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WO1996006160A1 - Procede de culture de cellules aviaires et lignee cellulaire ainsi obtenue - Google Patents

Procede de culture de cellules aviaires et lignee cellulaire ainsi obtenue Download PDF

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Publication number
WO1996006160A1
WO1996006160A1 PCT/JP1995/001681 JP9501681W WO9606160A1 WO 1996006160 A1 WO1996006160 A1 WO 1996006160A1 JP 9501681 W JP9501681 W JP 9501681W WO 9606160 A1 WO9606160 A1 WO 9606160A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
culture
cell
embryo
derived
Prior art date
Application number
PCT/JP1995/001681
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takashi Kuwana
Koichiro Hashimoto
Akira Nakanishi
Original Assignee
Meiji Milk Products Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meiji Milk Products Co., Ltd. filed Critical Meiji Milk Products Co., Ltd.
Priority to JP50794696A priority Critical patent/JP4267689B2/ja
Priority to AU34601/95A priority patent/AU3460195A/en
Priority to DE69525456T priority patent/DE69525456T2/de
Priority to US08/793,770 priority patent/US6180400B1/en
Priority to EP95929221A priority patent/EP0779359B1/en
Publication of WO1996006160A1 publication Critical patent/WO1996006160A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0604—Whole embryos; Culture medium therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/0611—Primordial germ cells, e.g. embryonic germ cells [EG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing bird-derived cells and a bird-derived cell line obtained by the culturing method.
  • useful proteins such as pharmaceuticals
  • transgenic livestock allows for a higher degree of sugar chain modification required for expressing the activity as a pharmaceutical, as compared to large-scale culture using bacterial yeast.
  • the production of useful proteins is expected to form a new industrial field in the future, as it can be produced at extremely low cost compared to the production by animal cell mass culture facilities. Since these useful proteins are considered to be foreign substances and often harmful to animals that originally produce them, attempts have been made to secrete the product outside the body in order to avoid this. It proposes two feasible production systems.
  • transgenes are introduced into cells such as the following, which are considered to be powerful tools for producing transgenic birds in the future. There are ways to get birds.
  • primordial germ cells primordial germ cells
  • germ cells goniura; generic term for oocyte (oogonium) and spermatogonia (spermatogonium)] a group of cells present
  • c embryonic leaf cell-derived ES cells a cell line established by in vitro (embryonic stem cell) or primordial germ cell-derived EG cell (embryonic germ cell) corresponds to this
  • ES cells and EG cells have the property of proliferating in culture dishes for a long period of time while maintaining their undifferentiated state.Therefore, after introducing genes in culture and selecting specific cell clones, blastoderm It is possible to obtain ES cell or EG cell-derived individuals by producing and crossing germ-line chimeras by chimera production technology. ES cells have already been established in mice that have the ability to form germline chimeras (A. Bradley et al .: Nature, 309, 255, 1984), but in birds, morphologically, ES cells Although there is a report that a suitable cell line has been established (W093 / 23528), the ability to form chimeras has not been confirmed.
  • Primordial germ cells and germ cells are actively grown in cells that are the source of spermatozoa and eggs in the future. Therefore, once culture conditions for these cells are established, they can be used in culture in the same manner as ES cells. Gene manipulation is possible, and it has already been described in chickens that a method for obtaining chickens derived from transplanted primordial germ cells by embryo transfer of primordial germ cells [Takashi Kuwana, Experimental Medicine,
  • EG cells were first established in mice by Matsui and colleagues.Matsui and colleagues used mouse primordial germ cells as SCF (stem cell factor), plus TLIF (leukemia inhibitory factor) and bFGF (basic In the presence of fibroblast growth actor), STO cells [Kawase et al., Experimental Medicine, Vol. 10, No. 13 (extra number), 1575-1580, 1992] are cultured as a single feeder cell, and are morphologically ES-like. An EG cell line derived from primordial germ cells capable of forming a colony and proliferating to form a chimera was established (liatsui, Y., Zsebo, K. & Hogan, BLM: Cell, 70: 841-847, 1992). ). By applying this method to avian primordial germ cells, it may be possible to establish avian EG cell lines.
  • These cells are cells existing in the avian embryo or cells established therefrom. In order to enable cell manipulation and gene manipulation such as isolation, establishment, and gene transfer of these cells, these cells must be used. It is necessary to establish a culture method that can stably proliferate and maintain cells derived from birds including cells for a long period of time.
  • An object of the present invention is to provide a culture method capable of stably subculturing avian-derived cells, particularly cells of poultry such as chickens and quails, for a long period of time. It is another object of the present invention to provide a bird-derived cell line obtained by such a culture method. Disclosure of the invention
  • Adjusting the pH of the culture solution to the optimal range in animal cell culture is one of the important requirements for successful culture, and for that purpose, the pH value should be as close as possible to the pH of the environment surrounding cells in vivo. May need to be set to In general, animal cells can grow well between pH 6.8 and 7.6, but the optimal pH is in the range of 7.2 to 7.4, and when the pH is below 6.6 or above 7.8. It is said to die within 24 hours.
  • the inventors of the present invention have attempted to establish a long-term subculture of embryo cells derived from Nakatsuta birds by anyone who has succeeded so far. focusing on pH value, the pH of the culture solution was obtained idea set to the P H. However, the measurement of blood pH in early embryos has not been performed until now because of the difficulty in collecting blood and the small amount of blood collected, the amount of blood required for the measurement could not be secured.
  • the present inventors measured the pH of blood after the developmental stage, at which blood collection of about 2; zl per embryo was actually possible, over time.
  • the blood pH after the developmental stage had shifted to a value of pH 7.8 or higher, at which animal cells would die within 24 hours.
  • the pH of the egg white surrounding the yolk and egg white immediately below the embryo was referenced for reference. was also measured over time.
  • the present inventors concluded that the pH indicated by the blood is the most important for the overall pH environment in which embryo cells are placed, and that this pH value is appropriate for the growth of embryo cells. Based on the belief that the pH value is likely to be high, set the pH of the culture to pH 7.8 or higher. When we tried to culture avian embryo cells, we found that they could be passaged for a long time. Further, when the pH was applied to avian late embryo, chick, and adult cells, they found that a similar long-term subculture was possible, and completed the present invention.
  • the present invention provides a bird-derived cell culture method characterized by setting the pH of a culture solution to pH 7.8 or more in a bird-derived cell culture, and a cell line of a bird-derived cell obtained by the culture method. Is provided.
  • the present inventors selected chicken and quail embryos, which are the most popular poultry, raised around the world, as the representative examples of birds, and The egg white and yolk surrounding the developing embryo and the pH of the embryo's blood were measured over time.
  • the present inventors tried cell culture of avian-derived cells by setting the pH of the culture solution to a value of 7.8 to 8.2.
