WO1997007210A1

WO1997007210A1 - Conglutinine recombinee et son procede de production

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Publication number: WO1997007210A1
Application number: PCT/JP1996/000173
Authority: WO
Inventors: Nobutaka Wakamiya
Original assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Current assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date: 1995-08-17
Filing date: 1996-01-25
Publication date: 1997-02-27
Anticipated expiration: 1998-02-17
Also published as: EP0856580A1; CA2229775C; AU717207B2; AU4547096A; CA2400143A1; CA2400143C; EP0856580A4; CA2229775A1

Description

明細書組換えコングルチニンおよびその製造方法〔技術分野〕

本発明は、抗ゥィルス活性（中和活性）を有し、また、医薬品用途への応用が期待できる組換えコングルチニンとその製造方法、ならびにコレクチン類の生理活性を検出する方法に関する。〔背景技術〕

コングルチニンは、カルシゥム要求型の哺乳類 C型レクチンフアミリーに属するゥシ血清中に存在する動物レクチンであり、 Lee et al. , によりその全ァミノ酸配列（配列番号： 1 ) が解析されている〔Lee ei αΙ·，ジャーナル · バイオロジカル · ケミストリ一 U. Biol. Chera. )、 266巻、 2715— 2723頁、 1991年〕。

C型レクチンは、（1) システィンを豊富に含む N末端領域、 (2) コラーゲン様領域、（3) ネック領域、および（4) 糖鎖認識領域（CRD)の 4種の特徵的な領域を含む基本構造から構成されている〔Malhortra et al. , ョ一口ビアン · ジャーナル ' ォブ ' ィムノロジー（ Eur. J. Immunol .，） 22巻、 1437— 1445頁、 1992年〕。

C型レクチンには、コングルチニンの他にマンノース結合タンノ、。ク質（MBP) 、サーファクタントタンパク質 A (SP-A)およびサーファクタン卜タンパク質 D (SP-D)なども含まれ、これらのレクチンをコレクチンと総称している。

脊椎動物では、細胞を介する免疫応答および特異的抗体反応によるメカニズムが、病原菌の侵入に対する最大の生体防御システムと考えられている。しかしながら、最近になって、これらのレクチンによる非特異的な免疫応答が、母親の移行抗体や特異的防御システムが充分に発達していない小児に対し、種々の微生物の中和作用や排除に重要な役割を果たしていると考えられてきている〔Super et al., ランセッ卜（Lancet)、 II、 1236— 1239頁、 1989年）。

宿主の生体防御におけるこれらレクチンの役割について、例えば、マンノース結合タンパク質の遺伝子上の変異によるマンノース結合タンパク質の血中濃度の低下によって、感染を受けやすくなるという研究結果が報告されている〔Sumiya et al. , ランセツト（Lancet)、 337巻、 1569 - 1570頁、 1991年〕。

本発明者は、以前に、コングルチニンおよびマンノース結合夕ンパク質が、 HIおよび H3夕イブのインフルェンザ Aウイルスの感染ゃ赤血球凝集抑制活性を阻害することを見出した〔Wakamiya et al. , グリココンジュゲイト ' ジャーナル（Glycocon jugate J.う、 8巻、 235頁、 1991年； Wakamiya ei a .，バイオケミカル ' アンド · ノくィォフィジカル ' リサーチ ' コミュニケイシヨンズ（Biochem. Biophys. Res. Comm. )、 187巻、 1270 - 1278頁、 1992年〕。

その後、さらに本発明者らのグループにより、コングルチニンをコードする cDNAクローンが取得され、コングルチニンと種々のサーファクタントタンパク質- D遺伝子との間の強い関連性も見出されている [； Suzuki ei ai.,バイオケミカル · アンド · バイオフィジカル · リサーチ * コミュニケイシヨンズ（Biochera. Biophys. Res. Comm. ) 、 191巻、 335— 342頁、 1993年〕。

このように、コングルチニンは、生理活性医薬物質としての有用性が期待される物質でありながら、ゥシ血清中からはごくわずかしかの量しか採取できず、また、動物にその採取源を依存しているためにその安定供給が困難であるとの問題点もあった。そこで、コングルチニンの大量生産を意図すべく、遺伝子組換え手法を用いて、コングルチニンの大腸菌での発現が試みられた。すなわち、まず、コングルチニンの全 cDNAを、 PCR (ポリメラーゼ · チェイン · リアク'ション： Po l yme ras e Cha i n R ea c t i on)法により増幅し、これを発現べクタ一 pRSET- A に導入し、 M13/T7ファージを用いて発現させた。そして、得られた組換え体を解析した。その結果、この場合、組換えコングルチニンの発現は確認できたものの、ゥヱスタン · ブロット法で組換え体の生成がようやく確認できる程度の発現量しか得られず、この方法は大量生産に不向きであった。

