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WO1996012037A1 - Procede d'analyse d'un amas cellulaire - Google Patents

Procede d'analyse d'un amas cellulaire Download PDF

Info

Publication number
WO1996012037A1
WO1996012037A1 PCT/IB1995/000873 IB9500873W WO9612037A1 WO 1996012037 A1 WO1996012037 A1 WO 1996012037A1 IB 9500873 W IB9500873 W IB 9500873W WO 9612037 A1 WO9612037 A1 WO 9612037A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
samples
cells
serum
culture
cell
Prior art date
Application number
PCT/IB1995/000873
Other languages
English (en)
Inventor
Nicolas Cong Nguyen
Original Assignee
Nicolas Cong Nguyen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nicolas Cong Nguyen filed Critical Nicolas Cong Nguyen
Publication of WO1996012037A1 publication Critical patent/WO1996012037A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/16—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor using radioactive material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/60—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances involving radioactive labelled substances

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing a cell mass obtained from a sample of human or animal origin by measuring the residual radioactivity of this cell mass after its treatment with at least one radioactive nucleotide.
  • Another known method of analysis consists in putting the sample of the cell mass in culture to release the cells and in adding enzymes.
  • the cells After appropriate treatment, the cells are placed in a dark room for five days to impress a support carrying a sensitive emulsion. Analysis of the support impressed by the radioactive cells makes it possible to determine whether the cells are cancerous.
  • the aim of the invention is to develop a rapid, effective and reliable method for determining the hormone (s) which are the most effective in halting cell division, in order to allow the infallible development of a hormone treatment suitable for benign mastopathies corresponding to a cellular hyperplasia predominantly epithelial, in particular adenomas, f ibroadenomas, polyadenastoses, or conjunctives such as ibrocystic disease.
  • the method according to the invention characterized in that the said cell mass is divided into a predetermined number n of samples of substantially equal mass, in that each of these samples is placed in an appropriate container containing a suitable culture medium, in that one introduces into each of these containers an identical amount of said radioactive nucleotide, in that one introduces into at most n-1 of said containers respecti ⁇ vely at most n-1 hormones and in that said measurement of the residual radioactivity of the samples is carried out thoroughly washed and centrifuged after a predetermined time of bringing the samples and the radioactive nucleotide into contact, by direct counting of the radioactive particles by means of a counter.
  • said predetermined time for bringing together the samples and the radioactive nucleotide is between twelve and thirty-six hours and preferably substantially equal to twenty-four hours.
  • said radioactive nucleotide is preferably tritrium-labeled thymidine, or tritiated thymidine.
  • Said n-1 specific hormones are either of the estrogen type or of the progesterone type.
  • said cell mass is removed by surgical excision or by biopsy puncture and deposited sterile in bottles containing isotonic saline serum at least during the time of transport to a laboratory.
  • this cell mass is then cut into thin strips of 0.1 to 0.2 mm thick in a Petri dish containing a solution of Earle.
  • said cell mass can be sterilized on its external zone in a substance such as 70% ethanol and transferred to a petri dish containing an Earle solution without calcium or magnesium.
  • the cells are released into the solution and this solution is preferably filtered through a gauze filter to retain the large pieces and the fibers. Then, the filtered solution is centrifuged.
  • part of the cells are stored at a temperature between - 80 ° C and - 100 ° C, and preferably at around - 90 ° C in a Me Coy 5A medium modified with:
  • medium A 100 micrograms / ml of streptomycin; thereafter called medium A.
  • part of the cells are then cultured by dissolving approximately 10 7 to 10 9 cells in the medium of Me Coy 5A modified with:
  • tritiated thymidine 100 micrograms / ml of streptomycin, or in a medium of Me Coy 5A modified with: 20% serum - from bovine fetus, 100 Units / ml of penicillin, 100 micrograms / ml of streptomycin, hereinafter called medium B, and tritiated thymidine is added at a dose of 1 to 2 microcuries per ml to constitute a culture mixture.
  • a part of said culture mixture is taken which is deposited in cell culture tubes and a part which is deposited in reference tubes.
