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WO1997046676A1 - Tumor antigen proteins, genes thereof, and tumor antigen peptides - Google Patents

Tumor antigen proteins, genes thereof, and tumor antigen peptides Download PDF

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WO1997046676A1
WO1997046676A1 PCT/JP1997/001893 JP9701893W WO9746676A1 WO 1997046676 A1 WO1997046676 A1 WO 1997046676A1 JP 9701893 W JP9701893 W JP 9701893W WO 9746676 A1 WO9746676 A1 WO 9746676A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tumor antigen
dna
peptide
cells
protein
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP1997/001893
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kyogo Itoh
Shigeki Shichijo
Yasuhisa Imai
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Individual
Original Assignee
Individual
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Publication date
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Priority to EP97925280A priority patent/EP0911397A4/en
Priority to US09/202,047 priority patent/US6815531B1/en
Priority to CA002257531A priority patent/CA2257531A1/en
Priority to AU30479/97A priority patent/AU714548C/en
Publication of WO1997046676A1 publication Critical patent/WO1997046676A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a medicament for activating antitumor immunity, a medicament for treating an autoimmune disease, and a diagnosis of a tumor or an autoimmune disease. More specifically, the present invention relates to a novel tumor antigen protein, a novel gene thereof, a novel tumor antigen peptide, and the like.
  • TCR T cell receptor
  • This tumor antigen peptide after the tumor antigen protein is synthesized in the cell, It is produced by proteosome breakdown into peptides in the cytoplasm.
  • the MHC class I antigen formed in the endoplasmic reticulum binds to the tumor antigen peptide described above, moves to the transgolgi on the mature side via the cis Golgi, and is expressed on the cell surface (clinical immunity, (9): 1034-1042, 1995).
  • Tumor antigen proteins identified so far can be divided into the following four categories as described in the review by T. Boon et al. (J. Exp. Med., 183, 725-729, 1996). Can be.
  • Tumor antigen proteins in the first category are expressed only in testis in normal tissues, and in a group of tumor tissues, are expressed in melanoma, head and neck cancer, non-small cell lung cancer, bladder cancer, etc. It is a protein.
  • the tumor antigen proteins of this category include the above-mentioned MAGE, a group of proteins forming a similar family of 12 or more thereof (J. Exp. Med., 178: 489-495, 1993), BAGE (Immunity, 2: 167-175, 1995) and GAGE (J. Exp. Med., 182: 689-698, 1995), all of which have been identified from melanoma cells.
  • Tumor antigen proteins in this category are highly expressed in melanoma, but are expressed only in about 10% to 30% of patients with other types of tumors. However, it cannot be widely applied to the treatment and diagnosis of various tumors.
  • Tumor antigen proteins in the second category are expressed only in melanocytes and retina in normal tissues, and are expressed only in melanomas in tumor tissues. This is a group of proteins that are present. Since these tissue-specific proteins are strongly expressed in tumor cell melanoma, they function as melanoma-specific tumor antigen proteins. Tyrosinase (J. Exp. Med., 178: 489-495, 1993), MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3515, 1994) include tumor antigen proteins in this category. Gp100 (J. Exp. Med., 179: 1005-1009, 1994) and gp75 (J. Exp. Med., 181: 799-804, 1995). Cloned from ma cells. Separately, Me 1 an—A J. Exp. Med., 180: 35, 1994) was identified, but it was the same molecule as MART-1.
  • tumor antigen proteins in this category are not expressed in tumors other than melanoma, they cannot be widely applied to tumor treatment and diagnosis.
  • the third category of tumor antigen proteins is a group of proteins whose tumor-specific mutations give rise to new tumor antigen peptides recognized by CTL.
  • Mutant CDK4 Science, 269 1281-1284, 1995), -eaten in (J. Exp. Med., 183: 1185-1192, 1996), MUM-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7976-7980. 1995).
  • MUM-1 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7976-7980. 1995.
  • MUM-1 a single amino acid mutation increases the MHC class I antigen-binding affinity of the peptide and allows it to be recognized by T cells.
  • MUM-1 a T cell recognizes a peptide that results from the translation of an otherwise untranslated intron site by mutation. However, the frequency of these mutations is low, so they cannot be widely applied to the treatment and diagnosis of tumors.
  • the fourth category, the tumor antigen protein is widely expressed in normal tissues, but it is a protein recognized by CTL, P15 (J. unol, 154: 5944-5955, 1995) have been identified from melanomas.
  • a method of identifying a tumor antigen protein or a tumor antigen peptide known so far is as follows.
  • a set of tumor cells and a set of CTLs that attack these cells (usually established from the same patient's lymphocytes as the tumor cells) is prepared.
  • the tumor antigen peptide is directly identified using the cells of this set, or the gene encoding the tumor antigen protein is determined, and the corresponding tumor antigen peptide is identified. That is, as a method for directly identifying a tumor antigen peptide, a tumor antigen peptide bound to MHC class I antigen of tumor cells is extracted under acidic conditions, and various peptides separated by high performance liquid chromatography are extracted.
  • the tumor antigen peptide was identified by pulsing cells expressing the MHC class I antigen but not expressing the tumor antigen protein (for example, B cells of the same patient) and examining the CTL response. This is a method of determining the sequence using mass spectrometry or the like. By this method, a Pmell7-derived tumor antigen peptide identical to gp100 was identified from melanoma cells (Science, 264: 716-719, 1994).
  • a method for determining a gene encoding a tumor antigen protein and further identifying a corresponding tumor antigen peptide a method of cloning a gene encoding the tumor antigen protein using a molecular biological technique is known. is there. CDNA is prepared from tumor cells, and the cDNA is transfected with cells that do not express the tumor antigen protein (for example, COS cells) together with the MHC class I antigen gene and transiently expressed. Screening is repeated by the reactivity of CTLs against, and the gene encoding the tumor antigen protein is isolated. By this method, the above MAGE, Firoshi The genes for Nase, MART-1, gp100 and gp75 have been cloned.
  • the following method is used to estimate and identify the tumor antigen peptide that is actually bound to the MHC class I antigen from the information of the tumor antigen gene.
  • fragments of genes encoding tumor antigen proteins of various sizes are prepared by PCR, exonuclease, restriction enzymes, etc., and cells that do not express tumor antigen proteins together with the MHC class I antigen gene (for example, COS cells)
  • the region containing the tumor antigen peptide is limited by the reactivity of the CTL.
  • the peptide is synthesized, the MHC class I antigen is expressed and the cells that do not express the tumor antigen protein are pulsed, and the tumor antigen peptide is identified by examining the CTL response (J. Exp.
  • MHC types such as HLA-A1, -A0201, -A0205, -All, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, -C0401, -Cw0602.
  • sequence regularity (motif) of the peptide presented is known (I-related unogenetics, 41: 178-228, 1995), and based on this information, a candidate for a tumor antigen peptide is examined.
  • a method of synthesizing a peptide and confirming it by the same method as described above is also used (Eur. J. Immunol., 24: 759, 1994, J. Exp. Med., 180: 347. 1994).
  • tumor antigen proteins that are highly expressed in tumors are also expressed in normal tissues and are thought to cause autoimmune diseases due to excessive immune responses derived from the tumor antigen proteins.
  • a chemotherapeutic agent for example, IL-12, the appearance of vitiligo symptoms was reported (J. Clin. Oncol., 10: 1338-1343, 1992). is there.
  • any of the known tumor antigen proteins are expressed only in a limited number of tumors, or are expressed in many types of tumors but only in a small percentage of patients with that tumor Therefore, it cannot be widely applied to the treatment and diagnosis of various tumors.
  • the problem to be solved by the present invention is to treat squamous cell carcinoma and the like, unlike tumor treatment and diagnosis that can be performed using a known tumor antigen protein or a fragment thereof (hereinafter referred to as peptide fragment or tumor antigen peptide). It can be applied to a wide range of tumors, including those that can be applied to a large number of patients with a limited number of applicable tumors, or can be applied to various tumors while complementing the treatment and diagnosis of the tumor An object of the present invention is to provide a tumor antigen protein or a corresponding tumor antigen peptide which can be obtained.
  • Squamous cell carcinoma is one of the most common human cancers.
  • squamous cell carcinoma in esophageal and lung cancers is known to be relatively resistant to current chemotherapy and radiation therapy. From this point of view, the development of specific immunotherapy using the tumor antigen protein or the corresponding tumor antigen peptide is expected.
  • the present inventors have developed various types of tumors, in particular, tumor antigen proteins or their corresponding tumor antigen peptides that can be widely applied to the treatment and diagnosis of squamous cell carcinoma and the like. An attempt was made to identify the tumor antigen protein.
  • KE-4 esophageal cancer-derived squamous cell carcinoma cell line
  • KE-4 esophageal cancer cell line
  • CTL (1 ⁇ -4 (hereinafter referred to as 11)) that recognizes a tumor antigen peptide restricted to HLA-A2601, which is an expressed MHC class I antigen. , 55:42 48-4253, 1995).
  • the recombinant plasmid of the cDNA library prepared from KE-4 and the recombinant plasmid of the HLA-A2601 CDNA were simultaneously transfected into the fibroblast cell line VA-13 cells, and the transfectants were transfected.
  • KE-4CTL was allowed to act, and whether KE-4CTL was activated was measured based on the amount of IFN-7 produced and screened.
  • DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, or its DNA and strand DNA mutants that hybridize under indigenous conditions (however, the DNA produced by expression of the DNA and the DNA mutant is a peptide fragment capable of binding to MHC class I antigen by intracellular decomposition). Which can produce peptide fragments that can be recognized by T cells in their bound state).
  • a medicament comprising the tumor antigen protein according to (6), the tumor antigen peptide according to (7) or (8), or a derivative thereof having functionally equivalent properties as an active ingredient;
  • the present invention relates to DNA comprising at least one group, RNA corresponding to the DNA, or a chemically modified product thereof.
  • the DNA of the present invention encodes a novel tumor antigen protein, comprising a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or one or more amino acid residues in the amino acid sequence, DNA encoding the deleted or added mutant protein (provided that the protein and the mutant protein are peptide fragments capable of binding to MHC class I antigen by intracellular degradation thereof, and Or a DNA fragment that can be recognized by T cells at the same time), or a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, or a DNA variant that hybridizes with the DNA under stringent conditions.
  • the protein produced by expression of the DNA and the DNA mutant is a peptide fragment that can bind to MHC class I antigen by its intracellular degradation. Which can generate a peptide fragment that can be recognized by a T cell in the binding state of).
  • mutant protein in which one or more amino acid residues are substituted, deleted or added in the amino acid sequence generally refers to artificially produced so-called modified proteins or DNAs encoding proteins. This means a protein having functionally equivalent properties obtained by a polymorphism, mutation, modification reaction, or the like observed.
  • DNA encoding this mutant protein is, for example, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1st to 13th Vol. Sam Brook, J. et al., Cold Spring Harber Labolatory Press, published in New York, 1989, for example, by site-directed mutagenesis or PCR.
  • the number of amino acid residues to be substituted, deleted or added may be determined by well-known methods such as site-directed mutagenesis. Or a number that can be added.
  • the “DNA mutant that hybridizes with DNA under stringent conditions” can be obtained, for example, by the method described in the above-mentioned Molecular Cloning.
  • stringent conditions means, for example, a solution containing 6 ⁇ SSC (20 ⁇ SSC indicates 333 mM sodium citrate, 333 mM NaCl), 0.5% SDS and 50% formamide. After hybridization at 0 ° C, conditions for washing at 68 ° C in a solution of 0.1 lxSSC and 0.5% SDS, or Nakayama et al., Bio-experimental illustrations p.148-151, Shujunsha, 1995, etc.
  • a protein produced by expressing such a hybridizing DNA is recognized by T cells when a part of the peptide fragment constituting the protein binds to the MHC class I antigen. It contains a peptide moiety.
  • proteins and muteins that can generate peptide fragments that can bind to MHC class I antigen by intracellular degradation and can be recognized by T cells in their bound state These proteins may be referred to as tumor antigen proteins.
  • T cells capable of specifically binding to the complex of the peptide fragment and MHC class I antigen can transmit signals to T cells
  • a protein or mutant protein containing such a peptide moiety Means a non-covalent bond.
  • the peptide fragment binds to MHC class I antigen and is recognized by T cells
  • the peptide fragment can be expressed on the cell surface by expressing the peptide fragment endogenously in a suitable cell or binding to MHC class I antigen by adding (pulsing) from the outside. Then, there is a method in which tumor antigen protein-specific T cells are allowed to act on the peptide-presenting cells and the cytokines produced by the T cells are measured. Also, as a method for measuring the T cell-damaging activity on peptide-presenting cells, a method using 51 Cr-labeled peptide-presenting cells (Int. J. Cancer, 58: 317 (1994)) can be used. Here, it is preferable to use CTL as the T cell to be recognized.
  • the DNA of the present invention can be used as an active ingredient of a medicine. That is, a “medicine” containing the DNA of the present invention as an active ingredient can treat or prevent a tumor by, for example, administering the DNA of the present invention to a tumor patient or the like.
  • a “medicine” containing the DNA of the present invention as an active ingredient can treat or prevent a tumor by, for example, administering the DNA of the present invention to a tumor patient or the like.
  • the tumor antigen protein is highly expressed in the cells, and the tumor antigen peptide binds to the MHC class I antigen and is displayed on the cell surface with high density. In this way, tumors can be efficiently proliferated, thereby achieving treatment or prevention of tumors.
  • Methods for administering the DNA of the present invention and introducing it into cells include methods using viral vectors and other methods (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Monthly Pharmaceutical, 23-48 (1994). ), Special Edition of Experimental Medicine, 1 ⁇ (15), (1994).
  • the DNA of the present invention is incorporated into a DNA virus or RNA virus such as a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a box virus, a polio virus, or a simbis virus.
  • a DNA virus or RNA virus such as a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a box virus, a polio virus, or a simbis virus.
  • retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus And a method using vaccinia virus or the like.
  • DNA vaccine method direct injection of the expression plasmid into muscle
  • ribosome method ribofectin method
  • microinjection method calcium phosphate method
  • electoral poration method ribosome method
  • the in vivo method When administered by the in vivo method, it can be administered by an appropriate route depending on the disease, symptom and the like for the purpose of treatment. For example, it can be administered intravenously, arterially, subcutaneously, intradermally, intramuscularly, and the like. When administered by the in vivo method, for example, it may be in the form of a liquid preparation or the like.However, it is generally used as an injection containing the DNA of the present invention as an active ingredient. A carrier may be added.
  • ribosome or membrane fusion liposome such as Sendai virus (HVJ) —ribosome
  • a liposome preparation such as a suspending agent, a freezing agent, or a centrifugal concentrated freeze agent.
  • the content of the DNA of the present invention 5 in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age and weight of the patient, etc., but it is usually O.OOOOmg to: 100mg, preferably 0.001mg to 10rag.
