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WO1996017872A1 - Intermediate for producing surfactant peptide - Google Patents

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WO1996017872A1
WO1996017872A1 PCT/JP1995/001114 JP9501114W WO9617872A1 WO 1996017872 A1 WO1996017872 A1 WO 1996017872A1 JP 9501114 W JP9501114 W JP 9501114W WO 9617872 A1 WO9617872 A1 WO 9617872A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
leu
val
surfactant
arg
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP1995/001114
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tsunetomo Takei
Eiji Ohtsubo
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Original Assignee
Tokyo Tanabe Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tokyo Tanabe Co Ltd filed Critical Tokyo Tanabe Co Ltd
Priority to AU25768/95A priority Critical patent/AU2576895A/en
Publication of WO1996017872A1 publication Critical patent/WO1996017872A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/785—Alveolar surfactant peptides; Pulmonary surfactant peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to peptide derivatives. More specifically, the present invention relates to a peptide derivative which is an intermediate for producing a synthetic peptide useful as an active ingredient for treating respiratory distress syndrome.
  • Respiratory distress syndrome is a disease in which the surface activity of the alveolar surface is reduced due to lack of pulmonary surfactant and the alveoli collapse, resulting in severe respiratory distress. Is high. It is known that pulmonary surfactant preparations are effective for respiratory distress syndrome in newborns. In recent years, as apoproteins specific to mammalian lung surfactant, lipophilic surfactant topoprotein A and surfactant topoprotein D, and hydrophobic surfactant topoprotein B (hereinafter referred to as “SP-B”).
  • SP-B hydrophobic surfactant topoprotein B
  • SP-c surfactant Apoprotein C
  • Human lung-derived SP-C [SEQ ID NO: 1] is an apoprotein with 35 amino acids, a rich N-terminal amino acid, Val-rich, and extremely strong hydrophobicity.
  • the isolated SP-C also consists of 34 to 35 amino acids, and the amino acid sequence at the N-terminal varies depending on the animal species, but has very high homology to humans.
  • hydrophilic peptide portion having a specific sequence which is a partial structure of SP-C on the N-terminal side, and a hydrophobic peptide portion mainly composed of Leu and / or Nle on the C-terminal side.
  • Synthetic peptides containing amino acid sequences can be easily isolated and purified, can be manufactured in large quantities, can be formic acid, trifluoroacetic acid (TFA), trifluoroethanol, Dissolves well in dimethyl sulfoxide (DMSO), form-of-cloth, mixed form-of-form-methanol, methanol, ethylenechlorohydrin or tetrahydrofuran.
  • Xaa is absent or represents Cys or Ser
  • Xbb represents His or Asn
  • Xcc represents Leu or lie
  • W represents a hydrophobic peptide moiety.
  • the present invention is used as an intermediate for the production of the above-mentioned synthetic peptide (hereinafter referred to as “surfactant peptide”) which exhibits a strong surface activity by being combined with a lipid mixture. It is a peptide derivative in which the N-terminal and functional side chain of a hydrophilic peptide represented by the following specific sequence are protected (hereinafter, referred to as “the peptide derivative of the present invention”).
  • Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg (Xaa is absent or represents Cys or Ser, Xbb represents His or Asn, and Xcc represents Leu or lie.)
  • the peptide derivative of the present invention is a peptide derivative capable of easily producing surfactant peptide by condensing with a previously prepared hydrophobic peptide moiety.
  • the protecting group for the N-terminus and the functional side chain of the peptide derivative of the present invention is not particularly limited as long as it is a protecting group used in usual peptide synthesis.
  • the protecting groups of 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), 2-chlorobenzyloxycarbonyl (2-CLZ) or t-butyloxycarbonyl (Boc) are the protective groups of Lys. Boc, carbobenzoxy (Z) or tosyl (Tos) groups as bases, Trt, Fmoc, Boc, Dnp, Bom, Bzl or Tos groups as His protecting groups, and Arg protecting groups as Mtr, Pmc, Mts or Tos groups.
