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WO1996028160A1 - Composition pharmaceutique, cosmetique et/ou alimentaire aux prorpietes anti-oxydantes - Google Patents

Composition pharmaceutique, cosmetique et/ou alimentaire aux prorpietes anti-oxydantes Download PDF

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Publication number
WO1996028160A1
WO1996028160A1 PCT/BE1996/000024 BE9600024W WO9628160A1 WO 1996028160 A1 WO1996028160 A1 WO 1996028160A1 BE 9600024 W BE9600024 W BE 9600024W WO 9628160 A1 WO9628160 A1 WO 9628160A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pharmaceutical
cosmetic
composition according
pyrazyn
benzylimidazo
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/BE1996/000024
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-François REES
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Catholique de Louvain UCL
Original Assignee
Universite Catholique de Louvain UCL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Catholique de Louvain UCL filed Critical Universite Catholique de Louvain UCL
Priority to US08/930,439 priority Critical patent/US6204266B1/en
Priority to JP8527122A priority patent/JPH11501633A/ja
Priority to EP96905618A priority patent/EP0814808A1/fr
Publication of WO1996028160A1 publication Critical patent/WO1996028160A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical, cosmetic and / or food composition intended in particular for the prevention and / or treatment of pathologies linked to pro-oxidant agents.
  • the present invention also relates to the use of the pharmaceutical, cosmetic and / or food composition according to the invention.
  • Coelenterazine imidazolopyrazine is the substrate for bioluminescent reactions in many marine organisms.
  • Antioxidant molecules such as vitamins such as vitamin E (soluble in lipids) or cysteine derivatives (soluble in water) are also already used in cosmetic, pharmaceutical and / or food applications.
  • vitamins such as vitamin E (soluble in lipids) or cysteine derivatives (soluble in water) are also already used in cosmetic, pharmaceutical and / or food applications.
  • these antioxidant molecules have the disadvantage of either not being soluble in water, or having too high a toxicity as well as a too low efficiency.
  • the present invention aims to obtain a new pharmaceutical, cosmetic and / or food composition advantageously allowing prevention and / or treatment. pathologies linked to pro-oxidizing agents, and in particular a pharmaceutical, cosmetic and / or food composition with anti-inflammatory and / or anti-carcinogenic properties.
  • a further aim of the present invention is to obtain said pharmaceutical, cosmetic and / or food compositions which are characterized by low toxicity or absence of toxicity, by high solubility in a large number of solvents (H 2 O, alcohols, ...) and / or lipids and / or by high stability, in particular at acid pH.
  • solvents H 2 O, alcohols, ...) and / or lipids and / or by high stability, in particular at acid pH.
  • the present invention relates to a pharmaceutical, cosmetic and / or food composition
  • a pharmaceutical, cosmetic and / or food composition comprising a pyrazine derivative of formula
  • X being an element chosen from the group consisting of O, S, Se, and Te;
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are H, radicals chosen from the group consisting of alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, arylalkyl, alkylaryl, heteroaryl, heteroalkyl and hetero (alkylaryl and arylalkyl), preferably consisting of 1 to 20 carbon atoms optionally comprising 1 to 10 heteroatoms and whose carbon atoms may be optionally substituted by any element from the Mendeleev table, preferably an element chosen from the group consisting of H, B, N, O, F , P, S, Cl, As, Se, Br, Te and I, or chains of formula (R 5 ⁇ R 6 ) n , where n ⁇ 1, x represents one or more hetero atoms and R 5 and R 6 are radicals chosen from the group consisting of alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, arylalkyl, alkylaryl, heteroaryl, heteroalkyl and hetero
  • R 1 is H
  • R 2 and R 4 are aryl or alkylaryl groups, preferably consisting of 1 to 20 carbon atoms optionally comprising 1 to 10 heteroatoms and the carbon atoms may be optionally substituted by any element from the Mendeleev table, preferably an element chosen from the group consisting of H, B, N, O, F, P, S, Cl, As, Se, Br, Te and I, R 3 represents a phenol group or a chain of formula
  • x O
  • R 5 is phenyl
  • R 6 is methyl
  • the pyrazine derivative of the pharmaceutical, cosmetic and / or food composition according to the invention is chosen from the group consisting of:
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the composition according to the invention for fixing pro-oxidizing agents (free radicals) such as peroxides, superoxides, etc.
  • the present invention also relates to a process for the treatment and / or prevention of pathologies linked to the action of pro-oxidizing agents, in particular inflammatory or carcinogenic pathologies, in which the pharmaceutical, cosmetic and / / or food according to the present invention.
  • the pharmaceutical, cosmetic and / or food vehicles according to the invention are suitable vehicles in particular for oral administration, for example in the form of tablets, coated or uncoated, pills, capsules, solutions, essential oils and / or syrups.
  • these pharmaceutical, cosmetic and / or food vehicles can be sunscreen creams or oils well known to those skilled in the art, which can coat different parts of the human or animal body in combination with other protective agents for the skin. .