  • the DNA of the present invention is administered once every few days to several months.
  • tumor antigen proteins It is possible to produce large quantities of protein.
  • the expression of the DNA of the present invention to produce a tumor antigen protein can be carried out, for example, based on many books and documents such as the aforementioned Molecular Cloning.
  • a control gene such as a promoter sequence that controls transcription (eg, trp, 1ac, T7, SV40 early promoter) is added, and an appropriate vector (eg, pSV-SP0RT1) is added. Integrates into the plasmid to create an expression plasmid that replicates and functions in the host cell.
  • the expression plasmid is introduced into a suitable host cell to obtain a transformant.
  • Examples of the host cell include prokaryotes such as Escherichia coli, unicellular eukaryotes such as yeast, and cells of multicellular eukaryotes such as insects and animals.
  • Methods for introducing genes into host cells include the calcium phosphate method, the DEAE-dextran method, and the electric pulse method.
  • the transformant produces the target protein by culturing in a suitable medium.
  • the tumor antigen protein obtained as described above can be isolated and purified by a general biochemical method.
  • ⁇ a peptide fragment capable of binding to an MHC class I antigen and capable of being recognized by T cells in a bound state '', which can be generated by intracellular degradation of the tumor antigen protein of the present invention, That is, the “tumor antigen peptide” can be determined, for example, as follows.
  • DNA fragments encoding tumor antigen proteins of various sizes are prepared by PCR, exonuclease, restriction enzymes, etc., and inserted into an expression vector as described above to encode an MHC class I antigen that presents a tumor antigen.
  • MHC types such as HLA-Al, -A0201, -A0205, -All, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, -Cw0401, -Cw0602.
  • sequence regularity (motif) of the antigen peptide presented by binding is known.
  • candidate tumor antigen peptides are examined from DNA encoding tumor antigen proteins, and the peptides are synthesized. And a method similar to that described above (Eur. J. Immunol., 24: 759, 1994; J. Exp. Med., 180: 347, 1994).
  • MHC has class II antigens in addition to class I antigens, and specific tumor antigen peptides that can be generated by the incorporation and degradation of tumor antigen proteins into antigen presenting cells such as macrophages.
  • the conjugate with the MHC class II antigen is known to activate tumor-specific helper T cells (J. Immunol., 146: 1708-1714, 1991).
  • the tumor antigen peptides that bind to the MHC class II antigen as described above.
  • the determination can be made based on a method for determining an antigen peptide based on reactivity with T cells or a known knowledge of an antigen peptide motif. I can do it.
  • Tumor antigen peptides determined in this way can be produced by methods known in normal peptide chemistry.
  • a peptide can be produced by appropriately protecting and deprotecting a functional group of an amino acid with an appropriate protecting group, and binding one or several amino acids to each amino acid.
  • the protective group for the functional group of the amino acid is described, for example, in the above-mentioned book describing the peptide chemistry.
  • the tumor antigen peptide may be defined as a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a peptide fragment obtained from any of the mutant proteins thereof defined above.
  • the tumor antigen peptide derived from the protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and its derivatives will be described more specifically, but the description is also applicable to the tumor antigen peptide derived from the mutant protein. It will be appreciated that The tumor antigen peptide obtained by intracellular degradation of the protein represented by SEQ ID NO: 1 is not particularly limited.
  • peptides comprising an amino acid sequence at positions 57, 736 to 744, 785 to 793, 690 to 696.
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence at positions 57, 736 to 744, 785 to 793, 690 to 696.
  • the term “derivative of the tumor antigen peptide” refers to a derivative having functionally equivalent properties to the above-mentioned antitumor peptide, and a partial amino acid residue in the peptide Substituted, deleted or added derivatives, and derivatives obtained by modifying the amino or carboxyl groups of the peptides or derivatives of the peptides in which some amino acid residues are substituted, deleted or added.
  • the derivative in which some amino acid residues in the peptide have been substituted, deleted or added is preferably a tumor antigen peptide in which the epitope region involved in binding to CTL remains unchanged.
  • Derivatives in which amino acid residues involved in binding to the C class I antigen are substituted, deleted or added, and more preferably derivatives thereof in which only one amino acid residue is substituted (Immunol. 84: 298-303, 1995).
  • substitution of the amino acid at the binding site with the MHC class I antigen results in stronger binding to the MHC class I antigen.
  • peptide derivatives having CTL inducing activity can be easily selected. Since the peptide derivative selected in this way can strongly bind to the MHC class I antigen while maintaining the binding property to CTL, it can be applied as a more useful tumor antigen peptide.
  • Examples of the modifying group for the amino group include an acryl group.
  • Specific examples include an alkanoyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkanoyl group having 1 to 6 carbon atoms substituted with a phenyl group, and a cycloalkyl group having 5 to 7 carbon atoms.
  • Examples thereof include a carbonyl group substituted with an alkyl group, an alkylsulfonyl group having 1 to 6 carbon atoms, and a phenylsulfonyl group.
  • Examples of the carboxyl group-modifying group include an ester group and an amide group.
  • Specific examples of the ester group include an alkylester group having 1 to 6 carbon atoms and a carbon atom having 0 to 6 carbon atoms substituted by a phenyl group.
  • Examples of the amide group include an alkyl ester group and a cycloalkyl ester group having 5 to 7 carbon atoms.
  • Examples of the amide group include an amide group and an amino group substituted with one or two alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms.
  • the “antibody” can be easily prepared, for example, by the method described in Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D. et al., Edited by Cold Spring Harber Laboratory Press New York 1989. . That is, an animal is appropriately immunized using a tumor antigen protein or a tumor antigen peptide in a conventional manner.
  • an antibody that recognizes a tumor antigen protein or a tumor antigen peptide, and an antibody that neutralizes its activity can be easily produced.
  • Uses of the antibody include affinity chromatography, screening of cDNA libraries, immunological diagnostic methods, pharmaceuticals and the like.
  • the immunological diagnosis can be appropriately selected from the immunoblot method, the radioimmunoassay (RIA), the enzyme immunoassay (ELISA), the fluorescence or luminescence assay, and the like.
  • RNA corresponding to refers to an RNA corresponding to the DNA of the antisense strand of the double-stranded DNA or the DNA of the antisense strand and having 8 bases or more (hereinafter, referred to as antisense polynucleotide).
  • This antisense oligonucleotide is produced, for example, as DNA based on the nucleotide sequence of a gene encoding the tumor antigen protein of the present invention, or by incorporating this DNA into an expression plasmid in the antisense direction. It can be manufactured as RNA.
  • This antisense oligonucleotide is a sequence complementary to the DNA fragment of any part of the DNA coding sequence consisting of the nucleotide sequence of the gene of the present invention consisting of SEQ ID NO: 2, and the 5 'non-coding sequence.
  • the sequence is complementary to the transcription initiation site, translation initiation site, 5 ′ untranslated region, boundary region between exon and intron, or 5 ′ CAP region.
  • the “chemically modified form” of the above “DNA or RNA corresponding to the DNA” includes the transfer of DNA or RNA into cells or the intracellular transfer of DNA or RNA.
  • High stability Chemical derivatives such as phosphorothioate, phosphorodithioate, alkylphosphotriester, alkylphosphonate, alkylphosphamidate and the like ("Antisense RNA and DNA” WI LEY-LISS published 1992 P. 1_50). This chemically modified product can be produced according to the literature and the like.
  • the expression of a gene encoding a tumor antigen protein can be controlled using the antisense oligonucleotide of the present invention or a chemically modified product thereof. If overexpression of a tumor antigen protein causes autoimmune disease, this method reduces tumor antigen protein production, thereby reducing CTL damage and suppressing CTL growth. An immune disease can be treated or prevented.
  • a preferable length of the antisense oligonucleotide is, for example, 8 to 200 bases, more preferably 10 to 100 bases. 25 bases are particularly preferable, and those having 12 to 25 bases are particularly preferable.
  • the preferred length of the antisense oligonucleotide is, for example, 100 bases or more, and preferably 300 to 100 bases. And more preferably 500 to 1000 bases.
  • Methods for introducing antisense oligonucleotides into expression plasmids and then introducing them into cells include, for example, the method described in Experimental Medicine, Vol. 12, 1994, using liposomal recombinant virus, etc. There are methods.
  • the expression plasmid of the antisense oligonucleotide is used in the present invention so that the gene of the present invention is transcribed in the reverse direction behind the promoter using a normal expression vector, that is, the gene of the present invention is transcribed in the 3 ′ to 5 ′ direction. Connecting genes It can be easily made with just
  • the antisense oligonucleotide or chemically modified antisense oligonucleotide is administered as it is, it is mixed with a stabilizer, buffer, solvent, etc., then formulated, and simultaneously with antibiotics, anti-inflammatory drugs, anesthetics, etc. It may be administered.
  • the formulation thus prepared can be administered in various ways. Preferably, the administration is made daily or every few days to every few weeks. In order to avoid such frequent administration, it is possible to prepare a sustained-release minipellet preparation and implant it near the affected area. Alternatively, it is also possible to gradually and continuously administer to the affected part using an osmotic pump or the like. The usual dose is adjusted so that the concentration at the site of action is 0.1 InM-10M.
  • the tumor antigen protein and tumor antigen peptide of the present invention and their derivatives having functionally equivalent properties can be used alone or in combination of two or more.Pharmaceuticals containing them as an active ingredient include: It can be administered with an adjuvant so that cellular immunity can be effectively established, or can be administered in a particulate dosage form. That is, when a tumor antigen protein or a tumor antigen peptide is administered to a living body, the tumor antigen peptide is presented at a high density to the MHC class I antigen of the antigen-presenting cells, and tumor-specific CTLs grow efficiently.
  • the adjuvant those described in the literature (Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994) can be applied.
  • exogenous antigen peptides such as ribosome preparations, particulate preparations bonded to beads having a diameter of several m / m, and lipid-bound preparations can be efficiently converted to MHC class I antigens.
  • a dosing regimen that can be presented is used.
  • a method of administering antigen-presenting cells such as ⁇ cellular cells ⁇ and macrophages pulsed with a tumor antigen peptide and cells into which DNA encoding a tumor antigen protein has been introduced can also be considered.
  • the dosage of the tumor antigen protein and the tumor antigen peptide of the present invention in the formulation may vary depending on the disease to be treated, It can be adjusted as appropriate according to the patient's age, weight, etc., but is usually 0.0001 nig to 100 mg, preferably 0.001 mg to 1000 mg, and is preferably administered once every several days to several months.
  • a method for inducing CTL from peripheral blood lymphocytes in vitro using the tumor antigen peptide of the present invention is exemplified as follows.
  • Peripheral blood lymphocytes derived from the esophageal cancer patient having the squamous cell carcinoma are cultured in vitro, and the culture antigen is used as the tumor antigen peptide of the present invention, for example, ⁇ 736-7444 '', ⁇ 740- Add a peptide having the sequence of ⁇ 7 7 7 '', ⁇ 7 8 5-7 9 3 '', or ⁇ 6 9 0-6 9 '' to 10 g / m 1 to stimulate peripheral blood lymphocytes . Repeat the stimulation three times at one week intervals. One week after the third stimulation, peripheral blood lymphocytes are collected, and the cytotoxic activity is measured according to the method described by DD Kharkevitch et al., Int. 3. Cancer, 58: 317 (1994). As a result, the CTL-inducing activity of the tumor antigen peptide of the present invention is found.
  • the method for diagnosing a tumor or an autoimmune disease of the present invention can be performed using an antibody that specifically binds to a tumor antigen protein or a tumor antigen peptide.
  • a method for detecting a tumor antigen protein from a tumor tissue specimen a method for detecting the presence of a tumor antigen protein or an antibody against the tumor antigen protein in blood or tissue, and the like can be mentioned.
  • the detection method can be appropriately selected from an immunohistochemistry method, an immunoblot method, a radioimmunoassay method (RIA), an enzyme immunoassay method (ELISA), a fluorescence or luminescence measurement method, and the like.
  • FIG. 1 is a photograph of electrophoresis showing the results of Northern blot hybridization of Example 2.
  • KE-4, KE-3, TE-8 and TE-9 are esophageal cancer cell lines
  • Kuma- ⁇ is a head and neck cancer cell line
  • HSC-4 is an oral cancer cell line
  • Bee-1 is a B cell line
  • KMG-A is a bile cancer cell line
  • KIM-1, KYN-1 and HAK-3 are liver cancer cell lines
  • M36 and M37 are melanoma cells Each represents a strain.
  • CTL cytotoxic T cell
  • esophageal cancer cell line KE-4 whose histological type is classified as squamous cell carcinoma were established from peripheral blood mononuclear cells of patients.
  • KE-4CTL was used for the experiment.
  • the esophageal cancer cell lines KE-4 and KE-4CTL were obtained from the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology and Industrial Technology, 1-3-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture under the accession numbers of FERMBP-5955 and FERMBP-595. 4 (Deposit date: May 23, 1997).
  • HLA class I molecules of KE-4 were typed and confirmed to be HLA-A2402, -A260K-B54, -B60, -Cwl, and -Cw3.
  • HLA-A2601 was incorporated into the expression vector pCI-3 (manufactured by INVITR0GEN) according to Nakao et al., Cancer Res., ⁇ : 4248-4252 (1995). A recombinant plasmid was prepared. In a similar manner, a recombinant plasmid was prepared for HLA-A2402.
  • RNA fractions Separation of all RNA fractions and preparation of poly (A) + mRNA using an oligo (dT) column were performed from KE-4 using an mRNA purification system (Pharma Biotech) according to the attached protocol.
  • a cDNA was prepared from mRNA using a superscript plasmid system (manufactured by GIBCO BRL) and a Notl adapter and a Sail adapter were ligated at both ends, and then this cDNA was expressed.
  • Recombinant plasmid was obtained by ligation to the cleavage sites of restriction enzymes Notl and Sail of plasmid pSV-SPOBTl (GIBC0 BBL).
  • This recombinant plasmid was used with Gene Pulser (Bio-Ead) under the conditions of 25 // F, 2.5 kV, and electropulsed with E. coli Electromax DH10B / p3 TM cells (GIBCO BRL). And transformants transformed with recombinant plasmid in LB medium (1% pactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.3) containing ampicillin (50 g / ml). Selected.
  • interferon-17 The quantification of interferon-17 (IFN-7) was performed using Enzyme Immunoassay ( ⁇ LISA). After adsorbing an anti-human IFN-y mouse monoclonal antibody as a solid antibody on a 96-well microplate and blocking non-specific binding with serum albumin, the IFN-a in the sample is allowed to bind to the antibody. Was. Next, an anti-human IFN-Paw Egret polyclonal antibody was bound as a detection antibody, and further, an anti-Pseudomonas pulmonatus antibody labeled with Al-force phosphatase.
  • ⁇ LISA Enzyme Immunoassay
  • paraffinyl phosphate was reacted as a chromogenic substrate, the reaction was stopped by adding an equal amount of IN NaOB, and the absorbance (405 ⁇ ) was measured. It was quantified by comparing this with the value obtained with the standard IFN- ⁇ .
