol. Chem. 266: 14338-14342 (1991); and Wilson , et al., J. Biol. Chem. 267: 963-967 (1992)).
  • specific cells eg, hepatocytes in the liver
  • Wilson et al., J. Biol. Chem. 267: 963-967 (1992)
  • soluble glucokinase DNA complexed with this molecule, can be supplied to hepatocytes in the liver through an Asialoglycoprotein receptor binding, followed by endocytosis.
  • the ligand and DNA complex is administered intravenously.
  • liposome formulations for example, proteoliposomes containing viral envelope receptor proteins, i.e. virosomes
  • virosomes effectively deliver genes to hepatocytes and renal cells after direct injection
  • Nicolau et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 1068-1072 (1993); Kaneda, et al., Science 243: 375-378 (1989); Mannino, et al., Biotechmques 6: 682 (1988); and Tomita, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 186: 129-134 (1992)
  • Nicolau et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 1068-1072 (1993); Kaneda, et al., Science 243: 375-378 (1989); Mannino, et al., Biotechmques 6: 682 (1988); and Tomita, et al., Biochem. Biophys
  • glucokinase DNA expression vectors e.g., into a muscle or liver, either as a solution or as a precipitate with calcium phosphate (Wolff, et al., Science 247 : 1465-1468
  • the micromjection of the glucoqumase DNA segment constitutes an approach to achieve a gene therapy of germ lineages (Hogan, et al., Manipulatmg the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986); Brmster, et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA 82: 4438-4442 (1985)).
  • Another method to achieve a gene therapy of germ lineages is to effect a transfection of a gene and a homologous recombination in embryonic stem cells (Thomas, et al., Cell 51: 503-512 (1987); and Capecchi, Science 244: 1288 -1292 (1989)).
  • Example 1 Expression of glucokinase in the liver
  • This chimeric gene was used as a liver expression vector to obtain regulated expression and stabilization of mRNA from cDNAs in transgenic mice.
  • the strategy used to obtain the PEPCK / GK chimeric gene was started by sucking the BglII-Sphl fragment of the PEPCK / insulin chimeric gene, which includes the first exon (3'-Ins) and the gene translation initiation site of human insulin (5'-Ins), in the pSP72 polisher. To destroy the ATG translation initiation site, which was contained in a unique Ncol restriction site, this fragment of the insulin gene was digested with Ncol and treated with mung bean nuclease to remove single-chain pendant portions produced by the enzyme.
  • a 4.5 kb Xbal-Sphl fragment containing the entire PEPCK / GK chimeric gene was micromjected into fertilized eggs removed by scanning from the oviducts of C57BL6 / HJL mice superovulated at 6-8 hours after ovulation.
  • a schematic diagram of the chimeric gene is described in Figure 1. The expression of this chimeric gene leads to a 2.5 kb mRNA transcript when it is polyadenylated in the signal at the end of the glucochemase cDNA.
  • the general procedures for micromjection of the chimeric gene were as described in Hogan, B., et al., Manipulatmg the Mouse Embryo - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1986).
  • the animals were tested for the presence of the transgene by Southern blotting of 10 ⁇ g of tail DNA, digested with EcoRI.
  • the transfer spots were hybridized with a 2.3 kb EcoRI-EcoRI fragment containing all glucoqumase cDNA radiolabeled with [ ⁇ - 32 P] dCTP (3,000 Ci / mmol), Amersham Corp., Arlmgton Heights, IL) by random oligo-priming (Boehringer-Mannheim, Germany).
  • the animals expressing the transgene were retained and then fed ad libi tum with a standardized diet (Panlab, Barcelona, Spain) and kept under a 12-hour light and dark cycle (lamps connected at 8:00 am).
  • mice For the diabetic group, diabetes was induced by injection through the jugular vein at a dose of 2 mg of streptozotocma / 10 g of body weight on 2 consecutive days. Streptozotocma ("Stz”) (Sigma Chemical Co., Saint Louis, MO) was dissolved in a 10 mM sodium citrate buffer with 0.9% NaCl, pH 4.5, immediately before administration. Mice were used 7 days after streptozocin treatment. Diabetes was determined by measuring glycemic, glucosuric and ketone levels (ACCUTREND and GLUKETUR Test, Boehrmg Mannhem, Germany). The animals were sacrificed and samples were taken between 9 and 10 in the morning. Male mice with an age of 4 to 8 weeks were used.
  • mice of generations Fl and F2 from two transgenic lineages, carried approximately 5 and 20 intact copies, respectively, of the PEPCK / GK chimeric gene, as analyzed by Southern blotting, and were used in further studies. Bait couplings were used as controls for the transgenic animals.
  • RNA samples (30 ⁇ g) were electrophoresed on a 1% agarose gel containing 2.2 M formaldehyde. Northern blots were hybridized. a cDNA probe labeled with 32 P and glucokinase probe labeled ⁇ -actma 32 P, corresponding to an EcoRI-EcoRI 1.3 kb fragment of the rabbit NCA, as indicated in Valera, A. , et al., FASEB J. 9: 1067-1078 (1995).
  • Hepatocytes were isolated between 10 and 11 in the morning from normally fed mice and diabetic mice, as described in LeCam, A., et al., Exp. Cell Res. 98: 382-395 (1976). After removing non-parenchymal cells and debris, hepatocytes were resuspended in a Dulbecco-modified Eagle medium ("DMEM") (Gibco, Grand Island, NY) containing 0.2% albumin and 10% fetal calf serum (Boehrmger- Mannheim, Germany). 5.5 x 10 6 cells in 10 ml of this medium were plated on collagen-coated trays and kept at 37 ° C under a 5% C0 2 atmosphere.
  • DMEM Dulbecco-modified Eagle medium
  • hepatocytes were incubated in 10 ml of DMEM without glucose and supplemented with 16 mM lactate plus 4 mM pyruvate for a period of time up to 24 h. 100 ml aliquots of the medium were taken at different times and glucose and ⁇ -hydroxybutyrate concentrations were determined.
  • liver samples were homogenized in an ice-cold buffer (pH 7.4) containing 50 mM Tris-HCl, 300 mM sucrose, 100 mM KCl, ethylenediamma-tetraacetic acid (“EDTA" ) 1 mM and ⁇ -mercaptoethanol 0.7 ⁇ l / ml.
  • EDTA ethylenediamma-tetraacetic acid
  • ⁇ -mercaptoethanol 0.7 ⁇ l / ml.
  • EDTA ethylenediamma-tetraacetic acid
  • the concentrations of insulin and serum glucose, glycogen, glucose-6-phosphate and lactate in liver, glucose and lactate extracts were measured in hepatocyte incubation media, as described in Valera, et al., PHASEB J. 9: 1067-1078 (1995).
  • the glucose in 20 ml of blood was also determined using an ACCUTREND analyzer (Boehringer-Mannhein, Germany).
  • the levels of ⁇ -hydroxybutyrate in serum and in hepatocyte incubation medium were measured by ⁇ -hydroxybutyrate dehydrogenase technology (Boehringer-Mannheim, Germany). Serum triglycerides were determined. enzymatically (GPO-PAP, Boehrmger-Mannheim, Germany).
  • Serum free fatty acids were measured by the acyl-CoA-smtase and acyl-CoA oxidase method (Wako Chemicals, Germany). Enzymatic activities and metabolite concentrations are expressed as the mean ⁇ the typical error of the mean (SEM).
  • a 2.5 kb transcript was detected in the liver of control and transgenic mice, which resulted from the expression of both the endogenous glucoqumase gene and also the glucoqumase transgene.
  • Glucoqumase mRNA transcripts were not detected in the liver of diabetic control mice, while Stz-treated transgenic mice retained a high level of glucoqumase mRNA expression.
  • Glucoqumase activity in the liver of healthy transgenic mice was 2 times higher in both transgenic lineages and in controls. Enzymatic activity in diabetic control mice with Stz was extremely low.
  • the glucochemase activities of Stz-treated mice in both lineages were similar to those observed in healthy control mice or greater than them.
  • Glucose-6-P0 4 is a substrate for glycogen synthesis as well as an allosteric glycogen-smtase activator (Larner, J., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 63: 173-231 (1990)) .
  • the transgenic mice, which expressed the glucoqumase transgene accumulated more glycogen (approximately 2 times more) than the control mice.
  • Example 2 Expression of glucokinase in a muscle
  • a 0.8 kb fragment containing the small intron was introduced and the SV40 t antigen polyadenylation signal (t mtron / poly (A)) was introduced at the 3 'end of the Glucoqumase cDNA (Laimms, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 79: 6453-6457 (1982)).
  • t mtron / poly (A) the SV40 t antigen polyadenylation signal
  • the resulting plasmid was designated as pMLCl / GK.
  • a 5.5 kb Xhol-Notl fragment which contained the entire PEPCK / GK chimeric gene, was micromjected into fertilized eggs removed by scanning from the oviducts of C57BL6 / HKL mice superovulated at 6-8 hours after ovulation.
  • a schematic diagram of the chimeric gene is described in Figure 2.
  • the expression of this chimeric gene leads to a 2.5 kb mRNA transcript when polyadenylated in the signal located at the end of the glucoqumase cDNA.
  • the general procedures for microm- Chimeric gene ejections were as described in Hogan, et al., Manipulating the Mouse Embryo - A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986).
  • mice were tested for the presence of the transgene by Southern blot of 10 ⁇ g of tail DNA digested with EcoRI.
  • the transfer spots were hybridized with a 2.3 kb EcoRI-EcoRI fragment, which contained all the glucoqumase cDNA radiolabeled with [ ⁇ - 2 P] dCTP (3,000 Ci / mmol, Amersham Corp., Arlington Heights, IL) by random oligocebado.
  • the mice were fed ad libi tum with a standardized diet (Panlab, Barcelona, Spain) and were kept under a 12-hour light and dark cycle (the lamps are connected at 8:00 am). Male mice with an age of 4 to 8 weeks were used.
  • Total skeletal muscle RNA was obtained by the guanidine isothiocyanate method (Chirgwin, et al., Biochemistry 18: 5294-5299 (1979)), and RNA samples (30 ⁇ g) were electrophoresed on a gel 1% agarose containing 2.2 M formaldehyde. Northern blotting spots were hybridized to a ⁇ 2 P-labeled glucoquase cDNA probe, as indicated in Valera, et al., FASEB J. 9: 1067 -1078 (1995). This probe was labeled using [ ⁇ - 32 P] dCTP, following the random oligo-priming method, as described by the manufacturer (Boeh ⁇ nger-Mannheim, Germany). The specific activity of the labeled DNA was approximately 10 9 cpm / ⁇ g of DNA. The membranes contacted Kodak XCAR-5 films.
