WO1997010840A1

WO1997010840A1 - Medicament antisens anti-inflammatoire

Info

Publication number: WO1997010840A1
Application number: PCT/JP1996/002682
Authority: WO
Inventors: Shuji Sato; Takeshi Goto; Akira Wada; Yousuke Suzuki; Shinichi Kawai; Yutaka Mizushima
Original assignee: Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc.; Ltt Institute, Co., Ltd.
Priority date: 1995-09-18
Filing date: 1996-09-18
Publication date: 1997-03-27
Also published as: JPH09176038A; AU7000496A

Description

明細書抗炎症性ァンチセンス薬物技術分野

この発明は抗炎症性ァンチセンス薬物に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、慢性関節リウマチ、歯周囲炎、腎炎、潰瘍性大腸炎、動脈硬化症、乾癬などの炎症性疾患、敗血症性ショック、クローン病およびエイズなどの病態. 難治性肝疾患や肝移植における病態に関与する生理活性物質の遺伝子発現を特異的にブロックするアンチセンス薬物に関するものである。背景技術

従来より、染色体 DN Aの機能発現を制御する方法として、アンチセンス法が知られている。このアンチセンス法は、特定のタンパク質合成情報をコードしている染色体 DN Aから転写される mRNA (センス鎖）と一部または全部にわたつて相補的な塩基配列を持つ DNAまたは RN A (アンチセンス鎖）を用い、センス鎖とアンチセンス鎖が互いの相補性により結合することを利用して mRNA からのタンパク質合成情報を遮断する方法である。なお、主として安定性の観点から、これまでの例ではセンス鎖との結合配列としてアンチセンス D NAが用いられることが多い。

現在、 m R N Aの機能を遮断するためには、その全配列に相補的なアンチセンス鎖は必要とはされず、 mRNAからの夕ンパク質発現を制御する一部配列をターゲティング部位とすることが有効であると考えられている。すなわち、このようなターゲティング部位としては、 ①スプライシング部位、 ②キヤッビング部位. ③ A UGィニシエーションコドン（initiation codon)部位近傍が選択されることが多く、特に A U Gイニシエーションコドン部位については比铰的高いアンチセンス効果が得られている。 mRNAの立体構造も考慮すべきで、一般にはループ構造、あるいはバルジ構造といった一本鎖領域にアンチセンス DNAは結合しやすいと考えられている。ところで、天然物を起源とする医薬品の歴史は、科学の進歩とともに急激な変換を遂げてきており、新世紀に向けて創薬の潮流の一つは確実に遺伝子を対象としたものへと流れ出ている。ヒト遺伝子の全塩基配列を解明することを目的とした「ヒ卜ゲノムプロジヱクト」の進行いかんでは、全てのヒ卜遺伝子を含む完全なゲノム配列が 2010年頃には決定されると言われている。この膨大な情報は、遺伝子の欠損あるいは異常発現が関与すると考えられる疾患の解析研究に拍車をかけ、治療の概念を塗り替えることになると考えられている。こうした研究の機運を背景に、遺伝子療法ゃァンチセンス療法が新世紀の療法として脚光をあびるよう（こなってきてレ、る (Cook, S.T.， Ann. Rev. Pharm. 32, 329— 376, 1992; Tidd, D. M. , Anticancer Res. 10, 1169-1182, 1990) 。

遗伝子治療はバイォェシックス等の問題により、その適応は単-一遺伝子病や癌, A I D Sなどに限られている。これに対して、アンチセンス D N Aはあくまでも従来の合成医薬品と同様の化合物として捕らえることができ、しかも in vitroのみならず in vivoでの効果も報告されるようになり、その可能性の探索は新しい研究段階に入ってきている。

アンチセンス D N Aの医薬品としての可能性が提案されたのは、. 合成ァンチセンス D N Aを外部から加え、ラウス肉腫ウィルスの形質耘換を抑制したという 1 9 7 8年の報告が先駆けである（Zamecnik P. C. and Stephenson M. L. , Proc.

Nat 1. Acad. Sci. USA. 75, 280-284， 1978) 。ポリア二オンである D N Aが細胞内に取り込まれることが疑問視されていたが、その後、アンチセンス D N Aが内在性遺伝子の働きを遮断したことが培養細胞系で次々と報告され、医薬品としての期待が高まってきた。しかし、自然界に存在するホスホジエステル型 D N A

(以下、 D—オリゴと略記する）は、ヌクレアーゼなどにより短時間で分解されてしまうという医薬品としては致命的な欠点をもっている。このため、生物学的安定性をあげるために D N Aを化学修飾することが試みられているが、なかでもホスホロチォェ一卜型のヌクレオチド（以下、 S—オリゴと略記する）が安定で高い生物活性を得ている。現在、臨床試験に入っているものはこのタイプである ₍ 医薬品としてのアンチセンス D N Aの条件は、 ① mRN Aに対して塩基配列特異性をもつこと、 ②安定に細胞内へ輸送されること、 ③ mR N Aのタ一ゲティング部位に接近でき、 ④安定な二重鎖を形成できること、 ⑤一定時間細胞内で安定に存在できること、 ⑥毒性、副作用がないこと、 ⑦ある程度代謝されること、 ⑧ 経済的であること、などがあげられる。なかでも安定な形で細胞内へ輸送されることが必須条件となる。 D N Aまたは R N Aは、ヌクレアーゼ（以下、各々 D Nase および R Nase と略記する）などにより定量的に分解されてしまい、血中半減期は 1 分以内ときわめて短い。安定化のために、特に、リン酸基の酸素原子の 1 つを S—に置換した S —オリゴゃ C H ₃ 基に置換したメチルフォスフ才ネ一卜が主流となっている。他には、糖部分の修飾や 3 ' と 5 ' 末端の修飾、 2 ' 位の修飾体も考えられている（Goodchild. J. Bioconjug C em. 1， 165-187, 19 90) 。また、最近ではリン酸結合をぺプチド結合に変えた Peptide Nucleic Acid

( P N A ) が合成されており、アンチセンス D N Aよりも D N Aや R N Aに対する結合が強く、ヌクレアーゼに対して耐性であつたと報告されているが（Hanvey, L. et al. , Science 258, 1481-1485 (1992)) 、生物活性の報告はまだ存在しない。 3 ' 末端に塩基対を形成しループ構造を形成するようにデザインされたものや、ダンベル型のものゃ閉環構造のものも安定であると報告されている。

しかしながら、これら修飾体は、それらの合成に関与するコストを始め、さらにはそれらの精製が非常に困難であるなどの問題が多く、医薬品への応用は考えにくいのが現状である。また、これまでの研究では、上記のとおり S —オリゴが盛んに用いられているが、この型のオリゴヌクレオチドはセンス鎖への結合特異性（binding specificity) が低いことも大きな問題としてあげられる。このような意味から、アンチセンス D N Aを医薬へ応用する場合には、必然的に D—オリゴが最も適したものであると考えられている。

