WO1996030522A1

WO1996030522A1 - Molecule d'adn relative a la suppression d'une expression genique et nouvelle proteine

Info

Publication number: WO1996030522A1
Application number: PCT/JP1996/000719
Authority: WO
Inventors: Akihiko Saiga; Satoshi Orita; Hisanaga Igarashi; Kouichi Okumura; Gaku Sakaguchi
Original assignee: Shionogi & Co., Ltd.
Priority date: 1995-03-24
Filing date: 1996-03-19
Publication date: 1996-10-03
Also published as: AU699275B2; AU4956596A; CA2216428A1; EP0818536A1; CN1184506A; KR19980703267A; EP0818536A4

Description

明細耆遣伝子発現抑制に関連する D N A分子および新規タンパク質技術分野

本発明は、遣伝子発現抑制に関連する DN A分子および新規夕ンパク質に関する。詳細には、本発明は、ヒト T細胞白血病ウィルス I型由来の适伝子発現抑制機能を有する DN A分子、および該 DN A分子を含むプラスミドに関する。本発明はまた、ヒト T細胞白血病ウィルス I型 ¾伝子 LTRの U 5領域に存在する転写抑制領域に結合するタンパク質；該タンパク質の構造逸伝子；該遗伝子を有する発現べクタ一：該発現ベクターを導入した形質転換体；および該形質転換体を用いるヒト T細胞白血病ウィルス I型 S伝子 L T Rの U 5領域に存在する転写抑制領域に結合するタンパク質の製造方法に関する。本発明はさらに、該タンパク質を含有する抗ウィルス剤、および該タンパク質の発現を指摞とする癌の検出方法に関する。背景技術

ヒト T細胞白血病ウィルス〗型（human T-cell leukemia virus type I； HT LV— I) は、 1980年にヒ卜で初めて見出されたレトロウイルスである。このゥィルスの感染か、成人 T細胞白血病（adult T-cell leukemia； A T L) . HT L V- I閱連脊 ®症（HAM)、熱帯性瘦性麻瘅症（TSP) などの疾患の原因となり、ウィルスの感染から平均約 40〜50年という長期間にわたり体内に潜伏した後に発症することが明らかにされている。し力、し、その潜伏感染および癸症の機構についてはほとんど知られていない。

HTLV— Iの遣伝子は動物レトロウイルスに共通の、 ga g領域、 po l領域、および e n v領域の 3つの領域の他に、 t a xZr e x領域を有している。 t a xZr ex領域は、 env下流に位置し、ウィルス: S伝子の発現や A T Lの発症に重要な役割を担っていると考えられている。 t a x/r e xの mRNAは、 HTLV- Iの逮伝子の一次転写産物より 2段階のスプライシングを受けたものであり、オーバーラップする 2つのオーブンリーディングフレームを有している。

1つのオープンリーディングフレームから 40キロダルトンの Ta Xというタンパク質が翻択され、このタンパク質はウィルス自身の LTRや細胞の種々の逸伝子のプロモーターに作用して転写を活性化する。もう 1つのオープンリーデイングフレームからは 27キロダルトンの Rexというタンパク質が翻訳され、このタンパク質は転写後に核内で起こるウィルス RNAのプロセシングを Ϊ9節し、スプライシングを受けていない mRN Aの細胞質への移行に正の方向に作用する。

Re Xタンパク質と同じオープンリーディングフレーム内の異なる開始コドンから 21 kDのタンパク質 p 21 Xが翻訳される。発明者らは、この p 21 Xが、 HTLV- I遣伝子が 1段のスプラィシングを受けて第 2ェキソンを欠 t、た p 2 lXmRN Aから翻訳されることを明らかにした（Oritaら、 FEBS Lett.、 295、 127-134 (1991))。しかし、そのタンパク質の機能については未だ不明である。さらに、発明者らは、この p21XmRNAか、 H T L V— I感染細胞株において、 838から 0 〗、さらに e nv領域にいたる広範囲の欠失をもつ変異プロウィルスで発現していることも見いだした（Oritaら、 Nucleic Acids Res.、 21、 3799-3807 (1993))。また、 H T L V— I感染者末梢血リンパ球においても、 p 21 XmRNA力^ 上述のような変異プロウィルスより発現していることを見いだした。一方、完全型プロウィルスからの t a xZr e X領域の mRNAの発現は、 HTLV— I感染者末梢血中においてほとんど見られないことが知られており、インビボでは超高感度の検出法である RT— PCR法でしか検出できない。し力、、その発現は、感染者末梢血リンパ球をインビトロの培養系に移すと容易に検出し得るほど高くなることが知られている（Kiyokawaら、 Proc. Natl. Acad. Sci. US 、 82、 8359-8363 (1985)) 。また、 p2 lXmRNAの発現は、上記感染者末梢血リンパ球の培養前後で同程度であることも見いだしている（Orita ら、 J. Gen. Virol.、 73、 2283-2289(1992))。したがって、インビボでは、 t a x/r e xの mRN Aの発現が抑制されているが、 p 21 XmRNAは抑制されることなく発現しているものと考えられた。

HTLV— Iおよび RN Aウィルスの一種であるヒト免疫不全ウィルス（H I V)は、 DN A配列中のスプライシングシグナルを至適でないものとすることによって、スブライシング反応を遇らせ、 HTLV— Iの Re Xタンパク質および H I Vの R e Vタンパク質がスプライシング反応を抑制するための時間的猶予を持たせていると考えられている（Chang, D. D.および Sharp, P. A.、 Science^ 2 49、 614-615(1990))。そして、 R e xタンパク質および R e vタンパク質が充分量発現し、これらか核内に蓄積して S合することによって初めて、その機能が発揮され、 RXE (Rex responsible element)あるいは R RE (Rev responsib le element)を有するウィルス mRN Aのスプライシングの抑制および細胞質への移行を促進し、その結果、ウィルスの複製（構造タンパク質の発現）を引き起こすと考えられている（Inoueら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、 84、 3653-365 7 (1987)； Hidakaら、 EMfiO J.、 7、 519-523 (1988)； Seikiら、 Proc. Natl. Aca d. Sci. USん、、 7124-7128 (1988)；および、 Hanlyら、 Genes Dev.、 3、 1534 -1544 (1989))。

上記のように、 HTLV— :！に特有の pX領域から、少なくとも 2つの調節因子丁 a Xおよび R e Xタンパク質か翻訳され、これらの因子が HTLV— Iの複製に必要であることが示されている。 Taxは、 LTR (long terminal repea t) に働く転写活性化因子であり、さらに細胞側の種々の遣伝子を活性化する。

Ta xはまた、ある種の培養細胞を形質転換させる性質を示す。このように、 H T L V— Iによる細胞の癌化に T a Xが関与する可能性が示唆されている。

不 SS性感染期の HTLV - I遣伝子の発現は極めて低く、 ATL発症後においても低いことが知られている。そこで、 HTLV— Iの潜伏感染のメカニズムを解明するためには、ウィルス遗伝子の発現抑制機構を調べることが重要であると考えられる。 HTLV— I遣伝子の発現調節は主に HTLV— Iの LTR上で行われることが知られている。し丁偾域は113、 R、および U 5と呼ばれる 3つの領域に細分される。 U3領域には、 Taxが作用する配列、ならびに、細胞側の転写活性化因子である CREB、 ETS、 A P 1などが作用する配列が存在する。 R領域には、 YB— 1か結合して転写を活性化する配列が存在することが知られている (Kashanchiら、丄 Virol. , 68(1)： 561-565 (1994))。また、 Rおよびし '5領域には、 HTLV— I遣伝子発現について転写レベルおよび転写後に抑制的に働く領域がある（Xuら、 ol. Cell. Biol. , 14(8)： 5371-5383 (199 4)；および Seikiら、 Virology, 176: 81-86 (1990))。さらに、発明者らは最近新たに U 5領域の一部に転写抑制配列（U 5 Repressive Element； U 5 RE)を見いだし、さらに、 U 5 REに特昊的に粍合する 110kDa、 80kDa、および 70 kD aの 3つのタンパク Kの存在を報告した（Okumuraら、 FEBS Let., 356: 94-100 (1994))。発明の開示

本発明者らは、ヒト T細胞白血病ウィルス〗型の遺伝子発現抑制機構を解明するために、発現抑制に M連する适伝子配列およびタンパク質について検討を行つた。

本発明者らは、まず、 p 21 XmRNAを発現しているヒト T細胞白血病ウイルス I型（HTLV— I)の変異プロウィルスで欠失している領域であって、かつ完全型プロウィルスのゲノムに存在する領域中に、ウィルス遣伝子の発現を抑制する領域が存在することを予想し、ウィルスゲノムの DN A配列の一部をブラスミドに組み込み、 CAT¾伝子の発現を指標としたアツセィ系を用いて検討した。その結果、 po 1領域中に 2つのウィルス逸伝子発現抑制領域を見いだした。したかって、本発明の 1つの局面では、 p 21 XmRNAを発現している変異プロウィルスで欠失している傾域であって、完全型プロウィルスのゲノムに存在する領域中の、ヒト T細胞白血病ウィルス I型（HTLV— I) 由来の遣伝子発現抑制機能を有する A分子、および該 DN A分子を含むプラスミドが提供される。，

本発明の遣伝子発現抑制機能を有する D A分子は、配列表の配列番号 1の 2 268位の Cから 4080位の Tまでの DN A配列に含まれる連较する少なくとも 400個の核酸からなる DN A配列または該 DN A配列と約 59%以上の相同性を有する D N A配列を含む。

好ましい実施態様によれば、上記 DXA分子は、配列表の配列番号 1の 226 8位の Cから 4080位の Tまでの DN A配列に含まれる連統する少なくとも 4 00個の核¾からなる DNA配列または該 DNA配列と約 59%以上の相同性を有する DNA配列である。好ましい実施態様によれば、上記 DN A分子は、 S己列表の酉番号 1の 226 8位の Cから 3182位の Gまでの DNA配列または該 DNA配列と約 59 %以上の相同性を有する D N A配列を含む。

好ましい実施想様によれば、上記 DN A分子は、配列表の配列番号 1の 336 8位の Aから 3780位の Aまでの DNAE^Jまたは該 DNA配列と約 59¾以上の相同性を有する D N A配列を含む。

好ましい実施懸様によれば、上記 DNA分子は、配列表の配列番号 1の 316 5位の Αから 4080位の Tまでの DN A配列または該 DN A配列と約 59 %以上の相同性を有する D N A配列を含む。

本発明のプラスミドは、宿主細胞内で活性を有するプロモーター配列、上記のいずれかに記載の DN A分子、および、 RREまたは RXE配列を含む。

好ましい実施態様によれば、上記プラスミドは、さらに治療遣伝子 ffi列を含む。好ましい実施態搛によれば、上 ISプラスミドは、ウィルス感染細胞で発現率を高くさせるプロモーター Ε^ϋを含む。

好ましい実施筋様によれば、上記プラスミドは、上記プロモーターか L丁 Rである。

好ましい実施想様によれば、上記プラスミドは、上記治療 δ伝子配列が、宿主細胞に対して毒性であり得る S伝子配列あるいはウィルス複製を阻止し得る遣伝子配列である。

本発明の DNA分子は、遣伝子発現抑制またはウィルス感染症の処置に使用される。，

好ましい実施態様では、上記ウィルス感染症は、ヒ卜 Τ細胞白血病および Η I V感染症、特に A I DSである。

発明者らはまた、 U 5 REに特異的に結合するタンパク質についてさらに種々の検討を行い、その結果、このタンパク質の 1つをコードする新規の cDNAを単離した。大腸菌を用いてこの遺伝子を発現させ、得られた産物が、 DNA結合夕ンパク質の Kruppel型亜鉛フィンガードメインと、転写抑制に働くと考えられている Kruppel型の転写抑制因子に共通するドメィンとを有するタンパク質であることを見出した。さらに、このタンパク質が U 5 REに結合し、転写抑制に作用することを見出し、これを T R P— 1 (Transcriptional Repressive Protein -1) と命名し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の他の局面では、ヒト Τ細胞白血病ウィルス I型遣伝子 L T Rの U 5領域に存在する U 5 R Eに特異的に桔合する、上記従来技術とは別のタンパク質、特に Kruppel型の転写抑制因子に共通するドメインおよび 4個半の K ruppel型亜鉛フィンガードメインを含むタンパク貧か提供される。本発明のさらに他の局面では、上記タンパク質の構遣遗伝子；該遺伝子を有する発現べクタ一；該発現べクタ一を導入した形質転換体；および該形晳転換体を用いるヒト T 細胞白血病ウイルス I型 *伝子 L T Rの U 5領域に存在する転写抑制領域に結合するタンパク質の鬟造方法が提供される。

本発明のヒト T細胞白血病ウィルス I型 δ伝子 L T Rの U 5領域に存在する転写抑制領域に結合するタンパク質（T R P— 1 ) は、 Kruppel型の転写抑制因子に共通するドメインおよび 4個半の Kruppel型亜鉛フィンガードメインを含む。好ましい実施態様によれば、上記タンパク質は、上記 Kruppel型の転写抑制因子に共通するドメィンか配列表の配列番号 1 5の 1 9 6位の Valから 2 6 1位の T rpまでのアミノ酸 g£ ^またはその類似の配列であり、そして上記 4個半の Kruppe 1型亜鉛フィンガードメィンが配列表の BS^U番号 1 5の 5 1 8位の Tyrから 6 4 8 位の Hisまでのァミノ酸配列またはその類似の配列である。

好ましい実施態様によれば、上記タンパク質は、配列表の配列番号 1 5の 1 5 4位の Leuから 1 8 5位の Leuまでのァミノ酸配列、配列表の配列番号 1 5の 4 0 3位 Proから 4 4 3位の Proまでのアミノ酸列、および配列表の配列番号 1 5 の 4 7 0位の Arg力、ら 5 0 3位の Glyまでのアミノ酸 SS^iJ、あるいは、これらのァミノ酸配列に類似の配列をさらに含む。

好ましい実施憨搛によれば、上記タンパク質は、配列表の配列番号 1 5の 1位の Metから 6 8 8位の Alaまでのァミノ酸配列またはその類似の配列を含む。

本発明の D N A分子は、上記のいずれかに記裁のタンパク質をコードする。好ましい実施態様によれば、上記 D N A分子は、酉 ij表の配列番号 1 5の 7 2 4位の Gから 9 2 1位の Gまででなる塩基配列. および配列表の配列番号 1 5の 1 6 9 0位の Tから 2 0 8 2位の Cまででなる塩基配列を有する。好ましい実施 »様によれば、上記 DNA分子は、配列表の配列番号 15の 59 8位の Cから 693位の Gまででなる塩基 E列、配列表の E^J番号 15の 134 5位の Cから 1467位の Gまででなる塩基配列、および Bi^表の配列番号 15 の 1546位の Cから 1647位の Gまででなる塩基酉^ IIをさらに有する。

好ましい実施態様によれば、上記 DN A分子は、表の配列番号 15の 13 9位の Aから 2202位の Cまででなる塩基配列を有する。

好ましい実施態様によれば、上記 DNA分子は、配列表の配列番号 15の 1位の Cから 3776位の Aまででなる塩基配列を有する。

本発明の発現ベクターは、上記のいずれかに記載の DN A分子を有する。

本発明の形質転換体は、上記発現ベクターを宿主に導入して得られる。

好ましい実施態様では、上記宿主が大腸菌である。

本発明のヒ卜 T細胞白血病ウィルス I型遣伝子 LTRの U 5領域に存在する転写抑制領域に合するタンパク質の製造方法は、上記形質転換体を培養する工程、および産生されたタンパク質を培養培地から回収する工程を包含する。

