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WO1997010853A2 - Bifunktionelle nicotinamid-chelatbildner vom typ n2s2 für radioaktive isotope - Google Patents

Bifunktionelle nicotinamid-chelatbildner vom typ n2s2 für radioaktive isotope Download PDF

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WO1997010853A2
WO1997010853A2 PCT/DE1996/001824 DE9601824W WO9710853A2 WO 1997010853 A2 WO1997010853 A2 WO 1997010853A2 DE 9601824 W DE9601824 W DE 9601824W WO 9710853 A2 WO9710853 A2 WO 9710853A2
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WO
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asp
cys
leu
phe
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PCT/DE1996/001824
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French (fr)
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WO1997010853A3 (de
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Ludger Dinkelborg
Christoph Stephan Hilger
Wolfgang Kramp
Johannes Platzek
Bernd Radüchel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Pharma AG
Original Assignee
Institut fuer Diagnostikforschung GmbH
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Publication date
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/14—Angiotensins: Related peptides

Definitions

  • the invention relates to new chelating agents containing nicotinamides, pharmaceutical compositions containing these compounds, their use in radiodiagnostics and radiotherapy, processes for the production of these compounds and compositions, and conjugates of these compounds with substances which accumulate selectively in diseased tissue, in particular peptides.
  • radiopharmaceuticals for diagnostic and therapeutic purposes has long been known in the field of biological and medical research.
  • radiopharmaceuticals are used to represent certain structures such as the skeleton, organs or tissues.
  • the diagnostic application presupposes the use of such radioactive agents, which are specific to those after application
  • suitable detectors such as scintillation cameras or other suitable recording methods.
  • the distribution and relative intensity of the detected radioactive agent characterizes the location of a structure in which the radioactive agent is located and can be the presence of abnormalities in structure and function, pathological
  • radiopharmaceuticals can be used as therapeutic agents to irradiate certain pathological tissues or areas. Such treatment requires the production of radioactive therapeutic agents that accumulate in certain structures, tissues or organs. 4
  • Ion solutions or normal plasma ions such as Ca2 +, Na + , K + and Mg 2+ .
  • radiopharmaceutical agents can contain additional agents known as stabilizers. These keep the radionuclide in a stable form until it has reacted with the ligand.
  • stabilizers can include agents known as transfer or auxiliary ligands that are particularly useful in stabilizing and complexing the metal in a well-defined oxidation state until the target ligand complexes the metal via ligand exchange. Examples of this type of auxiliary ligand are
  • gluconheptonic acid (including their salts) gluconheptonic acid, tartaric acid, citric acid, or other common ligands, as detailed below.
  • Radionuclide is the standard
  • Radiopharmaceuticals are shown by first synthesizing the ligand and then reacting it with the metal radionuclide in a suitable manner in order to form a corresponding complex in which the ligand must necessarily be present unchanged after complexation, with the exception of the splitting off of any protective groups or hydrogen ions that may be present. Removal of these groups facilitates coordination of the ligand to the metal ion and thus leads to rapid complexation.
  • pertechnetate is first obtained from a nuclide generator and converted into a lower oxidation level by using suitable reducing agents (eg SnCl2, s 2 ° 4 2 ⁇ etc.), which is then converted by a suitable one
  • suitable reducing agents eg SnCl2, s 2 ° 4 2 ⁇ etc.
  • Chelator is stabilized. Because technetium in a row Complex formation conditions implemented. If, for example, the production of a technetium-99m radiopharmaceutical is desired, the ligand produced is mixed with a pertechnetate solution with the addition of a suitable reducing agent and the corresponding technetium complex is produced under suitable reaction conditions. These complexes are then suitably administered to the patient by injection, inhalation or ingestion.
  • the solutions containing the radionuclide can, as in the case of technetium-99m, be obtained from an available Mo-99 / Tc-99m nuclide generator, or can be obtained from a manufacturer, as in the case of rhenium-186.
  • the complex formation reaction is carried out at suitable temperatures (e.g. 20 ° -100 ° C) within a few minutes to several hours. In order to ensure complete complex formation, a large excess of more than 100-fold excess to the metal radionuclide) of the ligand produced and a sufficient amount of reducing agent are required for a complete reduction of the radionuclide used.
  • Radiopharmaceuticals are made by combining the radionuclide complex, in an amount sufficient for diagnostic or therapeutic use, with pharmacologically acceptable radiological carriers.
  • This radiological carrier should have favorable properties for the application of the radiopharmaceutical in the form of an injection, inhalation or ingestion.
  • examples of such carriers are HSA, aqueous buffer solutions, for example tris (hydroxymethyl) aminoethane (or their salts), phosphate, citrate, bicarbonate etc., sterile water, physiological saline, isotonic chloride or dicarbonate 6
  • Suitable complexing agents for technetium and rhenium isotopes are e.g. cyclic amines as described by Volkert et al. (Appl. Radiol. Isot. 1982, 33; 891) and Troutner et al. (J. Nucl. Med. 1980, 21; 443), but they have the disadvantage that they are often only able to bind technetium-99m in good yields from a pH> 9.
  • N2 ⁇ 2 systems (Pillai, M.R.A., Troutner, D.E. et al.; Inorg. Chem. 1990, 29; 1850) are in clinical use.
  • Non-cyclic N4 systems such as the major disadvantage of HMPAO is their low complex stability.
  • Tc-99m-HMPAO must be used within 30 minutes after it has been marked so that the proportion of decay products that have a different pharmacokinetics and excretion can be kept low.
  • radiochemical contaminants make it difficult to identify diseases to be diagnosed. A coupling of these chelates or
  • Chelating agents to other substances that accumulate selectively in foci of disease cannot be solved by simple means, so that these are generally distributed nonspecifically in the organism.
  • N2S2 chelators such as e.g. Ethylene dicysteine (EC; Verbruggen, AM et al .; J. Nucl. Med. 1992, 33; 551) meet the requirement for adequate stability of the corresponding technetium-99m complex, but only form when the pH of the complexing medium is> 9 Radio diagnostics with a purity greater than 69%.
  • N3S systems (Fritzburg, A.; EP-0173424 and EP-0250013) form stable technetium-99m complexes, but must be used to form a uniform radiopharmaceutical
  • the efficiency of radionuclides in in vivo diagnostics as well as therapy depends on the specificity and the selectivity of the labeled chelates to the target cell. These properties can be improved by coupling the chelates to biomolecules according to the "drug targeting" principle. Antibodies, their fragments, hormones, growth factors and substrates of receptors and enzymes are suitable biomolecules.
  • the British patent application GB 2,109,407 describes the use of radioactively labeled monoclonal antibodies against tumor-associated antigens for tumor diagnosis in vivo. Likewise, direct protein labels via donor groups (amino, amide, thiol, etc.) of the protein (Rhodes, BA et al., J. Nukl. Med.
  • the invention is therefore based on the object of stable complex compounds which are coupled or capable of
  • Coupling to different selectively enriching compounds are to be made available without their specificity and selectivity being significantly affected.
  • the requirements for the use of these compounds in humans with regard to the absorbed radiation dose are to be made available without their specificity and selectivity being significantly affected.
  • This object is achieved according to the invention in that new, bifunctional, thiol-substituted nicotinamides containing chelating agents and their coupling products with specifically enriching compounds are made available.
  • the invention relates to compounds of the general formula (I)
  • M is a radioisotope of Tc or Re and L is a ligand of the general formula (II)
  • II general formula (I)
  • bifunctional complexing agents which carry both functional groups for binding the desired metal ion and one (other, several) functional group for binding the selectively enriching molecule.
  • Such bifunctional ligands enable a specific, chemically defined binding of technetium or rhenium isotopes to a wide variety of biological materials, even if so-called prelabeling is carried out.
  • Some chelating agents coupled to monoclonal antibodies eg EP-0247866 and EP-0188256
  • fatty acids EP-0200492
  • N2S2 systems are used as chelating agents, which are not very suitable due to their low stability. Since both the selectively accumulating substances in their properties, as well as the mechanisms by which they are enriched, are very different, it is still necessary to vary the couplable chelating agent and the physiological requirements of the 10
  • Alkoxycarbonyl, amino, aldehyde or alkoxy groups with up to 20 carbon atoms is substituted and / or optionally interrupted and / or substituted by one or more heteroatoms from the series 0, N, S, P, As, Se ,
  • R 5 and R ⁇ are the same or different and each represents a hydrogen atom, a branched or unbranched C 1-6 alkyl radical or a sulfur protecting group.
  • Preferred compounds of the general formula (I) are distinguished in that R 1 and R 3 are hydrogen atoms.
  • Particularly preferred compounds of the general formula (I) are characterized in that R 1 , R 2 and R 3
  • R 7 is a hydroxyl, a branched or straight-chain, cyclic or polycyclic C ] _.39 alkoxy, alkenyloxy, polyalkenyloxy, alkynyloxy,
  • R 1 and R 3 are the same or different and each represents a hydrogen atom and / or a branched or unbranched C 1-4 alkyl radical or together represent an optionally substituted, saturated or unsaturated, aliphatic or aromatic C3_g cycle,
  • R 2 and R 4 are the same or different and each for a hydrogen atom, for a branched or unbranched C ] __g alkyl radical or a radical -CO-R 7 , in which
  • R 7 is a hydroxyl, a branched or straight-chain, cyclic or polycyclic C ⁇ _3 Q-alkoxy, alkenyloxy, polyalkenyloxy, alkynyloxy, polyalkynyloxy, aryloxy, alkylaryloxy or arylalkyloxy group, optionally with hydroxy, oxy , Oxo, carboxy, aminocarbonyl,
  • Alkoxycarbonyl, amino, aldehyde or alkoxy groups with up to 20 carbon atoms is substituted and / or optionally interrupted and / or substituted by one or more heteroatoms from the series 0, N, S, P, As, Se and optionally together one Form anhydride or represents an N (R a R b ) group, where R a and R ⁇ are the same or different and / or a hydrogen atom, a branched or 12
  • R 1 , R 2 and R 3 are hydrogen atoms and R 4 represents a radical -CO-R 7 , in which
  • R 7 represents a hydroxyl, a branched or straight-chain, cyclic or polycyclic C] _. 30-alkoxy, alkenyloxy, polyalkenyloxy, alkynyloxy, polyalkynyloxy, aryloxy, alkylaryloxy or arylalkyloxy group, which may optionally be substituted with hydroxy, Oxy, oxo, carboxy, aminocarbonyl, alkoxycarbonyl, amino, aldehyde or alkoxy groups with up to 20 carbon atoms and / or optionally substituted by one or more heteroatoms from the series O, N, S, P, As , Se is interrupted and / or substituted or a
  • N is (R a R b ) group, wherein
  • R a and R b are the same or different and / or represent a hydrogen atom, a branched or straight-chain, cyclic or polycyclic C ] __3o-alkyl, alkenyl, polyalkenyl, alkynyl, polyalkynyl, aryl, alkylaryl or arylalkyl radical , optionally with hydroxy, oxy, oxo, carboxy, aminocarbonyl,
  • Alkoxycarbonyl, amino, aldehyde or alkoxy groups with up to 20 carbon atoms is substituted and / or optionally interrupted and / or substituted by one or more heteroatoms from the series 0, N, S, P, As, Se.
