WO1997043434A1

WO1997043434A1 - Novel physiologically active substance and process for producing the same

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Publication number: WO1997043434A1
Application number: PCT/JP1997/001612
Authority: WO
Inventors: Kazuhiko Kurosawa; Kousaku Takahashi; Kyouko Matsubara; Masayuki Okue; Naohiro Washida; Kanji Higashio
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1996-05-14
Filing date: 1997-05-14
Publication date: 1997-11-20
Anticipated expiration: 1998-11-14
Also published as: JP3851661B2

Description

明細書新規生理活性物質及びその製造方法技術分野

本発明は、新規なニトロフエニルピロン系の生理活性物質、それを産生及び製造するために用いる微生物並びにその新規生理活性物質を製造する方法に関する _c さらに、本発明は、このような新規生理活性物質を有効成分とする医薬、特に、臓器移植等による免疫拒絶反応の抑制剤、全身性エリテマトーデス、慢性関節リゥマチ、ブドウ膜炎等の自己免疫疾患の治療剤、アトピー性皮膚炎等のアレルギ —疾患の治療剤、各種微生物による感染症の抗菌剤、或いは制癌剤耐性克服剤に関する。背景技術

免疫抑制剤は、免疫応答の低下を必要とする疾患や病態の予防治療に有効である。例えば腎臓、肝臓、骨髄、心臓及び角膜移植といった移植の拒絶反応の予防、又は全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、ブドウ膜炎等の自己免疫疾患の治療や、アトピー性皮虜炎のようなアレルギー疾患等、多くの免疫病の治療薬として適応される。 1983年に米国食品医薬局（U S F D A ) がシクロスポリンを承認して以来、免疫抑制剤の開発が活発に行われ、プログラフ、スパニジン等の薬剤が実用化されるに至り、それらの薬剤は臓器移植外科領域において高い評価を得ている。しかしながら、既存の薬剤は使用に伴う腎障害の多発や、自己反応性リンパ球の生成等の新たな問題が指摘されるとともに、自己抗体を生成して発症する自己免疫疾患に対してはその効力が必ずしも満足できるものではなかった c 発明の開示

本発明者らは上述の状況に鑑み、優れた免疫抑制活性を有し且つ副作用の少ない物質を自然界に広く求め鋭意探索の結果、ス卜レブトミセス属に属する菌株の培養物中に、該活性を有する新規なニトロフニルピロン系の生理活性物質を見出した。従って本発明は、新規なニトロフヱニルピロン系の生理活性物質、この新規生理活性物質を産生及び製造するために用いる微生物、及びその新規生理活性物質を製造する方法を提供することを課題とする。

詳しくは、免疫抑制活性、抗アレルギー活性、抗菌活性及び制癌剤耐性克服効果を有し且つ副作用の少ない新規生理活性物質、該生理活性物質を産生及び製造するために用いる微生物、及びその微生物を培養して該生理活性物質を得る該生理活性物質の製造方法を提供することを課題とする。

さらに、本発明は、前記したような生理活性を利用して種々の疾患を予防あるいは治療する医薬を提供することを課題とする。

すなわち、本発明は、次の式（1 ) で示される新規生理活性物質及びその薬理学的に許容される塩に関する。

また、本発明は、ストレブトミセスに属し、式（I ) で示される新規生理活性物質を産生及び製造するために用いることのできる微生物に関する。

このような微生物としては、具体的には本発明者らによって冲緙本島の土壌から分離採取されたストレプトミセス ' スぺクタピリ CStreptomyces spectabil 丄 s) S N F4435株（FERM BP- 5915)を挙げることができる。

また、本発明は、前記微生物を培養し、培養物中に前記新規生理活性物質を産生せしめ、これを採取することよりなる新規生理活性物質の製造法に関する。また、本発明は、前記微生物を培養し、培養物中に類縁体のスぺクチナビリンを産生し、このテトラェン部を閉環させて合成化学的な手段で新規生理活性物質を製造する方法に関する。

さらに、本発明は、前記式（I) で示される新規生理活性物質またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする医薬に関する。

本発明の医薬は、臓器移植による免疫拒絶反応あるいは自己免疫疾患の治療剤、アレルギー疾患の治療剤、感染症の抗菌剤、或いは制癌剤耐性克服剤等として用いられる。

すなわち、本発明の生理活性物質は、新規なニトロフニルピロン系の化合物であって、その活性からみて臓器移植等による免疫拒絶反応の抑制剤、全身性ェリテマトーデス、慢性関節リウマチ、ブドウ膜炎等の自己免疫疾患の治療剤、ァトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患の治療剤、各種微生物による感染症の抗菌剤、或いは制癌剤耐性克服剤等の医薬として有用である。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明化合物 SNF4435Cのメタノール中（lS gZml) での紫外線吸収スぺクトルを示す。

第 2図は、本発明化合物 SNF4435Cの臭化力リウム錠での赤外線吸収スぺクトルを示す。

第 3図は、本発明化合物 SNF4435Cの重クロ口ホルム溶液中での 500MHz Ή NMRスぺクトル（TMS基準）を示す。第 4図は、本発明化合物 S N F 4435Cの重ク口口ホルム溶液中での 125MHz¹³ C NMRスぺクトル（重クロ口ホルム基準）を示す。