  • Glucoqumase activity was calculated as the difference between glucose phosphorylation capacity, with 100 and 5 mM glucose, and hexoqumase activity as glucose phosphorylating capacity, with 5 mM glucose.
  • concentrations of insulin and serum glucose, glycogen, glucose-6-P0 4 and lactate in muscle extracts were measured as described in Valera, A., et al., PHASEB J. 9: 1067-1078 (1995) .
  • Glucose was also determined in 20 ml of blood using an Accutrend ® (Boehringer-Mannheim) analyzer.

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Abstract

Un procedimiento para tratar a un paciente diabético. El procedimiento incluye la operación de administrar al paciente un segmento de ADN que incluye un gen de glucoquinasa y una secuencia de promotor. En el segmento de ADN, la secuencia de promotor está enlazada operativamente al gen de glucoquinasa y es eficaz para la expresión de una cantidad terapéuticamente eficaz de glucoquinasa en el paciente diabético.

Description

TRATAMIENTO DE LA DIABETES CON UN GEN DE GLUCOQUINASA
Antecedentes del invento
La hiperglucemia se presenta tanto en la diabetes mellitus dependiente de insulina como en la diabetes mellitus no dependiente de insulina. La hiperglucemia se desarrolla cuando el azúcar que entra en el torrente sanguíneo después de una comida no es eliminado adecuadamen¬ te por el hígado y los tejidos periféricos sensibles a la insulina, tales como músculos y grasas (Bennet, P.H., En Diabetes Mellitus, compilado por Ellenberg, et al., 408-414 (3a ed., Medical Exammation Publishmg Co. 1983)) . El hígado recoge el exceso de azúcar procedente de la circulación y lo almacena como glucógeno. Cuando la glucosa entra en las células hepáticas, es fosforilada por la enzima glucoqumasa para formar glucosa-6-P04. La glucosa-6-P04 constituye el substrato para la síntesis de glucógeno y la utilización de glucosa. Se percibe sin embargo que el almacenamiento de glucosa en el hígado responde solamente de una fracción de la glucosa eliminada desde el torrente sanguíneo (Flier, et al., N. Engl . , J. Med. 327:707-713
(1992) ) . La mayor parte de la glucosa retirada del torrente sanguíneo se almacena en músculos y grasas . La evacuación de azúcar a los músculos y grasas es regulada por la insulina producida a partir del páncreas (Mueckler, M. , J. Diab. Comp. 7:130-141 (1993)) . La suplementación de insulina aumentará la ingestión de azúcar por los tenidos periféricos conduciendo a un alivio de los síntomas de la diabetes mellitus. Por consiguiente, la visión clásica de la enferme¬ dad es principalmente una insuficiencia de insulina, poniéndose énfasis en los músculos y grasas como tejidos principales para el mantenimiento de la homeostasis de glucosa (Holman et al., Diabetic Medicine 2:45-53 (1985)) . Sumario del invento
Un aspecto del invento se relaciona con un procedi¬ miento para tratar a un paciente diabético. El procedimiento incluye la operación de administrar al paciente un segmento de ADN que contiene un gen de glucoqumasa y una secuencia de promotor, en que la secuencia de promotor está enlazada operativamente con el gen de glucσquinasa y es eficaz para la expresión de una cantidad terapéuticamente eficaz de glucoqumasa en el paciente diabético. Resultó inesperado que la expresión de glucoquinasa en un paciente diabético ayudase a normalizar el nivel de glucosa de los pacientes en ausencia, o independientemente del nivel, de insulina. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de la glucoquinasa expresada que es suficiente para efectuar la absorción de glucosa en células, tejidos u órganos del paciente, y se puede determinar sin indebida experimentación.
La secuencia codificadora de glucoqumasa del segmento de ADN puede ser igual, o sustancialmente igual, que la secuencia codificadora de la glucoquinasa endógena, siempre y cuando codifique proteínas funcionales de glucoqumasa. Desde luego, el segmento de ADN puede ser igual, o sustan- cialmente igual, que el gen de glucoqumasa de una especie no humana, siempre y cuando codifique una proteína funcional de glucoquinasa. La transcripción del gen de glucoqumasa en el segmento de ADN está preferiblemente bajo el control de una secuencia de promotor que es diferente de la secuencia de promotor que controla la transcripción de la secuencia codificadora endógena, p.ej . , una secuencia de promotor que permanece activada o inducida durante la presentación de condiciones diabéticas en el paciente, tales como niveles elevados de glucosa, glucagón, tπglicéridos, o ácidos grasos libres. Ejemplos de tales secuencias de promotores incluyen el promotor fosfoenolpiruvato-carboxiqumasa
("PEPCK") y los promotores de la cadena ligera de miosma
("MLC") , p.ej. los promotores de MLC1, MLC2 y MLC1/3. En una realización, el segmento de ADN es introducido en el paciente diabético dentro de las células, con lo cual las células son tratadas m vi tro para incorporar en ellas el segmento de ADN y, como resultado, las células expresan m vi vo en el paciente diabético una cantidad terapéutica¬ mente eficaz de glucoqumasa. El segmento de ADN puede ser introducido en las células por un vector vírico, p.ej. , un vector retrovíπco. Las células pueden expresar también un transportador de glucosa, p.ej. , GLUT-1, GLUT-2, GLUT-3, GLUT-4, o GLUT-5. Ejemplos de células que expresan GLUT-2 son células hepáticas, células renales, células intestina¬ les, y células transíectadas para expresar GLUT-2. Ejemplos de células que expresan GLUT-4 son células musculares, células grasas, y células transíectadas para expresar GLUT- 4. Las células se pueden administrar tambián al paciente diabético en una masa intacta como un neo-órgano. P.ej., véase Mueckler, J. Diab. Comp. 7:130-141 (1993) .
En otra realización, el segmento de ADN es introducido directamente en el paciente diabético, p.ej., no es contení- do dentro de una célula. El segmento de ADN puede ser introducido en un vector. Ejemplos de vectores apropiados incluyen vectores víricos (p.ej ., vectores retrovíricos, vectores adenovíπcos, vectores víricos adeno-asociados, vectores víricos smdbis, y vectores víricos de herpes) , plásmidos, cósmidos, y cromosomas artificiales de levaduras. El segmento de ADN se puede introducir también como partícu¬ las infecciosas, p.ej., conjugados de ADN y un ligando, precipitados con fosfato de calcio y liposomas.
También se consideran dentro del alcance de este invento los segmentos de ADN aquí descritos, así como los vectores y las células que contienen tal segmento de ADN.
Otras características y ventajas del presente invento resultarán evidentes a partir de la breve descripción de los dibujos, de la descripción detallada del invento y de las reivindicaciones. Breve descripción de los dibujos
Se describen en primer lugar brevemente las Figuras:
La Figura 1 es una representación esquemática de la construcción de un vector de ADN que lleva un gen de glucoqumasa para su expresión en el seno de células hepáticas .
La Figura 2 es una representación esquemática de la construcción de un vector de ADN que lleva un gen de glucoqumasa para su expresión en el seno de células musculares .
Descripción detallada del invento
Los métodos para producir y utilizar segmentos de ADN, a fin de practicar el procedimiento terapéutico de este invento, se encuentran comprendidos perfectamente dentro de las aptitudes de una persona con experiencia ordinaria en este sector de la técnica. A menos que se defina otra cosa distinta, todas las expresiones técnicas y científicas aquí utilizadas tienen los mismos significados que comúnmente se entienden por una persona con experiencia ordinaria en el sector de la técnica al que pertenece este invento. También, todas las publicaciones que aquí se citan se incorporan por su referencia.
El procedimiento terapéutico del invento permite la sobreexpresión (p.ej., a un nivel mayor que el pretratamien- to) de glucoqumasa en un paciente diabético. La sobreexpre¬ sión de glucoqumasa en el paciente diabético da como resultado la absorción de glucosa en las células que expresan el segmento de ADN de glucoquinasa.
Lo que se entiende por "segmento de ADN" en el presente contexto es cualquier ente artificial (construcción) exógeno de ADN, que incluya una secuencia que codifique una gluco- qumasa funcional, y la glucoqumasa es expresada por las células dentro de las que se introduce el segmento de ADN. El segmento de ADN puede ser introducido tanto en las células somáticas como germinales o solamente en algunas de las células somáticas del paciente, o células que expresen el segmento de ADN se pueden introducir ex vivo en el paciente. El segmento de ADN, por lo tanto, puede ser o no ser una parte integrante del cromosoma del paciente, y si el segmento de ADN es integrado en un cromosoma, puede estar o no situado en el mismo sitio que su correspondiente secuen¬ cia de gen endógeno.
El segmento de ADN utilizado para poner en práctica el procedimiento terapéutico incluye un gen de glucoqumasa o su ADN complementario ("ADNc") , cuya expresión es impulsada por un promotor que es expresado durante la presentación de condiciones diabéticas. Ejemplos de promotores apropiados incluyen los promotores/mtensifícadores constitutivamente activos generales, p.ej., el promotor de β-actma (Kawamoto, et al., Mol. Cell Biol . 8:267-272 (1988) ; Moπshita, et al., Biochem. Biophys . Acta 1090:216-222 (1991)) , promotores de citomegalovirus ("CMV") y de SV40, (Okayama, et al., Mol. Cell Biol. 3:280-289 (1983) ; y Boshart, et al., Cell 41:521- 530 (1985) ) , o secuencias de repetición terminales largas retrovíπcas (LTR) (Crystal, RG, Science 270:404-410 (1995) ) , y promotores constitutivos específicos de tejidos fuertes, p.ej., los promotores de cadena ligera de miosma específicos de músculos (Lee, et al., J. Biol. Chem. 267:15875-15885 (1992) ; Greishammer, et al., Cell 69:79-93 (1992) y el promotor de albúmina específico del hígado (Heckel, et al., Cell 62:447-456 (1991)) .