  • the invention further relates to conjugates containing a compound of the general formula (I and / or II) and substances which accumulate selectively in diseased tissue, with a Heteroatoms from the series O, N, S, P, As, Se is interrupted and / or substituted or is an N (R a R b ) group, where R a and R b are identical or different and / or a hydrogen atom, a branched or straight-chain, cyclic or polycyclic C ⁇ _30-alkyl, alkenyl, polyalkenyl, alkynyl, polyalkynyl, aryl, alkylaryl or arylalkyl radical, optionally with
  • S, P, As, Se is interrupted and / or substituted.
  • the invention further relates to the new bifunctional thiol-substituted nicotinamide ligands of the general formula (II)
  • conjugates are characterized in that the substances accumulating in the diseased tissue include peptides such as endotheline, partial sequences of endothelin, endothelin analogs, endothelin derivatives, endothelin antagonists or angiotensins, partial sequences of angiotensins, angiotensin analogs, angiotensin derivatives and Angiotensin antagonists mean.
  • peptides such as endotheline, partial sequences of endothelin, endothelin analogs, endothelin derivatives, endothelin antagonists or angiotensins, partial sequences of angiotensins, angiotensin analogs, angiotensin derivatives and Angiotensin antagonists mean.
  • the peptides have the following sequences
  • R 1 and R 3 are the same or different and each represent a hydrogen atom and / or a branched or unbranched C ⁇ - ⁇ -alkyl radical or together an optionally substituted, saturated or unsaturated, aliphatic or aromatic C3_g cycle,
  • R 2 and R 4 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a branched or unbranched C 1 -C 6 -alkyl radical or a radical -CO-R 7 , in which
  • R 7 is a hydroxyl- a branched or straight-chain, cyclic or polycyclic C ⁇ _3 Q -alkoxy-, alkenyloxy-, polyalkenyloxy-,
  • Alkynyloxy, polyalkynyloxy, aryloxy, alkylaryloxy or arylalkyloxy group which is optionally substituted with hydroxyl, oxy, oxo, carboxy, aminocarbonyl, alkoxycarbonyl, amino, aldehyde or alkoxy groups having up to 20 carbon atoms and / or optionally interrupted and / or substituted by one or more heteroatoms from the series 0, N, S, P, As, Se and optionally together form a carboxylic anhydride or an N (R a R b ) group, where R a and R b are the same or different and / or a hydrogen atom, a branched or straight-chain, cyclic or Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu,
  • the present invention furthermore further relates to compounds of the general formula (II) 18th
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 have the meaning given above,
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 have the meaning given in claim 1,
  • kits which are used to produce radiopharmaceuticals, consisting of a compound of the general formula (II) or a conjugate according to the invention containing compounds of the general formula (I and / or II) and substances which accumulate selectively in tissues, a Reducing agent and optionally an auxiliary ligand, which are in the dry state or in solution, and one represent polycyclic C ] __3 Q -alkyl, alkenyl, polyalkenyl, alkynyl, polyalkynyl, aryl, alkylaryl or arylalkyl radicals which may be combined with hydroxyl, oxy, oxo, carboxy, aminocarbonyl, alkoxycarbonyl, Amino,
  • Aldehyde or alkoxy groups with up to 20 carbon atoms is substituted and / or optionally interrupted and / or substituted by one or more heteroatoms from the series O, N, S, P, As, Se,
  • R 5 and R 6 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a branched or unbranched C 1 -C 6 -alkyl radical or a sulfur protecting group,
  • Antibodies or their fragments are amidic or, in the case of substances containing hydroxyl groups such as fatty alcohols, ester-like or imidic in the case of substances containing aldehyde groups
  • the compounds of the general formula (II) according to the invention are prepared by protecting the free thiol function of 2-mercaptonicotinic acid in a manner known per se and then protecting the 20th
  • the chelates and chelating agents described in the present invention are thus clearly more suitable for diagnostic and therapeutic purposes than the previously known systems.
  • the mild marking conditions are a particular advantage.
  • the ligands according to the invention and their coupling products can be labeled on substances which accumulate selectively in diseased tissues at room temperature and at a physiological pH.
  • suitable protective groups which can be split off with different reaction conditions depending on the coupling product, always ensures that undesired side reactions cannot occur during the purification of the coupling products. This ensures that no undesired crosslinking reactions or oxidation of free sulfhydryl groups to form disulfides
  • the invention also relates to a radiopharmaceutical composition for the non-invasive in vivo presentation of organs, receptors and receptor-containing tissue and / or of atherosclerotic plaques, which contain a compound of the general formula (I) or a conjugate according to the invention containing compounds of the general formula (I and / or II) and contains substances which accumulate selectively in tissues, optionally with the additives customary in galenics, the compound being in a kit with
  • Technetium-99m or Re is prepared in the form of a pertechnetate or perrhenate solution.
  • the radiopharmaceutical composition is administered to a patient in an amount of 0.1 to 30 mCi, preferably 0.5 to 10 mCi per 70 kg of body weight, and the radiation emitted by the patient is recorded.
  • Vascular diseases These derivatives were applied to WHHL rabbits, which have high LDL concentrations in the blood due to a genetic defect in the LDL receptor and thus have atherosclerotic lesions. About 1 to 6 h after application of the derivatives in WHHL rabbits, a high accumulation in atherosclerotic plaques could be demonstrated. So far, only very late stages of atherogenesis have been diagnosed with invasive procedures. The compounds according to the invention therefore offer the decisive advantage of diagnosing much earlier stages of atherosclerosis using a non-invasive method.
  • Means are carried out in a manner known per se, in which the Groups of substances that selectively accumulate in diseased tissues.
  • the coupling partners include different biomolecules used. So e.g. Ligands attached to specific biomolecules.
  • Binding receptors and thus showing changes in receptor density these include Peptides,
  • EgF epidermal growth factor
  • biomolecules are metabolites that can be introduced into the metabolism of the cells and indicate a changed metabolism; these include e.g. Fatty acids, saccharides, peptides and amino acids. Fatty acids coupled to the less stable N2S2 systems have been described in EP-0200492. Other metabolic products such as saccharides, deoxyglucose, lactate and amino acids (leucine, methyl methionine, glycine) have been used with the help of PET technology to depict changed metabolic processes (R. Weinreich, Swiss Med. 8, 10, 1986). Not even biological substances like
  • Misonidazole and its derivatives which irreversibly bind to cell components in tissues or tissue parts with reduced oxygen concentration, can be used for the specific enrichment of radioactive isotopes and thus for the visual representation of tumors or ischemic regions (ME Shelton, 24
  • Suitable additives are, for example, physiologically harmless buffers (eg tromethamine), small additions of electrolytes (eg sodium chloride), stabilizers (eg gluconate, phosphates or phosphonates).
  • the pharmaceutical composition according to the invention is in the form of a solution or in lyophilized form and is added shortly before application with a solution of Tc-99m pertechnetate, eluted from commercially available Mo / Tc generators, or a perrhenate solution.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention are dosed in amounts of lxlO -5 to 5xl0 4 nmol / kg body weight, preferably in amounts between lxlO "3 to 5xl0 2 nmol / kg body weight.
  • the amount of radioactivity for diagnostic applications is between 0.05 to 50 mCi, preferably 5 to 30 mCi per 70 kg application, for therapeutic applications between 5 and 500 mCi, preferably 10 to 350 mCi.
  • the application is normally carried out by intravenous, intraarterial, peritoneal or intertumor injection of 0.1 to 2 ml of a solution of the agents according to the invention, intravenous application is preferred.
  • Ge f. C 50, 20 H 4, 35 N 16, 56 S 19, 08 28
  • reaction mixture After an incubation time of 10 min, the reaction mixture is examined for the purity of the Tc complex formed by means of HPLC: LiChrospher RP-18 column, 5 ⁇ , 125 x 4.6 mm; Gradient elution from 100% A to 100% B within 15 min (eluent A: acetonitrile / Na phosphate 5 mM, pH 2.0
  • M is a radioisotope of Tc or Re and L is a ligand of the general formula (II)
  • R 1 and R 3 are the same or different and each represents a hydrogen atom and / or a branched or unbranched C ⁇ - ⁇ -alkyl radical or together an optionally substituted, saturated or unsaturated, aliphatic or aromatic C ⁇ - ⁇ cycle,
  • R 2 and R 4 are identical or different and each for a hydrogen atom, for a branched or unbranched C -g-alkyl radical or a radical -CO-R 7 , wherein
  • R 7 is a hydroxyl, a branched or straight-chain, cyclic or polycyclic C ⁇ _3n- alkoxy, alkenyloxy, polyalkenyloxy, mg of compound 12 are dissolved in 1.0 ml of ethanol. 50 ul of this ligand solution are mixed with 100 ul ethanol, 150 ul phosphate buffer pH 8.5, 50 ul of a deoxygenated aqueous citrate solution (50 mg / ml), 2.5 ul of a deoxygenated tin (II) chloride solution (5 mg / ml 0.1 N HCl) and 100 ⁇ l of a pertechnetate solution (400-1000 ⁇ Ci) are added.
  • the reaction mixture is examined for the purity of the Tc complex formed by means of HPLC: LiChrospher RP-18 column, 5 ⁇ , 125 x 4.6 mm; Gradient elution from 100% A to 100% B within 15 min (eluent A: acetonitrile / sodium phosphate 5 mM, pH 2.0 (10/90); eluent B: acetonitrile / sodium phosphate 5 mM, pH 2.0 (75/25); 1 ml / min.
  • the radiochemical purity is> 94%.

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue Verbindungen der allgemeinen Formel (I) M - L, worin M für ein Radioisotop von Tc oder Re und L für einen Liganden der allgemeinen Formel (II) steht, worin R?1, R2, R3, R4, R5 und R6¿ unterschiedliche Bedeutung haben können und für Gruppen stehen, die einerseits für die koordinative Bindung von Metallionen, andererseits für die Kopplung an sich selektiv anreichernde Verbindungen geeignet sind. Die neuen Verbindung dienen zur Komplexierung von Technetium und Rhenium und werden in der medizinischen Diagnostik und Therapie eingesetzt.

Description

Bifunktionelle Nicotinamid-Chelatbildner vom Typ N2S2 für radioaktive Isotope
Die Erfindung betrifft neue, Nicotinamide enthaltende Chelatbildner, diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Mittel, ihre Verwendung in der Radiodiagnostik und Radiotherapie, Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen und Mittel, sowie Konjugate dieser Verbindungen mit sich in erkranktem Gewebe selektiv anreichernden Substanzen, insbesondere Peptiden.
Die Anwendung von Radiopharmaka für diagnostische und therapeutische Zwecke ist seit langem im Bereich der biologischen und medizinischen Forschung bekannt. Insbesondere werden Radiopharmaka dazu benutzt, um bestimmte Strukturen wie beispielsweise das Skelett, Organe oder Gewebe, darzustellen. Die diagnostische Anwendung setzt den Gebrauch solcher radioaktiver Mittel voraus, die sich nach Applikation spezifisch in solchen
Strukturen im Patienten anreichern, die untersucht werden sollen. Diese sich lokal anreichernden radioaktiven Mittel können dann mittels geeigneter Detektoren, wie beispielsweise Szintilations-Kameras oder anderer geeigneter Aufnahmeverfahren, aufgespürt, geplottet oder szintigraphiert werden. Die Verteilung und relative Intensität des detektierten radioaktiven Mittels kennzeichnet den Ort einer Struktur, in dem sich das radioaktive Mittel befindet und kann die Anwesenheit von Anomalien in Struktur und Funktion, pathologische
Veränderungen etc. darstellen. In ähnlicher Weise können Radiopharmaka als therapeutische Mittel angewendet werden, um bestimmte krankhafte Gewebe oder Bereiche zu bestrahlen. Solche Behandlung erfordert die Herstellung radioaktiver therapeutischer Mittel, die sich in bestimmten Strukturen, Geweben oder Organen anreichern. 4
Ionenlösungen oder normale Plasma-Ionen wie Ca2+, Na+, K+ und Mg2+.