本発明はまた、上記タンパク質を有効成分として含有する抗ウィルス剤を提供する。本発明の抗ウィルス剤は、 HTLV— Iに対して有効であり、さらに、ヒ卜免疫不全ウィルス、サイトメガロウィルスなどに対しても有効である。

さらに、本発明は、癌の検出方法を提供する。この本発明の方法は、上記タンパク質の発現を指標とするものである。図面簡単な説明

図 1(a)は、 HTLV— Iゲノムの各領域の概略を表し、図 1(b)は、 pRC/CMV- CATベクタ一の C A T遺伝子をコードする領域とゥシ成長ホルモンポリ Aシグナノレ（BGH pA) との間に、 HTLV— Iゲノムの各領域を組み込んで構築したブラスミドを表す。

図 2は、 HTLV— Iゲノムの R1〜R5領域の DNA配列をそれぞれ組み込んだ pRC/CMV-CATプラスミドを卜ランスフエク卜した HeLa細胞についての CAT 活性アツセィの琿層クロマトグラムである。

図 3は、 HTLV- Iゲノムの R6〜R9および R21領域の DNA配列をそれぞれ組み込んだ pRC/CMV-CATプラスミドをトランスフエクトした HeLa細胞についての CAT活性アツセィの薄層クロマトグラムである。

図 4は、 HTLV— Iゲノムの R7— R9領域の DNAK列をそれぞれ組み込んだ pRC/CMV-CATプラスミドをトランスフエタトした HeLa細胞の、 CATit伝子を鎊型としたノーザンブロット分析の結果を示す。

図 5は、 HTLV- Iゲノムの R 7、 R8、および R21領域の DNA配列をそれぞれ組み込んだ pRC/CMV -CATブラスミドの 3'側下流に RXEをセンス（+ ) またはアンチセンス（一）に組み込んだプラスミドをトランスフエク卜した HeLa 細胞についての CAT活性アツセィの薄クロマトグラムである。

図 6は、 HTLV—】ゲノムの R 7、 R 8、および R21領域の DNA配列をそれぞれ組み込んだ pRC/CMV-CATプラスミドの 3'側下流に RXEをセンス（+ ) またはアンチセンス（一）に組み込んだプラスミドをトランスフエク卜した HeLa 細胞の、 CAT遣伝子を铸型としたノーザンブロット分析の桔果を示す。

図 7は、 HTLV— Iゲノムの R 8を 5'または 3'側から欠失させ、得られた欠失変異領域の DNA配列を組み込んだ pRC/CMV- CATブラスミドを卜ランスフエクトした HeLa細胞の C A丁活性を示すグラフである。

図 8は、 C 413および N413をセンスあるいはアンチセンス方向に組み込んだ pRC/CMV-CATプラスミドをトランスフ iク卜した He 細胞についての CAT 活性の薄眉クロマトグラムである。

図 9は、 H I V感染症（例えば A I DS) への ¾伝子治療用プラスミド中の構成ュットを示す模式図である。

図 10は、本発明の TRP— 1タンパク質のドメイン構造の模式図である。図 1 1は、本発明の TRP— 1タンパク質の亜鉛フィンガードメインのァミノ酸配列の保存的配列の比較を示す。

図 12は、本発明の丁 RP— 1タンパク質と K i d - 1との、 KRAB-Aおよび KR AB-Bドメインのァミノ酸の比較を示す。

図 13は、大腸菌を用いて発現させた本発明の TRP— 1タンパク質のゲルシフ卜アツセィによる結合特異性解析の電気泳動 ¾果を示す。

図 14は、種々の培養細胞における本発明の TRP— 1の mRNAの発現のノーザンブロッ卜分析の; 泳勖結果を示す。

図 15は、種々の培養細胞における本発明の TRP— 1の mRN Αの発現のノーザンプロット分析の ¾気泳動結果を示す。

図 16は、（A)および（B) ともに、各組維における本発明の TRP— 1の mRN Aの発現のノーザンブロット分析の靈気泳動結果を示す。

図 17は、 C A Tアツセィにおける本発明の T R P— 1タンパク質の U 5 R E に対する機能解析の桔果を示す。発明を実施するための形態

( I )定義

以下に、本発明を説明するうえで用いられる用語を説明する。

nCruppel型亜鉛フィンガードメイン」とは、亜鉛原子の周りにポリペプチド鎮が折りたたまれることによって形成される、タンパク質中の構造的ドメィンであって、一般に、このドメインは、 DN A祜合タンパク質中に見出され、タンパク質と DN Aとの結合に関連していると考えられている（Witzgallら、 ϊοΐ. Cel 1. Biol. , 13(3) :1933-1942 (1993) ; Constantinou-Deltasら、 Genomics, 12 (3):581-9 (1992)；および Numotoら、 ucl. Acids Res., 21(16) :3767-75 (199 3)) 。例えば、本発明のヒト T細胞白血病ウィルス I型遺伝子 LTRの U5領域に存在する転写抑制領域（U5RE ； 15 Repressive Element) に結合するタンパク質（TRP— 1) は、 Kruppel型亜鉛フィンガードメインを 4個半有する。

ni ppel型の転写抑制因子に共通するドメイン」とは、 Kruppel型の転写抑制夕ンパク質に共通して認められるドメィンであり、 D N Aの転写抑制に関与していると考えられるドメインである（Witzgallら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 91(10):4514-8 (1994)：および Margolinら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91 (10):4509-13 (1994))。本明細書中では、以下、このドメインを KRAB-A, Bドメイン (Kruppel associated box-A, B domain) と称する ₀

アミノ酸配列または DN A配列に「類似の配列」とは、特定の配列に必ずしも限定されることはなく、この B ^に加えて当業者に公知の置換、挿入、欠失などを含み、そしてコードされるタンパク質の機能または活性が実質的に同じ程度で

Θ ある改変を含む配列をいう。あるいは、タンパク質の機能または活性が実質的に同じ程度であるならば、化学的または生化学的な改変、あるいは非天然または誘導化されたアミノ酸または塩基を含んでいてもよい。例えば、上記 TRP— 1タンパク質の場合は、好ましくは、天然型と約 50%以上の類似性または約 35%以上の相同性を有する。より好ましくは、天然型と約 70½以上の類似性または約 50% 以上の相同性、さらに好ましくは、それぞれ約 80%以上、約 65¾以上を有する。ここで、「類似性」とは、アミノ酸を以下の Α〜Εの 5つの群に分け、各群内のアミノ酸を同一として数えたときの、類似配列中の比較する配列に対する同一のァミノ酸の割合（¾) である。 Α群： Ala、 Ser、 Thr、 Pro. および Gly； B群： A sn、 Asp、 Glu、および Gin； C群： His、 Arg、および Lys； D群： Met、 Leu、】le、および Val；ならびに E群： Phe、 Tyr、および Trp。また、ァミノ K 列の「相同性」とは、全く同じアミノ酸のみを同一として数えたときの、類似配列中の比較する配列に対する同一のアミノ酸の割合（％) である。さらに、 DNA配列の「相同性」とは、特定の 0^11に必ずしも限定されることはなく、この配列に加えて当業者に公知の置換、挿入、欠失などを含み、特に、この DN Α配列が有する機能、例えば、 HTLV— Iの遗伝子発現抑制機能、が実質的に同じ程度である改変を含む配列をいう。

(I I)本発明に用い得る方法

本発明の各工程において用い得る一般的な生化学的実 «あるいは分子生物学的実狭手法（DNAの電気泳動、篾気泳動分離した DNAをゲル中から回収する方法、ライゲーシヨン、宿主の形質転換、組换ぇ宿主の培養、プラスミド DNAの調製、 DN Aの制限酵素による切断、 DNAの放射標識など）は、例えば Molecu lar Clonin 第 2版（liariiatisら、 Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)) に記載されているような、当業者に公知の方法が採用される。

A. HTLV— I由来の遣伝子発現抑制機能を有する DN A分子の検討

( 1 ) H T L V - Iゲノム上の種々の領域を含むブラスミドの構築

HTLV- 1感¾¾胞株としては、例えば、 M丁一 1、 MT— 2、 MT— 4、

TL— S u、 H S S 3な 'が fflい^れ、他に Λ Tし患き由水木悄 ώ血球が用 C、れ得る。これらの細胞を培養し、または培養せずに、細胞から全 RN^T Αの抽出か酸グァニジゥムチオシァネートーフエノールークロロホルム抽出法によって行われる。抽出した RN Aをランダムへキサヌクレオチドプライマ一とァニールさせた後、逆転写酵素と反応させることにより、 cDNAが¾製される。

まず、 HTLV— Iゲノムの、例えば図 1(a)に R1などで示すような適当な長さに設定した種々の領域を含む DN A配列は、 HTLV— Iのゲノム DNAを鋅型とし、所望の領域に適切な合成ブライマーセットを用いて、公知の PCR法により得られ得る。プライマーには、後のサブクローニングに使用し得るように、 5'側に N'ot I部位、 Hind III部位、 Apa I部位、 Xba I部位などの制限酵素部位が含まれていてもよい。また、 HTLV— Iゲノム上の各領域は、化学的または生化学的に改変され得るか、あるいは非天然または誘導化された塩基を含んでいてもよい。天然に生じる DNAE列以外の配列を含む組換え DN A配列もまた、本発明により提供される。天然型 DNA配列の代わりの型もまた提供され、これには、欠失、揷入、 1つ以上の塩基の置換によるものを含むがこれらに限定されない。好ましくは、天然型と 59%以上の相同性を有する。

PCR法により増幅した各領域を含む DN A配列は、例えばゲルで分離して回収し、制限酵素を用いて所望の部位を切出した後、プロモーター、発現を調節しようとする遣伝子配列などか組み込まれたまたは組み込まれ得る適切な発現べクター中に組み込まれ得る。好ましくは、プロモーター、 ^!丁ー 1の発現抑制領域、 RXEまたは RREなどが含まれるように設計され得る。さらに好ましくは、プロモーター、治療遣伝子 Bfi^、 HTLV—】の発現抑制領域、 RXEまたは R Eなどか含まれるように設計され得る。あるいは、目的に応じて、プロモ一ターの 5'上流に組み込んだり、または、適切な位 ®へアンチセンス方向に組み込むことも可能である。

発現ベクターとしては、真核細胞発現ベクターを用い、これらの発現ベクターをトランスフヱクトする細胞としては、哺乳類細胞（例えば、 He 細胞、 Jurkat 細胞、 COS細胞、 CHO細胞など）が好ましいので、これらの選択された細胞株で発現可能なベクタ一を用いる。 SV40系べクタ一、ゥシパピローマウィルスベクター、ヘルぺスウィルスベクター、アデノウイルスベクター、ボックスゥィルスべクター、レトロウイルスべクターなどの哺乳類細胞の発現べクターを用い得る。好ましくは、レトロウイルスベクターを用いて、 Jurkat細胞にトランスフエク卜され得る。

プロモーターとしては、公知のものはいずれも使用し得、ウィルス感染細胞で発現率を高くさせるプロモーターが好ましい。哺乳類細胞において発現し得るプ口モーターは、例えば、サイトメガロウィルス初期プロモーター（CMV) 、ゥィルス性 LTR (long terminal repeats 例えば、 HTLV— I LTR、ラウス肉臛ウィルス LTR、 H I V— LTR) 、 S V40初期プロモーター、および単純へルぺスチコシンキナーゼウィルスプロモーターが包含される。好ましく.は、ウィルス性 LTR、 CMVであって、最も好ましいのは、ウィルス性 LTRである。

発現を調節しょうとする遣伝子配列としては、目的に応じて種々のいかなる遣伝子配列も用いられ得る。例えば、 HTLV— Iゲノムの各領域の発現抑制活性を挨討する目的では、その遺伝子配列によりコードされるタンパク質が発現されて、容易に抉出し得る遗伝子が用いられる。例えば、クロラムフニコールァセチルトランスフ tラーゼ（CAT) 遣伝子、ルシフェラーゼ（Lu c) ¾伝子などが用いられ得る。また、感染細胞を攻撃する目的あるいはウィルス複製の阻止の目的では、感染細 <胞（感染宿主細胞）内で所定の生物活性を発揮し得る遣伝子配列が用いられ得る。感染細胞に対して毒性であり得る遣伝子配列あるいはウイルス複製を阻止し得る遣伝子配列は、治療遺伝子として当該分野で公知である。 ¾染紬胞に対して毒性であり得る S伝子としては、毒性遣伝子などが挙げられ、例えば、ジフテリアトキシン Aフラグメント（DT— A)遣伝子、単純へルぺスチミジンキナーゼ（HSTK)遣伝子などがある。ウィルス複製を阻止し得る S 伝子としては、例えば、アンチセンス核酸、リホ'ザィム、デコイ、トランス ' ドミナント · ミユータントなどが含まれる。

RXEまたは RREは、後述のように、本発明の H T L V— Iの逸伝子発現抑制領域の機能を解除する領域である。これらの領域に作用する R e Xまたは R e Vタンパク質がそれぞれ発現している HTLV— Iまたは H】 V- I感染細胞では、遣伝子発現抑制機構に対する解除機構が働いて、上記治療遣伝子が発現し得る。さらに、 RXE.または RREは、それぞれ HTLV— Iまたは H I V— I由来の領域だけでなく、例えば、 HTLV— I I、 H I V— I Iなどの RXE、 R REなどであってもよい。

さらに、 mRN Aの 3'末端に存在するポリ Aを付加するためにポリ Aシグナルが導入され得、例えば、ゥシ成長ホルモンのポリ Aシグナル（BGHpA) 、 S V40のポリ Aシグナル（S V40 p A)が用いられる。

上記のプロモータ一などの配列を有する発現ベクターもまた、 HTLV— Iゲノ厶中の抑制領域を検索するためなどの目的に応じて、適宜市販のベタターから選択してもよい。 HTLV— Iゲノム中の抑制領域を検索するためには、例えば、 pRC/CMV-CATベクター（Itwitrogen社製）か使用され得る。このような発現べクターに、例えば図 1(b)に示すような Not I部位に、 DNAライゲーシヨンキット (宝酒造製）を用いて HTLV— Iゲノムの各領域を組み込んで、プラスミドを楫築し得る。得られた各プラスミドについて、例えば、 T 7シークェンシングキット（フアルマシア社製）を用いて塩基配列を翻べ、所定のものであることを確認し得る。これらのプラスミドは、例えば E.coli JM109株を形質転換して培養し、塩化セシゥム密度勾配遠心分離を行うことにより精製し得る。

(2) DNAトランスフエクシヨン

上記（1)項で得られる各プラスミドで、以下のようにして適当な細胞をトランスフヱク卜し得る。例えば、上記プラスミドおよびルシフヱラーゼ〔Luc)遺伝子を有する pRC/CMV- Lucベクター（CMV-Luc)を含む混合物を、 HeLa細胞または Ju rkat細胞などに、公知の方法（例えば、リポフヱクチン（GIBCO BRL)法）に従つてトランスフ iクトする。トランスフ Lクトした細胞を培養した後、ライセートを調製し、遠心分 *1して上清を得る。この上清について、 CMV- Luc由来のルシフヱラーゼ活性を公知の方法（例えば、ピツカジーンキット（東洋インキ社製）を用いるルーマツト ·モデル LBお 01 (ベルトルード社製）による方法）により測定し、この結果をトランスフエクシヨン効率を補正するために用い得る。