  • the recombinant plasmid DNA was recovered from about 100 pools of the transformants shown in Reference Example 3 as follows. That is, 100 transformants per well were added to a 96-well U-bottom microplate containing LB medium containing ampicillin (50 ig / ml), cultured, and a part of the transformant was added to 0.25 ml of TYGPN medium (FM Ausubel, et al., CURRENT PROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc.), transfer to another 96-well U-bottom microplate and incubate at 37 ° C for 48 hours. Stored frozen.
  • TYGPN medium FM Ausubel, et al., CURRENT PROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc.
  • Recombinant plasmid DNA of a transformant cultured in a TYGPN medium was prepared in a microplate by an Alkali lysis method (edited by FM Ausubel et al., CURRENT PROTCOLS IN MOL ECULARIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc.).
  • the recombinant plasmid DNA recovered by isopropanol precipitation was suspended in a 10 mM Tris, lmM EDTA, pH 7.4 solution containing 50 ng / ml of 20 ng / ml RNase.
  • Fibroblast cell line VA-13 cells (RIKEN Cell Development Bank, Ann. Med. Exp. Biol. Fenn., 44: 242-254, 1966) by the ribofectin method as follows KE-4 c
  • the recombinant plasmid of DNA and the recombinant plasmid of HLA-A2601 CDNA were double-transfected. That is, VA-13 cells were added to a 96-well flat-bottomed microplate at 7,000 cells per well, and cultured in RPMI164 medium containing 100 1 of 10% FCS for 2 days. Using lipofectin reagent (manufactured by GIBCO BRL), recombinant plasmid KE-4 cDNA for about 100 transformants was used.
  • the four groups with high IFN-r production were further screened as follows using a pool of approximately 100 transformants of the relevant cryopreserved recombinant KE-4c DNA plasmid.
  • a pool of transformants was spread on a plate of LB agar medium containing ampicillin (50 ig / ml) to obtain colonies, and 200 colonies in each group, a total of 800 colonies, and one transformant per well.
  • the cells were cultured under the same conditions as described above to prepare a recombinant plasmid DNA of KE-4c DNA.
  • VA 13 cells + HLA-A2601 + 6DI 24 0
  • RNA was prepared from various cell lines using BNAzol B (TEL-TEST, INC.). 5 g of RNA was denatured in the presence of formamide and formaldehyde, subjected to agarose electrophoresis, and then transcribed and fixed on a Hybond-N + nylon membrane (Araersham). For normal tissue RNA, a commercially available membrane (manufactured by CL0NTECH) with immobilized mRNA was used.
  • the insert sequence of the recombinant plasmid 6DI cloned in Example 1 was labeled with 32 P to prepare a DNA probe, and a known method (Nakayama et al.) was used. According to the author, Bio-Illustrated Biological Experiments 2 ⁇ Basics of Gene Analysis, p.148-151, Shujunsha, 1995), after hybridizing to RNA on the membrane, using autoradiography. MRNA of the tumor antigen protein gene of the present invention was detected.
  • the membrane used for the detection of the mRNA of the gene is boiled in a 0.5% aqueous solution of sodium dodecyl sulfate to remove the probe, and is constantly expressed in the cells; Using actin as a probe, Northern hybridization was performed in the same manner, and mRNA was detected and used as an internal standard. The results are shown in Figure 1. From these results, it was revealed that the mRNA of the tumor antigen protein gene of the present invention was widely expressed in various cancer cells and normal tissues, and the total length was about 2.5 kb (FIG. 1).
  • the KE-4-derived cDNA library shown in Reference Example 3 was plated on an LB agar plate containing ampicillin (50 ⁇ g / ml) to obtain colonies, and then transferred to Hybond-N + nylon membrane (Amersham). According to the attached protocol, the DNA of the colony was transcribed and fixed. Hybridization and autoradiography were performed using the same 6 DI probe used in Example 2 under the same conditions as in Example 2 to incorporate the cDNA of the tumor antigen protein gene. A colony of a transformant having the recombinant plasmid was selected.
  • recombinant plasmids were recovered from the selected multiple colonies, treated with the restriction enzymes NotI and Sa1I, and the length of the integrated cDNA was confirmed by agarose electrophoresis.
  • a recombinant plasmid into which about 2.5 kb of cDNA was integrated was selected and named K3.
  • K3 DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit
  • the nucleotide sequence of the cDNA portion was determined.
  • the determined nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the total length of the cDNA is 252 It was 7 base pairs.
  • the amino acid sequence (800 amino acids) encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 was not homologous to the gene of a known tumor antigen protein derived from melanoma, and was a different gene.
  • a part of the base sequence of the present invention was decoded by the WashU-Merck EST Project and registered in GENBANK. It was revealed that the gene showed 90% or higher homology with three unknown gene sequences, Accession Nos. R89163 and R62890. R00027. No. R89163 corresponds to the sequence No. 1893-2267, R62 890 corresponds to the sequence No. 2018-2389, and R00027 corresponds to the sequence No. 2024-2510.
  • these sequences are base sequences 3 ′ to the start codon of the base sequence of the present invention, the amino acid sequence cannot be determined.
  • E.coli JM109CK3 a transformant for storage containing the novel tumor antigen protein cDNA of the present invention. did. E.coli JM109CK3) has been deposited at 1-3-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, with the Research Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Deposit date: May 22, 1997; Deposit number: FERM BP — 595
  • a cDNA library (manufactured by GI BCO BRL) of a normal human tissue (peripheral blood lymphocyte) was screened in the same manner as described above. As a result, a recombinant plasmid incorporating approximately 2.5 kb of cDNA was obtained. Was cloned, and the nucleotide sequence of the cDNA was determined. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 was identical except that the 812th position (the 812th position in normal human tissues was "T") was different.
  • One cDNA was isolated. Therefore, the full-length gene, including the gene encoding the tumor antigen protein of the present invention, is almost identical between cancer cells and normal human tissues. It was suggested that the gene was expressed.
  • Target cells KE-4CTL have produced IFN- ⁇ amount 1> (pg / ml)
  • cDNA Recombinant plasmid 6D I into which DNA was incorporated was used according to the attached protocol using Kilo-Sequence Deletion Kit (Takara Shuzo).
  • a plasmid was obtained in which the cDNA of the tumor antigen protein was deleted to various lengths. These plasmids were introduced into E. coli Electromax DH10BZp3 TM cells (GIBCO BRL), and cultured on an agar medium plate. Randomly selected 50 colonies. Plasmid DNA was prepared from the colonies and subjected to electrophoresis to select 5 clones having plasmids of an appropriate length.
  • HLA-A2601 cDNA and the plasmid DNA were double-transfected into VA-13 cells, and then the transfectant and KE-4CTL were mixed and cultured.
  • IFN- ⁇ in the culture solution was quantified.
  • no transgenic IFN- ⁇ from KE-4CTL was observed in the plasmid transfectant in which the nucleotide sequence at position 2253 and beyond was deleted in SEQ ID NO: 2. Therefore, it was expected that a peptide having a sequence following the 739th position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 would have an activity of inducing IFN-7 from KE-4CTL.
  • peptides having 10 amino acid residues were synthesized by shifting the amino acid sequence from position 730 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 by 3 amino acids.
  • IFN- ⁇ in the culture solution was quantified in the same manner as described above, except that these peptides were pulsed to VA-13 cells transfected with HLA-A2601 cDNA to present antigen.
  • the peptide having the amino acid sequence of “736 to 745”, “748 to 775” or “784 to 793” of SEQ ID NO: 1 was found to have IFN-inducing activity.
  • Pulsed thin! ⁇ -Peptide- IFN-a produced by KE4-CTL cells (pg / ml)
  • Table 3 suggests that these peptides function as tumor antigen peptides.
  • the sequence of the antigen peptide presented by binding to the HLA molecule has a regularity (motif).
  • the motif is tyrosine at the 9th and isoleucine, leucine or phenylalanine at the 9th ( ⁇ ⁇ ⁇ munogenetics, 41: 178-228, 1995).
  • Pulsed cells-peptide-IFN-a produced by KE4-CTL cells (pg / ml)
  • Example 3 Using the tumor antigen peptide shown in Example 3, it was examined whether peripheral blood lymphocytes of cancer patients derived from KE-4 could be stimulated in vitro to induce antigen-specific CTL.
  • the tumor antigen peptide used has the sequence of “736 to 7444”, “749 to 757”, and “690 to 698” obtained in Example 3 above.
  • Beptide The lymphocytes are separated from the peripheral blood derived from the cancer patient by the Ficoll method, and the cryopreserved peripheral blood lymphocytes are awakened to give approximately 2 ⁇ 10 6 cells / well in a 24-well plate. And cultured in RPM11640 medium containing 10% FCS and IL-2 (10 OU / ml).
  • the tumor antigen peptide was added to the culture solution to a concentration of 10 g Zm1, and peripheral blood lymphocytes were stimulated. After one week, X-rays irradiation (50G y) was approximately 1 X 1 0 5 single co peripheral blood lymphocytes the tumor ⁇ original base peptide added 1 0 g / m 1, was carried out a second stimulation . One week later, the third stimulation was repeated in the same manner. One week after the third stimulation, peripheral blood lymphocytes were collected from the peptides having the sequences of “736 to 744” and “749 to 757”, and DDKharke vitch et al., Int. J.
  • the cytotoxic activity was measured using KE-4 labeled with 51 Cr and the esophageal cancer cell line KE-3 in which the HLA-A locus is A2402 and A2 as target cells. .
  • Table 5 shows the results.
  • KE-4 When stimulated with a peptide having the sequence of “736 to 744”, KE-4 was severely damaged, but the negative control KE-3 was not damaged, and KE-4 specific CTL was induced. It was shown that. When stimulated with a peptide having the sequence of “749-757”, non-specific cytotoxic activity against KE-3 was observed, but stronger cytotoxic activity against KE-4 was observed. This suggested that KE-4 specific CTL was induced.
  • peripheral blood lymphocytes were collected after the third stimulation, and 10! 3 ⁇ 4 FCS, 503 ⁇ 4 AIM-V (GIBCO BRL), IL-2 (100 U / The culture was continued in RPMI-1640 medium containing (ml). Thereafter, the cytotoxic activity was measured using the same method as described above, using KE-4 and VA-13 cells labeled with 51 Cr as target cells. In addition, lymphocytes were isolated from peripheral blood of healthy humans whose HLA-A locus was homozygous for A24, and KE-4 labeled with 51 Cr in the same manner. In addition, cytotoxic activity was measured using QG-56 cells of a lung cancer cell line in which the HLA-A locus is homologous to A2601 as target cells. Table 6 shows the results.