El promotor se compone de una secuencia de ADN de actuación en cis, que es capaz de dirigir la transcripción de un gen en el apropiado entorno, tejido, contexto y como respuesta a reguladores fisiológicos, p.ej., hormonas, glucosa y metabolizadores bioquímicos intermediarios. La expresión de un transgén (p.ej., un gen de glucoqumasa o su secuencia de ADNc) puede ser regulada. Ejemplos de promoto- res mducibles incluyen el promotor de fosfoenolpiruvato- carboxiquinasa mducible por glucagón (Valera, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU., 91:9151-9154 (1994)) , el promotor de metalotioneína inducible por metales divalentess (Kaπn, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 80:4040-4044 (1993)) , y el promotor mducible por tetraciclma (Grossen, et al., Science 268 (1995) ) . Se ha informado de la secuencia de ADN genómico y de las secuencias de ADNc del gen de glucoqumasa. Ejemplos de ellas incluyen la secuencia de ADN de glucoqumasa en un ser humano (Koranyi, et al., Diabetes 41:807-811 (1992) ; Nishi, et al., Diabetologia 35:743-747 (1992) ; Stoffel, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 88:7294-7297 (1991) ; y
Tamzawa, et al. , Mol. Endocπnol . 6:1070-1081 (1992)) y en una rata (Andreone, et al., J. Biol. Chem. 264:363-369
(1989) ; Magnuson, et al., J. Biol . Chem. 264:15936-15942
(1989) ; Hayer, et al., Biochem. J. 270:261-263 (1990) ; Iynedjian, et al., J. Biol . Chem. 262:6032-6038 (1987)) .
Ejemplos de células que sirven como diana para la sobreexpresión de glucoquinasa, incluyen hepatocitos procedentes del hígado (Peng, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 85:8146 (1988) ; Wolff, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 84:3344 (1987) ; y Wilson, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 85:3014 (1988)) , mioblastos y miocitos proceden¬ tes de los músculos (Salmmer, et al., Human Gene Therapy 2:15-26 (1991)) , células tronco de la médula ósea (Bakx, et al., Human Gene Therapy 2:301-306 (1991) ; Williams, et al. , Nature 310:476-480 (1984) ; Lim, et al., Proc. Nati. Acad.
Sci. EE.UU. 86:8892-8896 (1989) ; Demarguoy, et al., Human
Gene Therapy 3:3-10 (1992) ; y Wieder, Human Gene Therapy
2:323-326 (1991)) , fibroblastos procedentes de la piel
(Wolff, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 87:2877-2881 (1990) ; Morgan, et al., Science 237:1476-1479 (1987) ; y Green, Scientific American 265:96-102 (1991) ) , células neuronales procedentes del cerebro (Price, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 84:156-160 (1987) ; y Renfranz, et al., Cell 66:713-729 (1991)), y células endoteliales (Nabel , et al., Science 244:1342-1344 (1989)) .
Para poner el práctica el procedimiento terapéutico de este invento, se pueden utilizar vectores (ADN' s tanto víricos como no víricos, p.ej., plásmidos, cósmidos, y cromosomas artificiales de levaduras) y otros sistemas disponibles de suministro de genes, o bien para la expresión m vi tro en el seno de células utilizadas en la implantación ex vivo o el suministro directo m vi vo de un gen de glucoqumasa a las células o los tejidos de un paciente. Se proporciona seguidamente una guía detallada:
Vectores víricos para el suministro de un gen de glucoguina- s_a
Se pueden utilizar vectores víricos para el suministro de un gen de glucoqumasa. Ejemplos de vectores víricos incluyen vectores retrovíricos recombmantes, vectores adenovíricos recombmantes, vectores víricos adeno-asociados recombmantes, vectores víricos de smdbis, y vectores víricos de herpes recombmantes.
(a) Vectores retrovíricos recombinantes
El genoma de un vector retrovírico recombmante se compone de secuencias de repeticiones terminales largas ("LTR") en ambos extremos, que sirven como un promo- tor/mtensificador vírico, y un sitio de iniciación de la transcripción así como un sitio Psi que sirve como una señal de empaquetamiento de viπones y un gen marcador selecciona- ble (p.ej ., un gen de resistencia a neomicma) . Un ejemplo de tal vector es pZIP-NeoSV (Cepko, et al., Cell 53:103-1062
(1984)) . El gen de glucoqumasa puede ser clonado en el seno de un sitio de clonación apropiado en el genoma retrovírico. La expresión se halla bajo el control de la transcripción del LTR retrovírico. El vector impulsará la expresión constitutiva de glucoqumasa en el apropiado tipo de células. El nivel de expresión es dictado por la fuerza promotora de las LTR. La selectividad para tejidos es determinada tanto por el origen del genoma vírico (p.ej., virus de sarcoma, virus de leucemia o virus de tumor mamario) y el linaje de células que se utiliza para empaque¬ tar el virus.
Se han descrito modificaciones específicas en las secuencias de las LTR para mejorar el nivel de expresión del gen clonado (Hílberg, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 84:5232-5236 (1987) ; Holland, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 84:8662-8666 (1987) ; y Valerio, et al., Gene 84:419- 427 (1989)) . El gen de glucoqumasa puede también ser clonado en el vector engarzado a un promotor interno como una secuencia de expresión (Crystal, R.G., Science 270:404- 410 (1995)) . Se ha mostrado también que el uso de un promotor interno confiere un nivel adicional de control sobre la expresión de los genes (Lai, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 86:10006-10010 (1989) ; y Scharfmann, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 88:4626-4630 (1991)) . Ejemplos de promotores internos son promotores constitutivos fuertes, p.ej ., el promotor de β-actina (Kawamoto, et al., Mol. Cell Biol. 8:267-272 (1988) ; Morishita, et al., Biochem. Biophys. Acta 1090:216-222 (1991) ; Lai , et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 86-10006-10010 (1989)) , el promotor de H-2k (Schuh, et al., Nature 345:757-760 (1990) ;
Jat, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 88:5096-5100
(1991)) , y los promotores de CMV y SV40 (Miller et al.,
Biotechniques 7:980-990 (1989)) . El promotor puede ser también un promotor mducible-regulable, p.ej ., el promotor de metalotioneína de ratón (Kaπn, et al., Pro. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 80:4040-4044 (1983)) , el promotor mducible por tetraciclina (Gossen, et al., Science 1766-1769 (1995) ; Efrat, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 92:3576-3580 (1995)) , un promotor/intensificador específico de tejidos, p.ej., el promotor de albúmina de ratón, específico para el hígado (Heckel, et al., Cell 62:447-456 (1991)) y el promotor de PEPCK (Valera, et al., FASEB J. 8:440-447
(1994)) , los promotores de la cadena ligera de la miosina, específicos de músculos (Lee, et al., J. Biol. Chem. 267:15875-15885 (1992) ; Shen, et al., Mol. Cell Biol . 11:1676-1685 (1991) ; Lee, et al., Mol. Cell Biol. 14:1220- 1229 (1994) ; Grieshammer, et al., Cell 69:79-93 (1992) ; y Donoghue, et al., Gene Dev. 2:1779-1790 (1988) ) , el promotor de la cadena pesada de la alfa-miosma (Molkentm, et al., J. Biol. Chem. 268:2602-2609 (1993)) , o el promotor P2 de adipocitos, específico de grasas (Graves, et al., Genes Dev. 5:428-437 (1991) ; Ross, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 87:9590-9594 (1990)) . Ejemplos de tales vectores retrovíricos que incorporan un promotor interno incluyen vLPGKSN (Valera, et al., Euro. J. Biochem. 222:533-539 (1994)) y mLBSN (Ferrari, et al. , Human Gene Therapy 6:733- 742 (1995) ) .
Los retrovirus recombmantes capaces de transducir el gen de glucoqumasa son producidos transíectando el o los genoma (s) retrovírico (s) recombinante (s) en el seno de un apropiado linaje de células de empaquetamiento anfotrópicas (exentas de virus cooperantes) . Ejemplos de linajes de células empaquetadoras de virus incluyen PA317 y Psi CRIP (Cornetta, et al., Human Gene Therapy 2:5-14 (1991) , Miller, et al. , Mol. Cell Biol. 6:2895-2902 (1986) ; Cone, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 81: 6349-6353 (1984)) . El linaje de células empaquetadoras de virus transíectadas empaquetará y producirá retrovirus recombmantes, derramán¬ dolos en los medios de cultivo de tejidos. Los retrovirus son recogidos y recuperados desde los medios de cultivo mediante centrifugación (Compere, et al., Mol. Cell Biol . 9:6-14 (1989)) . Los virus son resuspendidos en un tampón apropiado, p.ej., HEPES 10 mM, y son almacenados a -70°C o en nitrógeno líquido.
Los vectores retrovíricos pueden ofrecer una amplia gama de hospedantes y un amplio tropismo para tejidos mediante la apropiada elección del promotor interno y del linaje de células empaquetadoras de virus. Se consigue una orientación selectiva a dianas mediante modificación de la proteína de envoltura producida por el linaje de células empaquetadoras. Por ejemplo, mediante la generación de una proteína de envoltura quimérica con un fragmento variable monocatenario procedente de un anticuerpo monoclonal que reconoce al receptor humano de lipoproteínas de baja densidad, resultó posible dirigir eficazmente a una diana la infección de células que expresaban el receptor (Somia, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 92:7570-7574 (1995)) .
(b) Vectores adenovíricos recombinantes
Se pueden utilizar un adenovirus como un vector para transducir una secuencia de expresión de glucoqumasa. Se han desarrollado cierto número de vectores adenovíricos para la transducción de genes dentro de células (Berkner, et al., BioTechniques 6:616-629 (1988)) . Se ha conseguido una expresión constitutiva de alto nivel de los productos de genes transducidos. Estos vectores tienen la ventaja inherente, con relación a los vectores retrovíricos, de no requerir células replicantes para su infección, convirtién- dolos en vectores apropiados para una terapia génica somática (Mulligan, R.C., Science 260:926-932 (1993)) .
Se han desarrollado adenovirus defectuosos en replica- ción, que carecen de la región El del genoma, los cuales acomodarán una inserción de 7,5 kilobases de ADN ajeno (Crystal, R.G., Science 270:404-410 (1995) ; Logan, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 81:3655-3659 (1994) ; Freidman, et al., Mol. Cell Biol . 6:3791-3797 (1986) ; Levrero, et al., Gene 101: 195-202 (1991) ; e Imler, et al., Human Gene Therapy 6:71-721 (1995)) . Estos adenovirus recombmantes defectuosos en replicación, pueden ser propagados transfec- tando el genoma en el seno de células tratadas por ingenie¬ ría genética para expresar los genes de El (Jones, et al., Cell 16:683 (1979) ; y Berkner, et al., BioTechniques, 6:616- 629 (1988)) . Este sistema permite la producción de partícu¬ las de adenovirus en alto título (p.ej ., hasta 1013/ml) , lo cual intensifica grandemente la eficiencia de infección haciendo posible una multiplicidad mayor de infección (Crystal, R.G., Science 270:404-410 (1995)) .