  • a source for collecting bird embryos fertilized eggs of chicks or quail after ovulation are selected, and the fertilized eggs are kept warm in a crucible to promote their development.
  • the embryos were taken out of the shell and subjected to in vitro culture, subculture of embryonic cells at all developmental stages was successful.
  • the same culture method as described above was used to culture the cells of the heart and gonads of the quail chicks immediately after transformation, and subculture was also possible. At present, these cells are still being stably subcultured (passaged for more than 18 months).
  • primordial germ cells in the developing stage which have not reached the gonad primordia, are isolated from embryonic blood and cultured by the above-mentioned culture method, thereby significantly improving the in vitro survival rate. I was able to. Therefore, it has become possible to perform in vitro gene manipulation on avian primordial germ cells, which has been impossible until now, and the possibility of generation in individuals is increased.
  • non-avian cell line that has already been established, for example, as a cell line ST0 derived from mouse fetal fibroblasts, as a human fibroblast cell line, or as a primary cultured cell, for example, as a human aortic endothelium
  • these cells could also be passaged.
  • the pH of the culture solution is usually set to 7.8 or more, which is considered to kill animal cells within 24 hours. It is characterized by:
  • Conditions other than pH such as temperature, osmotic pressure, nutrient source, culture medium, etc. necessary for culture are Some modifications may be made according to the conditions used for avian embryonic cells or mammalian cell culture, and modifications to these may be made by a person of ordinary skill in the art in a certain order based on the statements in this specification. Is within the range that can be normally carried out, and does not limit the scope of the present invention at all.
  • the birds referred to in the present invention include poultry and other birds in general, and the poultry includes, for example, chickens, quails, ducks, ducks, geese, ostriches, turkeys, guinea fowls and pheasants.
  • cell line as used in the present invention does not only mean a cell line, but also includes an established cell line, a cell strain, and a clone.
  • the pH value of the culture solution is set to pH 7.8 or higher, and the present invention is not limited to other conditions. Specific examples of the present invention will be described in detail below. You.
  • the culture medium examples include Eagle et al.'S minimum essential medium (Eagle's rainimun essential medium ⁇ MEM), which was developed using the growth of mouse L cells and human HeLa cells as indicators, and fibroblasts derived from chicken embryo hearts. 5 to 10 ⁇ fetal serum or chicken serum, 1 to 4 g of glucose as an osmotic agent or energy source, 10 to 10 g for pH stabilization 30raM HEPES ( ⁇ -2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid) or EPPS ( ⁇ -2-hydroxyethylpip erazine- ⁇ '-3-propanesulfonic acid),-0.05 to 0.lmli as SH donor Use 2-merca ptoethanol or the like.
  • Eagle et al.'S minimum essential medium Eagle's rainimun essential medium ⁇ MEM
  • the culture is performed in a conventional gas phase, it added to a 2 ⁇ 4g eight of NaHC 0 3 to the culture medium to adjust the p H in Na 2 C0 3. Since the quality of the serum to be added greatly affects the cell growth ability, a lot check should be performed on the cells used.
  • Ca ++ is said to be involved in the regulation of cell growth or adhesion, and it is better to add about lrali of Ca ++ .
  • the cultivation temperature varies depending on the species, and a suitable temperature may be selected for each species. In the case of avian embryo cells, it is usually in the range of 37 to 38.5.
  • Subculture is usually performed as follows. When the first planted cells divide and proliferate and occupy approximately 1/3 to 2/3 of the bottom of the culture vessel, the medium containing 0.05 to 0.13 ⁇ 4 tribusin and 0.023 ⁇ 4 EDTA in PBS ( -) (Balanced salt solution excluding Ca + + and Mg + + ) 37, and disperse the cells by treating at room temperature for 3 to 5 minutes. Collect the cells by centrifugation, disperse the cells in a new culture medium, count the number of cells, transfer the cell suspension of a certain concentration to a new culture dish, and culture. Subsequent passage may be performed when the cells occupy approximately 90% of the culture area. Change the culture medium every two days.
  • Figure 1 shows the results of measuring the pH of egg white, yolk, and embryo blood surrounding the chicken embryo in the egg over time.
  • Figures 2-1 and 2-2 are phase-contrast micrographs showing low and high magnifications of cultured cells from the 8th passage of cells derived from the reproductive crescent of stage 3-4 embryos of chickens, respectively.
  • FIGS. 3-1 and 3-2 are phase-contrast micrographs showing low and high magnifications of cultured cells at the seventh passage of cells derived from the reproductive crescent of stage 3 to 5 of the chicken, respectively.
  • FIGS. 41 and 42 are phase-contrast micrographs showing low and high magnifications of cultured cells at passage 24 of germline-derived cells of 4-day embryos of chickens, respectively.
  • FIGS. 5-1 and 5-2 are phase-contrast micrographs showing low- and high-magnification cells cultured at the fifth passage of cells derived from the reproductive half-moon region of stage 3 to 5 embryos of Pezura, respectively.
  • Fig. 6-1 and Fig. 6-2 show phase-contrast micrographs showing low and high magnifications of cultured cells of the 7th passage of cells derived from gonad primordia of stage 17 embryos of Pezura, respectively.
  • 1 and FIGS. 7-2 are phase contrast micrographs showing low and high magnifications of cultured cells of the 24th passage of cells derived from the heart of a 7-day embryo of Pezura.
  • FIG. 8 is a phase-contrast microscope photograph showing the second generation of cultured human fibroblasts after subculture by the culture method of the present invention.
  • FIG. 9 is a phase-contrast microscope photograph showing the second-generation cultured cells of human fibroblasts that have been subcultured by a conventional culture method.
  • FIG. 10 shows cell proliferation at pH 7.2 of cells from the reproductive crescent of stage 3-5 embryos of chickens.
  • FIG. 11 shows cell culture at pH 7.8, ibid. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the pH of egg white, egg yolk and blood was measured for chicks and quail as environmental conditions surrounding embryo cells.
  • Chickens use white leghorns, and mushrooms use Japanese gizzards. 38.5 fertilized eggs after ovulation, forced air egg opener at 60% relative humidity (P-800, Showa Incubator Lab., Japa ⁇ ) And embryos of various developmental stages were collected.
  • the developmental stage in chick embryos was based on the “Hamburger and Hamilton Developmental Stage Table” (Hamburger, V. and Hamilton, H., J. orphol., 88: 49-92, 1951). ⁇ ⁇
  • the stage of development of zebra embryos is generally based on the “Zacchei Stage Table” (Zacchei, A.
  • Embryonic blood was collected at stages 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 and 25, 6 and 11 day embryos, and at the time of spinning. Watery egg whites and yolks beneath the embryos were collected from stage 1 to the time of blanching. These samples were collected using glass microcapillaries that had been washed three times with distilled water before use. The pH was measured with pHBOY-Cl (manufactured by Shindengen) using about the sample immediately after collection.