(3) CA丁アツセィ

上記（2)項で得られる上清について、例えば、クロラムフユ二コールァセチルトランスフ iラーゼ（CAT)遣伝子を含むブラスミドで卜ランスフヱクトした場合、当該分野で公知の方法（Fordisら、 Methods in Enzymology. 151、 382- 397 (1987)) により CAT活性を測定し得る。例えば、上清に¹⁴Cで放射標雜したクロラムフ二コールおよびァセチル CoAを加え、インキュベートする。次いで、酢酸ェチルを用いて抽出した後、濃縮し、薄雇クロマトグラフィー（TL C) プレートにスポッ卜する。これを、クロ口ホルム：メタノール =95： 5の展開溶媒で飽和した展開槽で展開し、例えば Biolmage analyzer (Fujix社製）付属のイメージングプレートに 1時閱接触させて、 X線フィルムへの焼き付けを行う。これにより、発現した C A丁によりァセチノレ化されたクロラムフエ二コールの割合を決定し得る。ァセチルイ匕クロラムフエ二コールはクロラムフヱニコールよりも脂溶性が高いため、順相 TLCプレート上での R f値が大きい。このアツセィによる CAT活性が高いほど、組み込まれた領域の発現抑制活性が低く、逆に、 C AT活性が低いほど、発現抑制活性が髙いことを示す。

(4) HTLV— Iゲノムから転写される RNA量の確錁

HTL V— Iゲノムの各領域を含むプラスミドから転写される RNAの盪は、以下のようにノーザンブロッテイングして分析し得る。各プラスミドで適当な細胞をトランスフエク卜し、総 RN Aを抽出する。次いで、 RN Aをァガ口一スーホルムアルデヒドゲルで電泳動し、メンブレン（例えば、ナイロン腠、ニトロセルロース膜）にブロッテイングする。例えば、 CAT遣伝子を含むプラスミドの場合、 CAT遺伝子を铸型として、 ⁸²Pなどで標識したプローブとハイブリダィズすることにより、 X維フイルムを用いて CAT RNA量を検出し得る。 CAT RNA量が多い場合は、転写レベルで抑制されていないことかわかる。

(5) ,欠失変異領域を有するプラスミドの構築

商い抑制活性を示す領域について、その抑制活性の中心部を探るために、該領域を 5'側、 3'側の双方向より欠失させて、得られた亜領域を持つプラスミドを構築し得る。まず、領域を 5'側から欠失させるため、これを例えば Not Iで切断した後、平滑末端とし、さらに、該領域内の Eco NI部位で切断したものを、例えば deletionキット（宝酒造製）で欠失させ得る。一方、 3'側からの欠失も、 Apa I および Xba Iで切断した後、 deletionキッ卜で欠失させ得る。このようして得られる欠失変異領域をベクターに組み込む。得られたプラスミドの CAT活性を測定して、 CAT活性の抑制に最低限必要とされる領域を検索し得る。抑制活性の中心部であれば、その一部が欠失することにより CAT活性が抑制されなくなること力、ら、活性中心部がわかる。

( 6 ) 遣伝子発現抑制機構の解明

以下の実施例より明らかなように、 P 21 XmRNAを発現している変異プロウィルスで欠失している領域であって、完全型プロウィルスのゲノムに存在する領域中に、 H T L V— I由来の遠伝子発現抑制機能を有する D N A配列が存在する。この HTLV— I由来の ¾伝子発現抑制領域は、生体内でウィルス遺伝子の発現を抑制することにより、免疫機構による排除からウイルス感染細胞を逃避させ得、 HTLV— Iの潜伏感染機構において重要な役割を果たし得る。さらに、この遣伝子発現抑制作用は、充分量の Re Xタンパク質の癸現により解除され得、ゥィルスの複製を効率よく起こす機序としても重要な役割を果たしていると考えりれる。

B. HTLV— I遣伝子の転写抑制領域に結合するタンパク質の検討

(1) TRP—：！の cDNAのクローニング

本発明のタンパク質である TRP— 1をコードする DNAを含む DNA断片のクローニングを配列決定方法と共に以下に例示する。この DN A断片の配列は、例えば、 U 5 REを数個連結させた DN Aをプローブとして、急性リンパ性白血病患者末梢血由来の細胞株である Molt-4細胞、 Jurkat細胞、 CEM細胞などの c D N Aライブラリーをスクリーニングし、スクリーニングによって得られた DN A を DN Aシークェンシングにより分析することにより、決定され得る。

(1. 1) DNAプ d—ブの作成

本発明のタンパク質である T R P— 1は U 5 R Eに結合すること力、ら、 T R P 一 1をサウスウェスタン法でスクリーニングするためのプローブとしては、 U δ REに相当する DNA配列を有するプローブを使用し得る。このプローブは、例えば、以下のように作成し得る。まず、 U5REを含むように合成された DNA 断片を精製し、熱変性させた後、二本鎖 DNAにする。次いで、得られた二本鎖 DN' Aのライゲーションを行って、 U 5 REが数個連結した配列を含む二本鎖 D NAとする。これを適当なプラスミド（例えば、 pSL1180、 pUC118、 pU19) に組み込んだ後、 PCR増幅用の铸型として使用する。 PCRを、例えば、放射標識用の³² P-dCTP存在下で行うことにより、サウスウェスタン法に用いるためのブローブを作成し得る。

(1. 2) ライブラリ一のスクリーニング

TRP— 1をコードする DN Aをスクリーニングするためのライブラリーとして、急性リンパ性白血街患者末梢血由来の細胞株である Molt-4細胞、 Jurkat細胞、細胞などの様々なライブラリーを用い得る。例えば、ヒト急性リンパ性白血病細胞株 Molt-4の pSport 1の cDNAライブラリ一は、以下のようにして作成し得る。まず、 Molt-4細胞から、グァニジンチオシァネート法（Choraczynskiら、 A nal. Biochem. 162. 156-159 (1987)) によって、 RNAを抽出し得る。この R NAから、例えば、 Oligotex (Takara Shuzo社製）、 Oligo dT Agaroseカラムを用いて mRNAを得、この mRN Aより、例えば Superscript cDNA合成システムを用いて c DNAおよび適切な発現ベクターに組み込まれた c DNAライブラリーを作成し得る。

次に、得られた cDN Aライプラリーを適当な宿主、例えば大腸菌に導入して、シャーレに撖き、これをニトロセルロース膜などの適当な腹に接触させた後、培養して、タンパク質を発現させる。このようにして調製したニトロセルロース膜上に固定された cDN Aから生じたタンパク質と上記のプローブとの DN A結合活性を指標にしてスクリーニングを行い得る。

さらに、上記スクリーニングで得られた cDN' Aクローンより調製した cDN A断片をプローブにして、 c DN Aライブラリーをコロニーハイブリダィゼーション、，プラークハイブリダィゼ一シヨンなどによりスクリ一ニングし得る。

(1. 3) クローンの塩基配列の決定

ライブラリーをスクリーニングして得られたクローンの挿入断片の塩基配列の決定は、例えば、ジデォキシ法 Sanger, Science, 214. 1205-1210 (1981)) に従って行い得る。このようなクローンを解析して得られた TRP— 1の DNA配列およびアミノ酸配列を、配列表の酉己列番号 15に示す。

( 2 ) 組換え T R P - 1の発現および U 5REとの結合解析

本発明の TRP— 1をコードする遣伝子は、 .：! [当なベクター、例えば、 pRSET、 pAM82、 pCDM8などに組み込まれて、 T R P— 1を発現させるための発現ベクターとされる。

この発現ベクターを、例えば、細菌、酵母、虽虫細胞、または動物細胞に導入して、形質転換体が作成される。この形質転換体を培養することにより、本発明の TRP— 1か産生され得る。

例えば、 pRSETの Kpnl-Notl部位に本発明の T R P一 1遺伝子を組み込んで、該遣伝子を含む発現ベクターを作成し、これを大臊菌 BL12株に導入することによつて形質転換体を作成し得る。この形質転換体は、オリゴヒスチジンをァミノ末端に有する融合タンパク質として発現され得る。このようにして得られた TRP— 1産生培養物は、ァフィ二ティーカラム法などで精製され得る。

TRP—: Iと U5REとの結合解析は、例えば、以下のように行い得る。 ³²P で標識した U 5 RE DN Aと精製した上記の組換え TRP— 1とを、結合反応用緩衝液中で poly d(I-C)存在下で反応させて、その反応液をポリアクリルアミドゲルで ¾気泳動し、これを ¾牴上で乾燥させた後、オートラジオグラフィ一により解析できる。

(3) TRP- 1の組繊分布の確認

本発明の TRP— 1の組維分布は、例えば、 mRNAの発現または TRP— 1 の発現を分析することにより、確認することができる。 mRNAの発現については、 cDNAを用いてノーザンプロット分析により確認し得る。 TRP— 1の発現については、 TRP— 1に対する抗体を作成した後、ウェスタンプロット分析により確認することができる。

(4).TRP - 1の機能解析

TRP- 1は U 5 REに結合して転写抑制に関与すると考えられるので、その機能解析は以下のように行うことができる。例えば、 TRP— 1が発現されるように組み込まれた発現べクタ一と、 U5RE遣伝子および発現の指標となるような遺伝子か組み込まれた究現ベクターとを、適当な細胞に同時に導入する。これを培養して指摄となる适伝子の発現を測定することにより、 TRP— 1が U5R Eを介して発現を抑制するか否かを確認できる。

発現の指標となるような遣伝子としては、その遣伝子配列によりコードされるタンパク質の発現が、容易に検出され得る S伝子が用いられる。例えば、クロラムフ _Λニコールァセチルトランスフヱラーゼ（CAT)遺伝子、ルシフェラーゼ (Lu c)遣伝子などが用いられ得る。実施例

[実施例 1 ]

(1) HTLV— Iゲノム上の各領域の遗伝子発現抑制作用の有無を解析するためのプラスミドの構築

遺伝子発現抑制作用の有無を解析した HTLV— Iゲノム上の各領域は、図 1 中に示すように、 R1 (記列表の配列番号 1の 1351位〜 3182位）、 R2 (配列表の列番号 1の 3165位〜 4984位）、 R3 (配列表の配列番号 1 の 4951位〜 6635位）、 R4 (配列表の配列番号 1の 2268位〜 407 8位）、 R5 (配列表の配列番号 1の 4061位〜 5782位）、 R6 (配列表の配列番号 1の 1351位〜 2268位）、 R7 (S£列表の配列番号 1の 226 8位〜 3182位）、 R8 (配列表の配列番号 1の 3165位〜 4080位）、および R9 (配列表の配列番号 1の 4061位 ~4984位）である。変異プロウィルスで欠失していないため抑制作用かないと考えられる領域 R 21 (配列表の配列番号 1の 7302位〜 8201位）を、比較のためのネガティブコント口ールとして用いた。なお、ヌクレオチドの塩基番号および組成は、公表されている HTLV— I ATKクローンのものを用いた（Seikiら、 Pro Natl. Acad. Sci. USA., 80、 3618-3622(1983))。図 1 (a)は、 HTLV- Iゲノムの各領域の概略を示し、長方形で示される部分は、 HTLV— Iの LTRおよび各構成遣伝子を表す。 ▼はスブライスドナーシグナルを、 ▲はスプライスァクセプターシグナルを表す。図 1(b)は、 HTL V- Iゲノムの一部を組み込んで遣伝子発現抑制作用を調べるためのブラスミド pRC/CMV-CATの概略図であり、 P_CMVは CM Vプロモータ一を、 BGHp Aはゥシ成長ホルモンボリ Aシグナルを表す。図 1 (b)の破敏部は、この位 Sに HTLV— Iゲノム上の遣伝子配列が組み込まれ得ることを示す。

HTLV— Iゲノムの各領域は、 HTLV— I感染細胞株 TL一 S uのゲノム DNAを铸型とし、以下の表 1に示すプライマーを合成し、これらを組み合わせ

1B て用いて PCR法により得た。各ブライマーとも、後のサブクローニングに使用し得るように 5'側に Not I部位を設けた。表 1

HTLV— Iゲノムの各領域を増幅するために、 PCR反応を以下のように行つた。まず、 HTLV— I感染 T細胞株 TL一 Suのゲノム DNA0.5 g、各プライマ一 100 pmol /チューブ、 lOx P CR反応緩衝液 10 1、 AmpliTaq DNAポリメラーゼ 5ュニット、および最終濃度の d'TPをチューブに加え、最終的に滅菌蒸留水で 100 1にした。反応は、 94てで 5分処理した後、 94てで 1分、 50。Cで 1分、 72てで 2分の反応サイクルを 30回繰り返し、その後 72てで 7分間行った _c 増幅した各領域を、ァガ a—スゲル上で分離した後、切出して、宝酒造製の SUPK EC-01を用いて回収した。精製した各領域の DNAフラグメントは、 Not I制限酵素（宝酒造製）で処理した後、 pRC/CMV-CATベクター（Invitrogen社製、以下 CMV -CAT) の Not I部位に DNAライゲーシ _sンキット（宝酒造製）を用いて組み込み、上記表 1に示す各領域の DN A配列を含むプラスミドを得た（それぞれ、 CM V-CAT-RK CMV- CAT- R2、 CMV-CAT-R3、 CMV-CAT-R4. CMV-CAT- R5、 CMV-CAT- R6、 CM V-CAT-R7、 CMV-CAT-R9、および CMV-CAT-R21と称す）。 R 8領域の DNA配列を含むプラスミドである CMV-CAT-R8は、 R 2のほぼ中央に存在する Xba I部位（配列表の配列番号 1の塩基番号 4080) と、 CMV-CATの N'ot I部位のすぐ 3'側に瞵接する Xba I部位とを、 Xba I (宝酒造製〉を用いて切断し、 R 2の 3'側の約 1/2 の領域を取り除いた後、自己接合して得た。

R7、 R8、および R21の 3·側直下流に RXE (Rex responsible elemen t) を組み込んだブラスミド（GiV-CAT-R7- RXE、 C V-CAT-R8-RXE. および CMV-CAT -R21-RXE) は、 TL一 S u細胞ゲノム DNAを鋅型として PCR法により得られた R X E (配列表の配列番号 1の塩基番号 319〜 620 ) (Toyoshimaら、 J. Virol.、 64、 2825-2832(1990)) を、 CMV-CAT-R7、 CMV- CAT-R8、および CMV- CAT-R 21の Apa I部位または Xba I部位に組み込むことにより得た。 pRC/CMV-ルシフェラーゼ（以下、 CMV-Luc) は、 pRC/CMVベクターの Hind III部位に、 pGV-Cベクタープラスミド（東洋インキ社製）を铸型とする PCR法によって得られたルシフヱラーゼ遗伝子を組み込むことにより得た。さらに、 SRa-rexブラスミドは、 pCD- SRaベクターに、 r e x c D N Aを組み込むことにより得た（Oritaら、 J. Ge n. Virol.、 73、 2283-2289(1992))。

各プラスミドについて、 T7シークェンシングキット（フアルマシア社製）を用いて塩基配列を翻べ、所定のものであることを確認した。各プラスミドで形質転換した E.coli JM109株のそれぞれを、 200mlの 2 YT培地で 16時間、 37てで培養し、常法に従って、塩化セシウム密度勾配遠心分離を 2回行うことにより精製した。

