[go: up one dir, main page]

WO1997005243A1 - Gene encoding protein having asymmetric hydrolase activity on 4-substituted-1,4-dihydropyridine derivatives and expression product of the same - Google Patents

Gene encoding protein having asymmetric hydrolase activity on 4-substituted-1,4-dihydropyridine derivatives and expression product of the same Download PDF

Info

Publication number
WO1997005243A1
WO1997005243A1 PCT/JP1996/002147 JP9602147W WO9705243A1 WO 1997005243 A1 WO1997005243 A1 WO 1997005243A1 JP 9602147 W JP9602147 W JP 9602147W WO 9705243 A1 WO9705243 A1 WO 9705243A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ala
gly
thr
asp
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1996/002147
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Akira Arisawa
Motoko Matsufuji
Takurou Tsuruta
Kazuyuki Dobashi
Takashi Nakashima
Kunio Isshiki
Takeo Yoshioka
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mercian Corp
Original Assignee
Mercian Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mercian Corp filed Critical Mercian Corp
Priority to JP50747097A priority Critical patent/JP3529099B2/ja
Priority to US09/000,016 priority patent/US6143541A/en
Priority to EP96925136A priority patent/EP0846759B1/en
Priority to AT96925136T priority patent/ATE251214T1/de
Priority to DE69630229T priority patent/DE69630229D1/de
Publication of WO1997005243A1 publication Critical patent/WO1997005243A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D211/00—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings
    • C07D211/04—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D211/80—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D211/84—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen directly attached to ring carbon atoms
    • C07D211/86—Oxygen atoms
    • C07D211/88—Oxygen atoms attached in positions 2 and 6, e.g. glutarimide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D211/00—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings
    • C07D211/04—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D211/80—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D211/84—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen directly attached to ring carbon atoms
    • C07D211/90—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures

Definitions

  • the present invention relates to a protein having an asymmetric hydrolytic enzyme activity of a 4-substituted-1,4-dihydropyridine derivative, a gene encoding the protein, and use of the protein.
  • a general method for synthesizing optically active 4-substituted-1,4-dihydropyridine derivatives, particularly 3,5-dicarboxylic acid monoesters includes (4R) -1,4-dihydroxypyridine-3.
  • a method is known in which 5-carboxylic acid monoester is used as an intermediate, and a preferable ester residue is introduced into the intermediate. [A. Ashiraori et al .; Chem. Pharm. Bull. Vol. 39, 108 (1991)].
  • a method for producing the optically active intermediate (4R) -1,4-dihydridopyridine-3,5-dicarboxylic acid monoester is described in the chemical method of Shibanuma et al. [Chem. Pharm.
  • the present inventors have proposed a simpler and more efficient method for microorganisms, for example, genus Streptomyces, 4-substituted-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylic acid diesters using cultures of the genus (Pa ecilomyces), the genus Botryodioplodia, the genus Alternaria, etc. Proposed a method for efficiently converting the corresponding 3,5-dicarboxylic acid monoester into a corresponding monoester (see WO 94/05637 pamphlet).
  • an object of the present invention is to provide an isolated gene, an expression plasmid containing the same, a transformant using such a plasmid, and a transformant using the same, which can contribute to the efficient production of the optically active compound.
  • the present inventors have proposed a 4-substituted-1,4-dihydropyridine derivative (hereinafter, referred to as “1,4-DHPDJ”) from the chromosomal DNA of Streptomyces viridosporus belonging to the genus Streptomyces.
  • 1,4-DHPDJ 4-substituted-1,4-dihydropyridine derivative
  • the protein according to the present invention was found to have subtilisin (Jacobs, M. et al.) On the amino acid sequence. , Nucleic Acids Res. (1985) JL3: 8913-8926) and found to have Asp. His and Ser as active sites.
  • the present invention comprises at least the sequence of Asp (29) or Ser (238) in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7, and An isolated gene encoding a protein having an asymmetric hydrolase activity of DHPD or a DNA fragment capable of hybridizing with the gene is provided.
  • a plasmid constructed by incorporating the gene into a vector, a transformant using the plasmid, and a transformant thereof The present invention also provides a method for producing a protein having an asymmetric hydrolase activity of 1,4-DHPD by culturing E. coli.
  • R is a lower alkanoyl group, a heterocyclic carbonyl group, a halo-substituted acetyl group, an alkoxyacetyl group, an aryloxyacetyl group, a substituted or unsubstituted phenyl lower alkanoyl group, a phenyl-substituted or unsubstituted A substituted lower alkenyl group, an alkoxy or alkenyloxycarbonyl group, an aralkyloxycarbonyl group or an organic sulfonyl group, and n represents an integer of 2 to 4) or a salt thereof.
  • Optical activity (4R) ⁇ characterized by recovering an optically active 4-substituted-1,4-dihydropyridine compound or a salt thereof.
  • a method for producing a 1,4-dihydro-2,6-dimethyl-4- (2-trophenyl) pyridine-3,5-dicarboxylic acid monoester derivative is also provided.
  • dicarboxylic acid monoester derivatives thus produced are useful as synthetic intermediates of optically active 1, 41-DHPD useful as prophylactic and therapeutic agents for ischemic heart disease and hypertension, etc., which are known per se. is there.
  • Figure 1 shows the DNA fragment containing the gene (dhpA) encoding the protein (DHPA) encoding the asymmetric hydrolase activity of 1,4-DHPD derived from the chromosomal DNA of Streptomyces pyridosporus. It is a restriction enzyme map.
  • FIG. 2 is a structural diagram of plasmid PDE88 carrying a gene according to the present invention.
  • FIG. 3 shows SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis) for estimating the molecular weight of a protein (DHP-A) having 1,4-DHPD asymmetric hydrolase activity according to the present invention. It is a drawing showing the result of.
  • FIG. 4 is a graph showing the proteinase activity of the protein (DHP-A) and the protease P6 according to the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the lipase activity of the protein (DHP-A) and lipase B according to the present invention in comparison.
  • FIG. 6 shows the relationship between the protein (DHP-A) and the protein according to the present invention.
  • 4 is a graph showing the thermal stability of P6 in comparison.
  • FIG. 7 is a structural diagram of plasmid pDE89.
  • FIG. 8 is a structural diagram of plasmid pDE87.
  • FIG. 9 is a structural diagram of plasmid pDE91.
  • cat-5 represents a chloram funicole resistance gene.
  • FIG. 10 is a structural diagram of plasmid pDE92.
  • Fig. 11 shows a subtilisin derived from Bacillus licheniformis (acillus lincheniformis) (Jacobs, M. et al., Nucleic Acids Res. (1985) 13: 8913-8926) and the evening protein (DHP-A) according to the present invention.
  • the N-terminal numerical value 205 'and the C-terminal numerical value 734' correspond to the amino acid numbers of SEQ ID NO: 2, ie, Leu (205) and Ile (734), respectively.
  • protein having an asymmetric hydrolase activity of a 4_-modified-1,4-dihydropyridine derivative means at least a compound represented by the above formula (I) as a substrate.
  • the present inventors have concluded that the protein having such activity is at least Asp (29) in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7. (In this specification and the claims, the numeral described in brackets following the amino acid symbol indicates the position in the corresponding sequence. Number means).
  • the protein according to the present invention has serine (as the active site) based on the amino acid sequence of the subtilisin derived from Bacillus linch eniforrais shown in FIG. 11 compared with the amino acid sequence of the protein according to the present invention. It is presumed that it has aspartic acid (Asp) and histidine (His) residues in addition to the Ser) residue, which can be understood from the fact that it can be regarded as belonging to the serine protein family. .
  • an isolated gene that encodes any protein that contains the sequence up to Ser (238) as an essential part and has an asymmetric hydrolytic enzyme activity of 1,4-DHPD.
  • a DNA fragment capable of hybridizing with the gene is provided.
  • a DNA fragment capable of forming a hybrid with a gene includes a nucleotide sequence common to a certain portion of the gene and several different nucleotides at the 5 ′ end or 3 ′ end or an intermediate sequence. And those having a sequence.
  • Such fragments may, depending on their expression, produce a protein having the same enzymatic activity as the protein produced by the corresponding gene, or at least be used for cloning of said gene. it can.
  • a typical example of the protein is described in SEQ ID NO: 7. Starting from the one consisting of 520 amino acid residues and removing several amino acid residues at the C-terminal side, for example, the amino acid of Leu (1) or Ser (518) of SEQ ID NO: 7 And those represented by the amino acid sequence of Leu (1) or Pro (512).
  • genes provided by the present invention can be transformed into an appropriate expression vector, transformed into an appropriate host microorganism, and transformed into an asymmetric hydrolase activity of 1,4-DHPD.
  • a recombinant plasmid carrying the gene As the invention vector that can be used, it is convenient to use one constructed so as to stably express a foreign gene.
  • the invention vector include, but are not limited to, aminoaminoglycoside phosphotransferase. Pi J680 and p with the coding gene (aph or aphll)
  • fdhpAJ a gene encoding a protein having the asymmetric hydrolase activity of DHPD
  • the insert fragment of SEQ ID NO: 3 is obtained from the chromosomal DNA of Streptomyces pyridosporus
  • the restriction enzyme ⁇ 3AI is partially degraded, so if you try to cut it out of plasmid with Sau3AI, it will break apart. Therefore, for example, a PCR is carried out using appropriate primers to amplify 2.54 kb SacI-Sau3AI (modified to BamHI), and the amplified fragment is ligated to the HI site or pi site on the aph gene of pIJ680.
  • the plasmid is inserted into the phI site on the aphll gene of J425, and the insertion direction of the dhpA gene is in the opposite direction to the aph gene or aphll gene, respectively.
  • Plasmids are functionally meaningless 29 amino acids (see SEQ ID NO: 5) (Pi J 680) or 15 amino acids (see SEQ ID NO: 6) (pi J 425) proteins after 734 amino acids from the dhpA protein Gives the fused product.
  • the gene of the present invention as described above may be, but is not limited to, Streptomyces pyridosporus, for example, deposited on July 29, 1992 at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, and then the international It can be advantageously prepared from strain A-914, which has been transferred to the depositary authority under the provisions of the Budapest Treaty and has a deposit number of FERM BP-4334.
  • the gene of the present invention is a DNA fragment of about 3.0 kb cut out from the chromosome of the strain by the restriction enzyme Sau3AI, and is included in the fragment represented by the restriction enzyme map in FIG.
  • isolated gene encodes the DNA in the form of the DNA fragment, and the protein itself having the desired enzyme activity from the fragment. It is used in the concept to include only the nucleotide portion and those in which the foreign nucleotide portion is in an additional form. Those in the latter form can be easily identified and isolated by those skilled in the art by sequencing the DNA fragment, as described later.
  • a DNA fragment containing a gene (dhpA) encoding a protein having an asymmetric hydrolase activity of 1,4-DHPD was obtained by the genetic engineering method well known in the art. Can be easily obtained from Many methods have been taught in this manual, and they can be used.However, since the A-914 strain is an actinomycete, an experimental book describing the genetic engineering method of actinomycete, for example, DA Hopwood et al .: It is desirable to follow Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual (1985) (John Innes foundatron).
  • All DNAs are extracted from the A-914 strain by the SDS-phenol method. This The DNA is partially degraded by the restriction enzyme ⁇ 3AI. Next, the digest is subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and fractionated into fragments that are easy to incorporate into vectors. This fractionated DNA has the same cohesive end as ⁇ 3AI ⁇ HI, Bglll. Bell is a vector that can be used as a cloning site ⁇ Plasmids such as pIJ702, which can use Bglll, T4DNA Ligation is used to ligate.
  • a transformant expressing a protein having the desired activity can be isolated from the transformants.
  • the DNA fragment containing dhpA of the present invention is preferably present in a form incorporated into the plasmid of the transformant, which is convenient in view of subsequent use.
  • a plasmid can be obtained by culturing the transformant and isolating the plasmid according to the alkali-SDS method.
  • the resulting plasmid DNA is cleaved with various restriction enzymes, and the cleavage site can be mapped by analyzing the length of the cleaved DNA fragment by agarose gel electrophoresis.
  • a restriction map of the DNA fragment integrated into the plasmid can be prepared, as shown in FIG. Therefore, whether the DNA fragment containing dhpA of the present invention has been obtained or not can be determined by measuring the asymmetric hydrolase activity of 1,4-DHPD of the transformant using the plasmid into which the DNA fragment has been incorporated, and It can be confirmed by comparing the restriction enzyme map of the DNA fragment with that of FIG. 1 or, if determined by sequencing, the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the DNA fragment thus obtained is further shortened by treating it with a restriction enzyme or exonuclease, if necessary, and various expression vectors including the vector, for example, pIJ350, pIJ41, pIJ 943.
  • various expression vectors including the vector, for example, pIJ350, pIJ41, pIJ 943.
  • actinomycete vectors such as pIJ922 and pUC18 and pUC19
  • the plasmids of the present invention can be provided by incorporating them into Escherichia coli vectors widely used in general genetic manipulation.
  • Plasmids according to the present invention can be introduced into hosts that can accept them.
  • a particularly useful combination is a vector, which uses high copy plasmid of actinomycetes represented by pi J702 as described above, and uses as a host, actinomycetes such as Streptomyces lividans 66, It is preferable to use Streptomyces pyridosporus A-914 Streptomyces clavus N-1284. The reason is that 0dhpA can be expressed at a high level, and (2) the introduced plasmid is structurally stably retained. It depends. In addition, particularly when the host is Streptomyces pyridosporus (S.
  • a host microorganism for example, Streptomyces viridosporus A-914 (pDE88) -5
  • a plasmid carrying any of the above-mentioned genes is transformed with the transformant thus obtained.
  • a strain selected from the group consisting of Streptomyces pyridosporus, Streptomyces lividans and Streptomyces crabs.
  • the A-914 (P DE 88) - 5 strain deposited with the life Institute of Advanced Industrial Science and Technology on July 10, 1995, after having been given the accession number FERM P- 15037, of the Budapest Treaty It has been transferred to an international deposit under the rules and deposited under the accession number of F ERM B P-5574.
  • transformants produce a protein having the asymmetric hydrolase activity of 1,4-DHPD by culturing in a nutrient medium. Therefore, by recovering the protein having the desired enzyme activity from the culture, A protein having the enzyme activity can be produced.
  • a protein according to a preferred embodiment of the present invention includes a protein represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7 (Leu (1) to Thr (520)), and a part of the C-terminal side thereof.
  • Examples include those represented by amino acid sequences added by lie.
  • the nutrient medium that can be used for the production of the protein according to the present invention is not particularly limited, but any medium that can be used for culturing a normal microorganism, for example, any carbon source that can use the microorganism can be used. In any case
  • Specific examples include sugars such as glucose, fructoses, sucrose, and dextrin; sugar alcohols such as glycerol and sorbitol; and organic acids such as fumaric acid and citric acid. Can be.
  • sugars such as glucose, fructoses, sucrose, and dextrin
  • sugar alcohols such as glycerol and sorbitol
  • organic acids such as fumaric acid and citric acid.
  • the amount of these carbon sources added to the medium is preferably about 0.1 to 10%.
  • Nitrogen sources include, for example, inorganic acid ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate and ammonium phosphate; organic acid ammonium salts such as ammonium fumarate and ammonium citrate; meat extract, yeast extract and corn steep liquor; A natural organic nitrogen source such as casein hydrolyzate can be used. Of these, organic nitrogen sources are often It can also be used as a carbon source. The appropriate addition amount of the nitrogen source is usually 0.1 to 10%.
  • inorganic salts examples include metal salts of aluminum phosphate such as potassium phosphate and sodium phosphate; alkali metal salts such as potassium chloride and sodium chloride; magnesium sulfate, ferrous sulfate and the like. Metal sulfate and the like can be used. The amount used is suitably in the range of 0.001% to 1%. Cultivation of microorganisms (transformants) is performed at 20-40 ° C, preferably 28-37 ° C, pH 5-9, preferably pH 6-8 under the above medium in aerobic conditions. do it.
  • the protein having an asymmetric hydrolase activity of 1,4-DHPD thus produced is in an isolated form, or a culture itself, a crude purified product of a culture, or an immobilized form.
  • the enzyme active protein and the compound of the formula (I) can be brought into contact in an aqueous medium and used to produce the compound of the formula (II). Therefore, according to the present invention, there is also provided a method for enzymatically converting a compound of the formula (I) into a compound of the formula ( ⁇ ) using the protein having the asymmetric hydrolase activity of 1,4-DHPD. .
  • a buffered aqueous solution can be used if necessary.
  • the compound of the formula (I) is dissolved in water or an auxiliary solvent such as acetone, dimethyl sulfoxide, or the like, added to the solution, and the pH is adjusted to 7.0 to 9.5. It can be converted into the compound of formula (II) by reacting it with the enzyme. After the completion of the reaction, the pH is adjusted to 1.5 to 3.0 using dilute hydrochloric acid and the like, and then extracted with an organic solvent such as chloroform, ethyl acetate, butyl acetate, and butanol.
  • the compound of formula (II) can be obtained by recrystallization or by means of phase transfer, precipitation and the like.
  • S. viridosporus 8-914 strain (? £ 1 ⁇ 1 BP-4334) was inoculated into 25 ml of TSB medium (Difco Tryptic Soy Broth 3.0%) and cultured with shaking at 28 ° C for 3 days.
  • TSB medium Difco Tryptic Soy Broth 3.0%
  • 2 ml of YEME medium (34% saccharose, 0.3% Bacto Yeast Extract, 0.5% Bacto Pepton, 0.3% Bacto Malt Extract. 0.5% Glycine. 5 mM MgCl 2 , pH not adjusted)
  • the cells were subcultured in 50 ml and cultured with shaking at 28 ° C for 40 hours.
  • the cells were collected from this culture by centrifugation at 8000 X g for 10 minutes, and the whole DNA was collected according to the method described in Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces / John Innes Foundation 1985. Was extracted and purified.
  • M buffer 10 OmM Tris-HC 1 pH 7.5, 50 OmM NaCl, 10 OmM MgCl 2 , 10 mM dithiothreitol
  • Sau3AI 1 unit (0.25 / 1
  • gel loading buffer (25% Ficol 0.25% bromphenol blue), which is 10 times higher than that of 11 ⁇ 1, and dispense into a 4cm 13% x 13cm 0.8% agarose gel.
  • Decompose sphage DNA-Hindlll The product was run at 30 V as a size marker. After the electrophoresis, a gel portion containing DNA corresponding to 4 to 6 kb was cut out, and the DNA was recovered and purified using an Ultrafree C3 unit 0.45 m (manufactured by Millipore).
  • This DNA solution (concentration 0.5 ⁇ gZ ⁇ 1) 91 was added to a pre-dephosphorylated ⁇ 1 ⁇ linearized pi J702 DNA solution (concentration 1 ng / ⁇ 1) 11
  • a ligation reaction (16 ° C, 3 hours) was performed using Ligation Kit ver.1 (Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • a dephosphorylated Bglll linearized DNA solution of the vector pIJ702 was prepared as follows. Total amount 50 1 of the reaction solution containing the p IJ 702 DNA 10 g (1 OmM Tris-H C 1 pH 7.5, 10 OmM NaC 1 OmM MgC 1 2: 1 mM Jichiosurei torr) to 25 Interview Stevenage DOO (2.5 / 1) Of Bglll, and reacted at 37 ° C for 4 hours, followed by extraction with chloroform, chloroform mixture, ethanol precipitation, 70% ethanol washing and drying in that order, as described above, was dissolved in 10 mM Tris-HC1 pH 8.0.
  • This solution In the solution, add a 10-fold concentration of 50% Al-rich phosphatase buffer (500 mM Tris-HC 1 pH 8.0, 1 mM EDTA) and calf intense alkaline phosphatase (Toyobo Co., Ltd.) 1 ⁇ (1,7 units), and incubate at 37 ° C for 1 hour 65. The enzyme was inactivated by incubating at 45 min with C. After that, extraction with a mixed solution of phenol and chloroform, and a form with black mouth, ethanol precipitation, washing, and drying were performed under the same conditions as described above. This DNA was dissolved in 101 TE, and a solution of finally dephosphorylated B gill linearized pIJ702 DNA was prepared.
  • 50% Al-rich phosphatase buffer 500 mM Tris-HC 1 pH 8.0, 1 mM EDTA
  • Toyobo Co., Ltd. calf intense alkaline phosphatase
  • DHP medium 3% TSB, 1.5% bactoga-500 g / m1 M801
  • the cells were cultured and cultured at 28 ° C for 5 days. A portion of the cells is cut out with a cork borer (inside diameter 6 mm) together with the medium, and a piece of medium is attached to each lane of silica gel TLC plate (vertically cut with lmm width every 8 mm). The medium was leached out and dried for 30 minutes.
  • This plate was developed with a solvent system consisting of black form-methanol (6: 1), and the asymmetric hydrolyzate M802 (Rf value 0.59) M802 (short 1? 0.53).
  • Natsuta pDE88 was digested with various restriction enzymes, and the length of the fragment was analyzed by agarose gel electrophoresis.As a result, the donor DNA fragment containing about 3.0 kb of dhpA shown in the restriction map in Fig. 1 was converted to vector P. It was built into IJ702.
  • Figure 2 shows the structure of pDE88.
  • Example 2 Obtaining a transformant and measuring enzyme activity
  • Protoplasts were prepared from Actinomyces. Calvus N-1284 in accordance with the conventional method described in the above-mentioned experiment by Hopwood et al. Preparing pro Bok Plast from the method described above as well as S. viridosporus A- 9 14 except for the use of TS B medium supplemented with 0.5% glycine and 5 mM Mg C 1 2 instead of YEME culture ground at the time of culture did.
  • the suspension (lm1) containing 1 ⁇ 10 9 cells of each protoplast thus obtained was placed in a sterile polystyrene tube (15 ml, manufactured by Corning), and centrifuged (5000 ⁇ g).
  • Example 1 was added to the obtained plasmid pDE88DNA solution (concentration 1 / gZm1) and mixed well.
  • This ⁇ buffer 0.24% Sakkaro scan, 0.2% trace Ereme emissions preparative solution (below 1), 0.023% K 2 S 0 4, 1.5% C a C 1 2, 50 mM Tris- maleic phosphate pH8.0
  • Protease P 6 (Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), which is known to have the asymmetric hydrolytic ability of 1,4-DHPD [T. Ad achietal; Tetrahedron on A symme try Vol. 4, 2061 (1933)].
  • .clavus N-1284 and .viridosporus A-9914 are strains that originally express asymmetric hydrolysis activity of 1,4-DHPD, but are transformed with PDE88.
  • the enzymatic activity (compared in terms of the amount of protease P6) in those culture solutions increased more than four times that of each host.
  • lividans is a strain that originally shows no enzyme activity, but it is one of the transformants.In the culture solution of lividans (p DE 88) -1, 6.8 mg in terms of proteinase P6 is contained. / m1 specific activity was detected. This is 5.6 times that of S. clavus N-1 284 and.
  • the reaction was performed using ⁇ -801 as a substrate, and the asymmetric hydrolyzate ⁇ -802 was measured by high performance liquid chromatography (HP LC).
  • HP LC high performance liquid chromatography
  • the protein solution (0.1 ml, 30 mg / m1 M80 1-dimethyl sulfoxide solution, 5 ⁇ 1) was sequentially mixed and incubated at 40 ° C for 1 hour. After 1 hour, 0.02M KH 2 P0 4: methanol - 1: the reaction was stopped was 0. 1 ml was added the reaction to 1 solution 2.4 ml.
  • Viridosporus A-914 (pDE88) -5 was inoculated into 30 ml of C medium supplemented with 5 zg / ml thiopeptin, and cultured with shaking at 28 ° C for 4 days. The supernatant was collected from the culture by filtration. (Subsequent operations were performed at 4 ° C.) Ammonium sulfate was added to the supernatant so as to be 60% saturated. After stirring for 3 hours, the mixture was centrifuged at 9000 xg for 20 minutes to obtain a supernatant. Further, ammonium sulfate was added to the supernatant to 80% saturation, and the mixture was stirred for 18 hours. The precipitate obtained after centrifugation at 9000 ⁇ g for 20 minutes was dissolved in distilled water to obtain a 60-80% ammonium sulfate fraction, which was subjected to the following purification.
  • Butyl-Toyopearl 650 (trade name: equilibrated with 20 ml of the above-mentioned 60-80% ammonium sulfate fraction fraction at a flow rate of 34 m 1 / hr with 5 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 1.8 M ammonium sulfate) It was applied to a column (26 x 27.5 cm) manufactured by Tosoh Corporation. A linear concentration gradient of 1.8 M from ammonium sulfate 1.8 M was prepared with 1000 mL of 5 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 1.8 M and 0.4 M ammonium sulfate to perform elution.
  • the obtained DHP-A fraction was subjected to SDS-PAGE (4-20% gradient) according to the method of Laemmli (Nature, 227, 680-685 (1970)), and the molecular weight was calculated. (The results are shown in Fig. 2.)
  • lane 1 is the molecular weight marker
  • lane 2 is the culture supernatant of .viridosporus A-914 (pDE88) -5
  • lane 3 is 60-80% ammonium sulfate of the same culture solution.
  • Fraction, lane 4 is the DHP-A fraction of A-914.
  • the molecular weight of DHP-A estimated from this was about 55 kDa.
  • protease P6 and DHP-A were measured according to the activity measuring method of Example 2.
  • protein quantification was performed using a protein assay kit (Bio-Rad), and the specific activity was calculated.
  • the activity was defined as 1 U of the enzyme producing 1 mg of M-802 per hour.
  • DHP-A showed a specific activity 2.12 times higher than that of protease P6.
  • Protease activities of DHP-A and protease P6 were measured by an ultraviolet absorption method. That is, as a substrate solution, add 0.6 ml of hammerten casein, 10 ml of 0.1 N sodium hydroxide solution, 30 ml of distilled water, and 40 ml of 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 8.5) to adjust the pH. It was adjusted to 8.5 and made up to 100 ml with distilled water. Add 150 mM 1 of 2 mM calcium acetate solution to 501 of various concentrations of protease P6 and DHP-A, An enzyme solution was used.
  • the lipase activity of DHP-A and lipase B was measured using Lipase UV Autotest Co. (Wako Pure Chemical Industries). The activity was defined as 1 U where the amount of protein exhibiting an absorbance at 340 nm of 1.0 after reaction at 37 ° C. for 6 minutes was 1 U. Figure 5 shows the results. DHP-A did not show lipase activity.
  • the protein DHP-A having an asymmetric hydrolase activity of 1,4-DHPD of the present invention is different from the conventional enzymes protease P6 and lipase B used for the same purpose.
  • the property of the protein having an asymmetric hydrolase activity of 1,4-DHPD of the present invention that shows little protease activity has an autolytic reaction that causes a decrease in the activity of protease P6. It means that it is difficult.
  • Example 10 The enzyme solution purified in Example 4 was desalted and concentrated in an ultra-free C3LGC (manufactured by Millipore) with a centrifugal filtration tube having a cut-off molecular weight of 10,000 to obtain a 2 mg Zm 1 solution. Add 2.5 ⁇ 1 of this enzyme solution to P hastGel
  • the N-terminal sequence was analyzed using a protein sequencer type PSQ-1 (manufactured by Shimadzu Corporation), and the sequence consisting of Leu-Asp-Thr-Ser-Val-Gly was determined. This matched the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 from the 205th to the 210th amino acid sequence. From this, the protein having asymmetric hydrolase activity of 1,4-DHPD (DHP-A) according to Example 4 The N-terminus was processed and found to start at leucine at position 205.
  • PSQ-1 protein sequencer type PSQ-1 (manufactured by Shimadzu Corporation)
  • the enzyme solution purified in Example 4 was replaced with a 0.1% formic acid solution in a centrifugal filtration tube with a cut-off molecular weight of 10,000 and Ultrafree C3 LGC (manufactured by Millipore), followed by desalting.
  • ⁇ Concentrated to a solution of 2 mgZm1.
  • the molecular weight of the enzyme protein was measured in positive ion mode using a high-performance quadrupole triple mass spectrometer AIIIIII (manufactured by Perkin Elmer Sociex).
  • [M + H] + (where M represents the molecular weight of the enzyme protein and H represents the molecular weight of the protein) gave a value of 52501, which is the 205th amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. Since the estimated molecular weight from Leu to the 72nd Thr of 524 is very close to 5250.61, the protein having asymmetric hydrolase activity of 1,4-DHPD according to Example 4 (DHP — A) was found to be mainly a protein whose C-terminus was processed and ended with Thr at position 724 (see SEQ ID NO: 7).
  • S. viridosporus A-914 (pDE88)-Inoculate 0.45 ml of the frozen seed of 5 strains into a 250 ml flask containing 30 ml of C medium and 28 ° C was cultured on a rotary shaker for 45 hours to obtain seeds.
  • the seeds cultured in this manner 60 ml, were used as antifoaming agents in C medium from which thiopeptin had been removed, 0.09% KM-75, 0.09% adecanol L G-126
  • the cells were inoculated into 15 liters of a medium supplemented with, and cultured at 28 ° C for 5 days. The resulting culture was filtered to obtain 9.5 liters of the filtrate.
  • P-902 and P-903 are represented by the following equations.
  • Example 10 Restriction of dhpA Gene Region Essential for Expression of Protein Having Asymmetric Hydrolysis Activity of 1,4-DHPD of Host-Vector System
  • Streptomyces lividans 66 transformed with PDE 88 expressed a protein with asymmetric hydrolysis activity of 1,4-DHPD as described above, it is essential for the expression of the same activity.
  • the region was thought to be present in the 3.0 kb Sau3AI insert in pDE88.
  • pDE89 FIG. 7
  • pDE87 FIG. 8
  • pDE880.2 / zg was digested with ⁇ 1, and the obtained DNA fragment was subjected to a self-cyclization reaction using Ligation Kit version 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • Plasmid pDE89 was prepared from the transformant obtained by transforming Streptomyces 1 ividans 66 with this reaction solution, according to the method described in the experimental manual of Hopwood et al. Already described in Example 1. Made. pDE89 is a plasmid in which a 0.64 kb fragment has been deleted from pDE88.
  • the method for preparing pDE89 is the same as the method for preparing PDE89 except that it is decomposed with ⁇ I instead of decomposed with ⁇ I.
  • pDE87 is a plasmid in which a 1.8 kb fragment has been deleted from pDE88.
  • Streptomyces lividans 66 transformed with pDE89 showed asymmetric hydrolysis activity of 1,4-DHPD
  • Strept omyces lividans 66 transformed with pDE87 showed asymmetric 1,4-DHPD.
  • No hydrolytic activity was exhibited. This indicates that the region essential for the expression of the protein having asymmetric hydrolysis activity of 1,4-DHPD is limited to 2.5 kb between ⁇ I- ⁇ 3AI, and the ⁇ I site contained therein is limited to 2.5 kb. Suggests that it is required for the expression of the activity.
  • Example 11 Subcloning of 1 dhpA Gene into Sequencing Vector (pDE91)
  • pDE88l ⁇ g was digested with Sacl and BamHI. This degraded product was mixed with 0.2 / g of ⁇ 55HI degraded product of Vecta-'plasmid p KF3 (Takara Shuzo Co., Ltd.) and ligated with Ligation Kit version 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.). After the reaction, Escherichia coli TH2 competent cells (Takara Shuzo Co., Ltd.) are transformed with this solution, and the recombinant selective medium (1% pactotryptone, 0,5% yeast extract, 0,5% Plasmid pDE91 (FIG.
  • the recombinant selective medium 1% pactotryptone, 0,5% yeast extract, 0,5% Plasmid pDE91 (FIG.
  • pDE91 is a plasmid obtained by inserting a 1.8 kb acl-BamHI fragment derived from PDE88 into pKF3.
  • PDE 9 2 pDE88l / g was decomposed with ⁇ iHI and ⁇ I. This degradation product was mixed with 0.2 ⁇ g of the ⁇ 5 ⁇ -degradation product of pKF 3. Ligation and transformation were carried out in the same manner as in the construction of pDE91, and plasmid PDE92 (FIG. 10) was prepared from the obtained strain.
  • PDE92 is a plasmid obtained by inserting a 0.9 kb BamHI- ⁇ 1 fragment derived from PDE88 into pKF3.
  • 0 £ 91 was divided into 7 tubes of 1 / zg each and decomposed by Sacl, PshBI and Sphl, PshBI and Xhol, Ps-hBI and Mlul, Xbal and ⁇ I, and ⁇ I, and Thereafter, using a DNA Blunting Kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), a DNA end blunting reaction and a self-cyclization reaction were performed. Using this solution, a deletion plasmid was prepared from a strain obtained by transforming an E. coli TH2 competent cell.
  • pDE925g was digested with BaI and ⁇ I, and 400 b (base pair) of DNA was removed from the ⁇ HI end by exonuclease III / S1 nuclease treatment.
  • pDE9255 ⁇ g was digested with Xhol and Sacl, and the DNA of 160b and 450b was scraped off from the end by exonuclease III / S1 nuclease treatment, followed by ⁇ BI. Decomposed. DNA deletion blunting reaction and self-cyclization reaction were performed on these deleted DNA fragments using DNA Blunting Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). Using this solution, a deletion plasmid was prepared from a strain obtained by transforming E.
  • nucleotide sequence was determined using DNA Sequencer 377 (manufactured by Applied Biosystems, Inc.). went. As a result of joining the sequence data of each plasmid, The nucleotide sequence of 2539b from the ⁇ I site to the ⁇ 3AI site, which is a region essential for the expression of the 4-substituted 1,4-DHPD asymmetric hydrolysis activity shown in Example 8, was determined.
  • the open reading frame (0RF) was examined according to the method of Bibb et al. (Gene, 30, 157 (1984)). As a result, 0RF shown in the sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing was found.
  • This sequence contained the Mlul site shown in Example 8 (DNA sequence 858-863). The gene starts from GTG at position 338 of the DNA sequence of SEQ ID NO: 1, but from the end thereof, the end of the region defined in Example 8, that is, the DNA sequence of position 253 of SEQ ID NO: 253 (C: cytosine position of Sau3AI site GATC) No stop codon was found by now.
  • the sequence of vector pIJ702 that is, the melanin pigment-producing gene (mel) region derived from Streptomyces antiepiotics ( ⁇ epto myces antibioticus) is in the direction of the dhpA gene. And adjacent to each other.
  • mel melanin pigment-producing gene
  • TAA stop codon
  • the amino acid sequence was determined from the DNA sequence corresponding to the translation region so far, and is shown in SEQ ID NO: 1 together with the DNA sequence.
  • the same amino acid sequence is shown as SEQ ID NO: 2.
  • the base sequence (sequence necessary for expressing the function of the dhpA gene of the sequence shown in SEQ ID NO: 1, ie, the protein having the asymmetric hydrolysis activity of 1,4-DHPD in the host-vector system described above (sequence)
  • the amino acid corresponding to the DNA sequence of No. 1 (position 1-2539) is shown in SEQ ID NO: 3.
  • genes encoding 5 proteins capable of enhancing the productivity of a protein having an asymmetric hydrolase activity of 1,4-DHPD by a microorganism Further, according to the present invention, there are also provided an expression plasmid incorporating such a gene, and a transformant using the same. Furthermore, according to the present invention, a protein having an asymmetric hydrolase activity of 1,4-DHPD can be efficiently produced by using such a transformant.
  • the asymmetric 1,4-DHPD hydrolyzing protein according to the present invention has low protease activity and therefore has high stability under various reaction conditions, and is industrially optically active 1,4-dihydroxypyridine. It is advantageous for the synthesis of derivatives.
  • the present invention can be used in the manufacturing industry of various compounds using microorganisms and the pharmaceutical manufacturing industry.
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Streptomyces viridosporus Strain name: A-914
  • Organism name Streptomyces * Streptomyces antibiot icus
  • GCC ACG GTC GCC ACG GCC GCC GCC GTG GCC CTC GCG GCC GGC ATG ACC 403 io Ala Thr Val Ala Thr Ala Ala Ala Ala Val Ala Leu Ala Ala Gly Met Thr
  • ATC CGC AAG GTC GAC GGC CAC ACC CTC GTG CTG CCG GCG GAC GCC GCC 643 lie Arg Lys Val Asp Gly His Thr Leu Val Leu Pro Ala Asp Ala Ala
  • Val lie Val Gly Tyr Gin Gly Ala Ala Arg Ala Ala Lys Ala Glu Val
  • Val Gly His Gly Thr His Val Ala Ser lie Ala Ala Gly Thr Gly Ala
  • GGC GGC ACG GTG GAC GGC GCG TAC TCG GCG TAC GTG GTC GCC ACG GGC 2131
  • Lys Gly Thr Tyr Leu Val Asp Ser Trp lie Ala Lys Asp Phe Gly Thr is 665 670 675
  • Tyr Thr Tyr Asp Thr Ala Gly lie Ser Ser Lys Ala Ala Gly Ala Pro
  • Gin Lys Gin Gly Leu Lys Val lie Val Gly Tyr Gin Gly Ala Ala Arg 130 135 140 Ala Ala Lys Ala Glu Val Arg Glu Ala Gly Glu Leu Arg Arg Thr Leu 145 150 155 160
  • Lys Gly Val Lys lie Ala Val Leu Asp Thr Gly Val Asp Thr Ser His 225 230 235 240
  • Gly Ala lie Lys Pro Asp Val Thr Ala Pro Gly Val Asp lie Thr Ala, o 405 410 415
  • 435 440 445 is s Ala Gly Ala Ala Ala Leu Leu Lys Gin Gin His Pro Asp Trp Thr Ser
  • Gin Gin Thr Val lie Ala Asp Pro Val Ser Val Ser Phe Gly Val Gin
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Streptomyces * Viridosporus (StiOptomyces viridosporus) Strain name: A-914
  • CDS Array features Characteristic symbol
  • ATC CGC AAG GTC GAC GGC CAC ACC CTC GTG CTG CCG GCG GAC GCC GCC 643 5 lie Arg Lys Val Asp Gly His Thr Leu Val Leu Pro Ala Asp Ala Ala
  • GAC ATC GGC CAG GAG GTC GGT GAG GGA CCG GCC GGC TAC ATG ACC ATC 1651 2 0 Asp lie Gly Gin Glu Val Gly Glu Gly Pro Ala Gly Tyr Met Thr lie
  • Lys Gly Val Lys lie Ala Val Leu Asp Thr Gly Val Asp Thr Ser His 2 o 225 230 235 240
  • Gly Ala lie Lys Pro Asp Val Thr Ala Pro Gly Val Asp lie Thr Ala
  • Sequence type nucleic acid
  • Val Ala Ser lie Ala Ala Gly Thr Gly Ala Gin Ser Lys Gly Lys Tyr 65 70 75 80 Lys Gly Val Ala Pro Gly Ala Ala lie Leu Asn Gly Lys Val Leu Asp
  • Gly Glu Gly Pro Ala Gly Tyr Met Thr lie Ser Gly Thr Ser Met Ala 225 230 235 240 Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Leu Lys Gin Gin His Pro
  • Asp Ser Trp lie Ala Lys Asp Phe Gly Thr Leu Lys Gly Gly lie Asp 465 470 475 480