  • the reference tubes preferably receive 0.025 ml of isotonic serum.
  • the culture tubes are advantageously placed in an incubation study for forty-eight hours at approximately +37 ° C. in a controlled atmosphere which preferably contains 95% air and 5% CO 2 .
  • the counter used to determine the number of radioactive particles is a liquid scintillation counter.
  • the method consists in determining the mitotic index and the hormone dependence of breast or prostate biopsies in tissue culture, in the presence of nucleotide markers, such as tritiated thymidine, necessary for the synthesis of DNA.
  • nucleotide markers such as tritiated thymidine
  • this method of analysis measures mitotic activity much more effectively than the measurement of hormone receptors on homogenates of tissue samples, because it better reflects the effect of hormones on the cell rather than the presence or absence of such and such a receptor on the cell membrane.
  • FIG. 1 represents a schematic view illustrating the main phases of the method and its equipment for implementation.
  • the general principle of the method comprises the following essential steps A to F.
  • Step A consists of taking a sample of a cell mass 10 which is divided into two parts 11 and 12, one of which 11 is used to carry out conventional histopathology using conventional equipment. 13 schematically represented by a microscope. The other part 12 is divided into n equal parts by weight, during step B. Each of these n equal parts is introduced into a test tube
  • a culture medium in this case physiological serum from the person or animal from which the cell mass was removed.
  • each of these test tubes is introduced with a predetermined equal amount of a radioactive nucleotide, such as for example tritium-labeled thymidine, schematically represented by a container 15.
  • a radioactive nucleotide such as for example tritium-labeled thymidine
  • step D two test tubes 16 are separated which constitute the reference tubes.
  • the other n-2 tubes called culture tubes, each receive a specific hormone Hi, H 2 , H3,. . . .
  • Stage E is a waiting stage during which the hormones act either to stimulate or to slow down cell division.
  • the duration t of this waiting is between twelve and thirty-six hours and is preferably l 'order of twenty-four hours.
  • step F the samples are centrifuged and washed and their residual radioactivity is measured using equipment 17 of the Geiger counter type or similar, for example a Packard type liquid scintillation counter with display screen 18 This counter allows direct and precise counting of radioactive particles.
  • the biopsy samples are taken either by surgical excision or by biopsy puncture. They are immediately placed in a sterile manner in vials " specially prepared for this purpose containing isotonic saline, and kept at + - + ° C during transport to the laboratory.
  • the biopsy is studied macroscopically and microscopically by a few sections after freezing to determine the degree of cellularity. Sometimes it is necessary to sterilize the external area of the sample by placing it for five minutes in ethanol at
  • EBSS Earle's solution
  • the external part and the adipose tissue are resected by dissection and separated from the healthy breast or prostate tissue and the necrotic or haemorrhagic parts.
  • examination under a binocular microscope allows the same operations to be carried out to prepare the material taken.
  • the biopsy When the biopsy is well trimmed, it is cut into small very thin strips of 0.1 to 0.2 mm thick in a new petri dish under an EBSS bath and the pieces are cut and not scraped with the blade. scalpel while being held stationary with dissecting forceps. After each cut, cells are released into the medium which will be poured through a gauze filter to retain large lumps and any fibers.
  • the filtered medium is centrifuged at 500G at + ° C for ten minutes. Part of the cells of the biopsy can be stored for further studies at -90 ° C in a medium of Me Coy 5A modified with:
  • the biopsy cell filtrate is studied by counting figurative elements to determine its cell content, according to the same technique as that of blood studies.
  • 11 must be from 10 7 to 10 9 cells to be diluted in 25 ml of a modified Me Coy medium A or of medium B, to which tritiated thymidine H-thymidine is added at a dose of 1 to 2 microcuries per ml, ie 25 to 50 microcuries in all. Then, ml of aliquot of this suspension are put into 150 x 16 mm Falcon tubes for tissue culture, at the rate of four tubes per hormone or per substance studied.
  • the reference tubes receive 0.025 ml of isotonic saline.