(2) CATアツセィによるゲノム上の各領域の遣伝子発現抑制活性の有無の検 ft

親クタ一である CMV-CAT 2 gおよびそれと等モル置の上記（ 1)項で得られた各プラスミドをそれぞれチューブに入れ、各チューブに 1 gの CMV-Luc、および pBluescriptベクターを加えて各チューブのプラスミド量を同一とした。次に、 TE緩衝液を加えて同一の溶液量とし、さらに、最終容量か 100 となるように Opti-MEM培地 (GIBCO BRL社製）を加えた。リボフクチン試薬（GIBCO BRL社製） 15 1と0 -*1£>1培地 ₍^1とを混合したものを、上記チューブに加え、室温で 15 分間放置した。この混合液を、 6ゥエルシャーレ中の HeLa細胞（3x10^s/ゥェル）または Jurkat細胞（3X10⁵/ゥエル） (これらは 3mlの Opti- MEM培地中) のそれぞれに加え、トランスフヱク卜した。 HeLa細胞では 6時間後、 Jurkat細胞では 16時間後に、培地を通常の含血清培地（HeLa細胞では E-MEM + 10¾熱不活性化ゥシ胎児血清、 Jurkat細胞では RPJiI + 1096熱不活性化ゥシ胎児血滑）に交換し、 48 時間培養した。その後、各細胞を集め、 300 の Reporter lysis緩衝液（ストラタジーン社製）にて、ライセートを調製した。これらのライセートを 1200rpmで 5分間遠心分離し、上清をとり、その一定量をピッ力ジーンキッ卜（東洋ィンキ杜製）を用いて、ルーマツト（ベルトールド社製）により CMV-Luc由来のルシフエラーゼ活性を測定した。

この結果をもとに、トランスフヱクシヨン効率を補正し、 CAT活性測定に用いる上清量を決定した。次に、決定量の上清をチューブにとり、 X I Reporter lysis緩衝液で 122^1にした。そこに、 ¹⁴C-クロラムフエ二コール（New Englan d Nuclear社製）およびァセチル CoA (4m ) 20 1を加え、混和した後、 37てで 1時間放置した。次いで、 500 ^1の齚酸ェチルを用いて抽出した後、遠心エバポレーターで澳榷し、 TLCプレート（DC-Alufolien Keiselgel 60 F254> MERCK 社製）にスポットした。これを、クロ口ホルム：メタノール =95： 5の展開溶媒で飽和した展開槽で展開した。そして、 Biolmage analyzer (Fujix社製）付属のイメージングプレートに 1時間接触させ、 X線フィルム（XAR5、コダック社製）への焼き付けを行った。クロラムフニコ一ルおよびァセチルイヒクロラムフエ二コールに相当する R f値の放射活性から、ァセチル化の割合を決定した。

まず、 p 21 X mRNAを発現する HTL V— I感染細胞株中の欠失型ウイルスにおいて欠失しているのとほぼ同等の領域である R 1 ~R 5の 5つの領域について、その逸伝子発現抑制活性の有無を、 He 細胞を用いて CAT遺伝子の発現を指棵としたアツセィ系にて検討した。その桔果を図 2に示す。各レーンは、それぞれ CMV-CAT2 gのモル数に相当する量の CMV-CAT-R1 (レーン 1)、 CMV-CA T-R2 (レーン 2) 、 CMV-CAT-R3 (レーン 3) 、 C V-CAT-R4 (レーン 4)、 CMV-CA T-R5 (レーン 5) 、および CMV-CAT (レーン C) をトランスフヱタトした HeLa細胞の C A T活性を示し、下部の数字はクロラムフ二コールのァセチル化の割合 (パーセント) を示している。 CMV-CAT-RK CMV-CAT-R2、および CMV-CAT-R4を卜ランスフタトした HeLa細胞では CAT活性が著しく低いことから、 R l、 R2, および R 4領域が強い抑制活性を示すことかわかった。また、 R 3領域も中程度の抑制活性を示した。

そこで、次に R l、 R2、および R 4にわたる領域をさらに 4つの領域に分けた R6〜R 9領域（図 1(a)参照）の抑制活性について検衬した。铕果を図 3に示す。各レーンは、それぞれ CMV-CAT2 gのモル数に相当する量の CMV-CAT-R6 (レーン 1 )、 CMV-CAT-R7 (レーン 2) 、 C V-CAT-R8 (レーン 3)、 CMV-CAT-R9 (レーン 4)、 C V-CAT-R21 (レーン 5) 、および CMV-CAT (レーン C) をトランスフク卜した HeLa細胞の CAT活性を示し、下部の数字はァセチル化の割合 (パーセント）を示している。 C1IV-CAT-R7および CMV-CAT-R8をトランスフユクトした HeLa細胞では C A T活性が低く、 R 7および R 8領域が強い抑制活性を示すことがわかった。しかし、ネガティブコントロールとした p 2 l XmRNAに転写される R2 1領域、ならびに、 R 6および R 9領域には抑制活性が見られない力、、極めて弱かった。

したがって、 R 1領域の抑制活性は R 7領域に由来し、 R 2領域の抑制活性は R8領域に、 R4領域の抑制活性は、 R7および R8に由来することが判明した。また、 HTLV— Iの宿主である T細胞由来の Jurkat細胞を用いて、同様の実 K を行った結果も同様であり、 R l、 R2、 R4、 R7、および R8領域が抑制作用を示すことを確認した。このように、 p 0 1領域中に 2つのウィルス遣伝子発現抑制領域（ 7ぉょび尺8) を見いだした。 [実施例 2] R 7および R 8領域の遣伝子発現抑制活性の機構の検討

(1 ).翻訳以降の影響の検衬

R 7および R 8領域の遣伝子発現抑制活性の機構の検 I†を、 CMV- T-R7および □IV- から転写される CAT RMの量のノーザンプロッティングにより以下のように行った。

シャーレ（010cm) 中の HeLa細胞（1.5xlO^e /ディッシュ）に、それぞれ、 CM V-CAT-R7 18.30 g、 CMV-CAT-R8 18.24 g, CMV-CAT-R9 18.3 g、および CMV-C AT 16 gのプラスミドをトランスフク卜し、 40時間後に、 IS0GEN拭薬（二ッポンジーン社製）を用いて、総 RNAを抽出した。次に、各 15 gを 1 %もしくは 1. 5¾のァガロースゲルで、 0.66Mホルムアルデヒド存在下、 MOPS緩衝液（20m)i MOP S [3-(N-モルホリノ） -プロパンスルホン酸] pH 7.0、 5mM 齚酸ナトリウム、および 0.5nM EDTA) により気泳動し、 20XSSCを用いたキヤビラリートランスファ一により、ナイロン膜（Hybond-Nt、アマシャム社製）にプロッティングした。常法通りアルカリ固定を行い、 CAT遣伝子を铸型として、マルチプライムラべリングキット（アマシャム杜製）で作製した³² P-標識プローブと 68 で 2時間、ハイブリダィズした。ハイブリダィゼーシヨン液には Quick Hyb.試菜（ストラタジーン社製）を用いた。メンブランの洗浄は、 2 xSSC、 0.1½SDS溶液で、室温で 15分間、 2回洗浄した後、さらに、 0.1XSSC：、 0.1%SDS溶液で、 60°Cで 30分間、 1回行った。シグナルの検出は、 X線フィルムにコダック社製 XARS^用い、增感紙存在下、で 40時間行った。

桔果を図 4に示す。各レーンは、 CMV-CAT-R7 (レーン 1) 、 CMV-CAT-R8 (レーン 2)、 CMV-CAT-R9 (レーン 3) 、および CMV- CAT (レーン C) をトランスフエクトした HeU細胞についてノーザンプロッティングを行った後、メンブランを C A T遺伝子を錄型として作製したプローブでハイプリダイズした結果を示す。図中の GAPDHの位置のバンドは、 GAPDH (グリセルアルデヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼ） ¾伝子を錶型として作製したプローブでハイブリダイズした結果を示し、これによりメンブラン上の RNAの: Bの均一さを検定した。なお、レーン Mには、トランスフヱクシ sンを行っていない HeLa細胞の RNAを用いた。ほぼ同一モル量のプラスミドをトランスフ ίクシヨンした HeLa細胞において、 CMV- CAT-R7および CMV-CAT-R8からの CAT RNA (予想サイズ約 2.3kb) は検出されず、著しく低い量であことかわかった。しかし、上記実施例 1で抑制作用が弱かった R 9領域を有する CMV-CAT-R9からの CAT RNA (予想サイズ約 2.3kb) 、および、コントロールの CMV- CATからの CAT RNA (予想サイズ約 1.3kb) は、検出可能であった。したがつて、 R7および R8領域による抑制は、すでに RNAレベルで起こっており、少なくとも翻訳以降でないことがわかった。

(2) 転写レベルでの揆討

発現した R N A量の低下が生じる理由として、以下の 2つの機構が考えられる。

1つは、 R 7および R 8領域が転写リブレッサ-としてシスに働いて、 CMVプ口モーターからの転写量を抑制するという機構であり、他方は、 CMVプロモー夕一からの転写量には変化がな t、が、 R 7および R 8領域を含む R N Aの安定性が悪くなつていることに起因するという機構である。一般に、転写リブレッサーは、プロモーターに対する距離、位 β、およびセンス 'アンチセンスの方向性を問わない。そこで、次に、 R l、 R2、および R4領域を CMVプロモーターの 5'側直上流にセンスまたはアンチセンス方向で袓み込んだブラスミドを構築して翻べた。その結果、これらの場合において抑制活性は見られなかった。したがつて、転写レベルでの抑制ではないと考えられる。

( 3 ) 転写後の影鬌の検对

HTLV- I R e xは、ウィルス mRNA上の RXEに結合して転写後に衝き、ウィルス mRN Aのスプライシングの抑制および核から細胞質への移行を促進していることがわかっている。そこで、この Re Xによる転写後の作用が、 R 7および R 8頓域の抑制作用に及ぼす影響について検封した。そのために、 CMV- CAT- 7. C V-CAT-R8, および CMV- CAT-R21の各ゲノム領域の 3'側直下流に、 RX Eをセンス（+ ) またはアンチセンス（一）方向に組み込み、 RNAへと転写されるようにしたプラスミド（CMV-CAT-R7-RXE( +または一）、 CMV-CAT-R8-RXEC + または—）、および CMV-CAT-R21-RXE( +または—））を構築した。

これらを、 R e Xを発現する SRa-rexプラスミドと同時に HeLa細胞にトランスフエタトして、 CAT活性を測定した。その結果を図 5に示す。図中の键括弧で示す各ブロック（それぞれ 2つのレーンからなる）は、それぞれ各 2 の、 CMV - CAT- R7-RXE ） (ブロック A)、 CMV-CAT-R8-RXEO) (ブロック B)、 C V-CAT-R 21-RX?(r) (ブロック C)、 CMV-CAT-R7-RX2C-) (ブロック D) 、 C V-CAT-R8-RXE (-) (ブロック E) 、 CMV-CAT- R21-RXE (-) (ブロック F) と、 pCD-SRa -rexCRex - .5 もしくは pCD_SRa Ox- )1.5 とを同時に卜ランスフクトした HeLa細胞の CAT活性を示し、下部の数字はクロラ厶フ 1二コールのァセチル化の割合 (パーセント）を示している。図 5から明らかなように、 R 7および R 8領域の抑制作用は、ブロック Aおよび Bの結果から、 r e x存在下（Rex+) 、 RXE がセンス方向の時のみ著しく阻害され、 C A丁活性の回復が見られた。したがつて、 R 7および R 8領域の抑制作用は、 RXEへの結合を介した R e Xによる転写後の作用によつて効果的に解除されることがわかつた。次に、 CMV-CAT-R7-RXE (十） 6 ^g、 CMV-CAT-R8-RXE(÷) 6 ^ . または CMV-CAT-R2 1-1»(£ひ）6 /^と、 pCD-SRa-rex(Rex+)9 もしくは pCD-SRa(Rex-)9 gとを H eLa細胞に同時にトランスフヱクトし、 40時間後に総 RN Aを得た。これらを 1. 59変性アルデヒドゲルにて泳動し、ノーザンブロッテイングを行い、メンブランを CATS伝子を铸型として作製したプローブでハイプリダイゼーシヨンを行つた（図 6) 。次いで、 GAPDH遣伝子を鋅型として作製したプローブでハイプリダイゼーシヨンを行い、これにより、メンブラン上の RN Aの量の均一さを検定した（図 6中の GAPDHの位置のバンド）。なお、図 6中の SRa -rexと示されたレーンは、 SRa-rex 9〃gのみをトランスフエクシヨンしたものである。この結果は、上記の CAT活性での钴果と一致する結果であった。

さらに、 HTLV— Iの LTRをトランスに活性化して転写を高めることかわかっている HTLV— 1 taxが、 R 7および R 8領域の抑制作用に対して影響を与えないことも確認した。したがって、以上の結果を考え合わせると、 R7および R 8領域による抑制作用は、主として転写後に儀いているものと考えられた。

[実施例 3 ] 遣伝子発現抑制活性領域の検射

( 1) 欠失変異領域を持つプラスミドの構築

抑制活性を示した R 7および R 8領域のうちょり強い活性を示した R 8領域について、その抑制活性の中心部を探るために、 CMV-CAT-R8中の R8を 5'側、 3'側の双方向より欠失させて、得られた亜領域を持つプラスミドを構築した。まず、 R 8^5 '側から欠失させるため、 C -CAT-R8を Not I (宝酒造製）で切断した後、 D A Bluntingキッ卜（宝酒造製）で平滑末端とし、さらに、 R8領域内の Eco NI 部位（S2列表の配列番号 1の塩基番号 3362) で切断したものを Kilo- sequenc e用 deletionキット（宝酒遣製）で欠失を行った。一方、 R 8を 3'側から欠失させるため、 CMV-CAT-R8を Apa I (宝酒造製）および Xba I (宝酒造製）で切断した後、 Kilo- sequence用 deletionキッ卜で欠失を行った。欠失の程度は、丁 7シークェンシングキット（フアルマシア社製）を用いて決定した。

(2) 欠失変異領域を持つプラスミドの CAT活性の測定

上記（1) 項で得られた欠失変異領域を持つブラスミドの CAT活性を測定した。その結果を図 7に示す。これらのプラスミドは、 R8領域を 5' (□) または 3'側（〇）から欠失させたものである。この結果から、 R 8の活性中心領域と考えられる 413bpの領域（C413) を図 7中に示す。図 7の縦袖は、 CAT活性を示し、横軸は、 R 8領域を示している。欠失の程度が進むにつれて、 CAT活性は、 R 8領域による低活性から徐々に回復することかわかった。したがって、 R8領域の抑制活性の完全な発現には、広い領域を必要とするか、または、小さな活性中心的なものが広い範囲に点在する必要があると考えられる。

また、 R 8領域の 5'側辺緣部（R 7領域の 3'側で R 8領域と重複する領域）を欠失させても、強い抑制活性を保持していることから、 R 7と R 8領域は、独立した 2つの遣伝子発現抑制領域であることが明らかである。

そして、欠失させることにより CAT活性の回復がめざましいものであった中央部の 413bp (配列表の配列番号 1の塩基番号 3368〜3780、以下じ 4 1 3) について抑制活性の程度を検討した。その結果を図 8に示す。それぞれ、 CM V-CAT2 ^のモル数に相当する量の CMV-CAT- C413センス（レーン 1 ) 、 CliV-CAT- C413アンチセンス（レーン 2) 、および CMV-CAT-'413 (レーン 3) をトランスフェク卜した HeLa細胞の CAT活性を比較した。下部の数字はクロラムフニコールのァセチル化の割合（パーセント）を示している。 C4 1 3を有する CMV- T- C413は、 R2 1領域中の 413bpの領域（配列表の配列番号 1の塩基番号 7302 〜77 14、以下 N4 1 3) を有する CJtV-CAT-N413をコントロールとして比べた場合、 CAT活性を強く抑制した。し力、も、この C4 1 3については、その抑制活性はセンス方向に組み込んだ時の方が有意に強いことがわかった。したがって、この点からも R 8領域の抑制作用か、転写後に鋤いていることが示唆された。以上のように、より強い抑制作用を有する領域は、その抑制作用の十分な発現に、比較的長 t、領域を必要とし、その領域のァンチセンス配列では抑制作用が減弱することから、その抑制作用は、その領域が転写され、ある特定の高次構造をとることが必要であり、転写後調節機構と考えられる。