Da Technetium in einer Reihe von Oxidationsstufen (+7 bis -1) vorliegen kann, ist es häufig erforderlich, daß radiopharmazeutische Mittel zusätzliche Mittel enthalten, die als Stabilisatoren bekannt sind. Diese halten das Radionuklid in einer stabilen Form, bis es mit dem Liganden reagiert hat. Diese Stabilisatoren können Mittel, die als Transfer- oder Hilfsliganden bekannt sind, beinhalten, die besonders nützlich dazu sind, das Metall in einer wohl definierten Oxidationsstufe zu stabilisieren und zu komplexieren, bis der Zielligand über einen Ligandenaustusch das Metall komplexiert . Beispiele dieser Art von Hilfsliganden sind
(einschließlich deren Salze) Gluconheptonsäure, Weinsäure, Zitronensäure oder andere gebräuchliche Liganden, wie später genauer ausgeführt ist.
Standardmäßig werden radionuklidhaltige
Radiopharmazeutika dargestellt, indem zunächst der Ligand synthetisiert und anschließend mit dem Metall-Radionuklid in geeigneter Weise umgesetzt wird, um einen entsprechenden Komplex zu bilden, in dem notwendigerweise der Ligand nach Komplexierung unverändert, mit Ausnahme der Abspaltung eventuell vorhandener Schutzgruppen oder Wasserstoffionen, vorliegen muß. Die Entfernung dieser Gruppen erleichtert die Koordination des Liganden am Metallion und führt so zu einer raschen Komplexierung.
Zur Bildung von Technetium-99m-Komplexen wird Pertechnetat zunächst aus einem Nuklidgenerator gewonnen und durch Verwendung geeigneter Reduktionsmittel (z.B. SnCl2, s2°42~ etc.) in eine niedrigere Oxidationsstufe überführt, die anschließend durch einen geeigneten
Chelator stabilisiert wird. Da Technetium in einer Reihe Komplexbildungsbedingungen umgesetzt. Ist beispielsweise die Herstellung eines Technetium-99m Radiopharmakons gewünscht, so wird der hergestellte Ligand unter Zusatz eines geeigneten Reduktionsmittels mit einer Pertechnetat-Lösung versetzt und unter geeigneten Reaktionsbedingungen der entsprechende Technetium-Komplex hergestellt. Diese Komplexe werden dann dem Patienten in geeigneter Weise durch Injektion, Inhalation oder Ingestion verabreicht.
Die das Radionuklid enthaltenden Lösungen können, wie im Falle von Technetium-99m, aus einem erhältlichen Mo- 99/Tc-99m Nuklid-Generator gewonnen werden, oder von einem Hersteller, wie im Falle von Rhenium-186, bezogen werden. Die Komplexbildungsreaktion wird unter geeigneten Temperaturen (z.B. 20°-100°C) innerhalb weniger Minuten bis mehreren Stunden durchgeführt. Um eine vollständige Komplexbildung zu gewährleisten, ist ein großer Überschuß mehr als 100-facher Überschuß zum Metall-Radionuklid) des hergestellten Liganden und eine ausreichende Menge an Reduktionsmittel für eine vollständige Reduktion des eingesetzten Radionuklids erforderlich.
Radiopharmazeutische Mittel werden durch Kombination des Radionuklid-Komplexes, in einer für die diagnostische oder therapeutische Anwendung ausreichenden Menge, mit pharmakologisch akzeptablen radiologischen Trägerstoffen hergestellt. Dieser radiologische Trägerstoff sollte günstige Eigenschaften für die Applikation des radiopharmazeutischen Mittels in Form einer Injektion, Inhalation oder Ingestion aufweisen. Beispiele solcher Trägerstoffe sind HSA, wäßrige Pufferlösungen, z.B. Tris- (hydroxymethyl) aminoethane (bzw. deren Salze) , Phosphat, Citrat, Bicarbonat usw., steriles Wasser, physiologische Kochsalzlösung, isotonische Chlorid- oder Dicarbonat- 6
Als geeignete Komplexbildner für Technetium und Rheniumisotope gelten z.B. zyklische Amine wie sie von Volkert et al. (Appl. Radiol.Isot. 1982, 33; 891) und Troutner et al . (J. Nucl. Med. 1980, 21; 443) beschrieben werden, die aber den Nachteil haben, daß sie häufig erst ab einem pH-Wert > 9 in der Lage sind, Technetium-99m in guten Ausbeuten zu binden. N2θ2-Systme (Pillai, M.R.A., Troutner, D.E. et al. ; Inorg. Chem. 1990, 29; 1850) befinden sich in der klinischen Anwendung. Nichtzyklische N4-Systme wie z.B. das HMPAO haben als großen Nachteil ihre geringe Komplexstabilität. Tc-99m-HMPAO muß wegen seiner Instabilität (Ballinger, J.R. et al . , Appl. Radiat. Isot. 1991, 42; 315, Billinghurst, M.W. et al . , Appl. Radiat. Isot. 1991, 42; 607) innerhalb von 30 Minuten nach seiner Markierung appliziert werden, damit der Anteil an Zerfallsprodukten, die eine andere Pharmakokinetik und Ausscheidung besitzen, klein gehalten werden kann. Solche radiochemischen Verunreinigungen erschweren die Erkennung von zu diagnostizierenden Erkrankungen. Eine Kopplung dieser Chelate bzw.
Chelatbildner an andere, sich selektiv in Krankheitsherden anreichernde Substanzen ist nicht mit einfachen Mitteln zu lösen, so daß sich diese im allgemeinen unspezifisch im Organismus verteilen.
N2S2~Chelatoren (Bormans, G. et al . ; Nucl. Med. Biol. 1990, 17; 499) wie z.B. Ethylendicystein (EC; Verbruggen, A.M. et al.; J. Nucl. Med. 1992, 33; 551) erfüllen zwar die Forderung nach hinreichender Stabilität des entsprechenden Technetium-99m-Komplexes, bilden aber erst ab einem pH-Wert des Komplexierungsmediums > 9 Radiodiagnostika mit einer Reinheit von größer 69%. N3S- Systme (Fritzburg, A. ; EP-0173424 und EP-0250013) bilden zwar stabile Technetium-99m-Komplexe, müssen aber zur Bildung eines einheitlichen Radiopharmakons auf
Temperaturen von ca. 100°C erhitzt werden. von Oxidationsstufen (+7 bis -1) vorliegen kann, die die pharmakologischen Eigenschaften durch Veränderungen der Ladungen eines Komplexes stark verändern können, ist es notwendig, Chelatoren bzw. Komplexliganden für Technetium-99m bereitzustellen, die Technetium sicher, fest und stabil in einer definierten Oxidationsstufe binden können, um zu verhindern, daß durch in vivo ablaufende Redoxprozesse bzw. Technetiumfreisetzungen aus den entsprechenden Radiodiagnostika eine unerwünschte Biodistribution stattfindet, die eine sichere Diagnostik entsprechender Erkrankungen erschwert .
Die Effizienz von Radionukliden in der in vivo Diagnostik, als auch der Therapie hängt von der Spezifität und der Selektivität der markierten Chelate zur Targetzelle ab. Eine Verbesserung dieser Eigenschaften ist durch Kopplung der Chelate an Biomoleküle nach dem "Drug-Targeting"-Prinzip zu erreichen. Als Biomoleküle bieten sich Antikörper, deren Fragmente, Hormone, Wachstumsfaktoren und Substrate von Rezeptoren und Enzymen an. So wird in der britischen Patentanmeldung GB 2,109,407 die Verwendung radioaktiv markierter monoklonaler Antikörper gegen tumorassoziierte Antigene, für die in vivo Tumordiagnsotik beschrieben. Ebenso wurden direkte Proteinmarkierungen über Donor- Gruppen (Amino-, Amid-, Thiol-, etc.) des Proteins (Rhodes, B.A. et al . , J. Nukl . Med. 1986, 27 685-693) oder durch Einführen von Komplexbildnern (US-Patent 4,479,930 und Fritzberg, A.R. et al . , Nucl. Med. 1986, 27, 957) mit Technetium-99m beschrieben. Diese experimentellen Methoden stehen jedoch für die klinische Anwendung nicht zur Verfügung, da zum einen die Selektivität zu niedrig und zum anderen die Backgroundaktivität im Organismus zu hoch ist, um ein in vivo Imaging zu ermöglichen. 8
Kopplungspartners hinsichtlich seiner Lipophilie, Membranpermeabilität etc. anpassen zu können.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, stabile Komplexverbindungen, die gekoppelt oder fähig zur
Kopplung an unterschiedliche sich selektiv anreichernde Verbindungen sind, zur Verfügung zu stellen, ohne daß deren Spezifität und Selektivität wesentlich beeinflußt wird. Zusätzlich besteht die Aufgabe, solche koppelbaren Chelatoren oder Komplexe bereitzustellen, die über eine größere chemische Variationsbreite der Substituenten verfügen, um diese den oben referierten Erfordernissen anpassen zu können. Dabei müssen gleichzeitig die Voraussetzungen für die Anwendung dieser Verbindungen am Menschen bezüglich aufgenommener Strahlendosis,
Stabilität und Löslichkeit der Verbindungen erfüllt sein.
Diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß neue, bifunktionelle, thiolsubstituierte Nicotinamide enthaltende Chelatbildner und deren Kopplungsprodukte mit sich spezifisch anreichernden Verbindungen zur Verfügung gestellt werden.
Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
M - L (I)
worin
M ein Radioisotop von Tc oder Re und L einen Liganden der allgemeinen Formel (II) In den letzten Jahren ist das Verlangen nach sich spezifisch in erkrankten Geweben anreichernden Radiodiagnostika gestiegen. Dies kann erreicht werden, wenn Komplexbildner leicht an sich selektiv anreichernde Substanzen gekoppelt werden können und dabei ihre günstigen Komplexierungseigenschaften nicht verlieren. Da es aber sehr häufig dazu kommt, daß nach Kopplung eines Komplexbildners unter Nutzung einer seiner funktionellen Gruppen an ein solches Molekül eine Abschwächung der Komplexstabilität beobachtet wird, erscheinen die bisherigen Ansätze zur Kupplung von Chelatbildnern an sich selektiv anreichernde Substanzen wenig zufriedenstellend, da ein diagnostisch nicht tolerierbarer Anteil des Isotops aus dem Konjugat in vivo freigesetzt wird (Brechbiel, M.W. et al. ; Inorg. chem. 1986, 25, 2772) . Es ist deswegen notwendig, bifunktionelle Komplexbildner darzustellen, die sowohl funktionelle Gruppen zur Bindung des gewünschten Metallions als auch eine (andere, mehrere) funktionelle Gruppe zur Bindung des sich selektiv anreichernden Moleküls tragen. Solche bifunktionellen Liganden ermöglichen eine spezifische, chemisch definierte Bindung von Technetium- oder Rhenium-Isotopen an verschiedenste biologische Materialien, auch dann, wenn ein sogenanntes Prelabeling durchgeführt wird. Es wurden einige Chelatbildner, gekoppelt an monoklonale Antikörper (z.B. EP-0247866 und EP-0188256) oder Fettsäuren (EP-0200492) , beschrieben. Als Chelatbildner werden jedoch die bereits erwähnten N2S2-Systeme verwendet, die aufgrund ihrer geringen Stabilität wenig geeignet sind. Da sowohl die sich selektiv anreichernden Substanzen in ihren Eigenschaften, sowie auch die Mechanismen, nach denen sie angereichert werden, sehr unterschiedlich sind, ist es weiterhin notwendig, den kopplungsfähigen Chelatbildner zu variieren und den physiologischen Anforderungen des 10
geradkettigen, zyklischen oder polyzyklischen C1_30-Alkyl-, Alkenyl-, Polyalkenyl, Alkinyl-, Polyalkinyl- , Aryl-, Alkylaryl- oder Arylalkylrest darstellen, der gegebenenfalls mit Hydroxy-, Oxy-, Oxo-, Carboxy-, Aminocarbonyl-,
Alkoxycarbonyl-, Amino-, Aldehyd- oder Alkoxygruppen mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen substituiert ist und/oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome aus der Reihe 0, N, S, P, As, Se unterbrochen und/oder substituiert ist, darstellt, steht,
R5 und R^ gleich oder unterschiedlich sind und jeweils für ein Wasserstoffatom, für einen verzweigten oder unverzweigten C^.g-Alkylrest oder für eine Schwefelschutzgruppe stehen.
Bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zeichnen sich dadurch aus, daß R1 und R3 Wasserstoffatome sind.
Besonders bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zeichnen sich dadurch aus, daß R1, R2,und R3
Wasserstoffatome sind und R4 für einen Rest -CO-R7, worin
R7 eine Hydroxyl-, eine verzweigte oder geradkettige, zyklische oder polyzyklische C]_.39-Alkoxy- , Alkenyloxy-, Polyalkenyloxy- , Alkinyloxy- ,
Polyalkinyloxy- , Aryloxy- , Alkylaryloxy- oder Arylalkyloxygruppe darstellt, die gegebenenfalls mit Hydroxy-, Oxy-, Oxo-, Carboxy-, Aminocarbonyl-, Alkoxycarbonyl-, Amino-, Aldehyd- oder Alkoxygruppen mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen substituiert ist und/oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere L 4
Figure imgf000011_0001
( I I )
bedeutet, worin
R1 und R3 gleich oder unterschiedlich sind und jeweils für ein Wasserstoffatom und/oder für einen verzweigten oder unverzweigten C^-^-Alkylrest oder gemeinsam einen gegebenenfalls substituierten, gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen oder aromatischen C3_g- Zyklus stehen,
R2 und R4 gleich oder unterschiedlich sind und jeweils für ein Wasserstoffatom, für einen verzweigten oder unverzweigten C]__g-Alkylrest oder einen Rest -CO-R7, worin
R7 eine Hydroxyl-, eine verzweigte oder geradkettige, zyklische oder polyzyklische C^_3 Q-Alkoxy- , Alkenyloxy- , Polyalkenyloxy- , Alkinyloxy- , Polyalkinyloxy- , Aryloxy-, Alkylaryloxy- oder Arylalkyloxygruppe, die gegebenenfalls mit Hydroxy-, Oxy-, Oxo-, Carboxy-, Aminocarbonyl-,
Alkoxycarbonyl-, Amino-, Aldehyd- oder Alkoxygruppen mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen substituiert ist und/oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome aus der Reihe 0, N, S, P, As, Se unterbrochen und/oder substituiert ist und gegebenenfalls gemeinsam ein Anhydrid bilden oder eine N (RaRb) -Gruppe darstellt, wobei Ra und R^ gleich oder verschieden sind und/oder ein Wasserstoffatom, einen verzweigten oder 12
Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Liganden bei denen R1, R2 und R3 Wasserstoffatome sind und R4 für einen Rest -CO-R7 steht, worin
R7 eine Hydroxyl-, eine verzweigte oder geradkettige, zyklische oder polyzyklische C]_.30-Alkoxy- , Alkenyloxy- , Polyalkenyloxy- , Alkinyloxy- , Polyalkinyloxy- , Aryloxy-, Alkylaryloxy- oder Arylalkyloxygruppe darstellt, die gegebenenfalls mit Hydroxy-, Oxy-, Oxo-, Carboxy-, Aminocarbonyl-, Alkoxycarbonyl-, Amino-, Aldehyd- oder Alkoxygruppen mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen substituiert ist und/oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome aus der Reihe O, N, S, P, As, Se unterbrochen und/oder substituiert ist oder eine
N(RaRb) -Gruppe ist, wobei
Ra und Rb gleich oder verschieden sind und/oder ein Wasserstoffatom, einen verzweigten oder geradkettigen, zyklischen oder polyzyklischen C]__3o-Alkyl- , Alkenyl-, Polyalkenyl- , Alkinyl-, Polyalkinyl- , Aryl-, Alkylaryl- oder Arylalkylrest darstellen, der gegebenenfalls mit Hydroxy-, Oxy-, Oxo-, Carboxy-, Aminocarbonyl-,
Alkoxycarbonyl-, Amino-, Aldehyd- oder Alkoxygruppen mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen substituiert ist und/oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome aus der Reihe 0, N, S, P, As, Se unterbrochen und/oder substituiert ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Konjugate enthaltend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I und/oder II) und sich selektiv in erkranktem Gewebe anreichernde Substanzen, wobei zwischen diesen eine Heteroatome aus der Reihe O, N, S, P, As, Se unterbrochen und/oder substituiert ist oder eine N(RaRb) -Gruppe ist, wobei Ra und Rb gleich oder verschieden sind und/oder ein Wasserstoffatom, einen verzweigten oder geradkettigen, zyklischen oder polyzyklischen Cι_30-Alkyl- , Alkenyl-, Polyalkenyl, Alkinyl-, Polyalkinyl- , Aryl-, Alkylaryl- oder Arylalkylrest darstellen, der gegebenenfalls mit
Hydroxy-, Oxy-, Oxo-, Carboxy-, Aminocarbonyl-, Alkoxycarbonyl-, Amino-, Aldehyd- oder Alkoxygruppen mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen substituiert ist und/oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome aus der Reihe O, N,
S, P, As, Se unterbrochen und/oder substituiert ist, steht.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die neuen bifunktionellen thiolsubstituierten Nicotinamid-Liganden der allgemeinen Formel (II)
Figure imgf000013_0001
( ι ι )
worin
R1, R2, R3 , R4, R5 und R6 die voranstehend angegebene
Bedeutung haben.
Bevorzugt sind erfindungsgemäße Liganden der allgemeinen Formel (II) , in denen R1 und R3 Wasserstoffatome sind. 14
Cys-Ser-Ala-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Ala-Val-Tyr-
Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Cys-Ser-Cys-Lys-Asp-Met-Thr-Asp-Lys-Glu-Cys-Leu-Asn-
Phe-Cys-His-Gln-Asp-Val-Ile-Trp,
Ala-Ser-Cys-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr- Phe-Ala-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Ala-Ser-Ala-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Ala-Val-Tyr- Phe-Ala-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Cys-Ser-Cys-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr- Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Cys-Thr-Cys-Phe-Thr-Tyr-Lys-Asp-Lys-Glu-Ala-Val-Tyr- Phe-Ala-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Cys-Val-Tyr-Phe-Cys-His-Gln-Asp-Val-Ile-Trp,
N-Acetyl-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Ala-Val-Tyr-Phe-Ala-His-Gln- Asp-Val-Ile-Trp,
Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu,
Ac-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu,
Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe,
Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe, konvalente Bindung besteht und diese im Falle von Carboxyl- oder Aminogruppen enthaltenden Substanzen wie natürlich vorkommenden oder modifizierten Oligonukleotiden, bei denen der Abbau durch natürlich vorkommende Nukleasen verhindert oder erschwert ist, Peptiden, Proteinen, Antikörpern oder deren Fragmente amidisch oder im Falle von Hydroxylgruppen enthaltenden Substanzen wie Fettalkoholen esterartig oder im Falle von Aldehydgruppen enthaltenden Substanzen imidisch vorliegt.
Besonders bevorzugte Konjugate zeichnen sich dadurch aus, daß die sich im erkrankten Gewebe anreichernden Substanzen Peptide wie Endotheline, Teilsequenzen von Endothelinen, Endothelin-Analoga, Endothelin-Derivate, Endothelin-Antagonisten oder Angiotensine, Teilsequenzen von Angiotensinen, Angiotensin-Analoga, Angiotensin- Derivate und Angiotensin-Antagonisten bedeuten.
In weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Konjugaten weisen die Peptide die folgenden Sequenzen
Cys-Ser-Cys-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr ' 1
Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Cys-Ser-Cys-Ser-Ser-Trp-Leu-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr-
Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Cys-Thr-Cys-Phe-Thr-Tyr-Lys-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr-
Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp, 16
Figure imgf000016_0001
( ι ι )
worin
R1 und R3 gleich oder unterschiedlich sind und jeweils für ein Wasserstoffatom und/oder für einen verzweigten oder unverzweigten C^ - ζ-Alkylrest oder gemeinsam einen gegebenenfalls substituierten, gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen oder aromatischen C3_g- Zyklus stehen,
R2 und R4 gleich oder unterschiedlich sind und jeweils für ein Wasserstoffatom, für einen verzweigten oder unverzweigten C^_g-Alkylrest oder einen Rest -CO-R7, worin
R7 eine Hydroxyl- eine verzweigte oder geradkettige, zyklische oder polyzyklische C^_3Q-Alkoxy- , Alkenyloxy- , Polyalkenyloxy- ,
Alkinyloxy- , Polyalkinyloxy- , Aryloxy- , Alkylaryloxy- oder Arylalkyloxygruppe, die gegebenenfalls mit Hydroxy-, Oxy-, Oxo-, Carboxy-, Aminocarbonyl-, Alkoxycarbonyl-, Amino-, Aldehyd- oder Alkoxygruppen mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen substituiert ist und/oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome aus der Reihe 0, N, S, P, As, Se unterbrochen und/oder substituiert ist und gegebenenfalls gemeinsam ein Carbonsäureanhydrid bilden oder eine N(RaRb) -Gruppe, wobei Ra und Rb gleich oder verschieden sind und/oder ein Wasserstoffatom, einen verzweigten oder geradkettigen, zyklischen oder Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu,
Sar-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala,
For-Met-Leu-Phe,
For-Met-Leu-Phe-Lys,
die Teilsequenzen
His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Phe-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe,
Val-Tyr-Ile-His-Pro,
oder die cyclischen Aminosäuresequenzen
Cyclo- (DTrp-DAsp-Pro-DVal-Leu) ,
Cyclo- (DGlu-Ala-alloDIle-Leu-DTrp)
auf .
