WO1997043631A1

WO1997043631A1 - Sensor zum nachweis von proteinen und verfahren zu dessen herstellung

Info

Publication number: WO1997043631A1
Application number: PCT/EP1997/001501
Authority: WO
Inventors: Thomas Wessa; Hans Sigrist
Original assignee: Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Current assignee: Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Priority date: 1996-05-10
Filing date: 1997-03-25
Publication date: 1997-11-20
Anticipated expiration: 1998-11-10
Also published as: EP0897536A1; DE19618812C1

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Sensor zum Nachweis von Proteinen nach dem Prinzip der Schlüssel-Schloß-Reaktion bestehend aus einem Sensorkörper, von dem eine Oberfläche mit einer Polymerschicht überzogen ist, wobei an die Polymerschicht die Rezeptormoleküle der Schlüssel-Schloß-Reaktion gebunden sind. Aufgabe der Erfindung ist es nun, den Sensor so auszugestalten, daß eine einfache Herstellung bei guter Reproduzierbarkeit gegeben ist. Gelöst wird diese Aufgabe dadurch, daß die Bindung zwischen dem Polymer und den Rezeptormolekülen durch ein photoreaktives Molekül vermittelt wird, welches kovalent am Lysin eines Rezeptormoleküls gebunden ist und in eine C-H-Bindung des Polyimids insertiert.

Description

Sensor zum Nachweis von Proteinen und Verfahren zu dessen Her¬ stellung

Die Erfindung betrifft einen Sensor zum Nachweis von Proteinen nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1, wie er aus der DE 44 18 926 bekannt ist und ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Es gibt bislang einige etablierte analytische Verfahren um auch Biomoleküle zu analysieren, die sich aber meist aufwendi¬ ger und teurer Labormethoden bedienen (HPLC, GC-MS) . Eine ähn¬ lich preisgünstige Alternative zu der hier beschriebenen Me¬ thode stellen hingegen die sogenannten Immunoassays dar. Diese basieren ebenfalls auf der Bindung eines Analyten an einen An¬ tikörper, benutzen aber zwangsläufig ein indirektes Verfahren für den Nachweis dieser Bindung. Dabei wird der Probe ein ra¬ dioaktiv-, fluoreszenz- oder enzymmarkiertes analyt-analoges Molekül zugesetzt, das mit dem Analyt um die Antikörperbinde¬ stellen konkurriert. Zur Auswertung ist damit ein Verfahren nötig, das aus mehreren Reagenzienzuführungen, Inkubations¬ und Waschgängen besteht; die Gesamtzeit pro Assay beträgt typischerweise eine Stunde. Eine On-line-Messung ist damit ausgeschlossen.

Darüber hinaus wurden weitere Immunosensorprinzipien in der Literatur beschrieben. Nach Meinung vieler Autoren weichen sie immer noch stark von der Idealvorstellung eines preisgün¬ stigen, genügend empfindlichen zukünftigen Immunosensors ab: In mehreren Übersichtsartikeln wurden solche Methoden bereits aufgrund ihrer hohen Kosten (Oberflächen-Plasmonen-Resonanz, Gitterkoppler, Differentielles Interferometer) bzw. wegen ih¬ rer niedrigen Empfindlichkeit (Potentiometrischer Immunosen¬ sor) kritisiert, während der Immunosensor auf Oberflächenwel¬ len (OFW) -Basis bislang favorisiert wurde.

Aus der EP 0 361 729 A2 ist ein Verfahren der e. g. Art zur Erzeugung eines Sensors bekannt, welcher eine Schutzschicht zur räumlichen Trennung von Substrat und wäßriger Analytlösung - 2 - aufweist. Dieser Sensor weist bei einer Arbeitsfrequenz >100 MHz Dämpfungen zwischen 30 und 40 dB auf, wodurch eine hohe Störanfälligkeit bei starkem Rauschen verursacht wird.

