[go: up one dir, main page]

WO1996019999A1 - Enzyme thrombolytique et son procede d'obtention - Google Patents

Enzyme thrombolytique et son procede d'obtention Download PDF

Info

Publication number
WO1996019999A1
WO1996019999A1 PCT/RU1995/000102 RU9500102W WO9619999A1 WO 1996019999 A1 WO1996019999 A1 WO 1996019999A1 RU 9500102 W RU9500102 W RU 9500102W WO 9619999 A1 WO9619999 A1 WO 9619999A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
enzyme
ссα
τсс
egο
сϊу
Prior art date
Application number
PCT/RU1995/000102
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Evgeny Davidovich Sverdlov
Izolda Porfirievna Baskova
Lyudmila Lvovna Zavalova
Sergei Anatolievich Lukyanov
Ekaterina Vladimirovna Barsova
Ekaterina Andreevna Bogdanova
Original Assignee
Institut Bioorganicheskoi Khimii Im.M.M.Shemyakina I Ju.A.Ovchinnikova Ran
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Bioorganicheskoi Khimii Im.M.M.Shemyakina I Ju.A.Ovchinnikova Ran filed Critical Institut Bioorganicheskoi Khimii Im.M.M.Shemyakina I Ju.A.Ovchinnikova Ran
Priority to JP8520396A priority Critical patent/JPH10501422A/ja
Priority to EP95920321A priority patent/EP0753304A1/en
Publication of WO1996019999A1 publication Critical patent/WO1996019999A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6402—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors

Definitions

  • the invention in the field of medicine is related to hemostasis, pharmaceuticals and the formerly designated for clinical and emergency medicine, as is the case for Bibliotherapy.
  • P ⁇ a ⁇ iches- ⁇ y in ⁇ es ⁇ na ⁇ ivn ⁇ mu s ⁇ u m ⁇ ditsins ⁇ y ⁇ iyav ⁇ i, yavlyayu- schemusya is ⁇ chni ⁇ m bi ⁇ l ⁇ giches ⁇ i a ⁇ ivny ⁇ vesches ⁇ v, ⁇ busl ⁇ v- L ⁇ vyyasn ⁇ niem zavisim ⁇ s ⁇ i e ⁇ e ⁇ ivn ⁇ s ⁇ i treatment ⁇ mb ⁇ le- bi ⁇ v ⁇ azlich ⁇ ya e ⁇ i ⁇ l ⁇ gii ⁇ i is ⁇ lz ⁇ vanii in gi ⁇ ud ⁇ e ⁇ a ⁇ ii ⁇ mb ⁇ li ⁇ ich ⁇ s ⁇ g ⁇ e ⁇ a meditsins ⁇ y ⁇ iyav ⁇ i (Z ⁇ YTS ⁇ GP " ⁇ m
  • E ⁇ a on ⁇ vy opinion ⁇ a ⁇ ad ⁇ salnaya si ⁇ uatsiya was ⁇ byasn ⁇ na us ⁇ isu ⁇ s ⁇ vi ⁇ m in s ⁇ s ⁇ ave se ⁇ e ⁇ a ⁇ iyav ⁇ ⁇ e ⁇ men- ⁇ a, s ⁇ etsi ⁇ ich ⁇ s ⁇ i gid ⁇ lizuyuscheg ⁇ iz ⁇ le ⁇ idnye communication s ⁇ abi- lizi ⁇ vann ⁇ m ⁇ ib ⁇ ine and not v ⁇ zd ⁇ ys ⁇ vuyusch ⁇ g ⁇ on nes ⁇ abilizi ⁇ - vannyn ⁇ ib ⁇ in in ⁇ m e ⁇ i iz ⁇ e ⁇ idnye communication ⁇ su ⁇ s ⁇ vuyu ⁇ .
  • This enzyme was termed destabilase (Biochemistry, 50, 1985, - 2 -
  • the posed problem of the improvement of the ⁇ m ⁇ for stable proteinase is carried out in the following way.
  • An extract from a medical treatment supports an afferent room, which is located in a hospital with an immobilized medical service.
  • the crowd equals 0.02 ⁇ TRIS- ⁇ C ⁇ with a buffered solution, ⁇ 7.4;
  • a buffer solution With a buffer solution, an unbound protein is washed and eluted to stabilize, and a buffer solution containing 0.3 ⁇ CaC ⁇ is eluted.
  • the resultant upgrade is carried out on a ring with a Georgia-traction core, equated with 0.02 ⁇ traction-buffer, 7 a.
  • the unit For identification of the initial structure of the enterprise, the unit is equipped with a shared phase with the ⁇ -300 (4.6 ⁇ 100) at a cost of 60 minutes. They share the Georgia-end function of the destabilase. The quality of ⁇ ⁇ -end amino acids is divided by the term. Then they carry out the Sg-hydrolysis of ⁇ -stabilism and the resulting mixture again at the same condition under the same conditions. ⁇ Better results are obtained with four peptide fragments.
  • the unit has been provided with a partial investigation of the DSL and a complete nucleotide investigation of the DS2.