  • Lys Leu Gly Leu Lys Pro Leu Glu Val Asn Ala lie Lys Lys Glu Ala
  • 260 265 270 lie Leu Thr Leu Lys Asp Lys Gly Val Leu Gin Glu Glu Glu Asp Val
  • Lys Pro Asp Val Lys lie Glu Tyr Val Asp Glu Thr Gly Arg Lys Leu 705 710 715 720
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Human (Homo sapiens) Tissue type: Esophageal cancer tissue
  • CCGAATACCT CACGCCTGAG GAGATGGTGA CCTTTAAAAA GACCAAGCGG AGGGTGAAGA 1260

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Description

明 細 害 腫瘍抗原タンパク質、 その遗伝子および腫瘍抗原ペプチド 発明の属する技術分野
本発明は抗腫瘍免疫を活性化するための医薬、 自己免疫疾患を治療する ための医薬、 および腫瘍または自己免疫疾患の診断に関する。 さらに詳し くは、 本発明は、 新規な腫瘍抗原タンパク質、 その新規な遣伝子、 新規な 腫瘍抗原べプチドなどに関する。
従来の技術
生体による腫瘍の排除には免疫系、 特に T細胞が重要な役割を果たして いることが知られている。 実際、 ヒ トの腫瘍局所には腫瘍細胞に対して傷 害活性を示すリンパ球の浸潤が認められ (Arch. Surg., 126:200-205, 1990) 、 メラノーマからは自己の腫瘍細胞を認識する細胞傷害性 T細胞 （CTL) が比較的容易に分離されている（Immunol. Today, 8:385, 1987、 J. Immunol. , 138:989, 1987、 Int. J. Cancer, 52:52-59, 1992等） 。 また、 T細胞移 入によるメラノ一マ治療の臨床結果も腫瘍排除における Τ細胞の重要性を 示唆している（J.Natl. Cancer. Inst.， 86:1159, 1994)。
自己の腫瘍細胞を攻撃する CTLが標的とする分子については長い間不 明であつたが、 最近の免疫学および分子生物学の進歩により次第に明らか になってきた。 すなわち、 CTLは、 T細胞受容体 （TCR) を用いて、 腫瘍抗原ペプチドが主要組織適合遺伝子複合体 （MHC) クラス I抗原に 結合した複合体を認識して自己の腫瘍細胞を攻撃していることが明らかと なった。
この腫瘍抗原べプチドは、 腫瘍抗原タンパク質が細胞内で合成された後、 プロテオソームによって細胞質内でぺプチドに分解されることによって生 成される。 一方、 小胞体で形成された MHCクラス I抗原は、 上記の腫瘍 抗原べプチドと結合し、 シスゴルジを経て成熟側のトランスゴルジへと移 動し細胞表面に発現する （臨床免疫， (9) :1034-1042, 1995)。
この腫瘍抗原タンパク質としては、 1991年に Τ.Βοοπ らが初めて MAG Eと名付けたタンパク質をヒ トメラノーマ細胞から同定し（Science, 254: 1643-1647, 1991)、 またその後、 いくつかの腫瘍抗原タンパク質がさらに メラノーマ細胞から同定されている。
今までに同定された腫瘍抗原タンパク質は、 T. Boonらの総説（ J. Exp. Med. ， 183, 725〜729， 1996)に記述されているように、 以下の 4つのカテゴリ 一に分けることができる。
1つ目のカテゴリーに含まれる腫瘍抗原タンパク質は、 正常組織では精 巣でのみ発現しており、 腫瘍組織ではメラノーマ、 頭頸部癌、 非小細胞性 肺癌、 膀胱癌などに発現が認められる一群のタンパク質である。 このカテ ゴリーの腫瘍抗原タンパク質としては、 上記の MAGE、 その 12種類以 上の類似するファミリーを形成するタンパク質群（J.Exp. Med. , 178:489-4 95, 1993)、 B A G E (Immunity, 2:167-175, 1995)および G A G E (J. Exp. Med., 182:689-698, 1995)があり、 いずれもメラノーマ細胞から同定され ている。
し力、し、 このカテゴリーの腫瘍抗原タンパク質は、 メラノーマでは高発 現しているものもあるが、 その他の種類の腫瘍ではその腫瘍の患者のうち 10%から 30%程度にしか発現しておらず、 種々の腫瘍の治療や診断に 広く応用することはできない。
2番目のカテゴリーに含まれる腫瘍抗原タンパク質は、 正常組織ではメ ラノサイ ト、 網膜でのみ発現しており、 腫瘍組織ではメラノーマのみで発 現が認められる一群のタンパク質である。 これらの組織特異的なタンパク 質は腫瘍細胞のメラノーマに強度に発現していることから、 メラノーマに 特異的な腫瘍抗原タンパク質として機能している。 このカテゴリ一の腫瘍 抗原タンパク質としては、 チロシナ一ゼ（J.Exp.Med., 178:489-495, 1993) , MART- 1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3515, 1994)、 g p 100 (J. Exp. Med. , 179:1005-1009, 1994)、 g p 75 (J. Exp. Med. , 181:799-80 4, 1995)があり、 これらの遺伝子はいずれもメラノ一マ細胞からクロ一二 ングされている。 また、 別途 Me 1 a n— A J.Exp.Med., 180:35, 1994) が同定されたが、 MART— 1と同一の分子であった。
しカヽし、 このカテゴリーの腫瘍抗原タンパク質は、 メラノーマ以外の腫 瘍では発現していないため、 広く腫瘍の治療や診断に応用することはでき ない。
3番目のカテゴリーに含まれる腫瘍抗原タンパク質は、 腫瘍特異的な突 然変異により新たに C T Lに認識される腫瘍抗原べプチドが生じるように なる一群のタンパク質である。 このカテゴリ一の腫瘍抗原タンパク質とし ては、 突然変異した CD K4 (Science, 269 1281-1284, 1995)、 -eaten in(J. Exp. Med. , 183:1185-1192, 1996)、 MUM- 1 (Proc. Natl. Acad. Sc i. USA, 92:7976-7980. 1995)がある。 CDK4、 3- cateninでは、 1つの アミノ酸変異により、 ぺプチドの MHCクラス I抗原結合親和性が増加し、 T細胞に認識されるようになる。 MUM— 1では、 突然変異により、 通常 は翻訳されないィントロン部位が翻訳されることにより生じるぺブチドが T細胞に認識されている。 しかし、 これらの突然変異の頻度は低いため、 広く腫瘍の治療や診断に応用することはできない。
4番目のカテゴリーに含まれる腫瘍抗原夕ンパク質は、 正常組織にも広 範に発現しているが、 CTLに認識されるタンパク質である P 15(J. Imm unol, 154:5944-5955, 1995)がメラノ一マ細胞から同定されている。 これまでに知られている腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原べプチドの 同定方法は以下の様になされている。
まず、 これらの同定に際して、 腫瘍細胞およびこの細胞を攻撃する C T L (通常、 腫瘍細胞と同一の患者のリンパ球から樹立する）のセッ 卜の用 意を行う。 つづいて、 このセッ 卜の細胞を用いて腫瘍抗原ペプチドを直接 同定するか、 または腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子を決定してさ らにその対応する腫瘍抗原べプチドを同定することによって行われる。 すなわち、 腫瘍抗原ペプチドを直接同定する方法としては、 腫瘍細胞の MH Cクラス I抗原に結合している腫瘍抗原べプチドを酸性条件下で抽出 し、 高速液体クロマトグラフィーで分離された種々のペプチドを、 MH C クラス I抗原を発現しているが腫瘍抗原タンパク質を発現していない細胞 (例えば、 同一患者の B細胞など）にパルスし、 C T Lの反応を調べるこ とにより腫瘍抗原べプチドを同定し、 さらにマススぺク トロメ トリーなど を用いて配列を決定する方法である。 この方法によって、 メラノーマ細胞 から g p 1 0 0と同一分子の Pmell7由来の腫瘍抗原べプチドが同定された (Science, 264 :716-719, 1994)。
また、 腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子を決定してさらにその対 応ずる腫瘍抗原べプチドを同定する方法としては、 分子生物学的手法を用 いて腫瘍抗原タンパク質をコードする遣伝子をクローニングする方法があ る。 腫瘍細胞から c D N Aを調製し、 その c D N Aを腫瘍抗原タンパク質 を発現していない細胞 （例えば C O S細胞など）に MH Cクラス I抗原遗 伝子とともにトランスフヱク トして一過的に発現させ、 それに対する C T Lの反応性によるスクリーニングを繰り返し行い、 腫瘍抗原タンパク質を コードする遺伝子を単離する。 この方法により、 上記の MA G E、 チロシ ナーゼ、 MART—1、 gp l 00、 g p 75の遺伝子がクローニングさ れた。
この 瘍抗原遺伝子の情報から実際に MH Cクラス I抗原に結合して提 示されている腫瘍抗原べプチドを推定、 同定するために次のような方法を 用いる。 まず、 PCR、 ェキソヌクレア一ゼ、 制限酵素などにより様々な サイズの腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子のフラグメントを作製し、 MHCクラス I抗原遺伝子とともに腫瘍抗原タンパク質を発現していない 細胞 （例えば COS細胞など）にトランスフエク トして一過性に発現させ、 CTLの反応性により腫瘍抗原べプチドを含む領域を限定する。 その後、 ぺプチドを合成し、 MH Cクラス I抗原は発現して腫瘍抗原タンパク質を 発現していない細胞にパルスし、 CTLの反応を調べることなどにより腫 瘍抗原ペプチドを同定する（J.Exp. Med.， 176:1453, 1992、 J. Exp. Med. , 1 79:24, 759, 1994)。 また、 HLA-A1, -A0201, -A0205, -All, -A31, -A680 1， -B7, -B8, -B2705, -B37, -C 0401, -Cw0602 などの MHCの型につい ては、 結合して提示されるペプチドの配列の規則性 （モチーフ） が判明し ており （I關 unogenetics, 41:178-228, 1995)、 それを参考にして腫瘍抗 原べプチドの候補を調べ、 そのべプチドを合成して上記と同様な方法で確 認する方法も用いられる（Eur. J. Immunol. , 24:759, 1994、 J. Exp. Med. , 1 80:347. 1994)。
また、 腫瘍において高発現している腫瘍抗原タンパク質は、 一方で、 正 常組織にも発現し、 その腫瘍抗原タンパク質に由来する免疫反応が過剰に 起こることで、 自己免疫疾患を引き起こしているとも考えられている。 例 えば、 化学療法剤と I L一 2を併用してメラノーマの治療を行った場合、 白斑症状の出現が認められるとの報告（J.Clin. Oncol., 10:1338-1343, 19 92)がある。 これは、 メラノーマに発現する腫瘍抗原タンパク質の断片 （ぺ プチド断片という） と MH Cクラス I抗原の複合体に対して C T Lまたは 抗体が誘導、 産生され、 正常組織である皮膚組織に作用することで自己免 疫疾患様の症状である白斑症状が出現したためと考えられる。
発明が解決しょうとする課題
上記の様に既知の腫瘍抗原タンパク質はいずれも、 限られた腫瘍でしか 発現していないか、 または多くの種類の腫瘍で発現していてもその腫瘍の 患者のうちの少数にしか発現していないため、 種々の腫瘍の治療や診断に 幅広く応用できるものではない。
そこで、 本発明が解決しょうとする課題は、 既知の腫瘍抗原タンパク質 またはその断片 （以下、 ペプチド断片または腫瘍抗原ペプチドという） を 用いて実施できる腫瘍の治療や診断と異なって、 扁平上皮癌等を含む幅広 い腫瘍に応用できるもの、 または応用可能な腫瘍が限られていてもその腫 瘍の患者のうち多くの人に応用できるもの、 またはその腫瘍の治療や診断 を補完しつつ各種腫瘍に応用できるものである腫瘍抗原タンパク質または その対応する腫瘍抗原べプチド等を提供することにある。
なお、 扁平上皮癌は、 ヒ トの癌で最も多く認められる癌のひとつである。 特に、 食道癌や肺癌での扁平上皮癌は現在の化学療法や放射線療法に比較 的抵抗性を示すことが知られている。 その点からも腫瘼抗原タンパク質ま たはその対応する腫瘍抗原べプチド等を用いた特異的免疫療法の開発が期 待されている。
また、 腫瘍抗原夕ンパク質に由来する特異的免疫が過剰に惹起されたこ とにより自己免疫疾患が発症した場合には、 腫瘍抗原タンパク質をコード する遗伝子の発現を妨ぐアンチセンス D N A · R N Aや腫瘍抗原べプチド のアンタゴニストなどを用いて、 免疫反応を特異的にプロックする治療法 が期待される。 課題を解決するための手段
本発明者らは、 各種の腫瘍、 特に扁平上皮癌等の治療や診断に幅広く応 用できる腫瘍抗原タンパク質またはその対応する腫瘍抗原べプチド等を得 るために、 メラノ一マ以外の腫瘍からの腫瘍抗原夕ンパク質の同定を試み た。
すなわち、 本発明者らは食道癌由来の扁平上皮癌細胞株 KE-4(以下、 食 道癌細胞株 KE-4、 あるいは単に KE-4と称す）を樹立し、 また該 KE- 4におい て発現する MHCクラス I抗原である HLA- A2601に拘束性の腫瘍抗原べプチド を認識する CTL (以下、 1^-4(：11と称す）を樹立した0：3^^1\1^5. , 55:42 48-4253, 1995)。
つづいて、 線維芽細胞株 VA- 13細胞に、 KE- 4から作製した c DNAライ ブラリーの組換えプラスミ ドと HLA- A2601 CDNAの組換えプラスミ ドを 同時にトランスフヱク 卜し、 そのトランスフヱクタン卜に KE- 4CTLを作用 させ、 KE- 4CTLが活性化されたかを IFN- 7の産生量で測定しスクリーニン グした。 その結果、 メラノーマ以外の腫瘍細胞から初めて、 本発明の腫瘍 抗原タンパク質をコ一ドする新規な遺伝子をクローニングすることに成功 即ち、 本発明の要旨は、
(1) 配列番号： 1のアミノ酸配列を有するタンパク質、 又は fのァミノ 酸配列のうち 1もしくは複数のァミノ酸残基が置換、 欠失もしくは付加さ れた変異タンパク質、 をコードする DN A (ただし、 該タンパク質および 変異タンパク質はその細胞内分解により、 MHCクラス I抗原と結合し得 るべプチド断片であってその結合状態で T細胞により認識され得るぺプチ ド断片、 を生じ得るものである） 、
(2)配列番号： 2の塩基配列からなる DNA、 又はその DN Aとストリ ンジヱン卜な条件下でハイブリダィズする DNA変異体 （ただし、 該 DN Aおよび DN A変異体が発現して生産されるタンパク質は、 その細胞内分 解により、 MHCクラス I抗原と結合し得るぺプチド断片であってその結合状 態で T細胞により認識され得るペプチド断片、 を生じ得るものである） 、
(3)前記 （1) または （2)記載の DN Aを有効成分として含有する医 薬、
(4)前記 （1) または （2) 記載の DNAを有する発現プラスミ ド、
(5) 前記 （4)記載の発現プラスミ ドによって形質転換された形質転換 体、
(6)前記 （1) または （2)記載の DNAを発現して生産される腫瘍抗 原夕ンパク質、
(7)前記 （6)記載のタンパク質の一部からなるペプチドであって、 M HCクラス I抗原と結合して T細胞により認識され得る腫瘍抗原べプチド、 または機能的に同等の特性を有するその誘導体、
(8) 配列番号： 1のアミノ酸配列の第 749位〜第 757位、 第 736 位〜第 744位、 第 785位〜第 793位、 又は第 690位〜第 698位 のアミノ酸配列の全部又は一部を有するペプチドである、 前記 （7)記載 の腫瘍抗原べプチド、 または機能的に同等の特性を有するその誘導体、