Der Nachteil des in der DE 44 18 926 beschriebenen Sensors be¬ steht darin, daß die Herstellung einen hohen Arbeitsaufwand bei einem hohen Gefährdungspotential erfordert und daß die Sensoreigenschaften eine starke Streuung aufweisen.

Aufgabe der Erfindung ist es nun, einen Sensor der e. g. Art so auszugestalten, daß eine einfache Herstellung bei guter Re¬ produzierbarkeit gegeben ist.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die Merkmale der Pa¬ tentansprüche 1 und 3. Die Unteransprüche beschreiben vorteil¬ hafte Ausgestaltungen des Verfahrens.

Der Sensor ermöglicht die spezifische Messung der Anwesenheit bzw. der Konzentration verschiedener Biomoleküle wie Proteine, Enzyme sowie komplexerer Makromoleküle - Teile des Erbgutes (DNS, RNS) oder verschiedene Krankheitserreger (z. B. Viren oder Bakterien) - durch Direktnachweis der Bindung an spezifi¬ sche Antikörper in wäßrigen Lösungen. Mit dieser Methode sind damit keine zeitaufwendige Verfahren mehr notwendig, die auf die Konkurrenz zwischen gelabelten und ungelabelten Analyten beruhen (indirektes Nachweisverfahren bei Immunoassays) .

Bei dem Sensor handelt es sich um einen massensenεitiven Sen¬ sor, der die bei der Sorption des Analyten verursachten Schallgeschwindigkeitsänderung von akustischen Oberflächenwel¬ len (OFW) nutzt, um auf die sorbierte Masse des Analyten und somit auf dessen Anwesenheit bzw. Konzentration in der Lösung zurückzuschließen.

Um eine analytenspezifische Sorptionsreaktion zu erhalten, sind selektive Beschichtungen auf dem OFW-Substrat notwendig. Besondere Flexibilität ist hierbei dann gewährleistet, wenn diese Beschichtungen aus immunochemisch aktiven Molekülen wie Antikörpern oder Antigenen bestehen. Bei dem erfindungsgemäßen Sensor handelt es sich also um einen echten Immunosensor der seine Daten in-situ ermittelt und damit eine echte On-line- Meßmethode für Bioanalytik ermöglicht.

Gegenüber der herkömmlichen Bioanalytik bietet der beschrie¬ bene Sensor eine Reihe von Vorteilen:

Kostengünstig: 4 - 10 DM pro Stück

Empfindlichkeit wie Bio-Assay

- auf beliebige Biosysteme übertragbar

sehr gute Langzeitstabilität

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Beispiels mit Hilfe der Figuren näher erläutert.

Fig. 1 zeigt den Verlauf einer enzymatischen Glukosezersetzung auf einem Sensor und die

Fig. 2 zeigt den Verlauf von Immunoreaktionen für unterschied¬ liche Antikörperkonzentrationen.

Die Fig. 3 zeigt den TRIMID Gehalt des Rezeptorproteins und

die Fig. 4 dessen Enzymaktivität anhand von Absorptionsspek¬ tren.

Die Fig. 5 zeigt die Rezeptoranbindung an das Polymer Polyi- mid.

Der Sensor in unserem Beispiel arbeitet auf der Basis akusti¬ scher Oberflächenwellen. Ein solcher Sensor wird in der DE 43 19 215 beschrieben. Der Sensorkörper wird auf einer Seite zunächst mit einem Poly¬ mer, in diesem Beispiel einem aromatischen Polyimid beschich¬ tet. Die Beschichtung der Oberfläche des Sensorkörpers mit Po¬ lyimid erfolgt wie in der DE 44 18 926, S. 3, Zeilen 11 bis 55 beschrieben. Auf die polyimidiserte Sensoroberfläche werden anschließend 10 μl des geeignet verdünnten, modifizierten Re¬ zeptormoleküls gegeben.