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Verbindungen der allgemeinen Formel (II) 18
Carboxylgruppe in an sich bekannter Weise aktiviert und in einem aprotischen Lösungsmittel unter Zusatz einer geeigneten Base mit Verbindungen der allgemeinen Formel (III)
H2N-CR1R2-CR3R4-NH2
(III)
worin R1, R2, R3 und R4 die voranstehend angegebene Bedeutung haben,
bei Temperaturen von -20°C bis 180°C zu Verbindungen der allgemeinen Formel (II)
Figure imgf000018_0001
( M )
worin R1, R2, R3 , R4 , R5 und R6 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben,
umsetzt
und gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppen in an sich bekannter Weise abspaltet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Kits, die zur Herstellung von Radiopharmaka dienen, bestehend aus einer Verbindung der allgemeinen Formel (II) oder einem erfindungsgemäßen Konjugat enthaltend Verbindungen der allgemeinen Formel (I und/oder II) und sich selektiv in Geweben anreichernden Substanzen, einem Reduktionsmittel und gegebenenfalls einem Hilfsliganden, die in trockenem Zustand oder in Lösung vorliegen, sowie einer polyzyklischen C]__3Q-Alkyl- , Alkenyl-, Polyalkenyl, Alkinyl-, Polyalkinyl- , Aryl-, Alkylaryl- oder Arylalkylrest darstellen, der gegebenenfalls mit Hydroxy-, Oxy-, Oxo-, Carboxy- , Aminocarbonyl-, Alkoxycarbonyl-, Amino-,
Aldehyd- oder Alkoxygruppen mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen substituiert ist und/oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome aus der Reihe O, N, S, P, As, Se unterbrochen und/oder substituiert ist, darstellt, stehen,
R5 und R6 gleich oder unterschiedlich sind und jeweils für ein Wasserstoffatom, für einen verzweigten oder unverzweigten Cι_g-Alkylrest oder für eine Schwefelschutzgruppe stehen,
deren Konjugate mit sich selektiv in erkranktem Gewebe anreichernden Substanzen, wobei zwischen diesen eine kovalente Bindung besteht und diese im Falle von Carboxyl- oder Aminogruppen enthaltenden Substanzen wie natürlich vorkommende oder modifizierte Oligonukleotide, bei denen der Abbau durch natürlich vorkommende Nukleasen verhindert oder erschwert ist, Peptiden, Proteinen,
Antikörpern oder deren Fragmente amidisch oder im Falle von Hydroxylguppen enthaltenden Substanzen wie Fettalkoholen esterartig oder im Falle von Aldehydgruppen enthaltenden Substanzen imidisch vorliegt
sowie deren Komplexe mit Radioisotopen von Tc und Re
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (II) erfolgt dadurch, daß man die freie Thiolfunktion der 2-Mercaptonicotinsäure in an sich bekannter Weise schützt und anschließend die 20
vorliegenden Erfindung beschriebenen Chelate und Chelatbildner sind damit eindeutig besser für diagnostische und therapeutische Zwecke geeignet als die bisher bekannten Systeme. Ein besonderer Vorteil liegt in den milden Markierungsbedingungen. So gelingt nach Abspaltung der Schutzgruppen die Markierung der erfindungsgemäßen Liganden sowie deren Kopplungsprodukten an sich selektiv in erkrankten Geweben anreichernden Substanzen bei Raumtemperatur und bei physiologischem pH- Wert. Durch Wahl geeigneter Schutzgruppen, die sich je nach Kopplungsprodukt mit unterschiedlichen Reaktionsbedingungen abspalten lassen, ist stets gewährleistet, daß unerwünschte Nebenreaktionen bei der Aufreinigung der Kopplungsprodukte nicht auftreten können. Dies bietet die Gewähr, daß keine unerwünschten Vernetzungsreaktionen oder Oxidationen freier Sulfhydrylgruppen zu Disulfiden unter
Reinigungsbedingungen auftreten. Solche Veränderungen beeinflussen häufig die Markierungsausbeute und radiochemische Reinheit und somit auch den Background durch unspezifisch gebundenes Technetium nachteilig. Die Etablierung von Schwefelschutzgruppen bzw. deren Abspaltung erfolgt nach Methoden, die dem Fachmann bekannt sind. Ein weiterer wesentlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindungen liegt in der hohen
Stabilität der freien aromatischen Thiole, die besondere Schutzmaßnahmen( e. g. Schutzgasatmosphäre) im Umgang mit den Kopplungsprodukten überflüssig macht . Die Kopplung an sich selektiv in erkrankten Geweben anreichernden Substanzen erfolgt ebenfalls nach an sich dem Fachmann bekannten Methoden (z.B. Fritzberg et al . ; J.Nucl.Med. 26, 7 (1987)) , beispielsweise durch Umsetzung von elektrophilen Gruppen des Komplexliganden mit nukleophilen Zentren der sich selektiv in erkrankten Geweben anreichernden Substanzen oder durch Reaktion nukleophiler Gruppen des Chelators mit elektrophilen Gebrauchsanweisung mit einer Reaktionsvorschrift zur Umsetzung der beschriebenen Verbindungen mit Technetium- 99m oder Re in Form einer Pertechnetatlösung oder Perrhenatlösung.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine radiopharmazeutische Zusammensetzung zur nicht invasiven in vivo Darstellung von Organen, Rezeptoren und rezeptorhaltigem Gewebe und/oder von atherosklerotischen Plaques, die eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder ein erfindungsgemäßes Konjugat enthaltend Verbindungen der allgemeinen Formel (I und/oder II) und sich selektiv in Geweben anreichernden Substanzen, gegebenenfalls mit den in der Galenik üblichen Zusätzen, enthält, wobei die Verbindung in einem Kit mit
Technetium-99m oder Re in Form einer Pertechnetat- oder Perrhenatlösung zubereitet wird.
In einer Methode zur Durchführung einer radiodiagnostischen Untersuchung wird die radiopharmazeutische Zusammensetzung in einer Menge von 0,1 bis 30 mCi, bevorzugt von 0,5 bis 10 mCi pro 70 kg Körpergewicht einem Patienten verabreicht und die vom Patienten abgegebene Strahlung aufgezeichnet .
Überraschenderweise zeigen viele der synthetisierten und mit Technetium-99m oder Re markierten Chelate eine höhere Stabilität als vergleichbare N2S2- und N3S-Systeme, die in der Literatur beschrieben sind. So konnten z.B. bei einer erfindungsgemäßen Substanz (Beispiel 2) , die an ein Alkylamin gekoppelt wurde, keine Zersetzungsprodukte nach 24 h beobachtet werden. Auch konnte durch Kompetitionsversuche festgestellt werden, daß die in dieser Erfindung beschriebenen Tc-99m oder Re-Chelatoren besser als die vergleichbaren N2S2, N3S und
Propylenaminoxim-Systeme komplexieren. Die in der 22
J.Nucl.Med. 30, 351, 1989) . Schließlich ist auch die Kopplung der neuen Chelatbildner an monoklonale Antikörper bzw. deren Fragmente, Polysaccharide wie Dextrane oder Stärken, Bleomycine, Hormone, Enzyme, Polypeptide wie Polylysin und Nukleotide vom DNA- oder
RNA-Typ möglich. Günstig erwiesen sich Kopplungsprodukte der erfindungsgemäßen Chelate bzw. deren Komplexe mit Technetium-99m oder Re mit Fettalkoholen, Fettalkoholderivaten oder mit Fettalkoholaminen bzw. deren Derivate zur Detektion von atherosklerotischen
Gefäßerkrankungen. Diese Derivate wurden WHHL-Kaninchen appliziert, die durch einen genetischen Defekt des LDL- Rezeptors hohe LDL-Konzentrationen im Blut aufweisen und somit atherosklerotische Läsionen aufweisen. Etwa 1 bis 6 h nach Applikation der Derivate in WHHL-Kaninchen konnte ein hohe Anreicherung in atherosklerotischen Plaques nachgewiesen werden. Bisher konnten nur sehr späte Stadien der Atherogenese mit invasiven Verfahren diagnostiziert werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen bieten daher den entscheidenden Vorteil, viel frühere Stadien der Atherosklerose mit einem nicht invasiven Verfahren zu diagnostizieren.
Es ist unerheblich, ob eine Markierung der beschriebenen Chelatbildner mit Technetium-99m vor oder nach der Kopplung an das sich selektiv anreichernde Molekül durchgeführt wird. Für eine Kopplung an das sich selektiv anreichernde Molekül nach einer Komplexierung ist jedoch Voraussetzung, daß die Umsetzung des radioaktiven Komplexes mit der sich anreichernden Verbindung schnell, unter milden Bedingungen und nahezu quantitativ abläuft, so daß eine anschließende Aufreinigung nicht erforderlich ist .
Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Mittel erfolgt in an sich bekannter Weise, in dem man die Gruppen der sich selektiv in erkrankten Geweben anreichernden Substanzen.
Als Kopplungspartner werden u.a. verschiedene Biomoleküle verwendet. So z.B. Liganden, die an spezifische
Rezeptoren binden und so Veränderungen der Rezeptordichte erkennen lassen, hierzu gehören u.a. Peptide,
Steroidhormone, Wachstumsfaktoren und Neurotransmitter.
Kopplungsprodukte mit steroidhormon-rezeptoraffinen Substanzen ermöglichen eine verbesserte Diagnostik von
Mamma- und Prostatacarzinomen (S.J. Brandes und J.A.
Katzenellenbogen, Nucl.Med.Biol . 15, 53, 1988) .