他の 2〜 3種類の発現べクタ一についても同様の方法によってその発現効果を試みたが、いずれも同程度もしくはそれ以下の発現が確認されるに止まり、効率的な発現系を確立するには至らなかった。これは、コラーゲン様領域のような構造を有するタンパク質が大腸菌に存在しないために、コングルチニンの発現が困難であると考えられる。また、真核生物細胞系で得られるコングルチニンは、その生産量が少なく、時に不適当な転写後修飾が起こることもある。

このように、コングルチニンは医薬品としての有用性が期待される物質でありながら、自然界から採取できる量はごくわずかである上に、遺伝子組換え手法によっても人為的に大量に得ることはできなかった。

〔発明の開示〕

本発明は上述した従来技術が克服できなかつた問題点に鑑みて発明されたものであり、（i ) コングルチニンのコラーゲン領域を構成する 171個のァミノ酸配列（配列番号： 2 ) の一部のァミノ酸配列、すなわち、 G l y-Xaa- Xaa (配列番号： 3、第 2位および第 3位の Xaa はタンパク質構成ァミノ酸である）の単位のァミノ酸配列を二つ含む 6個のァミノ酸からなる極めて短いコラーゲン領域、（i i )ネック領域、および（i i i ) 糖鎖認識領域を含む組換えコングルチニンが、前述発現系と同様の方法によって、当該組換ぇコングルチニンが大量に生産できるとの知見に基づいて本発明を確立するに至ったものである。

また、本発明の組換えコングルチニンは、極めて短いコラーゲン領域、ネック領域、および糖鎖認識領域から構成されているにもかかわらず、天然型コングルチニンと同様の糖結合特異性、力ルシゥム依存性のコングルチネーション活性、ひいてはインフルェンザ Aウィルスに対する赤血球凝集阻害（H I )活性、中和活性、およびウィルス増殖（感染拡大）阻止活性を有するものである。

さらに、本発明のコレクチン類の生理活性を検出する方法は、ウイルス、特にィンフルェンザ Aウイルスで予め感染させた細胞からの增殖ゥィルスの発芽の抑制効果を測定することで、コングルチニンを含むコレクチン類の生理活性を検出しょうとするものである。この検出方法によれば、従来の検出方法（例えば、中和活性試験）で不活性と判断されたコレクチン類であっても、その生理活性が確認されるなど、コレクチン類の生理活性が正当にかつ多角的に評価できる。併せて、本発明の検出方法により、コレクチン類の用途を定める際の適切な判断材料をもたらすものでめる。 ''

〔図面の簡単な説明〕

第 1 図は、組換えコングルチニン D N Aによる形質転換のためのベクターを示す図であり；

第 2図は、組換え融合コングルチニンの SDS- PAGEの結果を示す図であり；

第 3図は、マンナン一セファロース ' ァフィ二ティー ' クロマトグラフィ一による各画分の吸光度測定、 CBB 染色およびゥェスタン · プロッティングの結果を示す図であり；

第 4図は、ビス（スルホスクシ二ミジル）スべラート処理後の SDS- PAGEの結果を示す図であり；

第 5図（a) 、 ( b) および）は、組換えコングルチニンのゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示すグラフであり；

第 6図は、組換えコングルチニン、および 20mMの N—ァセチルグルコサミン含有組換えコングルチ二ンのマンナンに対する結合能を示すグラフであり；

第 7図は、組換えコングルチニン、および 10mMの EDTA含有組換ぇコングルチニンのマンナンに対する結合能を示すグラフであり第 8図は、マイクロタイ夕一プレー卜アツセィシステムによる組換えコングルチ二ンおよび天然コングルチ二ンのコングルチネ —シヨン活性を示す図であり；

第 9図は、天然型コングルチニンおよび組換えコングルチニンの赤血球凝集抑制（H I )活性を示す図であり；

第 10図（a) および（b) は、組換えコングルチニン（rBKg-CRD)のゥィルス増殖（感染拡大）阻止活性を示す図であり；

第 1 1図（a) および（b) は、組換えコングルチニン（rBKg - CRD)のウイルス増殖（感染拡大）阻止活性を示す図であり；

第 12図（a) および（b) は、それぞれ従来の中和活性試験および本発明の検出方法での作用機序を示す模式図であり；

第 13図は、ヒトマンノース結合夕ンパク質（hMBP)による感染阻害効果を示す図であり；および

第 14図は、ヒトマンノース結合タンパク質（hMBP)による感染阻害効果を示すグラフであり；および

第 15図は、組換えコングルチニン（rBKg- CRD)、 hMBPおよびゥサギ MBP による感染阻害効果を示す図である。〔発明を実施するための最良の形態〕

以下に本発明の組換えコングルチニンに関して、実施例に沿つて詳細に説明するが、これら実施例の開示によって、本発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。

すなわち、大腸菌での部分コングルチニンの発現（実施例 1 ) . 組換えコングルチニンの構造的検討（実施例 2 ) 、組換えコングルチニンと天然コングルチニンの糖結合活性の検討（実施例 3 ) - 組換えコングルチニンのコングルチネーション活性試験（実施例 4 ) 、赤血球凝集抑制（HI)試験（実施例 5 ) 、中和活性試験（実施例 6 ) 、ウイルス増殖〔感染拡大〕阻止試験（実施例 7 ) 、およびコレクチン類の生理活性の検出（実施例 8 ) について以下に説明する。実施例 1 ：大腸菌での部分コングルチニンの発現

(1) RT- PCR法による部分コングルチニン

D N Aフラグメン小の調製

Suzukiらの方法〔バイオケミカル . アンド . ノくィオフイジ力ルリサーチ · コミュニケイシ■ョンズ (B iochem. Biophys. Res.