第 5図は、本発明化合物 S N F4435Dのメタノール中（18.0 g Zml) での紫外線吸収スぺクトルを示す。

第 6図は、本発明化合物 SNF4435Dの臭化力リウム錠での赤外線吸収スぺクトルを示す。

第 7図は、本発明化合物 SNF4435Dの重クロ口ホルム溶液中での 500MHz Ή NMRスぺクトル（TMS基準）を示す。

第 8図は、本発明化合物 S NF4435Dの重クロロホルム溶液中での 125MHz¹³ C NMRスぺクトル（重クロ口ホルム基準）を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明の新規生理活性物質（以下、本発明化合物という）は、微生物を培養することにより得られる。この時、用いる微生物としては、本発明化合物を産生する菌であれば特に限定されないが、好ましくはストレプトミセス属 (Streptomyc es sp. ) に属する菌、特に好ましくはストレプトミセス ' スぺク夕ピリス（Strep tomyces _spectabi 1 is) S N F4435株を挙げることができる。このストレプトミセス · スぺクタビリス SNF4435株は、本発明者らが、沖緝本島から採取した土壌より分離した菌株であり、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM P- 15476として、平成 8年 2月 27日に寄託し、その後、この原寄託よりブダペスト条約に袪づく寄託に移管し、受託番号 FERM BP-5915が付されている。

ストストレプトミセス ' スぺクタビリス（Streptomyces spectabili^) S N F 4435株の分離は、沖緙本島の土壌を放線菌の分離に通常用いられている方法、例えば Goodfellow, M.； Actinomycetologica Vol. 2, No.1 13〜29(1988)に記載の方法によつて容易に実施することができる。

このようにして分離されたストレブトミセス 'スぺクタビリス S NF4435株の性状を示すと次のとおりである。

1. 形態

気菌糸はうつすらと着生し、わずかに疑似輪生分岐が見られるが菌糸の分断は認められない。気菌糸は赤色系まれには白色系の色調を呈し、 10個以上の胞子の連鎖が形成されて屈曲性の直線型をしている。胞子の表面はほぼ平滑で、大きさが 0.4X0.8 ΐΛ位の円柱状である。菌核、胞子のう、遊走子等の特殊な器官は見出されない。

2. 各種培地における生育状態

各種寒天平板培地において、 27°C、 14日間培養した結果を表 1に示す。尚、色の記載については、 J I S色名帳（JIS Z 8102準拠、日本規格協会、平成 5年 4 月 15日、第 1版第 3刷発行）に従った。

第 1 表

寒天培地生育気菌糸裏面可溶性色素イ-スト ·麦芽良好サーモンピンク金赤

(8R 7.5/7.5)、なし

(ISP2) 拡散性粉状、うつすらと (9R 5.5/14)

中程度ピンク（2.5R 7/7)、鮮やかな黄みの赤

拡散性粉状、かすかに (7.5R 5/15) なしスタ-チ ·無機塩中程度明るい黄みの赤鮮やかな赤

(7.5R 7/9)、なし

(ISP4) 拡敏性粉状、うつすらと (5R 4/14)

グリセリン，中程度鲜やかな黄赤黄赤

ァスパラギン (5YR 7/14)、なし (ISP5) 拡散性粉状、うつすらと (5YR 6/12)

ペプトン ·ィ-スト · 不良うぐいす色焦茶黒茶 (2.5 鉄 (1GY 4.5/3.5) 、

(ISP6) 拡散性粉状、かすかに (5YR 3/2) YR 2/1.5 チロシン中程度鮮やかな黄赤黄赤

(5YR 7/14) なし (ISP7) 拡散性粉状、うつすらと (5YR 6/12) (1) 生育温度範囲

イースト '麦芽寒天培地を用い、 7。C、 12°C、 17°C、 22°C、 27°C、 32°C、 37。C、 42°C及び 47°Cの各温度で試験した結果、 7 ° ( 、 42°C及び 47°Cを除き、そのいずれの温度でも生育した。最適生育温度は 27°C〜32°C付近と思われる。

(2) ゼラチンの液化

グルコース ·ペプトン ·ゼラチン培地、 27°C培養あるいは単純ゼラチン培地、 20°C培養において、いずれの培地でも培養 10日後頃より液化が始まり、 21日後の観察での液化作用は中程度であつた。

(3) スターチの加水分解

スターチ ·無機塩寒天培地、 27°C培養において、培養 3日後頃より水解性が認められ、その作用は比較的強い。

(4) 脱脂牛乳の凝固 ·ぺプトン化

脱脂牛乳培地、 37°C培養において、凝固は認められなかったが、培養 7日後頃よりぺプトン化が観察された。

(5) メラニン様色素の生成

卜リプトン ' イースト 'ブロス培地、ペプトン · イースト '鉄寒天培地またはチロシン寒天培地を用いた 27°C培養において、ペプトン ·イースト '鉄寒天培地のみに培養 3日後頃からメラニン様色素の生成が認められた。