(9)前記 （6)記載の腫瘍抗原タンパク質、 前記 （7) または （8) 記 載の腫瘍抗原べプチド、 または機能的に同等の特性を有するその誘導体を 有効成分として含有する医薬、
(10)前記 （6)記載の腫瘍抗原タンパク質、 または前記 （7) もしく は （8)記載の腫瘍抗原ペプチドに特異的に結合する抗体、
(11)配列番号： 2の塩基配列からなる DNAのコーディ ング配列また は 5' ノンコーディ ング配列の中の DNA断片と相補的な配列をもつ 8塩 基以上からなる DNA若しくはその DNAに対応する RNA、 またはそれ らの化学的修飾体、 に関する。
発明の実施の形態
本発明の DN Aは、 新規な腫瘼抗原タンパク質をコ一ドするものであり、 配列番号： 1のアミノ酸配列を有するタンパク質、 又はそのアミノ酸配列 のうち 1もしくは複数のァミノ酸残基が置換、 欠失もしくは付加された変 異タンパク質、 をコードする DN A (ただし、 該タンパク質および変異夕 ンパク質はその細胞内分解により、 MHCクラス I抗原と結合し得るぺプ チド断片であってその結合状態で T細胞により認識され得るぺプチド断片、 を生じ得るものである） 、 あるいは、 配列番号： 2の塩基配列からなる D NA、 又はその DNAとストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズする DNA変異体 （ただし、 該 DNAおよび DNA変異体が発現して生産され るタンパク質は、 その細胞内分解により、 MHCクラス I抗原と結合し得 るべプチド断片であってその結合状態で T細胞により認識され得るぺプチ ド断片、 を生じ得るものである） が例示される。
本明細書において、 「アミノ酸配列のうち 1もしくは複数のアミノ酸残 基が置換、 欠失もしくは付加された変異タンパク質」 とは、 人為的に作製 したいわゆる改変タンパク質や、 タンパク質をコードする DN Aに一般に みられる多形、 変異や修飾反応などにより得られる機能的に同等の特性を 有するタンパク質を意味し、 この変異タンパク質をコードする DNAは、 例えば、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual第 2版第 1一 3巻 Sam brook, J.ら著， Cold Spring Harber Labolatory Press出版 ew York 19 89年に記載の方法、 例えば部位特異的変異誘発や P CR法等によって製造 することができる。 なお、 ここで置換、 欠失もしくは付加されるァミノ酸 残基の数は、 上記部位特異的変異誘発等の周知の方法により置換、 欠失も しくは付加できる程度の数を指す。
本明細書において、 「DN Aとストリンジェン卜な条件下でハイプリダ ィズする DN A変異体」 とは、 例えば前述の Molecular Cloning に記載の 方法によって得ることができる。 ここで、 「ストリンジヱン卜な条件」 と は、 例えば、 6xSSC (20XSSCは、 333 mM So d i um c i t r a t e、 333 mM N a C 1を示す） 、 0.5%S D Sおよび 50%ホルムァミ ドを含む溶液中で 42°Cにてハイプリダイズさせた後、 0. lxSSC、 0.5%SDSの溶液中で 68°Cにて洗浄するような条件、 あるいは、 中山ら著、 バイオ実験イラストレイテツ ド②遺伝子解析の基礎、 p.148— 151、 秀潤社、 1995年、 に記載の条件等を指す。 本明細 書においては、 このようなハイブリダイズする DN Aが発現して生産され るタンパク質は、 そのタンパク質を構成する一部のぺプチド断片が MHC クラス I抗原と結合して T細胞により認識されるべプチド部分を含むもの である。
本明細書において、 「細胞内分解により、 MHCクラス I抗原と結合し 得るぺプチド断片であってその結合状態で T細胞により認識され得るぺプ チド断片を生じ得るタンパク質および変異タンパク質」 （以下、 これらの タンパク質を腫瘍抗原タンパク質と言う場合がある。 ） とは、 そのタンパ ク質又は変異タンパク質の一部のァミノ酸配列からなる部分べプチドが M HCクラス I抗原と結合可能であり、 MHCクラス I抗原と結合して細胞 表面に提示された場合、 そのべプチド断片と MHCクラス I抗原の複合体 に対し、 特異的に結合可能な T細胞が結合して T細胞にシグナルを伝える ことができる、 そのようなぺプチド部分を含むタンパク質又は変異タンパ ク質を意味する。 なお、 ここでいう結合とは非共有結合を意味する。
ぺプチド断片が MHCクラス I抗原に結合して T細胞に認識されること を確かめる方法としては、 例えば、 ペプチド断片を適当な細胞に内因性に 発現させるか、 または外部から加える （パルスする） ことにより M H Cク ラス I抗原に結合させることで細胞表面にぺプチド断片を提示させ、 つづ いて、 そのべプチド提示細胞に対して腫瘍抗原タンパク質特異的な T細胞 を作用させ、 その T細胞が産出するサイ トカインを測定する方法などがあ る。 また、 ペプチド提示細胞に対する T細胞の傷害活性を測定する方法と して、 51Crで標識したペプチド提示細胞を用いる方法 （Int. J. Cancer, 58: 317(1994)) も使用できる。 ここで、 認識する T細胞としては、 C T L を用いるのが好ましい。
本発明の D N Aは医薬の有効成分として使用することができる。 即ち、 本発明の D N Aを有効成分として含有する 「医薬」 は、 例えば、 本発明の D N Aを腫瘍患者等に投与することで腫瘍を治療または予防することがで きる。 本発明の D N Aを投与すると細胞内で腫瘍抗原タンパク質が高発現 し、 腫瘍抗原ペプチドが MH Cクラス I抗原と結合して、 細胞表面に高密 度に提示されることにより、 腫瘍特異的 C T Lが体内で効率的に増殖する ことになり、 これにより腫瘍の治療または予防が達成される。 本発明の D N Aを投与し細胞内に導入する方法としては、 ウィルスベクタ一による方 法およびその他の方法 （日経サイエンス， 1994年 4月号， 20-45頁、 月刊薬 事， 23-48(1994), 実験医学増刊， 1^(15), (1994). ぉ びこれら の引用文献等） のいずれの方法も適用することができる。
ウィルスベクターによる方法としては、 例えばレトロウイルス、 アデノ ウィルス、 アデノ関連ウィルス、 ヘルぺスウィルス、 ワクシニアウィルス、 ボックスウィルス、 ポリオウイルス、 シンビスウィルス等の D N Aウィル ス又は R N Aウィルスに本発明の D N Aを組み込んで導入する方法が挙げ られる。 この中で、 レトロウイルス、 アデノウイルス、 アデノ関連ウィル ス、 ワクシニアウィルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、 発現プラスミ ドを直接筋肉内に投与する方法 （D N Aワクチン法） 、 リボソーム法、 リボフヱクチン法、 マイクロインジェ クシヨン法、 リン酸カルシウム法、 エレク ト口ポレーシヨン法等が挙げら れ、 特に DNAワクチン法、 リボソーム法が好ましい。
本発明の DNAを実際に医薬として作用させるには、 DNAを直接体内 に導入する in vivo法、 およびヒ トからある種の細胞を採集し体外で DN Aを該細胞に導入しその細胞を体内に戻す ex vivo法がある （日経サイエ ンス， 1994年 4月号， 20- 45頁、 月刊薬事， (1), 23-48(1994)、 実験医学 増刊， （15), (1994)、 およびこれらの引用文献等） 。 in vivo法がより 好ましい。
in vivo法により投与する場合は、 治療目的の疾患、 症状等に応じた適 当な投与経路により投与され得る。 例えば、 静脈、 動脈、 皮下、 皮内、 筋 肉内等に投与することができる。 in vivo法により投与する場合は、 例え ば、 液剤等の製剤形態をとりうるが、 一般的には有効成分である本発明の DNAを含有する注射剤等とされ、 必要に応じて、 慣用の担体を加えても よい。 また、 本発明の DNAを含有するリボソームまたは膜融合リポソ一 ム （センダイウィルス （HVJ) —リボソーム等） においては、 懸濁剤、 凍結剤、 遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができ る
製剤中の本発明の DNAの含 5は、 治療目的の疾患、 患者の年齢、 体重 等により適宜調整することができるが、 通常、 O.OOOlmg〜： I00mg、 好まし くは 0.001mg〜10ragの本発明の DNAを、 数日ないし数月に 1回投与する のが好ましい。
また、 本発明の DNAを用いる組換え DNA技術により、 腫瘍抗原タン パク質を大量に製造することが可能である。
本発明の DNAを発現して腫瘍抗原タンパク質を生産するには、 例えば、 前述の Molecular Cloning等の多くの成書や文献に基づいて実施すること ができる。 発現させたい DNAの上流に、 転写を制御するプロモーター配 列 （例えば、 t rp、 1 a c、 T7、 S V 40初期プロモーター） 等の制 御遺伝子を付加し、 適当なベクター （例えば pSV— SP0RT1など） に組み込むことにより、 宿主細胞内で複製し、 機能する発現プラスミ ドを 作製する。 次に発現プラスミ ドを適当な宿主細胞に導入して形質転換体を 得る。 宿主細胞としては、 大腸菌などの原核生物、 酵母のような単細胞真 核生物、 昆虫、 動物などの多細胞真核生物の細胞などが挙げられる。 また、 宿主細胞への遺伝子導入法としては、 リン酸カルシウム法、 DEAE—デ キストラン法、 電気パルス法などがある。 形質転換体は、 適当な培地で培 養することによって目的とするタンパク質を生産する。 以上のようにして 得られた腫瘍抗原タンパク質は一般的な生化学的方法によって単離精製す ることができる。
本明細書において、 本発明の腫瘍抗原タンパク質の細胞内分解により生 じ得る、 「MHCクラス I抗原と結合し得るぺプチド断片であってその結 合状態で T細胞により認識され得るペプチド断片」 、 即ち 「腫瘍抗原ぺプ チド」 は、 例えば以下の様にして決定することができる。
まず、 PCR、 ェキソヌクレア一ゼ、 制限酵素などにより様々なサイズ の腫瘍抗原タンパク質をコードする DNAの断片を作製後、 前述のように 発現ベクターに挿入し、 腫瘍抗原を提示する MHCクラス I抗原をコード する遗伝子を含むプラスミ ドとともに腫瘍抗原タンパク質を発現していな い細胞 （例えば COS細胞など）にトランスフェク 卜して一過性に発現さ せ、 CTLの反応性により腫瘍抗原ペプチドを含む領域を限定する。 その 後、 その領域内の種々のペプチドを合成し、 腫瘍抗原を提示する MH Cク ラス I抗原は発現するが腫瘍抗原タンパク質を発現していない細胞にパル スし、 C T Lの反応を調べることなどにより腫癢抗原べプチドを同定する (J. Exp. Med. , 176 : 1453, 1992、 J. Exp. Med. . 179(24)759, 1994)。
また、 HLA-Al, -A0201, -A0205, -All, -A24, -A31, - A6801, - B7, -B8, -B2705, -B37, -Cw0401, - Cw0602などの MH Cの型については、 結合し て提示される抗原ペプチドの配列の規則性 （モチーフ） が判明しており、 それを参考にして腫瘍抗原タンパク質をコードする D N Aから腫瘍抗原べ プチドの候補を調べ、 そのべプチドを合成して上記と同様な方法で確認す る方法も用いられる（Eur. J. Immunol. , 24 : 759, 1994、 J. Exp. Med. , 1 80 :347, 1994)。
ところで、 MH Cにはクラス I抗原以外にクラス I I抗原も存在するこ と、 および腫瘍抗原タンパク質がマクロファージなどの抗原提示細胞に取 り込まれ分解されることにより生じ得る特定の腫瘍抗原べプチドと該 MH Cクラス I I抗原との結合体は、 腫瘍特異的なヘルパー T細胞を活性化す ることが知られている （J. Immunol. , 146 : 1708-1714, 1991) 。
本発明の新規な腫瘍抗原タンパク質遺伝子のクローニングの成功に伴い、 上記の如き MH Cクラス I I抗原と結合する腫瘍抗原べプチドについても 決定することが可能である。 具体的には、 MH Cクラス I抗原の場合と同 様に、 T細胞との反応性に基づく抗原ペプチドの決定法、 あるいは抗原べ プチドのモチーフに関する公知の知見等に基づき、 決定することが可能で める。
この様にして決定される腫瘍抗原べプチドは、 通常のぺプチド化学にお いて知られている方法で製造することができる。 例えば、 "Peptide Synth esis ， Interscience, New York, 1966s The Proteins ， Vol. 2, Academ ic Press Inc. , New York, 1976、 「ぺプチド合成」 丸善 （株）， 1975、 「ぺ プチド合成の基礎と実験」 丸善 （株）， 1985等に記載されている方法等が 挙げられる。 すなわち、 C末端部位の構造により液相法、 固相法のいずれ かを選択して合成することができ、 なかでも液相法がより好ましい。 すな わち、 ァミノ酸の官能基を適当な保護基で適宜保護および脱保護を行い、 アミノ酸を一残基または数残基づつ結合させることでぺプチドを製造する ことができる。 なお、 アミノ酸の官能基の保護基については、 例えば前述 のべプチド化学について記載する書籍等に記載されている。
本明細書に於いて、 腫瘍抗原ペプチドとは、 配列番号： 1で示されるァ ミノ酸配列を有するタンパク質、 又は既に定義したその変異タンパク質の いずれかから得られるペプチド断片として定義し得る。 以下、 配列番号： 1のアミノ酸配列で示されるタンパク質由来の腫瘍抗原べプチドおよびそ の誘導体についてより具体的に説明するが、 その説明は変異タンパク質由 来の腫瘍抗原べプチドにも適用し得るものであることは理解されよう。 配列番号： 1で示されるタンパク質の細胞内分解によって得られる腫瘍 抗原ペプチドとしては、 特に限定されるものではないが、 例えば配列番号
： 1のアミノ酸配列の第 7 4 9位〜第 7 5 7位、 第 7 3 6位〜第 7 4 4位、 第 7 8 5位〜第 7 9 3位、 第 6 9 0位〜 6 9 8位のァミノ酸配列の全部又 は一部を有する腫瘍抗原ペプチドが挙げられる。 好ましくは、 9個のアミ ノ酸残基からなるものであり、 例えば、 配列番号： 1の第 7 4 9位〜第 7
5 7位、 第 7 3 6位〜第 7 4 4位、 第 7 8 5位〜第 7 9 3位、 第 6 9 0位 〜6 9 8位のァミノ酸配列からなるぺプチドが特に好ましい。 なお、 本明 細害において、 腫瘵抗原ペプチドを表示するに際して、 例えば、 配列番号
： 1の第 7 4 9位〜第 7 5 7位のァミノ酸配列からなるぺプチドを、 単に
「7 4 9〜7 5 7」 のように略す場合がある。 本明細害において、 「腫瘍抗原ペプチドの誘導体」 とは、 前記の腫瘻抗 原べプチドと機能的に同等の特性を有するものであって、 該ぺプチドの中 の一部のアミノ酸残基を置換、 欠失もしくは付加した誘導体、 および該ぺ プチドまたは該ぺプチドの一部のァミノ酸残基を置換、 欠失もしくは付加 した誘導体のァミノ基もしくはカルボキシル基を修飾した誘導体を意味す る。 具体的には、 配列番号： 1のアミノ酸配列の第 7 4 9位〜第 7 5 7位、 第 7 3 6位〜第 7 4 4位、 第 7 8 5位〜第 7 9 3位、 又は第 6 9 0位〜第 6 9 8位のァミノ酸配列の全部又は一部を有する本発明の腫瘍抗原べプチ ドにおいて、 第 7 4 9位〜第 7 5 7位、 第 7 3 6位〜第 7 4 4位、 第 7 8 5位〜第 7 9 3位、 又は第 6 9 0位〜第 6 9 8位のァミノ酸配列の中の一 部のアミノ酸残基を置換、 欠失したり、 他のアミノ酸残基を付加した誘導 体が例示される。
