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WO1996037607A2 - Nukleinsäure mit einem polymorphen bereich eines b2-bradykinin-rezeptor-gens - Google Patents

Nukleinsäure mit einem polymorphen bereich eines b2-bradykinin-rezeptor-gens Download PDF

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WO1996037607A2
WO1996037607A2 PCT/DE1996/000891 DE9600891W WO9637607A2 WO 1996037607 A2 WO1996037607 A2 WO 1996037607A2 DE 9600891 W DE9600891 W DE 9600891W WO 9637607 A2 WO9637607 A2 WO 9637607A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
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dna
bradykinin receptor
polymorphic
receptor gene
polymorphic region
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/DE1996/000891
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French (fr)
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WO1996037607A3 (de
Inventor
Andreas Braun
Stefan Kammerer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ROSCHER ADELBERT
Original Assignee
ROSCHER ADELBERT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ROSCHER ADELBERT filed Critical ROSCHER ADELBERT
Publication of WO1996037607A2 publication Critical patent/WO1996037607A2/de
Publication of WO1996037607A3 publication Critical patent/WO1996037607A3/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid comprising a polymorphic region of a B 2 bradykinin receptor gene, a method for producing such a nucleic acid and the use thereof.
  • Bradykinin is a vasoactive nonapeptide of the kinin family, which is released from kininogens by proteolytic activity of kallikrein. Bradykinin is involved in various physiological processes such as cardiovascular hemostasis, neurotransmission, cell proliferation or bronchopulmonary contraction.
  • bradykinin works via a cell surface receptor, which is called the B 2 bradykinin receptor. This receptor binds to G proteins and triggers, among other things, the activation of phospholipase C and / or phospholipase A.
  • Studies of the genomic structure of the human B 2 bradykinin receptor gene show that it comprises 3 exons.
  • bradykinin plays a role in various diseases and is present in different amounts. For example, the amount of bradykinin increases in heart disease and asthma and decreases in allergies.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a means by which it can be determined whether the B 2 bradykinin receptor is present in different forms in the above diseases. According to the invention, this is achieved by the subject matter in the claims.
  • the present invention thus relates to a nucleic acid comprising a polymorphic region of a B 2 bradykinin receptor gene.
  • polymorphic region of a B 2 bradykinin receptor gene encompasses any region of a B 2 bradykinin receptor gene which can have a sequence polymorphism in individuals of a population, for example humans.
  • nucleic acid encompasses any type of nucleic acid, e.g. RNA and DNA, the latter being preferred.
  • RNA and DNA the latter being preferred.
  • the present invention will now be described by way of example for DNA.
  • the present invention is based on the applicant's knowledge that the B 2 - bradykinin receptor gene has polymorphic regions. This is evident from the applicant's recent work in which DNA from blood donors was examined for the B 2 bradykinin receptor gene. Frequently found polymorphic areas are shown in FIGS. 1-4.
  • Figure 1 describes a DNA comprising a polymorphic region of exon 1 of a B 2 bradykinin receptor gene.
  • the polymorphic region is located at nucleotide position 12 downstream of the transcription start site. It represents a tandem repeat polymorphism and is expressed, for example, in the alleles BE1-2G, BE1 -3G and BE1 -3T.
  • BE1 -2G there are two units of the repeat GGTGGGGAC, while BE1-3G has three of these units.
  • BE1-3T has three repeat units, two of which correspond to the above repeat and one has the sequence GGTGGTGAC.
  • Figure 2 (A) describes a DNA comprising a polymorphic region of exon 2 of a B 2 bradykinin receptor gene.
  • the polymorphic region is located at nucleotide position 181 of the cDNA. It represents a base polymorphism and is expressed, for example, in the alleles BE2-C and BE2-T.
  • BE2-C there is a C, which leads to the codon CGT (Arg), while BE2-T has a T, which leads to the codon TGT (Cys).
  • Figure 2 (B) shows the open reading frame (ORF) of the alleles BE2-C and BE2-T.