Wie in Fig. 5 zu erkennen ist, kommt es nur zur Immobilisation von photomarkierten Enzym auf der polyimidisierten Sensorober¬ fläche, wenn der Wassergehalt in der Proteinmatrix niedrig ge¬ halten wird. Bei einem zu hohen Wassergehalt im Protein kommt es bei Belichtung zur Reaktion des Carbens mit Wasser, so daß die Insertierungsreaktion zwischen Polyimid und Protein in den Hintergrund gedrängt wird und die Anbindung an die Sensorober- flache ausbleibt. Aus diesem Grund werden die Sensoren 20-40 min in einem Vakuumtrockenschrank bei Raumtemperatur und einem Druck < 10 mbar behandelt. Optimal ist eine 30 minütige Trock¬ nung bei 1 mbar. Der daraus resultierende eingetrocknete En¬ zymfilm wurde anschließend mit einer Quecksilberdampflampe be¬ lichtet. Zur Erzeugung der Triplettcarbene ist eine Belichtung des Enzymfilms bei 348 nm und 0,7 mW/cm² für 30 min notwendig.

Zur Immobilisierung wurde mit TRIMID modifizierte Glucoseoxi- dase (T-Glucoseoxidase, T-GOD) mit einem Proteingehalt von 1.92 mg/ml verwendet. Der TRIMID-Gehalt betrug 6.5 mol TRIMID pro mol Glucoseoxidase.

Voruntersuchungen zeigten, daß die T-GOD-Lösung nicht unver¬ dünnt auf dem Sensor abgeschieden werden konnte. Bei einer zu hohen Proteinkonzentration kommt es zu hohen Eingangsdämpfun¬ gen und es kann keine akustische Welle beobachtet werden.

Als Ergebnis dieser Voruntersuchungen wurde die T-Glucose- oxidaselösung im Verhältnis 1:125 mit Phosphatpuffer (1 : 100) verdünnt, 10 μl dieser Lösung auf den Sensor gebracht und das Enzym, wie oben beschrieben, immobilisiert (vakuumbehandelt, belichtet) .

Mittels eines enzymatischen Assays konnte die auf der Sen¬ soroberfläche abgeschiedene Menge an Enzym spektroskopisch be¬ stimmt werden.

Zur Durchführung der Enzymaktivitätsüberprüfung sind folgende Lösungen notwendig:

Lösung 1

53 mg 3 ,5-Dichlor-2-Hydroxy-Benzosulphonsäure werden in Wasser (bidest.) gelöst und mit 1 M NaOH auf pH=7 gebracht. Dann wer¬ den 3 mg Peroxidase (Meerrettich) zugegeben und auf 10 ml mit Wasser aufgefüllt.

Lösung 2

16.2 mg 4-Aminophenazon werden in 10 ml Wasser gelöst.

Lösung 3

1.4 g Na₂HP0₄ * 2 H₂0 und 700 mg NaH2Pθ4 sowie 37.2 mg EDTA werden in 100 ml Wasser gelöst.

Lösung 4

1.8 g -D-Glucose werden in 10 ml Wasser gelöst.

In eine Küvette werden dann 1.55 ml von Lösung 3 0.2 ml von Lösung 4 0.2 ml von Lösung 1 50 μl von Lösung 2

gegeben und nach guter Durchmischung (Vortex) der Hintergrund bei 520 nm vermessen. Anschließend gibt man 50 μl einer ange¬ messen verdünnten GOD-Lösung hinzu und mißt die Absorptionsän¬ derung bei 520 nm (Ausbildung eines roten Farbstoffs) inner¬ halb der ersten Minuten. Bei hohen Glucoseoxidasekonzentratio- nen genügen 2 Minuten, bei den auf dem Sensor abgeschiedenen Mengen an Antigen wurde 10-20 Minuten lang gemessen.