  • the products of the invention can be easily incorporated into solvents (aqueous media, alcohols, etc.) or lipids (for example in combination with edible oils or tanning oils).
  • compositions according to the invention are prepared according to methods generally used by those skilled in the art, in particular by pharmacists, and can comprise any pharmaceutically suitable vehicle or adjuvant, solid or liquid, and not toxic.
  • the incorporation of the derivatives according to the invention in a galenical medium can also be envisaged.
  • the percentage of active product (pyrazine derivatives) in the pharmaceutical vehicle can vary according to very wide ranges, only limited by the tolerance and the level of acceptance of the product by the patient.
  • the limits are generally determined by the frequency of administration to the patient.
  • a final aspect of the present invention relates to the use of the composition according to the invention for the preparation of a medicament intended for the prevention and / or treatment of pathologies linked to the action of prooxidizing agents.
  • the present invention relates to the use of the composition according to the invention for the preparation of a medicament intended for the prevention and / or treatment of inflammatory or carcinogenic pathologies and / or for the treatment of cancerous tumors.
  • FIG. 1 represents the structure of the imidazolopyrazine derivatives used in the pharmaceutical and food composition according to the invention.
  • FIG. 2 represents the relation uniting the concentration of superoxide dismutase (SOD) and the ratio of the intensities measured in the absence and in the presence of superoxide dismutase (I 0 / I) for two concentrations of coelenterazine
  • FIG. 3 represents the evolution of the slope of the relation uniting the concentration of superoxide dismutase and I 0 / I and of the speed constant
  • FIG. 4 represents the linear relationship between the concentration of coelenterazine and the maximum intensity of the luminescence evoked by the superoxide anion in our experimental conditions.
  • FIG. 5 represents the inactivation of superoxide dismutase by KCN 10 -2 M. The enzymatic activity is totally inhibited by KCN, and no more difference is perceptible between the two concentrations of coelenterazine (10 -7 and 4 ⁇ 10 -7 M).
  • FIG. 6 represents the influence of the luminol concentration on the slope of the relationship uniting the superoxide dismutase concentration and the ratio of the intensities I 0 / I.
  • FIG. 7 represents the stability of derivative 10 in an aqueous medium.
  • Three 10 -5 M CLZN-10 solutions were prepared in citrate (pH 4), phosphate (pH 7) and glycine (pH 10) buffers. Aliquots of these solutions were removed regularly and the CLZN-10 assayed by luminescence in DMSO.
  • FIGS. 8 and 9 represent the percentage of cell survival of human fibroblasts subjected to an oxidative stress inducer in the presence of increasing doses of derivatives according to the invention, with (FIG. 9) or without (FIG. 8) serum.
  • FIG. 10 schematically represents the transformation of a precursor of the derivative according to the invention into a derivative of the invention.
  • FIG. 11 represents the survival percentage of different cell types as a function of increasing doses of CLZ-9 (M).
  • This property could be due to the existence of donor groups (carbonyl) and acceptor groups (nitrogen) of electrons in the central nucleus of the molecule.
  • the phenol groups present in the molecules could also constitute sensors of (ROS).
  • the main reaction mechanism would be comparable to that involved in the chemoluminescent oxidation of coelenterazine by molecular oxygen.
  • reaction product is not a stable and not very reactive radical.
  • excited product formed would be characterized by very great instability. This is such that these products seem to disintegrate instantly by rupture of the nucleus imidazolopyrazine; part of the destructive energy of the ROS is dissipated in the form of light while the rest is released in the form of thermal radiation.
  • the maximum light intensity measured by the luminometer during the competition reaction is linked to the ratio in concentrations of imidazolopyrazine and superoxide dismutase as well as to that of the respective speed constants.
  • the antioxidant and consequently anti-carcinogenic properties of a pharmaceutical, cosmetic or food composition comprising imidazolopyrazine derivatives are completely unexpected, since the fixation of superoxide dismutase by derivatives of imidazolopyrazine of the composition according to the invention is specific and is not observed in other chemoluminescent molecules such as luminol.
  • Each of the imidazolopyrazine derivatives tested was applied to human fibroblasts (MRC5) in culture.
  • the culture medium is renewed, the cells incubated for 72 hours, then their level of survival and growth evaluated by a measurement of the total protein content in each well (Biorad).
  • the results show that the imidazolopyrazine derivatives are little or not toxic to these cells. Only the CLZN-11 derivative has significant toxicity at a concentration of 0.1 mM.
  • FIG. 11 represents the percentage of survival of different cell types (fibroblasts, human endothelial cells (ECV) or pig (EAP)) as a function of increasing doses of CLZ-9 (molar). A toxic effect of the products can possibly be observed on a certain cell type at high concentrations (10 -4 M in pigs). 3. In vivo toxicity.
  • fibroblasts were subjected to an oxidative stress inducer (ter-butyl hydroperoxide (t-BHP)) for 6 to 12 hours in the absence and in the presence of increasing doses of coelenterazine and its derivatives.