  • Figure 3 describes a DNA comprising a polymorphic region of exon 3 of a B 2 bradykinin receptor gene.
  • the polymorphic region is located in the 3'-untranslated region of exon 3. It represents a polymorphism of repeats with a consensus sequence, TGGA (A) GGGCTAGAACC, and is expressed, for example, in the alleles BE3-R48 and BE3-R35 off. There are 48 repeats in BE3-R48, while BE3-R35 has 35 repeats.
  • Figure 4 describes a DNA comprising a polymorphic region of the exon 1 promoter region.
  • the polymorphic region is located at nucleotide positions 675 and 1 1 53. It is a base polymorphism and is expressed e.g. in the BP-TC and BP-CT alleles.
  • BP-TC has a T (625) and a Cd 153
  • BP-CT has a C (675) and a T (1 1 53).
  • the DNAs of Figures 1-4 are preferred embodiments of the present invention.
  • the DNA of Fig. 3 was BE3-R35 / 1 or BE3-R48 / 1 and the DNA of Fig. 1 as BE1 -3T (Xba 7.0 / 2) at the DSM (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) filed under DSM 9927, DSM 9928 and DSM 9929 on April 20, 1995.
  • DSM German Collection of Microorganisms and Cell Cultures
  • a DNA according to the invention can be present in a vector or expression vector.
  • examples of such are known to the person skilled in the art.
  • these are e.g. pGEMEX, pUC derivatives, pGEX-2T and pET3b.
  • yeast e.g. to call pY100 and Ycpadl
  • animal cells e.g. pKCR, pEFBOS, cDM8 and pCEV4 must be specified.
  • suitable cells around one, in an expression vector to express the present DNA according to the invention.
  • suitable cells include the E. coli strains HB101, DH1, x1776, JM101, JM109 and BL21, the latter being preferred, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae and the animal cells L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero and HeLa .
  • DNA according to the invention has to be inserted into an expression vector. He is also aware that this DNA can be inserted in conjunction with a DNA coding for another protein or peptide, so that the DNA according to the invention can be expressed in the form of a fusion protein.
  • polymorphic regions can be detected in a B 2 bradykinin receptor gene. It is thus possible, for example, to determine whether the B 2 bradykinin receptor is present in different forms in various diseases, such as cardiac diseases, asthma and allergies.
  • the above areas can be demonstrated by conventional methods. Reference is made to the example below.
  • the polymorphic areas of Figures 1-3 are detected in B 2 -Bradykinin receptor genes from blood donors. A customary PCR method is carried out for this. The amplified DNA fragments are then compared with one another in the customary manner, for example by means of gel electrophoresis. The above polymorphic areas are detected at different frequencies.
  • B 2 bradykinin receptors can be found which have changed in their gene or protein structure. This can be done via a DNA according to the invention or a polypeptide according to the invention.
  • the receptors can then be tested for their activity in conventional methods. Such methods can also include the use of drugs such as angiotensin converting enzyme inhibitors, kinin receptor agonists or antagonists and bradykinin agonists or antagonists, whereby their effect on altered B 2 bradykinin receptors can be examined.
  • drugs such as angiotensin converting enzyme inhibitors, kinin receptor agonists or antagonists and bradykinin agonists or antagonists, whereby their effect on altered B 2 bradykinin receptors can be examined.
  • Antibodies to modified B 2 bradykinin receptors can also be produced. These antibodies are suitable for both diagnostic and therapeutic purposes. Polypeptides according to the invention can be used in a conventional manner for their production.
  • the invention is illustrated by the following example.
  • Genomic DNA was isolated from 179 randomly selected blood donors. This genomic DNA was used to detect polymorphic areas in the respective B 2 bradykinin receptor genes. For this purpose, a PCR method was carried out, the primer pairs chosen being those which enable the polymorphic regions indicated in FIGS. 1-3 to be amplified. The following primer pairs were used: for exon 1: BE 1 F (5 '-G CCCTTCAAAGATGAG CTG-3') and BE 1 R (5 '-
  • BE2F (5'-CCATTTCTCCTCCCTGCTCGAG-3') and BE2R (5'-
  • the PCR reaction had a total volume of 50 ⁇ ⁇ and contained 1 ⁇ g of genomic DNA, 50 ng of forward (F) and reverse (R) primer, 1, 25 U Taq polymerase, 200 ⁇ mol of each of the dNTPs and 1.5 mM MgCl 2 .