Der Extinktionskoeffizient des entstehenden Farbstoffs beträgt 13300 (M cm)^-1. Damit ist es möglich die spezifische Enzymak¬ tivität der Glucoseoxidaselösung zu bestimmen. Diese wird in "units/mg" angegeben, wobei eine "unit" wie folgt definiert ist: Eine " unit" oxidiert l μmol -D-Glucose pro Minute bei pH=5.1 (T=35°C).

Da zur Erzeugung von 1 mol des roten Farbstoffs 2 mol Wasser¬ stoffperoxid (aus der Glucosespaltung) notwendig sind, ent¬ spricht die gemessene Zunahme des Chromophors 0.5 units pro Minute.

Die Zunahme der Absorption bei 520 nm ist exemplarisch für drei verschiedene Sensoren in Fig. 1 angegeben. Daraus ergibt sich ein Mittelwert der Steigungen von 0.0021 Absorptionsein¬ heiten pro Minute. Ein Vergleich mit der Enzymaktivität der T- GOD-Stammlösung zeigt, daß diese Absorptionszunahme einer Pro¬ teinmasse auf dem gesamten Sensor von 18.5 ng entspricht.

Die Bestimmung der Sensorempfindlichkeit sowie der Nachweis¬ grenze für polyklonale Antikörper gegen Glucoseoxidase er¬ folgte durch Variation der Antikörpermenge im Analytstrom.

Dazu wurden die Sensoren mit T-Glucoseoxidase über die be¬ schriebene photoinitiierte Reaktion beschichtet und zunächst mit Rinderserumalbumin (4 mg/ml) gespült, um die unspezifi¬ schen Bindungstellen zu blockieren. Da die Sensoren im Durch¬ fluß mit dem Protein beprobt wurden, zeigten sie unterschied¬ liche Abscheidungsgeschwindigkeiten, die dann aber alle zu ei¬ ner (innerhalb eines Fehlerbereichs von 10 %) Frequenzänderung von 35 kHz gelangten.

Die so vorbehandelten Sensoren wurden dann einzeln mit Anti¬ körperlösung beprobt, wobei der Analyt - polyklonale Antikör- per gegen Glucoseoxidase - im Kreislauf über die Sensoren ge¬ leitet wurde. Dabei wurden jeweils unterschiedliche Antikör¬ permengen in 5 ml Phosphatpuffer gelöst und über die Sensoren geleitet. Die Konzentrationsreihe, die in Auszügen in Fig. 2 dargestellt ist, beinhaltete einen Bereich von 2 - 200 μg/ml Antikörper (entspricht 10-1000 μg) .

Es sind verschiedene Frequenzabnahmen sowie unterschiedliche Anfangsgeschwindigkeiten der Immunoreaktionen zu erkennen.

Die Änderung der Resonanzfrequenz des Oszillators wurde gegen die Antikörpermenge im Analytstrom aufgetragen. Die Steigung der Gerade gibt die Sensorempfindlichkeit wieder, die zu 58.8 Hz/μg bestimmt wurde.

Um die Korrelation zwischen Antikörpermenge und Reaktionsge¬ schwindigkeit zu bestimmen, wurde für jede Messung die An¬ fangsgeschwindigkeit der Immunoreaktion ermittelt. Aus den Meßpunkten innerhalb der ersten Minute nach Analytzugabe konnte durch lineare Regression die Frequenzabnahme pro Zeiteinheit berechnet werden. Die Korrelationskoeffizienten waren bei allen ausgewerteten Kurven deutlich größer als 0.98.

Die so ermittelten Anfangsgeschwindigkeiten korrelieren mit der zugegebenen Antikörpermenge. Es resultiert ein deutlich linearen Zusammenhang zwischen den beiden Größen (r = 0.9822). Die Steigung der Regressionsgerade beträgt 4.92 Hz/(sμg) .