  • All the culture tubes are placed in the incubation oven for forty-eight hours at + 37 ° C. in an atmosphere of 95% air and 5% CO 2 .
  • the cells are centrifuged at 500 G for ten minutes at + A ° C, and washed three times with the washing solution.
  • the small ball of cells obtained is then frozen and thawed twice to break the membranes, then 5 ml of trichloroacetic acid are added to it.
  • the tubes are again centrifuged at 750G for fifteen minutes at + 4. ° C.
  • the small cell ball is treated with 1.0 ml of hyamine hydroxide (10X) for twelve hours at +37 ° C to digest the membranes and release the cytoplasm and nuclei.
  • the culture tubes are transferred to the counting tubes by adding 1.5 ml of methanol and then adding 10 ml of modified Bray solution.
  • the tubes are then counted in a liquid scintillation counter of the Packard type.
  • the results of the counting of each group of tubes are expressed in disintegration by minutes, or strokes / min.
  • the incorporation rate of tritiated thymidine in the cells of each group tested is expressed as a percentage more or less compared to the average of the control group, or reference group, respective to each series. A difference where p is greater than or equal to 0.05 is required to be significant.
  • N 9 19 which is histomologically a carcinoma of the breast, shows an increase under estradiol of + 41% and a decrease under testone of -33% and -23% under progesterone, and responds very favorably with androgen treatment.
  • seven cases of benign estradiol sensitive breast tumor regressed completely after treatment with progesterone in the form of ointment for local applications.
  • This process has the advantage of allowing very rapid and perfectly exact and precise detection of the tests carried out.

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Abstract

Ce procédé d'analyse d'un amas cellulaire issu d'un prélèvement d'origine humaine ou animale consiste à déterminer l'index mitotique de l'hormonodépendance de biopsies mammaires ou prostatiques en culture cellulaire. A cet effet, on divise l'amas cellulaire en n échantillons de masse égale, on dépose ces échantillons dans des récipients contenant un milieu de culture adéquat, on introduit dans n-1 de ces récipients n-1 hormones spécifiques et une quantité déterminée d'un nucléotide radioactif. On effectue ensuite une mesure de la radioactivité résiduelle pour chaque échantillon par comptage direct des particules radioactives au moyen d'un compteur.

Description

O 96/12037 PCMB95/00873
PROCEDE D'ANALYSE D'UN AMAS CELLULAIRE
La présente invention concerne un procédé d'analyse d'un amas cellulaire issu d'un prélèvement d'origine humaine ou animale par la mesure de la radioactivité résiduelle de cet amas cellulaire après son traitement au moyen d'au moins un nucleotide radioactif .
Une des applications d'une analyse de ce type est la détermination d' un index d'hormonodépendance de biopsies mammaires ou prosta¬ tiques .
A la découverte d'un nodule mammaire, perçu à la palpation ou au cours d'une mammographie systématique , chez une femme de plus de quarante-cinq ans , la biopsie s'impose généralement en fin de compte car l' histopathologie seule permet d'affirmer ou non le diagnostic de cancer du sein . C'est le cas pour une femme sur onze dans ce groupe d'âge. Mais pour plus de trois femmes sur dix , ce sera heureusement une mastopathie bénigne.
Alors , se pose le problème de soigner ou non ces patientes . P. Mauvais-Jarvis et ses collaborateurs ont expliqué ce dilemme, dans "Hormones et Seins", P. Scali et R. Villet, Masson Ed. 1991 , sur le "Traitement hormonal des mastopathies bénignes".
Selon ce document , on peut admettre que seules deux méthodes permettent la guérison des mastopathies bénignes en même temps qu'elles évitent la cancérisation .
D'une part la castration qui supprime la production d'hormones prolif ératives , d'autre part, la mastectomie qui supprime les récep¬ teurs des hormones prolif ératives . Cette schématisation quelque peu simpliste a au moins l'avantage d'avancer les bases physiopatho- logiques du traitement hormonal qui reposent en effet sur deux sortes d'actions , soit l'inhibition de la sécrétion des gonadotrophines qui aboutit à des degrés divers à une castration biochimique, soit l' utilisation d' antioestrogènes stéroïdiens ou non stéroïdiens empêchant les hormones de se lier à leur récepteur nucléaire au niveau mammaire .