  • t-BHP oxidative stress inducer
  • Cell survival after exposure to t-BHP (10 -4 M) for 10 hours is 20 to 30%.
  • the addition of coelenterazine and its derivatives to the incubation medium significantly improves (* p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01) the survival of cells treated with t-BHP.
  • Figures 8 and 9 attached show the results obtained with the compositions according to the invention.
  • the cosmetic composition according to the invention can be applied in the form of a cream directly on the patient's skin.
  • the derivatives according to the invention can also be incorporated into the oily phase of the cosmetic composition instead of being dissolved in the aqueous composition.
  • composition according to the invention is added to an oily phase of a food composition, in particular in spreads, of the minarine or margarine type.
  • Oily phase the powdered ingredients are incorporated into the mixture of oils, to which the melted butter and possibly a colorant are added. This fat phase is stored at 55 ° C.
  • Aqueous phase the gelatin is dispersed in water at 80 ° C, the other ingredients are added and the pH is adjusted to 5 with lactic acid. The mixture is mixed until a homogeneous mass is obtained and the aqueous mixture is stored at 55 ° C.
  • the aqueous phase is then slowly incorporated with vigorous stirring into the fatty dispersion at 55 ° C.
  • We the product is then homogenized at 200 bars and then allowed to cool quickly to 12 ° C.
  • the product is packaged in trays and kept refrigerated before administration to a patient.
  • cosmetic or food compositions can comprise the compounds according to the invention in combination with other adjuvants which can be incorporated in the aqueous phase or the oily phase of the cosmetic and / or food compositions according to the invention.
  • FIG. 10 The inventors have also shown in FIG. 10 the transformation of a precursor of a derivative according to the invention into a pyrazine derivative.
  • the precursor of the invention is capable of also fixing the free radicals to obtain the derivative according to the invention, which is always active and is also capable of fixing the free radicals.
  • the Applicant has also observed that the derivatives of the invention have anti-tumor properties, in particular on carcinomammaries at low concentrations.
  • the derivatives of the invention therefore have a lethal effect on cancer cell lines at concentrations where they are not toxic to normal cells.

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Abstract

La présente invention concerne une composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire comprenant un dérivé de pyrazine de formule (I) ou (II) et/ou son précurseur de formule (III) ainsi que leur utilisation comme antioxydants.

Description

COMPOSITION PHARMACEUTIQUE, COSMETIQUE ET/OU ALIMENTAIRE AUX PROPRIETES ANTI-OXYDANTES.
Obiet de l'invention.
La présente invention concerne une composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire destinée en particulier à la prévention et/ou le traitement de pathologies liées aux agents pro-oxydants.
La présente invention concerne également l'utilisation de la composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire selon l'invention.
Arrière-plan technologique et état de la technique à la base de l'invention.
La coelentérazine, imidazolopyrazine, constitue le substrat de réactions bioluminescentes chez de nombreux organismes marins.
Chez ces organismes, l'oxydation de la coelentérazine par l'oxygène moléculaire, réaction catalysée par une enzyme (luciferase), est responsable de la réaction lumineuse. Des études ont démontré la présence de la coelentérazine chez de nombreux organismes non bioluminescents (Shimomura, Comp. Biochem. Physiol. 86B, pg 361-363 (1987)).
La synthèse d' imidazolopyrazine est connue de l'Homme de l'Art par les documents suivants : Inoue et al., Chemistry Letters, pg 299-300 (1980); Tiranishi et Goto, Bulletin of Chemical Society Japanese 63, pg 3132-3140 (1990); Qi et al., Journal of Chemical Society Perkin Trans 1, pg 1607-1611 (1982); Me Capra et Roth, Journal of Chemical Society Chemistry Community., pg 894-895 (1972); Inoue et al., Chemistry Letters, pg 141-144 (1975); Inoue et al.,
Tetrahedron Letters No. 31, pg 2685-2688 (1977); Qi et al.
Journal of Chemical Society Chemistry Community, pg 1307-1309
(1991); Hori et al., Biochemistry, Vol. 12 No. 22, pg 4463- 4468 (1973); Hart et al., Biochemical and Biophysical Research Communication., pg 980-986, (1978).
Cependant, aucun de ces documents ne décrit une composition pharmaceutique, cosmétique ou alimentaire comprenant un de ces dérivés d' imidazolopyrazine ni les propriétés anti-oxydantes de ces produits, ni une quelconque autre application thérapeutique de ces produits.
Des molécules antioxydantes telles que des vitamines comme la vitamine E (soluble dans des lipides) ou des dérivés de cystéine (soluble dans l'eau) sont également déjà utilisés dans des applications cosmétiques, pharmaceutiques et/ou alimentaires. Cependant, ces molécules antioxydantes présentent l'inconvénient de soit ne pas être solubles dans l'eau, soit présenter une toxicité trop élevée ainsi qu'une efficacité trop faible.
Buts de l'invention.