Um die Nachweisgrenze für polyklonale Antikörper gegen Gluco¬ seoxidase zu bestimmen, geht man wie folgt vor. Die Empfindlichkeit beträgt 58.8 Hz/μg, der Achsenabschnitt wurde mit 27.1 kHz bestimmt. Mit diesen Werten kann unter Ein- bezug des dreifachen Rauschsignals der Sensoren (120 Hz) , die Nachweisgrenze für polyklonale Antikörper gegen Glucoseoxidase zu 2 μg bzw. 13.6 pmol bestimmt. Da die jeweilige Antikörper¬ menge in 5 ml Phosphatpuffer eingewogen wurde, enspricht die- - 8 -_. ser Wert einer minimal detektierbaren Konzentration von 2.7 nmol/1.

Das beschriebene Beschichtungsverfahren kann auch auf andere Sensor- bzw. Meßprinzipien übertragen werden. Beispielsweise können die Sensorchips des Optischen Gitterkopplers in glei¬ cher Weise mit modifizierten Rezeptormolekülen beschichtet werden.

Als mögliche Rezeptormoleküle können Enzyme, Antigene und An¬ tikörper sowie Nukleinsäuren verwendet werden.

Ein Beispiel für eine Beschichtung ist an dem Antigen Gluco¬ seoxidase gezeigt, das direkt mit 3-Trifluoromethyl-3-(m- isothiocyanophenyl) -diazirin (TRIMID) umgesetzt wurde, um so zu einem photoreaktiven Protein zu gelangen. Den Antikörper selbst mit TRIMID zu modifizieren ist prinzipiell ebenso mög¬ lich, aber kostenintensiver.

Der Syntheseweg konnte nicht direkt von dem literaturbekannten T-BSA auf T-GOD übertragen werden, da Glucoseoxidase das Coen- zym FAD enthält, das nicht kovalent an das Enzym gebunden ist. Durch die Umsetzung von GOD mit TRIMID bei pH 11.4 mittels In¬ kubation bei 50°C wurde Glucoseoxidase zwar mit TRIMID modifi¬ ziert, das Coenzym aber war abgetrennt, was durch das UV-Spek¬ trum nachgewiesen wurde. Es konnte eine Schulter bei 348 nm (TRIMID) festgestellt werden, die FAD-Peaks bei 375 bzw. 450 nm waren nicht mehr zu erkennen.

Untersuchungen haben gezeigt, daß die Inkubation bei 50°C zur Abtrennung des Coenzyms führt, die Behandlung des Enzyms bei pH=11.4 diese Dissoziation jedoch nicht herbeiführt.

T-GOD wurde deshalb nach folgender Vorschrift hergestellt:

18 mg Glucoseoxidase und 1.27 g -D-Glucose wurden in 0.1 Vol-% TEA (in Wasser, pH = 11.4) gelöst und die resultierende Lösung mit reinem TEA auf einen pH von 10.4 eingestellt.

Zugabe von 170 μl TRIMID (29 μmol/1) in Chloroform

30 see im Ultraschallbad beschallen, wobei eine milchig gelbe

Suspension entstand

2 Stunden bei 37°C im Wasserbad inkubieren

über eine Sephadex G-25-Säule in 1.5 mM NaCl, 0.05 mM Natrium¬ phosphatpuffer (pH=7.4) Chromatographieren .

Eine Bestimmung der Proteinkonzentration ist mit der Methode nach Lowry möglich. Dazu wurde ein speziell vorbereiteter BSA- Standard als Referenz vermessen und die Extinktionen des T-GOD darauf bezogen.

Für diese Untersuchung war eine Stammlösung aus 0.5 ml 2%-iger CuS0₄-Lösung, 0.5 ml 2%-iger Tartratlösung und 49 ml 2%-iger Na2Cθ3~Lösung in 0.1 M NaOH notwendig. Um die Proteinkonzen¬ tration der Fraktionen 12 und 13 zu bestimmen, wurden 100 μl mit PBS (1:100) auf 1 ml verdünnt und 6 Proben hergestellt, indem jeweils 10 μl, 20 μl und 30 μl auf 200 μl mit PBS (1:100) verdünnt wurden (Doppelbestimmung). Zu diesen Proben kam je 1 ml der Stammlösung hinzu, das Gemisch wurde 10 min stehen gelassen.