Comm. )、 191巻、 335— 342頁、 1993年〕に従い、まず、ゥシコングルチニンの cDNA配列に基づいて、以下の配列を有する PCR 用プライマ一をデザインし、そして合成した。これらプライマーは、それぞれ制限酵素 Xhol および EcoRI の切断部位を含んでいる o

5' -GGCTCGAGGGGGAGAGTGGGCTTGCAGA-3' (配列番号： 4 )

5' -GGGAATTCTCAAAACTCGCAGATCACAA-3' (配列番号： 5 )

1 X反応緩衝液、 1 Mの各プライマー、 200^ Mの dNTPs 、 1単位のディープ ' ベント · D NAポリメラーゼ（ニュー · イングランド · バイオラブス社製）および 10ngの cDNAを含む反応混合物 50 1 を試料として用いた。ァ卜一社製 P C R反応装置（ザィモリアクター（登録商標））を用い、 92°Cで 1分間の変性、 60°C で 1 分間のァニーリング、および 72°Cで 2分間の P C R反応を、 35サイクル繰り返して、 497bp の P C R生成物を得た。

(2) 部分コングルチニン生成物の形質転換体の調製

実施例 1 (1) にて得られた P C R生成物を、制限酵素 Xhol および EcoRI で消化した後、 DNA ライゲ一シヨンキッ卜（宝酒造製）を用いて、細菌の発現ベクターである pRSET- A (インビトロゲン社製）に挿入した。そして、ライゲーシヨン混液を、 £. co JM109 中に形質導入し、コングルチニン D N Aの 631bp から 1113 bpに対応する部分コングルチニン D N Aが挿入された形質転換体を得た（第 1図参照）。

このフラグメン卜の配列は、完全なコングルチニンタンパク質の 191から 351番目のァミノ酸残基に相当しており、すなわち、短いコラーゲン領域、ネック領域、および糖認識領域のシーゲンスを含んだ形態にて正確に増幅を行っていた。また、この操作での P C R反応のエラーは認められなかった。かくして、かような部分コングルチニンを高レベルで産生する、所望の安定な形質転換体が得られた。

(3) 組換えコングルチニンタンパク質の発現および精製

完全な挿入体（部分コングルチニン D NA) を含む形質転換した E. co の単一コロニーを S0B 培地（アンピシリン 50 g/1 含有）中で、 37°Cで一晚培養した。培養液 1.2ral を 200ml の SOB 培地（アンピシリン 50 g/1 含有）に接種し、 0D_SOOnm 値が約 0.3になるまで培養した。濃度が最終的に 1 πιΜになるようにィソプロピル- 1- チオー ^ - D- ガラクシド（IPTG)を加え、さらに 1 時間培養した。この細胞を、 E. co l i ラクトースプロモーターにより活動する T7RNA ポリメラ一ゼ遺伝子を含む M13 ファージで、 M0 I 5 p f u/細胞で感染させ、さらに 3時間培養した。培養液を、 3, 000 gで 15分間遠心分離して集菌した。

細菌のペレットを 20m lの緩衝液 A (塩酸グァニジン 6 M、リン酸ナトリウム 20mM、塩化ナトリゥム 500mM、 ρΗ7. 8)中に懸濁した後、超音波処理（15秒、出力 70%、 10回処理）により溶菌した。 43, 000 gで 30分間遠心分離した後、上清に、ニッケル- NTAァガロース（キアゲン社製）を加えて 15分間反応させた。反応物を力ラムに流し込み、このカラムを TBS/NT液（卜リス—塩酸 20mM、塩化ナトリウム 140mM、 0. 05%アジ化ナトリウム、 0. 05%ツイーン 20 (登録商標）、 pH7. 4)で洗浄し、さらに、 TBS/NTC 液（ 5 mMの塩化カルシウムを含む TBS/NT液）で十分に洗浄した。融合タンパク質を、 0. 5Mのィミダゾ一ルを含む TBS/NTC 液で溶出した。

溶出液を、 1 , 000 倍容量の TBS/NTC 液に対して 3回透析した。

透析および遠心分離した後、上清を、マンナン—セファロ一スカラム（CNB r活性化セファロース 4B (フアルマシア社製）にマンナン（シグマ社製）を結合させたァフィ二ティーカラム）に流した。 TBS/NTC 液で洗浄した後、結合したタンパク質を、 5 mMの N-ァセチルダルコサミンを含む TBS/NTC 液で溶出した。