La présente invention vise à obtenir une nouvelle composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire permettant avantageusement la prévention et/ou le traitement des pathologies liées aux agents pro-oxydants, et en particulier une composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire aux propriétés anti-inflammatoires et/ou anti-cancérigènes.
Un but complémentaire de la présente invention est d'obtenir lesdites compositions pharmaceutiques, cosmétiques et/ou alimentaires qui soient caractérisées par une faible toxicité ou une absence de toxicité, par une importante solubilité dans un grand nombre de solvants (H2O, alcools, ...) et/ou des lipides et/ou par une stabilité élevée, en particulier à pH acide.
Eléments caractéristiques de la présente invention.
La présente invention concerne une composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire comprenant un dérivé de pyrazine de formule
ou
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000005_0002
et/ou son précurseur de formule
Figure imgf000005_0003
dans lesquelles
B est un radical choisi parmi le groupe constitué par X, X-SO3H, X-PO4, X-alkyl=O, ledit alkyle étant constitué de 1 à 20 atomes de carbone comprenant éventuellement 1 à 10 hétéroatomes et dont les atomes de carbone peuvent être éventuellement substitués par un quelconque élément du tableau de Mendeleev, de préférence un élément choisi parmi le groupe constitué par H , B , N , O , F , P , S , Cl , As , Se , Br , Te et I ,
X étant un élément choisi parmi le groupe constitué par O, S, Se, et Te;
R1, R2, R3 et R4 sont H, des radicaux choisis parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, alkylaryle, hétéroaryle, hétéroalkyle et hétéro-(alkylaryle et arylalkyle), de préférence constitués de 1 à 20 atomes de carbone comprenant éventuellement 1 à 10 heteroatomes et dont les atomes de carbone peuvent être éventuellement substitués par un quelconque élément du tableau de Mendeleev, de préférence un élément choisi parmi le groupe constitué par H, B, N, O, F, P, S, Cl, As, Se, Br, Te et I, ou des chaînes de formule (R5 × R6)n, où n ≥ 1, x représente un ou plusieurs hétéro-atomes et R5 et R6 sont des radicaux choisis parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, alkylaryle, hétéroaryle, hétéroalkyle et hétéro-(alkylaryle et arylalkyle), constitués de 1 à 20 atomes de carbone comprenant éventuellement 1 à 10 heteroatomes et dont les atomes de carbone peuvent être éventuellement substitués par un quelconque élément du tableau de Mendeleev, de préférence un élément choisi parmi le groupe constitué par H, B, N, O, F, P, S, Cl, As, Se, Br, Te et I; et éventuellement un véhicule pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire adéquat.
De préférence, dans les dérivés de pyrazine selon l'invention,
R1 est H,
R2 et R4 sont des groupements aryles ou alkylaryles, de préférence constitués de 1 à 20 atomes de carbone comprenant éventuellement 1 à 10 heteroatomes et dont les atomes de carbone peuvent être éventuellement substitués par un quelconque élément du tableau de Mendeleev, de préférence un élément choisi parmi le groupe constitué par H, B, N, O, F, P, S, Cl, As, Se, Br, Te et I, R3 représente un groupe phénol ou une chaîne de formule
(R5 × R6)n dans laquelle
n = 1,
x représente O,
R5 est un phényle et
R6 est un méthyle.
De préférence, le dérivé de pyrazine de la composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire selon l'invention est choisi parmi le groupe constitué par :
* 3,7-dihydro-2-(p-hydroxybenzyl)-6-(p-hydroxyphényl)-8- benzylimidazo[1,2-a]pyrazyn-3-one (CLZN)
* 3,7-dihydro-2-méthyl-6- (p-métoxyphényl) -8- benzylimidazo[1,2-a]pyrazyn-3-one (CLZN-7)
* 3,7-dihydro-2-phényl-6- (p-métoxyphényl) -8- benzylimidazo[1,2-a]pyrazyn-3-one (CLZN-8)
* 3,7-dihydro-2-méthyl-6-(p-hydroxyphény1)-8- benzylimidazo[1,2-a]pyrazyn-3-one (CLZN-9)
* 3,7-dihydro-2-phényl-6-(p-hydroxyphênyl)-8- benzylimidazo[1,2-a]pyrazyn-3-one (CLZN-10)
* 3,7-dihydro-2-benzyl-6- (p-hydroxyphényl)-8- benzylimidazo[1,2-a]pyrazyn-3-one (CLZN-11)
et éventuellement un véhicule pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire adéquat.
Un autre aspect de la présente invention concerne l'utilisation de la composition selon l'invention pour la fixation d'agents pro-oxydants (radicaux libres) tels que peroxydes, superoxydes, ... . La présente invention concerne également un procédé de traitement et/ou de prévention de pathologies liés à l'action d'agents pro-oxydants, en particulier des pathologies inflammatoires ou cancérigènes, dans lequel on administre à un patient la composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire selon la présente invention.
Les véhicules pharmaceutiques, cosmétiques et/ou alimentaires selon l'invention sont des véhicules adéquats notamment pour l'administration orale, par exemple sous forme de tablettes, enrobées ou non enrobées, de pilules, de capsules, de solutions, d'huiles essentielles et/ou de sirops.