Se han descrito estrategias para generar recombmantes adenovíricos (Berkner, et al., BioTechniques 6:616-629 (1988)) . Un ejemplo lo constituye el uso del plásmido pMLP6 (Logan, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 81:3655-3659 (1984)) que lleva el genoma de Adenovirus 5 con la región El suprimida. La digestión con las endonucleasas de restricción BglI I y Rsal producirá un plásmido lmealizado que retiene solamente los 194 pares de bases (pb) situados más a la izquierda del genoma de Adenovirus 5. Se puede clonar en el plásmido de Adenovirus 5 una secuencia de expresión que contiene una región de promotor específico de tejidos regulado, p.ej., el promotor PEPCK (Valera, et al., FASEB 8:440-447 (1994) ) engarzado a un fragmento de ADN que codifica glucoqumasa con extremos 3' y 5' compatibles (modificados por apropiadas ligaciones con engarzadores y se somete luego a una apropiada digestión con endonucleasas de restricción tal como se describe en Maniatis, et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1989) ) . Todo el genoma adenovírico recombinante es generado luego mezclando el plásmido de Adenovirus 5-PEPCK-glucoquinasa lmealizado con un fragmento subgenómico de ADN de Adenovirus que representa las unidades 3,85-100 map (preparado digiriendo el genoma vírico de In340 con Clal o Xbal ) (N.E. Biolabs, Beverly, MA)
(Berkner, et al., BioTechniques 6:616-629 (1988) ) . Los ADN' s son luego transíectados en células 293 de riñon humano (Graham, et al., J. Gen. Virol . 36:59-72 (1977) ) tal como se describe en Berkner, et al., Nuc . Acid. Res. 11:6003-6020
(1983) . Una recombinación mtermolecular a través de segmentos apropiados del plásmido y del fragmento subgenómi¬ co de ADN adenovírico dará como resultado la producción de genomas adenovíricos recombinantes, defectuosos en replica- ción, que llevan el gen quimérico de PEPCK-glucoqumasa. Los genomas recombinantes emergerán de los linajes de células 293 en forma de partículas víricas empaquetadas esparcidas dentro del medio. Las modificaciones de este diseño han dado como resultado vectores de expresión de alto nivel (Berkner, et al., BioTechmques 6:616-629 (1988)) incorporando regiones del promotor tardío principal y los elementos líderes tripartitos (Berkner, et al., Nuc. Acid. Res.
11:6003-6020 (1983) ; y Logan, et al., Proc. Nati. Acad. Sci.
EE.UU. 81:3655-3659 (1984)) en el ente artificial de vector.
La utilización de adenovirus recombinantes para el suministro de genes en el seno de células de las vías respiratorias en seres humanos y animales, ha sido descrito
(recopilado en Crystal, R.G. , Science 270:404-410 (1995) ;
Katkm, et al., Human Gene Therapy 6:985-995 (1995) ) . La factibilidad de transducir genes asociados con el metabolis- mo de glucógeno, utilizando transferencia mediada por adenovirus en hepatocitos y mioblastos de ratas primarios en cultivos, también ha sido descrito (Baque, et al., Biochem,
J. 304 (Pt 3) :1009-1014 (1994) ; Gomez-Foix, et al., J. Biol .
Chem. 267:25129-25134 (1992)) .
(c) Virus adeno-asociados recombinantes
Se puede utilizar también el virus adeno-asociado ("AAV") como un vector para transducir una secuencia de expresión de glucoquinasa. El AAV ofrece la ventaja de que no ha sido implicado en la etiología de ninguna enfermedad, y se ha mostrado que su integración específica de un sitio en el cromosoma 19 humano no interfiere con la expresión de genes de hospedantes ni promueven reacondicionamientos de genes (Kotin, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 87:2211- 2215 (1990) ; Samulski, et al., Euro. Mol. Biol . Org. J. 10:3941-3950 (1991)) . Igual que con los adenovirus, el AAV es capaz de infectar células post-mitóticas, convirtiéndose con ello en un vector apropiado para el suministro de genes a células somáticas.
El genoma de AAV contiene dos genes, rep y cap, y secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) (Hermonat, et al., J. Virol. 51:329-339 (1984)) . Los vectores de AAV recombinantes son construidos reemplazando el gen rep, el gen cap, o ambos, por una secuencia de expresión del gen de glucoqumasa (Hermonat, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 81:6466-6470 (1984)) . La única secuencia que se necesita para la integración en el vector de AAV es la ITR de la base 145 terminal (Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol . 158 (97) : 97-129 (1992)) . Tales vectores están disponibles en la forma de un plásmido (Tratschin, et al., Mol. Cell Biol. 5:3251-3260 (1985) ; Lebkowski, et al., Mol. Cell Biol. 8:3988-3996 (1988) ; y McLaughlin, et al., J. Virol . 62:1963-1973 (1988)) .
Los genomas de AAV recombinantes pueden ser empaqueta¬ dos en el seno de partículas de AAV por co-transfección del plásmido de vector y un segundo plásmido de empaquetamiento que lleva los genes rep y cap dentro de una célula infectada por un adenovirus. Se ha mostrado que tales partículas transducen eficazmente genes heterólogos en un cierto número de linajes celulares de mamíferos (Tratschin, et al., Mol. Cell Biol. 5:3251-3260 (1985) ; Lebkowski, et al., Mol. Cell Biol. 8:3988-3996 (1988) ; McLaughlin, et al., J. Virol. 62:1963-1973 (1988) ; Flotte, et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356 (1992)) .
Además de utilizar una secuencia de expresión, se han demostrado altos niveles de expresión de genes engarzados directamente con el promotor endógeno p40 de AAV (Wondis- ford, et al., Mol. Endocrinol . 2:32-39 (1988)) .
(d) Vectores de virus de herpes
Los vectores de virus de herpes ("HSV") constituyen un sistema singular para el suministro de genes a células de linaje neuronal (Anderson, et al., Cell Mol. Neurobiol . 13:503-515 (1993)) . Los vectores derivados de HSV infectan neuronas post-mitóticas y producen una infección latente establecida en algunos tipos de células, convirtiéndose en un sistema apropiado para una terapia génica somática (Leib, et al., BioEssays 15:547-554 (1993)) .
Se han descrito estrategias para la generación de vectores de HSV y virus recombinantes apropiados para la transducción del gen de glucoquinasa (Leib, et al., BioEs¬ says 15:547-554 (1993)) . El método general extensamente utilizado para mutagenizar genes víricos endógenos (Post, et al. , Cell 25:227-232 (1981)) se puede aplicar para la introducción de genes exógenos de glucoqumasa en el genoma de HSV. La secuencia de expresión de glucoqumasa es clonada en el seno de un plásmido que contiene una porción del genoma de HSV, tal que por lo menos 300 pb flanquean los extremos 5' y 3' de la secuencia (Breakfield, et al., New Biol. 3:203-218 (1991) ; y Efstathiou, et al., Brit . Med. Bull. 51:45-55 (1995)) . El plásmido es transfectado en el seno de células permisivas en curso de cultivo, juntamente con el ADN de HSV de plena longitud (Geller, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 87:8950-8954 (1990)) . La recombma- ción homologa y la replicación del ADN darán como resultado la generación de genomas recombinantes de HSV, que son empaquetados dentro de nuevas partículas de virus por la célula. A lo largo de varias rondas de purificación de calvas, se puede identificar para su producción a gran escala un virus recombinante que sea portador de la secuen- cía de expresión de glucoqumasa.
Se han utilizado con éxito vectores de HSV defectuo¬ sos, para transferir genes exógenos a neuronas in vi tro e in vivo (Geller, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 87:1149- 1153 (1990) ; Geller, et al., Science 241:1667-1669 (1988) ; y Efstathiou, et al., Brit . Med. Bull. 51:45-55 (1995)) . Se han utilizado una variedad de promotores constitutivos, inclusive los promotores de HSV de ciclo lítico, las LTR de virus de sarcoma de Rous, los promotors IE de citomegalo- virus humanos (HCMV) y los promotores de neurofilamentos y de PGK para expresión transitoria. Se ha obtenido una expresión a largo plazo utilizando las LTR del virus de leucemia murina de Moloney, el promotor LAT de HSV, el promotor IE de HCMV, fusionado con los elementos promotores de LAT, y el promotor de enolasa específico de neuronas. Se ha informado que estos vectores son útiles para la transduc- ción de genes en células de origen no neuronal, p.ej., hepatocitos de ratón (Efstathiou, et al., Brit . Med. Bull. 51:45-55 (1995) ; Miyanohara, et al., New Biol . 4:238-246 (1992) ) .
(e) Vectores del virus de sindbis que expresan glucoquina- sa:
Los vectores basados en el virus de smdbis están concebidos como sistemas autoamplificadores para intensifi¬ car la expresión de genes exógenos en células de mamíferos (Herweijer, et al., Human Gene Therapy 6:1161-1167 (1995)) . En este sistema, las secuencias subgenómicas que codifican las proteínas estructurales se reemplazan por la secuencia de expresión del transgén, p.ej ., glucoqumasa (Huang, et al. , Virus Genes 3:85-91 (1989) ; y Bredenbeek, et al., J. Virol . 67:6439-6446 (1993)) . El virus de sindbis recombman- te es generado colocando todo el genoma bajo el control de los promotores de bacteriófagos T7 o SP6 a fin de hacer posible la transcripción del ARN de cadena (+) m vi tro
(Herweijer, et al., Human Gene Therapy 6:1161-1167 (1995)) . Los genomas de ARN resultantes se utilizan luego para transfectar células diana (Xiong, et al., Science 243:1188- 1191 (1989) ) . Se producen virus infecciosos infectando con un virus cooperante (Bredenbeek, et al . , J. Virol . 67:6439- 6446 (1993)) . Se han descrito modificaciones de este diseño utilizando las LTR de virus de sarcoma de Rous para dirigir la transcripción de los genes no estructurales (Herweijer, et al., Human Gene Therapy 6:1161-1167 (1995)) .
Para generar un vector del virus de smdbis recombi- nante, el gen de luciferasa clonado dentro del sitio Xbal singular en el vector pSm-Lux (Herweijer, et al., Human Gene Therapy 6:1161-1167 (1995)) , es reemplazado por el ADNc de glucoqumasa o por una secuencia de expresión que codifica glucoqumasa después de apropiadas modificaciones de las endonucleasas de restricción. Véase Sambrook, et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989) .