組換えコングルチニンの精製度を、後述するようにして、 SDS- PAGEまたはウエスタン · ブロッ卜法により解析した。

(4) SDS- PAGE分析

SDS-PAGEには、 4〜20%の濃度勾配のポリアクリルアミドゲルを用いた。また、ポリペプチドを、 1 %のクマシ一ブルー（CBB) で染色した。その結果を、第 2図に示した。第 2図において、レーン Mは標準タンパク質、レーン 1 は全細胞溶解物、レーン 2 は塩酸グァニジン可溶画分、レーン 3 は塩酸グァニジン不溶画分、レーン 4 はニッケルーァガロースカラム溶出画分、そして、レーン 5 はマンナンーセファロースカラム溶出画分を示す。ァミノ酸配列から推定される組換え融合コングルチニンの分子量は 22. 5 kD であるが、 SDS-PAGEによる解析では、 27kDa であった。また、ェンテロキナーゼによる組換えコングルチニンの消化は不完全であるが、消化した微量の組換えコングルチニンの N末端アミノ酸配列は、成熟したコングルチニンと一致した。 (5) マンナン一セファロース ' ァフィ二ティー . クロマト

グラフィ一、 SDS- PAGE、および各画分のウエスタン ' プロッティング検定

マンナンーセファロースカラム溶出画分を、 4〜20 %の濃度勾配のポリアクリルアミドゲル、 1 %のクマシ一ブル一染色の条件下で、 SDS-PAGEにより分析した。タンパク質をニトロセル口一ス膜上に転写した後、これを 2， 000倍希釈のゥサギ抗コングルチニン血清と共にィンキュベートし、続いて抗ゥサギ I gG結合ビォチン（ベクター社製）と反応させ、最後に、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（BRL社製）と反応させた。 NBT/ B C I P (BRL製）をアルカリホスファターゼの発色基質として用いた。

そして、溶出パターンの結果を第 3図に示した。組換えコングルチニンは、天然コングルチニンと同様に、 5 mMの N-ァセチルダルコサミンで溶出した。このことは、この融合タンパク質が、マンナンに対し強い親和性を有していることを示すに他ならない。また、組換えコングルチニンの最終精製量は、 co l i の培養液 1 ^ あたり 2. 8ragであつた。実施例 2 ：組換えコングルチニンの構造的検討

(1) 組換え融合コングルチニンの化学的架橋

天然コングルチニンは、 9〜18量体のポリぺプチドから構成されている（Kawasaki et al. , アーティブス · ォブ · バイオケミス卜リー · アンド · ノィォフィジックス（Arch. Biochem.

Biophys. ) 、 305巻、 533— 540頁、 1993年）。最も大きな多量体の分子量は約 1， OOOkDaであり、典型的な多量体構造は 4個の 3量体構造物が十文字構造を形成したものである（Strang et al.，バイオケミカル . ジャーナル（Biochem. J. )、 234巻、 381 一 389頁、 1986年）。そこで、組換えコングルチニンについても、その構造について調査した。

組換えコングルチ二ンタンパク質を、 10mMの塩化カルシゥムを含んだ PBS 緩衝液に 22.8 g/mlの濃度で溶かした。検体を、 0 mM、 0.15mM、 0.3mM 、 0.6raM 、 1.2mM 、 2.5ra および 5 mMのビス (スルホスクシニミジル）スベラ一卜により、 37°Cで 20分間処理した後、 4〜20%濃度勾配の SDS-PAGEで分析した。その結果を、第 4図に示した。第 4図の結果から、組換え融合コングルチニンは、分子量 27kDa の単量体および三量体から構成されていることが確認された。

(2) ゲル濾過クロマトグラフィー

精製した組換えコングルチ二ンを、 10mMの EDTAを含む ρΗ 8.0の TBS 緩衝液を用い、流速 0.5 ml "分で、スーパーロース 6 (ファルマシア社製）により処理した。そして、 40 g の組換えコングルチニンをこのカラムに流した。分画を、 280nra で測定した, 組換えタンパク質の回収量を、クマシ一タンパク質ァッセィ試薬 (ピアス社製）で検定した。

そして、以下に示す抗ゥシコングルチニンゥサギ血清を用いたサンドウイツチ ELISA 系を各分画に適用した。カラムの検量には、フアルマシア社製標準分子量キット（チログロブリン（THY) 、フェリチン（FER) 、カタラーゼ、アルドラーゼ（ALD) 、ァルブミン（BSA) 、オボアルブミン（OVA) 、キモトリブシノ一ゲン A (CHY) 、リボヌクレアーゼ A ) を用いた。図 5 に示すように、 94kDa (31画分）、 39kDa (34画分）および 4.6kDa (39画分）の三つの主要なピークを確認した。しかしながら、定量分析によれば、 39画分にはタンパク質は認められなかった。また、. SDS- PAGE後の銀染色によつても、 4.6kDaの画分は染色されなかった。この画分は、 200nm および 280nm の紫外部吸収から、ぺプチドでないことが確認された。