Verschiedentlich weisen Tumorzellen eine veränderte
Dichte von Rezeptoren für Peptidhormone oder Wachstumsfaktoren auf, wie z.B. den "epidermal growth factor" (EgF) . Die Konzentrationsunterschiede lassen sich zur selektiven Anreicherung von Cytostatika in
Tumorzellen nutzen (E.Abound-Pirak et al . ;
Proc.Natl.Acad.Sei. USA 86, 3778, 1989) . Weitere Biomoleküle sind in den Metabolismus der Zellen einschleusbare Metabolite, die einen veränderten Stoffwechsel anzeigen; hierzu gehören z.B. Fettsäuren, Saccharide, Peptide und Aminosäuren. Fettsäuren gekoppelt an die weniger stabilen N2S2-Systeme wurden in der EP- 0200492 beschrieben. Andere Stoffwechselprodukte wie Saccharide, Desoxyglucose, Lactat und Aminosäuren (Leucin, Methylmethionin, Glycin) wurden mit Hilfe der PET-Technik zur bildlichen Darstellung veränderter StoffWechselvorgänge verwendet (R. Weinreich, Swiss Med. 8, 10, 1986) . Auch nicht biologische Substanzen wie
Misonidazol und seine Derivate, die sich in Geweben bzw. Gewebeteilen mit reduzierter Sauerstoffkonzentration irreversibel an Zellbestandteile binden, können zur spezifischen Anreicherung von radioaktiven Isotopen und somit zur bildlichen Darstellung von Tumoren oder ischämischen Regionen herangezogen werden (M.E. Shelton, 24
Beispiel 1
2- (S-Piperonyl)mercaptonicotinsäure 1 1,55 g wasserfreie 2-Mercaptonicotinsäure (10 mmol) suspendiert man in 10 ml Eisessig und gibt dazu etwa
2,28 g des Piperonylalkohols (15 mmol) sowie 2, 1 ml BF3- Diethyletherat (15 mmol) . Es wird 1-2 h bei RT gerührt, wobei sich alles klar löst. Anschließend engt man im Rotationsdamfer bei 40°C Badtemperatur ein. Der ölige Rückstand wird in Essigester gelöst. Durch Verreiben mit Diethylether kristallisiert das geschützte Nicotinsäurederivat aus. Ausbeute: 72% Analyse : Ber. : C 58,12 H 3,83 N 4,84 O 22,12 S 11,08 Gef. : C 57,77 H 3,92 N 4,65 S 11,01
2- (S-Piperonyl)mercaptonicotinsäure-N-hydroxysuccinimido- ester 2 Zu einer Lösung von 2,89 g der Säure 1 (10 mmol) , 2,80 ml Triethylamin und 1,15 g N-Hydroxysuccinimid (10 mmol) in 50 ml wasserfreiem Dichlormethan werden unter Rühren bei -10°C 2,27 g DCC (11 mmol) in 50 ml wasserfreiem Dichlormethan zugetropft und 2 Stunden bei 0°C und 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird auf -20°C gekühlt und vom ausgefallenen Harnstoff abfiltriert. Nach Abziehen des Lösungsmittels wird der Rückstand chromatographiert (Kieselgel, Dichlormethan) . Ausbeute: 74% Analyse:
Ber. : C 55,96 H 3,65 N 7,25 O 24,85 S 8,30 Gef. : C 55,65 H 3,74 N 7,41 S 8,20
N.N' -Bis \2 - (S-Piperonyl)mercaptonicotincarbamoyll - ethylendiamin 3 erfindungsgemäßen Komplexbildner unter Zusatz eines Reduktionsmittels, vorzugsweise Zinn- (II) -Salzen wie -chlorid, -pyrophosphat oder -tartrat - und gegebenenfalls unter Zugabe der in der Galenik üblichen Zusätze - in wäßrigem Medium löst und anschließend sterilfiltriert. Geeignete Zusätze sind beispielsweise physiologisch unbedenkliche Puffer (z.B. Tromethamin) , geringe Zusätze von Elektrolyten (z.B. Natriumchlorid) , Stabilisatoren (z.B. Gluconat, Phosphate oder Phosphonate) . Das erfindungsgemäße pharmazeutische Mittel liegt in Form einer Lösung oder in lyophilisierter Form vor und wird kurz vor der Applikation mit einer Lösung Tc-99m-Pertechnetat, eluiert aus kommerziell erhältlichen Mo/Tc-Generatoren, oder einer Perrhenatlösung versetzt.
Bei der nuklearmedizinischen in vivo Anwendung werden die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel in Mengen von lxlO-5 bis 5xl04 nmol/kg Körpergewicht, vorzugsweise in Mengen zwischen lxlO"3 bis 5xl02 nmol/kg Körpergewicht dosiert. Ausgehend von einem mittleren Körpergewicht von 70 kg beträgt die Radioaktivitätsmenge für diagnostische Anwendungen zwischen 0,05 bis 50 mCi, vorzugsweise 5 bis 30 mCi pro 70 kg Applikation. Für therapeutische Anwendungen werden zwischen 5 und 500 mCi, vorzugsweise 10 bis 350 mCi appliziert. Die Applikation erfolgt normalerweise durch intravenöse, intraarterielle, peritoneale oder intertumorale Injektion von 0,1 bis 2 ml einer Lösung der erfindungsgemäßen Mittel . Bevorzugt ist die intravenöse Applikation.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung des Erfindungsgegenstandes. 26
N.N' -Bis r2-mercaptonicotincarbamoyl1 ethylendiamin .
Technetium-ggm-KQmplex
10 mg der Verbindung 5. werden in 1,0 ml Ethanol gelöst. 50 μl dieser Ligand-Lösung werden mit 250 μl Ethanol, 50 μl einer desoxygenierten wäßrigen Citratlösung (50 mg/ml), 2,5 μl einer desoxygenierten Zinn(II) -chlorid- Lösung (5 mg/ml 0,1 N HCl) und 100 μl einer Pertechnetat- Lösung (400- 1000 μCi) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird nach einer Inkubationszeit von 10 min mittels HPLC auf die Reinheit des gebildeten Tc-Komplexes untersucht: LiChrospher RP-18 Säule, 5μ, 125 x 4 mm;
Gradientenelution von 100% A nach 100% B innerhalb von 15 min (Eluent A: Acetonitril/Na-phosphat 5 mM, pH 2, 0 (10/90) ; Eluent B: Acetonitril/Na-phosphat 5 mM, pH 2,0 (75/25) ; 1 ml/min. Die radiochemische Reinheit ist > 99%.
Beispiel 2
2- (S-Triphenylmethyl)mercaptonicotinsäure 5
1,55 g wasserfreie 2-Mercaptonicotinsäure (10 mmol) suspendiert man in 10 ml Eisessig und gibt dazu etwa 2,6 g des Triphenymethylcarbinols (10 mmol) sowie 2,1 ml BF3~Diethyletherat (15 mmol) . Es wird 1-2 h bei RT gerührt, wobei sich alles klar löst. Anschließend engt man im Rotationsdampfer bei 40°C Badtemperatur ein. Der ölige Rückstand wird in Essigester gelöst. Durch Verreiben mit Diethylether kristallisiert das geschützte Nicotinsäurederivat aus. Ausbeute: 90% Analyse:
Ber. : C 75,54 H 4,82 N 3,52 0 8,05 S 8,07 Gef. : C 75,06 H 4,93 N 3,64 S 8,18 Zu einer gerührten Lösung von 6,01 g Ethylendiamin (100 mmol) in wenig wasserfreiem Dichlormethan werden bei 0°C 5,78 des aktivierten Esters 2 (200 mmol) in wenig wasserfreiem Dichlormethan und 20,2 g Triethylamin (200 mmol) zugegeben. Es wird 2 Stunden bei 0°C und weitere 24 Stunden bei RT gerührt. Anschließend wird im Vakuum eingedampft und in Dichlormethan aufgenommen. Es wird 2x mit 0,5 N HCl und gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel abgezogen. Der Rückstand wird durch Verreiben mit Diethylether kristallisiert. Ausbeute: 39% Analyse : C 59,79 H 4,35 N 9,30 O 15,93 S 10,64 C 59,61 H 4,45 N 9,24 S 10,52
N.N' -Bis \2-mercaptonicotincarbamoyll ethylendiamin 4 Zu 10 ml Trifluoressigsäure werden unter Ausschluß von Sauerstoff bei Raumtemperatur 603 mg des geschützten Nicotinsäurederivates 3_ (1 mmol) und eine Spur Anisol gegeben und 1 h unter Rückfluß erhitzt. Anschließend wird die Trifluoressigsäure im Vakuum abgezogen und der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen. Nach Waschen mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser wird mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der ölige Rückstand wird durch Verreiben mit Diethylether kristallisiert. Ausbeute: 89% Analyse:
Ber . : C 50 , 28 H 4 , 22 N 16 , 75 0 9 , 57 S 19 , 18
Ge f . : C 50 , 20 H 4 , 35 N 16 , 56 S 19 , 08 28
N.N' -Bis f2- (S-Triphenylmethyl)mercaptonicotinrarbamnyl - diamingprgpjQnsäure 8
8,91 g des Esters werden in wäßrig/ethanolischer Kalilauge (4,0 g = 72 mmol KOH, 20 ml Wasser, 40 ml Ethanol) 6 h bei RT gerührt. Anschließend wird mit Wasser verdünnt und mit halbkonz . HCl angesäuert . Der Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 90% Analyse : Ber. : C 73,76 H 4,91 N 6,49 0 7,42 S 7,43 Gef.: C 73,41 H 5,03 N 6,54 S 7,56
N.N1 -Bis r2-mercaptonicotincarbamoylldiaminopropionsäurR 9 863 mg der Säure £ (1 mmol) werden 45 Minuten bei 0°C mit 10 ml wasserfreiem HF in Gegenwart von 5 ml Anisol und
3,5 ml Diethylsulfid behandelt. Nach Abdampfen der Säure wird der verbleibende Rückstand in Ethylacetat aufgenommen und mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet . Nach Abziehen des Lösungsmittels verbleibt ein langsam kristallisierendes Öl. Ausbeute: 43% Analyse: Ber. : C 47,61 H 3,73 N 14,81 O 16,91 S 16,95 Gef. : C 47,48 H 3,87 N 15,03 S 16,46
N.N' -Bis r2-mercaptonicotincarbamovl1diaminopropionsäure.
Technetium-99m-Komplex
10 mg der Verbindung 5_ werden in 1,0 ml Ethanol gelöst. 50 μl dieser Ligand-Lösung werden mit 100 μl Ethanol,
150 μl Phosphatpuffer pH 8,5, 50 μl einer desoxygenierten wäßrigen Citratlösung (50 mg/ml), 2,5 μl einer desoxygenierten Zinn (II) -chlorid-Lösung (5 mg/ml 0,1 N HCl) und 100 μl einer Pertechnetat-Lösung (400- 1000 μCi) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird nach einer
Inkubationszeit von 10 min mittels HPLC auf die Reinheit 2- (S-Triphenylmethyl)mercaptonicotinsäure-N-hydτ-oxy- succinimidoester 6
Zu einer Lösung von 3,97 g der Säure 1 (10 mmol) , 2,80 ml Triethylamin und 1,15 g N-Hydroxysuccinimid (10 mmol) in 50 ml wasserfreiem Dichlormethan werden unter Rühren bei -10°C 2,16 g DCC (11 mmol) in 50 ml wasserfreiem Dichlormethan zugetropft und 2 Stunden bei 0°C und 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird auf -20°C gekühlt und vom ausgefallenen Harnstoff abfiltriert. Nach Abziehen des Lösungsmittels wird der Rückstand chromatographiert (Kieselgel, Dichlormethan) . Ausbeute: 64% Analyse: Ber. : C 70,43 H 4,48 N 5,66 0 12,94 S 6,48 Gef. : C 70,22 H 4,68 N 5,46 S 6,44
N.N' -Bis \2 - (S-Triphenylmethyl)mercaptonicotincarbamoyll - diaminopropionsäureethylester 7
Zu einer Suspension von 2,05 Diaminopropionsäure- ethylester Dihydrochlorid (10 mmol) in wenig wasserfreiem Dimethylformamid werden bei 0°C zunächst 9,89 g des aktivierten Esters £ (20 mmol) in wenig waserfreiem Dimethylforamid und anschließend unter Eiskühlung 5,05 g Triethylamin (50 mmol) zugegeben. Es wird 2 Stunden bei 0°C und weitere 24 Stunden bei RT gerührt. Anschließend wird im Vakuum eingedampft und in Dichlormethan aufgenommen. Es wird 2x mit 0,5 N HCl und gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel abgezogen. Der Rückstand wird chromatographiert (Kieselgel, Dichlormethan) . Ausbeute: 29% Analyse: C 74,13 H 5,20 N 6,29 0 7,18 S 7,20 C 73,83 H 5,45 N 6,34 S 7,28 30
946 mg des Amids 2JL (1 mmol) werden 45 Minuten bei 0°C mit 10 ml wasserfreiem HF in Gegenwart von 5 ml Anisol und 3 , 5 ml Diethylsulfid behandelt. Nach Abdampfen der Säure wird der verbleibende Rückstand in Dichlormethan aufgenommen und mehrmals mit Wasser gewaschen und getrocknet. Chromatographische Reinigung über Kieselgel mit Dichlormethan ergibt 272 mg eines Öls. Ausbeute: 59% Analyse : Ber. : C 54,64 H 5,90 N 15,17 0 10,40 S 13,89 Gef. : C 55,04 H 6,03 N 15,43 S 13,66
N.N' -Bis T2-mercaptonicotincarbamoyπ diamino- propionsäurehexylamiri 11. Technetium-99m-Komp]ex 10 mg der Verbindung 11. werden in 1,0 ml Ethanol gelöst. 50 μl dieser Ligand-Lösung werden mit 250 μl Ethanol, 50 μl einer desoxygenierten wäßrigen Citratlösung (50 mg/ml) , 2,5 μl einer desoxygenierten Zinn(II) -chlorid- Lösung (5 mg/ml 0,1 N HCl) und 100 μl einer Pertechnetat- Lösung (400- 1000 μCi) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird nach einer Inkubationszeit von 10 min mittels HPLC auf die Reinheit des gebildeten Tc-Komplexes untersucht: LiChrospher RP-18 Säule, 5μ, 125 x 4,6 mm; Gradientenelution von 100% A nach 100% B innerhalb von 15 min (Eluent A: Acetonitril/Na-phosphat 5 mM, pH 2,0
(10/90) ; Eluent B: Acetonitril/Na-phosphat 5 mM, pH 2,0 (75/25) ; 1 ml/min. Die radiochemische Reinheit ist > 97%.