  • the cycling conditions were initially 5 minutes at 94 ° C, followed by 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 53 ° C and 1 minute at 72 ° C for 40 cycles and an end extension time of 5 minutes at 72 ° C.
  • PCR products obtained were subjected to single-strand conformation polymorphism electrophoresis (SSCP electrophoresis).
  • 5 ⁇ ⁇ of the PCR mixture were diluted with 15 ⁇ ⁇ formamide and denatured at 95 ° C. for 5 minutes.
  • the SSCP gel was a 12% polyacrylamide gel buffered with 1 x TBE (85 mM Tris, 90 mM boric acid, 2 mM EDTA) and the electrophoresis was carried out in 1x TBE, at room temperature, with constant 120 volts for 24 hours.
  • the polymorphic region of FIG. 1 is detected in the form of the alleles 2G, 3G and 3T.
  • the PCR products (10 l) obtained were digested with 4 U Taql at 65 ° C. for 1 hour. This was followed by electrophoretic separation on a 2.5% MetaPhor TM agarose gel with 1 ⁇ TBE buffer containing 35 g / ml ethidium bromide at 100 V for 2 hours. The separation was made visible under UV light.
  • the polymorphic region of FIG. 2 is detected in the form of two alleles.
  • the one allele (C at nucleotide position 181) was cleaved twice by Taql, while the other allele (T at nucleotide position 181) is cleaved only once (cf. FIG. 6).
  • the PCR products obtained (10 ⁇ ⁇ ) were applied directly to a 1% agarose gel and electrophoretically with 1 ⁇ TBE buffer containing 35 ⁇ g / ml ethidium bromide at 100 V 2 Hours separated. The separation was made visible under UV light. 7 shows the separation.
  • the polymorphic region of FIG. 3 is detected in the form of the alleles R48, R35, RV1 and RV2.
  • the latter alleles have an intermediate number of repeats and are underrepresented.

Landscapes

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine, einen polymorphen Bereich eines B2-Bradykinin-Rezeptor-Gens umfassende Nukleinsäure, ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Nukleinsäure und deren Verwendung.

Description

Nukleinsäure mit einem poiγmorphen Bereich eines B2-Bradykinin-Rezeptor-Gens
Die vorliegende Erfindung betrifft eine, einen polymorphen Bereich eines B2-Brady- kinin-Rezeptor-Gens umfassende Nukleinsäure, ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Nukleinsäure und deren Verwendung.
Bradykinin ist ein vasoaktives Nonapeptid der Kininfamilie, das aus Kininogenen durch proteolytische Aktivität des Kallikreins freigesetzt wird. Bradykinin ist an verschiedenen physiologischen Prozessen, z.B. kardiovaskuläre Hämostase, Neuro- transmission, Zellproliferation oder bronchopulmonare Kontraktion, beteiligt. Hierzu wirkt Bradykinin über einen Zelloberflächen-Rezeptor, der als B2-Bradykinin-Rezep- tor bezeichnet wird. Dieser Rezeptor bindet an G-Proteine und triggert u.a. die Aktivierung von Phospholipase C und/oder Phospholipase A. Studien der genom¬ ischen Struktur des humanen B2-Bradykinin-Rezeptor-Gens zeigen, daß es 3 Exons umfaßt.
Es hat sich gezeigt, daß Bradykinin bei verschiedenen Erkrankungen eine Rolle spielt und in unterschiedlichen Mengen vorliegt. So ist z.B. bei Herzerkrankungen und Asthma die Bradykinin-Menge erhöht und bei Allergien erniedrigt.