(6) 炭素源の利用性

プリドハム . ゴドリーブ寒天培地、 27°C培養において、 D—グルコース、 D— キシロース、 D—フラク卜ース、ラフイノース、イノシトール、 D—マンニトール、マンノース、 D—ガラクトースを利用し、 L—ァラビノース、シュクロース、 L—ラムノースは利用しない。

以上の性状を要約すると、 S N F 4435株の菌学的性状は、気菌糸が直線状で胞子のうは形成しないが、わずかに疑似輪生分岐が認められる。気菌糸の先端には 10個程度の胞子を連鎖し、その表面は平滑である。種々の培地で、気菌糸の色調はピンクから赤色系を呈す。可溶性色素はぺプトン · イースト ·鉄寒天培地でメラニン様色素が生成され、またスターチの水解性及び蛋白の分解力は中程度である o

尚、細胞壁に含まれる 2， 6—ジアミノピメリン酸は LL—型であった。これらの性状より、 SNF4435株はストレプトミセス (Streptomyces) 属に属すると考えられ、「バージーズ 'マニュアル 'ォブ ·デターミナティブ ·パクテリォロジ一 (Bergey' s Manual of Determinative Bacteriology リ」第 8版、及び I S P 報告「ィンタ一ナショナル · ジャーナル ·ォブ · システマティック ·バクテリォロジー (International Journal of Systematic Bacteriology) 」第 18巻、 69頁、 279頁（1968年）、同 19巻、 391頁（1969年）、同 22巻、 265頁（1972年）より検索した結果、ストレプトミセス，スぺク夕ビリス（Streptomyces spectabilis) を近縁種として挙げられる。そこで、 S NF4435株とストレブ卜ミセス · スぺクタビリス（Streptomyces spectabilis IFO 13424 ) とを比較した。結果を第 2表に示す。

第 2 表

この結果より、気菌糸の色調及び生育温度範囲等に若干の差異が認められる以外、気菌糸の形態、胞子の表面、生育状態やメラニン様色素を生成する点及び炭素源の利用性などで両者はよく一致する。従って、 S NF4435株をストレブトミセス - スぺクタビリス (Streptomyces spectabi 1 i s)と ι口 J定した。本発明で用いられる微生物は、 X線、紫外線等の照射処理、又は亜硝酸、 N— メチルー N， —ニトロ一 N—二トロソグァニン（N T G ) 等の変異誘起剤による処理、形質転換、形質導入又は融合等の通常用いられる菌種変換処理方法により変異させた微生物であっても良い。

本発明化合物は、通常の微生物が利用しうる栄養源含有培地にこれらの本発明化合物の産生菌を接種して発育させることにより、その培養物中に産生され、あるいは化合物を製造するために用いられる微生物を接種して発育させその培養物を原料として有機合成により、目的とする本発明化合物を製造することができる栄養源としては、放線菌の栄養源に利用されているのものであれば良く、合成培地、半合成培地、天然培地などいずれも使用できる。例えば、炭素源としてはグルコース、グリセロール、麦芽糖、デンプン、シュクロース、糖蜜、水飴又はデキストリンなどが単独又は混合物として用いられる。窒素源としては、大豆粉、コーングルテンミール、コーンスティ一プリカ一、肉エキス、酵母エキス、綿実柏、ペプトン、小麦胚芽、魚粉、尿素などの有機窒素源、硫酸アンモニゥム、硝酸ナトリウムなどの無機窒素源が単独又は混合物として用いられる。無機塩としては、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム又は各種リン酸塩等を使用することができ、さらに必要に応じて、鉄、銅、コバルト、モリブデン、マンガン又は亜鉛などの重金属塩を微量添加することもできる。又、培養中発泡の著しい時には、消泡剤として公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加しても良い。この他に、該生産菌が利用し、本発明化合物の生産に有用な有機及び無機物を、適宜用いることができる。

菌株の培養方法としては、一般の微生物代謝産物の生産法と同様に行えば良く、固体培養でも液体培養でも良い。液体培養の場合は、静置培養、攪拌培養、振とう培養又は通気培養等のいずれを実施しても良いが、ストレプトミセス · スぺク夕ビリス S N F 4435株を培養する場合には、特に振とう培養又は深部通気攪拌培養が好ましい。又、培養条件によっても異なるが、好ましい培地の pHは 4〜8の範囲で、培養温度は 22〜37°C、好ましくは 25〜30°Cが適当である。また培養時間は 48〜168 時間、好ましくは 96〜144 時間である。

培養物から目的とする本発明新規生理活性物質を単離、製造するには、微生物の生産する代謝物を単離するのに通常使用される分離手段を適宜利用すれば良い。また、必要があれば合成化学的な手段を適宜利用すれば良い。