  • peptide derivative of the present invention include Fmoc-Pro-Val-His (, rt) -Leu-Lys (, Boc) -Argi > tr), Fmoc-Pro-Val-Asn-Leu-Lys ( (Boc) -Arg (Mtr), Fmoc-Pro-Val-Asn-Ile-Lys (Boc) -Arg (Mtr) or Fmoc-Cys (Acm)-Pro-Val-His (Trt)-Leu-Ly s (Boc )-Arg (Mtr).
  • Surfactant peptide produced from the peptide derivative of the present invention and a hydrophobic peptide portion is mixed with choline phosphoglyceride, acidic phospholipid and fatty acid as a lipid mixture.
  • a pulmonary surfactant useful as a therapeutic agent for respiratory distress syndrome can be produced.
  • the molecular weight of the synthesized peptides was measured by the fast atom bombardment method (FABMS).
  • FABMS fast atom bombardment method
  • the mass spectrometer used was JMS-S102A (produced by Honden Electronics Co., Ltd.), and the ion source used was a cesium gun (lOKeV).
  • the title peptide derivative B was synthesized and purified by a peptide synthesizer system 9050 (manufactured by Millipore) in the same manner as in Example 1.
  • the amino acid was sequentially extended in the N-terminal direction on the resin, and H-Nle- (Nle-Nle-0-resin) was synthesized by a multipeptide solid-phase synthesis system.
  • the peptide derivative A of Example 1 was added to N-hydroxyquinobenzotriazole and N, N'-diisopropylcarpoide. The mixture was added and shaken for 8 hours, and the condensation reaction was performed twice. The confirmation of the condensation reaction was carried out by a force test using the ninhydrin method.
  • a 20% solution of pyridin-DMF was added to deprotect the F-moc protecting group at the N-terminal. It was washed six times with methanol and dried under reduced pressure. While stirring the dried peptide-0-resin (100 mg) under ice cooling, m-cresol (0.2 ml), 1,2-ethanedithiol (0.5 ml), thioanisole (1 2 ml), TFA (7.5 ml) and trimethylsilyl bromide (4 ml), and the mixture was stirred under ice-cooling for 120 minutes to obtain a functional side chain.
  • the peptide was cut out from the resin together with the deprotection, and filtered through a glass filter (G3).
  • the filtrate was concentrated under reduced pressure to about 5 ml by an evaporator, and getyl ether was added to precipitate the peptide.
  • the peptide precipitate was taken out using a glass filter (G3), washed with getyl ether five times, dried under reduced pressure, and further purified by HPLC to obtain a surfactant peptide of [SEQ ID NO: 4].
  • C was prepared.
  • H-Leu- (Leu) prepared in the same manner as in Reference Example 1. -Leu-0-resin is cut out of the resin and purified to H-Leu- (Leu) ,. -Leu-OH was obtained.
  • the precipitated dicyclourea was removed by filtration, and water was added to the filtrate.
  • the product was extracted with a black hole form, washed sequentially with a 10% aqueous sodium hydrogen carbonate solution, a 0.1N aqueous hydrochloric acid solution and distilled water, and the solvent was distilled off under reduced pressure. Then, after recrystallization from ethanol / water (4: 1), the crystals were dried under reduced pressure to obtain 3.58 g of a condensate (yield: 80%).
  • the surfactant peptides obtained in Reference Examples 1 and 2 were treated with 12N hydrochloric acid-TFA containing 5% (v / v) phenol [2: 1 (V / V)] at 150 ° C under vacuum. After acid hydrolysis for 2, 4, 6, 12, 24, 48 and 72 hours to remove the acid, the hydrolysis products were analyzed by Shimadzu Amino Acid Automatic Analysis System (LC-9A). In the hydrolysis for 1 to 72 hours, the amino acid value showing higher recovery was adopted, and the amino acid composition value was calculated. The value almost coincided with the calculated value.