D'autres véhicules pharmaceutiques, cosmétiques et/ou alimentaires adéquats peuvent être utilisés selon le mode d'administration choisi.
En particulier, ces véhicules pharmaceutiques, cosmétiques et/ou alimentaires peuvent être des crèmes ou des huiles solaires bien connues de l'Homme du Métier, qui peuvent enduire différentes parties du corps humain ou animal en combinaison avec d'autres agents protecteurs de la peau.
En outre, les produits de l'invention peuvent être aisément incorporés dans des solvants (milieux aqueux, alcools, ...) ou des lipides (par exemple en combinaison avec des huiles alimentaires ou des huiles de bronzage).
Les compositions pharmaceutiques, cosmétiques et/ou alimentaires selon l'invention sont préparées selon des procédés généralement utilisés par l'Homme du Métier, en particulier par les pharmaciens, et peuvent comprendre tout véhicule ou tout adjuvant pharmaceutiquement adéquat, solide ou liquide, et non toxique.
L'incorporation des dérivés selon l'invention dans un milieu galénique peut également être envisagée . Le pourcentage de produit actif (dérivés de pyrazine) dans le véhicule pharmaceutique peut varier selon de très larges gammes, uniquement limitées par la tolérance et le niveau d'acceptation du produit par le patient.
Les limites sont généralement déterminées par la fréquence d'administration au patient.
Un dernier aspect de la présente invention concerne l'utilisation de la composition selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement des pathologies liées à l'action d'agents prooxydants.
En particulier, la présente invention concerne l'utilisation de la composition selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement des pathologies inflammatoires ou cancérigènes et/ou au traitement des tumeurs cancéreuses.
Brève description des figures.
La figure 1 représente la structure des dérivés d'imidazolopyrazine utilisés dans la composition pharmaceutique et alimentaire selon l'invention.
La figure 2 représente la relation unissant la concentration en superoxyde dismutase (SOD) et le rapport des intensités mesurées en l'absence et en présence de superoxyde dismutase (I0/I) pour deux concentrations en coelentérazine
(CLZN). Dans cette figure sont également présentés les résultats de la même expérience réalisée lorsque la superoxyde dismutase est dénaturée thermiquement. La figure 3 représente l'évolution de la pente de la relation unissant la concentration en superoxyde dismutase et I0/I et de la constante de vitesse
KSOD en fonction de la concentration en coelentérazine.
La figure 4 représente la relation linéaire entre la concentration en coelentérazine et l'intensité maximale de la luminescence évoquée par l'anion superoxyde dans nos conditions expérimentales. La figure 5 représente l'inactivation de la superoxyde dismutase par le KCN 10-2 M. L'activité enzymatique est totalement inhibée par le KCN, et plus aucune différence n'est perceptible entre les deux concentrations en coelentérazine (10-7 et 4 × 10-7 M).
La figure 6 représente l'influence de la concentration en luminol sur la pente de la relation unissant la concentration en superoxyde dismutase et le rapport des intensités I0/I.
La figure 7 représente la stabilité du dérivé 10 en milieu aqueux. Trois solutions de CLZN-10 10-5 M ont été préparées dans des tampons citrate (pH 4), phosphate (pH 7) et glycine (pH 10). Des aliquots de ces solutions ont été prélevés régulièrement et le CLZN-10 dosé par luminescence dans le DMSO.
Les figures 8 et 9 représentent le pourcentage de survie cellulaire de fibroblastes humains soumis à un inducteur de stress oxydatif en présence de doses croissantes de dérivés selon l'invention, avec (figure 9) ou sans (figure 8) sérum. La figure 10 représente de manière schématique la transformation d'un précurseur du dérivé selon l'invention en un dérivé de l'invention.
La figure 11 représente le purcentage de survie de différents types cellulaires en fonction de doses croissantes en CLZ-9 (M).
EXEMPLES .
1 . Origine des propriétés anti -oxydantes de la composition pharmaceutique , cosmétique et alimentaire selon l ' invention .
Les propriétés anti-oxydantes des dérivés d'imidazolopyrazine semblent résulter d'une part des propriétés de ces molécules à réagir très rapidement avec les formes activées de l'oxygène.
Cette propriété pourrait être due à l'existence de groupes donneurs (carbonyle) et accepteurs (azote) d'électrons dans le noyau central de la molécule.
Les groupes phénol présents dans les molécules pourraient constituer également des capteurs de (ROS).
Le mécanisme réactionnel principal serait comparable à celui impliqué dans l'oxydation chemoluminescente de la coelentérazine par l'oxygène moléculaire.
D'autre part, ces propriétés pourraient résulter de la très haute instabilité du produit excité formé au cours de la réaction des ROS avec les imidazolopyrazines.