Sur le plan pratique, force est de reconnaître les difficultés rencon¬ trées dès que l'on aborde en termes concrets le traitement médical des mastopathies bénignes .
On dispose actuellement de certaines méthodes qui permettent de recueillir des informations sur l'index mitotique observé avant et après un traitement hormonal donné.
Ces méthodes d'analyses sont pratiquées à partir d'une biopsie et consistent à effectuer un prélèvement d'un amas cellulaire , par exemple d'origine mammaire ou prostatique, que l'on écrase pour faire une pâte en vue de dissocier les récepteurs. On sépare cette pâte en deux parties dont l'une est mise en présence d'oestrogènes radioactifs et l' autre en présence de progestérones radioactives ."
Une autre méthode d'analyse connue consiste à mettre le prélèvement de l'amas cellulaire en culture pour libérer les cellules et à rajouter des enzymes .
L'article "Cancer biology for individualized therapy : Corrélation of growth fraction index in native-state histoculture with tumor grade and stage" publié dans la revue "Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA" décrit une méthode d'analyse de cellules constituée par un procédé d' autoradiographie. Après trois à onze jours , une culture cellulaire issue de tissus prélevés par biopsie est soumise à de la thymidine tritriée destinée à marquer les cellules .
Après un traitement approprié, les cellules sont placées en chambre noire pendant cinq jours pour impressionner un support portant une émulsion sensible. L'analyse du support impressionné par les cellules radioactives permet de déterminer si les cellules sont cancéreuses .
Ce processus est long et nécessite une mise en oeuvre compliquée, ce qui le rend difficilement utilisable en pratique, notamment dans le cadre d'une campagne de dépistage précoce.
D'autres méthodes d'analyse sont décrites par les publications WO 92/19722 au nom de THE SALK INSTITUTE FOR BIOLOG1CAL STUDIES et WO 92/19722 au nom de MORGAN Lee Roy. Toutefois aucune de ces méthodes ne fournit un moyen rapide et efficace permettant de choisir avec sûreté le traitement hormonal le mieux approprié pour résorber des tumeurs cancéreuses en permettant une analyse rapide et efficace des effets des résultats obtenus sur des tissus prélevés par biopsie , suite à divers traitements hormonaux.
Ces méthodes couramment pratiquées actuellement présentent plusieurs inconvénients : elles sont longues et ne sont pas fiables parce qu'elles ne permettent pas de déterminer d'une manière infail- lible quelles sont les hormones favorables à la division cellulaire, donc à la prolifération incontrôlée des cellules , notamment à la forma¬ tion de mastoses dans les seins, et quelles sont les hormones défavo¬ rables à cette division cellulaire.
Le but de l'invention est de développer une méthode rapide , efficace et fiable pour déterminer la ou les hormones qui sont les plus effi¬ caces pour enrayer la division cellulaire , afin de permettre la mise au point infaillible d'un traitement hormonal approprié à des mastopathies bénignes correspondant à une hyperplasie cellulaire à prédominance épithéliale, notamment les adénomes , les f ibroadénomes , les polyadénomastoses , ou conjonctives telles que la maladie f ibrokystique .
Ce but est atteint par le procédé selon l'invention caractérisé en ce que l'on divise ledit amas cellulaire en un nombre prédéterminé n d'échantillons de masse sensiblement égale, en ce que l' on dépose chacun de ces échantillons dans un récipient approprié contenant un milieu de culture adéquat , en ce que l'on introduit dans chacun de ces récipients une quantité identique dudit nucleotide radioactif , en ce que l'on introduit dans au plus n-1 desdits récipients respecti¬ vement au plus n-1 hormones spécifiques , et en ce que l'on effectue ladite mesure de la radioactivité résiduelle des échantillons préala- blement lavés et centrifugés après un temps prédéterminé de mise en présence des échantillons et du nucleotide radioactif , par comptage direct des particules radioactives au moyen d' un compteur.