以上の結果から、コングルチニンは、コラーゲン領域が在しなくても三量体を形成できることが明らかになった。さらに、この結果は、コングルチニンと同様に、 C型レクチンファミリーに属する組換えヒトーマンノース結合タンパク質やゥシ一肺サーファクタントタンパク質 Dが、コラーゲン領域を欠いていても、ネツク領域を介して 3量体を形成するという事実と一致している (Sheriff et ai.，ネイチヤー - ストラクチユラル · バイオロジー (Nature Struct. Biol. )、 1巻、 789— 794頁、 1994年； Hoppe et al., FEBSレターズ（FEBS Lett. )、 344巻、 191— 195頁、 1994年）。実施例 3 ：組換えコングルチニンおよび天然コングルチニン

の糖結合活性

(1) 糖結合特異活性

マイクロ夕イタ一プレートを、マンナン（10〃 g/ml) を含む 100 / 1 のコ一ティング緩衝液（炭酸ナトリゥム 15mM、炭酸水素ナトリウム 35mM、 0.05%アジ化ナトリウム、 pH9.6)中、 4 °Cで 1 晚表面処理した。各段階後にプレートを TBS/NTC 液（卜リス一塩酸 20mM、塩化ナトリウム 140mM 、 0. 05%ァジ化ナトリウム、 0. 05%ツイーン 20 (登録商標）、 pH 7. 4、塩化カルシウム 5 mM) で 3回洗浄した。コーティングが完了した後、プレー卜を、 1 %のゥシ血清アルブミンを含む TBS/NTC 液で、室温で 1 時間処理し、固定した。

組換えコングルチニンまたは天然コングルチニンの単独希釈物 ( 0、 1、 10、 100 および 1 , 000ng/ra l ) あるいは種々の糖類の希釈液との混合物を TBS/NTC 、または 20mMの N-ァセチル -D- ダルコサミン（A) もしくは 10mMの EDTAを含む TBS/NTC に添加した。

TBS/NTCBで 1 , 000または 2， 000倍に希釈したゥサギ抗天然コングルチニン血清およびャギ抗ゥサギ I gG西洋ヮサビペルオ^シダーゼ結合物（バイオ · ラッド社製）を添加し、 37°Cで 1 時間ィンキュペートした。最後に、 TMB 基質液（KPL社製 TMB マイクロウエル . ペルォキシダーゼ基質システム） 100〃 1 を各ゥエルに加えた。 1 Mのリン酸 100 1 を添加する前後に、 450 あるいは 655nm での吸光度を測定した（フロー · ラブス社製タイタ一テツク ' マルチスキャン · プラス M K I Iプレート · リーダー）。そして、糖抑制試験はこの EL I SA 系を用いて、 Lu e t al .，の方法 (バイオケミカル ' ジャーナル（B i ochem. J. )、 284巻、 795— 802頁、 1992年）に従って実施した。

マイクロタイター · プレートを、酵母マンナン（ 1 〃 g/ゥェル）でコートした後、組換えコングルチニンと糖類を共に反応させた。抑制曲線と比較して、結合を 50%抑制する糖濃度を I _{5 0}として算出した。このようにして得られた結果を、表 1 に示した。表 1の結果から明らかなように、組換えコングルチニンの糖結合活性は、天然コングルチニンとほぼ一致していた。また、第 6図および第 7図に示すように、組換えコングルチニンの結合活性は、天然コングルチ二ンと同様に、カルシウムィォン依存性であつたさらに、この結合活性は、 N—ァセチルダルコサミンにより抑制された。一方、組換えコングルチニンに融合したヒスチジンの夕グは、マンナンへの結合活性および結合特異性には影響しなカヽつた。

1

組換えコングルチニンおよび天然コングルチニンの糖特異性

*

I 5 0 (mM) 組換えコンク'ルチニン天然コングルチニン **

N-ァセチル- D-グルコサミン 0.65 1.4

フコース 41.5

Lーフコース 37.8

D—フコース 55.3

D—マンノース 12.3 19.5

マルトース 25.8 49.0

N-ァセチル- D -マンノサミン 26.6

グルコース 39.5 41.5

ガラクトース 46.8 > 100

X -ァセチル- D-ガラクけミン

ラクトース > 100

* ：マンナンとの結合を 50%抑制する糖濃度

** ： Lu, J. et a 1. , B iochem. J. ,

vol. 284, pp.795-802 (1992)

*** ：抑制活性が認められない。実施例 4 ：組換えコングルチニンのコングルチ

ネーション活性試験

組換えコングルチニンおよび天然コングルチニンのコングルチネーション活性を、マイクロ夕イタ一プレートアツセィシステムにより測定した。 Wakamiyaらの方法〔バイオケミカル · アンド • ノ、ィォフィジカル · リサーチ ' コミュニケイシヨンズ（B iochem. Biophys. Res. Coram. ), 187巻、 1270— 1278頁、 1992年〕に従い iC3b結合ヒッジ赤血球細胞を作製した。 10倍希釈した新鲜ゥマ血清と等量の抗フォルスマン抗体の混合物で感作し、 37°Cで 10分間培養して、 1 %iC3b結合ヒッジ赤血球細胞を得た。