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Hydrogenated Pyridines (AREA)

Description

明 細 書
4—置換— 1 , 4ージヒ ドロピリジン誘導体の不斉加水分解酵素活性タ ンパク質をコー ドする遺伝子およびその発現産物 技術分野
本発明は、 4-置換- 1, 4-ジヒ ドロピリ ジン誘導体の不斉加水分解 酵素活性を有するタンパク質、 ならびに該タンパク質をコードする遺伝 子、 および該タンパク質の使用に関する。
4-置換- 1, 4-ジヒ ドロピリジン系のジヒ ドロピリジン環の 3位と 5位に結合した 2つ置換基が相互に異なるものは、 その 4位に不斉炭素 を有しており、 2種の光学異性体が存在する。 最近、 これらの化合物の 生物学的性質が検討された結果、 それぞれの光学活性体間に薬理活性、 生体内動態、 安全性などに差があることが報告されている [K. Tamaza wa et al. ； J . Med. Chem. Vol. 29， 25 04(1986)]。 このような不斉炭素を有する化合物を医薬品として使用する場合、 生体 に対して余計な負荷を与えないという意味から、 医薬品として好ましい —方の異性体のみを与えるという考え方が一般的になりつつある。 この ような観点から光学活性 4-置換- 1, 4-ジヒ ドロピリ ジンの 3, 5-ジ 置換体を製造するための方法が検討されている。
光学活性 4-置換- 1, 4-ジヒ ドロピリジン誘導体、 特に、 3, 5 -ジ カルボン酸モノエステル類を合成するための 般的方法としては、 （4 R) - 1 , 4-ジヒ ドロピリジン- 3または 5-カルボン酸モノエステルを 中間体とし、 これに好ましいエステル残基を導入する方法が知られてい る [A. Ashiraori et al. ； C hem. P harm. Bull. Vol. 39， 108 (1991) ] 。 この光学活性中間体の （4 R) - 1, 4-ジヒ ド 口ピリジン- 3, 5-ジカルボン酸モノエステルの製造方法としては、 柴 沼らの化学的方法 [Chem. Pharm. Bull. Vol. 28, 2809 (1 980) ] 、 並びに阿知波らの酵素法 [Tetrahedron Letters, Vol. 3 2， 5805 ( 1991 ) ] および Charles J . Sinらの酵素法 [Tetrahedron Letters, Vol. 32， 3465 ( 1991 ) ] が知 られている。
ところが、 前記方法は、 必ずしも効率よく目的化合物を得ることがで きないため、 本発明者らは、 より簡易で効率のよい方法として、 微生物、 例えば、 ストレプトミセス ( S treptomyces) 属、 パェシ口ミセス （Pa ecilomyces) 属、 ボ卜 ォティォプロアイァ ( B otryodioplodia) 属、 アルテナリア (Alternaria) 属等、 の培養物を用い、 4-置換- 1, 4 - ジヒ ドロピリジン- 3, 5-ジカルボン酸ジエステルから対応する 3, 5 -ジカルボン酸モノエステルへ効率よく変換する方法を提案した （国際 公開第 94/05637号パンフレツ ト参照） 。
しかし、 さらに効率のよい光学活性 4-置換- 1, 4-ジヒ ドロピリジ ン- 3, 5-ジカルボン酸モノエステルの製造に使用できる手段を提供す る必要性は依然として存在する。
従って、 本発明の目的は、 前記光学活性化合物の効率のよい製造に資 することのできる、 単離された遺伝子、 それらを含む発現プラスミ ド、 かかるプラスミ ドによる形質転換体、 ならびにかかる形質転換体の培養 による 4-置換- 1， 4-ジヒ ドロピリジン誘導体の不斉加水分解酵素活 性を有するタンパク質の提供、 およびその使用に係る手段を提供するこ とにある。
発明の開示
本発明者らは、 前記ストレプト ミセス属に属するス トレブトミセス ピリ ドスポルス （ S treptomyces viridosporus) の染色体 DN Aから、 4-置換- 1， 4-ジヒ ドロピリジン誘導体 （以下、 「1， 4— DHPDJ という。 ） の不斉加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺 伝子を含む DN A断片をクローニングし、 そして前記遺伝子を発現させ ることに成功した。
さらに、 前記遺伝子の配列決定およびその発現により得られるタンパ ク質の特性決定により、 該タンパク質の一次構造と前記不斉加水分解酵 素活性との関連性等について、 広範な知見を得た。 また、 該タンパク質 と各種夕ンパク質についてのアミノ酸配列のデーターベースを用いる配 列の相同性等に関する検索の結果、 本発明に従うタンパク質は、 ァミ ノ 酸配列上ズブチリシン （ J acobs, M. et al.， Nucleic Acids R es. (1985) JL3 : 8913— 8926参照） とある程度の相同性 を有し、 活性部位として、 Asp. Hisおよび Serを有することが推測さ れることも見い出した。
従って、 本発明によれば、 配列番号 （S EQ I D NO) ： 7に記 載されたアミノ酸配列中の少なく とも Asp(29)ないし Ser(238)の 配列を含んでなり、 かつ 1, 4- DHPDの不斉加水分解酵素活性を有 するタンパク質をコードする単離された遺伝子または該遺伝子とハイブ リ ッ ド形成しうる DN A断片が提供される。
さらに、 本発明によれば、 前記遺伝子をベクターに組み込んで構築さ れるプラスミ ド、 かかるプラスミ ドによる形質転換体、 その形質転換体 を培養することによる 1， 4 - D H P Dの不斉加水分解酵素活性を有す るタンパク質の製造方法も提供される。
またさらに、 本発明によればかかる酵素活性を有するタンパク質と、 次式
Figure imgf000006_0001
( I )
(但し、 式中 Rは、 低級アルカノィル基、 複素環カルボニル基、 ハロ置 換ァセチル基、 アルコキシァセチル基、 ァリールォキシァセチル基、 置 換もしくは非置換フエニル低級アルカノィル基、 フエニル置換もしくは 非置換低級アルケノィル基、 アルコキシもしくはアルケニルォキシカル ボニル基、 ァラルキルォキシカルボニル基または有機スルホ二ル基を表 わし、 nは、 2〜4の整数を表わす。 ） で示される化合物またはその塩 とを水性媒体中で接触させ、 次式 NH(CK2)
Figure imgf000006_0002
(但し、 式中 R及び nは、 前記と同意義である） で示される光学活性 4 -置換- 1， 4-ジヒ ドロピリジン化合物またはその塩を回収することを 特徴とする光学活性 （4R) -1, 4-ジヒ ドロ- 2, 6-ジメチル- 4- (二 トロフエニル） ピリジン- 3, 5-ジカルボン酸モノエステル誘導体の製 造方法も提供される。
こうして、 製造される前記ジカルボン酸モノエステル誘導体の一部は、 それ自体既知の虚血性心疾患や高血圧症などの予防および治療薬として 有用な光学活性 1, 4一 DHPDの合成中間体として有用である。
図面の簡単な説明
図 1は、 ス トレプト ミセス ピリ ドスポルスの染色体 DN Aに由来す る 1, 4- DHPDの不斉加水分解酵素活性を有するタンパク質 （DH P-A) をコードする遺伝子 (dh pA) を含む DN A断片の制限酵素 地図である。
図 2は、 本発明に従う遺伝子を担持するプラスミ ド PDE88の構造 図である。
図 3は、 本発明に従う 1, 4- DHPD不斉加水分解酵素活性を有す るタンパク質 （DHP— A) の分子量を算定するための SDS- P AG E (ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルァミ ド電気泳動） の結果を 示す図面である。
図 4は、 本発明に従う、 前記タンパク質 （DHP— A) とプロテア一 ゼ P6のプロテア一ゼ活性を対比して示すグラフである。
図 5は、 本発明に従う、 前記タンパク質 （DHP— A) とリパーゼ B のリパーゼ活性を対比して示すグラフである。
図 6は、 本発明に従う、 前記タンパク質 （DHP— A) とプロテア一 ゼ P 6の熱安定性を対比して示すグラフである。
図 7は、 プラスミ ド p D E 89の構造図である。
図 8は、 プラスミ ド p DE 87の構造図である。
図 9は、 プラスミ ド p DE 91の構造図である。 図中、 c a t - 5は クロラムフユ二コール耐性遺伝子を表す。
図 10は、 プラスミ ド p DE 92の構造図である。
図 1 1は、 バチルス リ ケニホルミス （ acillus lincheniformis) 由来のズブチリシン （Jacobs, M. et al. , Nucleic Acids Re s. (1985) 13 : 8913- 8926) と本発明に従う夕ンパク 質 （DHP— A) の相同性の程度を示す、 アミノ酸の一文字記号により 示した部分的なァミノ酸配列である。 配列中の矢印は活性中心を表し、 星印は、 両者に共通するアミノ酸を表し、 ドッ トは、 両者において類縁 性のあるアミノ酸を表す。 N-末端側の数値 205' および C一末端側 の数値 734' は、 それぞれ配列番号： 2のアミノ酸番号、 すなわち L eu (205) および I le (734) に相当する。
発明の詳細な記述
本明細書、 配列表および図面に記載したァミノ酸の三文字記号および 一文字記号は、 当該技術分野で慣用されている略号に基いている。
また、 本発明にいう 「4_霉換-1, 4-ジヒ ドロピリジン誘導体の不 斉加水分解酵素活性を有するタンパク質」 とは、 少なくとも基質として の前記式 （ I ) で示される化合物に作用させることにより前記式 （Π) で示される化合物へ変換できる活性を有するタンパク質を意味する。 本発明者らは、 このような活性を有するタンパク質は、 少なくとも配 列番号： 7に記載されたァミノ酸配列の中の少なくとも Asp (29) な いし Ser (238) の配列を含むものであることを見い出した （なお、 本明細書中および請求の範囲において、 ァミノ酸の記号に続けて力ッコ 内に記載する数字は、 相当する配列中の位置番号を意味する） 。 このこ とは、 図 11に記載したバチルス リケニホルミス （Bacillus linch eniforrais) 由来するズブチリシンのアミノ酸配列本発明に従うタンパ ク質のァミノ酸配列の対比から、 本発明に従うタンパク質がその活性部 位としてセリ ン （Ser) 残基に加え、 ァスパラギン酸 （Asp) 残基およ びヒスチジン （His) 残基を有することが推測され、 セリンプロテア一 ゼファ ミ リーの一員に属するものとみなせることから理解できるであろ つ。
したがって、 本発明によれば、 まず最初に、 少なく とも配列番号 7に 記載されたァミノ酸配列中、 N-末端側に位置する活性部位である Asp (29) から C-末端側に位置する活性部位である Ser (238) まで の配列を必須のものとして含み、 かつ 1， 4- DH P Dの不斉加水分解 酵素活性を有するいずれかのタンパク質をコードする単離された遺伝子 (もしくは DN A断片） またはその遺伝子とハイプリ ッ ド形性しうる D N A断片が提供される。 遺伝子とハイプリ ッ ド形成しうる DN A断片と しては、 具体的には遺伝子と一定部分に共通のヌクレオチド配列を有し, 5' 末端もしくは 3' 末端または中間配列において数個の異なるヌクレ ォチド配列を有するものが挙げられる。 このような断片は、 それらの発 現により、 対応する遺伝子が産生するタンパク質と同様な酵素活性を有 するタンパク質を産生することができるか、 あるいは少なく とも前記遺 伝子のクローニングに使用することができる。
前記タンパク質の典型的なものとしては、 配列番号 ： 7に記載された アミノ酸残基数 520個からなるものを初め、 その C-末端側のアミ ノ 酸残基が数個除去されたもの、 例えば、 配列番号： 7の Leu (1) ない し Ser (518) のアミ ノ酸配列で表されるもの、 および Leu (1) な いし Pro (512) のアミ ノ酸配列で表されるものが挙げられる。 また. 配列番号： 7の N-末端側および Zまたは C-末端側にさらなるアミノ酸 配列が付加されたものも前記タンパク質に包含され、 具体的なものとし ては、 配列番号： 7の C-末端に lie Gly Tyr Thr Tyr Asp Thr Ala Gly lie (配列番号： 4の lie ( 725：) 〜 lie ( 734 ) 参照） が付加したアミノ酸配列を有するもの、 配列番号： 4および配列番号： 2に記載されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。 これらのタン パク質をコードする遺伝子の具体的なものとしては、 配列番号： 1およ び配列番号： 3に記載された DN A配列で示されるものを挙げることが できる。
本発明で提供される上記遺伝子は、 それらを適当な発現ベクターに組 み込み、 組換えプラスミ ドとし、 適当な宿主微生物を形質転換すること により、 1, 4- DHPDの不斉加水分解酵素活性を有するタンパク質 を産生するのに使用することができる。
したがって、 本発明によれば、 前記遺伝子を担持する組換えプラスミ ドも提供される。 使用できる発明べクタ一としては、 外来の遺伝子を安 定に発現するように構築されたものを使用することが都合よく、 限定さ れるものでないが、 例えば、 ァミノグリコシドホスホトランスフヱラー ゼをコ一ドする遺伝子 (aphまたは aphll) を有する pi J 680および p
I J 425 〔これらの構造図および の塩基配列については、 D. A.
Hopwoodりヽ enetic Manipulation of S treptorayces- A L aborat ory Manual, The John I nnes Foundation, ； ( 1985) ； aphl iの塩基配列については、 E. Beck et al. , Gene, 19 , 327— 3 36 (1982) 、 参照〕 などが挙げられる。
これらのベクタープラスミ ドを本発明に使用して本発明の遺伝子を調 製する場合について、 その典型例を以下、 簡単に説明する。
1, 4一 DHPDの不斉加水分解酵素活性を有するタンパク質をコー ドする遺伝子 （以下、 fd h p AJ という。 ） で例えば配列番号： 3に 記載のものの挿入断片はストレブト ミセス ピリ ドスポルスの染色体 D N Aからの制限酵素^ 3 A I部分分解物のため、 プラスミ ドから Sau 3 A Iで切り出そうとするとバラバラに分解してしまう。 そこで例えば、 適当なプライマーを用いて P C Rで、 2.54 kb Sac I - Sau3 A I (BamH Iに改変） 間を増幅し、 増幅した断片を p I J 680の aph遺伝 子上にある旦^ H I部位または pi J 425の aphll遺伝子上にある ph I部位へ揷入し、 各々 dhpA遺伝子の挿入方向が aph遺伝子または aphll 遺伝子に対し逆方向になっているプラスミ ドを選択する。
これらのプラスミ ドは dhpA由来タンパク 734アミノ酸の後に機能 的に無意味な 29アミノ酸 （配列番号： 5参照） （Pi J 680) また は 15アミノ酸 （配列番号： 6参照） （pi J 425) のタンパク質が 融合した産物を与える。
上述のような本発明の遺伝子は、 限定されるものでないが、 ストレブ ト ミセス ピリ ドスポルス、 例えば 1992年 7月 29日付で工業技術 院生命工学工業技術研究所に寄託され、 その後同研究所の国際寄託当局 にブタペスト条約の規定の下に移管され、 FERM BP- 4334の 受託番号が付与された A- 914株から有利に調製することができる。 また、 本発明の遺伝子は、 前記菌株の染色体から制限酵素 Sau3 A Iに より切り出される約 3. O k bの DNA断片であって、 図 1の制限酵素 地図で表わされる断片に含まれている。
従って、 本発明にいう 「単離された · · ·遺伝子」 の語は、 上述した ように前記 DN A断片の形態にあるもの、 ならびにその断片から目的と する酵素活性を有するタンパク質自体をコードするヌクレオチド部分の み、 および外来のヌクレオチド部分がそれに追加した形態にあるものを 包含する概念で用いている。 後者の形態にあるものは、 後述するように、 前記 DN A断片の配列決定を行えば、 当業者にとって容易に特定するこ とができ、 また単離することもできる。
したがって、 1， 4- DHPDの不斉加水分解酵素活性を有するタン パク質をコードする遺伝子 (dhpA) を含む DNA断片は、 当該技術分 野で周知の遺伝子工学的方法により、 前記 A-914株から容易に取得 することができる。 この方法については多く実験書に教示されているの でそれらを利用することができるが、 A- 914株は、 放線菌であるこ とから、 放線菌の遺伝子工学的方法を記載した実験書、 例えば D. A. Hopwood et al. ： Genetic Manipulation of S treptomyces, A Laboratory Manual (1985) (John I nnes foundatron) などに従うことが望ましい。
以下に本発明の DN A断片を取得する方法について簡単に説明するが 詳細な方法については特に断らない限り前述の Hopwoodらの実験書に記 載された公知の方法に従って行うことができる。
遺伝子のクローニング
A-914株から全 DN Aを S D S-フエノール法により抽出する。 こ の DN Aを制限酵素^ 3 A Iで部分分解する。 次にこの分解物を 0. 8 %ァガロースゲル電気泳動にかけ、 べクターに組み込みやすい長さの 断片に分画する。 この分画された DNAを^ 3 A Iと付着末端を同じ くする^ H I、 Bglll. Bellをクローニングサイ トとして利用可能 なベクター · プラスミ ド例えば Bglllが利用可能な p I J 702等に T 4 DN Aライゲ一スを用いて連結する。
この DN Aでベクターが導入可能な宿主のうち 1, 4- DHPDの不 斉加水分解酵素活性を有するタンパク質を有さないもの [一例として p I J 702を用いた場合と宿主としてストレプミセス リ ビダンス （ treptomyces lividans) 66 (FERM BP— 737) などが挙げ られる。 ] を形質転換して、 供与体ゲノム DN A中のランダムな領域を 組み込んだプラスミ ドをもつ多数の形質転換体を取得する。 それらのう ち個々の形質転換体に対し、 1， 4- DHPDの不斉加水分解酵素活性 の測定を行う。 具体的な酵素活性の測定方法については後述する。
この結果形質転換体の中から目的の活性を有するタンパク質を発現す る形質転換体を分離することができる。 本発明の d h p Aを含む DNA 断片はその形質転換体がもつプラスミ ドに組み込まれた形で存在させて おくのが、 その後の使用を考慮すると都合がよい。 このようなプラスミ ドを得るには、 その形質転換体を培養し、 アルカリ- SDS法に従って プラスミ ドを単離すればよい。 得られたプラスミ ド DNAを各種制限酵 素で切断し、 切断された DN A断片の長さをァガロース · ゲル電気泳動 で分析することにより切断部位のマッビングを行うことができる。 この 結果からプラスミ ドに組み込まれた DN A断片の制限酵素地図が作成で きるがそれは図 1に示される通りである。 したがって、 本発明の d h p Aを含む DN A断片が取得されているか 否かは、 DNA断片を組み込んだプラスミ ドによる形質転換体の 1， 4 -DHPDの不斉加水分解酵素活性の測定と、 その DN A断片の制限酵 素地図を図 1のものと、 また、 配列決定による場合には配列番号 3 ： の 核酸配列と比較することにより確認することができる。
こう して得られる DNA断片は、 必要によりさらに制限酵素あるいは ェキソヌクレアーゼで処理して短縮化し、 前記ベクターを初めとする各 種発現べクタ一、 例えば、 p I J 350、 p I J 41、 p I J 943. p I J 922などの放線菌ベクターの他、 p UC 18、 pUC 19など、 一般的な遺伝子操作で汎用される大腸菌ベクターに、 組み込んで、 本発 明のプラスミ ドを提供することができる。
以上の操作を参照すれば、 当業者は上記の本発明に従う遺伝子を担持 するいずれの組換えプラスミ ドも得ることができるであろう。
d h p Aを含む DNA断片を組み込んだプラスミ ドをもつ形質転換体の 作出
本発明によるプラスミ ドは、 それらを受容可能な宿主へ導入すること ができる。 ベクターおよびそれが受容可能な宿主の組み合せは多数存在 し、 適宜選択可能であるので限定できない。 しかし、 特に実用性に富む 組み合せとしては、 ベクタ一として、 前述のような pi J 702に代表 される放線菌の高コピープラスミ ドを使用し、 宿主として、 放線菌例え ばストレプミセス リ ビダンス 66、 ストレブミセス ピリ ドスポルス A-914 ス トレプミセス クラブス ( S treptomyces clavus) N - 1284を用いることが望ましい。 その理由は、 0d h p Aを高発現さ せることができ、 ②導入されたプラスミ ドが構造的に安定して保持され ることによる。 その上、 特に宿主がストレプミセス ピリ ドスポルス (S. viridosporus) A- 914およびストレプミセス クラブス （S. clavus) N- 1284の場合、 さらに③宿主自体に 1, 4-DHPD不斉 加水分解酵素の生産能があることから、 導入プラスミ ド由来の酵素活性 を合わせて増強された酵素活性が期待できる。 ④反応基質、 反応生成物 に対する副反応が少ない、 といった利点もある。
本発明によれば、 こう して得られる形質転換体、 例えば Streptomyce s viridosporus A- 914 (pD E 88 ) -5を初めとする、 前記遺伝 子のいずれかを担持するプラスミ ドにより宿主微生物 （例えば、 ストレ プト ミセス ピリ ドスポルス、 ストレプトミセス リ ビダンスおよびス トレブトミセス クラブスからなる群より選ばれるー菌株） が形質転換 された形質転換体が提供される。 なお、 前記 A-914 (PDE 88) - 5株は、 1995年 7月 10日付けで生命工学工業技術研究所に寄託し、 FERM P— 15037の受託番号が付された後、 ブタペスト条約の 規定の下で国際寄託に移管され F ERM B P-5574の受託番号で 寄託されている。
これらの形質転換体は、 栄養培地で培養することにより 1， 4- DH PDの不斉加水分解酵素活性を有するタンパク質を産生するので、 培養 物から目的の酵素活性を有するタンパク質を回収することにより、 前記 酵素活性を有するタンパク質を製造することができる。
したがって、 本発明によれば、 前記形質転換体を使用する 1, 4-D H P Dの不斉加水分解酵素活性を有するタンパク質の製造方法も提供さ れる。
本発明に従う遺伝子を使用すれば、 それらの遺伝子にコードされたタ ンパク質が発現されるので、 上述したタンパク質もまた本発明により提 供される。 しかし、 例えば、 前記 A-914 (pDE 88) -5株 （F E RM B P- 5574) を培養することにより発現されるタンパク質は、 培養中にプロセシングを受け短縮化されたタンパク質として蓄積される 5 ので、 本発明の好ましい態様のタンパク質としては、 配列番号： 7に記 載されたァミ ノ酸配列で示されるもの （Leu (1) 〜Thr (520) ) 、 その C-末端側の一部のアミノ酸残基が除去されたもの （例えば、 Leu (1) 〜Ser (518) および Leu ( 1 ) 〜Pro (512) のアミノ酸配 列で示されるもの） 、 ならびに前記 Leu (1) 〜Thr (520) の C-末 t o 端の Thrに、 さらに lie Gly Tyr Thr Tyr Asp Thr Ala Gly