  • LC-9A Shimadzu Amino Acid Automatic Analysis System
  • 1,2-dino-noremitoyl glycerol (3) -phosphocholin (21 Omg), 1-noreno-tomi-one 2-oleoyl-1 sn-glycero (3) -phospho-1L-serine (90.Omg) ) And palmitic acid (33.Omg) were dissolved in a chloroform solution (4: 1 (VZV)) (100 ml), and surfactant peptide C of SEQ ID NO: 4 (11 Omg) was dissolved in TFA (0. 5 ml). These solutions were mixed and evaporated to dryness under reduced pressure.
  • the resulting residue The suspension was suspended in a water-ethanol mixture [9: 1 (V / V)] (110 ml) at 45 ° C for 25 minutes. This suspension was frozen at 55 ° C and dried at 100-120 Hg vacuum for 28 hours to give 348.7 mg of a white powder of lung surfactant.
  • the pulmonary surfactant prepared from the surfactant peptide and the lipid mixture has a good suspension property and a strong surface activity, and thus is useful as a therapeutic agent for respiratory distress syndrome.
  • Val Val Val Val Val Leu Leu Val Val Val lie Val Gly Ala Leu Leu Met
  • Leu Arg lie Pro Cys Cys Pro Val Asn Leu Lys Arg Leu Leu Val Val

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Description

明 細 書 サーファクタン トぺプチ ドの製造中間体 技術分野
本発明は、 ペプチ ド誘導体に関する。 詳しく は、 呼吸窮迫症候群治療 の有効成分として有用な合成べプチ ドの製造中間体であるべプチ ド誘導 体に関する。 背景技術
呼吸窮迫症候群は、 肺サーファクタン 卜の欠乏により肺胞表面の表面 活性が低下し、 肺胞が虚脱する結果、 重篤な呼吸障害をきたす疾病であ ,り、 未熟な新生児に多症し死亡率が高い。 新生児の呼吸窮迫症候群に対 しては、 肺サーファクタン 卜製剤が卓効を示すことが知られている。 近年、 哺乳動物の肺サーファクタ ン トに特異的なアポ蛋白質として親 水性のサーファクタン トアポ蛋白質 A及びサーファクタン トアポ蛋白質 D、 並びに疎水性のサーファクタン 卜アポ蛋白質 B (以下 「SP— B」 と いう。 ） 及びサーファクタン 卜アポ蛋白質 C (以下 「SP — c」 という。 ） の 4種が確認された 〔アポ蛋白質の構造と機能についての総説 （秋野豊明、 黒木由夫著、 呼吸と循環、 第 38巻第 1 8号第 722頁、 1 990年 ； 安田寛 基ら編、 バイオサ一ファクタン ト、 第 2章 サーファクタン 卜の生化学 —サ一ファクタン 卜とアポ蛋白、 第 1 3 1頁、 1 990年、 株式会社サイェン スフ ォーラム） 〕 。
ヒ ト肺由来の S P - C 〔配列番号 1〕 は、 アミ ノ酸 35個からなり、 N末端アミ ノ酸が Ph eで V alに富み疎水性が極めて強いアポ蛋白質であ る。 またゥシ 〔配列番号 2〕 、 ブタ 〔配列番号 3〕 、 ラッ 卜等の肺から単 離された SP - Cも、 アミ ノ酸 34〜 35個からなり、 N末端側のアミ ノ酸 配列が動物種により異なっているがヒ 卜との相同性が極めて高い。