培養により生成した本発明化合物は、通常培養物中の菌体内及び菌体外の両方に蓄積されることが多いので、例えば遠心分離、濾過等の手段により培養濂液及び菌体に分離し、培養濾液及び菌体より通常の分離手段、例えば、透析法、溶媒抽出法、不純物との溶解度差を利用する方法、イオン交換樹脂法又は吸着もしくは分配クロマトグラフィ一法及びゲル濾過法などを単独又は適宜組み合わせて、場合によっては反復使用することによつて分離精製することができる。

合成化学的な手段を利用して採取される本発明化合物は、微生物を培養して培養液中に生成された本発明化合物の類縁体（ニトロフエニルピロン系）について上記分離手段を使用することによって分離精製し、合成化学的な手段、例えば触媒を用いた閉環反応により製造させることができる。反応に用いられる有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、第 3ブチルアルコール、テトラヒド口フラン、ジェチルエーテル、エチレングリコール、ジメチルエーテル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジォキサン、塩化メチレン、クロ口ホルム、ジクロロェタン又はァセトニトリル等が挙げられる。閉環反応を光を用いて行う場合は、通常 200ηπ！〜 800nmの波長の光を用いるが、必要に応じてこれ以上またはこれ以下の波長を選択できる。閉環反応の反応温度は、通常一 20〜400 °Cであり、必要に応じてこれ以上またはこれ以下の温度を選択できる。閉環反応の反応時の圧力は、通常 1〜10 atmで、必要に応じてこれ以上またはこれ以下の圧力を選択できる。閉環反応に用いられる触媒としては、例えば塩化アルミニウム、塩化スズ、フッ化ホウ素、フッ化ホウ素酸銅およびヨウ素等が挙げられる。閉環反応の反応時間は、通常 30分から 2日の範囲であるが、必要に応じてこれ以上またはこれ以下の時間を選択できる。

本発明におけるスぺクチナピリンのテトラェン部を閉鎖させる反応式を示す。

上記反応条件により閉環反応を行った後、有機合成化学の分野における公知の方法、例えば溶媒抽出、再結晶、クロマトグラフィー、イオン交換樹脂、 HP L C等を用いる方法により SNF4435Cおよび S NF4435Dを分離精製することができる。

得られた本発明化合物の性状を示す。尚、 SNF4435は平面構造（式（I)参照）は同一だが光学異性体が存在し、それぞれを SNF4435C又は Dとする。これらの光学異性体は、液体クロマトグラフィ一等の常法の分離手段によってそれぞれの光学異性体に分離することができる。尚、医薬として用いる場合は光学異性体単体であっても良いし、ラセミ体であっても良い。

S N F 4435 Cの物理化学的性状

( 1 ) 色及び性状：乳白色粉末 (2) 分子式： C₂₈H₃,N0₆

(3) マススペクトル（FAB— MS) ： m/z 478(Μ + Η) ⁺

(4 ) 比旋光度： [a]_D ²⁶— 105.6 ° (C 0.10, CHC1₃)

(5 ) 紫外線吸収スぺクトル：図 1に示す。

A ^Me0Hnm (ε) ： 271 (19322)

(6 ) 赤外線吸収スぺクトル：図 2に示す。

リ… ^KBr cm—¹ ： 2950, 2850, 1670, 1600, 1520, 1350, 1255, 1165,

1040

(7 ) 'Η—核磁気共鳴スペクトル：図 3に示す。（500MHz, CDC1₃)

δ (ppm)： 8.19(d， J=8.7H_Z.2H), 7.55(d, J=8.7H_Z.2H), 5.58(d， J = l.4H_Z.1H)，

4.95 (S, 1H)， 4.78 (t, J=8.2H_Z.1H), 4.32(d, J=9.8H_Z. 1H)，

3.97 (d， J=9.8H_Z.1H), 3.96(S, 3H), 3.64(S, 1H), 2.84(S, 1H), 2.43 (d， J=8.2H_Z.2H), 1.89(S，3H)， 1.84(S, 3H)， 1.74(S，3H), 1.72 (d， J = 1.4Hz.3H), 1.30(S， 3H)

(8) ¹³C—核磁気共鳴スペクトル：図 4に示す。（125MHz, CDC )

(ppm): 180.5(s)， 162.2(s), 155.2(s), 146.9(s), 145. l(s)， 131.0(s),

130.4(s), 129.1(d), 123.8(d), 123.6(d), 122.0(d), 119.6(s), 100.3(s), 73.5(d), 70.6(t), 63.7(d), 55.6(q)， 51.8(s), 51.1 (d)， 46.4(t), 43.0(s), 30.4(q)， 23.0(q), 22.2(q), 9.4(q), 7.0(q)

( 9 ) 溶解性：メタノール、クロロホルム、ェタノ一ル、ァセトン、ピリジン、酢酸ェチル、ジェチルエーテル、ジメチルスルホキシド等に可溶へキサン、水に不溶

(10) 呈色反応： 50%硫酸、ヨウ素に陽性

(11) HP L C ：保持時間 14.6分カラム；イナ一トシル OD S— 2 (ø 4.6X250闘、 GLサイエンス社）溶媒； 80%メタノール ·水、流速 1 mlZmin 、 U V 220nm