lieが付加したァミ ノ酸配列で示されるものが挙げられる。
本発明に従うタンパク質の製造に使用できる前記栄養培地としては、 特に限定されるものでないが、 通常の微生物の培養に用い得るもの、 例 えば、 炭素源としては、 前記微生物の利用可能なものであればいずれで
15 もあってもよく、 具体的には、 グルコース、 フルク ト一ス、 シュクロー ス、 デキス トリ ンなどの糖類； グリセロール、 ソルビトールなどの糖ァ ルコール； フマル酸、 クェン酸などの有機酸を挙げることができる。 こ れらの炭素源の培地への添加量は、 通常 0.1〜10%程度とすること が好ましい。
0 窒素源としては、 例えば、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 リ ン酸アンモニゥムなどの無機酸アンモニゥム塩； フマル酸アンモニゥム、 クェン酸アンモニゥムなどの有機酸アンモニゥム塩；肉エキス、 酵母ェ キス、 コーンスティープリカ一、 カゼイン加水分解物等の天然有機窒素 源などを使用することができる。 このうち有機窒素源は、 多くの場合、 炭素源としても兼用できる。 窒素源の添加量は、 通常 0.1〜10%が 適当である。
無機塩類としては、 例えば、 リ ン酸カリウム、 リ ン酸ナトリウムなど のリ ン酸アル力リ金属塩 ；塩化力リゥム、 塩化ナトリゥムなどの塩化ァ ルカリ金属塩；硫酸マグネシウム、 硫酸第一鉄などの硫酸金属塩等を使 用できる。 その使用量は、 0.001%〜1%の範囲が適当である。 微生物 （形質転換体） の培養は、 上記の培地で 20〜40°C、 好まし くは 28〜37°C、 pHは 5〜9、 好ましくは、 pH6〜8で好気的条件 下で実施すればよい。
こう して、 製造される 1, 4- DHPDの不斉加水分解酵素活性を有 するタンパク質は、 単離された形態、 または培養物そのもの、 培養物の 粗精製物または固定化された形態にあるいずれかで、 その酵素活性タン パク質と前記式 （I) の化合物とを、 水性媒体中で接触させ、 前記式 (II) の化合物を製造するのに使用することができる。 したがって、 本 発明によれば、 前記 1, 4- DHPDの不斉加水分解酵素活性を有する タンパク質を使用する、 式 （I) の化合物の式 （Π) の化合物への酵素 転化方法も提供される。
前記水性媒体としては、 必要により緩衝化された水溶液を使用するこ とができる。 式 （I) の化合物は、 水またはアセトン、 ジメチルスルホ キシド、 等の補助溶媒に溶解して加え、 pHを 7, 0〜9. 5に調節し た後、 通常、 20〜50°Cで前記酵素と接触するように反応させること で、 式 （II) の化合物へ転化することができる。 反応終了後、 希塩酸等 を用いて pHを 1. 5〜3. 0に調節し、 次いでクロ口ホルム、 酢酸ェ チル、 酢酸プチル、 ブタノール等の有機溶媒で抽出し、 さらに必要によ り結晶化するか、 または転溶、 沈殿化等の手段により精製された式 （II) の化合物を得ることができる。
以下、 具体例を示して、 さらに本発明を詳細に説明するが、 これらの 例示は本発明の理解を容易にする目的で提供される。
実施例 1 プラスミ ド pD E 88の構築
S. viridosporus 八-914株 （？£尺1^1 B P- 4334) を T S B培地 （D if co Tryptic Soy Broth 3.0%) 25m l に植菌 し、 28 °Cで 3日間振とう培養した。 これを種菌として、 その 2m 1を YEME培地 （34%サッカロ—ス、 0.3% Bacto Yeast E tr act、 0.5% Bacto Pepton、 0.3% Bacto Malt Extract. 0.5% Glycine. 5 mM MgCl2、 pH無調整） 50m lに植え継ぎ 28°Cで 40時間振とう培養した。 この培養液から菌体を 8000 X g、 10分間の遠心分離で集菌し、 Hopwoodらの実験書、 Genetic Manup ilation of S treptomyces/ J ohn I nnes Foundation 1985リ に示された方法に従って全 DN Aを抽出精製した。
この DNA 100 gを含む TE (1 OmM Tris-H C 1 pH 8. 0、 ImM EDTA pH 8.0 ) 溶液 100〃 1に対し、 80〃 1の H20および 20 1の 10倍濃度 Mバッファー （ 10 OmM Tris- HC 1 pH 7.5、 50 OmM NaCl、 10 OmM MgCl2、 10 mMジチオスレィ トール） および制限酵素 S a u 3 A I 1ュニッ ト （0. 25 / 1 ) を順次加え 37°Cで 30分反応させた。 その後等量 （200 β 1 ) の ΤΕ飽和フエノ一ル♦ クロロホルム混液 （フエノール： クロ口 ホルム ： イソアミノルアルコール- 25 : 25 : 1に 8-キノ リノ一ルを 0.2%添加したもの） で抽出後水層を取り、 これをさらに等量のクロ 口ホルムで抽出した。 水層を採取後これに 1ノ10容量の 3 M酢酸ナト リウムを加え、 続いて 3倍容量のエタノールを加えよく混ぜた後一 80 °Cで 15分間冷却した。 その後 5000 x g、 5分間の遠心で DNAを 沈殿させた。 この DNAを 70%エタノール lm lで 1回洗浄し、 減圧 下で乾燥した後 100〃 1の TEに溶解した。
この溶液に 11〃 1の 10倍濃度 gel loading buffer (25% Ficol 0.25% ブロムフヱノールブルー） を加えた後、 13cmx 13 cmの 0.8%ァガロースゲル 4ゥエルに分注し、 スファージ DN A - Hindlll分解物をサイズマーカーとして 30 Vで泳動した。 泳動後 4〜6 k bに相当する DNAを含むゲル部分を切り出し、 ウルトラフリ 一 C3ユニッ ト 0.45 m (ミ リポア社製） を用いて、 DNAを回収 精製した。 この DN A溶液 （濃度 0.5〃 gZ〃 1 ) 9 1に予め脱リ ン酸化した^ 1Π線状化 pi J 702 DNA溶液 （濃度 1 n g/ β 1 ) 1 1を加えたベクター · ィンサート混合液をライゲーシヨンキッ ト ver.1 (宝酒造株式会社製） を用いてライゲーシヨン反応 （16°C、 3 時間） を行った。
ここでベクター p I J 702の脱リ ン酸化 Bglll線状化 DNA溶液は、 以下のようにして調製した。 p I J 702 DNA 10 gを含む総 量 50 1の反応液 （ 1 OmM Tris-H C 1 pH 7.5 , 10 OmM NaC 1 OmM MgC 12 : 1 mMジチオスレィ トール） に 25ュ ニッ ト （2.5/ 1 ) の Bglllを加え、 37 °Cで 4時間反応後、 すでに 前述したようにフヱノールとクロ口ホルムの混液およびクロロホルムに よる抽出、 ェタール沈殿、 70%ェタール洗浄乾燥を順次行った後、 D N Aを 45 1の 10 mMTris- H C 1 pH8.0に溶解した。 この溶 液に 5〃 1 の 1 0倍濃度のアル力リホスファターゼバッファー （5 0 0 mM Tris-H C 1 pH 8. 0、 1 mM E D TA) および calf inte stinal alkaline phosphatase (東洋紡株式会社製) 1 βΐ ( 1 , 7ュ ニッ ト） を加え、 3 7°Cで 1時間ィンキュベ一卜した後 6 5。Cで 4 5 mi nインキュベー トして酵素を失活させた。 その後は前述と同様な条件で フエノールとクロロホルムの混液およびクロ口ホルムによる抽出、 エタ ール沈殿、 洗浄、 乾燥を行った。 この DNAを 1 0 1の T Eで溶解し、 最終的に脱リ ン酸化された B gill線状化 p I J 7 0 2 DNA溶液を 調製した。
ライゲーション後、 反応液 1 5 β 1を用いて、 前述の Hopwoodらの実 験書に記載された方法に従って . Iividans6 6のプロ トプラスト ( 1 X 1 09cells) の形質転換を行った。 ここで抗生物質による選択条件は チオペプチン 5 0 g/m 1 とした。 2 8 °Cで 4日間培養後約 1 5 0 0 株の形質転換株を得た。 p I J 7 0 2に存在する m e 1遺伝子 (メラニ ン色素生産遺伝子） に位置するクローニングサイ ト (BglH) に供与体 DN Aが挿入した場合、 m e 1遺伝子は不活性化される。 そして形質転 換株がそのようなプラスミ ドをもつ場合黒色 （メラニン） 色素を生産し ない株として視覚的に容易に見分けることができる。 メラニン色素非生 産株コロニーを 1個ずつ D H P培地 （3 %T S B、 1. 5%バク トァガ - 500 g/m 1 M8 0 1 ) に 2 5株 /8 c mプレー トの密度で パッチ状に植菌し、 2 8°Cで 5日間培養した。 コルクボーラ一 （内径 6 mm) で菌体の一部を培地ごと切り出し、 培地片をシリカゲル T L Cプ レートの各レーン （8 mmごとに幅 l mmで縦に切れ目を入れたもの） に付着させ、 室温に 3 0分間放置し、 培地内容物を浸出、 乾燥させた。 このプレ一トをクロ口ホルム ·メタノール （6 : 1) からなる溶媒系で 展開し、 各レーン毎に培地中の M 801 (R f 値 0.59) の不斉加水 分解物 M802 (尺 1?値0.53) の有無を調べた。
このようにして形質転換体の中から、 M801の不斉加水分解活性を もつ株 . lividans (p D E 88) を分離した。 この株がもつプラスミ ド （pDE88と命名した。 ） に目的の遺伝子 d h p Aがクローニング されているか否かを確かめるため、 pDE88 DN Aを前述 Hopwood らの実験書に示された公知の方法に従って抽出精製し、 再び . livida 66を形質転換して、 2次形質転換株を得た。 前述の TLCアツセィ の結果、 この株は最初に取得された株と同様に 1， 4一 DHPDを不斉 加水分解活性を発現し、 p DE 88に d h p Aが含まれていることが明 らかとなつた。 pDE 88を各種制限酵素で切断しその断片の長さをァ ガロースゲル電気泳動で分析した結果図 1の制限酵素切断地図で示され る約 3.0 k bの d h p Aを含む供与体 DN A断片がベクター P I J 7 02に組み込まれていた。 pDE 88の構造図を図 2に示す。
実施例 2 形質転換体の取得と酵素活性の測定
放線菌 . calvus N- 1284を前述の Hopwoodらの実験書に記載 された常法に従ってプロ トプラストを調製した。 培養の時に YEME培 地の代わりに 0.5%グリシンおよび 5 mM Mg C 12を添加した TS B培地を用いたこと以外前述の方法と同様に S. viridosporus A- 9 14からもプロ 卜プラストを調製した。 このようにして得た各プロ トプ ラスト 1 X 109 Cellsを含む懸濁液 lm 1をポリスチレン製滅菌チュ ーブ （15m l容量、 コ一ニング社製） 中に入れ、 遠心分離 （5000 X g、 10分間） 後上清を捨て、 残りのプロ トプラス卜に実施例 1で取 得したプラスミ ド p D E 88 DN A溶液 （濃度 1 / gZm 1 ) を 10 1を加えよく混ぜた。 これに Τバッファー （0.24% サッカロー ス、 0.2%ト レース · エレメ ン ト溶液 （後述1) 、 0.023% K2S 04、 1.5% C a C 12、 50 mM Tris-マレイ ン酸 pH8.0を
5 含む溶液 3m 1に対し、 ポリエチレングリコール （重合度 1000) 1 gを溶解してできる溶液） 0.4m lを加え 30秒間室温に放置した後、 Pバッファー （後述2) 10m 1でプロ トプラス トを洗浄し、 次いで R 3培地 （13.5%サッカロース、 0.05% KC 0.6%Mg C 12、 6H20、 1%グルコース、 0.4%バク トペプトン、 0.4%酵母
10 エキス、 0.57%TES、 2.2%バク トァガー、 をオートクレーブ後、 0.5%KH2PO4を 1/100容量、 5MC a C l 2を 0.3Z100 容量、 IN NaOHを 1.8ノ 100容量添加） 5枚にプレーティ ン グした。 これを 28 °C 16時間培養後、 チオペプチン 250 z g/m 1 (最終濃度） を添加した SNA培地 （0.8% Nutrient Broth. 0. i s 3 % Bacto A ar) 2 m 1をプレート上に均一に重層し、 さらに 5 曰間培養を続けた。
トレースエレメ ン ト溶液 1 ( 1リ ッ トル当り） ：
Figure imgf000022_0001
N a 2B 407 · 10 H20 1 Omg
(NH4)6M07024 · 4 H20 1 Omg
pノくッファー 2 ： 1 0. 3 % サッカロース
0. 0 2 5 % K2S 04
0. 2 0 2 % M g C 1 2 · 6 H20
0. 2 (v/v)% トレース ' エレメ ン ト溶液
オートクレープ後
0. 0 0 5 % KH2P 04
0. 3 6 8 % C a C 1 2 · 2 H20
0. 5 7 3 % TE S pH 7. 2
その結果 . clavus N-l 2 8 4を宿主としたものから 3 1株、 S. viridosporus A-9 1 4を宿主としたものから 2 4株の形質転換株を 得た。 異なる宿主をもつものから 1株ずつを選択し、 それぞれ . clav us N-1 2 8 4 (p D E 8 8) -6および . viridosporus A-9 1 4 (p D E 8 8 ) -5と命名した。 これらの株および旦. lividans (p D E 8 8) ならびに各々の宿主として使用された株を T S B培地 （形質 転換株に対してはチオペプチン 5 g/m 1を添加したもの） 2 5 m l で 4日間培養した後、 この培養液 l m lを種菌として C培地 （2 %グル コース、 2 %溶性でんぶん、 2%エスサンミート、 （大豆粉：味の素株 式会社製） 0. 5 %酵母エキス、 0. 2 5 %N a C l、 0. 3 2 %C a C 03、 0. 0 0 0 5%F e S 04、 0. 0 0 0 5 %Mn S O4 0. 0 0 0 5 %Z n S 04、 pH 7. 4) 3 0m lへ添加し、 2 8°Cで各菌が 1 , 4 - D H PDの不斉加水分解酵素活性タンパク質を最大限生産し得る期間、 す なわち . lividansおよび S. lividans ( p D E 8 8 ) では 3日間、 S. clavus N-1 2 8 4および . clavus N-1 2 8 4 (p D E 8 8) - 6では 4日間、 S. viridosporus A- 9 1 4および S. viridosporus A- 914 (p D E 88) -5では 6日間振とう培養を行った。 得られ た培養液を後述する方法に従って 1， 4- DHPD不斉加水分解酵素の 特異活性を測定した。 その結果を表 1に示す。
このとき、 対照酵素として、 1, 4一 DHPDの不斉化加水分解能を もつことが知られている P r o t e a s e P 6 (天野製薬株式会社） [T. Ad a c h i e t a l ； Te t r ah e d r on A s y m me t r y Vo l. 4, 2061 (1933) ] の酵素活性を同時に 測定した。
Figure imgf000025_0001
注）
Figure imgf000025_0002
H-801
CH
Figure imgf000025_0003
«-802 表 1によると、 . clavus N - 1 284および . viridosporus A - 9 1 4は本来 1， 4- DH PDの不斉加水分解活性を発現している菌 株であるが P DE 88で形質転換することにより、 それらの培養液中の 酵素活性 （プロテアーゼ P 6換算量で比較） が各々の宿主の 4倍以上に 増加した。 一方で . lividansは本来全く酵素活性を示さない菌株であ るが形質転換体の 1っ . lividans (p DE 88) -1の培養液中には、 プロテア一ゼ P 6に換算して 6.8mg/m 1の特異活性が検出された。 これは S. clavus N-1 284の 5.6倍および .
Figure imgf000026_0001
2 · 9倍に相当した。 最大の比活性を示したものは . viridosporus A - 9 1 4 (p DE 88) -5で、 プロテアーゼ P 6に換算して 1 0.4 m g ノ m 1に相当する比活性が認められた。 このように、 本発明による d h を含むプラスミ ドで形質転換株は、 いずれも、 培養液中に大量の酵 素活性タンパク質を分泌することが明らかになった。
(活性測定法）
Μ-80 1を基質として反応し、 不斉加水分解物 Μ- 802を高速液体 クロマトグラフィー （HP L C) により測定した。 即ち、 0: 5Μトリ ス -塩酸緩衝液 （ρΗ 8.5 ) 0. 1 m 1、 蒸留水 0.2 mし 5 M N a C I溶液 0. 1m l、 1, 4- DHPDの不斉加水分解酵素活性を有する タンパク質溶液 0. 1 m 1、 30 mg/m 1 M80 1—ジメチルスル フォキシド溶液 5〃 1を順次混合し、 40°Cで 1時間インキュべ一ショ ンした。 1時間後、 0.02M KH2P04： メタノール- 1 ： 1溶液 2.4m l に反応液 0. 1 m lを加え反応を停止した。 この溶液を 800 0 X g、 10分間遠心分離し、 上清を H P L Cにより測定した。 HP L C測定条件は、 カラム： YMC- A- 302 (4. 6 I D 1 50mm) 、 移動相 0.02M KH2PO4 : メタノール = 1 : 1溶液、 流速 0.8 m 1 /m i n、 検出 U V 350 nm、 温度 50°C、 インジェクション量 1 0 1で行った。 この条件下で Μ- 801の保持時間は 6— 7m i n、 M-802は 4-5m i nであった。
実施例 3 S. viridosporus A- 914 ( p D E 88 ) - 5の培養及び 硫安分画
S^. viridosporus A- 914 (p DE 88) - 5を、 5 z g/m lの チオペプチンを添加した C培地 30m 1に植菌し、 28 °Cで 4日間振と う培養した。 この培養液から濾過により、 上清を集めた。 （以後の操作 は 4 °Cで行った。 ） この上清に 60%飽和となるように硫酸アンモニゥ ムを加えた。 3時間撹拌した後、 9000 x g、 20分間遠心分離し、 上清を得た。 さらにその上清に 80%飽和となるように硫酸アンモニゥ ムを加え、 18時間撹拌した。 9000 x g、 20分間遠心分離したの ち得られた沈殿を蒸留水に溶解し、 60-80%硫安分画とし、 以下の 精製に供した。
実施例 4 酵素活性タンパク質の精製
上記の 60-80%硫安分画画分 20m 1を流速 34 m 1 / h r 1. 8 M硫酸アンモニゥムを含む 5 OmMトリス-塩酸緩衝液 （pH 7.5) で平衡化した Butyl- Toyopearl650 (商品名：東ソ一社製） のカラ ム （26 x 27.5 cm) にアプライした。 硫酸アンモニゥム 1.8 M及 び 0.4 Mを含む 5 OmMトリス-塩酸緩衝液 （pH 7.5) 1000m l ずつで硫酸アンモニゥム 1.8Mから 0.4 Mの直線濃度勾配を作り、 溶 出を行った。 10m lずつ分取し、 各フラクションについて実施例 2の 活性測定法にしたがって 1， 4-DH PD不斉加水分解酵素の活性を測 定した。 不斉加水分解活性の認められたフラクショ ンを集め、 1, 4- DHPDの不斉加水分解酵素活性を有するタンパク質 （以下、 DHP— Aという） の画分とした。
実施例 5 分子量の測定
得られた DH P— A画分を Laemmliの方法 （Nature、 227、 68 0-685 (1970) ) に従って SDS- PAGE (4- 20%グラジ ェン ト） を行い、 その分子量を算定した。 （結果を図 2に示す。 ） なお 図 3においてレーン 1は分子量マーカ一、 レーン 2は . viridosporus A-914 (pDE88) -5の培養上清、 レーン 3は同培養液の 60 〜80%硫安画画分、 レーン 4は A-914の DHP— A画分である。 これより推定された DH P— Aの分子量は約 55 k D aであった。
実施例 6 (比活性の測定）
プロテアーゼ P 6及び DHP— Aを実施例 2の活性測定法にしたがつ て活性測定を行った。 また、 プロテインアツセィキッ ト （Bio-Rad社） により蛋白定量を行い、 比活性を算出した。 活性は 1時間に lmgの M - 802を生成する酵素量を 1 Uとした。 その結果、 DHP— Aはプロ テアーゼ P 6に比べ、 2.12倍高い比活性を示した。
(プロテアーゼ活性測定）
紫外部吸収法により DHP— A及びプロテアーゼ P 6のプロテア一ゼ 活性測定を行った。 即ち、 基質溶液として、 ハンマステンカゼイ ン 0. 6 gに 0.1 N水酸化ナトリゥム溶液 10 m 1、 蒸留水 30 m 1、 0.0 5Mトリス-塩酸緩衝液 （pH8.5) 40m lを加え、 pHを 8.5に調 製し、 蒸留水で 100m lにした。 各種濃度のプロテアーゼ P 6及び D HP— A溶液 50 1に 2 mM酢酸カルシウム溶液 150^ 1を加え、 酵素液とした。 その酵素液 0.2m 1に基質溶液 1.0m 1を加え、 30 °C、 10分間インキュベートした。 その後、 トリクロロ酢酸混液 （ 1. 8%トリクロ口酢酸、 22 % 1 M酢酸ナトリウム溶液、 33%1M酢酸 溶液） 1.0m lを加え、 反応を停止し、 8000 X g、 5分間遠心分 離し、 上清の 275 nmにおける吸光度を測定した。 この活性は 30°C、 10分間反応させた時の 275 nmにおける吸光度 1. 0を呈する酵素 量を 1Uとした。 その結果を図 4に示す。 DHP— Aのプロテアーゼ活 性はプロテアーゼ P 6に比べ、 1Z30以下であった。
(リパーゼ活性測定）
リパーゼ UVオートテス トヮコー （和光純薬） により DHP— Aとリ パーゼ Bのリパーゼ活性を測定した。 活性は 37°C、 6分間反応させた 時の 340 nmにおける吸光度 1. 0を呈するタンパク質量を 1 Uとし た。 図 5に結果を示す。 DHP— Aにリパーゼ活性は認められなかった。 以上より、 本発明の 1, 4- DHPDの不斉加水分解酵素活性を有す るタンパク質 D HP— Aは同様な目的で使用される従来の酵素プロテア ーゼ P 6やリパーゼ B等とは異なり、 プロテアーゼ （カゼイン分解） 活 性やリパーゼ活性を殆ど示さないことから、 これらの酵素とは区別され る新規で特異な酵素活性を示すタンパク質である。 特にプロテア一ゼ P 6に対しては、 比活性が高い、 熱安定性が優れているといった利点を有 する。 本発明の 1， 4- DHPDの不斉加水分解酵素活性を有するタン パク質のもつプロテア一ゼ活性を殆ど示さないという性質はプロテア一 ゼ P 6において活性低下の原因である自己分解反応が起こりにくいこと を意味している。
(酵素活性タンパク質の熱安定性） 1 mgZm 10?1?—八溶液0.6 m 1または 2mgZm 1プロテア ーゼ P 6溶液 0.6m 1に 0.5Mトリス-緩衝液 （pH 8.5) 0.2m l 及び蒸留水 0.2m 1を混合し、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60°Cで 15分間熱処理を行い、 その後 3 Omg/m 1 M-801溶液 5 を加え、 60分間インキュベートした。 その混合液を実施例 2の活性測 定法に従って酵素活性を測定した。 結果を図 6に示す。 DHP— Aは 3 0°Cから 45。Cまでほぼ 100%活性を保持していたが、 プロテアーゼ P 6は 45°Cで約 25%活性は低下していた。
実施例 7 N末端ァミノ酸配列の決定