Anschließend erfolgte die Zugabe von 100 μl 0.5 N Folinlösung, die ein Extinktionsmaximum bei 578 nm erzeugt, was nach 30 min vermessen werden konnte. Mit Hilfe des BSA-Standards konnte anschließend die Proteinmenge von T-GOD errechnet werden; es ergab sich eine Proteinmassenkonzentration von 4.22 mg/ml.

Der Trimidgehalt eines Proteins kann durch den Extinktionsun¬ terschied einer Probe vor und nach dem Belichten bei 348 nm überprüft werden. Bei Glucoseoxidase stellt sich das Problem, daß die FAD-Moleküle in diesem Bereich ebenfalls Licht absor- bieren, was den TRIMID-Peak überdeckt. Bei der Bestimmung des TRIMID-Anteils in T-GOD wurde die Tatsache ausgenutzt, daß das FAD nach einer Inkubation bei erhöhter Temperatur vom Enzym abgetrennt wird. Da der FAD-Peak die Absorptionsbande von TRI¬ MID überlagert, wurde zur Detektion von TRIMID zunächst das FAD abgetrennt, indem das Protein (jeweils 500 μl) 2 h bei 50° C inkubiert und anschließend die Lösung über eine PDIO-Säule chromatographiert wurde. In der Enzymfraktion war danach nur noch der Proteinpeak bei 280 nm erkennbar.

Die Proteinfraktion wurde dann in der Küvette 2 mal je 10 min belichtet und nach jeder Belichtung ein Absorptionsspektrum aufgenommen. Man erkennt in Fig. 3 deutlich eine Veränderung der Absorption zwischen 340 nm und 400 nm, also im Bereich der TRIMID-Bande.

Der Gehalt an kovalent gebundenem TRIMID betrug 8 + 2 mol TRI¬ MID pro mol Glucoseoxidase.

Die enzymatische Aktivität des modifizierten Proteins konnte spektroskopisch mittels des oben beschriebenen enzymatischen Assays ermittelt werden. Dazu wurden 50 μl T-GOD, die 8.73 μg Protein enthielten untersucht.

Mit dieser Methode wurde die enzymatische Aktivität der ver¬ wendeten Glucoseoxidaselösungen bestimmt. In Fig. 4 ist die Kinetik der enzymatischen Katalyse der Stammlösung (GOD) sowie die des modifizierten Enzyms (T-GOD) dargestellt.

Durch den linearen Teil der Kurve wurde mittels linearer Re¬ gression jeweils eine Gerade bestimmt. Diese diente als Kali¬ briergerade zur Detektion der enzymatischen Aktivität der je¬ weiligen Glucoseoxidase auf dem Sensor.

Die Bestimmung der Absorptionszunahme mittels linearer Regres¬ sion ergab für T-GOD einen Wert von 0.989 min^-1. Mit Hilfe des Lambert-Beer'sehen Gesetzes kann daraus die spezifische En- zymaktivität der modifizierten Glucoseoxidase mit 34.92 units/mg bestimmt werden. Im Vergleich dazu besitzt die nicht modifizierte Glucoseoxidase einen Wert von 87.59 units/mg.

Um die Anbindung von T-GOD auf einer Oberfläche und im spe¬ ziellen an Polyimid zu beobachten, wurde das erzeugte T-GOD mit [¹⁴C] markiert. Dazu wurde die Glucoseoxidase zunächst re- duktiv methyliert und anschließend auf einer polyimidisierten Oberfläche immobilisiert.