L'avantage du comptage direct est qu'il est rapide , précis et ne se prête à aucune interprétation erronée.
Selon un mode de réalisation préféré , ledit temps prédéterminé de mise en présence des échantillons et du nucleotide radioactif est compris entre douze et trente-six heures et de préférence sensiblement égal à vingt-quatre heures .
En outre, ledit nucleotide radioactif est de préférence de la thymidine marquée au tritrium, ou thymidine tritiée.
Lesdites n-1 hormones spécifiques sont soit du type oestrogène ou soit du type progestérone.
D'une manière préférée , ledit amas cellulaire est prélevé par exérèse chirurgicale ou par ponction biopsique et déposé stérilement dans des flacons contenant du sérum salé isotonique au moins pendant le temps du transport dans un laboratoire.
De façon avantageuse, cet amas cellulaire est ensuite découpé en fines lamelles de 0, 1 à 0, 2 mm d'épaisseur dans un disque de Pétri contenant une solution d'Earle.
Suivant les cas , avant son découpage, ledit amas cellulaire peut être stérilisé sur sa zone externe dans une substance telle que l'éthanol à 70% et transféré dans un disque de Pétri contenant une solution d'Earle sans calcium ni magnésium.
Après chaque coupe les cellules sont libérées dans la solution et l'on filtre de préférence cette solution à travers un filtre de gaze pour retenir les gros morceaux et les fibres. Ensuite, l'on centrifuge la solution filtrée. D'une manière préférée, l'on conserve une partie des cellules à une température comprise entre - 80°C et - 100°C , et de préférence à environ - 90° C dans un milieu de Me Coy 5A modifié avec :
20% de sérum de la patiente (sein) ou du patient (prostate) ,
100 Unités/ml de pénicilline,
100 microgrammes/ml de streptomycine; appelé par la suite le milieu A.
Dans ce contexte, l'on met ensuite en culture une partie des cellules en délayant environ 107 à 109 des cellules en milieu de Me Coy 5A modifié avec :
20% de sérum de la patiente (sein) ou du patient (prostate) , 100 Unités/ml de pénicilline,
100 microgrammes/ml de streptomycine, ou dans un milieu de Me Coy 5A modifié avec : 20% de sérum—de foetus de bovin, 100 Unités/ml de pénicilline , 100 microgrammes/ml de streptomycine, appelé par la suite le milieu B , et on ajoute de la thymidine tritiée à la dose de 1 à 2 microcuries par ml pour constituer un mélange de culture.
De façon préférée, l'on prélève une partie dudit mélange de culture que l'on dépose dans des tubes pour culture cellulaire et une partie que l'on dépose dans des tubes de référence .
Les tubes de référence reçoivent de préférence 0,025 ml de sérum isotonique.
Les tubes de culture sont avantageusement placés en étude d'incubation pendant quarante-huit heures à environ +37 °C dans une atmosphère contrôlée qui contient de préférence 95% d'air et 5% de CO2.
Dans la forme de réalisation avantageuse du procédé, le compteur utilisé pour déterminer le nombre de particules radioactives est un compteur à scintillation liquide.
D' une manière générale , le procédé consiste à déterminer l' index mitotique et l'hormonodépendance des biopsies mammaires ou prostatiques en culture tissulaire , en présence de marqueurs nucléotidiques , tels que la thymidine tritiée, nécessaires à la synthèse de l'ADN .
Dans la pratique , ce procédé d' analyse mesure l'activité mitotique beaucoup plus efficacement que le dosage des récepteurs hormonaux sur les homogénéisats de prélèvements tissulaires , car il reflète mieux l' effet des hormones sur la cellule plutôt que la présence ou l'absence de tel ou tel récepteur sur la membrane cellulaire .