10 実施例 4にて精製された酵素溶液を分画分子量 10, 000の遠心濾 過チューブ、 ウルトラフリー C3LGC (ミ リポア社製） にて脱塩 ·濃 縮し、 2mgZm 1の溶液とした。 この酵素液 2.5〃 1を P hastGel
Homogeneous 12.5 (ファルマンァ社製） にアプライし、 PhastSys tem (フアルマシア社製） を用いて、 250V, 1011八で1時間30 i s S- PAGEを行った。 その後 PhastTransfer (フアルマシア社製） を 用いて、 20V, 25mA, で 40分、 酵素蛋白質を P V D F (Polyvi nyldifluoride) 膜 （ミ リポア社製） へ転写した。 この時、 転写バッファ —として、 25mM Tris, 192mM Glycine (pH 8.3) , 2 0%Methanolを用いた。 転写後、 膜を風乾し、 酵素蛋白質が転写され
20 た部分を切出し、 プロテインシーケンサー PSQ— 1型 （島津製作所製） で N末端配列の分析を実施した結果、 Leu-Asp-Thr-Ser- Val- Glyからな る配列が決定された。 これは配列番号： 4のアミノ酸配列第 205番目 から第 210番目の配列に一致した。 このことから、 実施例 4に従う 1, 4- DHPDの不斉加水分解酵素活性を有するタンパク質 （DHP— A) の N末端はプロセッシングを受けて、 2 0 5番目のロイシンから始まつ ていることが分かった。
実施例 8 質量分析測定による C末端ァミノ酸の決定
実施例 4にて精製された酵素溶液を分画分子量 1 0, 000の遠心濾 過チューブ、 ウルトラフリー C 3 L G C (ミ リポア社製） にて 0. 1 % 蟻酸溶液に置換し、 さらに脱塩 ·濃縮し、 2 m gZm 1の溶液とした。 この溶液 2 0 0 β \を検体として高性能四重極三連質量分析装置 A Ρ I III (Perkin Elmer Sociex社製） にて酵素蛋白質の分子量測定 を正イオンモードで行った。 その結果、 [M + H] + (ただし Mは酵素 蛋白質の分子量、 Hはプロ トンの分子量を表わす。 ） で 5250 1の値 が得られ、 この値は配列番号： 4のアミノ酸配列で 205番目の Leuか ら 72 4番目の Thrまでの推定分子量 5 2 5 0 3. 61に極めて近いこと から、 実施例 4に従う 1, 4— DHPDの不斉加水分解酵素活性を有す るタンパク質 （DH P— A) は、 その C末端はプロセッシングを受けて、 724番目の Thrで終わっているタンパク質 （配列番号： 7参照） を主 とするものであることが分かった。
実施例 9 製造法
S. viridosporus A- 9 1 4 ( p D E 8 8 ) - 5株の凍結種母 0. 4 5 m 1を C培地 3 0 m 1を入れた 2 5 0m l フラスコに植菌し、 2 8 °C で 4 5時間ロータリーシェーカー上で培養し、 種母とした。 このように して培養した種母 6 0 m 1をチオペプチンを除いた C培地に消泡剤とし て 0. 0 9 %KM- 7 5、 0. 0 9 %アデカノ一ル L G- 1 2 6を添加した 培地 1 5 リ ッ トルに植菌し、 2 8°Cで 5日間培養した。 得られた培養液 を濾過し、 濾液 9. 5リ ッ トルを得た。 これを U F膜により約 4倍濃縮 し、 DHP— A酵素液とした。 この酵素液 128 Om 1に塩化ナトリウ ム 74 g、 6 Omg/m 1 0-フヱナンスロ リ ン DM S 0溶液 12.8 m 1を加え、 pHスタツ ト装置を備えた反応容器で 1 N水酸化ナトリゥ ムを用いて pH 8.5-8.6に調整しながら、 窒素置換下で 30°Cで撹拌 を行った。 これに 5 OmMトリス-塩酸緩衝液 （pH 8.5) 480m l に P-902 36 gを溶解した溶液を 26.64m 1 Zh rの速度で 1 8時間添加した。 反応開始 34時間後に反応混合物に等量の酢酸ェチル を加え、 得られた水層を pH2.0に調整し、 等量の酢酸ェチルで 2回抽 出した。 酢酸ェチル層を蒸留水で洗浄した後、 無水硫酸ナトリウムで乾 燥した。 乾燥剤を濾過した後、 濃縮乾固し、 黄色固体を得た。 これを減 圧乾固し、 P- 903 25.0 gを得た。
得られた P-903の光学純度検定を行った。 即ち、 P-903 10 0//gZm l溶液を下記条件下で HPLC分析を行った。 カラム： ES -0 VM4.6 I D X 45 Omm. 移動相 2-P r 0H： 0.02M KH ZP 04= 20 ： 80、 カラム温度 35°C、 流速 1. Om 1 Zm i n、 検 出 UV350 nm、 インジヱクシヨン量 10〃 1。 この条件下で （S) -P- 903の保持時間は、 14〜15m i nで、 （1 ) -?-903の保 持時間は 16〜17m i nであった。
P-902および P-903は次の式で示される。
Figure imgf000033_0001
実施例 10 上記宿主-ベクタ一系 1, 4-DHPDの不斉加水分解活性 を有するタンパク質の発現に必須な dhpA遺伝子領域の限定
P D E 88で形質転換したストレプトマイセス · リビダンス 66 (Str eptomyces lividans 66)が、 前述のように 1、 4- DHPDの不斉加水 分解活性を有するタンパク質を発現したことより同活性の発現に必須な 領域は p DE 88中の 3.0 kb Sau3AI 挿入断片 中に存在すると考えら れた。 この領域をさらに限定するために、 pDE 89 (図 7) および p DE 87 (図 8) を構築した。 すなわち、 pDE 88 0.2 /zgを ^1で 分解して、 得られた DN A断片を Ligation Kit version 2 (宝酒造株式 会社製） にて自己環状化反応を行った。 この反応溶液で Streptomyces 1 ividans 66を形質転換して得た形質転換株からすでに実施例 1で述べた H o p w o o dらの実験書に示された方法でプラスミ ド p DE 89を調 製した。 p D E 8 9は p D E 8 8から 0.64 kb 断片が欠失したブラ スミ ドである。
また、 p D E 8 7の調製方法は^ Iで分解する代わりに^ Iで分解す るところを除いては P D E 8 9の調製方法と同じである。 p D E 8 7は p D E 8 8から 1.8 kb 断片が欠失したプラスミ ドである。
p D E 8 9で形質転換した Streptomyces lividans 66は 1 , 4- DH P Dの不斉加水分解活性を示したが、 p D E 8 7で形質転換した Strept omyces lividans 66は 1 , 4 -D H P Dの不斉加水分解活性を示さなかつ た。 このことは、 1， 4- DH P Dの不斉加水分解活性を有するタンパ ク質の発現に必須な領域が^ I- ^3AI間の 2.5 kbに限定され、 その中 に含まれる^ I部位が活性の発現に必要であることを示唆している。 実施例 1 1 dhpA遺伝子の配列決定用ベクターへのサブクローニング (p D E 9 1 )
p D E 8 8 l〃gを Saclおよび BamHIで分解した。 この分解物をべクタ — 'プラスミ ド p KF 3 (宝酒造株式会社製） の §55HI分解物 0.2 /gと混合し、 Ligation Kit version 2 (宝酒造株式会社製） にてライ ゲーシヨンを行った。 反応後、 この溶液で大腸菌 (Escherichia coli) TH 2コンビテント 'セル（宝酒造株式会社製） を形質転換し、 リコン ピナント選択培地 （1 %パク ト トリプトン、 0、 5 %酵母エキス、 0、 5 %NaCl、 50 g/ml ストレプトマイシン硫酸塩、 12 zg/ml クロラム フヱニコール、 p H 7, 5 ) に生育した株からプラスミ ド p D E 9 1 (図 9 ) を調製した。 p D E 9 1は P D E 8 8由来 1.8 kb acl- BamHI断片 を p K F 3に挿入したプラスミ ドである。
( P D E 9 2) p D E 88 l /gを^ iHIおよび^ Iで分解した。 この分解物を p KF 3 の §5ϋΗΙ- 分解物 0.2 〃gと混合した。 以下 p D E 91の構築の時と 同様な方法で、 ライゲ一ション、 形質転換し、 得られた株からプラスミ ド PDE 92 (図 10) を調製した。 P DE 92は P DE 88由来 0.9 kb BamHI- ^1断片を pKF 3に挿入したプラスミ ドである。
実施例 12 dhpA遺伝子塩基配列の決定
0£ 91を1 /zgずつ 7本のチューブに分け、 それぞれ および Sa cl， PshBIおよび Sphl, PshBIおよび Xhol, Ps—hBIおよび Mlul, Xbalおよ び^ I, および^^ I, および で分解した後、 DNA Blunting Kit (宝酒造株式会社製） を用いて、 DNA末端平滑化反応および自己環 状化反応を行った。 この溶液で、 E. coli TH2 コンビテン ト · セルを形 質転換して得た株より欠失プラスミ ドを調製した。 さらに p DE 92 5 fig を Ba Iおよび^ Iで分解し、 ェキソヌクレア一ゼ III /S 1ヌクレ ァ一ゼ処理により、 ^HI末端より 400 b (ベース ·ペア） の DNAを削り 取った。 同様にして、 p DE 92 5 β gを Xholおよび Saclで分解し、 ェ キソヌクレアーゼ III /S 1ヌクレア一ゼ処理により、 末端より 160 b および 450 b の DNAを削り取った後、 さらに^ ^BIで分解した。 これ らの欠失 DNA断片に対し、 DNA Blunting Kit (宝酒造株式会社製） を用 いて、 DNA末端平滑化反応および自己環状化反応を行った。 この溶液で、 E. coli TH2 コンビテント ·セルを形質転換して得た株より欠失ブラス ミ ドを調製した。 このようにして得られた種々の欠失プラスミ ドならび に PDE 91および P DE 92を铸型にして、 DNAシークェンサ一 37 7型 （アプライ ド バイオシステムズ株式会社製） を用いて塩基配列の 決定を行った。 各プラスミ ドの配列データをつなぎ合わせた結果、 実施 例 8で示された 4 -置換 1， 4 - D H P D不斉加水分解活性の発現に必須 な領域である^ I部位から^ 3AI部位までの 2539 bの塩基配列が決定さ れた。
決定された塩基配列をもとに Bibbらの方法 （Gene, 30, 157 (1984) ) に従ってオープンリーディ ングフレーム （0RF) を調べた。 その結果、 配列表の配列番号： 1の配列に示した 0RFを見出した。 この配列は実施 例 8で示した Mlul部位 （DNA配列 8 5 8— 8 6 3位） を含んでいた。 遺伝子は配列番号： 1の DNA配列 338番目の GTGから始まるが、 その下流 から実施例 8で限定された領域の末端すなわち配列番号 1の DNA配列 253 9番目（Sau3AI部位 GATCの C ； シトシン位）までに停止コ ドンが見出され なかった。
P D E 8 8の構造より、 その末端よりさらに下流には、 ベクタ一 pIJ7 02の配列すなわちストレプトマイセス ·アンティ ピオティクス（^ epto myces antibioticus) 由来メラニン色素産生遺伝子（mel)領域が dhpA遺 伝子の方向と相対する向きで隣接していた。 Bernan らが報告した^遺 伝子の塩基配列（Gene, 37, 101 (1985))を考慮した結果、 この^ i領域に て dhpA遺伝子より続く 0RFの停止コ ドン（TAA)を配列番号 1の DNA配列 2807 番目に見出した。 そこまでの翻訳領域に相当する DNA配列からアミノ酸 配列を決定し、 配列番号： 1に DNA配列とともに示した。 また同一のアミ ノ酸配列は配列番号： 2の配列として示されている。 配列番号： 1に示 した配列のうち dhpA遺伝子がもつ機能すなわち 1 , 4 -D H P Dの不斉 加水分解活性を有するタンパク質を前記の宿主-ベクタ一系で発現させ るのに必要な塩基配列 （配列番号： 1の DNA配列 1— 2539位） と対応す るアミノ酸を配列番号： 3に示した。 さらに同一のァミノ酸配列を配列 番号 ： 4の配列として示した。
産業上の利用可能性
本発明に従えば、 1, 4- DHPDの不斉加水分解酵素活性を有する タンパク質の微生物による生産性を高めることのできる該タンパク質を 5 コー ドする遺伝子が提供される。 さらに、 本発明によれば、 かかる遺伝 子を組み込んだ発現プラスミ ドおよびそれによる形質転換体も提供され る。 またさらに、 本発明によれば、 かかる形質転換体を用いることによ り、 1, 4-DHPDの不斉加水分解酵素活性を有するタンパク質を効 率よく製造することもできる。 本発明に従う、 1， 4- DHPDの不斉 ! 0 加水分解酵素活性を有するタンパク質はプロテアーゼ活性が低いため、 各種反応条件下で安定性が高く、 工業的な光学活性 1, 4-ジヒ ドロピ リジン誘導体の合成に有利である。
したがって、 本発明は微生物を用いる各種化合物の製造業や医薬製造 業で利用可能である。
20 配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 2809
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： enomic DNA
起源
生物名 ： ストレブトマイセス ' ピリ ドスポルス（Streptomyces viridosporus) 株名： A- 914
生物名： ストレプトマイセス * アンティ ビォテイクス（Streptomyces antibiot icus)
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 338. . 2539
特徴を決定した方法： E
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 2540. . 2809
特徴を決定した方法： P
配列 GAGCTCGGGC TCACCTTCGT CATGGTCACC CACGACTCGG CGATCGCGCG GAAGGCCCCG 60 CGCCTGGCGA CGATCCGCGA GGGACGGATC ACCGTGCGGG AGAACACCGG GGCCTGAGCC 120 GGCGAGGTCC CACCACGCGG TTCTGTAACG GAGTTCCGGC GGTGACGTTA CAGTCGCCCG 180 GCGACTTGCC CACCTTTTCC ACAGCCCTTG AGGCGCTTGA TCACCCCTCG GCATACTGCG 240 5 TGCTCCGGGG GGTGCGCGCA TGCGTACGAG ACCACCCCCG ACCGGGTGAC GGGGAGTTCA 300 CCCGGCAACT CCGCTAGGGG GAACCTTGCG CAGACAA GTG AAA AGA GCA TGC GCG 355
Met Lys Arg Ala Cys Ala 1 5
GCC ACG GTC GCC ACG GCC GCC GCC GTG GCC CTC GCG GCC GGC ATG ACC 403 i o Ala Thr Val Ala Thr Ala Ala Ala Val Ala Leu Ala Ala Gly Met Thr
10 15 20
GGA CCG GCG GCG GCG AGC GGG GAG CAC ACG GCC GCC GCC GGA CAG CCG 451 Gly Pro Ala Ala Ala Ser Gly Glu His Thr Ala Ala Ala Gly Gin Pro
25 30 35
i s TCG GCG AAG GCG TCG GCG AAG ACG TCC TCG CTC AAG GCC ACG CAG CAC 499 Ser Ala Lys Ala Ser Ala Lys Thr Ser Ser Leu Lys Ala Thr Gin His
40 45 50
ATC ACA CTG ATC ACC GGC GAC CGG GTC GCC GTG GAC GCC ACG GGC CGC 547 lie Thr Leu lie Thr Gly Asp Arg Val Ala Val Asp Ala Thr Gly Arg 2 o 55 60 65 70
GTC GTC GGC CTC GAG AGG GCC GAG GGG CGG GAA CAC ATA CCC GTC CAG 595 Val Val Gly Leu Glu Arg Ala Glu Gly Arg Glu His lie Pro Val Gin
75 80 85 ATC CGC AAG GTC GAC GGC CAC ACC CTC GTG CTG CCG GCG GAC GCC GCC 643 lie Arg Lys Val Asp Gly His Thr Leu Val Leu Pro Ala Asp Ala Ala
90 95 100
CGG CTG GTC GCG AGC GGC AAG CTC GAC CGG CGG CTC TTC GAC ATC ACC 691
5 Arg Leu Val Ala Ser Gly Lys Leu Asp Arg Arg Leu Phe Asp He Thr
105 110 115
GAA CTC GGC AAG GCC GCG ACC CGC AAC TCC CAG AAA CAG GGA CTG AAG 739
Glu Leu Gly Lys Ala Ala Thr Arg Asn Ser Gin Lys Gin Gly Leu Lys
120 125 130
i o GTC ATC GTC GGC TAC CAG GGC GCC GCA CGG GCC GCC AAG GCC GAG GTC 787
Val lie Val Gly Tyr Gin Gly Ala Ala Arg Ala Ala Lys Ala Glu Val
135 140 145 150
CGC GAA GCG GGC GAA CTC CGC CGG ACC CTG ACG TCC CTG AAC GCG GAC 835
Arg Glu Ala Gly Glu Leu Arg Arg Thr Leu Thr Ser Leu Asn Ala Asp i s 155 160 165
GCG GTG CGG ACC CCG CAC GAG GAC GCG TCC GAG CTG TGG GAC GCC GTC 883
Ala Val Arg Thr Pro His Glu Asp Ala Ser Glu Leu Trp Asp Ala Val
170 175 180
ACC AAC GGC GAC CGG ACC GCC TCC GGC ATC GCC CAC GTC TGG CTG GAC 931
2 0 Thr Asn Gly Asp Arg Thr Ala Ser Gly lie Ala His Val Trp Leu Asp
185 190 195
GGG GTC CGC AGG GCC GCC CTC GAC ACG TCC GTC GGG CAG ATC GGC GCC 979
Gly Val Arg Arg Ala Ala Leu Asp Thr Ser Val Gly Gin lie Gly Ala
200 205 210 O 97/05243 P T/JP / 214
39
CCC AAG GCG TGG TCC GCC GGC TAC GAC GGC AAG GGC GTG AAG ATC GCC 1027
Pro Lys Ala Trp Ser Ala Gly Tyr Asp Gly Lys Gly Val Lys lie Ala
215 220 225 230
GTC CTG GAC ACC GGT GTC GAC ACG AGC CAT CCG GAC CTG AAG GGC CGG 1075
5 Val Leu Asp Thr Gly Val Asp Thr Ser His Pro Asp Leu Lys Gly Arg
235 240 245
GTG ACC GCG TCC AAG AAC TTC ACC GCC GCG CCC GGC GCC GGC GAC AAG 1123
Val Thr Ala Ser Lys Asn Phe Thr Ala Ala Pro Gly Ala Gly Asp Lys
250 255 260
, o GTG GGC CAC GGC ACC CAC GTC GCC TCG ATC GCG GCG GGC ACG GGC GCC 1171
Val Gly His Gly Thr His Val Ala Ser lie Ala Ala Gly Thr Gly Ala
265 270 275
CAG TCC AAG GGC AAG TAC AAG GGC GTC GCA CCC GGC GCC GCG ATC CTC 1219
Gin Ser Lys Gly Lys Tyr Lys Gly Val Ala Pro Gly Ala Ala lie Leu
1 S 280 285 290
AAC GGC AAG GTC CTC GAC GAC TCC GGT TTC GGC GAC GAC TCC GGC ATC 1267
Asn Gly lys Val Leu Asp Asp Ser Gly Phe Gly Asp Asp Ser Gly lie
295 300 305 310
CTC GCC GGC ATG GAG TGG GCG GCC GCG CAG GGC GCC GAC GTC GTC AAC 1315
2 o Leu Ala Gly Met Glu Trp Ala Ala Ala Gin Gly Ala Asp Val Val Asn
315 320 325
ATG AGC CTG GGC GGC ATG GAC ACA CCG GAG ACC GAC CCG CTG GAG GCG 1363
Met Ser Leu Gly Gly Met Asp Thr Pro Glu Thr Asp Pro Leu Glu Ala
330 335 340 GCG GTC GAC AAG CTG TCC GCC GAG AAG GGC GTC CTG TTC GCC ATC GCG 1411
Ala Val Asp Lys Leu Ser Ala Glu Lys Gly Val Leu Phe Ala l ie Ala
345 350 355
GCC GGC AAC GAG GGC CCG GAG TCG ATC GGT TCG CCC GGC AGC GCG GAC 1459
5 Ala Gly Asn Glu Gly Pro Glu Ser lie Gly Ser Pro Gly Ser Ala Asp
360 365 370
GCC GCC CTC ACC GTC GGC GCC GTC GAC GAC AAG GAC AAG CTC GCC GAC 1507
Ala Ala Leu Thr Val Gly Ala Val Asp Asp Lys Asp Lys Leu Ala Asp
375 380 385 390 i o TTC TCC TCC ACC GGC CCC CGC CTC GGC GAC GGC GCC ATC AAG CCG GAC 1555
Phe Ser Ser Thr Gly Pro Arg Leu Gly Asp Gly Ala lie Lys Pro Asp
395 400 405
GTC ACC GCT CCC GGC GTG GAC ATC ACG GCC GCC TCG GCG GAG GGC AAC 1603
Val Thr Ala Pro Gly Val Asp lie Thr Ala Ala Ser Ala Glu Gly Asn i s 410 415 420
GAC ATC GGC CAG GAG GTC GGT GAG GGA CCG GCC GGC TAC ATG ACC ATC 1651
Asp lie Gly Gin Glu Val Gly Glu Gly Pro Ala Gly Tyr Met Thr lie
425 430 435
TCC GGC ACG TCG ATG GCG ACC CCG CAC GTC GCG GGC GCG GCG GCC CTC 1699