Los vectores del virus de smdbis han sido utilizados con éxito para transducir genes ajenos en células 3T3
(fibroblastos de ratón) , células 293 (linaje de células de riñon humano) , células HepG2 (linaje de células de hepatoma humano) y mioblastos primarios de rata (Herweijer, et al., Human Gene Therapy 6:1161-1167 (1995)) .
Suministro in vivo de un gen de glucoquinasa por infección vírica
Se pueden utilizar vectores víricos para suministrar la secuencia codificadora de glucoqumasa a las células, a los tejidos y a los órganos de pacientes diabéticos mediante una infección m vivo . Al realizar la infección m vivo, el vector vírico recombinante es administrado al organismo con el fin de dar como resultado una infección sistémica general o una infección específica para órganos/tejidos del pacien¬ te. Por ejemplo, una inyección por vía intravenosa de un retrovirus recombinante o una administración por aerosol de vectores adenovíricos recombmantes da como resultado una infección del revestimiento epitelial del tracto respirato¬ rio (Rosenfield, et al., Science 252:431-434 (1991) ; y Hsu, et al., J. Infectious Dis. 166:769-775 (1992)) ; una inocula¬ ción estereotáxica de los virus de herpes simple recombman- te han dado como resultado una infección de regiones selectas del cerebro (Fmk, et al., Human Gene Therapy 3:11- 19 (1992)); y una infección de un hígado activo mitóticamen- te (en regeneración) por inyección directa o administración a través de la vena portal de retrovirus recombinante ha dado como resultado una expresión persistente del genoma mfectador (Kalenko, et al., Human Gene Therapy 2:27-32 (1991) ; y Rettmger, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 91:1460-1464 (1994) ) .
Suministro ex vivo de un gen de glucoguinasa
(a) Transducción in vitro de células en cultivo Las células primarias y los linajes celulares se hacen crecer en los medios recomendados que han sido suplementados con los apropiados factores de crecimiento, sueros y antibióticos. Las células son transducidas con el gen de glucoqumasa o bien por infección directa con un vector vírico recombinante antes descrito o por unos medios de suministro no víricos, p.ej., una transfección mediada por ADN. Se preparan y purifican secuencias de expresión de ADN recombmantes, que comprenden regiones de promoto- res/mtensificadores celulares y regiones reguladoras enlazadas operativamente a los genes y ADNc's de glucoquma- sa diseñados para la expresión en tejidos diana de mamíferos en la forma de plásmidos, fragmentos de ADN lmealizados, o vectores de ADN/ARN víricos, tal como se describe en Sambrook, et al . , Molecular Cloning - A Laboratory Manual
(Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) . Se puede introducir un ADN en células mediante una transducción mediada por ADN siguiendo uno de los siguientes métodos: precipitación con fosfato de calcio, método de DEAE-dextrano, electroporación (Ausudel, et al., Current Protocols m Molecular Biology
(Wiley-Interscience, 1987)) , fusión con lipofectma o con un protoplasto (Sandra-Goldm, et al., Mol. Cell Biol . 1:743-
752 (1981)) . Cuando el marcador seleccionable está en un plásmido separado, se utiliza el método de co-precipitación con fosfato de calcio (Ausudel, et al., Current Protocols m Molecular Biology (Wiley-Interscience, 1987)) .
A las veinticuatro horas después de una transfección mediada por ADN, las células en cultivo son tripsmizadas y vueltas a cultivar en placas en medios de selección a una densidad de 1/10. Los linajes de células clónales, que han heredado el marcador seleccionable, son captadas mediante clonación en aros, expandidas en cultivo, y analizadas en cuanto a la herencia del gen transfectado que interesa mediante PCR (Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, 1990) ) y análisis por transferencia Southern (Southern, J. Mol. Biol. 98:503
(1975) ) del ADN genómico preparado a partir de las células - 18 - clónales/linajes celulares. La expresión del gen transfecta¬ do de glucoqumasa se examina mediante un análisis por transferencia Northern (Sambrook, et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) del ARN total mediante análisis por mmunotransferencia con antisueros específicos para glucoqumasa y por análisis de la actividad de glucoqumasa (Valera, et al., Eur. J. Biochem. 222:533-539 (1994) ; Davídson, et al., Arch. Biochem. Biophys . 253:156-157 (1987) ) .
(b) Modificación ex vivo de células para implantación
Las tecnologías para la transducción de genes mediada por virus y ADN en células de mamíferos (p.ej . , células primarias y linajes celulares) , permite el tratamiento ex vivo de las células por ingeniería genética. Estas células tratadas por ingeniería genética pueden servir como facto¬ rías metabólicas (Newgard, Diabetes 43:341-350 (1994) ; Hughes, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 89:688-692 (1992) ; y Newgard, C.B., J. Lab. Clin. Med. 122:356-363 (1993)) , como nuevos sistemas de suministro de fármacos (Kasid, et al, Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 87:473-477 (1990) ; y Chen, et al., Human Gene Therapy 6:917-926 (1995)), como tejidos u órganos subrogados (Mendell, J.R., et al., N. Engl . J. Med. 333:832-838 (1995) ; y Rhim, et al., Science 263:1149-1152 (1994)) , o como neo-órganos (Thompson, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 86:7928-7932 (1989) ; y Culliton, Science 246:747-749 (1989)) después de una apropiada implantación en el paciente. Por ejemplo, se pueden aislar hepatocitos a partir del hígado (Ponder, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 1217-
1221 (1991) ; y Pages, et al., Human Gene Therapy 6:21-30
(1995) ) , se les puede someter a cultivo a corto plazo
(Pages, et al., Human Gene Therapy 6:21-30 (1995)) y luego transducir con un vector vírico o plasmídico que lleva la secuencia de expresión que comprende el ADNc de glucoqumasa bajo el control de la transcripción de un promotor específi- co para el hígado. Luego, los hepatocitos modificados genéticamente son recogidos y trasplantados a un paciente o bien por infusión de las células en la vena portal (Wilson, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 87:6437-8441 (1990)) o por introducción intraesplénica (Ponder, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 88:1217-1221 (1991)) . En ratones, se mostró que los hepatocitos modificados genéticamente, introducidos mtraesplénicamente, reemplazaban hasta un 80% del hígado enfermo (Rhim, et al., Science 263:1149-1152 (1994)) . En perros, un reemplazo del 5% de la masa de hígado con hepatocitos transducidos con el retrovirus que expresaba la αl-antitπpsina humana, dio como resultado la expresión del péptido humano durante hasta 30 días (Kay, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89:89-93 (1992)) . Similarmente, unas hipercolesterolemias en conejos hiperlipidémicos heredables de Watanabe, se corrigieron transitoriamente por implanta¬ ción de hepatocitos transducidos con un retrovirus capaz de dirigir la expresión de un receptor funcional de lipoproteí- nas de baja densidad ("LDL") (Wilson, Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 87:8437-8441 (1990)) . Un promotor interno específico del hígado podría intensificar un nivel sostenido de expresión del transgén.
En otro ejemplo, se pueden aislar mioblastos a partir de biopsias de músculos (Mendell, et al., N. Engl . J. Med. 832-838 (1995)) , se pueden expandir en cultivo y modificar genéticamente para expresar altos niveles de glucoquinasa por transfección con un ADN que comprende el gen de gluco¬ quinasa bajo el control de la transcripción de un promo- tor/intensificador específico de músculos fuertes o se pueden infectar con un retrovirus recombinante específico de músculos (Ferrari, et al., Human Gene Therapy 6:733-742
(1995) ) . Los mioblastos que expresan glucoquinasa se pueden transferir luego a un músculo por inyección directa de las células. La experiencia obtenida anteriormente con mioblas- tos murinos ha demostrado que los mioblastos inyectados se fusionarán para formar miofibrillas multinucleadas preexis¬ tentes (Dhawan, et al., Science 254:1509-1512 (1991) ; y Barr, et al., Science 254:1507-1509 (1991)) . Las fibras musculares diferenciadas mantendrán un alto nivel de expresión del transgén (Yao, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 89:3357-3361 (1992)) . Todavía en otro ejemplo, los fibroblastos humanos pueden ser modificados por transferencia de genes, mediada por receptores o mediada por retrovirus (Veelken, et al., Human Gene Therapy 5:1203-1210 (1994) ; y Chen, et al., Human Gene Therapy 6:917-926 (1995)) para sobreexpresar glucoqui- nasa. Luego, las células son embebidas en látices, revesti¬ dos con colágeno, de fibras expandidas de poli (tetrafluoro- etileno) (Gore-Tex) , como antes se describe (Thompson, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 86:7928-7932 (1989) ; y Moullier, et al., Nature Genetics 4:154-159 (1993) ) . La adsorción de factores 1 de crecimiento con fijación de heparina a los látices de colágeno, después de implantación en la cavidad peπtoneal, inducirá la vascularización y formación de un neo-órgano. Se informó que tales neo-órganos producían una expresión sostenida de transgenes en ratones (Salvetti, et al., Human Gene Therapy 6:1153-1159 (1995)) y perros (Moullier, et al., Nature Med. 1:353-357 (1995)) . Tales neo-órganos, que comprenden fibroblastos u otros tipos de células que sobreexpresan glucoqumasa, pueden servir para normalizar los azúcares en sangre en el estado msuli- nopénico.
Suministro no vírico in vivo de un gen de glucoguinasa a pacientes
Los entes artificiales de genes de glucoqumasa no víricos pueden también ser dirigidos a diana in vi vo a tejidos u órganos específicos, p.ej., el hígado o los músculos, en pacientes. Ejemplos de tales sistemas de suministro pueden incluir una endocitotis mediada por receptores, una encapsulación de liposomas o una inserción directa de vectores de expresión no víricos. (a) Endocitosis mediada por receptores
Mediante endocitosis mediada por receptores, el gen de glucoquinasa se puede suministrar a células específicos, p.ej., hepatocitos en el hígado (Wu, et al. , J. Biol. Chem. 266:14338-14342 (1991) ; y Wilson, et al., J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992)) . Utilizando un asialoorosomucoide acoplado a poli-L-lisina, se pueden suministrar ADN de glucoquinasa soluble, complejado con esta molécula, a hepatocitos en el hígado a través de una fijación al receptor de asialoglicoproteína, seguido por endocitosis. El complejo de ligando y ADN es administrado por vía intraveno¬ sa. Se ha obtenido un alivio transitorio de la hipercoleste- rolemia suministrando receptores funcionales de LDL a conejos deficientes en receptores de LDL (Wilson, et al., J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992)) . Se han desarrollado otros conjugados de ADN y ligandos, p.ej., complejos de transferrina-polilisina-ADN (Wagner, et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 87:3410-3414 (1990) ; Wagner, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89:7934-7938 (1992) ; y Wagner, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89:6099-6103 (1992)) , complejos de tensioactivo B-polilisma-ADN (Baatz, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 91:2547-2551 (1994)) y complejos de anti-trombomodulina-polilisina-ADN (Trubetskoy, et al. , Bioconjug. Chem. 3:323-327 (1992)) .