Il permet de déterminer avec précision le taux d'incorporation de la thymidine tritiée dans la synthèse de l' ADN des échantillons tissu¬ laires étudiés , cette incorporation étant plus ou moins élevée par rapport à une culture de référence en présence d' hormones spéci- fiques . Il est ainsi possible de déterminer quelle est l' hormone dont la présence favorise ou inhibe la multiplication des cellules , ce qui permet de recommander le traitement qui pourrait résorber la lésion surtout quand la réponse de l'anatomie pathologique est négative , c' est-à-dire lorsque la lésion est non cancéreuse .
L'invention sera mieux comprise en référence au dessin annexé dans lequel :
la figure 1 représente une vue schématique illustrant les phases principales du procédé et son équipement de mise en oeuvre .
En référence à la figure 1 , le principe général du procédé comporte les étapes essentielles A à F suivantes .
L' étape A consiste à effectuer un prélèvement d' un amas cellulaire 10 qui est divisé en deux parties 11 et 12 dont l' une 11 sert à effectuer une histopathologie classique au moyen d' un équipement conventionnel 13 représenté schématiquement par un microscope. L'autre partie 12 est divisée en n parts égales en poids , au cours de l'étape B . Chacune de ces n parts égales est introduite dans un tube à essais
14 contenant un milieu de culture , en l'occurrence du sérum physio- logique de la personne ou de l'animal sur lequel l'amas cellulaire a été prélevé.
Au cours de l'étape C , on introduit dans chacun de ces tubes à essais une quantité prédéterminée égale d'un nucleotide radioactif , tel que par exemple de la thymidine marquée au tritium, schématiquement représentée par un récipient 15.
Au cours de l'étape D , on sépare deux tubes à essais 16 qui consti¬ tuent les tubes de référence . Les n-2 autres tubes , dits tubes de culture, reçoivent chacun une hormone spécifique Hi , H2, H3, . . . .
Hn-2 qui est introduite dans le tube à essais .
L' étape E est une étape "d'attente au cours de laquelle les hormones agissent soit pour stimuler , soit pour ralentir la division cellulaire . La durée t de cette attente est comprise entre douze et trente-six heures et est de préférence de l'ordre de vingt-quatre heures .
Au cours de l'étape F , les échantillons sont centrifugés et lavés et leur radioactivité résiduelle est mesurée au moyen d'un équipement 17 du type compteur Geiger ou similaire, par exemple un compteur à scintillation liquide du type Packard avec écran d'affichage 18. Ce compteur permet un comptage direct et précis des particules radioactives .
Des essais en laboratoire ont été effectués et sont décrits en détail ci-dessous .
Les échantillons biopsiques sont prélevés soit par exérèse chirur¬ gicale, soit par ponction biopsique. Ils sont immédiatement déposés stérilement dans des flacons "spécialement préparés à cet effet conte¬ nant du sérum salé isotonique , et conservés à + -+°C pendant le transport jusqu'au laboratoire. La biopsie est étudiée macroscopiquement et microscopiquement par quelques coupes après congélation pour en déterminer le degré de cellularité. Parfois , il est nécessaire de stériliser la zone externe de l'échantillon en le plaçant pendant cinq minutes dans de l' ethanol à
70% avant d'être transféré dans un disque de Pétri contenant de la solution d'Earle (EBSS) sans calcium ou magnésium.
Dans le cas de biopsies chirurgicales relativement substantielles , la partie extérieure et le tissu adipeux sont réséqués par dissection et séparés du tissu mammaire ou prostatique sain et des parties nécro¬ sées ou hémorragiques . Pour les ponctions biopsiques , l'examen au microscope binoculaire permet d'effectuer les mêmes opérations de préparation du matériel prélevé.
Toutes les dissections sont effectuées sous couvert d' un bain d'EBSS .
Lorsque la biopsie est bien parée, elle est découpée en petites lamelles très fines de 0, 1 à 0,2 mm d'épaisseur dans un nouveau disque de Pétri sous bain d'EBSS et les pièces sont taillées et non grattées avec la lame de bistouri tout en étant maintenues immobiles avec une pince de dissection. Après chaque coupe , des cellules sont libérées dans le milieu qui sera versé à travers un filtre de gaze pour retenir les gros morceaux et les fibres éventuels .