該ぺプチドの中の一部のァミノ酸残基を置換、 欠失もしくは付加した誘 導体としては、 好ましくは、 腫瘍抗原ペプチドのうちで C T Lとの結合に 関与するェピトープ領域はそのままであって MH Cクラス I抗原との結合 に関与するァミノ酸残基が置換、 欠失もしくは付加された誘導体が挙げら れ、 さらに好ましくはその誘導体であって一つのァミノ酸残基のみを置換 したものが挙げられる（Immunol. 84:298-303, 1995)。 メラノ一マの腫瘍 抗原タンパク質である g P 100 の抗原ペプチドにおいては、 MH Cクラス I抗原との結合部位のァミノ酸を置換することにより、 MH Cクラス I抗 原へより強く結合するようになり、 かつ、 メラノーマ患者の末梢血リンパ 球を in vitroで刺激した場合、 抗原ペプチドに特異的な C T Lがより強く 誘導されることが報告されている（J. Immunol. , 157: 2539-2548. 1996)。 かかる誘導体は、 市販のぺプチド合成機により容易に合成可能であり、 合成された誘導体の MH Cクラス I抗原との結合親和性は、 該誘導体とラ ジオアイソ トープで標識された標準べプチドとの M H Cクラス I抗原への 結合の競合阻害アツセィにより、 無細胞系で容易に測定することができる (E. T. Kuboら、 J. Immunol.， 152 : 3913. 1994)。 従って、 作製した種々の ぺプチド誘導体をこのアツセィに供することにより、 C T L誘導活性を有 するぺプチド誘導体を容易に選ぶことができる。 このようにして選ばれた ペプチド誘導体は、 C T Lとの結合性はそのまま維持しつつ、 MH Cクラ ス I抗原により強く結合可能であるため、 さらに有用な腫瘍抗原べプチド として適用ができる。
ァミノ基の修飾基としては、 例えばァシル基が挙げられ、 具体的には炭 素数 1から 6のアルカノィル基、 フェニル基で置換された炭素数 1から 6 のアルカノィル基、 炭素数 5から 7のシクロアルキル基で置換されたカル ボニル基、 炭素数 1から 6のアルキルスルホニル基、 フヱニルスルホニル 基等が挙げられる。
カルボキシル基の修飾基としては、 例えばエステル基およびアミ ド基が 挙げられ、 エステル基の具体例としては、 炭素数 1から 6のアルキルエス テル基、 フヱニル基で置換された炭素数 0から 6のアルキルエステル基、 炭素数 5から 7のシクロアルキルエステル基等が挙げられ、 アミ ド基の具 体例としては、 アミ ド基、 炭素数 1から 6のアルキル基 1つまたは 2つで 置換されたアミ ド基、 フ ニル基で置換された炭素数 0から 6のアルキル 基 1つまたは 2つで置換されたアミ ド基、 アミ ド基の窒素原子を含んで 5 から 7員環のァザシクロアルカンを形成するァミ ド基等が挙げられる。 本明細書において、 「抗体」 は、 例えば、 Antibodies ; A Laboratory M anual, Lane, H, D.ら編， Cold Spring Harber Laboratory Press出版 Ne w York 1989年などに記載の方法により容易に作製される。 即ち、 腫瘍抗 原タンパク質または腫瘍抗原べプチドを用いて常法により適宜動物を免疫 することにより、 腫瘍抗原タンパク質、 腫瘍抗原ペプチドを認識する抗体、 さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。 抗体の用途として は、 ァフィ二ティークロマトグラフィー、 c DNAライブラリ一のスクリ 一二ング、 免疫学的診断法、 医薬等が挙げられる。 免疫学的診断法は、 ィ ムノブ口ッ ト法、 放射免疫測定法 （R I A) 、 酵素免疫測定法 （EL I S A) 、 蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。
本明細書において、 「配列番号： 2の塩基配列からなる DNAのコーディ ング配列または 5' ノンコーディング配列の中の断片 DNAと相補的な配 列をもつ 8塩基以上からなる DN A若しくはその DN Aに対応する RNA」 とは、 2本鎖 DN Aのアンチセンス鎖の DN Aまたはそのアンチセンス鎖 の DNAに対応する RNAであって 8塩基以上のもの （以下、 アンチセン スォリゴヌクレオチドという。 ） をいう。
このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 例えば本発明の腫瘍抗原タン パク質をコードする遺伝子の塩基配列を基にして DN Aとして製造するか、 またはこの DNAをアンチセンスの向きに発現プラスミ ドに組み込むこと で RN Aとして製造することができる。
このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 本発明の遺伝子である配列番 号： 2の塩基配列からなる DNAのコーディング配列、 5' ノンコ一ディ ング配列のいずれの部分の D N A断片と相補的な配列であつてもよいが、 好ましくは転写開始部位、 翻訳開始部位、 5' 非翻訳領域、 ェクソンとィ ン卜ロンとの境界領域もしくは 5' CAP領域に相補的配列であることが望ま しい。
上記 「DNA若しくはそのDNAに対応するRNA」 の 「化学的修飾体」 (以下、 アンチセンスオリゴヌクレオチドの化学的修飾体という） として は、 D N Aまたは R N Aの細胞内への移行性または細胞内での安定性を高 めることができる化学的修飾体を表し、 例えば、 ホスホロチォエート、 ホ スホロジチォエート、 アルキルホスホトリエステル、 アルキルホスホナー ト、 アルキルホスホアミデート等の誘導体 （"Antisense RNA and DNA" WI LEY - LISS刊 1992 P. 1_50)が挙げられる。 この化学的修飾体は、 同文献等 に従って製造することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその化学的修飾体を用い て、 腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御することができ る。 腫瘍抗原タンパク質の過剰発現が自己免疫疾患の原因である場合は、 この方法によつて腫瘍抗原タンパク質の生産量を減らすことで、 C T Lに よる傷害を軽減するとともに C T Lの増殖を抑制することとなり自己免疫 疾患を治療または予防することができる。
ァンチセンスォリゴヌクレオチド又はその化学的修飾体をそのまま投与 する場合は、 このアンチセンスォリゴヌクレオチドの好ましい長さとして は、 例えば 8〜2 0 0塩基のものが挙げられ、 さらに好ましくは 1 0〜2 5塩基が挙げられ、 特に好ましくは 1 2〜2 5塩基のものが挙げられる。 また、 アンチセンスオリゴヌクレオチドを発現プラスミ ドに組み込む場 合は、 このアンチセンスオリゴヌクレオチドの好ましい長さとしては、 例 えば 1 0 0塩基以上が挙げられ、 好ましくは 3 0 0〜1 0 0 0塩基が挙げ られ、 さらに好ましくは 5 0 0〜1 0 0 0塩基が挙げられる。 ，
アンチセンスオリゴヌクレオチドを発現プラスミ ドに組み込んだ後細胞 に導入する方法としては、 例えば実験医学、 12巻、 1994年に述べられてい る方法が挙げられ、 リポソ一ムゃ組換えウイルスなどを利用した方法が挙 げられる。 アンチセンスオリゴヌクレオチドの発現プラスミ ドは通常の発 現ベクターを用いてプロモーターの後ろに逆向きに、 すなわち本発明の遺 伝子が 3 ' から 5 ' の向きに転写されるように、 本発明の遺伝子をつなぐ だけで簡単に作製できる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチ ドの化学的修飾体をそのまま投与する場合、 安定化剤、 緩衝液、 溶媒など と混合して製剤した後、 抗生物質、 抗炎症剤、 麻酔薬などと同時に投与し てもよい。 こうして作成された製剤は様々な方法で投与可能である。 投与 は連日または数日から数週間おきになされるのが好ましい。 また、 この様 な頻回の投与を避けるために徐放性のミニペレツ ト製剤を作成し患部近く に埋め込むことも可能である。 あるいはォスモチックポンプなどを用いて 患部に連続的に徐々に投与することも可能である。 通常投与量は作用部位 における瀵度が 0. lnM-10 Mになるように調製する。
本発明の腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原べプチド並びに機能的に同 等の特性を有するそれらの誘導体は、 単独又は 2種以上を組み合わせて用 いることができ、 それらを有効成分として含有する医薬は、 細胞性免疫が 効果的に成立するようにアジュバン卜とともに投与したり、 粒子状の剤型 にして投与することができる。 即ち、 腫瘍抗原タンパク質や腫瘍抗原ぺプ チドを生体に投与すると、 抗原提示細胞の MH Cクラス I抗原に腫瘍抗原 ペプチドが高密度に提示され、 腫瘍特異的 C T Lが効率よく増殖する。 ァ ジュバントとしては、 文献 （Clin. Microbiol. Rev. , 7 :277-289, 1994)に 記載のものなどが応用可能である。 また、 剤型としては、 リボソーム製剤、 直径数/ mのビーズに結合させた粒子状の製剤、 リピッ ドを結合させた製 剤など外因性の抗原べプチドを MH Cクラス I抗原へ効率良く抗原提示さ せうる投与法が用いられる。 また、 腫瘍抗原ペプチドをパルスした榭状細 胞ゃマクロファージなどの抗原提示細胞や腫瘍抗原タンパク質をコードす る D N Aを導入した細胞を投与する方法も考えられる。 製剤中の本発明の 腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原べプチドの投与量は、 治療目的の疾患、 患者の年齢、 体重等により適宜調整することができるが、 通常 0. 0001nig〜 lOOOmg. 好ましくは 0. 001mg〜1000mgであり、 これを数日ないし数月に 1 回投与するのが好ましい。
本発明の腫瘍抗原べプチドを用いる i n vitro での末梢血リンパ球から の C T Lの誘導方法が、 下記のように例示される。
前記扁平上皮癌を有する食道癌患者由来の末梢血リンパ球を i n vitro で培養し、 培養液に本発明の腫瘍抗原ペプチドとして、 例えば、 「7 3 6 〜7 4 4」 、 「7 4 9〜7 5 7」 、 「7 8 5〜7 9 3」 、 「6 9 0〜6 9 8」 の配列を有するぺプチドを 1 0 g /m 1になるように加え、 末梢血 リンパ球を刺激する。 1週間の間隔をおいて 3回の剌激を繰り返す。 3回 目の刺激から 1週間後、 末梢血リ ンパ球を回収し、 D. D. Kharkevitch ら著、 Int. 3. Cancer, 58 : 317 (1994)に記載の方法に従って、 細胞傷害活性を測 定することにより、 本発明の腫瘍抗原べプチドの C T Lの誘導活性が見出 される。
本発明の腫瘍または自己免疫疾患の診断方法としては、 腫瘍抗原タンパ ク質または腫瘍抗原べプチドに特異的に結合する抗体を用いて行うことが できる。 例えば、 腫瘍組織標本から腫瘍抗原タンパク質を検出する方法、 血中または組織中の腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原タンパク質に対す る抗体の存在を検出する方法などがあげられる。 検出方法としては、 免疫 組織化学法、 ィムノブロッ ト法、 放射免疫測定法 （R I A ) 、 酵素免疫測 定法 （E L I S A ) 、 蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。 ま た、 抗体を用いて腫瘍抗原タンパク質を検出することにより、 腫瘍の早期 発見、 再発発見が可能となり、 また腫瘍抗原タンパク質、 腫瘍抗原べプチ ドまたはそれらをコ一ドする D N Aを用いた医薬の適応可能な腫瘍患者の 選択が可能になる。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 2のノーザンブロッ トハイブリダィゼーションの結果を 示す電気泳動の写真である。
図 1の a)中 KE-4、 KE-3、 TE-8および TE-9は食道癌細胞株を、 Kuma-Ιは頭 頸部癌細胞株を、 HSC-4は口腔癌細胞株を、 Bee- 1は B細胞株を、 KMG-Aは胆 癌細胞株を、 は乳癌細胞株を、 KIM-1、 KYN- 1および HAK-3は肝癌細 胞株を、 そして M36および M37はメラノーマ細胞株を、 それぞれ表す。
実施例
以下、 本発明の一例として実施例により本発明をさらに詳しく説明する が、 本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
参考例 1
食道癌細胞株に対する細胞傷害性 T細胞 （C T L ) 株の樹立
中尾ら著， Cancer Bes.， : 4248-4252(1995)の記載に従い、 組織型が 扁平上皮癌に分類される食道癌細胞株 KE-4に対する C T Lを患者の末梢血 単核球細胞から樹立し、 KE-4CTLと命名して実験に使用した。 食道癌細胞 株 KE-4および KE- 4CTLは、 茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号、 工業技術院 生命工学工業技術研究所に、 それぞれ受託番号 F E R M B P— 5 9 5 5 および F E R M B P— 5 9 5 4で寄託されている （寄託日 ： いずれも平 成 9年 5月 2 3日） 。 また、 前述の中尾らの報告に従い、 KE-4の HLAクラ ス I分子のタイピングを行い、 HLA-A2402, -A260K - B54、 -B60、 -Cwl、 - Cw3であることを確認した。
参考例 2
HLA-A2601 c D N A及び HLA-A2402 c D N Aの調製
KE-4から、 中尾ら著， Cancer Res. , ^: 4248-4252(1995)の記載に従い、 HLA-A2601 の c D N Aを発現べクタ一 pCI?3(INVITR0GEN社製）に組み込んだ 組換えプラスミ ドを作製した。 また同様な方法により、 HLA-A2402につい ても組換えプラスミ ドを作製した。
参考例 3
KE- 由来 c DNAライブラリ一の作製
KE-4から mRNA精製システム （ファルマンァバイオテク社製） を用い 添付のプロトコールに従い、 全 RN A画分の分離および oligo(dT)カラム による poly(A) + mRN Aの調製を行った。 mR N Aよりスーパースクリ ブトプラスミ ドシステム（GIBCO BRL社製）を用い添付のプロトコ一ルに従 い、 両端に Notlアダプターと Sailアダプターを連結した cDN Aを作製し た後、 この c DN Aを発現べクタ一のプラスミ ド pSV-SPOBTl(GIBC0 BBL 社製）の制限酵素 Notlおよび Sailの切断部位にライゲ一シヨンにより連結 して組換えプラスミ ドを得た。 この組換えプラスミ ドをジーンパルサ一（B io-Ead社製）を用いて 25//F, 2.5k Vの条件で、 電気パルスにより大腸菌 のエレク トロマックス DH10B/p3 TMセル（GIBCO BRL社製）に導入し、 アン ピシリン （50 g/ml)を含む LB培地（1%パク ト トリプトン、 0.5%イースト エキス、 0.5%NaCl、 pH7.3)で組換プラスミ ドが導入されている形質転換 体を選択した。
参考例 4
インタ フ ロン一？の定量
インターフェロン一 7 (IFN-7)の定量は、 ェンザィムィ厶ノアッセィ（Ε LISA) により行った。 96ゥヱルマイクロプレートに固層化抗体として抗ヒ ト IFN-yマウスモノクローナル抗体を吸着させ、 ゥシ血清アルブミンで非' 特異的結合をブロックした後、 検体中の IFN-ァを抗体に結合させた。 次に 検出抗体として抗ヒ ト IFN-ァゥサギポリクローナル抗体を結合させ、 さら にアル力リフォスファターゼ標識した抗ゥサギィムノグロプリンャギ抗体 を結合した後、 発色基質としてパラ二卜ロフヱニルフォスフヱ一トを反応 させ、 IN NaOBを等量加えて反応を停止させた後、 吸光度（405ηιιι)を測定し た。 これをスタンダードの IFN-ァで得られた値と比較することにより定量 した。
実施例 1
新規な腫瘍抗原夕ンパク質遗伝子のスクリ一二ング
参考例 3に示した形質転換体の約 100個のプールからの組換えプラスミ ド D N Aの回収は以下のように行った。 すなわち、 アンピシリン （50 i g/ ml)を含む LB培地の入った 96ゥエル U底マイクロプレートにゥエルあたり 100個の形質転換体を加え培養後、 その一部をゥニル当たり 0. 25mlの TYGPN 培地（F. M. Ausubelら編、 CURRENT PROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. )の入った別の 96ゥヱル U底マイクロプレー卜に移し て 37°Cで 48時間培養し、 残りの LB培地のマイクロプレートは凍結保存した。