さらにまた、当初から D N A等の核酸の低い膜透過性は問題視されており、上記のホスホジェチル型ォリゴヌクレオチドの細胞内安定性の問題も考慮すると、今後のアンチセンス医薬品としての鍵は細胞内導入法（デリバリ一法）にあるといっても過言ではない。培養系での成功例からも分かるように、 D N A等のオリゴヌクレオチドが細胞内に取り込まれることは間違いなく、主としてェンドサイトーシスで取り込まれ、約 8 O k D aの膜タンパク質が推定レセプ夕一として考えられている。修飾オリゴヌクレオチドも主としてエンドサイ卜一シスにより取り込まれるが詳細は不明な点が多く、依然として細胞内への移行量は少ない。低い膜透過性を增強させるためのデリバリ一法が考案されているが、毒性などの問題も含めて解決すべき点が残っている。

一方、炎症性疾患の治療には、近年、ステロイド剤および非ステロイド系抗炎症剤が多く使用されている。ステロイド剤は各種の炎症性疾患における諸症状を顕著に改善するが、投与するにつれて次第にその効果が減少すること、副作用として冠動脈不全、消化性潰瘍、白内障、敗血症、易感染症などを誘発する危険があるなどの問題点を有している。また、非ステロイド系抗炎症剤は一時的に炎症症状を抑制するが、炎症性疾患を根本から治療するものではない。従って、効力が強く、その治療効果が持続的でかつ安全性の高い炎症性疾患治療剤の開発が望まれているのが現状である。

特に、慢性関節リウマチは、関節滑膜を病変の主座とする原因不明の慢性炎症性疾患である。病変部位は、時に関節滑膜に止まらず、関節滑膜に初発した炎症は、やがて钦骨、骨の破壊を引き起こし、ついには全身の関節組織破壊へと至る従来の慢性関節リゥマチの治療には経験的な要素が強く作用し、その第一選択薬としては非ステロイド系消炎鎮痛薬が用いられてきた。しかし、最近では、慢性関節リゥマチの治療における非ステロィド系消炎鎮痛薬の役割は縮小しつつある _c その投与によって鎮痛作用は期待できるものの、非ステロイド系消炎鎮痛薬には抗リウマチ作用がないということが共通認識となってきており、しかも、消化管障害、腎機能低下などに代表される非ステロイド系消炎鎮痛薬の副作用が、臨床上、無視できないことが明らかになつてきたためである。

このような状況の中で、メ卜卜レキサ一卜をはじめとして、ミゾリビン、 F K 5 0 6等の新たな抗リウマチ薬の早期使用が行われつつある。

なお、慢性関節リゥマチをはじめとする各種炎症性疾患については以下のメ力ニズム等が知られている。すなわち、炎症は起炎物質の侵襲に対する恒常性維持のための生体反応である。炎症反応には様々な細胞が動員されるが、サイトカインはこれら細胞間のメディェ一ターの一つであり、炎症反応において重要な役割を担っている。様々なサイトカインが炎症部位で産生され、サイ i、力インカスケ - ドを形成しながら炎症巣ならびに全身における炎症反応を調節している。これらのサイトカインのうち、腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor:以下、 T N F と略記する）はマクロファージ等の細胞が産生するサイ卜力インである。この T N Fは当初は腫瘍に障害を与える物質として見出された力 <、最近では広く炎症を通した生体防御反応の係わるサイトカインとして理解されつつある。 TN Fの遺伝子は、ヒ卜、ブ夕、ゥシ、ゥサギ、マウス等の広範な哺乳動物でその存在が明らかになつており、それらの 1次構造も決定されている。それによると、各動物間でのアミノ酸配列は、 80%前後の相同性が保存されており、 TN Fが生体にとつて極めて重要な生理活性物質であることを示唆している。ヒ卜 TN F前駆体は, 233 個のアミノ酸残基をもち、成熟型では 155 個または 157 個のアミノ酸から構成されている。分子量は 17kDa であるが、生体内では 45kDaの 3量体を形成している。マウスの TN Fには糖鎖が存在すると考えられている力 <、ヒ卜には存在せず、またマウスの T N Fにおいても糖鎖はその活性発現に必須ではない。

TN Fは、 B C Gの感作された動物に、リポ多糖 aipopolysaccharide: 以下, L P Sと略記する）を接種することにより発現する。実験的には、種々の方法でマクロファージの TN F産生準備状態を作りだすことができ、適当な誘因刺激（例えば、菌体ゃ L P S等の菌体成分）により、 2時間前後をピークとする T N F の産生を導くことができる。また、ヒ卜マクロファージ系細胞（例えば、 U937株等）を用いた in vitro 実験系においても T N Fの産生を再現することができる _c

TN Fが作用する細胞は多岐にわたる。例えば、マクロファージから産生された TN Fは、好中球や血管内皮細胞に働き、炎症の初発からの進展をもたらす。その後、線維芽細胞や肝細胞に作用することによりその炎症は終息、修復へ向かうことになる。炎症反応は、多くの細胞とメディエーターが相互に関連しつつ進行し、通常は一定の速度で消失するが、抗原となるべき物質が存在し、その量が一定以上であれば、その情報は次には免疫系へと受け渡される。 TN Fは、このように非特異的生体防御反応から特異的防御反応への移行にも関与している。これら以外にも、 TN Fは例えば骨芽細胞、破骨細胞、脂肪細胞、上皮細胞、下垂体、そして特に滑膜細胞にも作用することが知られている。

また、慢性関節リゥマチ等の炎症性疾患の病因としては、多彩な免疫応答系 - 炎症反応の異常が挙げられており、例えば、 T N Fの一つである T N F - α以外にも、 c-fos 等の癌遺伝子、ヒ卜インターロイキン— 1 β (以下、 I L — 1 βと略記する）や I L 一 6等のサイトカインが関与していると考えられてもいる。そしてさらに、近年では、炎症性疾患のメデイエ一夕一の一つとしてプロスタグランジン（以下、 P Gと略記する）とその合成酵素の役割が注目されている。すなわち、 1 9 7 1年に Vane等によつてァスピリン等の非ステロィド系消炎鎮痛薬の作用機序が P G合成抑制にあることが報告されて以来、非ステロイド系消炎鎮痛薬の研究は P G合成抑制との関係で進められてきた。しかしながら、近年になつて、 P Gを生合成する酵素シクロォキシゲナーゼ（以下、 C 0 Xと略記する）には 2種類のものがあり、これまで検討されてきた C 0 Xは主として、生理的にすでに存在している C 0 X— 1 と呼ばれる酵素であり、これとは别に、種々の刺激ゃサイトカイン等によつて遊離細胞などで生産され、炎症や組織阻害に大きく関係する C O X— 2が存在することが見いだされた（Vane, J. , Nature, 367, 2 15-216, 1994: Xie. W. , Robertson, D. , and Simmons, D. , Drug Devel. Res.， 25, 249-265， 1992) 。この C O X— 2 は、その遺伝子も C O X— 1 とは異なり - I L一 1 の剌激などにより新たに産生される酵素である。例えば、 Lee 等の報告によれば、マクロファージ中の C 0 X - 1 は L P Sの刺激によつても不変であり , 刺激や炎症にかかわらず一定の濃度で検出されるが、 C 0 X - 2 は正常状態ではその遺伝子もほとんど証明されず、 L P Sの刺激により増加し、しかもデキサメタゾンによりその発現が完全に抑制される。近年、ヒト C 0 X— 2の c D N Aがクローン化され、これによつて炎症性細胞における C 0 X— 2のき生の規則性が解明されつつある。