本発明者らは、 N末端側に SP - Cの部分構造である特定配列の親水性 ペプチ ド部分を、 C末端側に主として Leu 及び 又は Nle から構成さ れる疎水性べプチ ド部分を有する下記ァ ミ ノ酸配列を含有する合成ぺプ チ ドが、 単離 ·精製が容易であること、 大量製造が可能であること、 ギ 酸、 ト リ フルォロ酢酸 （TFA) 、 ト リフルォロエタノール、 ジメチルス ルホキシ ド （DMSO) 、 ク ロ口ホルム、 ク ロ口ホルム/メ タノール混合 液、 メ タノール、 エチレンク ロロ ヒ ドリ ン又はテ 卜 ラ ヒ ドロフラ ンに良 く溶解し、 特にメ タノールに対する溶解度が著しく高いこと、 該合成べ プチ ドと脂質混合物から調製される肺サーファクタ ン トが、 懸濁化剤無 添加、 - 20°C以下で行う通常の凍結乾燥法により製造した場合でも、 均 一懸濁性が良好で、 しかも強力な表面活性作用を有することを知り、 特 許出願した （PCT/ JP94 / 02057 ) 。
Xaa-Pro- Val-Xbb-Xcc-Lys- Arg- W
( Xaaは存在しないか又は Cys若しくは Serを表し、 Xbbは His又は Asnを表し、 Xccは Leu又は lieを表し、 Wは疎水性ペプチ ド部分を表 す。 ） 発明の開示
本発明は、 脂質混合物と配合するこ とにより強力な表面活性作用を示 す前記合成べプチ ド （以下、 「サーフ ァ ク タ ン 卜べプチ ド」 という。 ） の製造中間体と して使用できる下記特定配列で表される親水性べプチ ド の N末端及び官能性側鎖を保護したペプチ ド誘導体 （以下、 「本発明べ プチ ド誘導体」 という。 ） である。
Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg (Xaaは存在しないか又は Cys若しくは Serを表し、 Xbbは His又は Asnを表し、 Xccは Leu又は lieを表す。 )
ペプチドの化学的製造方法としては、 逐次延長法 （stepwise elongation ) 及び断片縮合法 （fragment condensation ) があるが、 断片縮 合法は逐次延長法に比べ、 目的物の精製が容易で大量合成に適した製造 法であり、 不慮の失敗による損失を防止できるという特徴を有している。 本発明べプチ ド誘導体は、 予め調製した疎水性べプチ ド部分と縮合させ ることにより、 サーファクタン 卜ペプチ ドを容易に製造することができ るべプチ ド誘導体である。
本発明ペプチ ド誘導体の N末端及び官能性側鎖の保護基としては、 通 常のぺプチ ド合成において使用される保護基であれば特に制限されるこ とはないが、 末端ァミ ノ基の保護基としては 9一フルォレニルメチルォキ シカルボニル （Fmoc) 、 2—クロ口べンジルォキシカルボニル（2-CLZ) 又は t一ブチルォキシカルボニル（Boc) 基が、 Lys の保護基としては Fmoc. Boc、 カルボベンゾキシ （Z) 又は 卜シル（Tos) 基力、 Hisの 保護基としては Trt 、 Fmoc , Boc、 Dnp、 Bom、 Bzl又は Tos基 が、 Argの保護基としては Mtr、 Pmc、 Mts又は Tos基が挙げられる。 すなわち、 本発明ペプチ ド誘導体の具体例としては、 Fmoc- Pro- Val -His(, rt)-Leu-Lys(,Boc)-Argi> tr) 、 Fmoc - Pro - Val - Asn -Leu -Lys (Boc)- Arg (Mtr) 、 Fmoc-Pro- Val- Asn-Ile-Lys (Boc) -Arg (Mtr)又は Fmoc- Cys ( Acm ) - Pro - Val - His ( Trt ) - Leu - Ly s (Boc)- Arg (Mtr)が挙げられる。
本発明べプチ ド誘導体と疎水性べプチ ド部分とから製造されるサーフ ァ ク タ ン 卜べプチ ドに脂質混合物と してコ リ ンホスホグリ セ リ ド、 酸性 リ ン脂質及び脂肪酸類を配合することにより、 呼吸窮迫症候群治療剤と して有用な肺サーファクタン 卜を製造するこ とができる。 発明を実施するための最良の形態
以下に実施例をもって本発明を更に詳細に説明する。