2 o Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu
440 445 450
CTG AAG CAG CAG CAC CCC GAC TGG ACC TCC GCC GAA CTG AAG GGC GCG 1747
Leu Lys Gin Gin His Pro Asp Trp Thr Ser Ala Glu Leu Lys Gly Ala
455 460 465 470 3
41
CTC ACC GGC TCC ACC AAG GGC GGC AAG TAC ACC CCG TTC GAG CAG GGT 1795
Leu Thr Gly Ser Thr Lys Gly Gly Lys Tyr Thr Pro Phe Glu Gin Gly
475 480 485
TCG GGC CGG ATC CAG GCC GAC AAG GCG CTC CAG CAG ACC GTG ATC GCC 1843
5 Ser Gly Arg He Gin Ala Asp Lys Ala Leu Gin Gin Thr Val lie Ala
490 495 500
GAC CCG GTC TCG GTG AGC TTC GGC GTC CAG CAG TGG CCG CAC ACC GAC 1891
Asp Pro Val Ser Val Ser Phe Gly Val Gin Gin Trp Pro His Thr Asp
505 510 515
i o GAC GAG CCG GTC ACC AAG CAG CTG ACC TAC CGC AAC CTC GGC ACC CAG 1939
Asp Glu Pro Val Thr Lys Gin Leu Thr Tyr Arg Asn Leu Gly Thr Gin
520 525 530
GAC GTC ACG CTG AAG CTG ACG TCG ACC GCC ACC GAC CCC AAG GGC AAG 1987
Asp Val Thr Leu Lys Leu Thr Ser Thr Ala Thr Asp Pro Lys Gly Lys
1 5 535 540 545 550
GCG GCC CCG GCG GGC TTC TTC ACG CTG GGC GCC ACC ACG GTG ACC GTC 2035
Ala Ala Pro Ala Gly Phe Phe Thr Leu Gly Ala Thr Thr Val Thr Val
555 560 565
CCG GCG GGC GGC AGC GCC TCC GTC GAC ATG ACC GCC GAC ACC CGG CTC 1083
20 Pro Ala Gly Gly Ser Ala Ser Val Asp Met Thr Ala Asp Thr Arg Leu
570 575 580
GGC GGC ACG GTG GAC GGC GCG TAC TCG GCG TAC GTG GTC GCC ACG GGC 2131
Gly Gly Thr Val Asp Gly Ala Tyr Ser Ala Tyr Val Val Ala Thr Gly
585 590 595 GGC GGG CAG ACG GTC CGC ACG GCC GCC GCG GTG CAG CGC GAG GTC GAG 2179
Gly Gly Gin Thr Val Arg Thr Ala Ala Ala Val Gin Arg Glu Val Glu
600 605 610
TCG TAC GAC GTG ACC GTC CGG CAC ATC GGC CGG GAC GGC AAG CCC ACG 2227
5 Ser Tyr Asp Val Thr Val Arg His lie Gly Arg Asp Gly Lys Pro Thr
615 620 625 630
ACC GAA CAC CTC ACC GAC CTG ATC GGC TAC GCG GGC CTG GGC TCC GGC 2275
Thr Glu His Leu Thr Asp Leu lie Gly Tyr Ala Gly Leu Gly Ser Gly
635 640 645
i o CGC GGT TAC GGC GCC CCG GCC ACC GAC ACC GCC ACC CTG CGC CTG CCC 2323
Arg Gly Tyr Gly Ala Pro Ala Thr Asp Thr Ala Thr Leu Arg Leu Pro
650 655 660
AAG GGC ACC TAC CTG GTG GAC TCC TGG ATC GCC AAG GAC TTC GGG ACG 2371
Lys Gly Thr Tyr Leu Val Asp Ser Trp lie Ala Lys Asp Phe Gly Thr i s 665 670 675
CTC AAG GGC GGC ATC GAC TGG CTG GTC CAG CCG AAG CTG AGC GTC ACC 2419
Leu Lys Gly Gly lie Asp Trp Leu Val Gin Pro Lys Leu Ser Val Thr
680 685 690
AAG GAC ACC ACG CTG ACA CTC GAC GCA CGC ACC ACC AAG GCG GCG GAC 2467
2 0 Lys Asp Thr Thr Leu Thr Leu Asp Ala Arg Thr Thr Lys Ala Ala Asp
695 700 705 710
ATC ACC GTG CCG GAC CCC AAG GCC AAG CCG CTC TCC GCG ACC ATC GGC 2515 lie Thr Val Pro Asp Pro Lys Ala Lys Pro Leu Ser Ala Thr l ie Gly
715 720 725 TAC ACC TAC GAC ACG GCG GGG ATC TCG TCG AAG GCG GCG GGG GCG CCG 2563
Tyr Thr Tyr Asp Thr Ala Gly lie Ser Ser Lys Ala Ala Gly Ala Pro
730 735 740
GAC GCG GCC GGG TTC CCG GGG ACC TCG GGG GTG TGG TGC CCC CGA TCG 2611
5 Asp Ala Ala Gly Phe Pro Gly Thr Ser Gly Val Trp Cys Pro Arg Ser
745 750 755
TCC GCG CGG GCG GCG GGA AGG GCG ACC AGC GGG ACA CCG GCG GCG ACG 2659
Ser Ala Arg Ala Ala Gly Arg Ala Thr Ser Gly Thr Pro Ala Ala Thr
760 765 770
i o ACG GCT GCG GCG CCG AGC GCG CGA CGA CGG GTG AGT TCC GGC ATG CGG 2707
Thr Ala Ala Ala Pro Ser Ala Arg Arg Arg Val Ser Ser Gly Met Arg 775 780 785 790
GAC CTC CTG GGG TGC GTT GGG TTG ACG ACC CCG CAT ACC TAT CGA CCG 2755
Asp Leu Leu Gly Cys Val Gly Leu Thr Thr Pro His Thr Tyr Arg Pro i s 795 800 805
GAG GAG AAG GGG AGA AAT CGG CCC GGA CCG GTT GGC CGC GAT CCG GAC 2803
Glu Glu し ys Gly Arg Asn Arg Pro Gly Pro Val Gly Arg Asp Pro Asp
810 815 820
AAT TAA 2809 2 o Asn
823 配列番号： 2
配列の長さ ： 823
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
5 配列の種類： タンパク質
配列
Met Lys Arg Ala Cys Ala Ala Thr Val Ala Thr Ala Ala Ala Val Ala
1 5 10 15
Leu Ala Ala Gly Met Thr Gly Pro Ala Ala Ala Ser Gly Glu His Thr t o 20 25 30
Ala Ala Ala Gly Gin Pro Ser Ala Lys Ala Ser Ala Lys Thr Ser Ser
35 40 45
Leu Lys Ala Thr Gin His lie Thr Leu lie Thr Gly Asp Arg Val Ala 50 55 60
i s Val Asp Ala Thr Gly Arg Val Val Gly Leu Glu Arg Ala Glu Gly Arg 65 70 75 80
Glu His lie Pro Val Gin lie Arg Lys Val Asp Gly His Thr Leu Val
85 90 95
Leu Pro Ala Asp Ala Ala Arg Leu Val Ala Ser Gly Lys Leu Asp Arg 2 0 100 105 110
Arg Leu Phe Asp lie Thr Glu Leu Gly Lys Ala Ala Thr Arg Asn Ser
115 120 125
Gin Lys Gin Gly Leu Lys Val lie Val Gly Tyr Gin Gly Ala Ala Arg 130 135 140 Ala Ala Lys Ala Glu Val Arg Glu Ala Gly Glu Leu Arg Arg Thr Leu 145 150 155 160
Thr Ser Leu Asn Ala Asp Ala Val Arg Thr Pro His Glu Asp Ala Ser
165 170 175
5 Glu Leu Trp Asp Ala Val Thr Asn Gly Asp Arg Thr Ala Ser Gly lie
180 185 190
Ala His Val Trp Leu Asp Gly Val Arg Arg Ala Ala Leu Asp Thr Ser
195 200 205
Val Gly Gin lie Gly Ala Pro Lys Ala Trp Ser Ala Gly Tyr Asp Gly ! o 210 215 220
Lys Gly Val Lys lie Ala Val Leu Asp Thr Gly Val Asp Thr Ser His 225 230 235 240
Pro Asp Leu Lys Gly Arg Val Thr Ala Ser Lys Asn Phe Thr Ala Ala
245 250 255 i s Pro Gly Ala Gly Asp Lys Val Gly His Gly Thr His Val Ala Ser lie
260 265 270
Ala Ala Gly Thr Gly Ala Gin Ser Lys Gly Lys Tyr Lys Gly Val Ala
275 280 285
Pro Gly Ala Ala lie Leu Asn Gly Lys Val Leu Asp Asp Ser Gly Phe 2 o 290 295 300
Gly Asp Asp Ser Gly He Leu Ala Gly Met Glu Trp Ala Ala Ala Gin 305 310 315 320
Gly Ala Asp Val Val Asn Met Ser Leu Gly Gly Met Asp Thr Pro Glu
325 330 335 5243 P T/JP96/02147
46
Thr Asp Pro Leu Glu Ala Ala Val Asp Lys Leu Ser Ala Glu Lys Gly
340 345 350
Val Leu Phe Ala lie Ala Ala Gly Asn Glu Gly Pro Glu Ser lie Gly
355 360 365
5 Ser Pro Gly Ser Ala Asp Ala Ala Leu Thr Val Gly Ala Val Asp Asp
370 375 380
Lys Asp Lys Leu Ala Asp Phe Ser Ser Thr Gly Pro Arg Leu Gly Asp 385 390 395 400
Gly Ala lie Lys Pro Asp Val Thr Ala Pro Gly Val Asp lie Thr Ala , o 405 410 415
Ala Ser Ala Glu Gly Asn Asp lie Gly Gin Glu Val Gly Glu Gly Pro
420 425 430
Ala Gly Tyr Met Thr lie Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val
435 440 445 i s Ala Gly Ala Ala Ala Leu Leu Lys Gin Gin His Pro Asp Trp Thr Ser
450 455 460
Ala Glu Leu Lys Gly Ala Leu Thr Gly Ser Thr Lys Gly Gly Lys Tyr 465 470 475 480
Thr Pro Phe Glu Gin Gly Ser Gly Arg lie Gin Ala Asp Lys Ala Leu 2 0 485 490 495
Gin Gin Thr Val lie Ala Asp Pro Val Ser Val Ser Phe Gly Val Gin
500 505 510
Gin Trp Pro His Thr Asp Asp Glu Pro Val Thr Lys Gin Leu Thr Tyr
515 520 525 Arg Asn Leu Gly Thr Gin Asp Val Thr Leu Lys Leu Thr Ser Thr Ala
530 535 540
Thr Asp Pro Lys Gly Lys Ala Ala Pro Ala Gly Phe Phe Thr Leu Gly 545 550 555 560
5 Ala Thr Thr Val Thr Val Pro Ala Gly Gly Ser Ala Ser Val Asp Met
565 570 575
Thr Ala Asp Thr Arg Leu Gly Gly Thr Val Asp Gly Ala Tyr Ser Ala
580 585 590
Tyr Val Val Ala Thr Gly Gly Gly Gin Thr Val Arg Thr Ala Ala Ala l o 595 600 605
Val Gin Arg Glu Val Glu Ser Tyr Asp Val Thr Val Arg His lie Gly
610 615 620
Arg Asp Gly Lys Pro Thr Thr Glu His Leu Thr Asp Leu lie Gly Tyr 625 630 635 640
1 5 Ala Gly Leu Gly Ser Gly Arg Gly Tyr Gly Ala Pro Ala Thr Asp Thr
645 650 655
Ala Thr Leu Arg Leu Pro Lys Gly Thr Tyr Leu Val Asp Ser Trp lie
660 665 670
Ala Lys Asp Phe Gly Thr Leu Lys Gly Gly lie Asp Trp Leu Val Gin 2 0 675 680 685
Pro Lys Leu Ser Val Thr Lys Asp Thr Thr Leu Thr Leu Asp Ala Arg
690 695 700
Thr Thr Lys Ala Ala Asp lie Thr Val Pro Asp Pro Lys Ala Lys Pro 705 710 715 720 05243
48
Leu Ser Ala Thr lie Gly Tyr Thr Tyr Asp Thr Ala Gly lie Ser Ser
725 730 735
Lys Ala Ala Gly Ala Pro Asp Ala Ala Gly Phe Pro Gly Thr Ser Gly
740 745 750
5 Val Trp Cys Pro Arg Ser Ser Ala Arg Ala Ala Gly Arg Ala Thr Ser
755 760 765
Gly Thr Pro Ala Ala Thr Thr Ala Ala Ala Pro Ser Ala Arg Arg Arg
770 775 780
Val Ser Ser Gly Met Arg Asp Leu Leu Gly Cys Val Gly Leu Thr Thr i o 785 790 795 800
Pro His Thr Tyr Arg Pro Glu Glu Lys Gly Arg Asn Arg Pro Gly Pro
805 810 815
Val Gly Arg Asp Pro Asp Asn
820 823
1 5 配列番号： 3
配列の長さ： 2539
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
0 配列の種類： genomic DNA
起源
生物名：ストレブトマイセス * ビリ ドスポルス（StiOptomyces viridosporus) 株名： A-914
配列の特徴 特徴を表す記号： CDS
存在位置： 338. . 2539
特徴を決定した方法： E
配列
5 GAGCTCGGGC TCACCTTCGT CATGGTCACC CACGACTCGG CGATCGCGCG GAAGGCCCCG 60 CGCCTGGCGA CGATCCGCGA GGGACGGATC ACCGTGCGGG AGAACACCGG GGCCTGAGCC 120 GGCGAGGTCC CACCACGCGG TTCTGTAACG GAGTTCCGGC GGTGACGTTA CAGTCGCCCG 180 GCGACTTGCC CACCTTTTCC ACAGCCCTTG AGGCGCTTGA TCACCCCTCG GCATACTGCG 240 TGCTCCGGGG GGTGCGCGCA TGCGTACGAG ACCACCCCCG ACCGGGTGAC GGGGAGTTCA 300 i o CCCGGCAACT CCGCTAGGGG GAACCTTGCG CAGACAA GTG AAA AGA GCA TGC GCG 355
Met Lys Arg Ala Cys Ala 1 5
GCC ACG GTC GCC ACG GCC GCC GCC GTG GCC CTC GCG GCC GGC ATG ACC 403 Ala Thr Val Ala Thr Ala Ala Ala Val Ala Leu Ala Ala Gly Met Thr i s 10 15 20
GGA CCG GCG GCG GCG AGC GGG GAG CAC ACG GCC GCC GCC GGA CAG CCG 451 Gly Pro Ala Ala Ala Ser Gly Glu His Thr Ala Ala Ala Gly Gin Pro
25 30 35
TCG GCG AAG GCG TCG GCG AAG ACG TCC TCG CTC AAG GCC ACG CAG CAC 499 2 0 Ser Ala Lys Ala Ser Ala Lys Thr Ser Ser Leu Lys Ala Thr Gin His
40 45 50
ATC ACA CTG ATC ACC GGC GAC CGG GTC GCC GTG GAC GCC ACG GGC CGC 547 lie Thr Leu lie Thr Gly Asp Arg Val Ala Val Asp Ala Thr Gly Arg 55 60 65 70 GTC GTC GGC CTC GAG AGG GCC GAG GGG CGG GAA CAC ATA CCC GTC CAG 595 Val Val Gly Leu Glu Arg Ala Glu Gly Arg Glu His lie Pro Val Gin
75 80 85
ATC CGC AAG GTC GAC GGC CAC ACC CTC GTG CTG CCG GCG GAC GCC GCC 643 5 lie Arg Lys Val Asp Gly His Thr Leu Val Leu Pro Ala Asp Ala Ala
90 95 100
CGG CTG GTC GCG AGC GGC AAG CTC GAC CGG CGG CTC TTC GAC ATC ACC 691 Arg Leu Val Ala Ser Gly Lys Leu Asp Arg Arg Leu Phe Asp lie Thr
105 110 115 i o GAA CTC GGC AAG GCC GCG ACC CGC AAC TCC CAG AAA CAG GGA CTG AAG 739 Glu Leu Gly Lys Ala Ala Thr Arg Asn Ser Gin Lys Gin Gly Leu Lys
120 125 130
GTC ATC GTC GGC TAC CAG GGC GCC GCA CGG GCC GCC AAG GCC GAG GTC 787 Val lie Val Gly Tyr Gin Gly Ala Ala Arg Ala Ala Lys Ala Glu Val , 5 135 140 145 150
CGC GAA GCG GGC GAA CTC CGC CGG ACC CTG ACG TCC CTG AAC GCG GAC 835 Arg Glu Ala Gly Glu Leu Arg Arg Thr Leu Thr Ser Leu Asn Ala Asp
155 160 165
GCG GTG CGG ACC CCG CAC GAG GAC GCG TCC GAG CTG TGG GAC GCC GTC 883 2 0 Ala Val Arg Thr Pro His Glu Asp Ala Ser Glu Leu Trp Asp Ala Val
170 175 180
ACC AAC GGC GAC CGG ACC GCC TCC GGC ATC GCC CAC GTC TGG CTG GAC 931 Thr Asn Gly Asp Arg Thr Ala Ser Gly lie Ala His Val Trp Leu Asp
185 190 195 GGG GTC CGC AGG GCC GCC CTC GAC ACG TCC GTC GGG CAG ATC GGC GCC 979 Gly Val Arg Arg Ala Ala Leu Asp Thr Ser Val Gly Gin lie Gly Ala
200 205 210
CCC AAG GCG TGG TCC GCC GGC TAC GAC GGC AAG GGC GTG AAG ATC GCC 1027 5 Pro Lys Ala Trp Ser Ala Gly Tyr Asp Gly Lys Gly Val Lys lie Ala
215 220 225 230
GTC CTG GAC ACC GGT GTC GAC ACG AGC CAT CCG GAC CTG AAG GGC CGG 1075 Val Leu Asp Thr Gly Val Asp Thr Ser His Pro Asp Leu Lys Gly Arg
235 240 245 i o GTG ACC GCG TCC AAG AAC TTC ACC GCC GCG CCC GGC GCC GGC GAC AAG 1123 Val Thr Ala Ser Lys Asn Phe Thr Ala Ala Pro Gly Ala Gly Asp Lys
250 255 260
GTG GGC CAC GGC ACC CAC GTC GCC TCG ATC GCG GCG GGC ACG GGC GCC 1171 Val Gly His Gly Thr His Val Ala Ser He Ala Ala Gly Thr Gly Ala 1 5 265 270 275
CAG TCC AAG GGC AAG TAC AAG GGC GTC GCA CCC GGC GCC GCG ATC CTC 1219 Gin Ser Lys Gly Lys Tyr Lys Gly Val Ala Pro Gly Ala Ala lie Leu