最近の分子生物学、免疫学等の進歩によって、慢性関節リウマチをはじめとする各種炎症性疾患の病因、病態の解析が上記のとおりに急速に進展しつつあり、これらの知見に基づいた抗サイ卜カイン療法、抗接着分子療法、モノクローナル抗体療法、経口ペプチド療法、 T細胞ワクチネーシヨンなど、より理論的な裏打ちのある新たな治療法が開発されつつある。

一方、アンチセンス法が対象とするヒ卜疾患としては、その原因とターゲット遺伝子との関係が明瞭であるということから、ウイルス疾患がその筆頭に挙げられており、初期のァンチセンス療法は、サイトメガロウィルス、ヘルぺスウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、パピ口一マウィルス、水泡性口内炎ウィルス（V S V ) 等による感染症に対して効果を上げている。また、慢性骨髄性白血病の原因である転座した b c r- ab l遺伝子や、あるいは炎症または癌転移に影響している接着分子の一つである I C A M— 1 を対象としたアンチセンス療法も効果を上げている。

しかしながら、一般的には、疾患の原因となる遺伝子が複数あるよりは、アンチセンス法の特性上、病因と遺伝子が 1 ： 1 で対応するときに最大の効果が期待できる。従って、炎症性疾患の治療にアンチセンス法を応用するためには、病態の的確な把握とともに、原因遺伝子の同定が不可欠である。そして、さらにはその遺伝子の発現メ力二ズムを特定し、発現遮断のための適切な部位を選択することも必要である。発明の開示

この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、慢性関節リゥマチ、歯周囲炎、腎炎、潰瘍性大腸炎、動脈硬化症、乾癬などの炎症性疾患、敗血症性ショック、クローン病、エイズなどに関与する生理活性物質の発現を特異的にブロックするアンチセンス D N Aを主成分とする新しい抗炎症性薬物を提供することを目的としている。

この発明は、上記の課題を解決するための第 1 の発明として、合成ポリアミノ酸またはその誘導体と、ヒ卜炎症性疾患に関与する生理活性物質をコ一ドする m R N Aの一部もしくは全塩基配列に相補的なァンチセンス ' オリゴヌクレオチドとの複合体からなることを特徴とする抗炎症性ァンチセンス薬物を提供する。この第 1 の発明の抗炎症性ァンチセンス薬物においては、上記の合成ポリァミノ酸が、リジン残基とセリン残基との繰り返し配列からなる核酸結合体であること、またその誘導体が、合成ポリアミノ酸のポリェチレングリコール（以下、 P E Gと略記する）プロック修飾体であることを好ましい態様としている。

またこの発明は、第 2 の発明として、合成ポリアミノ酸またはその誘導体と、ヒ卜 I L 一 1 /3をコードする m R N Aの一部もしくは全塩基配列に相補的なァンチセンス · オリゴヌクレオチドとの複合体からなることを特徴とする抗炎症性ァンチセンス薬物を提供する。この第 2の発明においては、上記の I L— 1 /3をコ ― ドする mRN Aの一部もしくは全塩基配列に相補的なァンチセンス . オリゴヌクレオチドが、配列番号 2または 4の一部もしくは全塩基配列を有するォリゴヌクレオチドであることを好ましい態様としている。

さらに第 3の発明として、合成ポリアミノ酸またはその誘導体と、ヒ卜 T N F をコードする mR N Aの一部もしくは全塩基配列に相補的なァンチセンス . オリゴヌクレオチドとの複合体からなることを特徴とする抗炎症性ァンチセンス薬物を提供する。この第 3の発明においては、ヒ卜 TN Fが、ヒト TN F— αであり、このヒ卜 TN F— αをコードする mR N Aの一部もしくは全塩基配列に相捕的なアンチセンス ' オリゴヌクレオチドが、配列番号 6、配列番号 8または配列番号 1 0のいずれかの一部もしくは全塩基配列を有するォリゴヌクレオチドであることを好ましい態様としている。

さらにまた、第 4の発明として、合成ポリアミノ酸またはその誘導体と、一連の P G E ₂ 合成酵素をコ一ドする mRN Aの一部もしくは全塩基配列に相補的なアンチセンス · オリゴヌクレオチドとの複合体からなることを特徴とする抗炎症性アンチセンス薬物を提供する。この第 4の発明においては、 P G E ₂ 合成酵素が、 C OX— 2であり、この C 0 X— 2をコードする m R N Aの-一部もしくは全塩基配列に相補的なァンチセンス · オリゴヌクレオチドが、配列番号 1 2の一部もしくは全塩基配列を有するォリゴヌクレオチドであることを好ましい態様としている。図面の簡単な説明

図 1 は、この発明に用いることができる P L Sの化学式（ a ) および P L S P の化学式（ b ) である。

図 2は、配列番号 2の D N A鎖を用いた抗炎症性ァンチセンス薬物および比絞例による I L - 1 /3の産生抑制効果を示すグラフ図である。

図 3は、配列番号 4の D N A鎖を用いた抗炎症性ァンチセンス薬物および比較例による I L一 1 3の産生抑制効果を示すグラフ図である。

図 4は、配列番号 2の D N A鎖を用いた抗炎症性ァンチセンス薬物および比較例による I L 一 1 ^の産生抑制効果を示すグラフ図である。

図 5 は、配列番号 6 の D N A鎖を用いた抗炎症性アンチセンス薬物および比較例による T N F — αの産生抑制効果を示すグラフ図である。

図 6 は、配列番号 8 または 1 0 の D Ν Α鎖を用いた抗炎症性アンチセンス薬物および比較例による T N F - αの産生抑制効果を示すグラフ図である。