(3) S伝子発現抑制活性領域の相同性の検討

HTL V— Iはレトロウィルスのオンコウィルスに属し、近縁のウィルスとしては、サル T細胞白血病ウィルス I型（STLV— I ) 、 HTLV— 1 I、およびゥシ白血病ウィルス（BLV)が知られている（Weissら、 RN'A TUMOR VIRUSE S： Molecular Biology of Tumor Viruses ^ 第 2版、 405-485、 Cold Spring Harb or Laboratory (1985))。一方、 H I Vはレトロウイルスではある力^ レンチウィルスに «し、分類上近くない。 STLV— I、 HTLV- I I、および BLV は、 HTLV— Iと同様に、感染宿主に一生涯持統感染し、生体内ではそれらの遣伝子発現が強く抑制されていることが知られている。発明者らは、 STLV- I、 HTLV— I I、または BLV感染細胞において、 HTLV— Iの p 21X mRNAと同じ性質の mRNAを見いだしている（Oritaら、 VIRUS GENES. 7、 1 97-204 〔1993))。従って、 STLV— I、 HTLV- I I、および BLVにも遺伝子発現抑制活性を有する DNA配列か存在することか予想される。そこで、ウィルスの全 DNA配列が知られている HTLV— I I (SMmotohnoら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、 82、 3101-3105 (1985)) 、 Bし V (Sagataら、 Proc. N atl. Acad. Sci. USA.、 82、 677-681 (1985)) 、および陰性対照として H I V (Adachiら、 J. Virol.、 59、 284-291 (1986)) について、 HTLV— Iの遣伝子発現抑制配列（2260位〜 4080位まで）との相同性を解析した。解析は、 DNASIS (日立ソフトウアエンジニアリング株式会社）の DMA Maximum Homology 解析ソフトを、データベースとして GenBankを用いて行った。

相同性解析の桔果、 HTLV— I Iおよび BLVのいずれも、 HTLV— I由来の遣伝子発現抑制領域に対応する p 01遗伝子領域で、それぞれ 65 %および 59 %の相同性が見られた。一方、 H I Vでは、特定の領域でい相同性が見られなかった。従って、 HTLV— I由来の逸伝子発現抑制配列と同様の活性を有する配列として、好ましくは 59 ½の相同性を有することが必要であると考えられる。 [実施例 4] HTLV— I由来の遺伝子発現抑制活性の RRE依存的 Re Vによる解除

HTLV- I0Re xと RX Eとの関係と同様に、 H I Vには Re vと RRE との関係が知られている。そこで、実施例 2の（3)項の記載と同様に、 CMV-CA T-R7、 CMV-CAT-R8, および CMV- CAT- R21の各ゲノム領域の 3'側直下流に、 RXE の代わりに RREをセンス（+ ) またはアンチセンス（一）方向に組み込み、 R NAへと転写されるようにしたプラスミド（CMV-CAT-R7-RRE( +または一）、 CMV- CAT-R8-RRE( +または—）、および CMV-CAT- R21-RRE( +または—））を構築した。これらの各 2 gを、 R e Vタンパク質を発現する SRa-revプラスミド 1.5;Ugまたは Re Vタンパク質を発現しない pCD-SRなプラスミド 1.5 gと、同時に HeLa細胞にトランスフヱタトして、 CAT活性を測定した。結果を表 2に示す。表 2 プラスミド Rev C AT活性（％) 誘導倍数（Rev ^ /Rev- )

C V-CAT-R7-RREC+) + 13.1 10.0

1.3

CMV-CAT-R7-RRE (-) + 1.5 1.3

1.2

CMV-CAT- 8-RREC+) 2.9 5.0

0.58

CMV-CAT-R8-RREC-) + 0.48 1.1

0.42

CMV-CAT- 21-RRE(r) 42.6 1.6

26.5

CMV-CAT- 21-RREC-) 33.9 0.74

45.7

表 2から明らかなように、 R7および R8領域は R R Εの組み込みの方向性にかかわらず C A Τ¾伝子の発現を強く抑制した。これらの抑制効果は、 Re v + の場合の CAT活性（96) を Re ν—の場合の CAT活性（¾) で割った数である誘導倍数で比較すると、 RREかセンス方向に組み込まれた場合にのみ Re V タンパク質の効果が発揮されることが明らかに示された。この結果は、上記実施例 2の（3)項の結果と同様であった。

〔実施例 5〕 TRP— 1 cDNAのクローニング

U 5に存在する転写抑制配列 U 5 REに結合する因子を単離するために、 U 5 REを 8個連結させた DNAをプローブとして、以下のようにして、サウスゥェスタン法で Molt-4 c DNAライブラリーをスクリーニングした。

サウスウェスタン法でのスクリーニング用のプローブを製するために、まず、 U 5 REに相当する両鎖のオリゴヌクレオチド（配列表の配列番号 16および配列番号 17)を合成した。この合成した DNAを 19%アクリルアミド、 1¾ァクリルアミドビス、および 7M尿素からなるゲルを用いて、 300Vで 2時間鼋気泳動した後、目的の合成 DN Aを含むゲルを切り出した。次いで、このゲルを 37てで 16時間 TE緩衝液（10 mM Tris-HCl、 pH 7.4、 1 mM EDTA) に浸し、ゲルから D NAを溶出した。この溶出液を TE緩衝液で飽和した DE52 (フアルマシア社製）に通して DN Aを吸着させた後、 0.5 mlの TNE緩衝液 (10 mM Tris-HCU pH 7. 4、 ΙπΜ EDTA. 1.5 NaCl)を用いて溶出した。この DNA溶液に 1 mlのェタノールを加え、 DNAを沈殿させて合成 DNAを精製した。精製した合成 DNAを TE緩衝液に溶解し、 DNAの最終 «度か lO g/ lになるようにそれぞれを加えた ¾f液を 65てで 10分間熱変性した後、徐々に温度を下げてニ本鏆 DN Aを作製した。次いで、ニ本鎮 DNA 1 gに対して 100ユニットのライゲース（二ツボンジーン社製）を加え、 12てで 16時間反応して、 U5REを 8個連結し、得られた DNA (8 xU δ RE)を、プラスミド pSL1180 (フアルマシア社製）の BamHIおよび Bglll部位に、 10ユニットのライゲース存在下で 12 で 16時間ライゲーションを行うことにより組み込んだ。

サウスウェス夕ン法に用いるためのプローブを、上記 8 xU 5 REを銪型として、 a³²P-dCTP存在下で PCRを行い増幅した。 PCRの反応液は、 1 iの 8 xU5RE-pSL1180 ( lng/^1) を、 2 1の ll)x P C R用緩衝液 C100 mM Tris -HC1、 pH 8.3、 500 ntM KC1、 15 i MgCl₂、 0.1%ゼラチン）、 1 μΐの dNTP (4 mM dATP、 4 mil dGTP、 4nM dTTP、 0.8 mM dCTP) 、 0.5 1の¾£1ボリメラーゼ (タカラ酒造社製、 5ュニット、 1 1の合成ブライマー（pSL F;配列表の配列番号 18、 pSL R；配列表の配列番号 19 : 10 pmol/； u 1)、 12.5 1の α ³²P- dCTPに入れて、滅蓖蒸留水で 20 iilとした。 PCRは、 Thermal sequencer TSR-300 (岩城ガラス社製）を用い、 94"Cで 60秒間反応させた後、 94てで 45秒間、 55 で 45秒間、および 72てで 45秒間を 35サイクル行った後、 72°Cで 60秒間行った。

ヒト急性リンパ性白血病細胞株 Molt-4の pSport 1の cDNAライブラリーを、以下のようにして作成した。まず、 Molt-4細胞 10^β個を、 linlの 4Μ グァニジンチオシァネートを加えた後、 1 mlの水で飽和したフエノールを加えて抽出した。この抽出液から lmlのイソプロパノールで抽出したものを全 RN Aとした。全 R A 100;/gから、 Oligotexを用いて 10 gの mRN Aを得た。この 10 gの mR NAより、 Superscript cDNA合成システム（GIBC0-BRL社製）を用いて cD NAおよび cDNAライブラリー（pSPORT-l(BRL社製））を作成した。

次に、） iolt-4の c DNAライブラリーを E. coli DH5なに導入し、 1&のシャ一レあたりコロニー数が 5万個になるように撒き、合計 200万個をスクリーニングに用いた。このようにして撖いたコロニーに対してニトロセルロース膜（ミリポァ社製）を 1分間接触させた。それらのニトロセルロース胰を、 lnM IPTG (GIB C0-BRL社製）を含む培地上で 3時闐 37^eCで培養し、タンパク質を発現させた。このようにして調製したニトロセルロース膜に固定された cDN Aから生じたタンパク質と上記のプローブとを反応させて、タンパク質の DN A結合活性を指標にしてスクリーニングを行った。

さらに、得られた c DN Aクローンより調製した c DN A断片をプローブにして、 10^β個の) iolt-4 c DN Aライブラリ一をコロニーハイブリダィゼーシヨンによりスクリーニングした。フィルターの調製は、寒天培地で 37^eCにてー晚培養したコロニーを、 Colony/PlaqueScreen Plus (Dupont社製）フィルターに転写した後、 0.5 M NaOH, 1.5 H NaClに 1分間、 0.5 M Tris-HC 1.5 M KaClに 5分間、 2 XSSCに 5分間浸したのち風乾して行った。プローブの放射檫識は、な³² P-dC TPによりマルチブライムラべリングキット〔アマシャム社製）を用いて行った。ハイプリダイゼーシヨンは、 6 XSSPE (0.9 M NaCU 0.06 M リン酸ナトリウム、 6nM EDTA、 pH 7.4) 、 10%アイリッシュクリーム（R&A BAILEYS社製）、 1 ¾ S DS、および 50½ ホルムアミドにより、 42°Cで 6時間プローブなしでプレハイブリダイゼーシヨンを行つた後、プロ一ブを加えて 42 で 16時間ハイブリダイゼ一シヨンした。フィルターの洗浄は、 l xSSC、 0.5% SDSを用い、室温で 10分間、および 0.2xSSC、 0.5½ SDSを用い 65 で 30分間を 2回行った。シグナルの検出は、 X線フィルム（コダック社製； XAR5) を用い、増感紙存在下で- 80*Cで 16時間感光した後現像した。

その結果、約 3.8kbの cDNA挿入断片を含む陽性クローンが得られた。得られた cDN Aクローンの塩基配列の决定は、ジデォキシ法（Sanger、前出）に従つて Sequenase DNAシークェンスキット（U.S.B社製）を用いて行った。決定された DNA配列およびアミノ酸 Sfi^Jを、配列表の配列番号 15に示す。この c DN A断片を解析して得た塩基配列をもとに推定したアミノ酸列を解析した (DNASIS (日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社））。この道伝子はコンビユータによる解析の結果、新規の fi伝子であり、最も長いオープンリーディングフレームをァミノ酸に翻訳すると 688個のァミノ酸配列よりなることが明らかとなった。このアミノ酸配列から、図 10に示すように、カルボキシル末端側に Kruppel型の DNA結合領域である亜鉛フィンガードメイン 4個半、およびアミノ末端側に転写調節領域である KRAB-A, Bドメイン 1組に類似性があることが明らかとなつた。また、アミノ酸配列に基づく推定分子量は、 76 kDaであり、既知の y 5 REに特異的に結合するタンパク質（ 1 1 0 kD a、 80 kDa、および 70 kD a) とは、分子量および特徴的なドメインにおいて、全く異なるものである。

さらに、類似性解析の結果、最も類似性の高かったアミノ酸配列を持つ遣伝子は K i d— 1 (Witzgallら、 Mol. Cell. Biol., 13(3):1933-1942 (1993)、前出）であった。アミノ酸配列で比較すると、図 1 1に示すように、その亜鉛フィンガードメイン（丁 RP— 1のアミノ酸 518位〜 648位に相当し、 K i d— 1に関しては 407位〜 529位に相当する）では 61.0%の類似性で 53.7½の相同性を示し、図 12に示すように、 KRAB-Α,Βドメイン（TRP— 1のアミノ酸 1 96位〜 261位に相当し、 K i d— 1に関しては 12位〜 53位に相当する）では 48.5¾の類似性で 34· 9¾の相同性を示した。

上記以外の特徴的な列としては、アミノ酸 154位〜 185位にロイシンを 34.4¾含むロイシンリツチドメイン、 403位〜 443位にプロリン ·グルタミンを 65.9¾含むプロリン ·グルタミンリツチドメイン、および 470位〜 503 位にダリシンを 58.8¾含むグリシンリツチドメインかあることがわかった。プロリン ·グル夕ミンリツチドメインに関しては、タンパク質一タンパク質相互作用に関係することが今までに知られているが、その他のドメインの働きは未だ明らかではない。

[実施例 6 ] 組換え T R P— 1の発現と性状解析

TRP— 1の発現のために、発現クローニングによって得た c DNAクローンの DNAを、 ^と?^1とで切断して得た3.8 kbの DNA断片を発現ベクター pR SET (Invitrogen社製）の Kpnl-Notl部位に挿入した、 pRSET-TRP_lを構築した。この pRSET -TRP- 1を導入した大腸菌 BL12株は、オリゴヒスチジジンをァミノ末端に持つ融合タンパク質として TRP— 1を発現し得た。し8培地2し中で、菌体を 30てでー晚培養した後、 ft終癱度 IBMになるように IPTGを加え、さらに 6時間培ました。この融合タンパク質は、プレートボンドレジン（Invitrogen社製）を用いてァフィ二ティーカラム法で精製した。さらにブレップセル（BI0-RAD社製）を用いて電気泳動による分離を行い、最終的な精製品とした。

丁 — 1と U5REとの桔合解析は、次のように行った。まず、 ³²Pで標識したし '5RE DNA lngと糟製した上記の蛆換え TRP— 1とを、結合反応用緩衝液（20 mM Tris-HCU lmM EDTA、 50 iM N'aCl、 1 mM DTT、 5 ¾グリセ口— ル）中で 1 poly d(I-C)存在下で 30分間室温で反応させた。次に、その反応液を 5 %ポリアクリルアミドゲルで電気泳動したものを據紙上で乾燥させた後、ォートラジオグラフィーにより解析した。

TRP— 1と US REとの結合解析の結果を図 13に示す。図 13のレーン 1 は、大腸菌に発現させた TRP— 1と U 5 REプローブとの結合反応、レーン 2 はレーン 1の反応液に U 5 REプローブに対して 100倍モル量の非摞識 U 5 R Eを加えた場合、およびレーン 3は、レーン 2の U 5 REの代わりに非特異的な DNA断片を 100倍モル i加えた場合のそれぞれの結果を示す。この組换ぇ T RP— 1が³² Pで標職した U5 RE DN Aに結合することが示された。また、この U5RE DN Aプローブに対して棟餓していない U 5 RE DNA、あるいは、同じ長さの U5RE DNAの塩基配列に無関係な DNAによる躭合反応を行ったところ、非棵羝 U5RE DNAに対してのみ競合したことから、この T RP— 1は U5RE DNAに特異的に結合することがわかつた。