以下の実施例において、 合成したぺプチ ドの分子量を高速原子衝撃法 (FABMS) により測定した。 質量分析計には、 JMS— S102A型 （曰 本電子株式会社製） を使用し、 イオン源はセシウムガン （ lOKeV) を用 いた。
〔実施例 1〕 Fmoc-Pro-Va卜 His (Trt)-Leu-Lys (Boc)- Arg(Mtr) 標題のぺプチド誘導体 Aをぺプチドシンセサイザーシステム 9050型 （ミ リポア社製） により固相合成した。
初発の榭脂として N— α— 9一フルォレニルメ チルォキシカルボニル 一 Ν— ω— 4—メ トキシー 2， 3, 6, — ト リ メチルベンゼンスルホニル 一アルギニン （Fmoc— Arg ( Mtr ) ) を 2—メ トキシ— 4一アルコキ シベンジルアルコール—樹脂 （サスリ ン （ Sasrin ) 樹脂、 バッ ケィ厶 ( Bachem ) 社、 商標） に桔合させた N - α— 9一フルォレニルメチル ォキシカルボ二ルー Ν— ω— 4—メ トキシ - 2. 3, 6, — 卜 リメチルべ ンゼンスルホ二ルーアルギニン一 0—樹脂 （Fmoc— Arg (Mtr) —〇 —樹脂） （0. 20mmol) を使用し、 ペプチ ドシンセサイザーシステム 9050型の合成プロ トコールに従い、 モニターしながら順次ァ ミ ノ酸を樹 脂上で N末端方向に延長し、 N末端及び官能基を完全に保護したぺプチ ドー 0—樹脂を合成した。
その後、 完全に保護したペプチ ド一◦一樹脂をメ タノールで 5回洗浄 し、 減圧乾燥した。 その乾燥したペプチ ド— 0—樹脂 （ 330mg) に氷冷 下で攪拌しながら、 TFA—ジクロロメ タン （ 1 : 99, V / V ) 溶液を 加えた後、 30分間氷冷下で攪拌し、 次いで、 90分間室温で攪拌し、 保 護基をつけたままペプチドを樹脂から切り出し、 グラスフィルター （G3) で濾過した。 この濾過液をエバポレーターにより約 5mlにまで減圧濃縮 し、 ジェチルエーテルを加えてペプチ ドを沈殿させた。 このペプチ ド沈 殿物をグラスフィルター （G3) で濾取し、 ジェチルエーテルで 5回洗浄 した後、 減圧乾燥してペプチ ド誘導体 Aを 180mg取得した。
この粗製のペプチ ド誘導体 Aに TFA—ジクロロメタン （ 1 ： 99, V
/ V ) 溶液を添加し 10mg/ mlの試料溶液を調製し、 アサヒパッ ク ( Asahipak ) GS - 510 (021. 5 x 500mm ) カラム （商標、 旭化 成社製） による HPLCで精製し、 純粋なぺプチ ド誘導体 Aを採取した。 溶離液としては、 TFA—ジクロロメ タン （ 1 '· 99， V / V ) 溶液を 用い、 8. lmlZminの流速で 120分間溶出した。 溶出液中のペプチ ド の存在は、 245nm (分光光度計 ； 日本分光株式会社モデル 870 - UV ) 及び示差屈折計 （島津製作所株式会社モデル RID - 6A) でモニターし た。
FABMS (M + H-) ； 1527. 0 (分子量の計算値 ； 1525. 8 ) 〔実施例 2〕 Fmoc-Cys ( Acm ) - Pro - Val - His ( Tr t ) - Leu - Ly s
(Boc)- Arg (Mtr)
標題のぺプチド誘導体 Bをぺプチドシンセサイザーシステム 9050型 （ミ リポア社製） により実施例 1に準じた方法で合成し精製した。
FABMS ( M + H-) ； 1700. 0 (分子量の計算値 ； 1698. 8) IR ( KBr, cm ') ： 3325. 1， 1675 - 0， 1733. 9
Ή - NMR (CDC13， ppm ) : 0. 76， 0. 85 (gem - CH3 に 1. 38, 1. 95, 2. 06 (一 CH3) , 1. 63 ( _ CH -） , 2. 55〜 3. 23 (一 CH2— ) , 2. 69 (aromatic - CHa) , 3. 00 (—〇CH3) , . 78 (一 COCH3) , 7. 05〜7. 60 ( aromatic - Η )
〔参考例 1〕 サ一ファクタン トぺプチ ド Cの合成 （固相法）