(b) Encapsulación de liposomas
Se ha conseguido una satisfactoria transferencia de genes in vivo con la inyección de ADN, p.ej ., como un ente artificial lineal o un plásmido circular, encapsulado en liposomas (Ledley, Human Gene Therapy 6:1129-1144 (1995) y Farhood, et al., Ann. NY Acad. Sci. 716:23-35 (1994)) . Se encuentran actualmente en desarrollo un cierto número de anfífilos de liposomas catiónicos (Ledley, Human Gene Therapy 6:1129-1144 (1995) ; Farhood, et al., Ann. NY Acad. Sci. , 716:23-35 (1994) ) . Se mostró que la administración por vía mtratraqueal de complejos catíónicoε de lípidos y ADN efectuaba la transferencia y la expresión de genes en las células epiteliales que revisten los bronquios (Brigham, et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 10:24-29 (1994) ) . Se informó la expresión en tejidos pulmonares y en el endotelio después de inyección intravenosa de los complejos (Brigham, et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 8:209-213 (1993) ; Zhu, et al., Science, 261:209-211 (1993) ; Stewart, et al., Human Gene Therapy 3:267-275 (1992) ; Nabel , et al. , Human Gene Therapy 3:649-656 (1992) ; y Canónico, et al., J. Appl. Physiol . 77:415-419 (1994) ) . Las secuencias de expresión para glucoqumasa en ADN lineal, plasmídico o vírico, se pueden condensar mediante interacciones iónicas con el lípido catiónico para formar un complejo en forma de partículas para el suministro in vivo (Stewart, et al., Human Gene Therapy 3 :267-275 (1992)) .
Se ha encontrado que otras formulaciones de liposomas, por ejemplo, proteoliposomas que contienen proteínas receptoras de envoltura vírica, es decir, virosomas, suministran eficazmente genes a hepatocitos y células renales después de inyección directa (Nicolau, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 80:1068-1072 (1993) ; Kaneda, et al., Science 243:375-378 (1989) ; Mannino, et al., Biotechmques 6:682 (1988) ; y Tomita, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 186:129-134 (1992) ) .
(c) Inyección directa
La inyección directa de vectores de expresión de ADN de glucoquinasa, p.ej., en un músculo o en el hígado, o bien en forma de una solución o bien como un precipitado con fosfato de calcio (Wolff, et al., Science 247:1465-1468
(1990) ; Ascadi, et al., The New Biologist 3:71-81 (1991) ; y Benvenisty, et al., Proc. Nati. Acad. Ξci . EE.UU. 83:9551- 9555 (1986) ) , proporciona una tecnología alternativa para suministrar las secuencias de expresión de glucoquinasa a tej idos de individuos receptores .
La micromyección del segmento de ADN de glucoqumasa, p.ej. , como un ente artificial lineal o un plásmido circu¬ lar, en el pronúcleo de un zigoto o embriones bicelulares que pudieran transmitir el transgén a subsiguientes genera¬ ciones, constituye un enfoque para conseguir una terapia génica de linajes germinales (Hogan, et al., Manipulatmg the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986) ; Brmster, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 82:4438-4442 (1985) ) . Otro método para conseguir una terapia génica de linajes germinales consiste en efectuar una transfección de un gen y una recombinación homologa en células tronco embπónicas (Thomas, et al., Cell 51:503-512 (1987) ; y Capecchi, Science 244:1288-1292 (1989)) .
Los siguientes son ejemplos que demuestran ciertos aspectos de cómo llevar a la práctica el procedimiento terapéutico de este invento. Se cree que una persona experta en la técnica, basándose en la descripción que aquí se da, puede utilizar el invento en su extensión más completa. Los Ejemplos específicos que se exponen seguidamente han de ser considerados por lo tanto como meramente ilustrativos y no limitativos en absoluto del resto de la memoria descriptiva.
Ejemplo 1: Expresión de glucoguinasa en el hígado
(a) Construcción del gen quimérico de promotor de PEPCK de rata/glucoquinasa de rata (PEPCK/GK)
Todas las enzimas que modificaban ADN se adquirieron de Boehrmger-Mannheun, Alemania. Para obtener el gen quimérico de PEPCK/GK, se utilizó un fragmento EcoRI-EcoRI de 2,3 kb que contenía toda la secuencia de codificación y la señal de poliadenilación del ADNc de glucoquinasa de rata (Iynedjian, et al., J. Biol. Chem. 262:6032-6038 (1987)) . El ADNc fue introducido en un sitio EcoRI neo-creado en el gen quimérico de PEPCK/insulina (Valera, et al., FASEB 8:440-447 (1994)) . Este gen quimérico se utilizó como un vector de expresión en hígado para obtener una expresión regulada y una estabilización del ARNm procedente de ADNc's en ratones transgénicos. La estrategia utilizada para obtener el gen quimérico PEPCK/GK se inició succionando el fragmento BglII- Sphl del gen quimérico de PEPCK/insulina, que incluye el primer exón (3'-Ins) y el sitio de iniciación de la traduc¬ ción del gen de insulina humana (5'-Ins) , en el poliengarza- dor pSP72. Para destruir el sitio de iniciación de la traducción ATG, que estaba contenido en un sitio singular de restricción de Ncol, este fragmento del gen de insulina fue digerido con Ncol y tratado con nucleasa de haba mung para eliminar las porciones colgantes monocatenarias producidas por la enzima de restricción. Después de ello, se introdujo un engarzador EcoRI (Boehringer Mannheim, Alemania) para generar un nuevo sitio de subclonación en EcoRI . Luego, el fragmento EcoRI-EcoRI de ADNc de glucoqumasa fue introduci¬ do en este nuevo sitio de EcoRI . Finalmente, el fragmento BglII-Sphl del gen de insulina humana que contenía el ADNc de glucoqumasa de plena longitud fue insertado de nuevo en el gen quimérico de PEPCK/msulma. El plásmido final fue designado como pPEPCK/GK.
(b) Construcción de ratones transgénicos
Un fragmento Xbal-Sphl de 4,5 kb que contenía todo el gen quimérico PEPCK/GK, fue micromyectado en huevos fertilizados retirados por barrido desde los oviductos de ratones C57BL6/HJL superovulados a las 6-8 horas después de una ovulación. Un diagrama esquemático del gen quimérico se describe en la Figura 1. La expresión de este gen quimérico conduce a un transcrito de ARNm de 2,5 kb cuando está poliadenilado en la señal en el extremo del ADNc de gluco- qumasa. Los procedimientos generales para micromyección del gen quimérico fueron tal como se describe en Hogan, B., et al., Manipulatmg the Mouse Embryo - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1986) . Con una edad de 3 semanas, los animales fueron ensayados en cuanto a la presencia del transgén por transferencia Southern de 10 μg de ADN de cola, digerido con EcoRI Las manchas de transfe¬ rencia fueron hibπdadas con un fragmento EcoRI-EcoRI de 2,3 kb que contenía todo el ADNc de glucoqumasa marcado radiactivamente con [α-32P]dCTP (3.000 Ci/mmol) , Amersham Corp., Arlmgton Heights, IL) por oligocebado aleatorio (Boehringer-Mannheim, Alemania) . Los animales que expresaban el transgén fueron retenidos y luego fueron alimentados ad libi tum con una dieta normalizada (Panlab, Barcelona, España) y mantenidos bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12 h (lámparas conectadas a las 8:00 a.m.) . Para el grupo diabético, se indujo diabetes mediante inyección a través de la vena yugular de dosis de 2 mg de estreptozotocma/10 g de peso corporal en 2 días consecutivos. Se disolvió estrepto- zotocma ("Stz") (Sigma Chemical Co. , Saint Louis, MO) en un tampón de citrato de sodio 10 mM con 0,9% de NaCl, pH 4,5, inmediatamente antes de la administración. Se utilizaron los ratones a los 7 días después del tratamiento con estreptozo- tocina. Se determinó la diabetes midiendo los niveles glucémicos, glucosúricos y cetonúπcos (ACCUTREND y GLUKETUR Test, Boehrmg Mannhem, Alemania) . Los animales fueron sacrificados y se tomaron muestras entre las 9 y las 10 de la mañana. Se utilizaron ratones machos con una edad de 4 a 8 semanas.
Se encontró que unos ratones de generaciones Fl y F2, procedentes de dos linajes transgénicos, llevaban aproxima¬ damente 5 y 20 copias intactas, respectivamente, del gen quimérico PEPCK/GK, según se analizó por transferencia Southern, y se utilizaron en estudios ulteriores. Se utilizaron acoplamientos de carnadas como testigos para los animales transgénicos.
(c) Expresión del gen quimérico
Se obtuvo el ARN total a partir del hígado mediante el método del isotiocianato de guanidma, como se describe en Chirgwm, et al., Biochemistry 18:5294-5299 (1979) , y se sometieron a electroforesis muestras de ARN (30 μg) sobre un gel de agarosa al 1% que contenía formaldehído 2,2 M. Se hibridaron manchas de transferencia Northern a una sonda de ADNc de glucoquinasa marcada con 32P y una sonda de β-actma marcada con 32P, que correspondía a un fragmento EcoRI-EcoRI de 1,3 kb del ANDc de conejo, tal como se indica en Valera, A., et al., FASEB J. 9:1067-1078 (1995) . Estas sondas fueron marcadas con [CY- 2P]dCTP, siguiendo el método de oligocebado aleatorio, que se describe por el fabricante. La actividad específica de la sonda de ADN marcada era de aproximadamente 10y cpm/μg de ADN. Se pusieron en contacto membranas con películas KODAK XAR-5. La señal de β-actma se utilizó para normalizar las intensidades de señales como comparación entre pistas.