  • Figure 1 shows the results of pH measurements of the egg white surrounding the chick embryo, the yolk immediately below the embryo, and the blood.
  • blood is observed from around 47 hours of incubation (stage 12), at which time the pH is about 8.5, and until around 108 hours of laying eggs, the pH always exceeds 8.0. After that, it remained at about 7.8 or more until it was turned into black. ⁇ Zura shows a similar tendency
  • the cells described below were cultured by the culture method of the present invention.
  • stage 31 7 day embryo (stage 31) heart, knee, gonad
  • Stage 3-5 (corresponding to Zacchei stages 1-3) Reproductive half-moon area
  • the composition of the culture solution is as follows (hereinafter referred to as a bird culture solution).
  • Basic medium ⁇ - ⁇ (US GIBCO BRL 11900-016) supplemented with ⁇ D-glucose lmlt
  • EPPS ( ⁇ -2-Hydroxyethylpiperazine-N '-3-propanesulfonic acid) lOmM
  • PH of the culture medium was adjusted to p H8. 2 by Na 2 C0 3 in a conventional gas phase.
  • each tissue was immediately minced in an avian culture medium (0.5ral) in a 35 ⁇ dish using an ophthalmic luminous sword. Then, put the minced tissue pieces in a plastic flask for culture (Corning, USA, product number No. 25102S), add 5 ml of a bird culture solution, stopper tightly, and allow to stand at 38.5. Cultured. The total amount of the culture solution was changed every two days.
  • the cells are treated with PBS (-) containing 0.1% tribasin and 0.02% EDTA for 37, 3 minutes to disperse the cells. This was performed by transferring to a culture flask containing a new culture solution. Thereafter, passage was performed when the cultured cells occupied about 903 ⁇ 4 of the culture area.
  • mice and avian embryo culture medium For embryonic cell lines derived from mice and aortic endothelial cells, avian embryo culture medium And subcultured in the same manner as described above.
  • Figures 2 to 7 show low- and high-magnification phase-contrast micrographs of germ cells from chickens and quails in subculture. Embryonic cells derived from chickens and quails have been able to be subcultured for 3 to 15 months, and are still being subcultured.
  • Figure 2 shows a photograph of the passage 8 of cells from the reproductive crescent in the stage 3-4 chick embryo
  • Figure 3 shows the passage of cells from the reproductive crescent in stage 3-5 of the chicken
  • Fig. 4 shows a photograph of the 24th passage of cells derived from the gonad of a 4-day embryo of a chick
  • Fig. 5 shows a photograph of the half-moon region of a stage 3-5 embryo of a pebble
  • Fig. 6 shows a photograph of the 7th generation of cells derived from the germ primordium of the stage 17 embryo of Pezura
  • Fig. 7 shows a photograph of the heart of the 7th generation of Pezura embryo.
  • all tested cell lines can be subcultured for at least 15 generations, and for aortic endothelial cells of the stomach, at least 10 generations can be subcultured. Atsuta.
  • FIG. 8 shows a phase-contrast micrograph of the cells of the second generation after subculture by the culture method of the present invention
  • FIG. 9 shows a subculture by the conventional culture method for comparison with FIG. The phase contrast micrograph of the second generation cell is shown.
  • the culture method of the present invention it is possible to stably subculture avian-derived cells that could not be subcultured for a long period of time. It has become possible.
  • cells derived from mammals other than birds e.g., established cells, primary cultured cells, etc.
  • cells such as ST0 cells and SL-10 used as feeder cells when establishing mouse ES cells and EG cells can grow by the culture method of the present invention, these cells are avian It can be used to establish embryo-derived ES and EG cell lines.
  • the cells used were the reproductive crescent of the early stage chick embryo (stage 3 to 5), where primordial germ cells were first identified.
  • the cultivation was carried out in a culture flask at 38.5, mainly in 5% carbon dioxide gas and 95% normal gas phase at pH 7.2, and 10096 normal gas phase at pH 7.8.
  • the culture solution used was a basic medium a-MEM (US GIBCO BRL 11900-016) to which the following was added.
  • the pH of the culture was set at 7.2 (control) and 7.8 (test plot). The results are shown in FIGS.
  • the horizontal axis shows the number of passages, and the vertical axis shows the approximate number of cell divisions per day.
  • the values on the vertical axis are calculated by dividing the dilution ratio at each passage by the number of days required for the cells to become confluent afterwards, in order to know the number and speed of cell division. It is a convenient guide for From these figures, the following is clear.
  • pH 7.2 In the early stage of culture, cells show remarkable division, but stop dividing in about 1 to 2 months and die. (Note that “a” rbj in Figure 10 shows two independent experiments.)
  • pH 7.8 Has the same tendency to split as pH 7.2, but can be passaged without dying.
  • Primordial germ cells at the developmental stage that did not reach the gonad primordium were singulated from embryo blood and cultured by the conventional culture method and the culture method of the present invention, and the survival rates after a certain period of time were compared.
  • Fertilized eggs of chicks were spun at 803 ⁇ 4C and 38.5 ° C, and stage 13-15 embryos were obtained approximately 52 hours later. Approximately 31 embryo blood samples were drawn from each embryo using micro glass capillaries. Approximately 200 1 of the culture solution is placed on a 35 ⁇ plastic culture dish (Falcon, No. 1008), and the blood is dispersed therein. It was picked up and separated from blood cells. Using a 24-well cell culture microplate (Koingen), 100 primordial germ cells were cultured with the bird culture medium pH 8.2 and PH 7.4, respectively. . The composition of the culture solution was the same as that of the bird culture solution of Example 2.