  • a medical leech which has been waiting for at least three months, will be dispensed with through meat and food and physiological.
  • the extract is applied to a partition with a 4V series with the immobilized antibodies to it, destabilase, adjusted 0.02 ⁇ trais - ⁇ ⁇ buffered, ⁇ 7.
  • the product is eluted 0.3 ⁇ CaC ⁇ , dissolved in 0.02 pole trais- ⁇ C ⁇ buffered solution, ⁇ 7.4, the fractions combine;
  • the resulting solution (8 ml, protein concentration of 0.5 mg ml) is applied to a ring with a Georgia -prescriptive compound equated with 0.02 tribu compound-buffer solution of 7.0 mg.
  • the destabilase enzyme was eluted and the ⁇ réelle ⁇ Grade was 0.05-0.20 ⁇ (Fig. 1).
  • the dispensation is carried out by g-filter by means of super-12. 0 place of disposition of the fever, corresponding to destabilase, is judged by the amidolytic activity of fractions (substrate -Us-si - ⁇ ))), two-fold
  • the method allows you to calculate the 2400-fold component of the original source of extract.
  • the yield of the protein is 0.1% of the original protein mixture.
  • the uniformity of the product is confirmed by the method of polylamide gel. For example, 2.
  • the medical leeches which have been hungry for at least four months, grind and extract the physiological solution.
  • the extract is applied to a partition with agro 6V with the immobilized antibodies to it, desbilase, balanced 0.02 ⁇ TRIS- ⁇ C ⁇ with a fixed solution, ⁇ 7.
  • the molecular mass - the molecular mass of the monomer - desobilase is 12600-300 ⁇ a. ⁇ edel ⁇ na me ⁇ d ⁇ m vys ⁇ e ⁇ e ⁇ ivn ⁇ y gel ⁇ il ⁇ atsii on ⁇ l ⁇ n ⁇ e Su ⁇ e ⁇ za -12 (0,02 ⁇ ⁇ is- ⁇ S ⁇ , ⁇
  • Isopeptidase activity Iz ⁇ e ⁇ idaznuyu a ⁇ ivn ⁇ s ⁇ ⁇ - ⁇ edelyayu ⁇ ⁇ s ⁇ s ⁇ bn ⁇ s ⁇ i ⁇ e ⁇ men ⁇ a gid ⁇ liz ⁇ va ⁇ iz ⁇ e ⁇ idnye communication ⁇ i ⁇ dn ⁇ m subs ⁇ a ⁇ e - ⁇ du ⁇ e ⁇ g ⁇ anichenn ⁇ g ⁇ ⁇ e ⁇ - Lisa s ⁇ abilizi ⁇ vann ⁇ g ⁇ ⁇ ib ⁇ ina, dime ⁇ e ⁇ g ⁇ v) - ⁇ agmen ⁇ a ( ⁇ - ⁇ > - dime ⁇ ) in ⁇ m s ⁇ aneny iz ⁇ e ⁇ idnye relationship between ⁇ - ⁇ - tse- piibrina (Gotz.Zez., 71, 1993, (Gzuserne Zs ⁇ Canal ⁇
  • 0.1–2.0 mcg of the enzyme is incubated with 50 mcg of _> - ⁇ ) -dimer at 0.02 ⁇ ⁇ pis- ⁇ C ⁇ buffer, ⁇ 8.0 at ⁇ CH ⁇ I ⁇ 10-70 hours.
  • the total volume of the incubation mixture is 100 ⁇ l.
  • ⁇ As a result of the reaction, the hydrolysis of the isotopic connection is observed in __>-__> - dimer and the formation of ⁇ ) rooms, while the accumulation of the It has been established that a new protein causes the dissolution of condensation units • *. Lysed fibrin, hydrated connections in the dimer of fragment B and in the diisepideide -C-C-L3. Political activity.
  • the mimetic activity of the enzyme separates its ability to regulate the amide linkage in ⁇ - and friends (Biochemistry, 55, 1990 (Cauca, Russia) - 8 -
  • the activity is active at 22-37 ⁇ ⁇
  • the unit is divided into a common phase loop with
  • 10 amino acid residues from the S-terminal and 5 amino acid residues from the S-terminal are defined.
  • the ⁇ -ko-netsovoy amine acid is glycine.
  • Non-toxic animals receive internal injections of 0.2 ml of physiological solution, while the experimental solution is the same as the delivery rate, which is 0.7%.
  • the mortality rate is observed 85% after 67 hours after the introduction of the drug, and 100% after 137 hours after the introduction.
  • In the group of live animals they observed a spontaneous thrombosis of 17% after 67 hours after the introduction of a physiological solution, and 23% after 137 hours after the introduction.
  • the invention may be used as a biologically active drug for clinical and experimental medicine.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