ベロナール緩衝液のみ、あるいは 30mMの N-ァセチルダルコサミン含有べロナール緩衝液中に、 50 1 の 1 % iC3b結合ヒッジ赤血球細胞および組換えコングルチニン、もしくは天然コングルチニン 50〃 1 を加え、 37°Cで培養し、コングルチネーシヨン活性を測定した。凝集を生じる最も低濃度のタンパク質を含む濃度をコングルチネーションのカ価とし、その結果を第 8図に示した。第 8図において、レーン Aは天然コングルチニン、 Bは組換えコングルチ二ン、 Cは 30mMの N-ァセチルグルコサミン含有組換えコングルチニンを示す。コングルチネーシヨンの力価は、天然コングルチ二ンが 0.16〃 g/mlであるのに対して、組換えコングルチニンは 1.3 〜 2.5 g/mlであった。また、その活性は、 30mMの N-ァセチルダルコサミン（GlcNAc)で完全に阻害された。実施例 5 ：赤血球凝集抑制（HI)試験

(1) ウィルス

ィンフルェンザ Aウイルスの A/Ibaraki/1/90 (H3N2:ィンフルェンザウィルス A香港型）、 A /Osaka/869/95 (H3N2)、

A /Beijing/352/89 (謂 2)、 A /Adachi/1/57 (H2N2) 、および A VSuita/1/89 (H1N1：インフルエンザウイルス Aソ連型）を、赤血球凝集抑制（HI)試験に用いた。ゥィルスは標準的な方法で、 CAM (卵しょうのう膜）で増殖させ、使用時まで一 70°Cで保存した < ウィルス増殖用培地としては、 3 %組織培養用ビタミン、 0.2% アルブミン、 0.1%グルコース、および 0.2ng/mlのァセチレートトリプシンを含有するィーグル MEM 培地を用いた。 (2) 組換えコングルチニンの赤血球凝集抑制（HI)活性

Okuno et aし，の方法（ジャーナル ' ォブ ' クリニカル ' ミク口バイオロジー（J. Clin. Microbiol. ) 、 28巻、 1308— 1313頁、 1990年）に従い、 1 %ヒョコ赤血球を用い、 96穴マイクロタイ夕一プレートにより実施した。エーテル処理した卵由来のウィルス抗原を用いた。 TBS/C( 5 mMの塩化カルシウム含有 TBS液）中の培養混合液には、 30mMの N-ァセチルダルコサミン又は 10mMの EDTA以外は何も加えない。室温で 1時間培養後、ウィルス介在性のヒョコ赤血球凝集に対する組換え部分コングルチ二ン（rBKg - CRD)の効果を調査した。その結果を、表 2に示す。また、 A /Ibaraki/ 1/90における結果を、第 9図に示す。第 9図において、レーン Aは天然コングルチニン、レーン B、 Cおよび Dは組換え部分コングルチニンで、レーン Bは添加物なし、レーン Cは 30mMの N-ァセチルグルコサミン添加グループ、レーン Dは 10mMの EDTA添加グループを示す。

2

組換えコングルチニンおよび天然コングルチニンの

赤血球凝集抑制（HI)活性の発現濃度（ i g/ml)

* 検査せず, 赤血球凝集抑制（HI)活性は、用量依存性かつカルシウム依存性であった。また、組換えコングルチニンの赤血球凝集抑制（HI) 活性は、天然コングルチニンゃラット肺サ一ファクタントタンパク質ー D、ヒト肺サーファクタントタンパク質一 Dの力価

(Hartshorn et al. , ジャーナル · ォブ · クリニカル · インべスティゲイシヨン（J. Clin. Invest. )、 94巻、 311— 319頁、 1994 年）とほぼ同様の力価を示した。実施例 6 ：中和活性試験

(1) ウィルス

インフルェンザ Aゥィルスの A/Ibaraki/1/90 (H3N2:ィンフルェンザウィルス A香港型）、および A/SuUa/1/89 (H1N1:インフルェンザウィルス Aソ連型）を用いた。

(2) 中和活性試験

Okuno et al. , の方法（ジャーナル ' ォブ ' クリニカル ' ミクロバィォロジー（J. Clin. Microbiol. ) 、 28巻、 1308— 1313頁、 1990年）に従って、中和活性試験を行った。 96穴マイクロタイタープレート上で、組換えコングルチニンとインフルエンザウイルスを混合し、さらに 10%ゥシ胎児血清を含むィーグル MEM 培地で培養された Madin- Darby Canine Kidney (MDCK)細胞を加えて数日間培養した後、各種コングルチニンの中和活性を測定した。ィンフルェンザウイノレスの感染フォーカスを、抗ィンフルェンザウィルス · マウスモノクローナル抗体、抗マウス IgG ャギ血清、ペルォキシダーゼ抗ペルォキシダーゼ（PAP) 染色システムにより検出した。