  • Morphological abnormalities are as follows: 1) The cell membrane surface looks unclear, 2) The cells are blebbing
  • the proportion of primordial germ cells that retained the normal morphology considered to be viable at 4 hours of culture was examined. The ratios were 63 ⁇ 4 and 943 ⁇ 4 for pH 7.4 and ⁇ H8.2, respectively. there were. After 24 hours of culture, the concentrations were 4% and 18%, respectively. From this, it was found that setting the pH from 7.4 to 8.2 clearly improved the survival rate of primordial germ cells. This indicates that the culture method of the present invention can be effectively applied to developmental engineering operations using primordial germ cells. Industrial applicability

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Description

明細書 鳥類由来の細胞の培養方法および該培養方法によって得られた細胞系 技術分野
本発明は、 鳥類由来の細胞を培養する方法および該培養方法によって得られた 鳥類由来の細胞系に関する。 背景技術
1982年、 マウス受精卵に、 ラッ ト成長ホルモン遺伝子を導入したスーパーマウ スが作出 （R. D. Palmiter et al.： Nature, 300, 611-615, 1982) されて以来、 哺乳動物への外来遺伝子の導入が可能となり、 これまでに、 さまざまな外来遺伝 子を導入したトランスジエニック動物の作出が試みられてきた。 このような試み の中で、 家畜に対しては、 品種改良の促進、 臓器移植ドナー、 あるいは有用物質 を生産する動物工場 （バイオリアクター） などへの利用を目的としたトランスジ ヱニック家畜の作出が盛んに行われている。
特に、 トランスジヱニック家畜による、 医薬品などの有用タンパク質の生産は、 バクテリァゃ酵母による大量培養と比較して、 医薬品としての活性発現に必要な 高度の糖鎖修飾が可能であり、 さらにまた、 動物細胞の大量培養施設による生産 に比べて極めて低コス卜で生産できることなどから、 今後有用タンパク質の生産 方法として、 新しい産業分野を形成していくものと考えられる。 これらの有用夕 ンパクは、 本来生産する動物にとっては異物であり、 有害となる場合が多いと考 えられるので、 これを避けるために、 生産物質を体外に分泌させようとする試み がなされており、 それには実現可能な 2つの生産システムが提唱されている。
一つは、 哺乳動物の乳汁中に有用タンパク質を分泌生産させるシステムであり、 すでに実現している例として、 な-卜アンチトリブシンを乳汁中に高濃度で分泌生 産するトランスジエニックヒッジ （G. Wright et al.： Bio/Technology, 9, 830 -834, 1991) や、 ヒト組織プラスミノーゲンァクティベータ一 （Human tissue- 1 ype plasminogen activator) を乳汁中に分泌生産する卜ランスジエニックャギ
(K. M. Ebert et al.： Bio/Technology, 9, 835-838, 1991) などの報告がある。 今一つは、 鳥類の卵白中に有用物質を生産させるシステムで、 これがニヮトリ などで実現されれば、 閉鎖環境下で、 完全な管理のもとに多数飼育が可能なこと、 世代間隔が性成熟まで半年と短いこと、 定常的に卵が得られること、 飼育コスト が家畜に比べてきわめて低いことなどから、 トランスジヱニック家畜よりも、 産 業上の有用性が高いと考えられる。
トランスジュニック鳥類を作出するために、 鳥類受精卵 （胚） に遺伝子を導入 する方法として、 現在 3つの方法が用いられている。
(1) 放卵後のニヮトリ受精卵の胚盤葉細胞 （すでに 6万個の細胞にまで達してい る） に、 導入したい遺伝子をつないだレトロウイルスベクターを感染させて、 遺 伝子を導入する方法。 現在盛んに行われており、 例えばトランスジエニックチキ ンの最初の例として、 Bosselmanらは、 増殖能欠損型のトリレトロウイルスベクタ 一を胚盤葉細胞に感染させ、 孵化させて得た雄の精子を、 雌に人工授精させてそ の後世代の にベクター DMが伝達されることを検出している（Bosselman, R. A. et al.： Science, 243, 533-535, 1989) 。
(2) 放卵後の卵の胚盤葉細胞をトリブシンで解離してバラバラにした細胞に遣伝 子を導入した後、 それらを別の卵の胚盤葉の割腔に注入してキメラ鳥を作製し、 交配してトランスジエニック鳥類を得る方法。 胚盤葉キメラ鳥類の作出技術はす でに確立されているので （Petitte, J. N. et al.： evelopment, 108, 185-189， 1990) 、 この方法でトランスジエニック鳥類が作出される可能性があると考えら れる。
(3) 排卵直後の 1細胞期受精卵の細胞質に、 遺伝子をマイクロインジ Xクシヨン し、 体外培養でヒョコにまでP?化させる方法。 上記の 2つの方法は、 放卵後の胚 盤葉細胞への遺伝子導入であるのに対して、 この方法は、 1988年 Perryらにより、 排卵直後のニヮトリ受精卵を体外に取り出して培養し、 発生を進行させて、 ヒョ コにまで育てる方法が開発 （Perry, M. M.： Nature, 331， 70-72, 1988) された ことによって初めて可能となったものである。 しかしながら現段階では、 受精卵 の核を識別することができないこと、 多精子受精であることなどから、 核あるい は前核への遺伝子注入が困難であり、 細胞質への遺伝子導入となるため、 モザィ ク的なトランスジヱニックとなることが多く、 この方法でトランスジ Xニックニ ヮ卜リを作出するには改良すべき点が多い。
これらの方法とは別に、 今後トランスジエニック鳥類を作出するための有力な 手段となると考えられているものに、 次のような細胞に遺伝子を導入して、 キメ ラ作出を経て、 トランスジエニック鳥類を得る方法がある。