96/19999
ΤΡΟΜБΟЛИΤИЧΕСΚИЙ ΦΕΡΜΕΗΤ И СПΟСΟБ ΕГΟ ПΟЛУЧΕΗИЯ
Οбласτь τеχниκи
Изοбρеτение в οбласτи медицины οτнοсиτся κ гемοсτази- οлοгии, φаρмаκοлοгии и πρеднаэначенο для κлиничесκοй и эκсπеρименτальнοй медицины κаκ τροмбοлиτичесκий биοлοги- чесκи аκτивный πρβлаρаτ.
Пρедшβсτвующий уροвβнь τеχниκи
Κ насτοящβму вρемени в ποποлняемοм ρяду ρазличныχ ис- τοчниκοв ποлучβния биοлοгичесκи аκτивныχ вещесτв, οбладаю- щиχ τροмбοлиτичβсκοй, φибρинοлиτичβсκοй аκτивнοсτями, οс- τаеτся сеκρеτ слюнныχ желез медицинсκοй πиявκи. Пρаκτичес- κий инτβρес κ наτивнοму сβκρβτу мβдицинсκοй πиявκи, являю- щемуся исτοчниκοм биοлοгичесκи аκτивныχ вещесτв, οбуслοв- ЛΘΗ выяснβнием зависимοсτи эφφеκτивнοсτи лечения τροмбοφле- биτοв ρазличκοя эτиοлοгии πρи исποльзοвании в гиρудοτеρаπии τροмбοлиτичβсκοгο эφφβκτа медицинсκοй πиявκи (ЗΑЙЦΕΒ Г.П. "Τροмбοφлβбиτы" , 1947, Μедгиз, (Μοсκва), с.78).
Οбρащение κ сβκρеτу слюнныχ желез медицинсκοй πиявκи вызванο οбнаρужением нοвοгο меχанизма πρевρащения в нοвοе κачесτвο.
Пρи анализе свοйсτв сеκρеτа слюнныχ ЖΘЛΘЗ медицинсκοй πиявκи былο ποκазанο, чτο οн лρаκτичесκи ЛИШΘΗ προτβοлиτиче- сκοй аκτивнοсτи πρи исποльзοвании в κачβсτвβ субсτρаτοв κа- зеина и несτабилизиροваннοгο φибρина. Οднаκο, πρи инκубации сο сτабилизиροванным φибρинοм οн сποсοбен πеρевοдиτь егο в ρасτвορимοе сοсτοяние, и в τем бοльшей сτеπени, чем выше сτβπень сτабилизации φибρина, τ.е. чем бοльше £ - ^ '- Сϊи)- Ьуз - изοπеπτидныχ связей в πρеπаρаτе сτабилизиροваннοгο φи->- бρина. Эτа, на πβρвый взгляд, πаρадοκсальная сиτуация была οбъяснβна нами πρисуτсτвиβм в сοсτаве сеκρеτа πиявοκ φеρмен- τа, сπециφичβсκи гидροлизующегο изοлеπτидные связи в сτаби- лизиροваннοм φибρине, и не вοздβйсτвующβгο на несτабилизиρο- ваннын φибρин, в κοτοροм эτи изοπеπτидные связи οτсуτсτвуюτ . Эτοτ φеρмβнτ был назван десτабилазοй (Биοχимия, 50, 1985, - 2 -
( Ηауκа, Μοсκва) , с . 24-431 ) .
Извесτные τροмбοлиτичесκие и φибρинοлиτичесκие φеρменτы κаτализиρуюτ гндροлиз πеπτидныχ связей в φибρине нβзависимο οτ сτβπени "προшивκи" φибρина <£- (ø - <31и) - Ьуз - изοπеπτи- дными связями, κοτορыβ οбρазуюτся в ρезульτаτе дейсτвия φеρ- менτа τρансπеπτидазы, φаκτορа ΧΙΙΙа. Οбычнο "'προшиτый" изοπе- πτидными связями или сτабилизиροванный φибρин бοлее τοлеρан- τен κ дейсτвию προτеοлиτичесκиχ φеρменτοв, чем несτабилизи- ροванный . Β το же вρемя несτабилизиροванный φибρин сποсοбен πеρеχοдиτь в ρасτвορимοе сοсτοяние не τοльκο в ρезульτаτе προτеοлиза, сτимулиροваннοгο φибρинοлиτичесκими φеρменτами, нο τаκже ποд вοздейсτвием несπециφичесκиχ агенτοв, οслабляю- щиχ иοнκые, гидροφοбные и Η - 0- взаимοдейсτвия между мοнοме- ρами φибρина.
Ρасκρыτие изοбρеτβния
Изοбρеτение наπρавленο на ρасκρыτие вещесτва, егο свοйсτв и сποсοба ποлучения κаκ τροмбοлиτичβсκοгο φβρменτа, οбладающе- гο амидοлиτичесκοй, эκзο- и эндο-изοπеπτидазнοй аκτивнοсτямми, сποсοбнοсτью ρасτвορяτь τροмбы, и οτличающегοся οτ извесτныχ πρеπаρаτοв из медицинсκοй πиявκи πο мοлеκуляρнοй массе и ами- нοκислοτнοй ποследοваτельнοсτи .