初発の樹脂として、 Ν— α—フルォニルメチルォキシカルボ二ルー ノ ルロイシン— 0—樹脂 （Fmoc— Nle— 0—樹脂） （0. 20mmolZ0. 5g) を使用した。 その樹脂を DMFで 20分間膨潤させた後、 DMFで 4 回樹脂を洗浄した。 20 %ピぺリ ジン一 DMF溶液を加え振盪し脱保護を 行った。 この脱保護を完全に行うためにこの操作を 3回繰り返した。 次い で、 樹脂中の過剰のピぺリ ジンを除去するため DMFで 9回洗浄した。 こ の際、 ピぺリ ジンの残留を pH試験紙で確認した。
その後、 DMF ( 6ml ) 、 Fmoc一 Nle ( 0. 5mmol ) 、 N— ヒ ド 口キンべンゾトリアゾール （0. 5mmol) 及び N. N ' ージイソプロピ ルカルポジイ ミ ド （0. 5mmol) を加え 90分間振盪し縮合反応を行つ た。 次いで、 DMFで 4回樹脂を洗浄し、 過剰の試薬を除去した。 この縮 合反応の確認は、 ニンヒ ドリ ン法によるカイザーテス 卜で行った。
このようにして合成計画に従い、 順次ァミ ノ酸を樹脂上で N末端方向 に延長し、 H- Nle- (Nle -Nle- 0 -樹脂をマルチべプチ ド固相合成シ ステムにより合成した。
次いで、 合成した H-Nle-(Nle)14-Nle- 0—樹脂に DMFを添加後、 実施例 1のぺプチ ド誘導体 Aを N—ヒ ドロキンべンゾト リアゾール及び N , N ' ージイソプロピルカルポジイ ミ ドを加え 8時間振盪し， 縮合反 応を 2回行った。 なお、 この縮合反応の確認は、 ニンヒ ドリ ン法による力 ィザーテス 卜で行つた。
その後、 得られたペプチ ド— 0—樹脂に 20 %ピぺリ ジン一 DMF溶液 を加え、 N末端の Fmoc保護基の脱保護を行い、 このペプチ ド - 0 -樹 脂を DMFで 6回、 メタノールで 6回洗浄し、 減圧乾燥した。 その乾燥し たペプチ ド— 0—樹脂 （ lOOmg) に氷冷下で攪拌しながら、 m—ク レ ゾール （ 0. 2ml) 、 1 , 2—エタ ンジチオール （0. 5ml ) 、 チオア 二ソール （ 1. 2ml ) 、 TFA (7. 5ml ) 及び 卜 リ メチルシ リ ルブロ マイ ド （ 4ml ) を加えた後、 120分間氷冷下で攪拌し、 官能性側鎖 の脱保護とともにべプチドを樹脂から切り出し、 グラスフィルター （G3) で濾過した。 この濾過液をエバポレイターにより約 5mlにまで減圧濃縮 し、 ジェチルエーテルを加えてペプチ ドを沈殿させた。 このペプチ ド沈 殿物をグラスフィルター （G3) で '慮取し、 ジェチルエーテルで 5回洗浄 した後、 減圧乾燥し、 更に HPLCによる精製を行い、 〔配列番号 4〕 の サーファクタン トぺプチ ド Cを調製した。
FABMS ( M + H+) ； 2560. 2 (分子量の計算値 ； 2559. 3 ) 。 〔参考例 2〕 サーファクタン トペプチ ド Dの合成 （液相法）
参考例 1と同様な方法にて調製した H- Leu- (Leu),。- Leu- 0-樹脂を 樹脂から切り出し、 精製して H-Leu- (Leu),。- Leu- OHを得た。
FABMS ( M + H+) ； 1377. 0 (分子量の計算値 ： 1375. 8 ) このペプチ ド 2. 75g (0. 2mmol) を氷冷下、 塩化メチレン 600ml に溶解し、 濃硫酸 3mlをゆつく り滴下し、 ついでィソブチレン 300mlを 吹き込み、 室温で 65時間放置した。 反応終了後、 炭酸水素ナ ト リ ウム水 溶液で反応液を中和し有機層を水洗、 硫酸ナ ト リ ウムで乾燥し、 溶媒を 減圧濃縮して C末端カルボキシル基保護体 （H— Leu— (Leu) ,„ - Leu 一 OBt ) 2. 08g (収率 90%) で得た。
FABMS ( M + Η') ； 1433. 1 (分子量の計算値 ； 1431. 9) 次いで、 ペプチ ド誘導体 Bの 2. 4g (0. 15mol ) を氷冷下ジメチル ホルムア ミ ド （DMF) 500mlに溶解し、 ついで、 N， N ' — ジイ ソプ 口 ピルカルボシイ ミ ド 0. 3g ( 0. 15mmol ) 、 N— ヒ ドロキシサク シイ ミ ド 0. 17g (0. 15mmol ) 及び H - Leu - ( Leu ) ,。 _ Leu - OBt 2. 15g (0. 15mmol ) を加え、 _ 20 °Cで 1時間、 室温で 10時間反 応した。 反応終了後、 析出したジシクロウレアを濾別除去し、 濾液に水 を加えた。 クロ口ホルムで生成物を抽出し、 10%炭酸水素ナ ト リ ウム水 溶液、 0. 1N塩酸水溶液、 蒸留水で順次洗浄の後、 溶媒を減圧下留去し、 ついで、 エタノール一水 （4 ： 1 ) により再結晶の後、 減圧乾燥して縮合 体を 3. 58g得た （収率 80%) 。