胚盤葉細胞 （Blastoderm cell) 、 始原生殖細胞 （primordial germ cell ; PGC) 、 生殖原細胞 [goniura;卵原細胞 （oogonium) と精原細胞 （spermatogonium) の総称] 等の、 初期の胚内に存在する細胞群と、 in vitroで樹立された細胞株である胚 葉細胞由来の E S細胞 （embryonic stem cell) や始原生殖細胞由来の E G細胞 (embryonic germ cell) がこれに相当する c
E S細胞や E G細胞は、 培養皿の中で未分化状態を保持したまま長期間増殖し 続ける性質を持つので、 培養下で遺伝子を導入し、 特定の細胞クローンを選別し た後、 胚盤葉キメラ作出技術により生殖系列キメラを作製し、 交配することによ つて、 E S細胞あるいは E G細胞由来の個体を得ることが可能である。 E S細胞 は、 マウスについては、 すでに生殖系列キメラ形成能を持つものが樹立 （A. Bra dley et al.： Nature, 309, 255, 1984) されているが、 鳥類については、 形態的 に E S細胞らしい細胞系が樹立されたとの報告 （W093/23528) はあるものの、 キ メラ形成能は確認されていない。
始原生殖細胞や生殖原細胞は、 将来精子や卵子のもととなる細胞で活発に增殖 するため、 これらの細胞の培養条件が確立されれば E S細胞と同様培養下での遗 伝子操作が可能であり、 すでにニヮトリでは、 始原生殖細胞の胚間移植により移 植始原生殖細胞由来のニヮトリを得る方法が記載されている [桑名貴、 実験医学、
Vol. 12、 No. 2 (増刊） 、 260-265、 1994] ことを考慮すると、 始原生殖細胞由来 のトランスジ Xニック鳥類を作出することが期待できる。
E G細胞は、 松居らによって、 マウスにおいて初めて樹立されたもので、 松居 らは、 マウスの始原生殖細胞を、 SCF (stem cell factor) と、 さらにこれに加え TLIF ( leukemia inhibitory factor) および bFGF (basic fibroblast growth f actor) の存在下、 STO細胞 [川瀬ら、 実験医学、 Vol. 10、 No. 13 (増刊） 、 1575- 1580、 1992] をフィーダ一細胞として培養し、 形態的に E S細胞様のコロニーを 形成して増殖し、 キメラ形成能を持つ、 始原生殖細胞由来の E G細胞株を樹立し た （liatsui, Y. , Zsebo, K. & Hogan, B. L. M.： Cell, 70 : 841-847, 1992) 。 この方法を鳥類の始原生殖細胞に応用することにより、 鳥類の E G細胞株を樹立 できる可能性がある。
これらの細胞は、 鳥類胚内に存在する細胞あるいはそこから樹立される細胞で あり、 これらの細胞の単雜、 樹立、 遺伝子導入等の細胞操作および遺伝子操作を 可能とするためには、 これらの細胞を包含する鳥類由来の細胞を長期間安定的に 増殖維持できる培養方法の確立が必要である。
また、 鳥類由来の細胞の長期継代培養が可能となれば、 例えば、 ニヮトリマレ ック病など、 ウィルスに起因する疾病に対して、 予防ワクチンを製造することが 期待できる。 細胞培養によってワクチンを製造することは、 鶏卵などによる製造 に比べて、 異種抗原の混入が回避でき好ましいと考えられる。
しかしながら、 鳥類由来の細胞は、 初代培養では細胞は盛んに分裂を行い増殖 するが、 やがて培養細胞の細胞質内に多くの液滴が観察された後、 細胞は 2〜3週 間後増殖を停止し死滅するので、 継代培養することは不可能である。 Carrelは、 ニヮトリ胚の結締組織を 34年間にわたって増殖させることに成功しているが （黒 田行昭著、 動物組織培養法、 p2、 共立出版株式会社、 1974) 、 現在まで誰も追試 に成功した者はなく、 学会では否定されている。 現在、 正常細胞としては唯一、 ニヮトリ胚の線維芽細胞のみが、 34代前後の継代培養が可能である。
本発明は、 鳥類由来の細胞、 とりわけニヮトリやゥズラなど家禽類の細胞を、 長期間安定に継代可能な培養方法を提供することを目的とする。 またこのような 培養方法によつて得られた鳥類由来の細胞系を提供することを目的とする。 発明の開示
動物細胞培養における培養液の pHを最適な範囲に設定することは培養を成功さ せるための一つの重要な要件であり、 そのためには、 生体内の細胞を取り巻く環 境の pHにできるだけ近い値に設定する必要があると考えられる。 通常、 動物細胞 は、 pH6. 8〜7. 6の間で十分生育できるが、 至適 pHは 7. 2〜7. 4の範囲内にあり、 pH が 6. 6以下または 7. 8以上では 24時間以内に死滅するとされている。
本発明者らは、 今まで誰も成功した者が t、なかつた鳥類由来の胚細胞の長期継 代培養を試みるに当たり、 発生進行中の、 胚細胞を取り卷く環境 pHのうち、 特に 血液の pH値に着目し、 培養液の pHを当該 PHに設定するという着想を得た。 しかし ながら、 初期胚の血液の pHの測定は、 採血の困難さと採血量の少なさから、 測定 に必要とされる血液量の確保ができず、 今までなされていなかった。
そこで、 本発明者らは、 実際に胚当たり約 2 ;z lの採血可能な発生段階以降の血 液の pHを経時的に測定した。 その結果、 驚くべきことに、 発生段階以降の血液の pHは、 動物細胞が 24時間以内に死滅するとされている pH7. 8以上の値で推移してい た。 また、 血液循環前の初期胚の細胞にとっては、 胚内の位置により卵黄と卵白 に影響されている可能性も考えられたことから、 参考的に胚直下の卵黄と卵白を 取り巻く卵白の pHについても経時的に測定した。
これらの結果から、 本発明者らは、 胚細胞の置かれている総合的な pH環境は、 その血液の示す pHが最も重要なものであり、 この pH値が胚細胞の生育にとって適 正な pH値である可能性が高いとの考えのもとに、 培養液の pHを pH7. 8以上に設定し 鳥類由来の胚細胞の培養を試みたところ、 長期間継代可能であることを見出した。 さらに当該 pHを、 鳥類の後期胚、 ヒナ、 成体の細胞にも適用してみたところ、 同 様に長期間継代培養が可能であることを見出し、 本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、 鳥類由来の細胞培養において、 培養液の pHを pH7. 8以上に 設定することを特徴とする鳥類由来の細胞培養方法および該培養方法によって得 られた鳥類由来細胞の細胞系を提供するものである。
以下本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、 鳥類胚細胞を取り巻く p H環境を調べるために、 世界中で飼育 され、 最もポピュラーな家禽類である、 ニヮトリとゥズラの胚を鳥類の代表例と して選び、 正常に発生が進行中の胚を取りまく卵白および卵黄、 そして胚の血液 が示す p Hを経時的に測定した。