図 7 は、配列番号 6の D Ν Α鎖を用いた抗炎症性ァンチセンス薬物および比較例による T N F— αの産生抑制効果を示すグラフ図である。

図 8 は、配列番号 1 1 または 1 2 の D Ν Α鎖を用いた抗炎症性ァンチセンス薬物および対照による P G E ₂ の産生量を示すグラフ図である。

図 9 は、配列番号 1 1 または 1 2 の D N A鎖を用いた抗炎症性ァンチセンス薬物の U 9 3 7細胞への取り込み量を示すグラフ図である。

図 1 0 は、配列番号 1 1 または 1 2の D N A鎖を用いた抗炎症性ァンチセンス薬物の滑膜細胞への取り込み量を示すグラフ図である。

図 1 1 は、配列番号 2 の D N A鎖を用いた抗炎症性アンチセンス薬物および比較例によるェンド卜キシン誘発ショックモデルに対する致死抑制効果と投与量の関係を示すグラフ図である。

図 1 2 は、配列番号 2 の D N A鎖を用いた抗炎症性アンチセンス薬物によるェンドトキシン誘発ショックモデルに対する致死抑制効果と用法の関係を示すグラフ図である。

図 1 3 は、配列番号 2 の D N A鎖を用いた抗炎症性アンチセンス薬物によるェンドトキシン誘発ショックモデルに対する致死抑制効果と投与経路の関係を示すグラフ図である。

図 1 4 は、配列番号 2および配列番号 6の各々の D N A鎖を用いた抗炎症性ァンチセンス薬物によるェンド卜キシン誘発ショックモデルに対する致死抑制効果の差を示したグラフ図である。発明を実施するための最良の形態

合成ポリアミノ酸の核酸合成体は、水溶性ァミノ酸セリン残基とカチォン性ァミノ酸リジン残基の不規則もしくは規則的な繰り返しにより構成される。セリン残基とリジン残基の構成モル比は約 1 ： 1 であり、その分子量は 3000 - 50000 程度である。このようなポリアミノ酸は、たとえばォリゴヌクレオチドと均一系で複合体を構成するポリーリジン：セリン（以下、 P L S と略記する ·· 特許 WO 9 5 / 0 9 0 0 9号）を用いることができる。また、合成ポリアミノ酸の誘導体としては、特に、上記 P L Sの P E Gブロック修飾体（以下、 P L S Pと略記する）を新規なものとして例示することができ、この P L S Pは、例えば下記実施例 1 の方法によって作成することができる。なお、 P L Sおよび P L S Pの構造は、例えば図 1 ( a ) ( b ) の化学式としてそれぞれ例示することができる。さらに、炎症性疾患に関与する生理活性物質をコ一ドする m R N Aに相捕的なアンチセンス ' オリゴヌクレオチド、または P L S等の合成ポリアミノ酸もしくはその誘導体（例えば、 F L S P ) による修飾体ォリゴヌクレオチドは公知の方法 (Rajendra, B. R. et al. , Human Genetics. 55, 3633, 1980、 Lira, F. and Sun, A. , M. , Science, 210， 908, 1980) によって調製することもできる。実施例

以下、実施例を示し、この発明をさらに具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。なお、以下の実施例および比較例において使用するオリゴヌクレオチドは、次のとおりに合成、生成した。くオリゴヌクレオチドの合成および精製 >

配列表の配列番号 1 から配列番号 1 5のオリゴヌクレオチドを、 D N A合成機 (アプライドバイオシステム社製タイプ 380B) を用いて合成した。 2 ' —水酸基の保護基に t -プチルジメチルシリル基を用いたホスホロアミダイ卜法（Nuclei c Acid Res. , vol.17, 7059-7071, 1989) に基づき合成し、オリゴヌクレオチドの精製は文献（Nucleic Acid Res.， vol.19, 5125-5130, 1991) に記載された方法に従って行った。

配列番号 1 は、既知の 2 0塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、慢性関節リゥマチの生理活性物質の 1 つである I L一 1 /9遺伝子のィニシエーションコドンを含む 2 0塩基に対応するセンス D N A鎖であり、配列番号 2 は、これに相補的なアンチセンス D N A鎖である。また、配列番号 3 は、同じ I L 一 1 遺伝子の非翻訳領域を含む 2 0塩基に対応するセンス D N A鎖であり、配列番号 4 は、これに相補的なアンチセンス D N A鎖である（特開平 6 — 4 1 1 8 5号公報）。また、配列番号 5 は、同じく慢性関節リゥマチの生理活性物質の 1 つである T N F - 遺伝子のイニシエーションコドンを含む 2 0塩基に対応するセンス D Ν Α鎖であり、配列番号 6 は、これに相補的なアンチセンス D N A鎖、配列番号 7 は、 T N F - α遺伝子のスプライシングサイトを含む 2 0塩基（ T N F — α遺伝子配列の 1624— 1643番目）に対応するセンス D Ν Α鎖であり、配列番号 8 は、これに相補的なアンチセンス D N A鎖、配列番号 9 は、 T N F — α遺伝子のスプライシングサイトを含む 2 0塩基（ T N F — α遺伝子配列の 2161 - 2180番目）に対応するセンス D Ν Α鎖であり、配列番号 1 0 は、これに相補的なアンチセンス D N A鎖である。

さらに、配列番号 1 1 は、ヒト慢性関節リゥマチ等の炎症の免疫機構に関与する C O X— 2のィニシエーションコドンを含む 2 0塩基の領域に対応するセンス D N A鎖であり、配列番号 1 2 は、これに相補的なアンチセンス D N A鎖である ₍ さらにまた、配列番号 1 3 は、マウスの〗 L一 1 β遺伝子のィニシエーションコドンを含む 2 0塩基に対応するセンス鎖であり、配列番号 1 4 は、これに相補的なアンチセンス D Ν Α鎖である。また、配列番号 1 5 は、マウスの T N F — α 遗伝子のィニシエーシヨンコドンを含む 2 0塩基に対応するアンチセンス鎖である。実施例 1

く P E G修飾した P L Sの合成および精製〉

ε 一力ルポべンゾキシリジン— Ν—カルボン酸無水物 1 . 0 g (シグマ社製）およびべンジルセリン— N —カルボン酸無水物 1 . 0 g (シグマ社製）を N , N —ジメチルホルムァミド（D M F ：和光純薬工業社製）の 3 0 m 1 に溶かし、ク口口ホルム（和光純薬工業社製） 1 5 m l を加えた。片末端メトキシ片末端ァミノ基のポリエチレンォキシド（分子量 5000 ：日本油脂社製） 4 . 0 gをクロロホルム 1 5 m 1 に溶かして、その溶液を ε —カルボベンゾキシリジン一 N —カルボン酸無水物およびべンジルセリンー N—力ルボン酸無水物溶液に加えた。 2 6時間後に、反応混合液を 3 3 0 m 1 のジェチルエーテルに滴下して沈殿したポリマ一をろ過で回収してジェチルエーテル（和光純薬社製）で洗浄し Γこ後に真空で乾燥し、臭化水素酢酸溶液（和光純薬工業社製）で脱保護を行いポリ - リジン：セリンの P E Gブロックコポリマー（ P L S P ) を得た。実施例 2