En effet, contrairement aux autres substances connues et présentant une activité anti-oxydante, le produit réacticnnel n'est pas un radical stable et peu réactif. Au contraire, le produit excité formé serait caractérisé par une très grande instabilité. Celle-ci est telle que ces produits semblent se désintégrer instantanément par rupture du noyau imidazolopyrazine; une partie de l'énergie destructrice des ROS est dissipée sous forme de lumière tandis que le reste est libéré sous forme de rayonnement thermique.
Les résultats ci-dessous indiquent l'existence d'une coopérativité positive entre les imidazolopyrazines et la superoxyde dismutase (forme Cu-Zn) cytosolique des cellules.
Ce comportement est mis en évidence lors d'expériences permettant de mesurer la réactivité des imidazolopyrazines avec l'anion superoxyde. Cette méthode est basée sur la capacité des imidazolopyrazines à réagir avec l'anion superoxyde en émettant de la lumière.
Lors de ces expériences, un taux constant d'anion superoxyde est généré par un procédé enzymatique faisant réagir la xanthine oxydase avec l'hypoxanthine en présence d'oxygène. Cette réaction est réalisée en présence de concentrations croissances de superoxyde dismutase (Cu-Zn superoxyde dismutase) qui va entrer en compétition avec l'imidazolopyrazine pour l'anion superoxyde et donc modifier l'intensité lumineuse maximale produite.
L'intensité lumineuse maximale mesurée par le luminomètre pendant la réaction de compétition est liée au rapport dans concentrations en imidazolopyrazine et en superoxyde dismutase ainsi qu'à celui des constantes de vitesse respectives.
Par conséquent, connaissant la constante de vitesse de la réaction de l'antioxydant compétiteur avec l'anion superoxyde (K3), la constante de vitesse de la réaction de l'imidazolopyrazine avec l'anion superoxyde (K2) peut être calculée :
l0 = intensité lumineuse observée en absence du compétiteur I intensité lumineuse observée en présence du compétiteur
SOD superoxyde dismutase
IMPZ imidazolopyrazine
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Figure imgf000013_0002
Figure imgf000013_0003
La réalisation de cette expérience à deux concentrations en imidazolopyrazine permet d'éliminer K1 [O2 2-] correspondant à la réaction de dismutation spontanée de O2 2-. Les pentes A et B des droites unissant I0/I à la concentration en superoxyde dismutase sont :
Figure imgf000013_0004
et alors
Figure imgf000013_0005
Lorsque la concentration en imidazolopyrazine est augmentée, la pente de la relation unissant I0/I à la concentration en superoxyde dismutase doit diminuer. Ces expériences ont révélé un comportement inverse, soit une élévation de la pente pour des concentrations supérieures en imidazolopyrazine (figure 2). Ceci met en évidence une relation linéaire entre la concentration en coelentérazine et la pente de la droite (figure 3). Cette élévation de pente peut être interprétée par un accroissement de la constante de vitesse apparente de la superoxyde dismutase.
Ainsi, lorsque la concentration en coelentérazine est multipliée par 8 (de 50 à 400 nM), la constante de vitesse KSOD passe de 2 × 109 à 2.5 × 1010, soit une augmentation de 12.5 fois. Cet effet a été observé pour deux autres imidazolopyrazines testées (CLZN-9 et -10). L'amplitude de l'accroissement de KSOD semble se réaliser dans des proportions semblables à celles de la coelentérazine.
Différents contrôles ont été réalisés afin de vérifier que l'on n'est pas en présence d'un artefact. Ceuxci incluent :
- un test de linéarité entre la concentration en imidazolopyrazine et l'intensité lumineuse mesurés (figure 4);
- la dénaturation par chauffage de la superoxyde dismutase utilisée indique que la réduction de l'amplitude de la production lumineuse lors de la réaction des imidazolopyrazines avec l'anion superoxyde résulte bien d'une activité enzymatique, et non de la présence de contaminants métalliques (figure 2);
- l'inactivation de la superoxyde dismutase par le cyanure confirme que l'activité enzymatique correspond bien à la superoxyde dismutase et non à une protéine contaminant l'échantillon commercial (figure 5); enfin, des expériences identiques réalisées avec le luminol, molécule chemoluminescente réagissant avec l'anion superoxyde, gui ont révélé un comportement de ce produit conforme à la chéorie, soit une diminution régulière de la pente lorsque la concentration en luminol est augmentée (figure 6).
Par conséquent, les propriétés anti-oxydantes et par conséquent anti-cancérigènes d'une composition pharmaceutique, cosmétique ou alimentaire comprenant des dérivés d'imidazolopyrazine, sont tout à fait inattendues, étant donné que la fixation de la superoxyde dismutase par les dérivés d' imidazolopyrazine de la composition selon l'invention est spécifique et ne s'observe pas chez d'autres molécules chemoluminescentes telles que le luminol.
Vu l'importance de la superoxyde dismutase dans la lutte contre le stress oxydatif (cf. Fridovitch I, Journal of Biological Chemistry 264 (1989), p. 7761-7764), l'action des dérivés d'imidazolopyrazine sur cette enzyme renforcerait les défenses anti-oxydâtives des cellules, leur conférant de ce fait une meilleure protection contre les agents prooxydants.