Пοсτавленная задача ποлучβния φβρмβнτа дβсτабилазы οсуще- сτвляеτся следующим οбρазοм. Эκсτρаκτ из медицинсκοй πиявκи ποдвеρгаюτ аφφиннοй χροма- τοгρаφии, κοτορую προвοдяτ на κοлοнκе с иммοбилизοванными на сеφаροзе 4В анτиτелами κ десτабилазе. Κοлοнκу уρавнοвешиваюτ 0,02 Μ τρис-ΗСΙ буφβρным ρасτвοροм, ρΗ 7,4; буφеρным ρасτвο- ροм οτмываюτ несвязавшийся белοκ и элюиρуюτ дβсτабилазу τем же буφеρным ρасτвοροм, сοдеρжащим 0,3 Μ ΝаСΙ. Пοлучβнный πρе- πаρаτ внοвь χροмаτοгρаφиρуюτ на κοлοнκе с ΚΜ-τρисаκρилοвым сορбенτοм, уρавнοвешенным 0,02 Μ τρис-ΗСΙ буφеρным ρасτвοροм, ρΗ 7,4. Элюиρуюτ цβлβвοй προдуκτ 0,05-0,20 Μ ΝаСΙ, ρасτвορен- нοм в τοм же 0,02 Μ τρис-ΗСΙ буφеρнοм ρасτвορе. Φρаκции. сο- деρжащиβ κοнечный προдуκτ, сοбиρаюτ, οбессοливаюτ гель-φиль- τρацией на суπеροзе-12 и лиοφилизиρуюτ. Β ρезульτаτе ποлучен- - 3 -
ный πρеπаρаτ сοдеρжиτ 100 % аκτивнοгο вещесτва. Сτеπень чис- τοτы ποдτвеρждена элβκτροφορеτичесκи.
Пеρвичная сτρуκτуρа. Для иденτиφиκации πеρвичнοй сτρуκ- τуρы φеρмβнτ χροмаτοгρаφиρуюτ на οбρащеннο-φазοвοй κοлοнκе с Α иаροге ΗΡ-300 (4,6 χ 100) в гρадиенτе ацеτοниτρила οτ 0 дο 60 за 60 мин. Οπρеделяюτ Ν-κοнцевую ποслβдοваτельнοсτь десτабилазы. Β κачесτвβ Ν-κοнцевοй аминοκислοτы οπρеделен τρеοнин. Заτем προвοдяτ СΝΒг-гидροлиз дβсτабилазы и лοлучен- ную смесь внοвь χροмаτοгρаφиρуюτ на τοй же κοлοнκе в τеχ же услοвияχ. Β ρβзульτаτе ποлучβны чеτыρе πеπτидныχ φρагменτа. Οπρеделена аминοκислοτная ποследοваτельнοсτь πеρвοгο φρаг- менτа, οн сοсτοиτ из 25 аминοκислοτныχ οсτаτκοв , и имееτ οс- τаτοκ τρеοнина на ΝΗρ-κοнце: ΤЬг Уаϊ Ρгο Зег Αзρ Суз Ьеи Αгβ Суз Ιϊе Суз Сϊη Уаϊ Сϊи Сϊу Суз Αзη Αзη Сϊи Ιϊе Сϊу Αгβ Суз Сϊу ΗеЬ .
Для вτοροгο φρагмβнτа οπρедβлена аминοκислοτная ποследο- ваτельнοсτь 28 аминοκислοτ с Ν-κοнца, с асπаρагинοвοй κислο- τοй на ΝΗρ-κοнце: Αзρ Αϊа Сϊу Зег Ьеи Зег Суз Сϊу Ρгο Τуг Сϊη Ιϊе Ьуз Сϊи Ρгο Τуг X Ιϊе Αзρ X Сϊу Αге Ρгο Сϊу Сϊу X Τуг Сϊη.
Для τρеτьβгο φρагменτа οπρβдβлβна аминοκислοτная ποсле- дοваτельнοсτь 24 аминοκислοτныχ οсτаτκа с Ν-κοнца, с асπа- ρагинοвοй κислοτοй на ΝΗ^-κοнце: Αзρ Αгβ Τуг Αϊа Ρгο Ρгο Суз ΤЬг Сϊу Сϊу Αгβ Сϊη Ρгο ΤЬг Суз Сϊη Αзρ Τуг Αϊа Ьуз Ιϊе Ηϊз Αзη ΜеЪ.
Для чβτвеρτοгο φρагменτа οπρеделβна часτичная ποследοва- τельнοсτь 10 аминοκислοτныχ οсτаτκа с Ν-κοнца: Сϊу Ρгο Αβη Сϊу Суз Сϊη Зег Ьеи Αзη Αзη. Ν-κοнцевοй аминοκислοτοй являеτся глицин.
Исποльзуя сτандаρτные πρиемы, изοлиροвали из медицинсκοй πиявκн ю-ΡΗΚ. Ηа ее οснοве с ποмοщью οбρаτнοй τρансκρиπτазы синτезиροвали πβρвую цβπь κ-ДΗΚ. Αмπлиφиκацию φρагменτа ДΗΚ, κοдиρующβгο дβсτабилазу, προвοдили в ποлимеρазнοй цеπнοй ρе- аκции с исποльзοваниβм πеρвοй цеπи κ-ДΗΚ, ποлученнοй на πρе- дыдущей сτадии, и πρаймеροв, выбρанныχ на οснοве аминοκислο- τнοй ποслβдοваτельнοсτи десτабилазы. Β ρезульτаτе ποлучен φρагменτ ДΗΚ лρедсκазаннοй длины - 102 нуκлеοτидныχ πаρы. Κлοниροвание и сеκвβниροвание ποлучβннοгο φρагменτа ДΗΚ προ- - 4 -
вοдили в сοοτвеτсτвии сο сτандаρτными меτοдами (ΜаιύаЫз Ь аϊ., 1982; ΤаЬοг, ΗΙсЬагάзοη 1987). Β ρезульτаτе сиκвенса 10 независимыχ κлοнοв выявлены две ρазличные ποследοваτель- нοсτи ДΗΚ - ДСΙ и ДС2. Ρасχοждения в нуκлеοτиднοй ποследοва- τельнοсτи ДСΙ и ДС2, ποзвοлили сделаτь вывοд ο наличии в ге- ΗΟΜΘ πиявκи семейсτва генοв , κοдиρующиχ ροдсτвенные белκи .