〔実施例 7] TRP- 1 mRNA発現の組維分布

TRP— 1の組維別発現分布を調べるために、我々はヒト株化細胞（28種類）および組雄（16力所）の RN Aを用いてノーザンブ口ット分析を行った。

まず、各細胞より単饑した poly(A) + RNA 3 ^gを、 0.66 M ホルムアルデヒドを含む 1 ¾ァガロースゲルで MOPS敏衝液（20 nM MOPS, pH 7.0、 5mM酢酸ナトリウム、 0.5 iM EDTA) により ¾気泳動にかけ、 20XSSCを用いたキヤビラリ一トランスファ一によりナイロン腹（Gene Screen Plus、 Dupont社製）に移し、このナイロン腠を風乾した。このフィルター、およびヒト組維由来 mRNAをプロッティングした市販のフィルター（Clontech社製）のそれぞれについて、 TRP 一 1 cDNA (発現クローニングによって得た断片の 5'側から 950番目までの塩基）をな³² P-dCTPによりマルチプライムラべリングキット（アマシャム社製）を用いて標職したものをプローブとして用いて、ハイブリダィゼーシヨン緩衝液 (6 XSSPE. 1 % SDS、 10%アイリッシュクリーム（MA BAILEYS社製）、 50% ホルムアミド）中でハイブリダィゼーシヨンを行った。膜の洗浄は、 l xSSC、 0. 5½ SDSを用い室温で 10分間、 0.2XSSC：、 0.5% SDSを用い 65°Cで 30分間で 2回行つた。シグナルの検出には、 X擦フィルム（コダック社製； XAR5) を用い、増感紙の存在下で- 80 16時間感光した後現像した。

各細胞株における結果を図 14および図 15に示す。図 14は、それぞれ、 HL 60 (急性骨 «性白血病）、 HeLa細胞 S3 (子宮頸癌）、 K- 562 (慢性骨 ¾性白血病）、 Molt-4 (急性リンパ性白血病）、 Raji (パーキッ卜リンパ腫）、 SW480 (大腸腺痛）、 A549 (肺癌）、および G361 (黑色腫）の細胞株についてのノーザンブロットの結果である。図 1 5は、それぞれ、 CEM、 HPB、 Jurkats Molt-4. PN D4.1 (いずれも急性リンパ性白血病）、 CAKII 癌）、 KATO III (胃癌）、 A54 9 (肺痛）、 A673および RD (いずれも横紋筋肉腫）、 I R32, SKN SH、 TGW, および NB9 (いずれも神経芽腫）の細胞株についてのノーザンプロッ卜分析の結果である。細胞株では、 HTLV— I感染、非 ¾染 T細胞にかかわらず、図中の矢印で示す 4. Okbの転写物として発現しており、また実 ftした全ての細胞株におレ、て TRP- 1 fi伝子の発現が見られた。発現レベルは神柽芽腫細胞の 4種のうち 2 種（TGWおよび NB9) が、その他の神経芽腫細胞や他の細胞よりも発現が 5〜10倍裔かった。さらに、神 i¾芽腥細胞株 G0T0、 CHP134. NB19> および NB16、ならびにグリア細胞腫株 A2781、 11251、および T98Gに関して発現を検討したところ、 GOTO および NB19で発現が高い結果となった（データは示していない）。したかって、検討した神経芽腫細胞株 8株中 4株で TRP— 1の mRNAの発現が髙 L、こと力ゎカヽつた。

次に図 1 6 (A) および（B) に、各組始の場合の結果を示す。組繳においては、精巣では極めて低かったが、他の組織においてはほぼ一定量の発現があることが明らかになった。このことから、正常脳組維では他の組蛾と比べて、特に T RP- 1の mRN Aの発現が高くないこと力、ら、神柽芽腫細胞株で発現が高い結果か神経細胞の癌化の一部と関係か深いと考えられる。 [実施例 8] TRP- 1の機能解析

TRP- 1の機能解析は次のように行った。 EF-B0Sベクタ一にインフルエンザ HA tagを TRP— 1の N末端に有する HA-TRP-1¾合タンパク質が発現されるように組み込んだ発現ベクター pEF-HA-TRP-1と、 CAT (クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフ iラーゼ）遣伝子の上流に HSV TK (最小プロモーター領域）を連結したレポータープラスミド TK-CAT、あるいは、 TKと CAT遣伝子の間に U 5 REを 3個挿入した TK- 3XU5RE-CATとを、同時にリポフエクチン（GIBC0-BRL社製）を用いて HeLa細胞に導入した。 TK-3XU5RE-CATは T R P - 1の結合配列である U 5 REを有し、 TK-CATは結合配列を有さない。細胞を 48時間培養した後、回収し、ホモジナイズしたものを遠心分離し、その上清のタンパク質を定量した。その lOO^gに対して [¹⁴C] クロラムフ二コール（Amersham社製）と 4m Mのァセチル CoA (Sipa社製） 10 1とを加え、 37°Cで 1時間インキュベートし、 ft ェチル 0.5mlを加え挽拌した後、 10,000rpm、 10秒間遠心分糠して齚酸ェチル層を回収した。この酢酸ェチル層を乾燥し、再度 20 1の酢酸ェチルに溶解してシリカゲル薄層ブレート（DC-Alufolien Kiesel gel 60 F254. MERCK社製）にスポットし、クロ口ホルム一エタノール（95:5) の溶媒で薄層チャンバ内で展開した。この展開したシリカゲル薄屑プレートを、バイオイメージアナライザー (Fujix社製）を用いてァセチル化の割合を調べることにより、存在している C ATの活性を調べた。

結果を図 17に示す。図 17のレーン 1〜3は、レボーター伝子として TK-3 XU5RE-CATを 2 用い、レーン 4〜6は TK-CATを 2 g用い、さらに、エフェクター遗伝子としてレーン 1および 4は pEF-BOS-TRP-1 lO gを、レーン 2および 5は pEF-BOS- TRP-1 5 //g+pEF-BOS 5 を、レーン 3および 6は pEF-BOS 10 gを、それぞれ HeLa細胞に導入し、 48時間後に回収した細胞の抽出液を用いて解折した結果である。すなわち、 pEF-HA- TRP- 1と TK-3xU5RE-CAT、あるいは pEF-HA -TRP-1と TK-CATとを一組にして He 細胞に導入し、 TRP— 1が U5REを介して働くかどうかを解析した。その結果、 TK-3XU5RE-CATに対しては、 pEF- HA-TRP -1プラスミドの濃度依的に C ATffi性が抑制されたが、 TK CATに対しては影響がなかった。このことより、 TRP— 1は、 U 5 REを介して転写抑制活性を有することが示された。產業上の利用可能性

本発明により、伝子発現抑制機能に関連する D N A分子およびタンパク質が提供される。

本発明の H丁 L V— I由来の遗伝子発現抑制機能を有する D N A分子は、生体內でウイルス适伝子の発現を抑制することにより、免疫機構による排除からウイルス感染細胞を逃避させ得、 HTL V— Iの潜伏感染 «構において重要な役割を担っている。この遣伝子発現抑制作用とその R s Xタンパク質による解除とをうまく利用することにより、人工的な遣伝^現調節が可能となり、遣伝子治療などにおける細胞特異的 ¾伝子発現に応用し得るものと考えられる。

また、図 9に示すような構成ュニッ卜を含む、本発明の遣伝子発現抑制機能を有する DN A配列を含むプラスミドを用いることにより、 H IV感染症（例えば、 A IDS) の遺伝子治療へ応用することも考えられる。例えば、レトロウイルスベクターに、図 9のような構成ュニットを組み込み、感染あるいは非 «染細胞へ導入することができる。非感染細胞に導入された場合は、遺伝子発現抑制 DN A 配列が機能して、治療遣伝子の発現は抑制される。さらに、スプライスドナー (SD) シグナルとスプライスァクセプター（SA) シグナルとを配置することにより、治療遺伝子などがスブライスにより除去され、治療遣伝子の発現がさらに抑制される。一方、感染細胞においては、 H I V遣伝子から R e Vタンパク質が発現するので、これが R R Eを介して遣伝子発現抑制配列の抑制活性を解除し、治療遣伝子の発現が促進する。さらに、プロモーターとして HI V LTRを用いると、 HI Vの T a tタンパク質による転写促進機能によって、治療遣伝子の発現がさらに高まる。

また、本発明の δ伝子発現抑制機能を有する DN A分子および該 DN A分子を含むプラスミドは、成人 T細胞白血病（ATL)、 HTLV—〗関連脊髄症（H AM)、熱帯性症性麻 ¾症（TSP)などの疾患の発症機構の解明および有効な治療薬の開発にも有効であると考えられる。

本発明の T R P— 1は、 U 5 R Eに特異的に結合する D N A結合タンノク質であり、転写抑制活性を有することから、同様の配列を有するウィルス ¾伝子、例えば、，ヒト免疫不全ウィルス、サイトメガロウィルスなどの遣伝子、または細胞遺伝子の発現抑制に作用することが考えられる。したがって、抗ウィルス活性を有する可能性があり、抗ウィルス剤の開発に応用し得る。

また、 TRP— 1と比較的類似性の高い K i d— 1がラッ卜の臓より単雜されており、肾臓の発生過程、虚血、あるいは葉酸処理後の肾組繳再生過程で mR NAの発現が上昇し、転写を抑制することが知られている。したがって、 TRP 一 1がほとんどの組繳または細胞株で発現することから、転写抑制に関連する生理学的に重要な活性を有すると考えられる。すなわち、本発明のタンパク質は、抗ウィルス剤の有効成分として有用であり得る。さらに、神綞芽 tt細胞株の半数において TRP— 1の異常な高発現が見られたことから、神経細胞の癌化機構への関与が示 ¾され、 TRP— 1の研究により、神経細胞の癌化の機序解明、診断、および治療への応用に有用であり得る。すなわち、本発明のタンパク質の組における発現は、癌発現の検出指標となり得、さらに、本発明のタンパク質または該タンパク質をコードする DN A分子のアンチセンス鎖は癌治療薬となり得る。

配列表

配列番号 1

配列の長さ： 9 0 4 5

配列の型：核酸

鲅の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： genomic DNA

起源

生物名：ヒ卜

K列の特徴

特徴を表す記号： LTR

存在位髭： 1. . 757

特徴を決定した方法： S

特徴を表す記号： polyA signal

存在位置： 8584. . 8589

特徴を决定した方法： S

特徴を表す記号： LTR

存在位置： 8278. . 9032

特徴を決定した方法： S 24134 1354 682 o 6284 o o o o o o o o o 配列

TGACA^TGAC CATGAGCCCC AAATATCCCC CGGGGGCTTA GAGCCTCCCA GTGAAAAACA

TTTCCGAGAA ACAGAAGTCT GAAAAGGTCA GGGCCCAGAC TAAGGCTCTG ACGTCTCCCC CCGGAGGGCA GCTCAGCACC GGCTCGGGCT AGGCCCTGAC GTGTCCCCCT GAAGACAAAT CATAAGCTCA GACCTCCGGG AAGCCACCAA GAACCACCCA TTTCCTCCCC ATGTTTGTCA AGCCGTCCTC AGGCGTTGAC GACAACCCCT CACCTCAAAA AACTTTTCAT GGCACGCATA TGGCTCAATA AACTAGCAGG AGTCTATAAA AGCGTGGAGA CAGTTCAGGA GGGGGCTCGC ATCTCTCCTT CACGCGCCCG CCGCCCTACC TGAGGCCGCC ATCCACGCCG GTTGAGTCGC GTTCTGCCGC CTCCCGCCTG TGGTGCCTCC TGAACTGCGT CCGCCGTCTA GGTAAGTTTA AAGCTCAGGT CGAGACCGGG CCTTTGTCCG GCGCTCCCTT GGAGCCTACC TAGACTCAGC

GGGGGC AGTTTCCG ATATTGT AGACTT GACAA CCACCGCCCTATCGA AT ACTAATAATAG

AGGGG CCAGACC AGCACCA TAGT目TAATTAAACCACCCCGATCCCGC CCC C G CAA- GGTCAAACGGCCA GTTATACC CACATTACAAGTCCTT CCTCAA ACCC GCCCCAAT TATTT CCTATCACAAAAAAA GGGGCCCCCC CCCCCGCTG ACCC CCCC TTCATAGGGGGTTATA AT AAGAACG CCCCGCCTAA AGCCCCTAT CCCCA GAAGAGCACGCCG AAGATGCCT CCTATTA CCTATTGCCGGGCCG CCCG CAAACCCAAG CCCCCC CCATG CTCACTGGAA GCGAGACTCT GGGGGCTCGCCG GCCC CGGAA GGCCACGGATAOT CACT AATTTAA GCGGGGCTCAGCATT

o

GTCCGGC GCCCTG TTAGTGTCAACC CCAAC AGCCTAAA ACCCCCCCA ATAAAAAAA AAAC SCGGGOGTAGG CCC CC CCCTGGAG ATATTTGC GACAATAATAGGGCTTGTCG TTAAAAA GCGCCCATAAACCCCCAG CAACAGA ATGCCAAAAA CCAGATTTA TTTTACAAACC CC TAT GGCC GGACAGCGCC 00 ATGTG AGAAACG TACCTAAA CCMATATTTGGCGGCACCCT TCT

TTAGCCGGGCCG CCOTTCOGG GCCTCTCC TG CGG GCCAAGCCT GGAACTTAAAAGGGCAT AAAGAATGCCACAACAA MGGTTAG GCGAC CAGACTGCC CGCCGC CCCACT GGCTCCCTT GCC AAAT AACAGGTTA TACCCATT GCGCCCCCCGGAGCCAACCCCGAGGTA TTAACTT TT GCCCG CGAGATACCGGCCCC CCC GCCTTATATC AGAAA TTCCTTTTAATGGCCGCCT TAA GCGGGGCCC CCTCCAAA GACCAA GCGCGACCTG ACCTCTGCA GTGTTTACACCT nTA A

AAGCAAAATCCCAA ACCCTGGG AC COCGG TCGCGCGCCCCAGT TTAG CCATGCACATCTT TTATCCGCTTCCATGGGCCCGGCCA CACATG GTCCCC TAACGC CCAGCAAA AT TAAAATA GGGGGTT TACCCC CCCAAGCCCCAGTCATG GTCCACAAA TCCCCCCTCX CTATTTA CCTA GCGCGCGCCCCCC GCCGCCCCCCCG TCATCCCCA CCCAACCC ATTCCGC CCCGGATTTT A

t— » — » GGGGCGGAATGAAACC CCCGT GTT TTACATA AAAACAC TCATAAAC CCAAGATCCAGCCC —4

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GAAAACAGCTCGGATTTC CG CTGCCCATT AACT TCTACCC TCCCCACCTAGG CCTACTCA TA CGAACCCGTCCCT GCCAG TTACGATTTC CACCAGTTAA ATTGCA- ATCT TAAAATTA

CGACCGCCCC G0§TCA CGCTCAC TTAGGGGCTACT TAG GGCCCCTCCCCATAT

CGCCCCTTTACCi TTG AGCATGGCCAA ATTTGCTTCCC GTAGCTAGCCCG CCCTATT

TAT CCAGCATCAC TCGGAGAATT GAATAGT AGCACAGTTG GGGG GGGCTGTCCGAACTAC GG0TTO CO0C CACGGCCAAG TACGCGCGAC TCCTGTGGCT CGCAG GGGAGCCACACCATC

G GOGCGTTTCC GC GGCTCTAACA CCCCTTCTATATTCC TTTCATTCAC GAAACTGACTGC

CGGGCTCTGCTCC GCG GCCA CTTTCCCCCCT ACTTTTATTTCATGOTG TTTTTTCTTCGA

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CCAGHAACC CTACAAAGCA CTAATTATAC TTGCATTGTC TGTATCGATC GTGCCAGCCT 5880