2. Toxicité in vitro.
La faible toxicité de la composition pharmaceutique, cosmétique ou alimentaire de l'invention pour des cellules humaines est démontrée dans les expériences suivantes.
Chacun des dérivés d' imidazolopyrazine testés a été appliqué sur des fibroblastes humains (MRC5) en culture. Les doses des composés allaient de 10-8 à 10-4 M. Ces composés étaient appliqués 48 heures après ensemencement des puits avec les cellules (volume = 150 μl; 3000 cellules par puits) .
Après une nouvelle période de 24 heures, le milieu de culture est renouvelé, les cellules incubées pendant 72 heures, puis leur niveau de survie et de croissance évaluée par une mesure des contenus en protéines totales dans chaque puits (Biorad). Les résultats montrent que les dérivés d'imidazolopyrazine sont peu ou pas toxiques pour ces cellules. Seul le dérivé CLZN-11 présente une toxicité significative pour une concentration de 0.1 mM.
Cependant, la légère toxicité de ces dérivés à une concentration de 10-4 M s'explique par l'action négative de l'éthanol 1 % utilisé pour solubiliser ces dérivés. Aucun des deux produits de dégradation des dérivés (CLMN-4 et -5) n'est toxique pour les cellules.
Comparativement à la coelentérazine, des dérivés comprenant des groupements phényle additionnels présentent une meilleure stabilité. Tandis que la stabilité de la coelentérazine n'est que de quelques heures en milieu aqueux et quel que soit le pH, ses produits dérivés présentent une excellente stabilité à pH acide et neutre tandis que leur durée de demi-vie avoisine 60 minutes à pH alcalin (figure 7).
Des tests de toxicité in vitro similaires ont été effectués sur d'autres types cellulaires de mammifères (porc, homme, ...).
La figure 11 représente le pourcentage de survie de différents types cellulaires (fibroblastes, cellules endothéliales humaines (ECV) ou de porc (EAP)) en fonction de doses croissantes en CLZ-9 (molaire). Un effet toxique des produits peut éventuellement s'observer sur un certain type cellulaire à des concentrations élevées (10-4 M chez le porc). 3 . Toxici té in vivo .
Des tests ont montré que la coelentérazine (CLZN) (à une dose de 20 μg/kg et après 5 injections par voie intrapéritoneale) n'est pas toxique pour des souris (la survie est de 100% et aucun retard de croissance n'est observé).
Figure imgf000017_0001
4 . Réactivi té des composés avec les espèces activées de l ' oxygène .
La réactivité de la coelentérazine et des dérivés de l'invention avec l'oxygène singulet a été mesurée par photolyse puisée. Les résultats démontrent l'exceptionnelle réactivité de ces composés, les vitesses de réaction atteignant 2-30 X 108 M-1 S-1. Ces constantes de vitesse sont proches des maxima théoriques, tenant compte de la vitesse de diffusion de l'oxygène singulet dans le milieu réactionnel et sont égales ou supérieures à celles de la plupart des agents antioxydants connus.
5. Propriétés antioxydantes sur des fibroblastes .
Des fibroblastes humains ont été soumis à un inducteur de stress oxydatif (ter-butyl-hydroperoxyde (t-BHP)) pendant 6 à 12 heures en absence et en présence de doses croissantes en coelentérazine et de ses dérivés. La survie cellulaire après exposition au t-BHP (10-4 M) pendant 10 heures est de 20 à 30%. L'addition de coelentérazine et de ses dérivés au milieu d'incubation améliore de manière très significative (* p < 0.05; ** p < 0.01) la survie des cellules traitées par le t-BHP. Les figures 8 et 9 annexées présentent les résultats obtenus avec les compositions selon l' invention.
Dans la figure 9, on représente les mêmes expériences, dans lesquelles on ajoute également au milieu du sérum.
Les résultats les plus intéressants sont obtenus avec le dérivé CLZ-9. L'amélioration est déjà significative dès 2 X 10-8 M, tandis que la protection est totale à 10-6 M.
Dans la même série expérimentale, on a comparé l'efficacité de la vitamine E (α-tocophérol) (Troxol ®), antioxydant majeur des cellules animales. Les résultats indiquent que la coelentérazine et le dérivé CLZ-9 possèdent une activité antioxydante équivalente (CLZN) ou supérieure (CLZ-9) à la vitamine E. Ces expériences ont également été réalisées en présence de sérum (10%) dans le milieu de culture, car le sérum est connu pour réduire fortement le temps de vie des antioxydants. Dans ces conditions, l'efficacité des composés selon l'invention à protéger les cellules est conservée et la protection atteint 80 à 100% aux plus fortes concentrations, tandis qu'elle n'atteint que 60% dans le cas de la vitamine E. 6. Composition cosmétique adaptée pour l 'hygiène de la peau.
Figure imgf000019_0001
La composition cosmétique selon l'invention peut être appliquée scus forme de crème directement sur la peau du patient.