Interessant wäre es nun zu wissen, ob auch der B2-Bradykinin-Rezeptor bei solchen Erkrankungen in unterschiedlicher Form vorliegt. In einem solchen Fall gäbe es neue Möglichkeiten der Diagnose und Therapie dieser Erkrankungen.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu¬ stellen, mit dem festgestellt werden kann, ob der B2-Bradykinin-Rezeptor bei vorstehenden Erkrankungen in unterschiedlicher Form vorliegt. Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen er¬ reicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine, einen polymorphen Bereich eines B2-Bradykinin-Rezeptor-Gens umfassende Nukleinsäure.
Der Ausdruck "polymorpher Bereich eines B2-Bradykinin-Rezeptor-Gens" umfaßt jeglichen Bereich eines B2-Bradykinin-Rezeptor-Gens, der einen Sequenz-Polymor- phismus bei Individuen einer Population, z.B. des Menschen, aufweisen kann.
Der Ausdruck "Nukleinsäure" umfaßt eine Nukleinsäure jeglicher Art, z.B. RNA und DNA, wobei letztere bevorzugt ist. Nachstehend wird die vorliegende Erfindung beispielhaft für eine DNA beschrieben.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß das B2- Bradykinin-Rezeptor-Gen polymorphe Bereiche aufweist. Dies geht aus jüngsten Arbeiten des Anmelders hervor, in denen DNA von Blutspendern hinsichtlich des B2-Bradykinin-Rezeptor-Gens untersucht wurde. Häufig gefundene, polymorphe Bereiche sind in den Figuren 1-4 angegeben.
Figur 1 beschreibt eine DNA, die einen polymorphen Bereich von Exon 1 eines B2- Bradykinin-Rezeptor-Gens umfaßt. Der polymorphe Bereich befindet sich an der Nukleotidposition 12 downstream der Transkriptionsstartstelle. Er stellt einen Tandem-Repeat-Polymorphismus dar und drückt sich z.B. in den Allelen BE1-2G, BE1 -3G und BE1 -3T aus. In BE1 -2G liegen zwei Einheiten des Repeats GGTGGGGAC vor, während BE1-3G drei dieser Einheiten aufweist. In BE1-3T liegen drei Repeat-Einheiten vor, wobei zwei dem vorstehenden Repeat entspre¬ chen und eine die Sequenz GGTGGTGAC aufweist.
Figur 2(A) beschreibt eine DNA, die einen polymorphen Bereich von Exon 2 eines B2-Bradykinin-Rezeptor-Gens umfaßt. Der polymorphe Bereich befindet sich an der Nukleotidposition 181 der cDNA. Er stellt einen Basen-Polymorphismus dar und drückt sich z.B. in den Allelen BE2-C und BE2-T aus. In BE2-C liegt ein C vor, was zu dem Codon CGT (Arg) führt, während BE2-T ein T aufweist, was das Codon TGT (Cys) bedingt. Figur 2(B) zeigt den offenen Leserahmen (ORF) der Allele BE2- C bzw. BE2-T.
Fig. 3 beschreibt eine DNA, die einen polymorphen Bereich von Exon 3 eines B2- Bradykinin-Rezeptor-Gens umfaßt. Der polymorphe Bereich befindet sich in der 3'- nicht-translatierten Region von Exon 3. Er stellt einen Polymorphismus von Repe¬ ats mit einer Konsensus-Sequenz, TGGA(A)GGGCTAGAACC, dar und drückt sich z.B. in den Allelen BE3-R48 und BE3-R35 aus. In BE3-R48 liegen 48 Repeats vor, während BE3-R35 35 Repeats aufweist.
Fig. 4 beschreibt eine DNA, die einen polymorphen Bereich der Promotorregion von Exon 1 umfaßt. Der polymorphe Bereich befindet sich an den Nukleotidpositionen 675 und 1 1 53. Er ist ein Basen-Polymorphismus und drückt sich z.B. in den Allelen BP-TC und BP-CT aus. In BP-TC liegen ein T(625) und ein Cd 153) vor, während BP-CT ein C(675) und ein T(1 1 53) aufweist.