く I L一 1 /3に対するアンチセンス薬物の作成〉

ポリ — リジン：セリンのコポリマ一（ P L S ：シグマ社製）または実施例 1で合成 Z精製した P L S Pと、アンチセンス ' オリゴヌクレオチド（配列番号 2および 4 ) のいずれか一方とを公知の方法によりィォン性複合体形成した。

すなわち、形成された複合体が透過しない膜分画能をもつ限外濾過用チューブ (日本ミリポア · リミテツド社製：ウルトラフリ一 C3-GC UFC3 TGC 00 フィルタ —付き遠心チューブ）に、アンチセンス ' オリゴヌクレオチドと P L Sまたは P L S Pとの混合溶液を入れて遠心分離した。なお、オリゴヌクレオチドの濃度は 1 n M、 1 0 n Mおよび 1 0 0 n Mとなるように添加した。また、配列番号 4のォリゴヌクレオチドは、 1 0 M濃度のものも調製した。以上の条件により、遊離したオリゴヌクレオチドを下層へ濾過し、 P L Sとアンチセンス ' オリゴヌクレオチド複合体（以下、アンチセンス一 P L Sと略記する）および P L S Pとァンチセンス ' オリゴヌクレオチド複合体（以下、アンチセンス一 P L S Pと略記する）を得た。

また、これらの複合体の形成による濁りもしくは沈殿物生成の検討は、その溶液の 3 6 0 nmにおける吸光度測定により分光学的に行った。実験に際して、複合体は主としてィオン強度 0. 0 2のリン酸緩衝液（ p H =7.2)で溶解した。その結果、今回用いたァンチセンス ' オリゴヌクレオチドと P L Sもしくは P L S Pとの複合体形成に際しては、溶液系に白濁は一切見られなかった。

オリゴヌクレオチドの濃度は 2 6 0 n mの吸光度から求めた。その結果、形成された複合体におけるォリゴヌクレオチドが上記の各濃度であることが確認された。また、イオン性複合体形成における各々の電荷的中和の濃度は、 P L Sまたは P L S Pとオリゴヌクレオチドの分子量から求まる電荷の個数より計算した。さらに、アンチセンス一 P L Sおよびアンチセンス— P L S Pの各複合体が無電荷であることをキヤビラリ一電気泳動（マルチチヤンネルキヤビラリ一電気泳動装置： CAPI-3000 、 MCPD-3600 SPECT O MULTI CHANNEL DETECTOR 装備、大塚電子社製）により確認した。その結果、複合体のピークは無電荷のフヱニルァラニンのピークと同じであった。実施例 3

<培養細胞に対する抗炎症性ァンチセンス薬物の効果 >

実施例 2で作成したアンチセンス— P L Sおよびアンチセンス— P L S P複合体の I L 一 1 /3産生抑制効果を培養細胞系において検討した。

細胞にはヒ卜マクロファージ系の U 9 3 7細胞（大日本製薬社製）を用いた。細胞培養は、 1 0 %の F C S (Fetal Calf Serum ：三光純薬社製）と 1 0 0 unit Zm l のペニシリン（ライフ ' テクノロジ一社製）および 1 O O u g Zm l のストレプ卜マイシン（ライフ ♦ テクノロジ一社製）を含む R P M I 培地（日研生物医学研究所製）を使って、 3 7 °C、 5 % C 0₂ の条件下で行った。培養した U 9 3 7細胞の数はトリパンブル一による染色後、視覚的にカウントし求めた。

測定に際しては、 3 X 1 0 ⁵ 個 Zm 1 に調製した U 9 3 7細胞を含む 0. 1 5 m 1 の培地を 9 6穴のマイクロプレートに添加した。これらの細胞に対して 1 n g/m 1 C l 2 - o - tetradecanoy 1 - phorbol — 1 3 — acetate ( T P A : 和光純薬工業社製）および 1 gZm 1 の L P S (シグマ社製）を添加した後、実施例 2で作成したアンチセンス— P L Sまたはアンチセンス一 P L S Pを添加した。また、対照として、センス D N A鎖（配列番号 1 および 3 ) と P L Sまたは P L S P との複合体（各々、センス— P L Sおよびセンス— P L S P ) 、アンチセンス D N A鎖単独およびセンス D N A鎖単独もそれぞれ添加した。

2 4 時間のィンキュべション後、一 7 0 °Cにて十分に冷凍し、その後に溶解凍結を 3回繰り返し、上清の 2 5 0 1 を静かに集めた。これらはェライザ（ELISA ) キット（ 1L- 1 /S ELISA System ：ァマシャム社製）により調製した後、マイク口プレー卜リーダー（バイオ · ラッド社製）でデータ解析を行った。その結果、この発明の抗炎症性ァンチセンス薬物、特に I L - 1 ^遺伝子のィニシエーシヨンコドンに対するアンチセンス D N A (配列番号 2 ) と P L S または P L S Pとの複合体は、図 2 に示したとおり、ナノモル（ n M) オーダで I L ― 1 /3の産生を 1 0 0 %抑制した。すなわち、アンチセンス D N A濃度が 1 0 0 n Mでは 1 0 0 %の I L — 1 産生が抑制、 1 0 n M濃度では 5 0 %の I L — 1 β産生が抑制、 1 η Μ濃度では 2 0 %の I L 一 1 産生が抑制された。

一方、非翻訳領域に対するアンチセンス D Ν Α (配列番号 4 ) の場合には、キャリヤー特異的な効果が観られ、 P L S Pとの複合体のみ n Mォ一ダ一で I L 一 1 βの産生抑制効果が観察された。すなわち、図 3 に示したとおり、アンチセンス— P L S Pの場合には、アンチセンス D N A濃度が 1 で 9 0 %以上、 1 0 0 η Μでは 8 0 %以上の I L — 1 産生が抑制され、 1 0 η Μ濃度では 3 0 %. 1 n M濃度では 2 0 %弱の I L 一 1 産生が抑制された。これに対して、 Ύンチセンス一 P L Sの場合には、 1 0 M濃度で 5 0 %弱、 Ι Ο Ο η Μ以下の濃度では約 1 0 %弱の I L 一 1 /3産生抑制が観察されるに止まつた。