Les dérivés selon l'invention peuvent être également incorporés à la phase huileuse de la composition cosmétique au lieu d'être dissous dans la composition aqueuse.
7. Composi tion alimentaire selon l ' invention .
La composition selon l'invention est additionnée à une phase huileuse d'une composition alimentaire, en particulier dans des pâtes à tartiner, de type minarine ou margarine.
Figure imgf000020_0001
Procédé d ' obtention
Phase huileuse : les ingrédients en poudre sont incorporés dans le mélange d'huiles, auquel on ajoute le beurre fondu et éventuellement un colorant. Cette phase de graisse est conservée à 55 °C.
Phase aqueuse : la gélatine est dispersée dans de l'eau à 80 °C, on ajoute les autres ingrédients et on ajuste le pH jusqu'à 5 avec de l'acide lactique. On mélange jusqu'à obtention d'une masse homogène et on conserve le mélange aqueux à 55 °C.
On incorpore ensuite lentement et sous agitation vigoureuse la phase aqueuse dans la dispersion grasse à 55 °C. On homogénéise ensuite le produit à 200 bars et on laisse refroidir ensuite rapidement à 12 °C. On conditionne le produit en barquettes et on conserve réfrigéré avant administration à un patient.
D'autres exemples de compositions cosmétiques ou alimentaires peuvent comprendre les composés selon l'invention en combinaison avec d'autres adjuvants qui peuvent être incorporés dans la phase aqueuse ou la phase huileuse des compositions cosmétiques et/ou alimentaires selon l'invention.
Les inventeurs ont également représenté dans la figure 10 la transformation d'un précurseur d'un dérivé selon l'invention en un dérivé de pyrazine.
Comme il apparaît dans la figure 10, le précurseur de l'invention est susceptible de fixer également les radicaux libres pour obtenir le dérivé selon l'invention, qui est toujours actif et est également susceptible de fixer des radicaux libres.
De manière inatendue, la Demanderesse a également observé que les dérivés de l'invention possèdent des propriétés antitumorales, en particulier sur des carcinomammaires à de faibles concentrations.
Les dérivés de l'invention ont donc un effet léthal sur des lignées de cellules cancéreuses à des concentrations où ils ne sont pas toxiques pour des cellules normales.

Claims

REVENDICATIONS.
1. Composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire comprenant un dérivé de pyrazine de formule
' ou
Figure imgf000022_0001
et/ou son précurseur de formule
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000022_0003
caractérisé en ce que
B est un radical choisi parmi le groupe constitué par X, X-SO3H, X-PO4 et X-alkyl=O dans lequel
X est un élément choisi parmi le groupe constitué par O, S, Se et Te,
R1, R2, R3 et R4 sont H, des radicaux choisis parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, alkylaryle
Figure imgf000022_0004
hétéroaryle, hétéroalkyle et hétéro- (alkylaryle et arylalkyle), éventuellement substitués, ou des chaînes de formule (R5 × R6)n, où n ≥ 1, x représente un ou plusieurs hétéro-atomes et R5 et R6 sont des radicaux choisis parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, alkylaryle, hétéroaryle, hétéroalkyle et hétéro-(alkylaryle et arylalkyle), éventuellement substitués.
2. Composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire selon la revendication 1, caractérisée en ce que R1 est H, R2 et R4 sont des groupements aryle ou alkylaryle, éventuellement substitués,
R3 représente un groupe phénol ou une chaîne de formule (R5 × R6)n dans laquelle n = 1, x représente O, R5 est un phényle et R6 est un méthyle.
3. Composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant un dérivé de pyrazine choisi parmi le groupe constitué par :
* 3 ,7-dihydro-2-(p-hydroxybenzyl)-6-(p-hydroxyphényl)-8- benzylimidazo[1,2-a]pyrazyn-3-one
* 3,7-dihydro-2-méthyl-6- (p-métoxyphény1) -8- benzylimidazo[1,2-a]pyrazyn-3-one
* 3,7-dihydro-2-phényl-6- (p-métoxyphényl) -8- benzylimidazo[1,2-a]pyrazyn-3-one
* 3,7-dihydro-2-méthyl-6- (p-hydroxyphény1)-8- benzylimidazo[1,2-a]pyrazyn-3-one
* 3,7-dihydro-2-phény1-6- (p-hydroxyphényl)-8- benzylimidazo[1,2-a]pyrazyn-3-one
* 3,7-dihydro-2-benzyl-6- (p-hydroxyphényl)-8- benzylimidazo[1,2-a]pyrazyn-3-one
4. Utilisation de la composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire selon l'une quelconque des revendications précédentes pour la fixation d'agents prooxydants.
5. Utilisation de la composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement des pathologies liées à l'action des agents prooxydants.
6. Utilisation de la composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement des pathologies inflammatoires.
7. Utilisation de la composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement des pathologies cancérigènes.
8. Utilisation de la composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des tumeurs cancéreuses.
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