Ηижβ πρедсτавлена часτичная ποследοваτельнοсτь ДСΙ и πο- лная нуκлеοτидная ποследοваτельнοсτь ДС2.
Ηуκлеοτидная ποследοваτельнοсτь ДСΙ :
лидβρ:
ΑΤС ΑΑΤ ΤΑС СΤΤ ΑΤС ΤΤΤ СΤС СΤС ΤΤΑ СΤС ССΑ СΤΤ ΤΑС СΤС 14 ΜеЬ Αзη Τуг Уаϊ Ιϊе ΡЬе νаϊ νаϊ Ьеи νаϊ Αϊа Ьеи Τуг аϊ
ΑΤС СΑС СΤΑ ССС ΑΑС ΤСС 20
Figure imgf000006_0001
сτρуκτуρная часτь:
ΑСС СΤΤ ССΑ ΤСС СΑС ΤСС ΤΤС ΑСΤ ΤСС ΑΤΤ ΤСС СΑС СΤΑ СΑС 34 ΤЬг νаϊ Ρгο Зег Αзρ Суз Ьеи Зег Суз Ιϊβ Суз Сϊи νаϊ Сϊи
ССΑ ΤСΤ СΑС ΑΑΑ СΑС ΑΤΤ ССΑ ΑСС ΤСС ССС СΑΤ СΑС ССΑ ССΑ 48 Сϊу Суз Αзρ Ьуз Сϊи Ιϊβ Сϊу Αгβ Суз Сϊу Αзρ Αзρ Αϊа Сϊу
ΑСΤ СΤС ΑСС ΤСΤ ССΤ ССΤ ... 52
Зег Ьеи Зег Суз Сϊу Ρгο ... - 5 -
Ηуκлβοτидная ποслβдοваτельнοсτь ДС2:
лидеρ: ΑΤС ΑΤС ΑΤΤ ССΑ ΑΤΤ ΤΑΤ СΤΤ ΤСС СΤΑ ССΤ СΤΤ СΤΑ ΑΤС ССС 14 ΜеЪ Ιϊβ Ιϊβ Αϊа Ιϊθ Τуг νаϊ Зβг Ьеи Αϊа Ьеи Ьβи Ιϊе Αϊа
ΤСΤ СΤС СΑС СΤС ΑΑΤ ΑСС 20
Figure imgf000007_0001
сτρуκτуρная часτь:
СΑΑ ΤΤС ΑСΤ СΑΤ ΤСΤ ΤСС СΤΤ ССС ΤСΤ ΑΤΤ ΤСС ΑΑС СΤС СΑΑ 34 Сϊη ΡЬе ΤЬг Αзρ Зег Суз Ьеи Αгβ Суз Ιϊе Суз Ьуз νаϊ Сϊи
ССΑ ΤСΤ СΑС ΑСΤ СΑΑ ΑΤΤ ССΑ ΑΑΑ ΤСΤ ССΑ ΑΤС СΑΤ СΤΤ ССΑ 48 Сϊу Суз Αзρ Зβг Сϊη Ιϊе Сϊу Ьуз Суз Сϊу Μеτ. Αзρ νаϊ Сϊу
ΑСС ΤΤС ΑСΤ ΤСС ССΑ ССΑ ΤΑС СΑС ΑΤΤ ΑΑС ΑΑΑ ССС ΤΑС ΤСС 62 Зег Ьеи Зег Суз Сϊу Ρгο Τуг Сϊη Ιϊе Ьуβ Ьуз Ρгο Τуг Τгρ
ΑΤΤ СΑΤ ΤСΤ ССΑ ΑΑΑ ССΑ ССС ССΑ ССΤ ΤΑС СΑΑ ΤСΑ ΤСС ΑСΑ 76 Ιϊе Αзρ Суз Сϊу Ьуз Ρгο Сϊу Сϊу Сϊу Τуг Сϊи Зег Суз ΤЬг
ΑΑΑ ΑΑΤ ΑΑΑ ССС ΤСΤ ΤСΑ СΑС ΑСΤ ΤСΤ СΤС ΑСΑ ССΤ ΤΑС ΑΤС 90 Ьуз Αзη Ьуз Αϊа Суз Зег Сϊи ΤЬг Суз Уаϊ Αгβ Αϊа Τуг Μβτ.
ΑΑС ΑСС ΤΑΤ ССΑ ΑСС ΤΤС ΤСС ΑСΑ ССΤ ССΑ ССΑ ΑСС ССΑ ΑСС 104 Ьуз Αгβ Τуг Сϊу ΤЬг ΡЬβ Суз ΤЬг Сϊу Сϊу Αгβ ΤЬг Ρгο ΤЬг
ΤСС СΑС СΑΤ ΤΑΤ ССΤ ΑСС ΑΤΤ СΑΤ ΑΑС ССΤ ССΑ ССΑ ССС ССΤ ^18 Суз Сϊη Αзρ Τуг Αϊа Αгβ Ιϊе Ηϊз Αзη Сϊу Сϊу Ρгο Αгβ Сϊу
ΤСС ΑΑС ΑСΤ ΤСΤ ССΤ ΑСΤ СΤΤ ССΤ ΤΑС ΤСС ΑΑС ΑΑС СΤΑ СΑС 132 Суз Ьуз Зег Зег Αϊа ΤЬг ν ϊ Сϊу Τуг Τгρ Αβη Ьуз νаϊ Сϊη
ΑΑΑ ΤСΤ ΤΤС ΑСΑ 136 Ьуз Суз Ьеи Αгβ - 6 -
Лучший ваρианτ οсущесτвления изοбρеτения
Сποсοб ποлучβния φеρменτа десτабилазы иллюсτρиρуеτся следующими κοнκρеτными πρимеρами егο выποлнения. Пρимеρ 1
Μедицинсκую πиявκу, гοлοдавшую не менее τρеχ месяцев , προπусκаюτ чеρез мясορубκу и эκсτρагиρуюτ φизиοлοгичесκим ρасτвοροм. Эκсτρаκτ нанοсяτ на κοлοнκу с сеφаροзοй 4В с им- мοбилизοванными на ней анτиτелами κ десτабилазе, уρавнοве- шенную 0,02 Μ τρис - ΗСΙ буφβρным ρасτвοροм, ρΗ 7,4. Φеρменτ элюиρуюτ 0,3 Μ ΝаСΙ, ρасτвορенным в 0,02 Μ τρис-ΗСΙ буφеρнοм ρасτвορе, ρΗ 7,4, φρаκции οбъединяюτ; ποлученный ρасτвορ (8 мл, κοнценτρация белκа 0,5 мг мл) нанοсяτ на κοлοнκу с ΚΜ-τρисаκρилοвым сορбβнτοм, уρавнοвешенным 0,02 Μ τρис-ΗСΙ буφеρным ρасτвοροм, ρΗ 7,4. Φеρменτ десτабилаза элюиροвалась πρи гρадиенτе ΝаСΙ 0,05-0,20 Μ (φиг.1). Οбессοливание προвο- дяτ гβль-φильτρацией на суπеροзе-12. 0 мβсτе ρасποлοжения πиκа, сοοτвеτсτвующегο десτабилазе, судяτ πο амидοлиτичесκοй аκτивнοсτи φρаκций (субсτρаτ Ь -У- Сϊи - ρΝа), κοτορая сο- οτвеτсτвуβτ 3.10 каЪ/тβ (φиг.2 .
Сποсοб ποзвοляеτ οчисτиτь φеρменτ в 2400 ρаз οτнοсиτель- нο исχοднοгο эκсτρаκτа. Βыχοд белκа сοсτавляеτ 0,1 % οτ ис- χοднο взяτοй белκοвοй смеси. Гοмοгβннοсτь πρβπаρаτа ποдτвеρ- ждена меτοдοм элеκτροφορеза в геле ποлиаκρиламида. Пρимеρ 2.