以下の表 3に、組換えコングルチニンおよび天然コングルチニンの中和活性の比較結果を示した。また、中和価は、 50%感染阻止濃度で示した。 3

組換えコングルチニンおよび天然コングルチニンの

_ウィルス中和価（ i g/ral)

* 検査せず。実施例 7 ：ウィルス増殖（感染拡大）阻止試験

(1) ゥィルス

ィンフルェンザ Aゥィルスの A/Ibaraki/1/90 (H3N2:ィンフルェンザウィルス A香港型）を用いた。

(2) ゥィルス増殖（感染拡大）阻止試験

24穴マイクロタイタープレート上で、 10%ゥシ胎児血清を含むイーグル MEM 培地で培養された Madin-Darby Canine Kidney

(MDCK) 細胞に、インフルエンザウイルスを接種した。細胞を洗浄した後に、 0、 1および 2 g/mlの組換えコングルチニンを含有する 0.5% 卜ラガカントゴム（シグマ社製）を含むィンフルェンザウィルス増殖培地を用いて、 3 日間培養した。実施例 6 (2) の中和活性試験と同様にて操作し、 PAP 染色法にてゥィルス感染フォーカスの総面積を求めた。対照として、組換えコングルチニンを含有しないグループを用いた。その結果を、第 10図 (a) および（b) に示す。第 10図（a) および（b) の結果から明らかなように、組換えコングルチニンは、濃度依存的にインフルェンザウィルスの感染フォーカスの面積を減少させ、ウィルス増殖阻止効果を呈した。なお、この効果は、 2 g/mlの N-ァセチルダルコサミン（GlcNAc)により阻害された（第 11図）。実施例 8 ：コレクチン類の生理活性の検出

ウイルスで予め感染させた細胞での増殖ウイルスの発芽の抑制効果を測定することで、コレクチン類の生理活性を検出する方法を構築した。すなわち、従来の生理活性の検出方法（例えば、実施例 6 に記載の中和活性の検出）とは、先にコレクチン類とゥィルスを混合し、コレクチン類と結合しなかったウイルスを細胞に感染させ、その感染度からコレクチン類とウィルスの結合、つまり中和活性を測定するものであった（第 12図（a) )。これに対して、本発明の検出方法では、ウィルスで予め感染させた細胞で ' の増殖ウィルスの発芽の抑制効果を測定することで、コレクチン類の生理活性を検出しょうとするものである（第 12図（b) )。

そして、実施例 5 に記載の赤血球凝集阻害（H I )活性の測定方法、実施例 6 に記載の中和活性の測定方法、ゥスターンブロット法に従つたへマグルチニン（HA)結合の検定、および実施例 7 に記載の本発明の検出方法に従って、インフルエンザ Aウィルスに対する生理活性を測定した。また、各種コレクチンのインフルェンザ Aゥィルスに対する中和活性を実施例 6 に記載の方法に従つて測定した。それらの結果を、下記表 4および 5 にそれぞれ示しノ ο

H I活性中和活性 HA結合本願方法ゥ、ンコンゲル千-ン

天然型 + + +

組換型 + + +

hMBP

天然型 + + 組換型

ヒトサーファクタントタンパク

(hSP-D)

天然型 + + +

組換型土凡例：十、活性（結合性）有り活性（結合性）無し

注：最小タンパク質濃度とは、対照感染モデルの 50%以下の感染にまで感染抑制を呈するに必要な濃度である。上記表 4および 5から明らかなように、従来法では hMBP は天然型ならびに組換型のいずれでもインフルェンザゥィルスに対する中和活性が認められなかった。これに対し、本発明方法では、天然型 hMBP がウィルス増殖（感染拡大）を阻止するという hMBP に関する新たな知見を得るに至った。なお、天然型 hMBPと組換型 hMBP-CRDについて、対照にコレクチン類を含まない緩衝液を用いて、実施例 7 に記載の本発明の検出方法に従い、そのウィルスの発芽抑制効果を測定した。その結果を、下記表 6および第 13 図に示した表 6

注：最小タンパク質濃度とは、対照感染モデルの 50%以下の感染にまで感染抑制を呈するに必要な濃度である。上記表 6および第 13図の結果から、天然型 hMBP がゥィルス增殖（感染拡大）を阻止するという知見の正当性が確認された。この hMBP の作用に関する新たな知見を別の角度から立証すベく . 以下の実験を行つた。まず、 24穴マイクロタイタープレート上で、 10%ゥシ胎児血清を含むイーグル MEM 培地で培養された Mad i n-Da rby Can i ne K i dney (MDCK) 細胞に、インフルエンザ A ウィルスを接種した。細胞を洗浄した後に、 0、 0. 25および 0. 5 z g/m lの hMBP を含有する 0. 5% トラガカントゴム（シグマ社製）を含むインフルエンザ Aウィルス増殖培地を用いて、 3 日間培養した。実施例 6 (2) の中和活性試験と同様にて操作し、 PAP 染色法にてウィルス感染フォーカスの総面積を求めた。対照として、 1 g/m lの N-ァセチルダルコサミン（G l cNAc)を含むグループを用いた。その結果を、第 14図に示す。第 14図の結果から明らかなように、 hMBP は、濃度依存的にインフルエンザ A ゥィルスの感染フオーカスの面積を減少させ、ゥィルス増殖阻止効果を呈した。そして、部分組換えコングルチニン（rBKg- CRD)、 hMBP, およびゥサギ MBPを用いて、前述した手順に従ってインフルェンザ Aゥィルスに対する生理活性を測定した実験でも同様の傾向が認められた（第 15図）。なお、この場合、 rBKg-CRDについては 1 g/m lの N-ァセチルグルコサミン（G l cNAc)を、また hMBP ならびにゥサギ MBP については 1 a g/m lのマンノースを、それぞれ対照として用いた。