Bei der reduktiven Methylierung werden Aminofunktionen mit Formaldehyd umgesetzt und die entstehenden Schiffschen Basen reduziert. Diese hochspezifische Reaktion greift nur die -Ami- nogruppen der Lysineinheiten im Protein sowie den N-Terminus in der Aminosäuresequenz an. Um eine Denaturierung durch Zer¬ störung der Disulfidbrücken sowie die sofortige Reduktion des Formaldehyds zu vermeiden, wird als mildes Reduktionsmittel Natriumcyanborhydrid verwendet, was zu N,N-Dimethylderivaten führt. Es resultiert eine nahezu vollständige Umsetzung bei Einsatz des sechsfachen Überschusses an Formaldehyd, bezogen auf die Proteinmasse.

Da die reduktive Methylierung in HEPES-Puffer (pH=7.5) ab¬ läuft, wurde 1 ml T-GOD (4.22 mg/ml) über einer PDIO-Säule um¬ gepuffert und die Proteinfraktion zur radioaktiven Markierung verwendet. Dabei wurde wie folgt vorgegangen:

800 μl dieser Proteinfraktion wurden in ein lichtgeschütztes Reaktionsgefäß gebracht (Schutz der TRIMID-Gruppe) Zugabe von 6.5 μl [¹⁴C]-Formaldehyd (=200 nmol) , mit einer Ra¬ dioaktivität von 11.6 μCi Zugabe von 100 μl NaCNBH₃, (=240 mmol/1) auffüllen mit HEPES-Puffer auf 1 ml 3 h rühren bei Raumtemperatur das Produkt wurde über einer PDIO-Säule chromatographiert, um überschüssiges Formaldehyd abzutrennen. Die T-GOD-Fraktion des radioaktiv markierten Enzyms wurde wie oben beschrieben auf den Proteingehalt untersucht. Es ergab sich eine Proteinkonzentration von 0.915 mg/ml.

Um den Grad der radioaktiven Modifizierung von T-GOD zu be¬ stimmen, wurden jeweils 5 μl der einzelnen Fraktionen der [¹⁴C]-T-GOD-Synthese mit 5 ml Szintillationslösung (eine Mi¬ schung aus 1080 ml Toluol p.a., 5.4 g 2,5-Diphenyloxazol (PPO) , 0.2 g 2,2 '-p-Phenyl-bis-5-Phenyloxazol (POPOP) , 920 ml Triton und 40 ml Eisessig) vermischt (Vortex) und die -Strah¬ lung mit einem Szintillationszähler bestimmt.

In der Proteinfraktion wurde eine Aktivität von 2793 dpm (dpm=decompositions per minute) gefunden. Die Korrelation die¬ ser Werte mit den Ergebnissen der Proteinbestimmung nach Lowry des radioaktiv markierten Proteins ergab 597 dpm/μg Protein.

Die enzymatische Aktivität der radioaktiv markierten Protein¬ fraktion wurde wiederum mittels des enzymatischen Assays be¬ stimmt. Dazu wurden 20 μl der Proteinfraktion mit HEPES auf 200 μl verdünnt und von 50 μl dieser Lösung (= 4.6 μg) die en¬ zymatische Aktivität bestimmt.

Die Auswertung ergab eine Absorptionszunahme von 0.27 min^-1, was einer spezifischen Enzymaktivität von 18.19 units/mg ent¬ spricht. Das bedeutet, daß selbst nach zwei Modifikationen des Proteins die enzymatische Aktivität noch vorhanden ist.

Um die Ankopplung des Proteins an eine polyimidisierte Ober¬ fläche zu beobachten, wurden Deckplättchen aus Glas polyimidi- siert, anschließend mit [¹⁴C]-T-GOD beschichtet und die Radio¬ aktivität gemessen. Die Polyimidisierung von hydrophilen Ober¬ flächen ist neben anderen Methoden eine wichtige Grundlage für Immobilisationen auf akustoelektrischen Bauelementen.