Die DNAs der Figuren 1 -4 sind bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Die DNA von Fig. 3 wurde als BE3-R35/1 bzw. BE3-R48/1 und die DNA von Fig. 1 als BE1 -3T (Xba 7.0/2) bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroor¬ ganismen und Zellkulturen) unter DSM 9927, DSM 9928 bzw. DSM 9929 am 20. April 1995 hinterlegt.
Eine erfindungsgemäße DNA kann in einem Vektor bzw. Expressionsvektor vor¬ liegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressions¬ vektors for E.coli sind dies z.B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T und pET3b. Für die Expression in Hefe sind z.B. pY100 und Ycpadl zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z.B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind.
Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine, in einem Expressionsvektor vorliegende erfindungsgemäße DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101 , DH1 , x1776, JM101 , JM109 und BL21 , wobei letzterer bevorzugt ist, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa.
Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inse¬ riert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in Form eines Fusions¬ proteins exprimiert werden kann.
Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das Expressionsprodukt einer erfindungsgemäßen DNA zu isolieren und zu reinigen. Ein solches Expres¬ sionsprodukt, das auch ein Fusionsprotein sein kann, ist somit ebenfalls Gegen¬ stand der Erfindung.
Mit einer erfindungsgemäßen DNA können polymorphe Bereiche in einem B2-Brady- kinin-Rezeptor-Gen nachgewiesen werden. Damit ist es z.B. möglich, festzustellen, ob der B2-Bradykinin-Rezeptor bei verschiedenen Erkrankungen, wie Herzerkrankun¬ gen, Asthma und Allergien, in unterschiedlicher Form vorliegt.
Der Nachweis vorstehender Bereiche kann durch übliche Verfahren erfolgen. Es wird auf das nachstehende Beispiel verwiesen. In diesem werden die polymorphen Bereiche der Figuren 1-3 in B2-Bradykinin-Rezeptor-Genen von Blutspendern nachgewiesen. Dazu wird ein übliches PCR-Verfahren durchgeführt. Die amplifizier- ten DNA-Fragmente werden dann in üblicherweise, z.B. mittels Gelelektrophorese, miteinander verglichen. Es werden die vorstehenden polymorphen Bereiche in unterschiedlicher Häufigkeit nachgewiesen.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, festzustellen, ob bei bestimmten Erkrankungen ein veränderter B2-Bradykinin-Rezeptor vorliegt. Solche Erkrankungen könnten, insbesondere Myokardinfarkt, koronare Herzerkrankung, Kardiomyopa- thien, Hypertonie, vaskuläre Erkrankungen mit genetischer Disposition, Sterilität, Infertilität, Atopie, Asthma, Allergie, veränderte bronchiale Reaktivität und akute bzw. chronische Entzündungen sein. Bei all diesen Erkrankungen ist bekannt, daß Bradykinin eine Rolle spielt und in unterschiedlichen Mengen vorliegt. Die vorlie¬ gende Erfindung eignet sich somit zum Verständnis bestimmter Erkrankungen. Dies schließt eine Diagnose und Therapie dieser Erkrankungen ein. Erfindungsgemäß können B2-Bradykinin-Rezeptoren festgestellt werden, die in ihrer Gen- oder Pro¬ teinstruktur verändert sind. Dies kann über eine erfindungsgemäße DNA oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid erfolgen. Die Rezeptoren können dann in üblichen Verfahren auf ihre Aktivität getestet werden. Solche Verfahren können auch die Verwendung von Medikamenten, wie Angiotensin Converting Enzym-Inhibitoren, Kininrezeptor-Agonisten bzw. -Antagonisten und Bradykinin-Agonisten bzw. - Antagonisten, umfassen, wodurch deren Wirkung auf veränderte B2-Bradykinin- Rezeptoren untersucht werden kann. Des weiteren können auch Antikörper gegen veränderte B2-Bradykinin-Rezeptoren hergestellt werden. Diese Antikörper eignen sich sowohl in diagnostischer als auch therapeutischer Hinsicht. Zu ihrer Her¬ stellung können erfindungsgemäße Polypeptide in üblicher Weise verwendet werden.
Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel erläutert.
Beispiel: Nachweis von polymorphen Bereichen in B2-Bradykinin-Rezeptor- Genen
Von 179 willkürlich ausgewählten Blutspendern wurde genomische DNA isoliert. Diese genomische DNA wurde verwendet, um polymorphe Bereiche in den jeweili¬ gen B2-Bradykinin-Rezeptor-Genen nachzuweisen. Hierzu wurde ein PCR- Verfahren durchgeführt, wobei als Primer-Paare solche gewählt wurden, die eine Amplifika- tion der in den Figuren 1-3 angegebenen polymorphen Bereiche ermöglichen. Folgende Primer-Paare wurden verwendet: für Exon 1 : B E 1 F ( 5 '-G CCCTTCAAAGATGAG CTG-3 ' ) und BE 1 R ( 5 '-
AACTCCCCACGACCACAG-3') für Exon 2: BE2F (5'-CCATTTCTCCTCCCTGCTCGAG-3') und BE2R (5'-
GGTGGGCACGGAGTCCTCTC-3') für Exon 3: BE39F (5'-GAAGGTGGCCCAGTATGAGC-3') und B35R (5'-
GATTGGTCAGGATTTATGG-3')
Die PCR-Reaktion hatte ein Gesamtvolumen von 50 μ\ und enthielt 1 μg genom¬ ische DNA, jeweils 50 ng Forward- (F) und Reverse- (R) Primer, 1 ,25 U Taq- Polymerase, 200 μmol jedes der dNTPs und 1 ,5 mM MgCI2. Die Zyklisierungs- bedingungen waren anfangs 5 Min. bei 94°C, gefolgt von 1 Min. bei 94°C, 1 Min. bei 53°C und 1 Min. bei 72°C für 40 Zyklen und eine End-Extensionszeit von 5 Min. bei 72°C.
(a) Polymorpher Bereich in Exon 1
Um einen polymorphischen Bereich in Exon 1 nachzuweisen, wurden die erhalte¬ nen PCR-Produkte einer Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Elektrophore- se (SSCP-Elektrophorese) unterworfen. 5 μ\ des PCR-Ansatzes wurden mit 15 μ\ Formamid verdünnt und bei 95 °C 5 Min. denaturiert. Das SSCP-Gel war .ein 12%iges Polyacrylamidgel, gepuffert mit 1 x TBE (85 mM Tris, 90 mM Borsäure, 2 mM EDTA) und die Elektrophorese wurde in 1x TBE, bei Raumtemperatur, mit konstanten 120 Volt 24 Stunden durchgeführt. Nach Fixierung des Gels mit einer Mischung aus 895 Teilen Wasser : 100 Teilen Ethanol : 5 Teilen Essigsäure wurde dieses mit 0,1 % Silbernitrat 30 Minuten angefärbt. Das Gel wurde danach in 300 ml alkalischer Lösung, enthaltend 375 mM NaOH, 30 mg Natriumborhydrid, 1 ,2 ml Formaldehyd, entwickelt. Die SSCP-Analyse ist in Fig. 5 angegeben.
Es wird der polymorphe Bereiche von Fig. 1 in Form der Allele 2G, 3G und 3T nachgewiesen.
Bei den 179 untersuchten Blutspendern liegt folgende Verteilung von sechs "Genotypen vor: Genotyp 2G-2G 2G-3T 2G-3G 3T-3T 3T-3G 3G-3G
Anzahl * 48 52 42 9 18 10
Anzahl ** 50,4 46,7 42,5 10,8 19,7 8,9
* = beobachtet * * = statistisch erwartet
Daraus resultiert folgende Häufigkeit der Allele 2G, 3G und 3T:
Allele Häufigkeit
BE1 -2G 0,5307
BE1-3T 0,2458
BE1-3G 0,2235
(b) Polymorpher Bereich in Exon 2
Um einen polymorphen Bereich in Exon 2 nachzuweisen, wurden die erhaltenen PCR-Produkte (10 l) mit 4 U Taql bei 65°C für 1 Std. verdaut. Danach erfolgte eine elektrophoretische Auftrennung auf einem 2,5% MetaPhor™-Agarosegel mit 1 x TBE-Puffer, enthaltend 35 g/ml Ethidiumbromid bei 100 V 2 Stunden. Das Sichtbarmachen der Auftrennung erfolgte unter UV-Licht.