なお、注目すべきこととして、同じ低濃度範囲内でアンチセンス鎖とセンス鎖において結合特異性が顕著に現われた。比較例 1

実施例 3 と同一の方法により、ホスホロチォエー卜型のァンチセンス · ヌクレォチド（以下、 S —アンチセンスと略記する）の I L 一 1 /3産生抑制効果を測定した。結果は図 2および図 3に示したとおりである。この S —アンチセンスは同じ評価系で安定で高い生物活性を得ることができるといわれている力 <、 I L 一 1 /S遺伝子のィニシェ一シヨンコドンに対する S —アンチセンス（配列番号 2 ) は図 2 に示したとおり、 1 0 M濃度で約 2 0 %の I L 一 1 3産生抑制効果を示すのみであった。また、非翻訳領域に対する S —アンチセンス（配列番号 4 ) の場合には、図 3 に示したように、 1 0 M濃度で約 4 0 %程度の I L 一 1 /3産生抑制を示した。比絞例 2 実施例 3 と同一の方法で、アンチセンス D NA (配列番号 2 ) とリボフヱクチン（ギブコ社製）との複合体（以下、アンチセンス一リボフヱクチンと略記する）の I L一 1 3産生抑制効果を測定した。結果は図 4に示したとおりである。このリポフエクチンは、従来よりオリゴヌクレオチド用キヤリャ一として高く評価されてきている力く、アンチセンスーリポフエクチンは、かなり高いアンチセンス濃度（ 5 0 M) であるにもかかわらず、〖 L一 1 /3産生抑制効果は 2 0 %程度であった。また、 negative control として用いたセンス D N A ( 配列番号 1 ) とリボフヱクチンとの複合体（以下、センス— リボフヱクチンと略記する）と比較しても抑制効果に違いはみられず、ォリゴヌクレオチドの結合特異性に差は見られなかった。実施例 4

< TN F— αに対するアンチセンス薬物の作成〉

配列番号 6、 8および 1 0のアンチセンス ' オリゴヌクレオチドを用いたことを除き、実施例 2 と同様の方法で TN F— αに対するァンチセンス薬物（アンチセンス— P L S Pおよびアンチセンス一 P L S) を作成した。

これらのァンチセンス薬物について、実施例 2と同様に濁りおよび沈殿物形成、オリゴヌクレオチド濃度、その電荷等を測定した。実施例 5

<培養細胞に対する抗炎症性アンチセンス薬物の効果〉

実施例 4で作成したァンチセンス— P L Sおよびアンチセンス一 P L S Ρ複合体の TN F— α産生抑制効果を実施例 3と同様の方法を用いて検討した。

ただし、対照としては、センス D Ν Α鎖（配列番号 5 ) と P L Sまたは P L S Pとの複合体（各々、センス— P L Sおよびセンス一 P L S P ) 、アンチセンス D N A鎖単独およびセンス DNA鎖単独をそれぞれ用いた。また、効果測定のェライザキットは、 T N F— a ELISA System (フナコシ社製）を用いた。

その結果、 TN F— α遺伝子のィニシエーシヨンコドンに対するァンチセンス D Ν Α (配列番号 6 ) と P L S Pとの複合体は、図 5に示したとおり、アンチセンス D NAの濃度が 1 0 O p Mの場合には TN F— αの産生を 8 0 %抑制し、 1 0 ρ Μの濃度では 6 0 %抑制したが、それ以下の濃度では T N F—ひの産生抑制は観察されなかった。また、注目すべきこととして、同じ低濃度範囲内でアンチセンス鎖とセンス鎖において顕著な結台特異性も観察された。なお、アンチセンス ' オリゴヌクレオチドと複合体を形成する合成ポりアミノ酸としては、 p L S よりも P L S Pの方が高い TN F— α産生抑制効果を示した。

一方、 TN F— α遺伝子のスプライシングサイ卜に対するアンチセンス DNA

(配列番号 8、 1 0 ) と P L S Ρとの複合体による TNF— α産生抑制効果は、図 6に示したとおり、イニシエーションコドンに対するアンチセンス D NA (配列番号 6 ) と P L S Ρとの複合体とほぼ同等であった。このスプラインングサイ卜に対するァンチセンス効果は、細胞の核内へォリゴヌクレオチドが効率よく移行したことを示している。比較例 3

実施例 5 と同一の方法で、アンチセンス D NA (配列番号 6 ) とリポフエクチン（ギブコ社製）との複合体の TN F— α産生抑制効果を測定した。結果は図 7 に示したとおりであり、アンチセンスーリポフエクチンは、かなり高いアンチセンス濃度（ 5 0 Μ) であるにもかかわらず、 T N F - α産生抑制効果は 2 0 % 程度であった。また、オリゴヌクレオチドの結合特異性にも差はられなかった _c さらに、図 7には示していないが、実施例 5 と同一の方法により、 S—アンチセンス（配列番号 6 ) の T N F - α産生抑制効果も測定した。その結果、この S - アンチセンスは、 1 0 Μ濃度でも T N F— α産生抑制効果は 2 0 %程度であつた。実施例 6

< C 0 X - 2に対するアンチセンス薬物の作成〉

配列番号 1 1のアンチセンス ' オリゴヌクレオチドを用いたことを除き、実施例 2と同様の方法で C 0 X— 2に対するアンチセンス— P L S Pを作成した。

このアンチセンス薬物について、実施例 2と同様に濁りおよび沈殿物形成、ォリゴヌクレオチド濃度、その電荷等を測定した。

実施例 7

ぐ培養細胞に対する抗炎症性アンチセンス薬物の効果〉

実施例 6で作成したアンチセンス— P L S Pの C OX— 2産生抑制効果をヒト骨細胞の培養系において検討した。

ヒト骨細胞には、リゥマチ患者の膝関節より切除した組織より調製したヒト滑膜細胞を使用し、その培養は、実施例 3の U 9 3 7細胞と同一の条件で行い、細胞数を力ゥン卜した。

測定に際しては、 2. 8 X 1 0⁴ 個/ m 1 に調製したヒト滑膜細胞を含む 0. 3 m l の培地を 9 6穴のマイクロプレート（フアルコン社製）に添加し、 2 4時間培養した。その後、上清を静かに取り除き、 3 0 0 ^ 1 の R PM I培地で付着した細胞を洗浄し、以下の試験に供した。

各ゥヱルに、アンチセンス DNA鎖単独と、実施例 6で作成したアンチセンスー？し 8 ?の溶液 0. 1 5 m lを添加し、 3 0分後に 1 n g /m 1の I L— 1 /3 (ジーンザィム、 Lot. B41399 ) を必要に応じて添加した。アンチセンス DNA 鎖およびァンチセンス— P L S Pは 1 n Mから 1 0 M (最終濃度）の数種類を準備した。 2時間のィンキュベ一ションの後、上清の 3 0 0 1 を集め、必要に応じて希釈した後、 P G E ₂ ェライザキット（日本パ一セプティブリミテッド、 No. 8-6801) で測定した。