(12) 酸性、中性、塩基性物質の区別：中性

S NF4435Dの物理化学的性状

( 1 ) 色及び性状：乳白色粉末

(2) 分子式： C₂₈H₃₁N0₆

(3) マススペクトル（FAB— MS) ： m/z 478(M + H) ⁺

(4) 比旋光度： [ ] ⁶+ 84.8 。 (C 0.10， CHCh)

(5) 紫外線吸収スぺクトル：図 5に示す。

A_max ^Me0Hnm (ε) ： 270 (21462)

(6) 赤外線吸収スぺクトル：図 6に示す。

レ _max ^KBr cm"¹ ： 2950, 2850, 1670, 1600， 1520, 1350, 1255， 1165，

1040

( 7 ) 'H—核磁気共鳴スペクトル：図 7に示す。（500MHz, CDCh)

δ (ppm)： 8.15(d, J=8.7H_Z.2H), 7.47(d， J=8.7H_Z.2H)， 5.70(S，1H)，

4.94(dd, J=7.0, 9.5H_Z, 1H), 4.89(S， 1H)， 4.18(d, J=9.2H_Z, 1H), 3.84(d, 2Hz, 1H), 3.74(S， 1H), 3.54(S， 3H)， 2.74(S, 1H), 2.48(dd， J = 13.1， 9.5H_Z, 1H)， 2.28(dd， J二 13.1, 7.0H_Z.1H)，

1.97(S, 3H), 1.84(S，3H)， 1.80(S,3H)， 1.74(d, J=l.5H_Z.3H), 1.3KS, 3H)

(8) '³C—核磁気共鳴スペクトル：図 8に示す。（125MHz, CDC )

5 (ppm): 180.5(s)， 161.9(s), 154.9(s), 146.9(s)， 144.0(s), 131.3(s),

131.2(s), 129.9(d), 124.4(d), 123.2(d), 121.9(d), 119.7(s), 100.0(s)， 72.5(d), 70.6(t), 61.1(d), 55.2(d), 54.8(q), 51.1 (s),45.5(t)， 43.0(s), 30.7(q), 22.2(q), 22. l(q), 9.4(q), 6. 8 (q)

( 10) 呈色反応： 50%硫酸、ヨウ素に陽性

(11) H P L C ：保持時間 16. 6分

カラム；イナ一トシル O D S— 2 ( ø 4. 6 X 250mm , G Lサイエンス社）

溶媒； 80%メタノール ·水、流速 1 ml /mi n 、 U V 220nm

( 12) 酸性、中性、塩基性物質の区別：中性

本発明の新規生理活性物質を医薬として用いる場合、薬理学的に許容される塩としても良い。薬理学的に許容される塩として、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、或いはマグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属塩、アルミニゥムその他の金属塩、及びアルキルアミン塩、ピリジン塩等の有機アミン塩が挙げられる。この化合物又はその薬理学的に許容される塩は、ヒ卜及び動物に対し、医薬として経口的及び非経口的に安全に投与される。非経口的投与には、例えば静脈注射、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射、経皮投与、経肺投与、経舞投与、経腸投与、口腔内投与、経粘膜投与等が挙げられ、これらの製剤が投与される。例えば注射剤、坐剤、エアゾール剤、経皮吸収テープなどが挙げられる。又、経口投与製剤として例えば錠剤（糖衣錠、コーティング錠、バッカル錠を含む）、散剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、顆粒剤（コ一ティングした物、丸剤、トローチ剤、液剤、又はこれらの製剤学的に許容され得る徐放化製剤等）が挙げられる。経口投与用液剤には懸濁剤、乳剤、シロップ剤（ドライシ口ップを含む）、エリキシル剤などが挙げられる。

これらの製剤は公知の製剤学的製法に準じ、製剤として薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤等と共に医薬組成物として投与されるこれらの製剤に用いる担体ゃ賦形剤としては、例えば乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾゥ末、ゲンチアナ末など、結合剤としては例えばデンプン、トラガントゴム、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ェチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなど、崩壊剤としては例えばデンプン、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなど、滑沢剤としては例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マク口ゴールなど、着色剤としては医薬品に添加することが許容されているものを、それぞれ用いることができる。錠剤、顆粒剤は必要に応じ白糖、ゼラチン、ヒド口キンプロピルセルロース、精製セラック、ゼラチン、グリセリン、ソルビトール、ェチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、メタァクリル酸重合体などで被胶しても良いし、 2以上の層で被膜しても良い。さらにェチルセルロースやゼラチンのような物質のカプセルでも良い。又、注射剤を調製する場合は、主薬に必要に応じ P H調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加して、常法により各注射剤とする。

本発明の新規生理活性物質を患者に投与する場合、症状の程度、患者の年齢、健康状態、体重などの条件によって異なり特に限定はされないが、成人 1 日当たり約 10mg〜； lOg を経口或いは非経口的に 1 日 1回若しくはそれ以上投与すれば良い。急性毒性は、実施例 6に示すようにほとんどみられなかった。