CTCCACTTGG CACGTCCTAT ACTCTCCCAA CGTCTCTGTT CCATCCTCTT CTTCTACCCC 5940

CCTCCTTTAC CCATCGTTAG CGCTTCCAGC CCCCCACCTG ACGHACCAT TTAACTGGAC 6000

CCACTGCTTT GACCCCCAGA TTCAAGCTAT AGTCTCCTCC CCCTGTCATA ACTCCCTCAT 6060

CCTGCCCCCC TTTTCCTTGT CACCTGTTCC CACCCTAGGA TCCCGCTCCC GCCGAGCGGT 6120

ACCGGTGGCG GTCTGGCTTG TCTCCGCCCT GGCCATGGGA GCCGGAGTGG CTGGCGGGAT 6180

TACCGGCTCC ATGTCCCTCG CCTCAGGAAA GAGCCTCCTA CATGAGGTGG ACAAAGATAT 6240

TTCCCAGTTA ACTCAAGCAA TAGTCAAAAA CCACAAAAAT CTACTCAAAA TTGCGCAGTA 6300

TGCTGCCCAG AACAGACGAG GCCTTGATCT CCTGTTCTGG GAGCAAGGAG GATTATGCAA 6360

AGCATTACAA GAACAGTGCC GTHTCCGAA TATTACCAAT TCCCATGTCC CAATACTACA 6420

AGAAAGACCC CCCCTTGAGA ATCGAGTCCT GACTGGCTGG GGCCTTAACT GGGACCTTGG 6480

CCTCTCACAG TGGGCTCGAG AGGCCTTACA AACTGGAATC ACCCTTGTTG CGCTACTCCT 6540

TCTTGTTATC CTTGCAGGAC CATGCATCCT CCGTCAGCTA CGACACCTCC CCTCGCGCGT 6600

CAGATACCCC CATTACTCTC TTATAAAACC TGAGTCATCC CTGTAAACCA AGCACGCAAT 6660

TATTGCAACC ACATCGCCTC CAGCCTCCCC TGCCAATAAT TAACCTCTCC CATCAAATCC 6720

TCCTTCTCCT GCAGCAACTT CCTCCGTTCA GCCTCCAAGG ACTCCACCTC GCCTTCCAAC 6780

TGTCTAGTAT AGCCATCAAT CCCCAACTCC TGCATTTTTT CTTTCCTAGC ACTATGCTGT 6840

TTCGCCTTCT CAGCCCCTTG TCTCCACTTG CGCTCACGGC GCTCCTGCTC TTCCTGCTTC 6900

CTCCTAGCGA CGTCAGCGGC CTTCTTCTCC GCCCGCCTCC TGCGCCGTGC CTTCTCCTCT 6960

TCCTTQCTTT TCAAATACTC AGCGCTCTGC TTTTCCTCCT CTTTCTCCCG CTCTTTTTTT 7020

CGCTTCCTCT TCTCCTCAGC CCGTCGCTGC CGATCACGAT GCGTTTCCCC GCGAGGTGGC 7080

GCTTTCTCCC CTGGAGGGCC CCGTCGCAGC CGGCCGCGGC TTTCCTCTTC TAAGGATAGC 7140

AAACCGTCAA GCACAGCTTC CTCCTCCTCC TTGTCCTTTA ACTCTTCCTC CAAGGATAAT 7200

AGCCCGTCCA CCAATTCCTC CACCAGCAGG TCCTCCGGGC ATGACACAGG CAAGCATCGA 7260

AACAGCCCTG CAGATACAAA GTTAACCATG CTTATTATCA GCCCACTTCC CAGGGTTTGG 7320

ACAGAGTCTT CTTTTCGGAT ACCCAGTCTA CGTGTTTGGA GACTGTGTAC AAGGCGACTG 7380

GTGCCCCATC TCTGGGGGAC TATGTTCGGC CCGCCTACAT CGTCACGCCC TACTGGCCAC 7440

CTGTCCAGA6 CATCAGATCA CCTGGGACCC CATCGATGGA CGCGTTATCG GCTCAGCTCT 7500 ACAGTTCCTT ATCCCTCGAC TCCCCTCCTT CCCCACCCAG AGAACCTCTA AGACCCTCAA 7560

GGTCCHACC CCGCCAATCA CTCATACAAC CCCCAACATT CCACCCTCCT TCCTCCAGGC 7620

CATGCGCAAA TACTCCCCCT TCCGAAATGG ATACATGGAA CCCACCCTTG GGCAGCACCT 7680

CCCAACCCTG TCTTTTCCAG ACCCCGGACT CCGGCCCCAA AACCTGTACA CCCTCTGGGG 7740

AGGCTCCGTT GTCTGCATGT ACCTCTACCA GCTTTCCCCC CCCATCACCT GGCCCCTCCT 7800

GCCCCACGTG ATTTTTTGCC ACCCCGGCCA GCTCGGGGCC TTCCTCACCA ATGTTCCCTA 7860

CAAGCGAATA GAAGAACTCC TCTATAAAAT TTCCCTCACC ACAGGGGCCC TAATAATTCT 7920

ACCCGAAGAC TGTTTGCCCA CCACCCTTTT CCAGCCTGCT AGGGCACCCG TCACGCTAAC 7980

AGCCTGGCAA AACGGCCTCC TTCCGTTCCA CTCAACCCTC ACCACTCCAG GCCTTATTTG 8040

GACATTTACC GATGGCACGC CTATGATTTC CGGGCCCTGC CCTAAAGATG GCCAGCCATC 8100

TTTAGTACTA CAGTCCTCCT CCTTTATATT TCACAAATTT CAAACCAAGG CCTACCACCC 8160

CTCATTTCTA CTCTCACACG GCCTCATACA GTACTCTTCC TTTCATAGTT TACATCTCCT 8220

GTTTGAAGAA TACACCAACA TCCCCATTTC TCTACTTTTT AACGAAAAAG AGGCAGATGA 8280

CAATGACCAT GAGCCCCAAA TATCCCCCGG GGGCTTAGAG CCTCCCAGTG AAAAACATTT 8340

CCGAGAAACA GAAGTCTGAA AAGGTCAGGG CCCAGACTAA GGCTCTGACG TCTCCCCCCG 8400

GAGGGCAGCT CAGCACCGGC TCGGGCTAGG CCCTGACGTG TCCCCCTGAA GACAAATCAT 8460

AAGCTCAGAC CTCCGGGAAG CCACCAAGAA CCACCCATTT CCTCCCCATG TTTGTCAAGC 8520

CGTCCTCAGG CGTTGACGAC AACCCCTCAC CTCAAAAAAC TTTTCATGGC ACGCATATGG 8580

CTCAATAAAC TAGCAGGAGT CTATAAAAGC GTGGAGACAG TTCAGGAGGG GGCTCGCATC 8640

TCTCCTTCAC GCGCCCGCCG CCCTACCTGA GGCCGCCATC CACGCCGGTT GAGTCGCGTT 8700

CTGCCQCCTC CCGCCTGTGG TGCCTCCTGA ACTGCGTCCG CCGTCTAGGT AAGTTTAAAG 8760

CTCAGGTCGA GACCGGGCCT TTGTCCGGCG CTCCCTTGGA GCCTACCTAG ACTCAGCCGG 8820

CTCTCCACGC TTTGCCTGAC CCTGCTTGCT CAACTCTACG TCTTTGTTTC GTTTTCTGTT 8880

CTGCGCCGTT ACAGATCGAA AGTTCCACCC CTTTCCCTTT CATTCACGAC TGACTGCCGG 8940

CTTGGCCCAC GGCCAAGTAC CGGCGACTCC GTTGGCTCGG AGCCAGCGAC AGCCCATCCT 9000

ATAGCACTCT CAGGAGAGAA ATTTAGTACA CATAGTTGGA GGTAG 9045 配列番号 2

Θ己列の長さ： 2 9

配列の型：核酸

蛾の数：一本鎮

トポロジー：直餓状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

CCAGCGGCCG CGACCTCCAA GACCTCCTG 29 配列番号 3

配列の長さ： 2 9

列の型：核酸

鎖の数：一本敏

トポロジー：直钹状

配列の種類：他の核酸合成 DM

配列

AAAGCGGCCG CCCGATAGCC TTGTTCTCA 29 配列番号 4

配列の長さ： 2 9

配列の.型：核酸 '

縝の数：一本縝

トポロジー：直鎮状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TTTGCGGCCG CAACCCAGCA AACCCCTGG 29 配列番号 5

配列の長さ： 2 9

配列の型：核酸

縝の敏：一本縝

トポロジー：直敏状

配列の種類：他の核酸合成 DKA

配列

TTAGCGGCCG CGGCGCTGTC TCAACATAT 29 配列番号 6

配列の長さ： 2 9

配列の型：核酸

鎖の数：一本縝

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

AAAGCGGCCG CCGTTCCCTC AGCAATAAA 29 配列番号 7

配列の長さ： 2 9

配列の型：核酸

鎖の数：一本鑌

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

AAAGCCGCCG CGAAGGACTG TCATGTCTG 29 配列番号 8

配列の長さ： 2 9

K列の型：核酸

鎖の数：一本敏

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

ACTGCGGCCG CCCAGGGGTT TGCTGGGTT 29 配列番号 9

配列の長さ： 2 9

配列の型：核酸

鎖の数：一本縝

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TTAGCGGCCG CATATGTTGA GACAGCGCC 29 配列番号 1 0

配列の長さ： 2 9

配列 Q型：核酸

鎖の数：一本鍰

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DM

配列

AAAGCGGCCG CAATACCAAT GGGTTTGTT 29 配列番号 1 1

配列の長さ： 2 9

BS^llの型：核酸

敏の数：一本鎖

トポロジー '·直弒状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

AATGCGGCCG CCTCGAGGAT GTGGTCTAG 29 配列番号 1 2

配列の長さ： 2 9

配列の型：核酸

鎖の数：一本鑌

トポロジー：直鎮状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

AAAGCGGCCG CACTCAGGTT TTATAAGAG 29 配列番号 1 3

配列の長さ： 2 9

配列 Q型：核酸

鎖の数：一本鎮

トポロジー：直鎮状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

ATAGCGGCCG CCCCACTTCC CAGGGTTTG 29 配列番号 1 4

配列の長さ： 2 9

配列の型：核酸

鎖の数：一本蛾

トポロジー：直鑌状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TATGCGGCCG CAGGAAGAGT ACTGTATGA 29 配列番号 1 5

配列の長さ： 3 7 7 6

SS^jの型：核酸

鎮の数：繽

トポロジー：直鎖状

の種類： cDNA to mRNA

起源

生物名：ヒト

配列の特徴

特徴を表す記号： CDS

存在位 S： 139. . 2205

特徴を決定した方法： P

配列

CACGCGTCCG GCCGCCGAAG GGGACTGTTT GCTCCTACGG GCTGTAGATG GAGCTGTCCG 60 GCCCCGGAGA GGGGGAAGGC GCCTGGAAAA CGTTCTTCTT CTCCCTGGCC GACCCGAGCG 120 GGGAACAGCA CTCCCAGG ATG CAG TTT GTG TCA ACA CGG CCG CAG CCT CAG 171

Met Gin Phe Val Ser Thr Arg Pro Gin Pro Gin

1 5 10 CAG CTG GGC ATC CAG GGC CTG GGG CTG GAC AGC GGG AGC TGG AGC TGG 219 Gin Leu Gly lie Gin Gly Leu Gly Leu Asp Ser Gly Ser Trp Ser Trp

15 20 25

GCC CAG GCT CTG CCC CCG GAG CAG GTC TGC CAC CAG GAG CCG GCG CTG 267 Ala Gin Ala Leu Pro Pro Glu Gin Val Cys His Gin Glu Pro Ala Leu

30 35 40

CGC GGG GAA ATG GCC GAG GGA ATG CCG CCC ATG CAG GCT CAA GAA TGG 315 Arg Gly Glu Met Ala Glu Gly Met Pro Pro Met Gin Ala Gin Glu Trp

45 50 55

GAC ATG GAC GCC CGG CGG CCA ATG CCT TTT CAG TTC CCA CCC TTT CCA 363 Asp Met Asp Ala Arg Arg Pro Met Pro Phe Gin Phe Pro Pro Phe Pro

60 65 70 75

GAT AGG GCA CCT GTC TTC CCC GAC CGC ATG ATG CGA GAG CCC CAG TTG 411 Asp Arg Ala Pro Val Phe Pro Asp Arg Met Met Arg Glu Pro Gin Leu

80 90

CCC ACA GCA

Pro Thr Ala

GTG GAG AGG

Val Glu Arg Lys Val Asp Ala Gin Ala Ser Gin Leu Leu Asn Leu Glu

110 115 120

GGG CGC ACG GGG ACA GCC GAG AAG AAG CTG GCC GAC TGT GAA AAG ACG

Gly Arg Thr Gly Thr Ala Glu Lys Lys Leu Ala Asp Cys Glu Lys Thr

125 130 135

GCC GTG GAA TTT GGG AAC CAC ATG GAG AGC AAG TGG GCC GTG CTG GGG 603 Ala Val Glu Phe Gly Asn His Met Glu Ser Lys Trp Ala Val Leu Gly

140 145 150 155 ACC CTG CTG CAG GAG TAC GGG CTG CTG CAG AGG CGG CTG GAG AAC TTG 651 Thr Leu Leu Gin Glu Tyr Gly Leu Leu Gin Arg Arg Leu Glu Asn Leu

160 165 170

GAG AAC TTG CTG CGC AAC AGG AAC TTC TGG GTC CTG CGG CTG CCC CCG 699 Glu Asn Leu Leu Arg Asn Arg Asn Phe Trp Val Leu Arg Leu Pro Pro

175 180 185

GGC AGC AAG GGG GAG GCC CCC AAG GTT CCA GTG ACT TTT GTC GAC ATT 747 Gly Ser Lys Gly Glu Ala Pro Lys Val Pro Val Thr Phe Val Asp lie

190 195 200

GCT GTG TAC TTC TCC GAA GAC GAG TGG AAG AAC TTG GAC GAA TGG CAG 795 Ala Val Tyr Phe Ser Glu Asp Glu Trp lys Asn Leu Asp Glu Trp Gin

205 210 215

AAG GAG CTT TAT AAC AAC CTT GTT AAG GAG AAC TAC AAA ACC CTC ATG 843 Lys Glu Leu Tyr Asn Asn Leu Val Lys Glu Asn Tyr Lys Thr Leu Met

220 225 230 235

TCC CTG GAC GCG GAG GGC TCA GTC CCC AAG CCA GAT GCT CCA GTC CAG 891 Ser Leu Asp Ala Glu Gly Ser Val Pro Lys Pro Asp A1& Pro Val Gin

240 245 250

GCT GAG CCC AGG GAA GAA CCT TGT GTG TGG GAG CAG CGC CAC CCC GAA 939 Ala Glu Pro Arg Glu Glu Pro Cys Val Trp Glu Gin Arg His Pro Glu

255 260 265

GAG AGA GAA ATC CCA ATG GAT CCC GAA GCA GGA GCA GAG CCC CTG GTG 987 Glu Arg Glu He Pro Met Asp Pro Glu Ala Gly Ala Glu Pro Leu Val

270 275 280

CCT GCG CAG GAT GCG TCC TCC CAG GTG AAG CGT GAG GAC ACC CTG TGT 1035 Pro Ala Gin Asp Ala Ser Ser Gin Val Lys Arg Glu Asp Thr Leu Cys

285 290 295 GTC CGG GGT CAG CGG GGC CTG GAG GAA AGA GCC ATC CCT ACG GAA TCC 1083 Val Arg Gly Gin Arg Gly Leu Glu Glu Arg Ala lie Pro Thr Glu Ser

300 305 310 315

ATT ACC GAC TCC CCA ATT TCT GCC CAG GAC CTC TTG TCC CGG ATT AAA 1131 lie Thr Asp Ser Pro lie Ser Ala Gin Asp Leu Leu Ser Arg He Lys

320 325 330

CAG GAG GAG CAT CAG TGC GTG TGG GAT CAG CAG GAT TTG GCA GAC AGA 1179 Gin Glu Glu His Gin Cys Val Trp Asp Gin Gin Asp Leu Ala Asp Arg

335 340 345

5

GAT ATT CCC ACG GAT CCC AAT TCA GAG T • 1CT CTC ATC TCA GCA CAT GAC 1227 Asp He Pro Thr Asp Pro Asn Ser Glu Ser Leu lie Ser Ala His Asp

350 355 360

ATT TTG TCA TGG ATC AAG CAG GAG GAG CAG CCA TAC CCA TGG GGA CCA 1275 lie Leu Ser Trp lie Lys Gin Glu Glu Gin Pro Tyr Pro Trp Gly Pro

365 370 375

CGC GAC TCA ATG GAC GGA GAG CTT GGA TTA GAC TCT GGC CCT AGT GAC 1323 Arg Asp Ser Met Asp Gly Glu Leu Gly Leu Asp Ser Gly Pro Ser Asp

380 385 390 395

AGC CTG CTG ATG GTG AAG AAC CCA CCC CCG GCC CCG CCA CAG CCC CAG 1371 Ser Leu Leu Met Val Lys Asn Pro Pro Pro Ala Pro Pro Gin Pro Gin

400 405 410

CCC CAG CGC CAG CCA CCG CAG CCG CAG CTG CAG TCG CAG CCC CAG CCC 1419 Pro Gin Arg Gin Pro Pro Gin Pro Gin Leu Gin Ser Gin Pro Gin Pro

415 420 425

CAG AGC CTG CCC CCC ATC GCG GTG GCC GAG AAC CCG GGC GGC CCC CCG 1467 Gin Ser leu Pro Pro He Ala Val Ala Glu Asn Pro Gly Gly Pro Pro

430 435 440 2?