Auf die polyimidisierten Glasplättchen wurden 30-50 μl des ra¬ dioaktiv markierten Enzyms aufgebracht, nach einer definierten Einwirkzeit belichtet und anschließend gewaschen. Als Kon- trollexperiment wurden analog behandelte, jedoch unbelichtete Plättchen mitgeführt.

Die Waschprozedur bestand aus fünfmaligem Spülen der Plättchen mit einer Lösung aus 50 mM PBS, 150 mM NaCl sowie 0.02 Vol-% TWEEN 20. Zur Bestimmung der Radioaktivität wurden die Abdeck- plättchen in die Szintillationsröhren gebracht, mit 5 ml Szin- tillationslösung bedeckt und nach kurzem Mischen (Vortex) die -Strahlung der polyimidisierten Glasträger bestimmt. In Fig. 5 ist zu erkennen, daß die Belichtung nach 30 min Einwirken keine Anbindung an das Polyimid bewirkt. Die Strahlung dieser Glasplättchen liegt etwa in der gleichen Größenordnung wie die der unbelichteten Kontrollproben. Erst nach wesentlich länge¬ ren Einwirkzeiten vor der Belichtung bzw. partielle Trockung durch Anlegen eines Vakuums, was einen völlig eingetrockneten Proteinfilm zur Folge hatte, kommt es zur kovalenten Anbindung des Proteins an das Polyimid, was durch die deutlich höhere Radioaktivität der entsprechenden Glasträger zu erkennen ist.

Eine Photoimmobilisation von T-GOD auf Polyimid ist folglich möglich, sofern nur wenig Wasser in der Proteinmatrix vorhan¬ den ist. Bei Anwesenheit von Wasser ist der Modifizierungsgrad von T-GOD mit TRIMID zu gering, so daß alle durch Belichtung erzeugten Carbene mit Wasser abreagieren und es zu keiner meßbaren Anbindung an die Oberfläche kommt. Weiterhin zeigen diese Untersuchungen, daß die gewählte Waschprozedur geeignet ist, unspezifisch anhaftende Proteinmoleküle von der polyimi¬ disierten Oberfläche zu entfernen sowie Restradioaktivität auszuwaschen.

Claims

Patentansprüche:

1. Sensor zum Nachweis von Proteinen nach dem Prinzip der Schlüssel-Schloß Reaktion bestehend aus einem Sensorkörper, von dem eine Oberfläche mit einer Polymerschicht überzogen ist, wobei an die Polymerschicht die Rezeptormoleküle der Schlüssel-Schloß Reaktion gebunden sind, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die Bindung zwischen dem Polymer und den Re¬ zeptormolekülen durch ein photoreaktives Molekül vermittelt wird, welches kovalent am Rezeptormolekül gebunden ist und in eine C-H-Bindung des Polymers insertiert.

2. Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das photoreaktive Molekül 3-Trifluoromethyl-3-(m-isothiocyano- phenyl) -diazirin (TRIMID) ist.

3. Verfahren zum Beschichten von Sensoren gemäß einem der An¬ sprüche 1 oder 2, mit Proteinen, wobei die Oberfläche des Sensors modifiziert wird und wobei auf der Sensoroberfläche eine silanhaltige Promoterschicht aufgebracht und daran eine Polymerschicht angebunden wird, gekennzeichnet durch fol¬ gende Verfahrensschritte: a) modifizieren der Proteine durch Anbinden von carbener- zeugenden Molekülen an die Lysineinheiten der Aminosäu¬ resequenzen der Proteine, b) aufbringen der modifizierten Proteine auf die Polymer¬ schicht c) partielle Trocknung dieser Schicht und d) kovalente Anbindung der modifizierten Proteine an die Polymerschicht durch Einwirkung von UV-Licht.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die carbenerzeugenden Moleküle TRMID sind.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Trocknungsgrad der Schicht durch anlegen von Vakuum erreicht wird.