FABMS (Μ + Η') ； 3115. 2 (分子量の計算値 ； 3113. 9) この縮合体べプチ ドの各官能基の保護基は、 Cysの保護基である Acm 基以外は 1 % ( V/ V) イ ン ドールおよび 0. 1 % ( V/ V) エタンジ オールを含有する TFAを用い、 Acm基は Fujiiらの方法 （J. Chemical Soc. Chem. Commun . , No. 5， 283 ( 1989) ) に準じ脱 保護を行い、 「配列番号 5」 の粗サーファクタン トペプチ ド Dを得た。 実施例 2と同様な方法で精製し、 純粋なサ一ファクタン トペプチ ド Dを 調製した。
FABMS (M + Hつ ； 2211. 3 (分子量の計算値 ； 2209. 9 ) 〔ァ ミ ノ酸組成分析〕
参考例 1及び参考例 2で得たサーファクタントぺプチドを 5% (v/v) フエノールを含む 12規定塩酸一 TFA 〔2 ： 1 ( V/V) 〕 で、 真空下、 150°Cにて 1、 2、 4、 6、 12、 24、 48及び 72時間酸加水分解し、 酸 を除いた後に、 加水分解生成物を島津ァミ ノ酸自動分析システム （LC - 9A ) により分析した。 1〜 72時間加水分解において、 より高い回収を 示したアミ ノ酸値を採用し、 ァミ ノ酸組成値を算出したところ、 計算値 とほぼ一致する値を示した。
〔参考例 3〕
1， 2— ジノ ノレミ トイルグリセロー （ 3 ) —ホスホコ リ ン （21 Omg ) 、 1 一ノ ノレ ミ トイノレ一 2—ォレオイル一 sn—グリ セロー （ 3 ) —ホスホ一 L—セリ ン （ 90. Omg) 及びパルミチン酸 （ 33. Omg ) をクロロホ ルムーメ タノ ール混合液 〔4 ： 1 (VZV) 〕 ( 100ml ) に溶解し、 配 列番号 4のサーファクタントペプチド C (11· Omg) を TFA (0. 5ml ) に溶解した。 これらの溶液を混合し、 減圧乾固した。 得られた残留物を 45°Cで 25分間かけて水—エタノール混合液 〔9 : 1 (V/V) 〕 (110ml) に懸濁した。 この懸濁液を一 55°Cで凍結させて真空度 100〜 120 Hg で 28時間乾燥し、 白色粉末の肺サーファクタン トを 348. 7mg得た。
この粉末中にはェタノールの残存は認められず、 サーファクタン トの 総重量に対する各成分の含量は、 1, 2 -ジパルミ トイルグリセロー （3) 一ホスホコリ ンは 60. 2 % ( W/ W) 、 1—パルミ トイルー 2—才レオ ィル - sn—グリセロー （3) —ホスホー Lーセリ ンは 25. 8 % ( WZ W) 、 及びパルミチン酸は 9. 5 % (W/W) 、 サ一ファクタン トぺプ チ ド Cは 3. 2 % ( W / W ) 及び水 1. 3 % ( W / W ) であった。 この肺サーファクタ ン 卜の表面活性及び肺胞腔容量維持作用を W093 21225号公報記述の方法により測定した結果を次表に示す。 肺サーファクタン 卜の表面活性及び肺胞腔容量維持作用
Figure imgf000011_0001
産業上の利用可能性
上述のように本発明べプチ ド誘導体によれば、 一般溶媒に対する溶解 性が高いペプチ ドを容易にかつ大量に製造することができる。 該サーフ ァクタン トべプチドと脂質混合物から調製される肺サーファクタン トは、 懸濁性が良好であり、 強力な表面活性作用を示したので呼吸窮迫症候群 の治療剤として有用である。
1
11 配 列 表 配列番号 ： 1
配列の長さ ： 35
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Phe Gly lie Pro Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu lie Val 1 5 10 15