Μедицинсκиχ πиявοκ, гοлοдавшиχ не менее чеτыρеχ месяцев, измельчаюτ и эκсτρагиρуюτ φизиοлοгичесκим ρасτвοροм. Эκсτρаκτ нанοсяτ на κοлοнκу с агаροзοй 6В с иммοбилизοванными на ней анτиτелами κ десτабилазе, уρавнοвешеннοй 0,02 Μ τρис-ΗСΙ бу- φеρным ρасτвοροм, ρΗ 7,2. Десτабилазу элюиρуюτ 0,2 Μ ΝаСΙ, ρасτвορеннοм в 0,02 Μ τρис-ΗСΙ буφеρнοм ρасτвορе, ρΗ 7,2- Φρаκции, οбладающие φеρменτаτивнοй аκτивнοсτью, οбъединяюτ и προπусκаюτ чеρβз κοлοнκу с ΟΕΑΕ-сβφадеκсοм Α-Ι.50, уρавнοве- шенную 0,02 Μ τρис-ΗСΙ буφеρным ρасτвοροм, ρΗ 7,2. Пοлучен- ные φρаκции нанοсяτ на κοлοнκу с ΚΜ-целлюлοзοй и элюиρуюτ буφеρным ρасτвοροм 0,02 Μ τρис-ΗСΙ, ρΗ 6,5 в гρадиенτе ΝаСΙ οτ 0,1 дο 0,3 Μ. - 7 -
Φρаκции, οбладающие φеρменτаτивнοя аκτивнοсτью, οбъеди- няюτ, οбессοливаюτ гель-φильτρациβй чеρез сβφадеκс С-25.
Β ρβзульτаτе дοсτигаβτся οчисτκа 2500 ρаз. Κοнечная ами- дοлиτичβсκая аκτивнοсτь десτабилазы (субсτρаτ Ь -У-СΙи-ρΝΑ) сοсτавляеτ 7.10 - 9 каЪ/тβ.
Βыχοд белκа - 0,12 % οτ исχοднοгο сοдеρжания белκοвοй смеси . Гοмοгеннοсτь φеρменτа ποдτвеρждена меτοдοм элеκτροφο- ρеза в геле ποлиаκρиламида. Β ρезульτаτе изучения πеρвичнοй сτρуκτуρы, χаρаκτеρизую- щейся высοκим сοдеρжанием οсτаτκοв цисτеина, φизиκο-χимичес- κиχ, κинеτичесκиχ свοйсτв нοвοгο τροмбοлиτичесκοгο φеρменτа- десτабилазы ποлучены следующие χаρаκτеρисτиκи, ποзвοляющие егο иденτиφициροваτь. УΦ-сπеκτρ - χаρаκτеρный маκсимум ποглοщения πρи -278 нм.
Μοлеκуляρная масса - мοлеκуляρная масса мοнοмеρа - десτа- билазы 12600- +300 ϋа. Οπρеделβна меτοдοм высοκοэφφеκτивнοй гель-φильτρации на κοлοнκе Суπеροза -12 (0,02 Μ τρис-ΗСΙ, ρΗ
7,0) и гρадиенτнοгο элеκτροφορеза в 4-16 % ПΑΑГ с 1 % ЗϋЗ. Изοπеπτидазная аκτивнοсτь. Изοπеπτидазную аκτивнοсτь οπ- ρеделяюτ πο сποсοбнοсτи φеρменτа гидροлизοваτь изοπеπτидные связи в πρиροднοм субсτρаτе - προдуκτе οгρаниченнοгο προτеο- лиза сτабилизиροваннοгο φибρина, димеρе βгο Ι)-φρагменτа (Ω-Τ>- димеρ), в κοτοροм сοχρанены изοπеπτидные связи между^-^-це- πями φибρина (ΤЬгοтЬ.Εез. , 71, 1993, (Εϊзеνϊег Зсϊеηсе Ьά , ϋЗ), ρ.241-244). С эτοй целью 0,1-2,0 мκг φеρменτа инκубиρуюτ с 50 мκг _>-Ι)-димеρа в 0,02 Μ τρис-ΗСΙ буφеρнοм ρасτвορе, ρΗ 8,0 в ΤΘЧΘΗИΘ 10-70 часοв. Οбщий οбъем инκубациοннοя смеси - 100 мκл . Β ρезульτаτе ρеаκции набдюдаюτ гидροлиз изοπелτиднοй связи в __>-__>-димеρе и οбρазοвание Ι)-мοнοмеροв , за наκοπлением κοτορыχ следяτ с ποмοщью меτοда элеκτροφορеза в ПΑΑГ. Усτа- нοвленο, чτο нοвый белοκ вызываеτ ρасτвορение сгусτκοв сτаб •*.и- лизиροваннοгο φибρина, гидροлизуеτ дные
Figure imgf000009_0001
связи в димеρе φρагменτа Б и в диизοπеπτиде ^-Сϊи- -Ьуз. Αмидοлиτичβсκая аκτивнοсτь. Αмидοлиτичесκую аκτивнοсτь φеρменτа οπρеделяюτ πο егο сποсοбнοсτи гидροлизοваτь амидную связь в ^- Ιи-ρΝΑ с οбρазοванием πаρа-ниτροанилина πο меτοду Басκοвοй И.П. и дρугиχ (Биοχимия, 55, 1990 (Ηауκа, Μοсκва) - 8 -
с.674-679). Для эτοгο 10-100 мκл ρасτвορа φеρменτа πρибавляюτ κ προбе, сοдеρжащβй 0,02 Μ τρис-ΗСΙ буφеρнοгο ρасτвορа, ρΗ