Le milieu filtré est centrifugé à 500G à + °C pendant dix minutes. Une partie des cellules de la biopsie peut être conservée pour études ultérieures à - 90° C dans un milieu de Me Coy 5A modifié avec :
20% de sérum de la patiente (sein) ou du patient (prostate) ,
100 Unités/ml de pénicilline, 100 microgrammes/ml de streptomycine; et l'autre partie peut être mise en culture immédiatement.
Le filtrat de cellules biopsiques est étudié en numération d'éléments figurés pour déterminer sa teneur en cellules , selon la même tech¬ nique que celle des études de sang . 11 doit y avoir de 107 à 109 cellules à délayer dans 25 ml d'un milieu Me Coy modifié A ou d'un milieu B , auquel on additionne de la thymidine tritiée H-thymidine à la dose de 1 à 2 microcuries par ml, soit 25 à 50 microcuries en tout. Ensuite, ml d'aliquote de cette suspension sont mis dans des tubes de Falcon de 150 x 16 mm pour culture tissulaire, à raison de quatre tubes par hormone ou par substance étudiée.
Les tubes de référence reçoivent 0,025 ml de sérum salé isotonique.
Tous les tubes de culture sont placés dans l'étuve à incubation pendant quarante-huit heures à +37°C dans une atmosphère de 95% d'air et 5% de CO2.
A la fin de la période d'incubation, les cellules sont centrifugées à 500G pendant dix minutes à + A° C , et lavées trois fois avec la solution de lavage.
La petite boule de cellules obtenue est ensuite congelée et dégelée deux fois pour rompre les membranes , puis 5 ml d'acide trichloracétique y sont ajoutés .
Après deux heures à +4°C, les tubes sont de nouveau centrifugés à 750G pendant quinze minutes à +4.°C. La petite boule de cellules est traitée avec 1 ,0 ml d'hydroxyde d'hyamine (10X) pendant douze heures à +37 °C pour digérer les membranes et libérer le cytoplasme et les noyaux .
Le transfert des tubes de culture aux tubes de comptage se fait par addition de 1 ,5 ml de méthanol puis addition de 10 ml de solution de Bray modifiée.
Les tubes sont ensuite comptés dans un compteur à scintillation liquide du type Packard.
Après correction pour ajustement (quelching) , les résultats du comptage de chaque groupe de tubes sont exprimés en désintégration par minutes , ou coups/min. Le taux d'incorporation de la thymidine tritiée dans les cellules de chaque groupe testé est exprimé en pourcentage en plus ou en moins par rapport à la moyenne du groupe de contrôle, ou de référence , respectif de chaque série. Il faut une différence où p est supérieur ou égal à 0,05 pour être significatif .
Les résultats issus de ces essais sont donnés en détail ci-dessous.
Sur vingt biopsies chirurgicales , les résultats obtenus sont les suivants : Augmentation du taux d'incorporation de 3H-thymidine:
4 cas (N9 5 , 7 , 8, 19) en présence d' estradiol, 2 cas ( N9 5, 7) en présence de testostérone; Diminution du taux d'incorporation de 3H-thymidine:
7 cas ( N9 4, 6, 10, 14, 15, 17, 19) en présence de testostérone,
5 cas ( N9 10, 14, 15, 17 , 19) en présence de progestérone, 2 cas (N9 14 , 17) en présence de contisol,
2 cas ( N9 10, 14) en présence d'estradiol; Réponse au traitement :
- le cas N9 19, qui est histomologiquement un carcinome du sein, montre une augmentation sous estradiol de +41% et une diminution sous testérone de -33% et de -23% sous progestérone, et répond très favorablement sous traitement par androgène. sept cas de tumeur bénigne du sein sensible à l' estradiol ont régressé complètement après traitement par progestérone sous forme de pommade à applications locales .
Ce procédé a l'avantage de permettre une détection très rapide et parfaitement exacte et précise des tests réalisés .