Val Val Val Val Val Leu He Val Val Val lie Val Gly Ala Leu Leu
20 25 30
Met Gly Leu
35
配列番号 ： 2
配列の長さ ： 34
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Leu lie Pro Cys Cys Pro Val Asn lie Lys Arg Leu Leu lie Val Val
1 5 10 15
Val Val Val Val Leu Leu Val Val Val lie Val Gly Ala Leu Leu Met
20 25 30
Gly Leu 配列番号 ： 3
配列の長さ ： 35
配列の型 ： ア ミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Leu Arg lie Pro Cys Cys Pro Val Asn Leu Lys Arg Leu Leu Val Val
1 5 10 15
Val Val Val Val Val Leu Val Val Val Val He Val Gly Ala Leu Leu
20 25 30
Met Gly Leu
35
配列番号： 4
配列の長さ： 22
配列の型：アミノ酸
トナ:ロシ' -:直鎖状
配列の種類^プチト'
配列
Pro Val His Leu Lys Arg Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle 1 5 10 15
Nle Nle Nle Nle Nle Nle
20
配列番号 ： 5
配列の長さ ： 19
配列の型 ： ア ミ ノ酸
トポロ ジー ： 直鎖状 配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu

Claims

請 求 の 範 囲
1. 下記特定配列で表されるぺプチ ドの N末端及び官能性側鎖が保護され たべプチ ド誘導体。
Xaa一 Pro - Val一 Xbb一 Xcc一 Lys - Arg (Xaaは存在しないか又は Cys若しくは Serを表し、 Xbbは His又は Asn を表し、 Xccは Leu又は lieを表す。）
2. 配列力、 Fmoc― Pro一 Val一 His (Trt) - Leu― Lys (Boc) ― Arg (Mtr) 、 Fmoc一 Pro一 Val一 Asn一 Leu一 Lys (Boc) - Arg (Mtr)、 Fmoc - Pro - Val一 Asn - He一 Lys (Boc) - Arg (Mtr) 又は Fmoc - Cys (Acm) - Pro - Val - His (Trt) — Leu - Lys (Boc) - Arg (Mtr) である請求項 1記載のペプチ ド誘導体。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05294996A (ja) * 1992-04-17 1993-11-09 Tokyo Tanabe Co Ltd 合成ペプチド、それを含有する肺サーファクタント及び呼吸窮迫症候群治療剤
JPH069428A (ja) * 1992-06-24 1994-01-18 Tokyo Tanabe Co Ltd 気道部ウィルス疾患の予防及び治療剤
WO1994025480A1 (fr) * 1993-04-30 1994-11-10 Tokyo Tanabe Company Limited Procede pour purifier un polypeptide hydrophobe
WO1995015980A1 (en) * 1993-12-08 1995-06-15 Tokyo Tanabe Company Limited Novel synthetic peptide, lung surfactant containing the same, and remedy for respiratory distress syndrome

Patent Citations (4)

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