また、対照として、比铰例 1の S—アンチセンスおよびジーン卜ランスファー (和光純薬社製： Code 074-03621 ) とアンチセンス D NA鎖との複合体（以下、アンチセンス一ジーントランスファ一と略記する）についても同様に測定した。ジーントランスファ一は、リボソーム系のキヤリヤーであり、従来よりオリゴヌクレオチド . キャリヤーとして高く評価されている。

結果は図 8に示したとおりであり、 S—アンチセンスは P G E ₂ の産生を全く抑制しなかった。同様に、アンチセンス— ジーントランスファ一の場合も、 P G E の産生抑制は全く観察されなかった。

一方、この発明の抗炎症性ァンチセンス薬物であるァンチセンス— P L S Pは Mオーダで P G E の産生を効果的に抑制した。すなわち、 9 2 % ( I L— 1 添加時）の P G E 2 産生が抑制された。

なお、注目すべきこととして、試験した濃度範囲内で P G E 2 産生阻害におけるアンチセンス鎖とセンス鎖における結合特異性が顕著に現われた。実施例 8

<培養細胞への抗炎症性アンチセンス薬物の取り込み〉

実施例 6 と同様にして作成したアンチセンス一 P L S Pの培養細胞への取り込み効率を試験した。

先ず、アンチセンス D N A鎖を以下の方法で標識した。 D N A ( 1 . 8 3 0 D ₂₆。ュニット、 5 p m o l ) 2 7. 3 〃 1 、オートクレープした蒸留水 1 5 . 7 1 、 1 0 Xキナーゼ緩衝液（ 2 5 O mM トリス塩酸緩衝液： p H 7. 6 ) 、 l O O mM D T T、 T 4 ポリヌクレア一ゼ溶液（ 1 0 0ユニット/ / 1 ) 、 ₇ 一 ³² P - A T P 1 〃 1 を混合の後、 3 7 °Cにて 1 時間反応させた。なお、 ³² Pによる標識には、 T 4 ポリヌクレオチドキナ一ゼキッ卜（宝酒造製 Code No.2030 ) を用いた。

培養細胞には実施例 2 と同様のヒ卜マクロファージ系 U 9 3 7細胞と、実施例 7 と同様のヒト滑膜細胞を使用した。実施例 Ί と同様の条件で、 1 X 1 0 ^κ 個7 m l の U 9 3 7細胞をガラスチューブ（ファルコン社製 2 0 5 8、 6 m l — 1 2 X 7 5 ) にて培養した。ヒト滑膜細胞の場合には、目的の濃度に調製したアンチセンス— P L S P溶液の 5 0 1 を加えて培養し、 U 9 3 7細胞の場合には 1 n g / 1 の 1 2 — o - tetradecanoy 1 一 phorbol — 1 3 - acetate (T P A ：和光純薬工業社製）を添加の後、 Ύンチセンスー P L S P (最終濃度： 1 n gZm 1 力、ら 1 0 g/m 1 ) を添加して培養を続けた。所定の時間培養した後、培養チューブを 2 5 °Cにて 1 0分間、 1 5 0 0 r p mで遠心して細胞を沈殿させた後、上清を静かに取り除いた。次いで、チューブの底に付着した細胞に対して実施例 7で使用したのと同様の P B S溶液 3 m 1 を加えて 2回の洗浄を行った後、 1 % の S D S ( ドデシル硫酸ナトリウム） 5 0 0 〃 1 を加えて細胞を溶解した。最終的に、溶解液の全てに対して 1 0 m 1 のハイパーフローラ溶液を加えて液体シンチレ一夕一にて測定した。また、対照として、実施例 7 と同様に S —アンチセンスおよびアンチセンス一ジーントランスファ一についても同様に測定した。

結果は図 9および図 1 0 に示したとおりであり、 S —アンチセンスおよびアンチセンス一ジーン卜ランスファーの場合には、 U 9 3 7細胞（図 9 ) でもヒ卜滑膜細胞（図 1 0 ) でもアンチセンス D N Aは全く細胞内には取り込まれなかった, 一方、この発明のアンチセンス一 P L S Pは経時的に細胞内に取り込まれることが確認された。すなわち、 3時間までの培養では、 S —アンチセンスと比較して 1 0 0倍以上、またアンチセンス一ジーン卜ランスファーと比較した場合には 5 0倍以上の D N Aが細胞内に取り込まれた。実施例 9

<ェンドトキシン誘発ショックモデルマウスに対する抗炎症性アンチセンス薬物の致死抑制効果 >

配列番号 1 3、 1 4および 1 5のオリゴヌクレオチドを用いたことを除き、実施例 2 と同様の方法でマウス I L — 1 /3に対するァンチセンスー P L S P、およびマウス T N F— αに対するアンチセンス— P L S Pを作成し、そのェンドトキシン誘発ショックに対する致死抑制効果をモデルマウスを用いて検討した。

生理食塩水によつて目的の濃度に調製したァンチセンス一 P L S Ρ溶液 2 0 0 1 を、 8〜 1 0週齢の B A L B Z c雄マウス（日本 S L C社：約 2 0 g ) へ尾静脈内投与した。その直後、 2 0 m g/k g相当に生理食塩水で調製したェンドトキシン（ L P S、 Lot No. 68692 W. E. col i055:B5. D i f c o社製〉溶液 2

0 0 1 をマウス腹腔内へ投与して、経時的に生存固体数を計測した。

結果は図 1 1〜図 1 4 に示したとおりである。先ず、図 1 1 に示したとおり、

1 L - 1 3に対するァンチセンス一 P L S Pを用いた場合には、投与したァンチセンス薬物の濃度に依存してマウスの生存率は上昇した。特に、 1 0 O m g/k g濃度のアンチセンス一 P L S Pを投与した場合には、 4 0時間にわたり死亡例は認められなかった。

また、図 1 2 に示したとおり、 1 O m gZ k g濃度のアンチセンス一 P L S P を一度に投与した場合と、 5 m g k g濃度のアンチセンス一 P L S Pを二度に分けて投与した場合（合計 1 0 m g / k g ) の効果を比絞したところ、この発明のアンチセンス薬物を 1 2時間間隔で二度に分けて投与するほう力 <、単回投与に比べ効果的であることが判明した。

図 1 3 は、アンチセンス一 P L S Pを尾静脈内投与した場合と、腹腔内投与した場合の効果の差を示したものである。アンチセンス— P L S Pは腹腔内投与した場合には致死抑制効果を示さなかったが、尾静脈内投与では優れた致死抑制効果を示したことから、この発明のアンチセンス薬物は投与経路により効果に差を生じさせるものであることが認められた。