Es wird der polymorphe Bereich von Fig. 2 in Form zweier Allele nachgewiesen. Das eine Allel (C an der Nukleotidposition 181 ) wurde durch Taql zweimal gespal¬ ten, während das andere Allel (T an der Nukleotidposition 181 ) nur einmal gespal¬ ten wird (vgl. Fig. 6).
Bei den 179 untersuchten Blutspendern liegt folgende Verteilung von drei Genoty¬ pen vor:
Genotyp CC CT TT
Anzahl * 140 39 0
Anzahl ** 142,1 34,8 2,1
* = beobachtet * * = statistisch erwartet Daraus resultiert folgende Häufigkeit der Allele BE2-C und BE2-T:
Allele Häufigkeit
BE2-C 0,891 1
BE2-T 0, 1089
(c) Polymorpher Bereich in Exon 3
Um einen polymorphen Bereich in Exon 3 nachzuweisen, wurden die erhaltenen PCR-Produkte (10 μ\) direkt auf ein 1 %iges Agarosegel aufgetragen und elek- trophoretisch mit 1 x TBE-Puffer, enthaltend 35 μg/ml Ethidiumbromid, bei 100 V 2 Stunden aufgetrennt. Die Auftrennung wurde unter UV-Licht sichtbar gemacht. In Fig. 7 ist die Auftrennung angegeben.
Es wird der polymorphe Bereich von Fig. 3 in Form der Allele R48, R35, RV1 und RV2 nachgewiesen. Letztere Allele weisen eine Zwischehanzahl von Repeats auf und sind unterrepräsentiert.
Bei den 179 untersuchten Blutspendern liegt folgende Verteilung von 10 Genoty¬ pen vor:
R48 R48 R48 R48 R35 R35 R35 RV1 RV1 RV2 Genotyp
R48 R35 RV1 RV2 R35 RV1 RV2 RV1 RV2 RV2
Anzahl * 127 40 5 2 5 0 0 0 0 0 Anzahl** 126,5 42,0 4,2 1,7 3,5 0,7 0,3 0,0 0,0 0,0
* = beobachtet ** = statistisch erwartet
Daraus resultiert folgende Häufigkeit der Allele R48, R35, RV1 und RV2: Allele Häufigkeit
BE3-R48 0,8409
BE3-R35 0,1397
BE1 -RV1 0,0197
BE3-RV2 0,0059

Claims

Patentansprüche
1. DNA, umfassend einen polymorphen Bereich eines B2-Bradykinin-Rezeptor- Gens.
2. DNA nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der polymorphe Bereich in Fig. 1 angegeben ist.
3. DNA nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der polymorphe Bereich in Fig. 2 angegeben ist.
4. DNA nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der polymorphe Bereich in Fig. 3 angegeben ist.
5. DNA nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der polymorphe Bereich in Fig. 4 angegeben ist.
6. Polypeptid, codiert durch die DNA nach Anspruch 1.
7. Polypeptid nach Anspruch 6, nämlich jenes, das durch die DNA von Fig. 2 codiert ist.
8. Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach Anspruch 1.
9. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 8.
10. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach Anspruch 6 oder 7, um¬ fassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 9 unter geeigne¬ ten Bedingungen.
1 1. Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 6 oder 7 als Reagens zur Diagnose, Therapie und/oder Testung von Medikamenten.
12. Verwendung der DNA nach Anspruch 1 als Reagens zur Diagnose, Therapie und/oder Testung von Medikamenten.
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