TYGPN培地で培養した形質転換体の組換えプラスミ ド D N Aは、 マイクロ プレー卜でアル力リ溶解法（F. M. Ausubelら編、 CURRENT PROTCOLS IN MOL ECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. )により調製した。 イソプロパ ノール沈澱で回収した組換えプラスミ ド D N Aは、 50 ί/ 1の 20ng/ml RNase を含む 10mM Tris, lmM EDTA, pH7. 4溶液で懸濁した。
線維芽細胞株の VA-13 細胞 (理化学研究所細胞開発銀行、 Ann. Med. Exp. B iol. Fenn. , 44 : 242-254, 1966)へ、 リボフヱクチン法により以下のように KE-4 c D N Aの組換えプラスミ ドと HLA- A2601 C D N Aの組換えプラスミ ドをダブルトランスフユク 卜した。 すなわち、 VA- 13細胞を 96ゥエル平底 マイクロプレートにゥエル当たり 7000個を加えて、 100 1の 10% FCSを含 む RPMI 1 6 4 0培養液で 2日間培養した。 リポフエクチン試薬（GIBCO BRL 社製）を用い、 形質転換体約 100個分の KE- 4 c D N Aの組換えプラスミ ド 2 5 1と参考例 2に示した BLA-A2601 c DNAの組換えプラスミ ド 10 1(20 Ong)と約 35倍に希釈したリポフヱクチン試薬 35 1の混合液 70//1の 30 1 を VA-13細胞に加えてダブルトランスフヱク トした。 トランスフエクタン 卜は 2点ずつ用意した。 5時間後、 このトランスフヱクタントに 200//1の 10 % FCSを含む培養液を加え、 更に 72時間、 37°Cで培養した後、 培養液を除 去し、 ゥヱル当たり 10000個の KE-4CTLを加えて 100/21の 10%FCSと 25U/ml の 1レ2を含む培養液で 37°Cで 24時間培養した。 培養液を回収し、 IFN-yを ELISAで測定した。
高い IFN- r産生が認められた 4群については、 該当する凍結保存してあつ た KE-4c DNAの組み換えプラスミ ドによる形質転換体約 100個のプール を用いてさらに以下のようにスクリーニングを行った。 すなわち、 形質転 換体のプールをアンピシリン（50 ig/ml)を含む LB寒天培地のプレー卜にま いてコロニーを得て、 各群 200コロニー、 合計 800コロニーについてゥエル 当たりの形質転換体が 1種類となる条件で上記と同様の方法で培養し、 KE -4c DN Aの組換えプラスミ ド DN Aを調製した。 さらに上記と同様な方 法で VA-13細胞への KE- 4c DNAの組換えプラスミ ドと HLA-A2601 c DN Aの組換えプラスミ ドのダブルトランスフエク トを行い、 引き続いて KE-4 CTLとの混合培養を行い、 KE-4CTLが反応して産生した培養液中の IFN- γの 定量を行って陽性のプラスミ ドを選択した。 この操作により KE-4c DNA 組換えプラスミ ドクローンが選択され、 6DIと命名した。 6DIについては、 さらにもう一度、 同様な操作を繰り返して KE-4CTL細胞による IFN-7の 産生量を参考例 4の方法により定量した。 その結果を以下の表 1に示す。 標的細胞 KE-4CTLが産生した IFN-ァ量 (pg/ml)
VA— 13細胞 0
VA— 13細胞 + HLA-A2601 8
VA— 13細胞 + 6DI 4 3
VA— 13細胞 + HLA-A2601 +6DI 24 0
VA— 13細胞 + HLA-A02011) 0 9
VA— 13細胞 + HLA- A0201 + 6DI1) 3 0
1)：比較のため異なったタイプの HL Aをトランスフエク トした場合 (トランスフヱク 卜した DNA量、 HLA- A2601、 HLA-A0201が 200ng、 6DIが lOOngの時のデータ） 実施例 2
ノーザンハイプリダイゼーションによる腫瘍抗原タンパク質遺伝子発現の 解析
種々の細胞株より、 BNAzol B (TEL-TEST, INC.社製）を用いて RN Aを調 製した。 5 gの RNAをホルムアミ ド、 ホルムアルデヒ ド存在下で変性 させ、 ァガロース電気泳動を行った後、 Hybond- N+ ナイロンメンブレン（A raersham社製）に転写、 固定した。 正常組織の R N Aについては、 mRNA を固定した市販のメンブレン（CL0NTECH社製）を用いた。 マルチプライム DN Aラベリングシステム（Amersham 社製）により、 実施例 1でクロー二 ングした組換えブラスミ ド 6DIの挿入配列部分を32 Pで標識して D N Aプ ローブを作製し、 公知の方法 （中山ら著、 バイオ実験イラストレイテッ ド ②遗伝子解析の基礎、 p.148-151 、 秀潤社、 1995年） に従って、 メンブレ ン上の RNAにハイブリダイズさせた後、 ォートラジオグラフィ一により, 本発明の腫瘍抗原タンパク質遺伝子の mRN Aを検出した。 次に、 該遗伝 子の mRNAの検出に用いたメンブレンを、 0. 5%ドデシル硫酸ナトリ ゥム水溶液中で煮沸してプローブを剥がした後、 細胞で恒常的に発現して いる ;5—ァクチンをプローブとして、 同様の方法でノーザンハイプリダイ ゼーシヨンを行い、 mRNAを検出して内部標準とした。 結果を図 1に示 す。 これらの結果より、 本発明の腫瘍抗原タンパク質遺伝子の mRNAは、 各種癌細胞及び正常組織で広範に発現しており、 全長は、 約 2. 5kbで あることが明らかになった （図 1) 。
実施例 3
腫瘍抗原タンパク質をコート"する全長の c DNAク 0 -ンのクローニング と塩基配列の決定
参考例 3に示した KE-4由来 c DNAライブラリーをアンピシリン （50 μ g/ml) を含む L B寒天培地のプレートにまいてコロニーを得た後、 Hybond -N+ナイロンメンブレン（Amersham社製）に添付のプロ トコールに従って、 コロニーの DN Aを転写、 固定した。 実施例 2で使用したのと同じ 6 D I プローブを用い、 実施例 2と同様の条件でハイプリダイゼーションとォ一 トラジオグラフィーを行って、 腫瘍抗原タンパク質遺伝子の c DN Aが組 み込まれた組換えプラスミ ドを有する形質転換体のコロニーを選択した。 さらに、 選択された複数のコロニーより組換えプラスミ ドを回収し、 制限 酵素 No t I及び S a 1 Iで処理した後、 ァガロース電気泳動により組み 込まれた c DNAの長さを確認した。 約 2. 5 k bの c DNAが組み込ま れた組換えプラスミ ドを選択し、 これを K 3と命名した。 このプラスミ ド K 3 ίこつ tゝて DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencingキッ 卜 (ノ、。一キンェ ルマ一社製） を使用して、 cDN A部分の塩基配列を決定した。 決定され た塩基配列を、 配列表の配列番号： 2に示す。 該 cDN Aの全長は 252 7塩基対であった。 配列番号： 2の塩基配列によってコードされるァミノ 酸配列 （ 800アミノ酸） を、 配列番号： 1に示す。
解析の結果、 配列番号： 2の塩基配列は、 メラノーマ由来の既知の腫瘍 抗原タンパク質の遺伝子とは相同性はなく、 異なる遺伝子であった。 WW W E n t r e zデータベースを使用し、 配列番号： 2に記載した塩基配 列の検索を行った結果、 本発明の塩基配列の一部分が、 WashU-Merck EST Projectにより解読され、 GENBANK に登録されている機能不明の 3種類の 遺伝子配列、 Accession No. R89163、 R62890. R00027と 90 %以上の高い 相同性を示すことが明らかになった。 No.R89163は配列 1893〜2267番、 R62 890は配列 2018~2389番、 R00027は配列 2024〜2510番に相当する。 しかし、 これらの配列は本発明の塩基配列の開始コ ドンより 3' 側の塩基配列であ ることから、 アミノ酸配列を決定することができない。
なお、 上記の塩基配列決定後、 プラスミ ド K3を E.coli JM109に導入し、 本発明の新規な腫瘍抗原タンパク質 c DN Aを含有する保存用の形質転換 体である E.coli JM109CK3)を調製した。 E.coli JM109CK3)は、 茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3号、 工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて いる （寄託日 ：平成 9年 5月 22日 ；寄託番号： FERM BP— 595
1) 0
さらに、 正常ヒ ト組織 （末梢血リンパ球） の c DNAライブラリー （GI BCO BRL社製） を前記と同様にスクリーニングしたところ、 約 2. 5 k b の c DN Aが組み込まれた組換えプラスミ ドがクローニングされ、 該 c D NAの塩基配列を決定したところ、 配列番号： 2の塩基配列の第 812位 (正常ヒ ト組織での第 812位は "T" である） が異なる以外は同一であ る cDNAが単離された。 従って、 本発明の腫瘍抗原タンパク質をコード する遺伝子を含む全長の遺伝子は、 癌細胞と正常ヒ ト組織で、 ほぼ同一の 遺伝子が発現していることが示唆された。
次に、 実施例 1と同様な方法で、 新規な腫瘍抗原タンパク質遗伝子の c DNAが組み込まれた組換えプラスミ ド K3と、 HLA-A2601の c DNAが 組み込まれた組換えブラスミ ドとを VA-13細胞にダブルトランスフユク ト した細胞を標的細胞として、 KE-4CTLが反応して産生した IFN-ァ量を、 参 考例 4の方法により定量した。 その結果を以下の表 2に示す。 表 2
標的細胞 KE-4CTLが産生した IFN-ァ量1〉 (pg/ml)
VA— 13細胞 + HLA-A2601 + K3 1439
VA— 13細胞 +HLA-A02Q12) +K3 10 _
1)： VA-13細胞にそれぞれの HLAをトランスフヱク トした細胞に対する KE - 4 CTLが産生した IFN-y量 （バックグラウンド） を差し引いた値
2)：比較のため異なったタイプの HLAをトランスフユク トした場合
(トランスフユク トした DN A量： BLA-A2601、 HLA- A0201が 200ng、 K3が 1
OOngの時のデータ） 実施例 4
腫瘍抗原べプチドの同定
実施例 1でクローニングした新規な腫瘍抗原タンパク質遺伝子の部分 c DN Aが組み込まれた組換えプラスミ ド 6D Iより、 Kilo- Sequence用 Del etion Kit (宝酒造社製）を用いて、 添付のプロ トコールに従って、 腫瘍抗 原タンパク質遗伝子の cDNAが様々な長さにデリーションされたプラス ミ ドを得た。 これらのプラスミ ドを大腸菌のエレク トロマックス DH 10 BZp 3TMセル (GIBCO BRL社）に導入し、 寒天培地のプレート上で培養し、 無作為に 50個のコロニーを選択した。 該コロニーよりプラスミ ド DNA を調製し、 電気泳動に付すことにより、 適当な長さのプラスミ ドを有する 5個のクローンを選択した。
実施例 1に記載の方法により、 VA-13細胞へ HLA-A2601 cDNAと前記 プラスミ ド DN Aをダブルトランスフヱク 卜し、 引き続いて、 該トランス フエクタントと KE-4CTLとを混合培養し、 参考例 4に記載の方法に従って、 培養液中の IFN-ァを定量した。 この結果、 配列番号： 2の塩基配列の 22 53番目以降が欠失したプラスミ ドのトランスフヱクタントには、 KE-4CT Lからの IFN-ァ誘導活性が認められなかった。 従って、 配列番号： 1のァ ミノ酸配列の 739番目の近傍以降の配列を有するぺプチドに KE-4CTLか らの IFN- 7誘導活性があると予想された。
次に、 配列番号： 1のアミノ酸配列の 730番目以降を 3アミノ酸ずつ ずらして 10アミノ酸残基のぺプチドを 21種類合成した。 これらのぺプ チドを、 HLA-A2601 c DN Aをトランスフヱク 卜した VA-13細胞にパルス して抗原提示させたこと以外は前記と同様な方法で、 培養液中の IFN-ァを 定量した。 この結果、 配列番号： 1の 「736~745」 、 「748〜7 57」 、 「 784〜 793」 のアミノ酸配列を有するぺプチドに IFN-ァ誘 導活性が認められた。
さらに、 これら 3種類のペプチドについて、 より強い IFN-ァ誘導活性を 有するぺプチドを同定するために、 N末端または C末端を 1ァミノ酸短く した 9ァミノ酸残基のぺプチドを合成し、 同様に IFN- r誘導活性を測定し たところ、 配列番号： 1の 「736〜744」、 「749〜757」 、 「7 85〜793」 のアミノ酸配列を有するぺプチドにより強い IFN-ァ誘導活 性が認められた。 その結果を表 3に示す。 表 3
パルスした細！^―ぺプチド― KE4-CTL細胞が産生した IFN-ァ量 (pg/ml)
VA-13/A2601 「736 744」 203
VA-13/A02012' T736-744J 44
VA-13/A2601 T749-757J 183
VA-13/A0201 「749~757」 89
VA-13/A2601 T785-793J 394
VA-13/A0201 T785-793J 102
1) VA- 13細胞に HLA-A2601 cDNAをトランスフヱク トした場合
2)対照として VA-13細胞に異なった HLA-A0201 cDNAを卜ランスフヱタ トし
表 3より、 これらのぺプチドが腫瘍抗原べプチドとして機能することが 示唆された。
また、 H L A分子に結合して提示される抗原べプチドの配列には規則性 (モチーフ） のあることが知られており、 HLA- A24の場合、 9アミノ酸残基 よりなる抗原ペプチドのうち、 2番目がチロシン、 9番目がイソロイシン、 ロイシン又はフヱニルァラニンがモチーフとなることが知られている （Ιπι munogenetics, 41 : 178-228, 1995) 。
そこで配列番号： 1に記載のアミノ酸配列より、 上記モチーフに相当す る 「6 9 0〜6 9 8」 のアミノ酸配列を有するペプチドを合成した。 そし て、 HLA-A2402 c D N Aをトランスフヱク 卜した VA-13細胞にパルスし、 前記と同様な方法で、 KE-4CTLからの IFN-ァ誘導活性を調べた。 結果を表 4に示す。 表 4
パルスした細胞 ― ペプチド ― KE4-CTL細胞が産生した IFN-ァ量（pg/ml)
VA-13 「690~698」 157
VA-13/A2402n T690-698J 269
VA-13/A02012) 「690~698」 166
DVA-13細胞に HLA-A2402 cDNAをトランスフユク 卜した場合
2)対照として VA-13細胞に異なった HLA-A0201 cDNAをトランスフヱク 卜し た場合 表 4より、 「6 9 0〜6 9 8」 のべプチドが、 腫瘍抗原べプチドとして 機能することが示唆された。
実施例 5
腫瘍抗原べプチドによる末梢血リンパ球からの C T Lの誘導
実施例 3で示された腫瘍抗原べプチドを用いて、 KE- 4の由来である癌患 者の末梢血リンパ球を in vitroで刺激して抗原特異的な C T Lが誘導でき るか検討した。 使用した腫瘍抗原ペプチドは、 前記実施例 3で得られた 「7 3 6〜7 4 4」 、 「7 4 9〜7 5 7」 、 「6 9 0〜6 9 8」 の配列を有す るべプチドである。 前記癌患者由来の末梢血からフィコール法によりリン パ球を分離して凍結保存していた末梢血リンパ球を起眠させ、 2 4穴のプ レートに約 2 x 1 0 6細胞/穴となるように移し、 1 0 % F C Sと IL- 2(10 OU/ml)を含む R P M 1 1 6 4 0培地で培養した。 培養液に前記腫瘍抗原 ぺプチドを 1 0 g Zm 1になるように加え、 末梢血リンパ球を刺激した。 1週間後、 X線照射 （50G y )した約 1 X 1 0 5個の末梢血リンパ球ととも に前記腫癢抗原べプチドを 1 0 g /m 1加えて、 2回目の刺激を行った。 さらに 1週間後、 3回目の刺激を同様に繰り返した。 「736〜744」、 「749〜757」 の配列を有するぺプチドにつ いては 3回目の刺激から 1週間後、 末梢血リンパ球を回収し、 D.D.Kharke vitchら著、 Int. J. Cancer, : 317(1994)に記載の方法に従って、 51Crで 標識された KE-4、 及び HLA-Aローカスが A2402及び A 2である食道癌細胞株 K E - 3を標的細胞として、 細胞傷害活性を測定した。 結果を表 5に示す。