Beispiel 4
N.N' -Bis \ 7 - (S-TriphenylmethyDmercaptonicotincarbamoyl 1 - ethylendiaminocarbonyl-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp 12 Zu einer Lösung von 863 mg der Säure £ (1 mmol) , 280 μl Triethylamin und 115 mg N-Hydroxysuccinimid (1,0 mmol) in 10 ml wasserfreiem Dichlormethan werden unter Rühren bei des gebildeten Tc-Komplexes untersucht: LiChrospher RP-18 Säule, 5μ, 125 x 4,6 mm; Gradientenelution von 100% A nach 100% B innerhalb von 15 min (Eluent A: Acetonitril/Na-phosphat 5 mM, pH 2,0 (10/90) ; Eluent B: Acetonitril/Na-phosphat 5 mM, pH 2,0 (75/25) ; 1 ml/min. Die radiochemische Reinheit ist > 97%.
Beispiel 3
N.N' -Bis \2 - (S-Triphenylmetyhl)mercaptoniπotinnarbamoyl 1 - diaminopropionsäurehexylamid 10
Zu einer Lösung von 4,32 g der Säure £ (5 mmol) , 1,5 ml Triethylamin und 575 mg N-Hydroxysuccinimid (5 mmol) in 100 ml wasserfreiem Dichlormethan werden unter Rühren bei -10°C 1,13 g DCC (5,5 mmol) in 25 ml wasserfreiem Dichlormethan zugetropft und 2 Stunden bei 0°C gerührt. Anschließend wird eine Lösung von 506 mg Hexylamin (5 mmol) in Dichlormethan innerhalb von 30 Minuten zugetropft. Es wird zunächst weitere 2 Stunden bei 0°C gerührt und 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt . Das Produkt wird vom Harnstoff abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft und in Dichlormethan aufgenommen. Nach erneuter Filtration wird 2x mit 0,5 N HCl und gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen, über
Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel abgezogen. Der Rückstand wird durch Verreiben mit Diethylether kristallisiert. Ausbeute: 81% Analyse:
Ber. : C 74,89 H 5,86 N 7,40 O 5,07 S 6,78 Gef. : C 74,71 H 5,98 N 7,31 S 6,91
N.N' -Bis T2-mercaptonicotincarbamoyll diamino- propionsänrehexvlamid 11 32
N.N' -Bis r2-mercaptonicotincarbamovl1 ethylen- diaminocarbonyl -D-Trp-Leu-Asp-I]e-Ile-Trp. Technetium-99m-Komplex
10 mg der Verbindung 12. werden in 1,0 ml Ethanol gelöst. 50 μl dieser Ligand-Lösung werden mit 100 μl Ethanol,
150 μl Phosphatpuffer pH 8,5, 50 μl einer desoxygenierten wäßrigen Citratlösung (50 mg/ml) , 2,5 μl einer desoxygenierten Zinn(II) -chlorid-Lösung (5 mg/ml 0,1 N HCl) und 100 μl einer Pertechnetat-Lösung (400- 1000 μCi) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird nach einer
Inkubationszeit von 10 min mittels HPLC auf die Reinheit des gebildeten Tc-Komplexes untersucht: LiChrospher RP-18 Säule, 5μ, 125 x 4,6 mm; Gradientenelution von 100% A nach 100% B innerhalb von 15 min (Eluent A: Acetonitril/Na-phosphat 5 mM, pH 2,0 (10/90) ; Eluent B: Acetonitril/Na-phosphat 5 mM, pH 2,0 (75/25) ; 1 ml/min. Die radiochemische Reinheit ist > 96%.
Beispiel 5
Diaminobernsteinsäureethylester 14
In die Mischung von 5 g Diaminobernsteinsäure (34 mmol) und 100 ml Ethanol werden unter Rühren 1,5 h trockenes HCl-Gas eingeleitet und 6 h zum Sieden erhitzt. Nach
Abkühlung auf Raumtemperatur wird das Lösungsmittel abgezogen. Es verbleiben 6,97 g weiße Kristalle.
Ausbeute: 74%
Analyse: Ber. : C 34,67 H 6,55 N 10,11 O 23,09
Gef. : C 34,82 H 6,71 N 9,96
N.N' -Bis \ 2 - Lq-Tri.phenylmethyl)mercaptonicotincarbamoyll diamino-bernsteinsäureethylester 15 Zu einer gerührten Lösung von 2,77 g 2JL (10 mmol) in wenig wasserfreiem THF bei 0°C 744 mg des aktivierten -10°C 211 mg DCC (1,1 mmol) in 5 ml wasserfreiem Dichlormethan zugetropft und 2 Stunden bei 0°C gerührt. Anschließend wird eine Lösung von 845 mg H2N-D-Trp-Leu- Asp-Ile-Ile-Trp-COOH (1 mmol) und DMF innerhalb von 30 Minuten zugetropft. Es wird zunächst weitere 2 Stunden bei 0°C gerührt und 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt . Das Produkt wird vom Harnstoff abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft und in Dichlormethan aufgenommen. Nach erneuter Filtration wird 2x mit 0,5 N HCl und gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel abgezogen. Der Rückstand wird durch Verreiben mit Diethylether kristallisiert. Ausbeute: 36% Analyse:
Ber . : C 68 , 94 H 5 , 96 N 9 , 95 0 11 , 36 S 3 , 80
Gef . : C 70 , 02 H 6 , 08 N 9 , 78 S 3 , 52
N.N' -Bis r∑-mercaptonicotincarbamoyll ethylen- diaminocarbonyl-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp 13
1,69 g des Peptides 12 (1 mmol) wird 45 Minuten bei 0°C mit 20 ml wasserfreiem HF in Gegenwart von 5 ml Anisol und 3 , 5 ml Diethylsulfid behandelt. Nach Abdampfen der Säure wird der verbleibende Rückstand in 5% Essigsäure aufgenommen, mehrmals mit Diethylether gewaschen und lyophilisiert. Chromatographische Reinigung über Sephadex G-10 mit 0,2 M Essigsäure ergibt 579 mg eines Öls. Ausbeute: 48% Analyse: Ber. : C 58,79 H 6,02 N 13,94 O 15,93 S 5,32 Gef. : C 58,39 H 6,31 N 13,88 S 5,22 34
Analyse:
Ber. : C 72,95 H 4,54 N 6,30 0 9,00 S 7,21
Gef. : C 72,65 H 4,67 N 6,11 S 7,44
N.N1 -Bis \2 - (S-Triphenylmethyl)mercaptonicotincarbamoyl 1 - 2.3-diamino-2- Tcarbonyl (Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe) - propionsäure 18
Zu einer Lösung von 889 mg des Säureanhydrids und 505 mg Triethylamin in wasserfreiem Dimethylformamid wird die Lösung von 775 mg des Peptids H2N-Val-Tyr-Ile-His-Pro-
Phe-COOH in wenig Dimethylformamid langsam zugegeben und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und der Rückstand durch Verreiben mit Diethylether kristallisiert . Ausbeute: 31% Analyse:
Ber. : C 67,85 H 5,69 N 10,10 0 12,50 S 3,85 Gef. : C 67,54 H 5,78 N 10,01 S 3,47
N.N' -Bis \2-mercaptonicotincarbamoyll -2.3-diamino-2- Tcarbonyl (Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe) 1propionsäure 19 1,66 g des Peptides 12. (1 mmol) wird 45 Minuten bei 0°C mit 20 ml wasserfreiem HF in Gegenwart von 5 ml Anisol und 3,5 ml Diethylsulfid behandelt. Nach Abdampfen der Säure wird der verbleibende Rückstand in 5% Essigsäure aufgenommen und mehrmals mit Diethylether gewaschen und lyophilisiert. Chromatographische Reinigung über Sephadex G-10 mit 0,2 M Essigsäure ergibt 636 mg eines Öls. Ausbeute: 54% Analyse:
Ber. : C 57,03 H 5,64 N 14,25 O 17,64 S 5,44 Gef. : C 57,23 H 5,71 N 14,18 S 5,23
N.N' -Bis \2-mercaptonicotincarbamoyll ethylen- diaminocarbonyl-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp. Technetium-99m-Komrjlex Esters (20 mmol) in wenig wasserfreiem THF und 2,02 g Triethylamin (20 mmol) zugegeben. Es wird 2 Stunden bei 0°C und weitere 24 Stunden bei RT gerührt. Anschließend wird im Vakuum eingedampft und in Dichlormethan aufgenommen. Es wird 2x mit 0,5 N HCl gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel abgezogen. Der Rückstand wird durch Verreiben mit Diethylether kristallisiert. Ausbeute: 41% Analyse:
Ber. : C 72,33 H 5,23 N 5,82 0 9,97 S 6,66 Gef. : C 72,09 H 5,43 N 5,76 S 6,46
N.N' -Bis \2 - (S-Triphenylmethyl)mercaptonicotincarbamoyll - diamino-bernsteinsäure 16
5,87 des Esters werden in wäßrig/ethanolischer Kalilauge
(4,0 g = 72 mmol KOH, 20 ml Wasser, 40 ml Ethanol) 6 h bei RT gerührt. Anschließend wird mit Wasser verdünnt und mit halbkonz. HCl angesäuert. Der Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet.