その結果、 図 1に示すように、 ニヮトリ胚の場合、 血液循環は孵卵 47時間頃か ら観察され、 そのときの血液の p Hは約 8. 5を示し、 孵卵 108時間頃までは常に 8. 0よりも大きく、 その後 I？化するまでは P H7. 8以上を示した。 一方、 胚の血液循 環が観察される以前の発生段階の卵白の P Hは、 血液のそれよりもさらに塩基性 側 （ 11はほぼ9. 2〜9. 9) を示し、 卵黄のそれは若干酸性側 （ ^1はほぼ6. 0〜7. 8) であった。 受精卵の中での胚細胞の存在状況から推定して、 当該発生段階の胚 細胞は、 卵黄より卵白からの影響の方が大きいと考えられる。 試しにこの段階の 卵白と卵黄を混合したものの p Hは 7. 8〜8. 0を示した。 従って、 胚の血液循環が 観察される以前の段階でも、 鳥類胚は高塩基性の、 恐らく p H 7. 8以上の環境に置 かれている可能性が高い。
以上の結果から、 胚細胞を取り巻く p H環境は常に 7. 8以上の塩基性側にあるこ とが明らかとなった。
本発明者らは、 培養液の p Hを 7. 8〜8. 2の値に設定して鳥類由来の細胞の細胞 培養を試みた。 鳥類胚の採取源として、 放卵後のニヮトリあるいはゥズラの受精 卵を選び、 該受精卵を賻卵器で保温して発生を進行させ、 さまざまな発生段階の 胚を殻外に取り出し体外培養を試みたところ、 全ての発生段階の胚細胞の継代培 養に成功した。 また、 化直後のゥズラのヒナの心臓や生殖巣等の細胞について も、 上記と同じ培養方法で培養を試みたところ、 同様に継代培養が可能であった。 現在もこれらの細胞については、 全て安定的に継代培養を維続中である （18ヶ月 以上継代している）。 このように培養液の p Hを 7. 8以上に設定することは、 胚細 胞の環境が類似しているニヮトリ、 ゥズラ以外の鳥類由来の細胞にも適用できる。 このような、 鳥類由来の細胞の長期間にわたる継代培養方法は、 本発明者らによ つて初めて見いだされたものである。
さらに、 生殖巣原基に到達していない発生段階の鳥類始原生殖細胞を、 胚血液 中から単雜して、 上記培養方法で培養することにより、 従来より格段に in vitro での生存率を向上させることができた。 したがって、 鳥類始原生殖細胞に対して、 これまで不可能であった in vitroでの遣伝子操作を可能にし、 個体にまで発生さ せられる可能性が高まった。
さらにまた、 鳥類以外の細胞で、 すでに樹立されている細胞株として、 例えば、 マウス胎仔線維芽細胞由来の細胞系 ST0や、 ヒト線維芽細胞株、 初代培養細胞とし て、 例えばゥシの大動脈内皮細胞等を、 上記と同じ培養方法で培養を試みたとこ ろ、 意外にもこれらの細胞も継代可能であった。
このように、 鳥類のみならず哺乳類由来の細胞についても、 本発明の培養方法 で継代培養ができることが判明した。 また、 殻に包まれた状態で放卵される鳥類 以外の卵生の動物、 例えば爬虫類においても、 発生中の胚内環境における p Hの 推移は鳥類と同様に塩基性側にあると推定され、 本発明の培養方法で継代培養が 可能であると考えられる。
以上に記載したことから明らかなように、 本発明は、 鳥類胚の細胞を培養する にあたって、 培養液の p Hを通常動物細胞が 24時間以内に死滅するとされる 7. 8以 上に設定することを特徴としている。
p H以外の、 培養に必要な、 温度、 浸透圧、 栄養源、 培養基等の条件は、 従来 の鳥類胚細胞、 あるいは哺乳類の細胞培養に用いられている条件に準ずればよく、 これらについての多少の修正は、 本明細害の記載をもとに、 当業者が一定の順序 を踏んで実験を繰り返せば通常実施しうる範囲内にあり、 本発明の範囲を何ら限 定するものではない。
本発明でいう鳥類とは、 家禽類およびその他の鳥類全般を含み、 家禽類として は例えば、 ニヮトリ、 ゥズラ、 ァヒル、 カモ、 ガチョウ、 ダチョウ、 シチメンチ ヨウ、 ホロホロチョウ、 キジなどが包含される。
また、 本発明でいう細胞系とは、 単にセルラインの意味だけではなく、 樹立細 胞系 （established cell line) 、 細胞系統 （cell strain) およびクローン （cl one) を包含する。
上記したように、 本発明の特徴は、 培養液の p H値を p H7. 8以上に設定したこ とにあり、 その他の条件に限定されないが、 以下本発明の具体例を詳細に説明す る。
培養液としては、 Eagleらにより、 マウス L細胞ゃヒト HeLa細胞の増殖を指標と して開発された最少必須培地 （Eagle' s rainimun essential medium^ MEM) や、 二 ヮトリ胚心戤由来線維芽細胞の長期生存を指標として開発された 199培地に、 5〜 10¾のゥシ胎仔血清あるいはニヮトリ血清、 浸透圧調節剤あるいはエネルギー源と して l〜4g八のグルコース、 p H安定化のため 10〜30raMの HEPES (Ν-2-hydroxyeth ylpiperazine-N' -2-ethanesulfonic acid) あるいは EPPS (Ν-2-hydroxyethylpip erazine-Ν' -3-propanesulfonic acid) 、 - SH供与剤として 0. 05〜0. lmliの 2 - merca ptoethanolなどを添加したものを用いる。 培養を通常気相中で行う場合は、 NaHC 03を培養液に 2〜4g八となるように加え、 Na2C03で p Hを調整する。 添加する血清 の品質は、 細胞增殖能に大きく影響するので、 使用する細胞でロットチェックを 行う。 Ca+ +は、 細胞增殖あるいは付着の調節に関与しているとされており、 lrali程 度の Ca+ +を添加した方がよい。 本発明を実施する際に、 培地組成については、 上 記した組成の培養液以外にも、 選択の余地があるものが存在すると思われる。 し かしながら、 そのような選択は、 当業者であれば適宜試みることができる通常技 術であり、 いかなる選択をしょうと培養液の p Hを 7. 8以上に設定すれば、 それら は全て本発明に包含される。
培養温度は種により異なり、 それぞれに適した温度を選べばよく、 鳥類の胚細 胞の場合通常 37〜38. 5ての範囲内である。
継代培養は、 通常以下の通り行う。 最初に植えた細胞が分裂増殖し、 培養容器 の底面のほぼ 1/3〜2/3位を占めた頃に、 培地を除き、 0. 05〜0. 1¾トリブシン、 0. 02¾EDTAを含む PBS (-) (Ca+ +、 Mg+ +を除いた平衡塩類溶液） で 37て、 3〜5分間室温 で処理して細胞分散を行う。 遠心して細胞を集め、 新しい培養液中に分散させ、 細胞数を算定し、 一定濃度の細胞浮遊液を、 新しい培養皿に移して培養を行う。 その後の継代は、 細胞が培養面積のほぼ 90¾を占めるようになつた時点で継代すれ ばよい。 培養液は 2日毎に交換する。