以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。

〔実施例 1〕

(1) 微生物の分離

沖緦本島で採取した土壌を熱処理（60°C， 10分間）することにより得られた乾燥土壌 l g を 10mlの滅菌水で懸濁した。該懸濁液を 10—³倍に希釈し、寒天平板培地（硫酸アンモニゥム 0.05%、リン酸一カリウム 0.05%、塩化カルシウム 0.01%、硫酸マグネシウム 0.01%、尿素 0.01%、グルコース 0.05%、可溶性デンプン 0.1 %、クロラムフヱ二コール 0.008%、硫酸第一跌 0.0005%、硫酸マンガン 0.000 16%、硫酸亜鉛七水和物 0.00014%、塩化コバルト（II) 0.0002 %、寒天 1.8%、 PH6.0)で分離培養 (27 、 10日間）を行った。出現した集落を上記寒天平板培地に画線塗抹、純粋分離を行って、生理活性物質 SNF4435を生産する放線菌ス卜レプトミセス · スぺクタピリス SNF4435株（FERM BP- 5915)を得た。

(2) 微生物の培養

ストレプトミセス . スぺクタピリス S NF4435株（FERM BP-5915)の斜面培地 (グルコース .スターチ ·ァスパラギン寒天培地）からマツトごと 1 cm角を切り出し、 70mlの前培養培地（硫酸アンモニゥム 0.14%、リン酸一カリウム 0.2%、塩化カルシウム 0.03%、硫酸マグネシウム 0.03%、尿素 0.03%、ポリペプトン 0.5%、酵母エキス 0.1%、大豆粉 3 %、グルコース 1 %、可溶性デンプン 0.5 %、硫酸第一鉄 0.0005%、硫酸マンガン 0.00016%、硫酸亜鉛七水和物 0.00014 %、塩化コバルト（II) 0.0002%、 pH無調整）を入れた 500ml容の三角フラスコ 10本に接種し、 27°Cで 4日間回転振盪機上で培養して前培養液を得た。この前培養液 700mlを本培養培地（可溶性デンプン 1 %、グルコース 2 %、大豆粉 2.5%- 乾燥酵母 0.4%、肉エキス 0.1%、リン酸ニ力リウム 0.005%、塩化ナトリウム 0.2%、 PH7.2M20Lを含む 200L容タンクに接種して、 27°Cで 5日間通気攪拌培養 (通気量 120L/分、攪拌 200 回転/分、内圧 0. lkg/cm²)を行った。

〔実施例 2〕

(1) 培養物の精製による本発明化合物の製造法

実施例 1 (2) で得られた培養物 120Lを連続遠心分離（17，000rpm 、 20L/h)によつて遠心分離し、得られた菌体を、アセトン 36L で抽出した。アセトン抽出液は、減圧濃縮してアセトンを除去した後、等量の酢酸ェチルで二回抽出した。酢酸ェチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮して粗抽出物 70g を得た。これを少量のへキサン一酢酸ェチル（7 ： 3) の溶媒に溶解し、同じ溶媒で平衡化した 2L のシリカゲルカラムに付した。このカラムを 6Lのへキサン一酢酸ェチル (7 : 3) の溶媒で溶出した後、へキサン一酢酸ェチル（1 ： 1) で本発明化合物を溶出し、減圧濃縮して黄色粉末 2.2gを得た。さらに、この粉末を少量のメタノールに溶解し、 80%メタノール水溶液で平衡化した H PL Cカラム（カプセルパック C18— SG120 、 ø 20 X 250mm . 資生堂社）に流速 lOml/min で通し、同じ溶媒で溶出した。 220nmの吸収を検出、本発明化合物 S N F 4435の検出ピークを分取した。吸収が最初に大きくなる画分（保持時間約 27分）を SNF4435Cとし、次いで吸収が大きくなる画分（保持時間約 29分）を SNF4435Dとした。これらの画分を減圧濃縮し、化合物 SNF4435Cを 18mg、 S N F4435Dを 10mg、それぞれ乳白色粉末として得た。それらの粉末が SNF4435Cおよび SNF4435Dであることは、それぞれの比旋光度を測定することによって確認され、前記した物理化学的性状を示した。