Ausbeute: 87%
Analyse:
Ber. : C 71,50 H 4,67 N 6,18 0 10,58 S 7,07 Gef. : C 70,94 H 4,85 N 6,16 S 7,11
N.N1 -Bis \2 - (S-Triphenylmethyl)mercaptonicotincarbamoyl 1 - diamino-ber-πsteinsäureanhydrid 17
Man erhitzt 3,32 g (5 mmol) des Bernsteinsäurederivats und 1,17 g (15 mmol) Acetylchlorid solange unter Rückfluß bis das Bernsteinsäurederivat vollständig in Lösung gegangen ist . Der Überschuß an Acetylchlorid wird im Vakuum abgezogen und der Rückstand über Phosphorpentaoxid im Vakuum getrocknet und aus Dichlormethan/Petrolether umkristallisiert. Ausbeute: 81% 36
Patentansprüche
Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
M (I)
worin
M ein Radioisotop von Tc oder Re und L einen Liganden der allgemeinen Formel (II)
Figure imgf000036_0001
( ι ι )
bedeutet, worin
R1 und R3 gleich oder unterschiedlich sind und jeweils für ein Wasserstoffatom und/oder für einen verzweigten oder unverzweigten C^ - ζ-Alkylrest oder gemeinsam einen gegebenenfalls substituierten, gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen oder aromatischen C^ - β-Zyklus stehen,
R2 und R4 gleich oder unterschiedlich sind und jeweils für ein Wasserstoffatom, für einen verzweigten oder unverzweigten C -g-Alkylrest oder einen Rest -CO-R7, worin
R7 eine Hydroxyl- eine verzweigte oder geradkettige, zyklische oder polyzyklische Cι_3n- Alkoxy-, Alkenyloxy-, Polyalkenyloxy- , mg der Verbindung 12. werden in 1,0 ml Ethanol gelöst. 50 μl dieser Ligand-Lösung werden mit 100 μl Ethanol, 150 μl Phosphatpuffer pH 8, 5, 50 μl einer desoxygenierten wäßrigen Citratlösung (50 mg/ml) , 2,5 μl einer desoxygenierten Zinn(II) -chlorid-Lösung (5 mg/ml 0,1 N HCl) und 100 μl einer Pertechnetat-Lösung (400- 1000 μCi) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird nach einer Inkubationszeit von 10 min mittels HPLC auf die Reinheit des gebildeten Tc-Komplexes untersucht: LiChrospher RP-18 Säule, 5μ, 125 x 4,6 mm; Gradientenelution von 100% A nach 100% B innerhalb von 15 min (Eluent A: Acetonitril/Na- phosphat 5 mM, pH 2,0 (10/90) ; Eluent B: Acetonitril/Na-phosphat 5 mM, pH 2,0 (75/25) ; 1 ml/min. Die radiochemische Reinheit ist > 94%.

Claims

38
Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R3 und R4 unterschiedlich sind und R3 für ein Wasserstoffatom und R4 für einen Rest -CO-R7, worin
R7 eine Hydroxyl-, eine verzweigte oder geradkettige Cχ_30-Alkoxy- oder eine N(RaRb)- Gruppe bedeutet, wobei
Ra und R*-1 gleich oder verschieden sind und/oder ein Wasserstoffatom, einen verzweigten oder geradkettigen, zyklischen oder polyzyklischen C^.30-Alkylrest darstellen, der gegebenenfalls mit Hydroxy-, Oxy-, Oxo-, Carboxy-, Aminocarbonyl-, Alkoxycarbonyl-, Amino-, oder Alkoxygruppen mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen substituiert ist und/oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome aus der Reihe O, N, S unterbrochen und/oder substituiert ist, stehen.
4. Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R3 und R4 gleich sind und gemeinsam ein Carbonsäureanhydrid bilden.
5. Liganden der allgemeinen Formel (II)
Figure imgf000038_0001
( M ) Alkinyloxy- , Polyalkinyloxy- , Aryloxy- , Alkylaryloxy- oder Arylalkyloxygruppe, die gegebenenfalls mit Hydroxy-, Oxy-, Oxo-, Carboxy- , Aminocarbonyl- , Alkoxycarbonyl- , Amino-, Aldehyd- oder Alkoxygruppen mit bis zu 20
Kohlenstoffatomen substituiert ist und/oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome aus der Reihe O, N, S, P, As, Se unterbrochen und/oder substituiert ist und gegebenenfalls gemeinsam ein Carbonsäureanhydrid bilden oder eine N(RaRb) -Gruppe, wobei Ra und R gleich oder verschieden sind und/oder ein Wasserstoffatom, einen verzweigten oder geradkettigen, zyklischen oder polyzyklischen Cι_3Q-Alkyl- , Alkenyl-,
Polyalkenyl, Alkinyl-, Polyalkinyl- , Aryl-, Alkylaryl- oder Arylalkylrest darstellen, der gegebenenfalls mit Hydroxy-, Oxy-, Oxo-, Carboxy-, Aminocarbonyl-, Alkoxycarbonyl-, Amino-, Aldehyd- oder Alkoxygruppen mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen substituiert ist und/oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome aus der Reihe 0, N, S, P, As, Se unterbrochen und/oder substituiert ist, darstellt, stehen,
R5 und R6 gleich oder unterschiedlich sind und jeweils für ein Wasserstoffatom, für einen verzweigten oder unverzweigten Cx.g-Alkylrest oder für eine Schwefelschutzgruppe stehen.
2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R1 und R2 für ein Wasserstoffatom stehen. 40
diese im Falle von Carboxyl- oder Aminogruppen enthaltenden Substanzen wie natürlich vorkommende oder modifizierte Oligonukleotide, bei denen der Abbau durch natürlich vorkommende Nukleasen verhindert oder erschwert ist, Peptiden, Proteinen, Antikörpern oder deren Fragmente amidiseh oder im Falle von Hydroxylguppen enthaltenden Substanzen wie Fettalkoholen esterartig oder im Falle von Aldehydgruppen enthaltenden Substanzen imidisch vorliegt.
10. Konjugate nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die sich in erkranktem Gewebe anreichernden Substanzen Peptide wie Endotheline, Teilsequenzen von Endothelinen, Endothelin-Analoga, Endothelin-
Derivate, Endothelin-Antagonisten oder Angiotensine, Teilsequenzen von Angiotensinen, Angiotensin-Analoga, Angiotensin-Derivate und Angiotensin-Antagonisten sowie chemotaktische Peptide bedeuten.
11. Konjugate nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide die folgenden Sequenzen oder Teile davon
i I
Cys-Ser-Cys-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr
1 1
Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
I 1
Cys-Ser-Cys-Ser-Ser-Trp-Leu-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr-
1 1
Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp, worin R1, R2, R3, R4, R5 und R6 jeweils die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben.
6. Liganden nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß R1 und R2 für ein Wasserstoff stehen.
7. Liganden nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet^3 und R4 unterschiedlich sind und R3 für ein Wasserstoffatom und R4 für einen Rest -CO-R7, worin
R7 eine Hydroxyl-, eine verzweigte oder geradkettige Cι_3Q-Alkoxy- oder eine N(RaR^)-
Gruppe, wobei Ra und ΉP gleich oder verschieden sind und/oder ein Wasserstoffatom, einen verzweigten oder geradkettigen, zyklischen oder polyzyklischen Cι_30-Alkylrest darstellen, der gegebenenfalls mit Hydroxy-, Oxy-, Oxo-, Carboxy-, Aminocarbonyl-,
Alkoxycarbonyl-, Amino- oder Alkoxygruppen mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen substituiert ist und/oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome aus der Reihe 0, N, S unterbrochen und/oder substituiert ist, darstellt, stehen.
8. Verbindungen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß R3 und R4 gleich sind und gemeinsam ein
Carbonsäureanhydrid bilden.
9. Konjugate, enthaltend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I und/oder II) und sich selektiv in erkranktem Gewebe anreichernden Substanzen, wobei zwischen diesen eine kovalente Bindung besteht und 42
Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe,
Arg- Val -Tyr -Ile -His -Pro -Phe,
Arg-Val -Tyr- Ile -His -Pro- Phe -His -Leu,
Sar-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala,
For-Met-Leu-Phe,
For-Met-Leu-Phe-Lys,
die Teilsequenzen
His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Phe-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe,
Val-Tyr-Ile-His-Pro,
oder die cyclischen Aminosäuresequenzen
Cyclo- (DTrp-DAsp-Pro-DVal-Leu) ,
Cyclo- (DGlu-Ala-alloDIle-Leu-DTrp)
aufweisen.
12. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) , dadurch gekennzeichnet, daß man Technetium-99m oder Re in Form von Pertechnetat Cys-Thr-Cys-Phe-Thr-Tyr-Lys-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr-
Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Cys-Ser-Ala-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Ala-Val-Tyr-
Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
I 1
Cys-Ser-Cys-Lys-Asp-Met-Thr-Asp-Lys-Glu-Cys-Leu-Asn-
1 1
Phe-Cys-His-Gln-Asp-Val-Ile-Trp,
I I
Ala-Ser-Cys-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr- Phe-Ala-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Ala-Ser-Ala-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Ala-Val-Tyr- Phe-Ala-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Cys-Ser-Cys-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr- Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Cys-Thr-Cys-Phe-Thr-Tyr-Lys-Asp-Lys-Glu-Ala-Val-Tyr- Phe-Ala-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Cys-Val-Tyr-Phe-Cys-His-Gln-Asp-Val-Ile-Trp,
N-Acetyl-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Ala-Val-Tyr-Phe-Ala-His- Gln-Asp-Val-Ile-Trp,
Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu,
Ac-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu, 44
Figure imgf000044_0001
( ι ι )
worin R1, R2, R3 , R4, R5 und R6 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben,
umsetzt
und gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppen in an sich bekannter Weise abspaltet.
14. Kit zur Herstellung von Radiopharmaka, bestehend aus einer Verbindung der allgemeinen Formel (II) gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 oder einem Konjugat gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11 sowie einem Reduktionsmittel und gegebenenfalls einem
Hilfsliganden, die in trockenem Zustand oder in Lösung vorliegen, sowie einer Gebrauchsanleitung mit einer Reaktionsvorschrift zur Umsetzung der beschriebenen Verbindungen mit Technetium-99m oder Re in Form einer Pertechnetatlösung oder Perrhenatlösung.
15. Radiopharmazeutische Zusammensetzung zur nicht invasiven in vivo Darstellung von Organen, Rezeptoren und rezeptorhaltigem Gewebe und/oder von atherosklerotischen Plaques, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder ein Konjugat gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11 sowie gegebenenfalls mit den in der Galenik üblichen Zusätzen enthält, wobei die Verbindung in einem Kit nach Anspruch 14 mit Technetium-99m oder Re oder Perrhenat in Gegenwart eines Reduktionsmittels und gegebenenfalls eines Hilfsliganden mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (II)
RJ 4
Figure imgf000045_0001
( ι ι )
worin R1, R2, R3, R4, R5 und R6 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben,
umsetzt
13. Verfahren zur Herstellung von Liganden der allgemeinen Formel (II) , dadurch gekennzeichnet, daß man S-geschützte Nicotinsäure in an sich bekannter Weise in einem aprotischen Lösungsmittel unter Zusatz einer geeigneten Base in einen gegebenenfalls aktivierten Ester überführt und anschließend mit Verbindungen der allgemeinen Formel (III)
H2N-CR1R2-CR3R4-NH2
(III)
worin R1, R2, R3 und R4 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben,
bei Temperaturen von -20° bis 180°C zu Verbindungen der allgemeinen Formel (II) in Form einer Pertechnetat- oder Perrhenatlösung zubereitet wird.
16. Verfahren zur radiodiagnostischen Untersuchung, gekennzeichnet dadurch, daß eine radiopharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15 in einer Menge von 0,1 bis 30 mCi, bevorzugt von 0,5 bis 10 mCi pro 70 kg Körpergewicht einem Patienten verabreicht und die vom Patienten abgegebene Strahlung aufgezeichnet wird.
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