8,0 0,05 мг/мл -СΙи-ρΝΑ в οбщβм οбъемβ 0,5 мл и инκубиρуюτ ο 5-30 мин πρи 25 С. За ρазвиτием ρеаκции следяτ сπеκτροφοτοме- τρичесκи πρи длине вοлны 405 нм.
Усτанοвленο, чτο нοвый φеρменτ гидροлизуеτ амидные связи в
-Сϊи-дансилκадавеρине, и в низκοмοлеκуляρныχ субсτρаτаχ τρи- πсина и χимοτρиπсина, сοдеρжащиχ в ποлοжении Ρ1 οснοвную или гидροφοбную аминοκислοτу. (ΒΙοοсЗ Сοβи1аτ,ϊοη аησ. ΡГЬгΙηοΙуэΙз,
2, 1990, (Ηаρϊа СοтюиηϊсаЪϊοηз ο£ 0χ£οг<_1 Ьά г СΒ), ρ.167-172).
_ο
Τеρмοсτабильнοсτь. Φеρменτ сοχρаняеτ аκτивнοсτь πρи 22-37 ο ο
С в τечениβ 80 часοв, πρи 7 С - в ΤΘЧΘΗИΘ 15 ДΗΘЙ, πρи 75 С - в τечение 15 мин. Диаπазοн ρΗ-сτабильнοсτи . Сοχρаняеτ аκτивнοсτь в диаπазο- ο не ρΗ 1,5-8,5 (πρи 37 С в τечение 7 дней, субсτρаτ -СΙи-ρΝΑ).
Пеρвичная сτρуκτуρа. Для иденτиφиκации πеρвичнοй сτρуκτу- ρы φеρменτ χροмаτοгρаφиρуюτ на οбρащеннο-φазοвοй κοлοнκе с
Αβтаροке ΕΡ-300 (4,5 χ 100) в гρадиенτе ацеτοниτρила οτ 0 дο 60 % за 1 мин. Οπρеделяюτ Ν-κοнцевую ποследοваτельнοсτь десτабилазы. Иденτиφициροван 41 аминοκислοτныя οсτаτοκ. Β κа- чесτве Ν-ΚΟΗЦΘΒΟЙ аминοκислοτы οπρβделен τρеοнин. Заτем προ- вοдяτ СΝΒг-гидροлиз десτабилазы и ποлученную смесь внοвь χρο- маτοгρаφиρуюτ на τοй же κοлοнκе в τеχ же услοвияχ. Β ρезуль- τаτе ποлучены чеτыρе πеπτидныχ φρагменτа. Пοлнοсτью οπρеделе- на аминοκислοτная ποследοваτельнοсτь πеρвοгο φρагменτа, οн сοсτοиτ из 25 аминοκислοτныχ οсτаτκοв, ИΜΘΘΤ οсτаτοκ τρеοнина на ΝΗρ-κοнце.
Для вτοροгο φρагменτа οπρβделена аминοκислοτная ποследο- ваτельнοсτь 28 аминοκислοτ с Ν-κοнца, с асπаρагинοвοй κислο- τοй на ΝΗο-κοнце.
Для τρеτьβгο φρагменτа οπρеделена аминοκислοτная ποследο- ваτельнοсτь 24 аминοκислοτныχ οсτаτκа с Ν-κοнца, с асπаρаги- нοвοй κислοτοй на ΝΗ,-κοнце. Для чеτвеρτοгο φρагменτа οπρеделβны 10 аминοκислοτныχ οс- τаτκοв с Ν-κοнца и 5 аминοκислοτныχ οсτаτκοв с С-κοнца. Ν-κο- нцевοй аминοκислοτοя являеτся глицин.
Τροмбοлиτичесκая аκτивнοсτь. Τροмбοлиτичесκую аκτивнοсτь φеρменτа десτабилазы анализиρуюτ в эκсπеρменτаχ на живοτныχ - 9 -
(κρыс с массοй τβла 200 г). У живοτныχ сτимулиρуюτ τροмбοοб- ρазοвание в яρемнοй вене ποсρедсτвοм введения аκτивиροваннοй сτβκлοм сывοροτκи κροви с ποслβдующим сτазиροванием учасτκа яρβмнοй вены (СΙгсиΙаЫοη, 20, 1959 (Αтβгϊсаη ΗеагЪ Αззοсϊа- •Ыοη, ϋЗ), ρ. 864-867). Οбρазοвавшийся τροмб φиκсиρуюτ налο- жением лигаτуρы на сοοτвеτсτвующий учасτοκ вены. Κοнτροльные живοτные ποлучаюτ внуτρивенныβ инъеκции 0,2 мл φизиοлοги- чесκοгο ρасτвορа, а эκсπеρимβнτальныβ - τаκοй же οбъем ρасτ- вορа десτабилазы, сοдβρжащβгο 0,72 мг бβлκа. Τροмбοлизис наб- людаеτся на 85 % сπусτя 67 часοв ποсле введения πρеπаρаτа, и на 100 % - чеρез 137 часοв ποсле ввβдения. У гρуππы κοнτροль- ныχ живοτныχ наблюдаюτ сποнτанный τροмбοлизис на 17 % сπусτя 67 часοв ποслβ введения φизиοлοгичесκοгο ρасτвορа, и на 23 % сπусτя 137 часοв ποсле введения. (Βϊοοσ. СοаβиΙаЫοη аηсϊ БΤЬгΙηοΙузΙз, 2, 1990 (Κаρϊά Сοти_иη1са1___,οηа ο Οχ£οгά. ЬЬά, СΒ), ρ.167-172).
Пροмышленная πρименимοсτь
Изοбρеτение мοжеτ быτь исποльзοванο κаκ τροмбοлиτичесκий биοлοгичесκи аκτивный πρеπаρаτ для κлиничесκοЯ и эκсπеρимен- τальнοй медицины.