(d) Preparación e incubación de hepatocitos
Se aislaron hepatocitos entre las 10 y las 11 de la mañana de ratones normalmente alimentados y ratones diabéti¬ cos, tal como se describe en LeCam, A., et al., Exp. Cell Res. 98:382-395 (1976) . Después de eliminar las células no parenquimales y los desechos, los hepatocitos se volvieron a suspender en un medio de Eagle modificado por Dulbecco ("DMEM") (Gibco, Grand Island, NY) que contenía 0,2% de albúmina y 10% de suero de ternero fetal (Boehrmger- Mannheim, Alemania) . Se cultivaron en placas 5,5 x 106 células en 10 mi de este medio sobre bandejas revestidas con colágeno y se mantuvieron a 37°C bajo una atmósfera de C02 al 5%. Después de cuatro horas, se retiró el medio y las células se lavaron tres veces en DMEM en ausencia de suero o de glucosa. Subsiguientemente, se añadieron a las células 10 mi de DMEM sin suero y con glucosa 25 mM, las cuales células fueron mantenidas en este medio durante un período de tiempo de hasta 24 h. Se tomaron partes alícuotas de 100 μl del medio en diferentes momentos y se determinó la producción de lactato. Para medir la producción de glucosa y cetona en el cuerpo, se incubaron hepatocitos en 10 mi de DMEM sin glucosa y se suplementaron con lactato 16 mM más piruvato 4 mM durante un período de tiempo hasta de 24 h. Se tomaron partes alícuotas de 100 mi del medio en diferentes momentos y se determinaron unas concentraciones de glucosa y β-hidroxibutirato.
(e) Análisis en cuanto a enzimas, metabolitos y hormonas
Para medir la actividad de glucoqumasa, se homogenei- zaron muestras de hígado en un tampón enfriado con hielo (pH 7,4) que contenía Tris-HCl 50 mM, sacarosa 300 mM, KCl 100 mM, ácido etilendiamma-tetraacético ("EDTA") 1 mM y β- mercaptoetanol 0,7 μl/ml. Para determinar la actividad de piruvato-qumasa, el hígado fue homogeneizado en un tampón enfriado con hielo, que contenía KCl 100 mM, EDTA 1 mM y β- mercaptoetanol 0,7 μl/ml. Se analizaron estas actividades en materiales sobrenadantes de una centrifugación a 12.000 x g, tal como se describe en Davídson, A.L., et al., Arch. Biochem. Biophys. 253:156-176 (1987) y Feliu, J.E., et al., Eur. J. Biochem. 81:609-617 (1977) . Se calculó la actividad de glucoqumasa como la diferencia entre la capacidad de fosforilación de glucosa con glucosa a 100 y 0,5 mM, y la actividad de hexoqumasa se calculó como la capacidad fosforilante de glucosa con glucosa 0,5 mM. Se determinó la actividad de piruvato-qumasa con fosfoenolpiruvato 5 mM (actividad total) . Se midieron las concentraciones de insulina y glucosa en suero, glucógeno, glucosa-6-fosfato y lactato en extractos de hígados, glucosa y lactato en los medios de incubación de hepatocitos, tal como se describe en Valera, et al., FASEB J. 9:1067-1078 (1995) . También se determinó la glucosa en 20 mi de sangre utilizando un analizador ACCUTREND (Boehringer-Mannhein, Alemania) . Se midieron los niveles de β-hidroxibutirato en suero y en medio de incubación de hepatocitos, por la tecnología de la β-hidroxibutirato-deshidrogenasa (Boehringer-Mannheim, Alemania) . Los triglicéridos en suero se determinaron enzimáticamente (GPO-PAP, Boehrmger-Mannheim, Alemania) . Los ácidos grasos libres en suero se midieron por el método de acil-CoA-smtasa y acil-CoA-oxidasa (Wako Chemicals, Alemania) . Las actividades enzimáticas y las concentraciones de metabolitos se expresan como la media ± el error típico de la media (SEM) .
(f) Determinación de la expresión de glucoquinasa
Se detectó un transcrito de 2,5 kb en el hígado de ratones testigos y transgénicos, que resultaron de la expresión tanto del gen de glucoqumasa endógeno como también del transgén de glucoqumasa . No se detectaron transcritos de ARNm de glucoqumasa en el hígado de ratones testigos diabéticos, mientras que ratones transgénicos tratados con Stz retuvieron un alto nivel de expresión de ARNm de glucoqumasa. La actividad de glucoqumasa en el hígado de ratones transgénicos sanos era 2 veces mayor tanto en linajes transgénicos como en testigos. La actividad enzimática en ratones testigos diabéticos con Stz era extremadamente baja. Las actividades de gluco- qumasa de ratones tratados con Stz en ambos linajes fueron similares a las observadas en ratones testigos sanos o mayores que ellas. Estos hallazgos sugieren que el producto genético producido a partir del transgén de glucoquinasa era estable y activo en un entorno diabético.
(g) Almacenamiento y utilización de glucosa
Los resultados que se informan seguidamente en la Tabla I se obtuvieron a partir del linaje transgénico que llevaba aproximadamente 20 copias intactas del gen PEPCK/GK. En ambas Tablas I y II, "Con" y "Tg" representan ratones testigos y ratones transgénicos, respectivamente. TABLA I
Figure imgf000031_0001
Tal como se muestra en la Tabla I, la reducción de la actividad de glucoqumasa condujo a una dismmuación de 75% en la concentración mtracelular de glucosa-6-P04 en ratones testigos diabéticos, en comparación con testigos sanos. En contraste, los niveles de glucosa-6-PO^ en ratones transgé¬ nicos tratados con Stz fueron similares a los de ratones testigos sanos. El glucosa-6-P04 es un substrato para la síntesis de glucógeno así como un activador alostérico de glucógeno-smtasa (Larner, J., Adv. Enzymol . Relat. Áreas Mol. Biol . 63:173-231 (1990)) . Los ratones transgénicos, que expresaban el transgén de glucoqumasa, acumularon más glucógeno (aproximadamente 2 veces más) que los ratones testigos. En el caso de la diabetes, la falta de insulina y un aumento en glucagón dan como resultado la fosforilación y la inactivación de la glucógeno-smtasa. No se almacenó glucógeno en los hígados de ratones testigos diabéticos con Stz. Sin embargo, los ratones transgénicos tratados con Stz retuvieron la capacidad de sintetizar glucógeno a un nivel similar al que se presentaba en ratones sanos testigos. Esto está de acuerdo con el aumento en glucosa-6-P04 mtrahepáti- co. Por consiguiente, la expresión del transgén de glucoqui- nasa a solas era suficiente para restaurar la síntesis normal de glucógeno en el estado msulinopénico.
Una inducción de la utilización de glucosa resulta evidente en la actividad de piruvato-qumasa aumentada y en la concentración mtrahepática de lactato en el animal transgénico con glucoqumasa, comparado con los testigos.
(h) Parámetros en suero
Los cambios en el metabolismo del hígado causaron una normalización de parámetros del suero alterados durante la diabetes, tal como se informa en la Tabla II. Obsérvese que "FFAs" representa ácidos grasos libres.
TABLA II
Figure imgf000032_0001
Tal como se muestra en la Tabla II, los ratones testigos de Stz exhibieron msulinopenia e hiperglucemia, características de la diabetes mellitus. Por otra parte, los ratones transgénicos tratados con Stz manifestaron concen¬ traciones de glucosa en plasma próximos al margen normal , a pesar de un nivel muy bajo de insulina. Estos resultados sugieren un papel principal en el hígado en la homeostasis de glucosa corporal entera y un papel clave para la gluco- qumasa en la regulación de la absorción y del metabolismo de glucosa en el hígado. Una inducción de cetogénesis es una característica común de la diabetes mellitus dependiente de insulina, que no ha sido tratada (Taylor, et al., Biochem. J. 250:625-640 (1988) ; y McGarry, J.D., Science 258:766-770
(1992) ) . La alta concentración del cuerpo cetónico β- hidroxibutirato (β-OH-butirato) en el suero de ratones testigos tratados con Stz es una evidencia de cetosis. En contraste, la producción corporal de cetonas permanece dentro del margen normal en los ratones transgénicos tratados con Stz. La expresión del transgén de glucoquinasa conduce también a una normalización de los triglicéridos y ácidos grasos libres circulantes, que han aumentado marcada¬ mente durante la diabetes. Estos resultados indican que el rescate de la absorción de glucosa por el hígado era suficiente para normalizar los metabolismos corporales de glucosa, lípidos y cetonas. De modo compatible con el estado diabético, los ratones testigos tratados con Stz presentaron una reducción de 25% en el peso corporal a los 15 días después del tratamiento con estreptozotocina (desde 21,4 + 0,5 g hasta 15,7 ± 0,8 g (n = 25)) . La normalización del metabolismo en el hígado y los parámetros en suero en los ratones transgénicos tratados con Stz estaba acompañada por el mantenimiento del peso corporal (desde 20,3 ± 0,6 g hasta 21,1 ± 0, 9 g (n = 25) ) .
En resumen, los datos sugieren que el suministro y la expresión de glucoquinasa a un tejido tal como el hígado es suficiente para proporcionar protección del organismo con respecto del desarrollo de la diabetes mellitus a pesar de una insulinopenia. Ejemplo 2: Expresión de glucoguinasa en un músculo
(a) Construcción del gen quimérico de cadena ligera 1 de miosina de rata y glucoquinasa de rata (MLC1/GK)
Para obtener el gen quimérico MLCl/GK, se utilizó un fragmento EcoRI-EcoRI de 2,3 kb que contenía toda la secuencia de codificación y la señal de poliadenilación del ADNc de glucoqumasa de rata. Un fragmento EcoRI/HindII de 1,5 kb del promotor MLC1, incluyendo el sitio de casquete y franqueando 105 pares de bases (pb) de secuencias no traducidas, fue fusionado con el extremo 5' del ADNc de glucoqumasa (Peπasamy, et al. , J. Biol . Chem. 259:13595- 13604 (1984) ) . Para aumentar la estabilización del ARNm del transgén, se introdujo un fragmento de 0,8 kb que contenía el pequeño intron y la señal de poliadenilación del antígeno t de SV40 (t mtron/poli (A)) se introdujo en el extremo 3' del ADNc de glucoqumasa (Laimms, et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. 79:6453-6457 (1982)) . Finalmente, un fragmento genómico Sphl/HindIII de 0,9 kb del gen MLCl/3, que contenía un mtensificador específico de músculos fuertes (Donoghue, et al. , Genes & Dev. 2:1779-1790 (1988) ) se introdujo en el transgén por el extremo 3' del fragmento SV40 para asegurar altos niveles de expresión en un músculo del esqueleto. El plásmido resultante fue designado como pMLCl/GK.