(2) 合成による本発明化合物の製造法

実施例 1 (2) で得られた培養物 4 Lを遠心分離（5000rpm)し、得られた菌体をアセトン 2 Lで抽出した。ァセトン抽出液は、減圧濃縮してァセトンを除去した後、等量の酢酸ェチルで 2回抽出、酢酸ェチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮して粗抽出物 2.5gを得た。これを少量のクロ口ホルムに溶解して、同じ溶媒で平衡化した 100ml のシリカゲルカラムに付し、 300 mlのクロ口ホルムで溶出、減圧濃縮して乾固させ、 50ml のメタノールを加えてー晚静置、スぺクチナビリンを 49.5mg析出、沈殿させた。これを 5mlのクロ口ホルムに溶解、 2. Omgのヨウ素を加え、室温中 4.5 時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸ェチルで抽出後、 10%チォ硫酸ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、有機層を乾燥させた。溶媒を留去して得られた油状残渣をシリ力ゲル力ラムクロマトグラフィ一に付し、へキサン—酢酸ェチル（ 1 : 1 ) の混合液で処理、本発明化合物を溶出、減圧濃縮して黄色粉末 30.5mgを得た。さらに、この粉末を少量のメタノールに溶解し、 80%メタノール水溶液で平衡化した HP L Cカラム（力プセルパック C18— S G120 、 ø 20 X 250mm、資生堂社）に流速 10ml/minで通し、同じ溶媒で溶出、 220nm の吸収を検出、本発明化合物 S N F4435のピークを分取した。吸収が最初に大きくなる画分（保持時間約 27分）を SNF4435Cとし、次いで吸収が大きくなる画分（保持時間約 29分）を SNF4435Dとした。これらの画分を減圧濃縮し、化合物 SNF4435Cを 19.8mg、 S N F4435Dを 2.2mg 、それぞれ乳白色粉末として得た。それらの粉末が S NF4435Cおよび SNF4435Dであることは、それぞれの比旋光度を測定することによって確認され、前記した物理化学的性状を示した。

〔実施例 3〕

マイトジンによる脾細胞の増殖反応に対する阻害活性

雄性 B A L B/ cマウスの脾細胞を、 10%牛胎児血清を含む R PM I 1640培地中に懸濁し、本発明化合物 S N F 4435 C及び S N F 4435Dを様々な濃度で添加し、マイトジヱン（コンカナパリン A又は L P S) 添加又は無添加にて、 37°C、 5 % 1 θ 炭酸ガス濃度の条件下で 48時間培養、細胞増殖を ³Η—チミジンの細胞内取り込み率を基準として判定した。結果を第 3表（SNF4435C) 及び第 4表（SNF 4435 D) に示す。なお、第 3表及び第 4表中の TZCは細胞増殖率（（Mean土 SD)/ Control)を表す。

第 3 表供試化合物マイトジェン Mean土 S. D. T/C ICso 濃度（ng/ml) ( i /ml) (cpm) (%) (ng/ml)

533 土 29 100

50 ― 480 64 90

100 442 ± 52 83

500 256 土 11 48 500

1000 55 土 19 10

5000 15 5 3 一 Con A 1 36794 土 5245 100

50 35593 土 4392 97

100 31271 6421 85

500 16285 ± 2883 44 400

1000 10401 土 470 28

5000 1796 土 310 5 P S 5 11261 士 951 100

50 5 10309 士 911 92

100 5 7121 土 475 63

500 5 3151 土 223 28 200

1000 5 1326 土 31 12

5000 5 89 11 1 第 4 表供試化合物マイ卜ジェン Mean土 S, D. T/C ICsn 濃度（ng/ml) (//g/ml) (cpm) (%) (ng/ml)

_ 533 士 29 100

50 一 480 土 64 90

100 ― 442 土 52 83

500 一 256 土 11 48 500

1000 ― 55 土 19 10

5000 ― 15 士 5 3

Con A 1 39631 土 2501 100

5 ι 29107 1265 73

10 ι 24902 土 2654 63

50 ι 12629 2692 32 20

100 1 12082 土 1813 30

500 ¹ 5569 士 696 14

L P S 5 11647 833 100

5 5 7730 土 257 66

10 5 6083 土 611 52

50 5 2683 132 23 10

100 5 1969 土 100 17

500 5 566 土 25 5

〔実施例 4〕

細胞毒性

(1) 10%の牛胎児血清を加えた RPM I 1640培地中に、 K562(ヒト白血病）細胞を 1 X 10⁵個/ ml 接種し、 37°C、 5 % C0₂インキュベーター内で 24時間培養した後、これに本発明化合物 S NF4435C及び S NF4435Dを各々 l mg/mlになるように添加してさらに培養を続けた。 4 8時間後、培養した K562 細胞を顕微鏡で観察したが、本発明化合物 S N F 4435 C及び S N F 4435 Dのいずれを添加しても生育阻害は認められなかった。

(2) 10%の牛胎児血清を加えた R PM I 1640培地中に、 KB (ヒト鼻咽腔癌）細胞を 1 X10⁵ 個/ ml接種し、 37°C、 5 % C0₂インキュベーター内で 24時間培養した後、これに本発明化合物 SNF4435C及び SNF4435Dを各々 lmgZmlになるように添加してさらに培養を続けた。 48時間後、培養した KB細胞を顕微鏡で観察したが、本発明化合物 S N F 4435 C及び S N F 4435 Dのいずれを添加しても生育阻害は認められなかつた。

〔実施例 5〕

抗微生物活性

本発明化合物 S N F 4435 C及び S N F 4435Dの各種微生物に対する抗菌活性を、ペーパーディスク法（直径 8咖）による阻止円の大きさ（直径）で観察した。生理活性物質 S NF4435C及び S NF4435Dは各々メタノ一ルに溶解した 100〃g をペーパーディスクに染み込ませ測定に供した。結果を第 5表に示す。

第 5 表阻止円（mm)