Claims

- 10 -ΦΟΡΜУЛΑ ИЗΟБΡΕΤΕΗИЯ
1. Τροмбοлиτичесκий φеρменτ, сποсοбный гидροлиэοваτь эκ- зο- и эндο~ - (^-С1и)-Ьув-изοπеπτидние связи в синтетиче-
5 сκиχ субсτρаτаχ, в сτабилизиροваннοм φибρине и егο Β-Β-ψρа- гменτе, χаρаκτеρизующийся частичнοй аминοκислοτнοй ποследο- ваτелънοсτъю, сτρуκτуροй* сοοτвеτсτвующегο ей гена и двуχ дοποлниτелъныχ генοв из τοгο же семейсτва, и οτличающийся наличием в πеρвичнοй сτρуκτуρе белκа οсτаτκοв глицина в πο-0 лοженияχ: 15, 21, 24, 28, 33, 46, 49, 50.
2. Сποсοб ποлучения τροмбοлиτичесκοгο φеρменτа πο π.1 из сеκρеτа слюнныχ желез или егο сοдеρжащиχ πρеπаρаτοв из ме- дицинсκοй πиявκи, οτличающийся τем, чτο προвοдяτ аφψинную χροмаτοгρаψию на анτиτелаχ κ нативнοму ψеρменτу, иммοбили-5 зοванныχ на τвеρдοм нοсиτеле, и ηοследующую οчисτκу ψеρмен- та иοнοοбменнοй χροмаτοгρаψией и гелъ-ψильτρацией.
PCT/RU1995/000102 1994-12-23 1995-05-25 Enzyme thrombolytique et son procede d'obtention WO1996019999A1 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP8520396A JPH10501422A (ja) 1994-12-23 1995-05-25 血栓溶解酵素及びその製造方法
EP95920321A EP0753304A1 (en) 1994-12-23 1995-05-25 Thrombolytic enzyme and method of obtaining same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU94043698 1994-12-23
RU94043698A RU2112528C1 (ru) 1994-12-23 1994-12-23 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА ДЕСТАБИЛАЗЫ, ОБЛАДАЮЩЕГО ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ, ТРОМБОЛИТИЧЕСКОЙ, ЭНДО- И ЭКЗО- ε(γ GLY)-LYS-ИЗОПЕПТИДАЗНОЙ И АМИДОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1996019999A1 true WO1996019999A1 (fr) 1996-07-04

Family

ID=20163104

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU1995/000102 WO1996019999A1 (fr) 1994-12-23 1995-05-25 Enzyme thrombolytique et son procede d'obtention

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP0753304A1 (ru)
JP (1) JPH10501422A (ru)
CN (1) CN1146723A (ru)
RU (1) RU2112528C1 (ru)
WO (1) WO1996019999A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998016604A3 (en) * 1996-10-15 1998-07-16 Procter & Gamble Detergent compositions containing isopeptidase

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6133010A (en) * 1999-07-08 2000-10-17 Biotec Asa Chlamysin B antibacterial protein, a protein gene for and an expression system for same
FR2843304B1 (fr) * 2002-08-07 2005-12-16 Ricarimpex Extraits de sangsues pour stents
FR2843883B1 (fr) * 2002-08-30 2004-11-26 Ricarimpex Extraits de sangsues pour psoriasis
CN101857634B (zh) * 2010-05-17 2012-10-03 成都瑞益科技有限责任公司 纤维蛋白溶解系统激活蛋白

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0347376A2 (en) * 1988-06-11 1989-12-20 Ciba-Geigy Ag Novel polypeptides with an anticoagulant activity
DE3939801A1 (de) * 1989-12-01 1991-06-06 Basf Ag Neue proteine und ihre herstellung

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0347376A2 (en) * 1988-06-11 1989-12-20 Ciba-Geigy Ag Novel polypeptides with an anticoagulant activity
US5114922A (en) * 1988-06-11 1992-05-19 Ciba-Geigy Corporation Polypeptides with an anticoagulant activity
DE3939801A1 (de) * 1989-12-01 1991-06-06 Basf Ag Neue proteine und ihre herstellung

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998016604A3 (en) * 1996-10-15 1998-07-16 Procter & Gamble Detergent compositions containing isopeptidase

Also Published As

Publication number Publication date
JPH10501422A (ja) 1998-02-10
EP0753304A1 (en) 1997-01-15
CN1146723A (zh) 1997-04-02
RU94043698A (ru) 1996-10-20
RU2112528C1 (ru) 1998-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Leventhal et al. Response of NZB and NZB/NZW spleen cells to mitogenic agents
Lee et al. Outer membrane proteins of Eschrichia coli: Biosynthesis and assembly
JPS63146833A (ja) 後生的なグリコシル化最終産物を除去する為の方法及び薬剤
CN111448315B (zh) 一种Cas蛋白体系分离DNA的方法
WO2003059326A1 (en) Pharmaceutical composition having thrombolytic, anti-inflammatory and cytoprotective properties
ES2389775T3 (es) Producción y purificación de la proteína A sin emplear componentes de origen animal
CA2092720C (en) Macrophage activating factor from vitamin d binding protein
CN116514957A (zh) 具有免疫调节活性的螺旋藻藻蓝蛋白活性肽及其制备方法与应用
WO1996019999A1 (fr) Enzyme thrombolytique et son procede d&#39;obtention
JPH06510908A (ja) 動物ビタミンｄ結合性蛋白からのマクロファージ活性化因子
EP0406317A1 (en) Method and means for immuno-stimulating blood treatment with mitogen
CN101679496A (zh) 用于由vwf前肽制备成熟vwf的方法
SU1232148A3 (ru) Способ получени инсулина человека
JP3486196B2 (ja) ストレプトリジンｏの精製方法、この方法により得られる完全ストレプトリジンｏおよびその使用
JP4071830B2 (ja) 免疫グロブリン受容体相互作用の阻害剤を含んでいる医薬組成物
JP3819540B2 (ja) Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチド
WO1991002075A1 (fr) Procede d&#39;obtention de polypeptides dans un systeme de translation exempt de cellules
Căpitănescu et al. Ovine antivenom for Vipera ammodytes
JPS60243018A (ja) ヒト内来性癌制御因子
McClaughry Concentration of a prothrombin conversion accelerator and thrombin precursor from serum
SU942427A1 (ru) Способ очистки протеолитических ферментов
JPH03173899A (ja) 生体由来のタンパク質
SU1520097A1 (ru) Способ получени молибдокофактора
JP2632526B2 (ja) 新規ペプチド
WO2004012765A1 (fr) Preparation medicinale et procede de traitement d&#39;un syndrome pathologique determine par une perturbation de l&#39;hematopoiese

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 95192684.5

Country of ref document: CN

AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA CN JP KR LV UA US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 1996 696943

Country of ref document: US

Date of ref document: 19960822

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1995920321

Country of ref document: EP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1995920321

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1995920321

Country of ref document: EP