280 285 290
AAC GGC AAG GTC CTC GAC GAC TCC GGT TTC GGC GAC GAC TCC GGC ATC 1267 20 Asn Gly Lys Val Leu Asp Asp Ser Gly Phe Gly Asp Asp Ser Gly lie
295 300 305 310
CTC GCC GGC ATG GAG TGG GCG GCC GCG CAG GGC GCC GAC GTC GTC AAC 1315 Leu Ala Gly Met Glu Trp Ala Ala Ala Gin Gly Ala Asp Val Val Asn
315 320 325 ATG AGC CTG GGC GGC ATG GAC ACA CCG GAG ACC GAC CCG CTG GAG GCG 1363 Met Ser Leu Gly Gly Met Asp Thr Pro Glu Thr Asp Pro Leu Glu Ala
330 335 340
GCG GTC GAC AAG CTG TCC GCC GAG AAG GGC GTC CTG TTC GCC ATC GCG 1411 5 Ala Val Asp Lys Leu Ser Ala Glu Lys Gly Val し eu Phe Ala lie Ala
345 350 355
GCC GGC AAC GAG GGC CCG GAG TCG ATC GGT TCG CCC GGC AGC GCG GAC 1459 Ala Gly Asn Glu Gly Pro Glu Ser lie Gly Ser Pro Gly Ser Ala Asp
360 365 370
！ o GCC GCC CTC ACC GTC GGC GCC GTC GAC GAC AAG GAC AAG CTC GCC GAC 1507 Ala Ala Leu Thr Val Gly Ala Val Asp Asp Lys Asp Lys Leu Ala Asp 375 380 385 390
TTC TCC TCC ACC GGC CCC CGC CTC GGC GAC GGC GCC ATC AAG CCG GAC 1555 Phe Ser Ser Thr Gly Pro Arg Leu Gly Asp Gly Ala lie Lys Pro Asp i s 395 400 405
GTC ACC GCT CCC GGC GTG GAC ATC ACG GCC GCC TCG GCG GAG GGC AAC 1603 Val Thr Ala Pro Gly Val Asp lie Thr Ala Ala Ser Ala Glu Gly Asn
410 415 420
GAC ATC GGC CAG GAG GTC GGT GAG GGA CCG GCC GGC TAC ATG ACC ATC 1651 2 0 Asp lie Gly Gin Glu Val Gly Glu Gly Pro Ala Gly Tyr Met Thr lie
425 430 435
TCC GGC ACG TCG ATG GCG ACC CCG CAC GTC GCG GGC GCG GCG GCC CTC 1699 Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu
440 445 450 CTG AAG CAG CAG CAC CCC GAC TGG ACC TCC GCC GAA CTG AAG GGC GCG 1747
Leu Lys Gin Gin His Pro Asp Trp Thr Ser Ala Glu Leu Lys Gly Ala
455 460 465 470
CTC ACC GGC TCC ACC AAG GGC GGC AAG TAC ACC CCG TTC GAG CAG GGT 1795 Leu Thr Gly Ser Thr Lys Gly Gly Lys Tyr Thr Pro Phe Glu Gin Gly
475 480 485
TCG GGC CGG ATC CAG GCC GAC AAG GCG CTC CAG CAG ACC GTG ATC GCC 1843
Ser Gly Arg lie Gin Ala Asp Lys Ala Leu Gin Gin Thr Val He Ala
490 495 500
GAC CCG GTC TCG GTG AGC TTC GGC GTC CAG CAG TGG CCG CAC ACC GAC 1891
Asp Pro Val Ser Val Ser Phe Gly Val Gin Gin Trp Pro His Thr Asp
505 510 515
GAC GAG CCG GTC ACC AAG CAG CTG ACC TAC CGC AAC CTC GGC ACC CAG 1939
Asp Glu Pro Val Thr Lys Gin Leu Thr Tyr Arg Asn Leu Gly Thr Gin
520 525 530
GAC GTC ACG CTG AAG CTG ACG TCG ACC GCC ACC GAC CCC AAG GGC AAG 1987
Asp Val Thr Leu Lys Leu Thr Ser Thr Ala Thr Asp Pro Lys Gly Lys
535 540 545 550
GCG GCC CCG GCG GGC TTC TTC ACG CTG GGC GCC ACC ACG GTG ACC GTC 2035
Ala Ala Pro Ala Gly Phe Phe Thr Leu Gly Ala Thr Thr Val Thr Val
555 560 565
CCG GCG GGC GGC AGC GCC TCC GTC GAC ATG ACC GCC GAC ACC CGG CTC 1083
Pro Ala Gly Gly Ser Ala Ser Val Asp Met Thr Ala Asp Thr Arg Leu
570 575 580 GGC GGC ACG GTG GAC GGC GCG TAC TCG GCG TAC GTG GTC GCC ACG GGC 2131 Gly Gly Thr Val Asp Gly Ala Tyr Ser Ala Tyr Val Val Ala Thr Gly
585 590 595
GGC GGG CAG ACG GTC CGC ACG GCC GCC GCG GTG CAG CGC GAG GTC GAG 2179 5 Gly Gly Gin Thr Val Arg Thr Ala Ala Ala Val Gin Arg Glu Val Glu
600 605 610
TCG TAC GAC GTG ACC GTC CGG CAC ATC GGC CGG GAC GGC AAG CCC ACG 2227 Ser Tyr Asp Val Thr Val Arg His He Gly Arg Asp Gly Lys Pro Thr 615 620 625 630
！ o ACC GAA CAC CTC ACC GAC CTG ATC GGC TAC GCG GGC CTG GGC TCC GGC 2275 Thr Glu His Leu Thr Asp Leu lie Gly Tyr Ala Gly Leu Gly Ser Gly
635 640 645
CGC GGT TAC GGC GCC CCG GCC ACC GAC ACC GCC ACC CTG CGC CTG CCC 2323 Arg Gly Tyr Gly Ala Pro Ala Thr Asp Thr Ala Thr Leu Arg Leu Pro 1 5 650 655 660
AAG GGC ACC TAC CTG GTG GAC TCC TGG ATC GCC AAG GAC TTC GGG ACG 2371 Lys Gly Thr Tyr Leu Val Asp Ser Trp lie Ala Lys Asp Phe Gly Thr
665 670 675
CTC AAG GGC GGC ATC GAC TGG CTG GTC CAG CCG AAG CTG AGC GTC ACC 2419 2 o Leu Lys Gly Gly lie Asp Trp Leu Val Gin Pro Lys Leu Ser Val Thr
680 685 690
AAG GAC ACC ACG CTG ACA CTC GAC GCA CGC ACC ACC AAG GCG GCG GAC 2467 Lys Asp Thr Thr Leu Thr Leu Asp Ala Arg Thr Thr Lys Ala Ala Asp 695 700 705 710 ATC ACC GTG CCG GAC CCC AAG GCC AAG CCG CTC TCC GCG ACC ATC GGC 2515 lie Thr Val Pro Asp Pro Lys Ala Lys Pro Leu Ser Ala Thr lie Gly
715 720 725
TAC ACC TAC GAC ACG GCG GGG ATC 2539 Tyr Thr Tyr Asp Thr Ala Gly lie
730 734 配列番号： 4
配列の長さ ： 734
1 0 配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類： タンパク質
配列
Met Lys Arg Ala Cys Ala Ala Thr Val Ala Thr Ala Ala Ala Val Ala i s 1 5 10 15
Leu Ala Ala Gly Met Thr Gly Pro Ala Ala Ala Ser Gly Glu His Thr
20 25 30
Ala Ala Ala Gly Gin Pro Ser Ala Lys Ala Ser Ala Lys Thr Ser Ser
35 40 45
2 0 Leu Lys Ala Thr Gin His lie Thr Leu lie Thr Gly Asp Arg Val Ala
50 55 60
Val Asp Ala Thr Gly Arg Val Val Gly Leu Glu Arg Ala Glu Gly Arg 65 70 75 80 Glu His lie Pro Val Gin lie Arg Lys Val Asp Gly His Thr Leu Val
85 90 95
Leu Pro Ala Asp Ala Ala Arg Leu Val Ala Ser Gly Lys Leu Asp Arg
100 105 110
5 Arg Leu Phe Asp lie Thr Glu Leu Gly Lys Ala Ala Thr Arg Asn Ser
115 120 125
Gin Lys Gin Gly Leu Lys Val lie Val Gly Tyr Gin Gly Ala Ala Arg
130 135 140
Ala Ala Lys Ala Glu Val Arg Glu Ala Gly Glu Leu Arg Arg Thr Leu 1 0 145 150 155 160
Thr Ser Leu Asn Ala Asp Ala Val Arg Thr Pro His Glu Asp Ala Ser
165 170 175
Glu Leu Trp Asp Ala Val Thr Asn Gly Asp Arg Thr Ala Ser Gly lie
180 185 190 i 5 Ala His Val Trp Leu Asp Gly Val Arg Arg Ala Ala Leu Asp Thr Ser
195 200 205
Val Gly Gin lie Gly Ala Pro Lys Ala Trp Ser Ala Gly Tyr Asp Gly
210 215 220
Lys Gly Val Lys lie Ala Val Leu Asp Thr Gly Val Asp Thr Ser His 2 o 225 230 235 240
Pro Asp Leu Lys Gly Arg Val Thr Ala Ser Lys Asn Phe Thr Ala Ala
245 250 255
Pro Gly Ala Gly Asp Lys Val Gly His Gly Thr His Val Ala Ser lie
260 265 270 Ala Ala Gly Thr Gly Ala Gin Ser Lys Gly Lys Tyr Lys Gly Val Ala
275 280 285
Pro Gly Ala Ala lie Leu Asn Gly Lys Val Leu Asp Asp Ser Gly Phe 290 295 300
5 Gly Asp Asp Ser Gly lie Leu Ala Gly Met Glu Trp Ala Ala Ala Gin 305 310 315 320
Gly Ala Asp Val Val Asn Met Ser Leu Gly Gly Met Asp Thr Pro Glu
325 330 335
Thr Asp Pro Leu Glu Ala Ala Val Asp Lys Leu Ser Ala Glu Lys Gly i o 340 345 350
Val Leu Phe Ala lie Ala Ala Gly Asn Glu Gly Pro Glu Ser lie Gly
355 360 365
Ser Pro Gly Ser Ala Asp Ala Ala Leu Thr Val Gly Ala Val Asp Asp 370 375 380
1 5 Lys Asp Lys Leu Ala Asp Phe Ser Ser Thr Gly Pro Arg Leu Gly Asp 385 390 395 400
Gly Ala lie Lys Pro Asp Val Thr Ala Pro Gly Val Asp lie Thr Ala
405 410 415
Ala Ser Ala Glu Gly Asn Asp lie Gly Gin Glu Val Gly Glu Gly Pro zo 420 425 430
Ala Gly Tyr Met Thr lie Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val
435 440 445
Ala Gly Ala Ala Ala Leu Leu Lys Gin Gin His Pro Asp Trp Thr Ser 450 455 460 Ala Glu Leu Lys Gly Ala Leu Thr Gly Ser Thr Lys Gly Gly Lys Tyr 465 470 475 480
Thr Pro Phe Glu Gin Gly Ser Gly Arg lie Gin Ala Asp Lys Ala Leu
485 490 495
5 Gin Gin Thr Val lie Ala Asp Pro Val Ser Val Ser Phe Gly Val Gin
500 505 510
Gin Trp Pro His Thr Asp Asp Glu Pro Val Thr Lys Gin Leu Thr Tyr
515 520 525
Arg Asn Leu Gly Thr Gin Asp Val Thr Leu Lys Leu Thr Ser Thr Ala i o 530 535 540
Thr Asp Pro Lys Gly Lys Ala Ala Pro Ala Gly Phe Phe Thr Leu Gly 545 550 555 560
Ala Thr Thr Val Thr Val Pro Ala Gly Gly Ser Ala Ser Val Asp Met
565 570 575
！ 5 Thr Ala Asp Thr Arg Leu Gly Gly Thr Val Asp Gly Ala Tyr Ser Ala
580 585 590
Tyr Val Val Ala Thr Gly Gly Gly Gin Thr Val Arg Thr Ala Ala Ala
595 600 605
Val Gin Arg Glu Val Glu Ser Tyr Asp Val Thr Val Arg His lie Gly 20 610 615 620
Arg Asp Gly Lys Pro Thr Thr Glu His Leu Thr Asp Leu lie Gly Tyr 625 630 635 640
Ala Gly Leu Gly Ser Gly Arg Gly Tyr Gly Ala Pro Ala Thr Asp Thr
645 650 655 62 92 OZ
Figure imgf000061_0001
6 OVI 039 311 OIV 039 0D0 003 000 030 001 Oil OVO 030 DVV
51 01 9 t
J3S 8jy dsy OJJ jgg Β γ -ias 3ュ γ aas J9S STJI Jas 丄 3jty dj OJJ 0 2 331 00V DVD 033 331 333 031 093 33V 331 OVD ODV 991 030 001 033
S3人 ：
fl*-： 驟
Figure imgf000061_0002
Figure imgf000061_0003
3Π
Figure imgf000061_0004
3TI -iqi BTV S naq
0ΪΖ L 0Jd sA exv sAq OJJ dsy OJJ ΙΒΛ ュ 3ΪΙ dsy eiv BTV sA jqx J¾
00A S69 069
3JV BTV dsy na jq naq jqi α¾ dsy sA J¾ TBA S naq sAq OJJ s
989 089 9A9
UT0 ΤΒΛ "31 djx dsy θχΐ Λ13 sAq ng jqx Α χ^ gqj dsy sA \
0£9 999 099
3TI dュ丄 jas dsy TEA nsq ιΧχ jqi A g sA oaj nsq 3jy na jqi εχν
69
L lZ0/96dV/LDd ひ^ 0 6 ΟΛ\ 配列番号： 6
配列の長さ ： 48
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
アンチセンス ： Yes
フラグメント型：中間フラグメント
配列
CGG CGC GCC TTG AGC CTG GCG AAC AGT TCG GCT GGC GCG AGC CCC TGA 48 Arg Arg Ala Leu Ser Leu Ala Asn Ser Ser Ala Gly Ala Ser Pro
1 5 10 15 配列番号： 7
配列の長さ ： 520
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類： タンパク質
配列
Leu Asp Thr Ser Val Gly Gin He Gly Ala Pro Lys Ala Trp Ser Ala 1 5 10 15
Gly Tyr Asp Gly Lys Gly Val Lys lie Ala Val Leu Asp Thr Gly Val
20 25 30
Asp Thr Ser His Pro Asp Leu Lys Gly Arg Val Thr Ala Ser Lys Asn
35 40 45 Phe Thr Ala Ala Pro Gly Ala Gly Asp Lys Val Gly His Gly Thr His
50 55 60
Val Ala Ser lie Ala Ala Gly Thr Gly Ala Gin Ser Lys Gly Lys Tyr 65 70 75 80 Lys Gly Val Ala Pro Gly Ala Ala lie Leu Asn Gly Lys Val Leu Asp
85 90 95
Asp Ser Gly Phe Gly Asp Asp Ser Gly lie Leu Ala Gly Met Glu Trp
100 105 110
Ala Ala Ala Gin Gly Ala Asp Val Val Asn Met Ser Leu Gly Gly Met
115 120 125
Asp Thr Pro Glu Thr Asp Pro Leu Glu Ala Ala Val Asp Lys Leu Ser
130 135 140
Ala Glu Lys Gly Val Leu Phe Ala lie Ala Ala Gly Asn Glu Gly Pro 145 150 155 160 Glu Ser lie Gly Ser Pro Gly Ser Ala Asp Ala Ala Leu Thr Val Gly
165 170 175
Ala Val Asp Asp Lys Asp Lys Leu Ala Asp Phe Ser Ser Thr Gly Pro
180 185 190
Arg Leu Gly Asp Gly Ala lie Lys Pro Asp Val Thr Ala Pro Gly Val
195 200 205
Asp lie Thr Ala Ala Ser Ala Glu Gly Asn Asp lie Gly Gin Glu Val
210 215 220
Gly Glu Gly Pro Ala Gly Tyr Met Thr lie Ser Gly Thr Ser Met Ala 225 230 235 240 Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Leu Lys Gin Gin His Pro
245 250 255
Asp Trp Thr Ser Ala Glu Leu Lys Gly Ala Leu Thr Gly Ser Thr Lys
260 265 270
Gly Gly Lys Tyr Thr Pro Phe Glu Gin Gly Ser Gly Arg lie Gin Ala
275 280 285
Asp Lys Ala Leu Gin Gin Thr Val lie Ala Asp Pro Val Ser Val Ser
290 295 300
Phe Gly Val Gin Gin Trp Pro His Thr Asp Asp Glu Pro Val Thr Lys 305 310 315 320
Gin Leu Thr Tyr Arg Asn Leu Gly Thr Gin Asp Val Thr Leu Lys Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Ala Thr Asp Pro Lys Gly Lys Ala Ala Pro Ala Gly Phe
340 345 350
Phe Thr Leu Gly Ala Thr Thr Val Thr Val Pro Ala Gly Gly Ser Ala
355 360 365
Ser Val Asp Met Thr Ala Asp Thr Arg Leu Gly Gly Thr Val Asp Gly
370 375 380
Ala Tyr Ser Ala Tyr Val Val Ala Thr Gly Gly Gly Gin Thr Val Arg 385 390 395 400
Thr Ala Ala Ala Val Gin Arg Glu Val Glu Ser Tyr Asp Val Thr Val
405 410 415
Arg His lie Gly Arg Asp Gly Lys Pro Thr Thr Glu His Leu Thr Asp
420 425 430 Leu lie Gly Tyr Ala Gly Leu Gly Ser Gly Arg Gly Tyr Gly Ala Pro
435 440 445
Ala Thr Asp Thr Ala Thr Leu Arg Leu Pro Lys Gly Thr Tyr Leu Val 450 455 460
Asp Ser Trp lie Ala Lys Asp Phe Gly Thr Leu Lys Gly Gly lie Asp 465 470 475 480
Trp Leu Val Gin Pro Lys Leu Ser Val Thr Lys Asp Thr Thr Leu Thr
485 490 495
Leu Asp Ala Arg Thr Thr Lys Ala Ala Asp lie Thr Val Pro Asp Pro
500 505 510
Lys Ala Lys Pro Leu Ser Ala Thr
515 520