培養細胞の凍結保存は、 10¾ DMS0を含む増殖培地に、 細胞を 105〜106/ral浮遊さ せ、 lnilの硬質アンプルに入れた後、 1 /分位の割合で- 80 まで緩徐凍結した後、 液体窒素中に保存する。 使用に際しては、 37てで急速融解後、 増殖培地に混和し、 遠心して上清を捨て、 沈渣の細胞を上記と同一培養条件で培養する。
このようにして、 本発明の長期継代培養方法によつて得られた細胞系のうち、 ゥズラ胚ステージ 1 7の胚下半身の血管野部域を 2 9代継代培養したものを、 ェ 業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM P-14454で寄託した。 図面の簡単な説明
図 1は、 枏卵中のニヮトリの胚を取り卷く卵白、 卵黄および胚血液の p Hを経 時的に測定した結果である。
図 2— 1および図 2— 2は、 ニヮトリのステージ 3〜4胚の生殖半月部域由来の 細胞の継代 8代目の培養細胞の低倍率および高倍率をそれぞれ示す位相差顕微鏡写 真である。 図 3— 1および図 3— 2は、 ニヮトリのステージ 3〜5の生殖半月部域由来の細 胞の継代 7代目の培養細胞の低倍率および高倍率をそれぞれ示す位相差顕微鏡写真 である。
図 4一 1および図 4一 2は、 ニヮトリの 4日胚の生殖巣由来細胞の継代 24代目の 培養細胞の低倍率および高倍率をそれぞれ示す位相差顕微銪写真である。
図 5— 1および図 5— 2は、 ゥズラのステージ 3〜5胚の生殖半月部域由来細胞 の継代 5代目培養細胞の低倍率および高倍率をそれぞれ示す位相差顕微鏡写真であ る。
図 6— 1および図 6— 2は、 ゥズラのステージ 17胚の生殖巣原基由来細胞の継 代 7代目の培養細胞の低倍率および高倍率をそれぞれ示す位相差顕微鏡写真を示す < 図 7— 1および図 7— 2は、 ゥズラの 7日胚の心臓由来の細胞の継代 24代目の培 養細胞の低倍率および高倍率をそれぞれ示す位相差顕微鏡写真である。
図 8は、 ヒト線維芽細胞を、 本発明の培養方法で継代培養し始めて 2代目の培養 細胞を示す位相差顕微鏡写真である。
図 9は、 ヒト線維芽細胞を従来の培養方法で継代培養し始めて 2代目の培養細胞 を示す位相差顕微鏡写真である。
図 1 0は、 ニヮトリのステージ 3— 5胚の生殖半月部域由来の細胞の p H 7. 2に おける細胞増殖を示す。
図 1 1は同上の p H 7. 8における細胞增殖を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例を示すが、 本発明はこれらの実施例に制限を受けるもの ではない。
1 . p Hの測定
ニヮトリとゥズラについて、 胚細胞を取り巻く環境条件として卵白、 卵黄およ び血液の p Hを測定した。 ニヮトリは白色レグホンを、 ゥズラは日本ゥズラを用い、 放卵後の受精卵を 38. 5て、 相対湿度 60%にて forced air解卵器 （P- 800、 Showa Incubator Lab. , Japa η) 中で培養して、 種々の発生ステージ （developmental stage) の胚を採取した。 なお、 ニヮトリ胚における発生ステージは 「Hamburger and Hamiltonの発生ステ ージ表」 （Hamburger, V. and Hamilton, H. し， J. orphol. , 88: 49-92, 195 1) を用いた。 ゥズラ胚の発生ステージは 「Zaccheiのステージ表」 （Zacchei, A. Μ· , Archno Ital. Anat. Embryol. 66: 36-62, 1961) が一般に用いられるが、 ステージの区分がやや粗いので、 本明細書においては前記 「Hamburger and Hami ltonの発生ステージ表」 をゥズラ胚に適用したものを使用し、 同時にそれに相当 する発生ステージ表も括弧で併記した。
胚血液は、 ステージ 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18および 25、 6日胚および 11日胚、 そして、 賻化時にそれぞれ採取した。 水様性卵白および胚の真下に存在する卵黄 についてはステージ 1から賻化時までを採取した。 これらの試料の採取には、 使用 前に蒸留水で 3回洗浄したガラス製ミクロキヤピラリーを用いた。 p Hは、 採取後 直ちに約 の試料を用いて、 pHBOY-Cl (Shindengen社製） にて測定した。
ニヮトリ胚を取り巻く卵白、 胚直下の卵黄、 および血液の p H測定結果を図 1 に示す。 ニヮトリの場合、 血液は孵卵 47時間頃 （ステージ 12) から観察され、 そ の際の p Hは約 8. 5であり、 縛卵 108時間頃までは常に p H8. 0以上の値を示し、 そ の後賻化するまではほぼ 7. 8以上で推移した。 ゥズラについても同様な傾向を示し
7L。
—方、 血液が循環する以前の段階 （ステージ 11以前） の胚細胞の p H環境は、 卵白と卵黄に影響されていることが予想されるが、 該発生段階における卵白の p Hは、 血液よりもさらに塩基性側であり、 卵黄の p Hは酸性側であった。 胚細胞 の置かれている環境から全体としての p Hは、 通常の動物細胞培養の培養液の p Hよりもかなり塩基性側にあると推定される。 実際この段階の卵白と卵黄を混合 して測定した p Hは 7. 8〜8. 0を示した。 . 各種細胞の培養
1 細胞
以下に記す細胞に対して本発明の培養方法による培養を試みた。
①ニヮトリ （白色レグホン）
ステージ 3〜4の生殖半月部域
ステージ 3〜5の生殖半月部域
ステージ 17の生殖巣原基、 血管野部域
4日胚 （ステージ 24) の生殖巣
7日胚 （ステージ 31) の心膝、 生殖巣
②ニホンゥズラ
ステージ 3〜5 (Zaccheiのステージ 1〜3に相当） の生殖半月部域
ステージ 17 (Zaccheiのステージ 14に相当） の生殖巣原基、 血管野部域 7日胚 （ステージ 31、 Zaccheiのステージ 22に相当） の心膝、 生殖巣 賻化直後の鐮 （雄） （ステージ 46、 Zaccheiのステージ 33に相当） の心臓、 精巣
③マウス由来樹立細胞系
ST0 (線維芽細胞）
SL-10 (ST0のサブクローン）
ST-2
④ゥシ由来初代培養細胞
ゥシの大動脈内皮細胞
⑤ヒト線維芽細胞
健康な日本人男性の前腕部の皮膚組織片より採取し、 10¾ゥシ胎仔血清添加 Eagle-MEM培養液で培養して樹立し、 25代継代したもの
2 培養液
培養液の組成は以下の通りである （以下鳥類用培養液という） 。 基本培地 α -ΙίΕΜ (米国 GIBCO BRL 11900-016) に、 以下のものを添加したもの < D-グルコース lmlt
CaCl2 ImM
2 —メルカプトエタノール 5x10— sit
NaHC03 L 4g/1
EPPS (Ν-2-Hydroxyethylpiperazine-N' -3-propanesulfonic acid) lOmM