試験菌 SNF4435C S NF4435D

Escherichia coli BE 1186 0 0

Salmonella typhimurium TV 119 0 0

Pseudomonas aeruginosa IFO 13130 0 0

Xanthomonas oryzae IFO 3312 0 0

Xant omonas ci tri IFO 3781 0 0

Erwinia carotovora IFO 12380 0 0

Staphylococcus aureus 209P 0 9

Baci Uus subti 1 is H17 Rec ⁺ 0 10

Bacillus subti 1 is M45 Rec ― 0 10

Micrococcus luteus IFO 12708 0 0

Mycobacterium phlei IFO 3158 14 18

Alternaria mali IFO 8984 0 0

Botryotinia fuckel iana IFO 5365 0 0

Glomerella lagenaria IFO 7513 0 0

Pyricularia oryzae IFO 5994 18 16

Fusarium oxvsporum IFO 9761 0 0

Trichophyton rubrum IFO 6203 0 27

Aspergi 1 lus fumigatus IFO 9733 0 0

Candida albicans IFO 1594 9 9

Schizosaccharomvces _pombe IFO 0638 0 0

〔実施例 6〕

制癌剤耐性克服効果

5 %の牛胎児血清を加えた RPM I 1640培地（ギブコ社）に、 2780AD細胞 (Rogan A M et al. , Science, vol.224, pp994-996 (1984)) を I X 10⁶ 個 Zml となるように懸濁して 37°C、 5 % C0₂インキュベータ一内で 24時間培養した。

3H—ビンクリスチン（アマシャム社）含有 RPM I 1640に培地置換した後、本発明化合物 SNF4435Cあるいは SNF4435Dを種々の濃度で添加、さらに 2 時間培養を続けた後、ビンクリスチンの細胞内取り込みを scintillation system USER No.10 ( ベックマン社）により測定した。結果を第 6表に示す。

第 6 表

〔実施例 Ί〕

急性毒性

本発明化合物 S NF4435C及び S NF4435Dを、それぞれ 6週齢の雄性 B A L BZ cマウスに静脈内投与してその毒性を調べたところ、 25mg/kgで異常は見られなカ、つた。産業上の利用可能性

以上の結果から、本発明により新規な生理活性物質、その生理活性物質を産生及び製造をするために用いる微生物ならびにその製造方法が提供される。詳しくは、免疫抑制活性、抗菌活性及び制癌剤耐性克服効果を有する新規生理活性物質、該生理活性物質を製造するために用いる微生物、及びその微生物を用いることにより該生理活性物質を採取する該生理活性物質の製造方法が提供される。本発明新規生理活性物質は、その効果より臓器移植等による免疫拒絶反応の抑制剤、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、ブドウ膜炎等の自己免疫疾患の治療剤、アトピー性皮 I*炎等のアレルギー疾患の治療剤、各種微生物による感染症の抗菌剤、或いは制癌剤耐性克服剤として有用である。微生物への言及

寄託機関：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所

住所：日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号

寄託日：平成 8年 2月 2 7日

(平成 8年 2月 2 7 日に原寄託され、平成 9年 4月 1 4日にブダぺスト条約に基づく国際寄託へ移管）

受託番号： FERM B P - 5 9 1 5

Claims

請求の範囲

1. 次の式（1) で示される新規生理活性物質、 SNF4435及びその薬理学的に許容される塩。

0

0₂

2. 26°Cにおけるナトリウム D線による比施光度が— 105.6 。 (C 0.10， CHC ) である、請求項 1記載の新規生理活性物質、 SNF4435C及びその薬理学的に許容される塩。

3. 26°Cにおけるナトリウム D線による比施光度が + 84.8 。（C 0.10， CHCh) である、請求項 1記載の新規生理活性物質、 SNF4435D及びその薬理学的に許容される塩。

4. ストレプトミセス (Streptomyces) 属に属し、請求項 1〜 3のいずれかに記載の新規生理活性物質を産生することのできる微生物。

5. ストレプトミセス属に属する微生物が、ストレブ卜ミセス · スベクタビリス (Streptomyces spectabilis) SNF4435株（FERM BP- 5915) 又はその変異株である請求項 4記載の微生物。

6. ストレプトミセス (Streptomyces) 属に属する請求項 4又は 5記載の微生物を培養し、請求項 1〜 3のいずれかに記載の新規生理活性物質を培養物中に産生せしめ、これを採取することを特徴とする請求項 1〜3のいずれかに記載の新規生理活性物質の製造方法。

7 . スぺクチナピリンのテトラェン部を閉環させることを特徴とする請求項 1〜 3のいずれかに記載の新規生理活性物質の製造法。

8 . 請求項 1〜 3のいずれかに記載される新規生理活性物質またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする医薬。

9 . 免疫抑制剤である請求項 8記載の医薬。

10. アレルギー疾患治療剤である請求項 8記載の医薬。

11. 感染症治療剤である請求項 8記載の医薬。

12. 自己免疫疾患治療剤である請求項 8記載の医薬。

13. 制癌剤耐性克服剤である請求項 8記載の医薬。