表 5
効果細胞 標的細胞 傷害活性 （％)
「736~744」で刺激した KE-4 22.1
末梢血リンパ球 KE-3 3.7
「749~757Jで刺激した E-4 35.9
末梢血リンパ球 E-3 24.2
「 736〜 744」 の配列を有するペプチドで刺激した場合は、 KE-4は 強く傷害されたが、 陰性対照の KE-3は傷害されなかったことから、 KE-4特 異的な CTLが誘導されていることが示された。 また、 「749〜757」 の配列を有するぺプチドで刺激した場合は、 KE- 3に対する非特異的な細胞 傷害活性が認められたが、 KE-4に対してより強い細胞傷害活性が認められ たことから、 KE-4特異的な C T Lが誘導されていることが示唆された。
「 690〜 698」 の配列を有するぺプチドについては、 3回目の刺激 の後、 末梢血リンパ球を回収し、 10!¾ FCS、 50¾AIM-V (GIBCO BRL社製） 、 IL-2 (100U/ml) を含む RPMI-1640培地で培養を続けた。 その後、 前記と同 様の方法にて、 51Crで標識された KE- 4、 及び VA- 13細胞を標的細胞として 細胞傷害活性を測定した。 また、 HLA-Aローカスが A24のホモである健常人 の末梢血からリンパ球を分離し、 同様の方法にて51 Crで標識された KE-4、 及び HLA-Aローカスが A2601のホモである肺癌細胞株の QG-56細胞を標的細 胞として、 細胞傷害活性を測定した。 結果を表 6に示す。
表 6
効果細胞 標的細胞 傷害活性
「690~698」で刺激した KE-4 24. 7
癌患者末梢血リンパ球 VA-13 13. 8
「690~698」で剌激した KE-4 17. 7
健常人末梢血リンパ球 QG-56 11. 5
癌患者末梢血リンパ球及び健常人末梢血リンパ球を 「6 9 0〜6 9 8」 の配列を有するぺプチドで刺激することにより、 陰性対照である VA13細胞、 QG56細胞に対する非特異的な細胞傷害活性が認められたが、 KE-4に対して より強い細胞傷害活性が認められた。 以上の結果から、 KE- 4特異的な CTL が誘導されていることが示唆された。
発明の効果
本発明により腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原べプチドを用いた抗腫 瘍免疫を活性化するための医薬、 自己免疫疾患を治療するための医薬、 お よび腫瘍抗原タンパク質をコードする D N A等を含有する医薬を提供する ことができ、 また腫瘍または自己免疫疾患の診断方法を提供することがで さる。 ηχο 3JV sAq A 3 3jV "ID o^d ηχο εχν υχο J9S 3jy ηχο 3jy
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100 105 110
Gly Asp Ala Ser Ser Leu Ser lie Glu Glu Thr Asn Lys Leu Arg Ala
115 120 125
Lys Leu Gly Leu Lys Pro Leu Glu Val Asn Ala lie Lys Lys Glu Ala
130 135 140
Gly Thr Lys Glu Glu Pro Val Thr Ala Asp Val lie Asn Pro Met Ala 145 150 155 160
Leu Arg Gin Arg Glu Glu Leu Arg Glu Lys Leu Ala Ala Ala Lys Glu
165 170 175
Lys Arg Leu Leu Asn Gin Lys Leu Gly Lys lie Lys Thr Leu Gly Glu
180 185 190
Asp Asp Pro Trp Leu Asp Asp Thr Ala Ala Trp lie Glu Arg Ser Arg
195 200 205
Gin Leu Gin Lys Glu Lys Asp Leu Ala Glu Lys Arg Ala Lys し en Leu
210 215 220
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245 250 255
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Leu Glu Leu Gin Lys Gin Leu Glu Lys Gly Arg Arg Leu Arg Gin Leu
500 505 510
Gin Gin Leu Gin Gin Leu Arg Asp Ser Gly Glu Lys Val Val Glu lie
515 520 525
Val Lys Lys Leu Glu Ser Arg Gin Arg Gly Trp Glu Glu Asp Glu Asp
530 535 540
Pro Glu Arg Lys Gly Ala lie Val Phe Asn Ala Thr Ser Glu Phe Cys 545 550 555 560
Arg Thr Leu Gly Glu lie Pro Thr Tyr Gly Leu Ala Gly Asn Arg Glu
565 570 575
Glu Gin Glu Glu Leu Met Asp Phe Glu Arg Asp Glu Glu Arg Ser Ala
580 585 590
Asn Gly Gly Ser Glu Ser Asp Gly Glu Glu Asn lie Gly Trp Ser Thr
595 600 605
Val Asn Leu Asp Glu Glu Lys Gin Gin Gin Asp Phe Ser Ala Ser Ser
610 615 620
Thr Thr lie Leu Asp Glu Glu Pro lie Val Asn Arg Gly Leu Ala Ala 625 630 635 640
Ala Leu Leu Leu Cys Gin Asn Lys Gly Leu Leu Glu Thr Thr Val Gin
645 650 655
Lys Val Ala Arg Val Lys Ala Pro Asn Lys Ser Leu Pro Ser Ala Val
660 665 670
Tyr Cys lie Glu Asp Lys Met Ala lie Asp Asp Lys Tyr Ser Arg Arg
675 680 685 Glu Glu Tyr Arg Gly Phe Thr Gin Asp Phe Lys Glu Lys Asp Gly Tyr
690 695 700
Lys Pro Asp Val Lys lie Glu Tyr Val Asp Glu Thr Gly Arg Lys Leu 705 710 715 720
Thr Pro Lys Glu Ala Phe Arg Gin Leu Ser His Arg Phe His Gly Lys
725 730 735
Gly Ser Gly Lys Met Lys Thr Glu Arg Arg Met Lys Lys Leu Asp Glu
740 745 750
Glu Ala Leu Leu Lys lys Met Ser Ser Ser Asp Thr Pro Leu Gly Thr
755 760 765
Val Ala Leu Leu Gin Glu Lys Gin Lys Ala Gin Lys Thr Pro Tyr lie
770 775 780
Val Leu Ser Gly Ser Gly Lys Ser Met Asn Ala Asn Thr lie Thr Lys 785 790 795 800 配列番号： 2
配列の長さ ： 2527
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状 . 配列の種類： cDNA to mENA
ハイポセティカル配列： No
アンチセンス ： No
起源
生物名： ヒ 卜 (Homo sapiens) 組織の種類：食道癌組織
配列の特徴
特徴を表す記号： 5' im?
存在位置： 1. . 38
特徴を決定した方法： E 特徴を表す記号： CDS
存在位置 ： 39. . 2438
特徴を決定した方法： E 特徴を表す記号： 3' UTR
存在位置： 2439. . 2506
特徴を決定した方法： E 特徴を表す記号： polyA site
存在位置： 2507. . 2527
特徴を決定した方法： E
配列
GGTTCGGCGG CAGCCGGGCT CGGAGTGGAC GTGCCACTAT GGGGTCGTCC AAGAAGCATC 60 GCGGAGAGAA GGAGGCGGCC GGGACGACGG CGGCGGCCGG CACCGGGGGT GCCACCGAGC 120 AGCCGCCGCG GCACCGGGAA CACAAAAAAC ACAAGCACCG GAGTGGCGGC AGTGGCGGTA 180 GCGGTGGCGA ACGACGGAAG CGGAGCCGGG AACGTGGGGG CGAGCGCGGG AGCGGGCGGC 240 GCGGGGCCGA AGCTGAGGCC CGGAGCAGCA CGCACGGGCG GGAGCGCAGC CAGGCAGAGC 300 CCTCCGAGCG GCGCGTGAAG CGGGAGAAGC GCGATGACGG CTACGAGGCC GCTGCCAGCT 360 CCAAAACTAG CTCAGGCGAT GCCTCCTCAC TCAGCATCGA GGAGACTAAC AAACTCCGGG 420 CAAAGTTGGG GCTGAAACCC TTGGAGGTTA ATGCCATCAA GAAGGAGGCG GGCACCAAGG 480
AGGAGCCCGT GACAGCTGAT GTCATCAACC CTATGGCCTT GCGACAGCGA GAGGAGCTGC 540
GGGAGAAGCT GGCGGCTGCC AAGGAGAAGC GCCTGCTGAA CCAAAAGCTG GGGAAGATAA 600
AGACCCTAGG AGAGGATGAC CCCTGGCTGG ACGACACTGC AGCCTGGATC GAGAGGAGCC 660
GGCAGCTGCA GAAGGAGAAG GACCTGGCAG AGAAGAGGGC CAAGTTACTG GAGGAGATGG 720
ACCAAGAGTT TGGTGTCAGC ACTCTGGTGG AGGAGGAGTT CGGGCAGAGG CGGCAGGACC 780
TGTACAGTGC CCGGGACCTG CAGGGCCTCA CCGTGGAGCA TGCCATTGAT TCCTTCCGAG 840
AAGGGGAGAC AATGATTCTT ACCCTCAAGG ACAAAGGCGT GCTGCAGGAG GAGGAGGACG 900
TGCTGGTGAA CGTGAACCTG GTGGATAAGG AGCGGGCAGA GAAAAATGTG GAGCTGCGGA 960
AGAAGAAGCC TGACTACCTG CCCTATGCCG AGGACGAGAG CGTGGACGAC CTGGCGCAGC 1020
AAAAACCTCG CTCTATCCTG TCCAAGTATG ACGAAGAGCT TGAAGGGGAG CGGCCACATT 1080
CCTTCCGCTT GGAGCAGGGC GGCACGGCTG ATGGCCTGCG GGAGCGGGAG CTGGAGGAGA 1140
TCCGGGCCAA GCTGCGGCTG CAGGCTCAGT CCCTGAGCAC AGTGGGGCCC CGGCTGGCCT 1200
CCGAATACCT CACGCCTGAG GAGATGGTGA CCTTTAAAAA GACCAAGCGG AGGGTGAAGA 1260
AAATCCGCAA GAAGGAGAAG GAGGTAGTAG TGCGGGCAGA TGACTTGCTG CCTCTCGGGG 1320
ACCAGACTCA GGATGGGGAC TTTGGTTCCA GACTGCGGGG ACGGGGTCGC CGCCGAGTGT 1380
CCGAAGTGGA GGAGGAGAAG GAGCCTGTGC CTCAGCCCCT GCCGTCGGAC GACACCCGAG 1440
TGGAGAACAT GGACATCAGT GATGAGGAGG AAGGTGGA TCCACCGCCG GGGTCCCCGC 1500
AGGTGCTGGA GGAGGACGAG GCGGAGCTGG AGCTGCAGAA GCAGCTGGAG AAGGGACGCC 1560
GGCTGCGACA GTTACAGCAG CTACAGCAGC TGCGAGACAG TGGCGAGAAG GTGGTGGAGA 1620
TTGTGAAGAA GCTGGAGTCT CGCCAGCGGG GCTGGGAGGA GGATGAGGAT CCCGAGCGGA 1680
AGGGGGCCAT CGTGTTCAAC GCCACGTCCG AGTTCTGCCG CACCTTGGGG GAGATCCCCA 1740
CCTACGGGCT GGCTGGCAAT CGCGAGGAGC AGGAGGAGCT CATGGACTTT GAACGGGATG 1800
AGGAGCGCTC AGCCAACGGT GGCTCCGAAT CTGACGGGGA GGAGAACATC GGCTGGAGCA I860
CGGTGAACCT GGACGAGGAG AAGCAGCAGC AGGATTTCTC TGCTTCCTCC ACCACCATCC 1920
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Claims

請 求 の 範 囲
1 . 配列番号： 1のアミノ酸配列を有するタンパク質、 又はそのアミノ 酸配列のうち 1もしくは複数のアミノ酸残基が置換、 欠失もしくは付加さ れた変異タンパク質、 をコードする D N A (ただし、 該タンパク質および 変異タンパク質はその細胞内分解により、 主要組織適合遺伝子複合体（M H C )クラス I抗原と結合し得るぺプチド断片であってその結合状態で T 細胞により認識され得るペプチド断片、 を生じ得るものである） 。
2. 配列番号： 2の塩基配列からなる D N A、 又はその D N Aとストリ ンジヱントな条件下でハイブリダィズする D N A変異体 （ただし、 該 D N Aおよび D N A変異体が発現して生産されるタンパク質は、 その細胞内分 解により、 MHCクラス I抗原と結合し得るぺプチド断片であってその結合状 態で T細胞により認識され得るぺプチド断片、 を生じ得るものである）。
3. 請求項 1または 2記載の D N Aを有効成分として含有する医薬。
4. 請求項 1または 2記載の D N Aを有する発現プラスミ ド。
5. 請求項 4記載の発現プラスミ ドによって形質転換された形質転換体 c
6. 請求項 1または 2記載の D N Aを発現して生産される腫瘍抗原タン パク質。
7. 請求項 6記載のタンパク質の一部からなるペプチドであって、 M H Cクラス I抗原と結合して T細胞により認識され得る腫瘍抗原べプチド、 または機能的に同等の特性を有するその誘導体。
8. 配列番号： 1のアミノ酸配列の第 7 4 9位〜第 7 5 7位、 第 7 3 6 位〜第 7 4 4位、 第 7 8 5位〜第 7 9 3位、 又は第 6 9 0位〜第 6 9 8位 のァミノ酸配列の全部又は一部を有するぺプチドである、 請求項 7記載の 腫瘍抗原べプチド、 または機能的に同等の特性を有するその誘導体。
9. 請求項 6記載の腫瘍抗原タンパク質、 請求項 7または 8記載の腫瘍 抗原べプチド、 または機能的に同等の特性を有するその誘導体を有効成分 として含有する医薬。
10. 請求項 6記載の腫瘍抗原タンパク質、 または請求項 7もしくは 8 記載の腫瘍抗原べプチドに特異的に結合する抗体。
11. 配列番号： 2の塩基配列からなる DNAのコーディング配列また は 5'ノンコーディング配列の中の DNA断片と相補的な配列をもつ 8塩 基以上からなる DNA若しくはその DNAに対応する RNA、 またはそれ らの化学的修飾体。
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