(b) Construcción de ratones transgénicos
Un fragmento Xhol-Notl de 5,5 kb, que contenía todo el gen quimérico PEPCK/GK, fue micromyectado en huevos fertilizados retirados por barrido desde los oviductos de ratones C57BL6/HKL superovulados a las 6-8 horas después de una ovulación. En la Figura 2 se describe un diagrama esquemático del gen quimérico. La expresión de este gen quimérico conduce a un transcrito de ARNm de 2,5 kb cuando se poliadenila en la señal situada en el extremo del ADNc de glucoqumasa. Los procedimientos generales para la microm- yección del gen quimérico fueron tal como se describe en Hogan, et al., Manipulating the Mouse Embryo - A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986) . Con 3 semanas de edad, los animales fueron ensayados en cuanto a la presencia del transgén por transferencia Southern de 10 μg de ADN de cola digerido con EcoRI . Las manchas de transferencia fueron hibridadas con un fragmento EcoRI-EcoRI de 2,3 kb, que contenía todo el ADNc de glucoqumasa marcado radiactivamente con [α- 2P] dCTP (3.000 Ci/mmol, Amersham Corp., Arlington Heights, IL) mediante oligocebado aleato¬ rio. Los ratones fueron alimentados ad libi tum con una dieta normalizada (Panlab, Barcelona, España) y se mantuvieron bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12 h (se conectan las lámparas a las 8:00 a.m.) . Se utilizaron ratones machos con una edad de 4 a 8 semanas.
(c) Expresión del gen quimérico
Se otuvo ARN total del músculo de esqueleto por el método del isotiocianato de guanidina (Chirgwin, et al., Biochemistry 18:5294-5299 (1979)) , y unas muestras de ARN (30 μg) se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1% que contenía formaldehído 2,2 M. Se hibridaron manchas de transferencia Northern a una sonda de ADNc de glucoquma- sa marcada con ^2P, tal como se indica en Valera, et al., FASEB J. 9:1067-1078 (1995) . Esta sonda fue marcada utili¬ zando [α-32P] dCTP, siguiendo el método de oligocebado aleatorio, tal como se describe por el fabricante (Boehπnger-Mannheim, Alemania) . La actividad específica del ADN marcado fue de aproximadamente 109 cpm/μg de ADN. Las membranas se pusieron en contacto con películas Kodak XCAR- 5.
(d) Análisis de enzimas y metabolitos
Para medir la actividad de glucoquinasa y hexoqumasa, unas muestras de músculos del esqueleto se homogeneizaron en un tampón enfriado con hielo (pH 7,4) que contenía Tris-HCl 50 mM, sacarosa 300 mM, KCl 100 mM, ácido etilendiamma- tetraacético (EDTA) 1 mM, y β-mercaptoetanol 0,7 μl/m. Estas actividades fueron analizadas en materiales sobrenadantes de centrifugación a 12.000 x g (Davídson, et al., Arch. Biochem. Biophys. 253:156-176 (1987) y Feliu, et al., Eur. J. Biochem. 81:609-617 (1977)) . Se calculó la actividad de glucoqumasa como la diferencia entre la capacidad de fosforilación de glucosa, con glucosa a 100 y 5 mM, y la actividad de hexoqumasa como la capacidad fosforilante de glucosa, con glucosa a 5 mM. Las concentraciones de insulina y glucosa en suero, glucógeno, glucosa-6-P04 y lactato en extractos de músculos se midieron tal como se describe en Valera, A., et al., FASEB J. 9:1067-1078 (1995) . La glucosa se determinó también en 20 mi de sangre utilizando un analizador Accutrend® (Boehringer-Mannheim) .
En este estudio, se utilizaron ratones Fl y F2 procedentes del linaje transgénico MLCl/GK-A, que eran portadores de aproximadamente 10 copias intactas del gen quimérico cuando se analizaron por transferencia Southern. Se utilizaron acoplamientos de carnadas como testigos para los animales transgénicos. Un transcrito de 2,5 kb fue detectado en el músculo del esqueleto de ratones transgéni¬ cos, resultando de la expresión del transgén. No se detecta- ron transcritos de ARNm de glucoquinasa en los músculos de ratones testigos. El aumento en la expresión de glucoqumasa en los músculos de ratones transgénicos fue paralelo con la activación de la enzima. Estos hallazgos sugieren que el ARNm de glucoquinasa había sido traducido y que la proteína era estable en un entorno ectópico, tal como en tejido muscular. Estos resultados indican también que el estableci¬ miento de un cierto nivel de ARNm de glucoqumasa en el músculo de un ratón transgénico era suficiente para producir una enzima activada en alto grado. Un ensayo de tolerancia intrapeπtoneal de glucosa, realizado en estos ratones transgénicos, bien sea proceden¬ tes del linaje MLCl/GK-A o de otros Imajes de MCLl/GK, manifestaron una marcada reducción (aproximadamente 35%) en los niveles de glucosa en sangre, en comparación con los testigos. El aumento en los niveles de glucosa circulante era transitorio, y volvió gradualmente a los niveles básicos a los 120 mm en los ratones transgénicos y a los 180 min en los testigos.
Otras realizaciones
Ha de entenderse que aunque el invento ha sido descrito en conjunción con la descripción detallada del mismo, que la descripción precedente está destinada a ilustrar y no limitar el alcance del invento, que es definido por el alcance de las reivindicaciones anejas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones se hallan dentro de las reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Uso de un segmento de ADN, que incluye un gen de glucoqumasa y una secuencia de promotor, estando dicha secuencia de promotor enlazada operativamente a dicho gen de glucoqumasa y siendo eficaz para la expresión de una cantidad terapéuticamente eficaz de glucoqumasa en un paciente, para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de la diabetes.
2.- El uso de la reivindicación 1, en el que dicho segmento de ADN es introducido en el paciente dentro de células, habiendo sido tratadas dichas células m vi tro para incorporar en ellas dicho segmento de ADN.
3. - El uso de la reivindicación 2 , en el que dichas células expresan un transportador de glucosa.
4.- El uso de la reivindicación 3, en el que dicho transportador de glucosa es GLUT-2 o GLUT-4.
5.- El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 , en el que dichas células son células hepáticas o células musculares.
6. - El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha secuencia de promotor es diferente de la secuencia de promotor que controla la transcripción de glucoqumasa endógena.
7. - El uso de una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6 , en el que dicha secuencia de promotor es mducible durante la presentación de condiciones diabéticas.
8. - El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho promotor es un promotor de PEPCK o un promotor de MLC1.
9. - El uso de una cualquiera de las reivindicaciones
2 a 8 , en el que dicho segmento de ADN ha sido incorporado en dichas células por un vector vírico.
10.- El uso de la reivindicación 9, en el que dicho vector vírico es un vector retrovírico.
11.- El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en el que dichas células se hallan en un neo-órgano.
12.- El uso de la reivindicación 1, en el que dicho segmento de ADN es administrado directamente a un paciente.
13.- El uso de la reivindicación 12, en el que dicho segmento de ADN es una parte integrante de un vector.
14.- El uso de la reivindicación 13, en el que dicho vector es un vector vírico.
15.- El uso de la reivindicación 14, en el que dicho vector es un vector retrovírico, un vector adenovírico, un vector adeno-asociado, un vector vírico de smdbis o un vector vírico de herpes.
16.- El uso de la reivindicación 12, en el que dicho segmento de ADN es administrado a dicho paciente en un conjugado de ADN y ligando, un liposoma, o un precipitado con fosfato de calcio.
17.- Un procedimiento para tratar a un paciente diabético, que comprende administrar a dicho paciente un segmento de ADN, que incluye un gen de glucoqumasa y una secuencia de promotor, estando dicha secuencia de promotor enlazada operativamente a dicho gen de glucoquinasa y siendo eficaz para la expresión de una cantidad terapéuticamente eficaz de glucoqumasa en dicho paciente.
18.- Un procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicho segmento de ADN es introducido en el paciente dentro de células, habiendo sido tratadas dichas células m vi tro para incorporar en ellas dicho segmento de ADN.
19.- Un procedimiento según la reivindicación 18, en el que dichas células expresan un transportador de glucosa.
20.- Un procedimiento según la reivindicación 19, en el que dicho transportador de glucosa es GLUT-2 o GLUT-4.
21.- Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en el que dichas células son células hepáticas o células musculares.
22.- Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, en el que dicha secuencia de promotor es diferente de la secuencia de promotor que controla la transcripción de glucoqumasa endógena.
23. - Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, en el que dicha secuencia de promotor es inducible durante la presentación de condiciones diabéticas .
24. - Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en el que dicho promotor es un promotor de PEPCK o un promotor de MLC1.
25. - Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, en el que dicho segmento de ADN ha sido incorporado en dichas células por un vector vírico.
26.- Un procedimiento según la reivindicación 25, en el que dicho vector vírico es un vector retrovírico.
27.- Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 26, en el que dichas células se hallan en un neo-órgano.
28.- Un procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicho segmento de ADN es administrado directamente a dicho paciente.
29.- Un procedimiento según la reivindicación 28, en el que dicho segmento de ADN es una parte integrante de un vector.
30.- Un procedimiento según la reivindicación 29, en el que dicho vector es un vector vírico.
31.- Un procedimiento según la reivindicación 30, en el que dicho vector es un vector retrovírico, un vector adenovírico, un vector adeno-asociado, un vector vírico de sindbis o un vector vírico de herpes.
32.- Un procedimiento según la reivindicación 28, en el que dicho segmento de ADN es administrado a dicho paciente en un conjugado de ADN y ligando, un liposoma, o un precipitado con fosfato de calcio.
33.- Una molécula de ADN recombinante, que comprende un gen de glucoquinasa y una secuencia de promotor, en la que la secuencia de promotor está enlazada operativamente al gen de glucoquinasa.
34.- La molécula de ADN de la reivindicación 33, en que la secuencia de promotor es diferente de la secuencia de promotor que controla la transcripción de glucoqumasa endógena.
35.- La molécula de ADN de la reivindicación 34, en la que el promotor es un promotor de PEPCK o un promotor de MLC1.
36.- Un vector de expresión que comprende una molécula de ADN como se define en una cualquiera de las reivindica¬ ciones 33 a 35.
37.- El vector de expresión de la reivindicación 36, en el que el vector es un vector vírico.
38.- Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ADN como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35.
39.- Una célula que comprende una molécula de ADN como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35.
40.- Una molécula de ADN o un vector de expresión, como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37 para su uso en una terapia.
41.- Una molécula de ADN o un vector de expresión, como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37 para su uso en el tratamiento de la diabetes.
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