Claims

- 請 求 の 範 囲
1. 配列番号 （S EQ I D NO) ： 7に記載されたアミノ酸配列 中の少なくとも Asp (29) ないし Ser (238) の配列を含んでなり、 かつ 4-置換- 1, 4-ジヒ ドロピリ ジン誘導体 （1, 4-DHPD) の不
5 斉加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードする単離された遺伝子 または該遺伝子とハイプリッ ド形成しうる DNA断片。
2. タンパク質が配列番号： 7に記載されたアミノ酸配列で表される 請求の範囲第 1項記載の遺伝子または該遺伝子とハイプリッ ド形成しう る DNA断片。
0 3. 配列番号： 3に記載された DN A配列の中の少なくとも Leu (2 05) のコ ドン （CTC) ないし Th r (724) のコ ドン （ACC) の DN A配列を含んでなる請求の範囲第 1項記載の遺伝子または該遺伝 子とハイプリッ ド形成しうる DN A断片。
4. 配列番号： 3に記載された DN A配列で表される請求の範囲第 1 5 項記載の遺伝子。
5. 配列番号： 1に記載された DN A配列で表される請求の範囲第 1 項記載の遺伝子。
6. 請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれかに記載された遺伝子を ベクターに組み込んで構築された組換えブラスミ ド。
0 7. 請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれかに記載された遺伝子を 担持する組換えプラスミ ドにより宿主微生物が形成転換された形質転換 体。
8. 宿主微生物がス ト レプト ミセス リ ビダンス（Streptomyces li vidans)s ス 卜 レプ卜 ミセス ピ'リ ドスポノレス （Streptomyces virido sporus) およびス卜レプ卜ミセス クラブス ( S treptomyces clavus) からなる群より選ばれる菌株である請求の範囲第 7項記載の形質転換体。
9. 請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれかに記載された遺伝子を 担持するプラスミ ドにより宿主微生物が形質転換された形質転換体を栄 養培地で培養し、 培養物から 1， 4-DHPDの不斉加水分解酵素活性 を有するタンパク質も回収することを特徴とする該タンパク質の製造方 o
10. 請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれかに記載された遺伝子 を担持するプラスミ ドにより宿主微生物が形質転換された形質転換体を、 栄養培地で培養し、 培養物から得ることのできる 1, 4- DHPDの不 斉加水分解酵素活性を有するタンパク質。
1 1. 配列番号： 7に記載されたアミノ酸配列中の少なく とも Asp (2 9) ないし Ser (238) の配列を含んでなり、 かつ 1 , 4-DHPDの 不斉加水分解酵素活性を有するタンパク質。
12. 配列番号： 7に記載されたァミノ酸配列自体、 配列番号： 7の Leu ( 1 ) ないし Ser (518) のアミノ酸配列、 配列番号： 7の Leu
(1) ないし Pro (512) のアミノ酸配列、 および配列番号： 7の C- 末端にさらに lie Gly Tyr Thr Tyr Asp Thr Ala Gly lieが付 加したァミノ酸配列からなる群より選ばれる配列を有する請求の範囲第 1 1項記載のタンパク質。
13. 請求の範囲第 10〜12項のいずれかに記載のタンパク質と、 次式 RNH(CH2)nOOQ 1 ,C00(CH2)nNHR
(I)
(但し、 式中 Rは、 低級アルカノィル基、 複素環カルボニル基、 ハロ置 換ァセチル基、 アルコキシァセチル基、 ァリールォキシァセチル基、 置 換もしくは非置換フエニル低級アルカノィル基、 フエニル置換もしくは 非置換低級アルケノィル基、 アルコキシもしくはアルケニルォキシカル ボニル基、 ァラルキルォキシカルボニル基または有機スルホ二ル基を表 わし、 nは、 2〜4の整数を表わす。 ） で示される化合物またはその塩 とを水性媒体中で接触させ、 次式
Figure imgf000068_0001
(ID
(但し、 式中 R及び nは、 前記と同意義である） で示される光学活性 4 -置換- 1, 4-ジヒ ドロピリジン化合物またはその塩を回収することを 特徴とする光学活性 （4 R) -1, 4-ジヒ ドロ- 2， 6-ジメチル- 4 - (- トロフエニル） ピリジン- 3， 5-ジカルボン酸モノエステル誘導体の製 ' 造方法。
14. タンパク質が配列番号： 7に記載されたアミノ酸配列で表され る請求の範囲第 13項記載の製造方法。
15. タンパク質が請求の範囲第 10項記載のタンパク質である請求 5 の範囲第 13項記載の製造方法。
0
5
0
PCT/JP1996/002147 1995-07-31 1996-07-30 Gene encoding protein having asymmetric hydrolase activity on 4-substituted-1,4-dihydropyridine derivatives and expression product of the same Ceased WO1997005243A1 (en)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP50747097A JP3529099B2 (ja) 1995-07-31 1996-07-30 ４−置換−１，４−ジヒドロピリジン誘導体の不斉加水分解酵素活性タンパク質をコードする遺伝子およびその発現産物
US09/000,016 US6143541A (en) 1995-07-31 1996-07-30 Gene encoding a protein having symmetric hydrolase activity for 4-substituted 1,4-dihydropyridine derivatives and its expression product
EP96925136A EP0846759B1 (en) 1995-07-31 1996-07-30 Gene encoding protein having asymmetric hydrolase activity on 4-substituted-1,4-dihydropyridine derivatives and expression product of the same
AT96925136T ATE251214T1 (de) 1995-07-31 1996-07-30 Gen, das für ein protein mit asymmetrischer hydrolaseaktivität für 4-substituierte-1,4- dihydropyridin-derivate und sein expressionsprodukt
DE69630229T DE69630229D1 (de) 1995-07-31 1996-07-30 Gen, das für ein protein mit asymmetrischer hydrolaseaktivität für 4-substituierte-1,4-dihydropyridin-derivate und sein expressionsprodukt

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP21297595 1995-07-31
JP7/212975 1995-07-31
JP6747896 1996-02-29
JP8/67478 1996-02-29

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US09/514,340 Continuation-In-Part US6361987B1 (en) 1995-07-31 2000-02-28 Gene encoding a protein having asymmetric hydrolase activity for 4-substituted 1,4-dihydropyridine derivatives and its expression product

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1997005243A1 true WO1997005243A1 (en) 1997-02-13

Family

ID=26408697

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1996/002147 Ceased WO1997005243A1 (en) 1995-07-31 1996-07-30 Gene encoding protein having asymmetric hydrolase activity on 4-substituted-1,4-dihydropyridine derivatives and expression product of the same

Country Status (6)

Country Link
US (2) US6143541A (ja)
EP (1) EP0846759B1 (ja)
JP (1) JP3529099B2 (ja)
AT (1) ATE251214T1 (ja)
DE (1) DE69630229D1 (ja)
WO (1) WO1997005243A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100878035B1 (ko) 2007-05-16 2009-01-13 주식회사 대희화학 생체 촉매 효소를 이용한 선택적 가수분해방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994005637A1 (fr) * 1992-08-31 1994-03-17 Mercian Corporation Compose a base de 1,4-dihydropyridine presentant une activite optique et procede de production

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEM. PHARM. BULL., Vol. 39, No. 1 (1991), p. 108-111. *
J. MED. CHEM., Vol. 29, No. 12 (1986), p. 2504-2511. *
NUCLEIC ACIDS RES., Vol. 13, No. 24 (1985), p. 8913-8926. *

Also Published As

Publication number Publication date
EP0846759A1 (en) 1998-06-10
US6143541A (en) 2000-11-07
JP3529099B2 (ja) 2004-05-24
EP0846759B1 (en) 2003-10-01
EP0846759A4 (en) 2002-08-07
US6361987B1 (en) 2002-03-26
ATE251214T1 (de) 2003-10-15
DE69630229D1 (de) 2003-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0454478B1 (en) Cephalosporin acetylhydrolase gene and protein encoded by said gene
Mayaux et al. Purification, cloning, and primary structure of a new enantiomer-selective amidase from a Rhodococcus strain: structural evidence for a conserved genetic coupling with nitrile hydratase
JP4561010B2 (ja) Ｄ−ヒダントインハイドロラーゼをコードするｄｎａ、ｎ−カルバミル−ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするｄｎａ、該遺伝子を含む組み換えｄｎａ、該組み換えｄｎａにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、ｄ−アミノ酸の製造方法
KR101558622B1 (ko) ｍＲＮＡ의 안정화를 통한 표적 생성물의 증가된 제조
KR20180077008A (ko) 신규한 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법
HU228092B1 (en) Method for producing chiral carboxylic acids from nitriles with the assistance of a nitrilase or microorganisms which contain a gene for the nitrilase
JPH10229885A (ja) 新規アルコールアルデヒド脱水素酵素
JPH07508169A (ja) Ｄ−ｎ−カルバモイル−アミノ酸アミドヒドロラーゼおよびヒダントイナーゼ
KR100244066B1 (ko) D-N-카르바모일-α-아미노산의 제조법
US5281531A (en) Host and vector for producing D-ribose
AU636500B2 (en) Cloning and overexpression of glucose-6-phosphate dehydrogenase from leuconostoc dextranicus
WO1997005243A1 (en) Gene encoding protein having asymmetric hydrolase activity on 4-substituted-1,4-dihydropyridine derivatives and expression product of the same
JP4437170B2 (ja) 微生物、該微生物より得られるラクタマーゼ酵素、およびその使用
KR100679759B1 (ko) 관능기에 의해 수식된 이차 대사산물을 생산하는형질전환체 및 신규 생합성 유전자
CA2377793A1 (en) Gene encoding cyclic lipopeptide acylase and expression of the same
EP0513806B1 (en) Esterase genes, esterase, recombinant plasmids and transformants containing the recombinant plasmid and methods of producing optically active carboxylic acids and their enantiomeric esters using said transformants
JP2003533166A (ja) オイゲノールおよびフェルラ酸の異化作用の特異的不活性化遺伝子による置換フェノール生産のための生産株の構築
JP4880859B2 (ja) 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法
CN101962647B (zh) 诺卡噻唑菌素的生物合成基因簇及其应用
JPWO1997005243A1 (ja) ４−置換−１，４−ジヒドロピリジン誘導体の不斉加水分解酵素活性タンパク質をコードする遺伝子およびその発現産物
US7432102B2 (en) Transformants producing substance pf1022 derivatives, methods for producing the same, and novel biosynthesis genes
HU215231B (hu) Géntechnológiai eljárás S-(+)-2,2-dimetil-ciklopropán-karboxamid előállítására mikroorganizmusok segítségével
US5674718A (en) DNA segments and transformed microorganisms comprising the delta1 -dehydrogenase gene pseudomonas testosteroni, and uses thereof
JPWO2000008170A1 (ja) ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子およびその使用
US7335502B2 (en) Chlorohydrin and hydroxycarboxylic ester asymmetric hydrolase gene

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CN JP KR US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09000016

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1996925136

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1996925136

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1996925136

Country of ref document: EP