〔産業上の利用可能性〕

本発明によれば、従来、動物（ゥシ）から極めて低収率でしか取得できなかったコングルチニンと同等の生理活性を呈する組換ぇコングルチニンを、人為的に大量に生産する手段を実現ならしめたのである。また、本発明の組換えコングルチニンが、天然型コングルチニンと同質の生理活性を呈することから、医薬品としての有用性も期待できる。さらに、本発明の組換えコンダルチニンが、天然型コングルチニンの部分的構造体であり、天然型コングルチニンと比較してタンパク分子量が小さいことから、精製が容易になるなどの製造工程上の利点も併せ持つものである。

そして、本発明によれば、コレクチン類の生理活性を測定するための新たな検出方法が提供され、コレクチン類の生理活性が従来の検出方法との組み合わせにおいて多角的に評価できる。併せて、本発明の検出方法により、コレクチン類の用途を定める際の適切な判断材料がもたらされる。

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：葛 4。、/ベ： ^® G9½3I e,I00/96df/XDd 0 舰 6 OAV 配列の種類：ペプチド

配列の特徴

存在位置： 2

他の情報：第 2位のァミノ酸は、タンパク質構成ァミノ酸であれば、特に限定されない。

存在位置： 3

他の情報：第 3位のァミノ酸は、タンパク質構成ァミノ酸であれば、特に限定されない。

配列：

G l y Xaa Xaa

1 配列番号： 4 ■ 配列の長さ： 28

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列：

GGCTCGAGGG GGAGAGTGGG CTTGCAGA 28 配列番号： 5

配列の長さ： 28

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖伏

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列：

GGGAATTCTC AAAACTCGCA GATCACAA 28

Claims

5冃求の

1 . 天然コングルチニンの一部を含む組換えコングルチニンであつて、当該組換えコングルチニンが、 G l y-Xaa- Xaa (配列番号 3 ) のァミノ酸配列を二つ含むコラーゲン領域、天然コンダルチニンのネック領域、および天然コングルチニンの糖鎖認識領域を含み、前記 G l y_Xaa- Xaaのアミノ酸配列の第 2位および第 3位のアミノ酸が夕ンパク質構成ァミノ酸である、こと.を特徴とする組換えコングルチニン。

2 . 天然コングルチ二ンの一部を含む組換えコングルチ二ンの製造方法であって、下記工程、すなわち；

(a) 天然コングルチニン D N Aの 631 bp から 1 1 13bpに対応する c D N Aを挿入したベクタ一を構築し、

(b) 前記ベクターを、大腸菌 JM109 に導入して形質転換体を得、 ( G ) 前記形質転換体を、適当な培養培地にて培養し、

(d) 培養した形質転換体をファージ感染させ、および

(e) ファージ感染させた形質転換体から組換えコングルチニンを回収する、

工程を含み、前記組換えコングルチニンが、 G l y- Xaa- Xaa (配列番号： 3 ) のアミノ酸配列を二つ含むコラ一ゲン領域、天然コングルチニンのネック領域、および天然コングルチニンの糖鎖認識領域を含み、前記 G l y- Xaa- Xaaのアミノ酸配列の第 2位および第 3位のアミノ酸がタンパク質構成アミノ酸である、ことを特徴とする組換えコングルチニンの製造方法。

. コレクチン類の抗ウィルス活性を検出する方法であって、下記の工程、すなわち；

(a) ウィルスで感染した細胞を調製し、

( b) 前記細胞にコレクチン類を作用せしめ、および

(c) 前記細胞でのウィルスの出芽の抑制レベルを測定する、工程を含むことを特徴とするコレクチン類の抗ウィルス活性を検出する方法。 . 前記コレクチン類が、マンノース結合タンパク質（MBP) 、ヒトマンノース結合タンパク質（hMBP)、コングルチニン、および組換えコングルチニンからなるグループから選択される物質である請求の範囲第 3項に記載の抗ウイルス活性を検出する方法 _c . 前記ウィルス力く、インフルエンザ Aウィルスである請求の範囲第 3項もしくは第 4項に記載の抗ウィルス活性を検出する方法。 . 抗インフルエンザ Aウィルス活性を有するマンノース結合夕ンパク質（MBP) 。 . 抗インフルエンザ Aウィルス活性を有するヒトマンノース結合夕ンパク質（hMBP)。