さらに、図 1 4 に示したとおり、 I L — 1 3に対するアンチセンス薬物と T N F - aに対するアンチセンス薬物の効果を比較したところ、 3 0 m g Z k g濃度で投与した場合には、 T N F — αに対するアンチセンス薬物のほうが致死抑制効果が高く、 4 0時間後のマウス生存率は 6 0 %であった。

以上のモデルマウスを用いた試験結果から、この発明のアンチセンス薬物は in vivo モデル実験系においても優れた薬効を示すことが確認された。産業上の利用可能性

この発明により、一次構造特異的にセンス R N Aへ結合し、しかも非常に低い濃度領域で十分な生理活性物質抑制効果を発揮する抗炎症性ァンチセンス薬物が提供される。これによつて、慢性関節リゥマチ、歯周囲炎、腎炎、潰瘍性大腸炎動脈硬化症、乾癬などの炎症性疾患、敗血症性ショック、クローン病、エイズ等の疾患、または難治性肝疾患や肝移植による病態に対する有効な治療が可能となる。

配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 D N A

配列の特徴

ヒト I L一 1 /3遺伝子のィ二シェ一ションコドンを含む配列

GCAGCCATGG CAGAAGTACC 20 配列番号： 2

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 D N A

配列の特徴

配列番号 1 のアンチセンス鎖

配列

GGTACTTCTG CCATGGCTGC 20 配列番号： 3

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 D N A

配列の特徴

ヒト I L一 1 S遺伝子の非翻訳領域を含む

配列

AGAGAGCTGT ACCCAGAGAG 20 配列番号： 4 配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列の特徴

配列番号 3のアンチセンス鎖

配列

CTCTCTGGGT ACAGCTCTCT 20 配列番号： 5

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列の特徴

ヒト TN F— α遺伝子のィニシエーションコドンを含む配列

CCCTGGAAAG GACACCATGA 20 配列番号： 6

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列の特徴

配列番号 5のアンチセンス鎮

配列

TCATGGTGTC CTTTCCAGGG 20 配列番号： 7

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸配列の種類：他の核酸合成 D N A

配列の特徴

ヒ卜 T N F — α遺伝子のスプライシングサイト（ 1624— 1643番目）を含む配列

CCAGGCAGTC AGTAAGTGTC 20

配列番号： 8

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 D NA

配列の特徴

配列番号 7のアンチセンス鎖

配列

GACACTTACT GACTGCCTGG 20

配列番号： 9

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 D N A

配列の特徴

ヒ卜 T N F — α遺伝子のスプライシングサイ卜（2161— 2180番目）を含む配列

CTCCCTCCAG CAAACCCTCA 20

配列番号： 1 0

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 D N A

配列の特徴配列番号 9のアンチセンス鎖

配列

TGAGGGTTTG CTGGAGGGAG 20

配列番号： 1 1

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 D N A

配列の特徴

ヒ卜 C 0 X— 2遺伝子のィニシェ一シンコドンを含む配列

TGCCCGCCGC TGCGATGGCTC 20 配列番号： 1 2

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 D N A

配列の特徴

配列番号 11のァンチセンス鎖

配列

GAGCATCGCA GCGGCGGGCA 20 配列番号： 1 3

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 D N A

配列の特徴

マウス I L一 1 3遺伝子のィ二シェ一ションコドンを含む配列 GCAGCTATGG CAACTGTTCC 20 配列番号： 1 4

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列の特徴

配列番号 13のァンチセンス鎖

配列

GGAACAGTTG CCATAGCTGC 20 配列番号： 1 5

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列の特徴

マウス TN F— α遗伝子のィニシエーションコドンを含む 2 0塩基のァンチセンス鎖

配列

ATCATGCTTT CTGTGCTCAT 20

Claims

請求の範囲

1 合成ポリアミノ酸またはその誘導体と、ヒト炎症性疾患に関与する生理活性物質をコ一ドする m R N Aの一部もしくは全塩基配列に相補的なアンチセンス ♦ オリゴヌクレオチドとの複合体からなることを特徴とする抗炎症性ァンチセンス薬物。

2 合成ポリアミノ酸が、リジン残基とセリン残基との繰り返し配列からなる核酸結合体または核酸誘導体である請求項 1 の抗炎症性ァンチセンス薬物。

3 合成ポリアミノ酸の誘導体が、合成ポリアミノ酸のポリェチレングリコールブロック修飾体である請求項 2の抗炎症性ァンチセンス薬物 _c

4 ヒト炎症性疾患に関与する生理活性物質が、ヒ卜慢性関節リウマチに関与する生理活性物質である請求項 1 の抗炎症性ァンチセンス薬物。

5 合成ポリアミノ酸またはその誘導体と、ヒ卜インタ一ロイキン一 1 /3をコードする m R N Aの一部もしくは全塩基配列に相捕的なアンチセンス · オリゴヌクレオチドとの複合体からなることを特徴とする請求項 1 の抗炎症性ァンチセンス薬物。

6 ヒ卜イン夕一ロイキン一 1 /3をコードする m R N Aの一部もしくは全塩基配列に相補的なアンチセンス · オリゴヌクレオチドが、配列番号 2 または 4 の —部もしくは全塩基配列を有するォリゴヌクレオチドである請求項 5の抗炎症性アンチセンス薬物。

7 合成ポリアミノ酸またはその誘導体と、ヒト腫瘍壊死因子をコードする m R N Aの一部もしくは全塩基配列に相補的なァンチセンス . オリゴヌクレオチドとの複合体からなることを特徴とする請求項 1 の抗炎症性ァンチセンス薬物。

8 ヒト腫瘍壊死因子が、ヒト腫瘍壊死因子- αである請求項 7の抗炎症性アンチセンス薬物。

9 ヒ卜腫瘍壊死因子一 αをコードする m R N Aの一部もしくは全塩基配列に相補的なァンチセンス ' オリゴヌクレオチドが、配列番号 6、配列番号 8 または配列番号 1 0のいずれかの一部もしくは全塩基配列を有するォリゴヌクレオチドである請求項 8 の抗炎症性ァンチセンス薬物。 1 0 合成ポリァミノ酸またはその誘導体と、一連のプロスタグランジン E ₂ 合成酵素をコ一ドする mR NAの一部もしくは全塩基配列に相補的なァンチセンス · オリゴヌクレオチドとの複合体からなることを特徴とする請求項 1 の抗炎症性ァンチセンス薬物。

1 1 プロスタグランジン E ₂ 合成酵素が、シクロォキシゲナ一ゼー 2である請求項 1 0の抗炎症性アンチセンス薬物。

1 2 シクロォキシゲナ一ゼ— 2 をコ一ドする mR NAの一部もしくは全塩基配列に相補的なァンチセンス ' オリゴヌクレオチド力く、配列番号 1 2の一部もしくは全塩基配列を有するォリゴヌクレオチドである請求項 1 1 の抗炎症性ァンチセンス薬物。