S8S 085 9AS π"[9 s i 3JV -tas 丄ュ sAつ nig ias ■iXi o:d 8JV

6681 0V3 OVV 193 30V 3VX 33V 3VV 0V3 331 9V3 031 331 OVV 3VI ODD 003

OiS 09S

nI3 Ai9 SJV S Hュ 13K "TO STH 3ュ v ail na 9 ¹³S sig s usy

1981 0V9 309 333 3V3 33V OIV 9V3 3V3 303 3IV 313 003 031 3V3 331 3VV

CCC

aw "^S sAq ni3 s η ο oii 3ュ V ^ΐθ sAlュ Hi S H

E08I 311 33V f)VV 0V3 301 0V9 100 301 OVO 3VI 333 093 OVO 3VV D3V OVD

OSS S2S

ュ 3ュ v ail 911 sAi 3jy Τ^ΒΛ sXq At3

99Ζ.Ϊ 33V 333 DV3 DV3 31V OIV 310 39V 3VV 333 013 030 3IX 3DV OVV 330

0Z9 C C O I S

I9S 丄 J3S SJV β S H nai na na

331 0V3 ODD 391 331 3VI 333 OVV 03V 39D 339 330 3V3 3X0 DID DID

SOS 009

V 3jy 1 0Jd s s jas Ato s Χΐ9 TG ^19 BTV

6S9t 30V 033 OO 313 030 300 133 DOI 001 03V D9f) Ιί)Ι D39 393 390 V30

06 S8 08

^IOュ ¾ "TO BTV Λΐ3 ^T3 H dsy Αΐθ ^T3

Π9ΐ 300 33V 909 330 3Y3 030 339 DOO 333 DOO 109 300 333 IVO D30 000

S 0 S9 09

^1 ュュ as SJV dsy ^ΐθ AI3 OJJ OJJ ^19 O

E9SI 399 339 090 OOY 39V 330 3V9 900 I0D 033 933 933 3V0 390 DDI 033

3-ry nig Λιο OJJ "TO 3¾ Χ ^ dsy dsy Χΐ9 J9S 130 3V0 033 333 010 313 GV3 3LL 139 3V3 OVO 3X3 313 999 V03 33V

6 00/96dT/XDd ZZS0C/96 OAV CAC CTG CAG AAC CAC CAG CGG CTG CAC ACG GGC GAG CGG CCT TTC CAA 1947 His Leu Gin Asn His Gin Arg Leu His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gin

590 595 600

TGT GCA CTG TGC GGC AAG AGC TTC ATC CGC AAG CAG AAC CTG CTC AAG 1995 Cys Ala Leu Cys Gly Lys Ser Phe lie Arg Lys Gin Asn Leu Leu Lys

605 610 615

CAC CAG CGC ATC CAC ACG GGC GAG CGC CCC TAC ACG TGC GGC GAG TGC 2043 His Gin Arg He His Thr Gly Glu Arg Pro Tyr Thr Cys Gly Glu Cys

620 625 630 635

GGC AAG AGC TTC CGC TAC AAG GAG TCG CTC AAG GAC CAC CTG CAG TGC 2091 Gly Lys Ser Phe Arg Tyr Lys Glu Ser Leu Lys Asp His Leu Gin Cys

640 645 650

ACA GCG GCG GCC CGG GCC CCG GCG CCC CAC GGC AGC TCC CGC CGC CTC 2139 Ala Arg Ala Pro Ala Pro His Gly Ser Ser Arg Arg Leu Leu Ser Glu

655 660 665

CTG AGC GAG ACT AGG GCT GGG CTG GGG GAG GGC AGG GCC GGA CGG AGT 2187 Thr Arg Ala Gly Thr Ala Ala Leu Gly Glu Gly Arg Ala Gly Arg Ser

670 675 680

GGA TCG GGG GCG GCC TGAGCACCAA CCACCTTGCC GGGTGTCCTC AGCCACCGTC 2242 Gly Ser Gly Ala Ala

6

TGGAAATCGG CAACAGGCAT TGCACTCCGG TTGGGGGTCC CCCAGGGTGG GGCAGGGATC 2302 CCCCAGATCT GTCTGGTCTG AATGGACGCC CAGCTCATCT AGGGTGGACC CAGCTGCTGG 2362 GGAAGAGCCA GGGGGACCGC GAGGAGCCGA GCGTCCTCGG GCACCGCCCT CACACCTCCT 2422 CGAGTGCCCT GGGACCACTG GGCCACAGAT GGTCATCAGG GGAAGCCACC AGGGAGTCCC 2482 GAAGCCCHC TGAGATCAGG AAATCAGGTC CCAAGGTTAG GAGACGCCCT GAAAAAMGT 2542 GAAGGCCGAG GGATGTGCTA AGGGTAACAC CTTCATGATG ACAACACTGC CTCGCGTTTC 2602 MTAGCGCTT TATACTTTTT TAAGTGTTTT CTATCCGTTA TCCATTTCAC CCTTGGCCTA 2662 TCCCTCTCAG ATAGGTGGGG TAGGATTTTC CTGGTGACCG AGTAAAGTGA GAGGCAGGTG 2722 AGACGGTTCA CCCAATCACA CGGGAAGGGG CGCGCGCTGC CCAACCGCGC TCTCCGCCTA 2782

CCTCGCTGCT CGGGAAGCTG CTGGCCTGGC CCTCCTGGTC TCTCTTCCTT TCTGGTCTCT 2842

CTTCCTTTCC TTGCTCTCAC CCACGGATAA AACCAGAAGC GACAGGAGGC CAGCTCCTGG 2902

GGTTCCTGGG ACCGGGAACA GATTGGCTAC GGAACGCCCC AGGTTGTACA TTCAGAGGGC 2962

TCTTTCTCCA TGGGAGCTCC TGGTGCCGCC TTCGGCCCCA GCCTGTCCCC AGCCCCTCAA 3022

TCTGGTGCAG CAGCATCTTG TCACTGCACA ACAGTGGCCT GGTCCCCCAC AGGCAGTTAG 3082

GGCCCCAGGT CAGACCTCAC CATGATGATT TGTTCCAGTT CTCCCAGGGC AGAGGGGCGA 3142

GGGAGAGGCT TTTGCTGTGA GAGTAGCCGT CACGTGTCTC TTCCCAGCAG CGCCGGGCAA 3202

GTGGGTGCTA GAGTCTGAGC CTCAGGCTCT CCTGCCCTGG GCCTCCCAAT TGGTGCTATC 3262

TGTTACTGCC CGTGCTCACG GACATGGATA CAG 5A 4CCCTGC TGTGCTCCAC ACCCTGCAGG 3322

CGCCTCGGGA AGCGCCCAAA GGATTCCCCT TCACGTTGGT GCACCTGCTC CATAGCTCCG 3382

GGCGCTGCGT CCCGAGGGGC CACAGTCTCC ATTTCAGCGT CTT6CATGGC CTGGCACCGG 3442

GTGGGGTGGT ATGCCCCCTT GHTGTGTCA AAAATGACTT TCCCTGCCCT TGCCGTGGGT 3502

CCGGCGTTCC TCCCAGCCGG GATCACAGTG GGCAGCCGGC ACCCGGCACC ACTTTGGCGA 3562

GCGTCCTGCT TCCGCCCTCG CCCTCATCTA CGCTGCTCCG CTTTCCTCAG ACCCCTTTTT 3622

GCCGTGCAAA GGAATTCTTG ACATTAAATA AAAGGTATCC AGATTGCAGA CTGCATGTTC 3682

ACAGAGCTGG GGGTTCTCCA GCTTGCCTAC AGTAAAGCCT CAATGAACTG GAAAAAAAAA 3742

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 3776 配列番号 1 6

S己列長さ： 3 2

の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎮状

配列の種類：合成 DNA

GATCTAAGTT CCACCCCTTT CCCTTTCATT CG 32 配列番号 1 7

配列の長さ： 3 2

配列の型：核酸

鈹の数：一本鎖

トポロジー：直鎮状

配列の種類：合成 DNA

GATCCGAATG AAAGGGAAAG GGGTGGAACT TA 32 配列番号 1 8

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎮

トポロジー：直鎖状

配列の種類：合成 DNA

CCTGAGGTAA TTATAACCCG 20 配列番号 1 9

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポジー：直鎖状

配列の種類：合成！) N'A

CGCTGATATC GATCGCGCGC 20

93

Claims

請求の範囲

1. 遣伝子発現抑制機能を有する D N A分子であつて、配列表の配列番号 1の 2268位の Cから 4080位の Tまでの DN A配列に含まれる連統する少なくとも 400個の核酸からなる DNA配列または該 DNA配列と約 59 %以上の相同性を有する DN A配列、を含む DN A分子。

2. 遣伝子発現抑制機能を有する D N A分子であつて、配列表の配列番号 1の 2268位の Cから 4080位の Tまでの D N A配列に含まれる連続する少なくとも 400個の核酸からなる DN A配列または該 DN A配列と約 59 %以上の相同性を有する DNA配列、である DNA分子。

3. 配列表の配列番号 1の 2268位の Cから 3182位の Gまでの DNA配列または該 DN A配列と約 59%以上の相同性を有する DN A配列を含む、請求項 1または 2に記載の D N A分子。

4. 配列表の配列番号 1の 3368位の Aから 3780位の Aまでの DNA配列または該 DN A配列と約 59%以上の相同性を有する A配列を含む、請求項 1または 2に記載の DNA分子。

5. 配列表の配列番号 1の 3165位の Aから 4080位の丁までの DNA配列または該 DNA配列と約 59%以上の相同性を有する DN A配列を含む、請求項 1または 2に記载の DN A分子。

6. 宿主細胞内で活性を有するプロモーター配列、請求項 1から 5のいずれかに記稗の DNA配列、および、 RREまたは RXE配列を含む、プラスミド。

7. さらに治療遺伝子配列を含む、請求項 6に記戦のブラスミド。

8. 請求項 6または 7に記載のプラスミドであって、前記プロモーターが、ゥィルス感染細胞で発現率を高くさせるプロモーターである、プラスミド。

9. 請求項 8に記載のプラスミドであって、前記プロモーターが LTRである、プラスミド。

10. 請求項 7に記載のプラスミドであって、前記治療遣伝子配列が、宿主細胞に対して毒性であり得る遣伝子配列またはウィルス複製を阻止し得る S伝子配列である、プラスミド。

1 1 . If求項 1から 5のいずれかに記載の D N A分子の、 ¾伝子発現抑制への使用。

1 2 . 謂求項 1から 5のいずれかに記截の D N A分子の、ウィルス感染症の処 Sへの使用。

1 3. 前記ウィルス感染症が、ヒト T細胞白血病および H I V感染症である、諳求項 1 2に記載の使用。

1 . ヒト T細胞白血病ウィルス I型遺伝子 L T Rの U 5領域に存在する転写抑制領域に結合するタンパク質であって、 Kruppel型の転写抑制因子に共通するドメインおよび 4偭半の] Cruppel型亜鉛フィンガ一ドメインを含む、タンパク質。

1 5 . 分子 Sか約 7 6 k D aである、請求項 1 4に記載のタンパク質。

1 6 . 前記 Kruppel型の転写抑制因子に共通するドメインが配列表の配列番号 1 5の 1 9 6位の Valから 2 6 1位の Trpまでのアミノ酸配列またはその類似の配列であり、そして前記 4個半の Kruppel型亜鉛フィンガードメインが配列表の配列番号 1 5の 5 1 8位の Tyrから 6 4 8位の Hisまでのアミノ酸配列またはその類似の配列である、請求項 1 4に記載のタンパク質。

1 7 . 配列表の配列番号 1 5の 1 5 4位の Leuから 1 8 5位の Leuまでのアミノ酸配列、配列表の配列番号 1 5の 4 0 3位の Proから 4 4 3位の Proまでのァミノ酸配列、および配列表の配列番号 1 5の 4 7 0位の Argから 5 0 3位の Glyまでのアミノ酸配列、あるいは、これらのアミノ酸配列に類似の配列をさらに含む、請求項 1 6に記載のタンパク質。

1 8 . 配列表の配列番号 1 5の 1位の Metから 6 8 8位の Alaまでのァミノ酸配列またはその類似の配列を含む、 ¾求項 1 4に記載のタンパク質。

1 9 . 諝求項 1 4 ~ 1 8いずれかに記載のタンパク質をコードする D N A分子。

2 0 . 配列表の配列番号 1 5の 7 2 4位の Gから 9 2 1位の Gまででなる塩基配列、および配列表の配列番号 1 5の 1 6 9 0位の Tから 2 0 8 2位のじまででなる塩基配列を有する、請求項 1 9に記載の D N A分子。

2 1 . 配列表の配列番号 1 5の 5 9 8位の Cから 6 9 3位の Gまででなる塩基配列、 g£列表の配列番号 1 5の 1 3 4 5位の Cから 1 4 6 7位の Gまででなる塩基配列、および配列表の配列番号 1 5の 1 5 4 6位の Cから 1 6 4 7位の Gまででなる塩基 E?IJをさらに有する、請求項 20に記載の DNA分子。

22. 配列表の配列番号 15の 139位の Aから 2202位の Cまででなる塩基配列を有する、 »求項 19に記載の DN A分子。

23. 配列表の配列番号 15の 1位の Cから 3776位の Aまででなる塩基配列を有する、 it求項 22に記載の DN A分子。

24. 請求項 19〜23のいずれかに記載の DNA分子を有する発現ベクター。

25. 請求項 24に記載の発現ベクターを宿主に導入して得られる形質転換体 c

26. 前記宿主が大»菌である、蹐求項 25に記載の形貧転換体。

27. 諝求項 25に記載の形質転換体を培養するェ g、および産生されたタンパク質を培養培地から回収する工程を包含する、謂求項 14〜18のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。

28. 請求項 14〜18のいずれかに記載のタンパク質を有効成分として含有する抗ウィルス剤。

2 Θ. 請求項 14〜18のいずれかに記載のタンパク質の発現を指標とする、癌の検出方法。