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé d'analyse d'un amas cellulaire issu d'un prélèvement d'origine humaine ou animale par la mesure de la radioactivité rési- duelle de cet amas cellulaire après son traitement au moyen d'au moins un nucleotide radioactif , caractérisé en ce que l'on divise ledit amas cellulaire en un nombre prédéterminé n d'échantillons de masse sensiblement égale, en ce que l'on dépose chacun de ces échantillons dans un récipient approprié contenant un milieu de culture adéquat, en ce que l'on introduit dans chacun de ces récipients une quantité identique dudit nucleotide radioactif , en ce que l'on introduit dans au plus n-1 desdits récipients respectivement au plus n-1 hormones spécifiques , et en ce que l'on effectue ladite mesure de la radioac¬ tivité résiduelle des échantillons préalablement lavés et centrifugés après un temps prédéterminé de mise en présence des échantillons et du nucleotide radioactif , par comptage direct des particules radioactives au moyen d'un compteur.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ledit temps prédéterminé de mise en présence des échantillons et du nucleotide radioactif est compris entre douze et trente-six heures et de préférence sensiblement égal à vingt-quatre heures .
3. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ledit nucleotide radioactif est de la thymidine marquée au tritrium, ou thymidine tritiée .
4. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que lesdites n-1 hormones spécifiques sont du type oestrogène ou progestérone .
5. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ledit amas cellulaire est prélevé par exérèse chirurgicale ou par ponction biopsique et déposé stérilement dans des flacons contenant du sérum salé isotonique au moins pendant le temps du transport dans un laboratoire .
6. Procédé selon la revendication 5 , caractérisé en ce que ledit amas cellulaire est découpé en fines lamelles de 0, 1 à 0, 2 mm d'épaisseur dans un disque de Pétri contenant une solution d'Earle.
7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'avant son découpage, ledit amas cellulaire est stérilisé sur sa zone externe par traitement dans une substance telle que l'ethanol à 70% et transféré dans un disque de Pétri contenant une solution d'Earle sans calcium ni magnésium.
8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'après chaque coupe les cellules sont libérées dans la solution et en ce que l'on filtre cette solution à travers un filtre de gaze pour retenir les gros morceaux et les fibres .
9« Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on centrifuge la solution filtrée.
10. Procédé selon la revendication 8 , caractérisé en ce que l'on conserve une partie des cellules à une température comprise entre - 80° C et - 100° C , et de préférence à environ - 90 °C dans un milieu de Me Coy 5A modifié avec :
20% de sérum de la patiente (sein) ou du patient (prostate) ,
100 Unités/ml de pénicilline, 100 microgrammes/ml de streptomycine.
11. Procédé selon les revendications 3 et 8, caractérisé en ce que l'on met en culture une partie des cellules en délayant environ 107 à 109 des cellules en milieu de Me Coy 5A modifié avec : 20% de sérum de la patiente (sein) ou du patient
(prostate) ,
100 Unités/ml de pénicilline, 100 microgrammes/ml de streptomycine , ou dans un milieu de Me Coy 5A modifié avec : 20% de sérum de foetus de bovin,
100 Unités/ml de pénicilline, 100 microgramme s /ml de streptomycine, et on ajoute de la thymidine tritiée à la dose de 1 à 2 microcuries par ml pour constituer un mélange de culture.
12. Procédé selon la revendication 11 , caractérisé en ce que l'on prélève une partie dudit mélange de culture que l'on dépose dans des tubes pour culture cellulaire et une partie que l'on dépose dans des tubes de référence.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les tubes de référence reçoivent 0,025 ml de sérum isotonique.
14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les tubes de culture sont placés en étude d'incubation pendant quarante-huit heures à environ 37 °C dans une atmosphère contrôlée.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite atmosphère contrôlée contient 95% d'air et 5% de C02.
16. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le compteur est un compteur à scintillation liquide.
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R. A. VESCIO ET AL.: "Cancer biology for individualized therapy: Correlation of the growth fraction index in native-state histoculture with tumor grade and stage.", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 87, no. 2, WASHINGTON US, pages 691 - 695 *

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