5¾ゥシ胎仔血清 （米国 JRH Bioscience社製）
5¾ニヮトリ血清 （米国 JRH Bioscience社製）
培養液の P Hは、 通常気相中で Na2C03により p H8. 2に調整した。
2. 3 培養方法
Ca+ +および Mg++不含の燐酸緩衝塩類液 [PBS(-) ; p H8. 2] 中で、 白色レグホン および二ホンゥズラの生体より、 ステージ 3〜4、 3〜5の生殖半月部域、 ステージ 17の生殖巣原基、 血管野部域、 4日胚の生殖巣、 7日胚の生殖巣および心膝を、 そ れぞれ組織片として切り出した。 酹化直後のゥズラのヒナからも、 心臓および精 巣を切り出した。
組織片を切り出した後に、 速やかに 35咖シャーレ中の鳥類用培養液 （0. 5ral) 中 で、 眼科用光彩尖刀を用いて各組維を細切した。 次いで、 培巷用プラスチックフ ラスコ （米国 Corning社製、 製品番号 No. 25102S) 中に細切した組織片を入れ、 5 mlの鳥類用培養液を入れて密栓し、 38. 5てで静置培養した。 なお、 培養液は 2日毎 に全量交換した。
継代培養は、 細胞が、 培養用フラスコの培養面の約 30¾を占めた時点で、 0. 1¾ト リブシンと 0. 02¾EDTAとを含む PBS (-)で 37 、 3分間処理して細胞分散を行い、 新 しい培養液を入れた培養フラスコに移すことにより行った。 その後は、 培養細胞 が、 培養面積の約 90¾を占めた時点で継代操作をした。
マウス由来樹立細胞株およびゥシ大動脈内皮細胞については、 鳥類胚用培養液 を使用し、 上記と同じ方法で継代培養した。
ヒト線維芽細胞については、 10¾ゥシ胎仔血清添加 Eagle-ΪΕΜ培養液で 25代継代 培養したものを用いて、 26代目から鳥類用培養液に変えて上記と同じ方法で継代
¾ ^し 。
2. 4 結果
ニヮトリおよびゥズラ由来の細胞については、 試験した全ての細胞が継代培養 可能であった。 図 2〜図 7に継代培養中のニヮトリおよびゥズラ由来の胚細胞の 低倍率および高倍率の位相差顕微镜写真を示す。 ニヮトリおよびゥズラ由来の胚 細胞については、 これまで 3〜15力月の継代培養が可能であり、 現在も継代培養を 続行中である。
図 2は、 ニヮトリのステージ 3〜4胚の生殖半月部域由来の細胞の継代 8代目の写 真を示し、 図 3は、 ニヮトリのステージ 3〜5の生殖半月部域由来の細胞の継代 7 代目の写真を示し、 図 4は、 ニヮトリの 4日胚の生殖巣由来の細胞の継代 24代目の 写真を示し、 図 5は、 ゥズラのステージ 3〜5胚の生殖半月部域由来の細胞の継代 5代目の写真を示し、 図 6は、 ゥズラのステージ 17胚の生殖原基由来の細胞の継代 7代目の写真を示し、 図 7は、 ゥズラの 7日胚の心臓由来の細胞の継代 24代目の写 真を示す。
マウス由来の樹立細胞株については、 試験した全ての細胞株が、 少なくとも 15 代以上の継代培養が可能であり、 ゥシの大動脈内皮細胞については、 少なくとも 10代以上の継代培養が可能であつた。
ヒト線維芽細胞については、 少なくとも 8代以上の継代培養が可能であった。 図 8に、 本発明の培養方法で継代培養し始めて 2代目の細胞の位相差顕微鏡写真を示 し、 図 9には、 図 8との比較のために、 従来の培養方法で継代培養して 2代目の細 胞の位相差顕微镜写真を示す。
以上の実施例から明らかなように、 本発明の培養方法を用いることにより、 従 来継代培養不可能であつた鳥類由来の細胞を、 長期間安定に継代培養することが 可能となった。 また鳥類以外の哺乳動物由来の細胞 （榭立細胞、 初代培養細胞な ど） も、 本発明の培養方法で継代培養が可能であることが明らかになった。 特に、 マウスの E S細胞や E G細胞の樹立の際に、 フィーダー細胞として用いられる ST 0細胞や SL- 10などの細胞が、 本発明の培養方法で生育可能なことから、 これらの 細胞は、 鳥類胚由来の E S細胞系や E G細胞系を樹立する際に、 利用することが 可能である。 さらに、 殻に包まれた状態で放卵される鳥類以外の卵生の動物、 例 えば爬虫類においても、 本発明の培養方法で継代培養することが可能である。
3 . 各種 pHによる培養
3. 1 細胞
細胞は、 ステージ 3〜5のニヮトリ初期胚の生殖新月部域 （始原生殖細胞が最初に 確認される領域） を用いた。
3. 2 培養
培養は、 培養フラスコ中 38. 5てで、 pH7. 2では主に 5%炭酸ガス、 95%通常気相、 pH7. 8では 10096通常気相中行った。
培養液は、 基本培地 a -MEM (米国 GIBCO BRL 11900-016) に、 以下のものを添加 したものを用いた。
D-グルコース 5. 6rali
Figure imgf000017_0001
NaHC03 16. 7mH
Na2C03 9. lnM
2-メルカプトエタノール 50 li
EPPS (ρΗ7. 2の場合は HEPESを用いる） ΙΟπιΜ
5%ゥシ胎仔血清 （米国 JRH Bioscience社製）
5¾ニヮトリ血清 （米国 JRH Bioscience社製）
また、 培養液の pHはそれぞれ 7. 2 (対照区） 、 7. 8 (以上試験区） に設定した。 結果を図 10および 11に示す。 横軸は継代した回数、 縦軸は 1日に細胞が分裂した およその回数を示す。 縦軸の値は、 各継代時での希釈倍率を、 その後に細胞がコ ンフルェントになるのに要した日数で除して算出したものであり、 細胞分裂の回 数および速さを知るための便宜的な目安となるものである。 これらの図から、 以 下のことが明らかである。
pH 7. 2：培養初期では細胞は著しい分裂を示すが、 1〜2ヶ月ほどで分裂が停止し、 死滅する。 （なお、 図 1 0における 「a」 rbj は独立して行った 2回の実験をそ れぞれ示す。 ）
pH 7. 8： pH 7. 2の場合と同様の分裂傾向であるが、 死滅することなく継代可能で ある。
なお、 pH8. 2の場合、 培養初期では細胞の死滅が多く見られたが、 生存している 細胞は継代培養が可能であつた。
4 . 始原生殖細胞の培養
生殖巣原基に到達していない発生段階の始原生殖細胞を胚血液中から単雜し、 従来の培養方法と、 本発明の培養方法で培養を行い、 一定時間後の生存率を比較 した。
4. 1 培養方法
ニヮトリ （白色レグホン） の受精卵を、 湿度 80¾、 38. 5てで賻卵し、 約 52時間後 にステージ 13- 15の胚を得た。 胚の血管中から、 マイクロガラスキヤピラリーを用 いて、 一個体につき約 3 1の胚血液を吸い出した。 約 200 1の培養液を 35删プラ スチック培養皿 （ファルコン社、 No. 1008) に盛り上げ、 その中に血液を分散した c 倒立位相差顕微鏡下で、 始原生殖細胞をマイクロガラスキヤビラリ一を用いて拾 い上げ、 血球と分雠した。 24穴細胞培養用マイクロプレート （コ一二ング社） を 用いて、 鳥類用培養液の p H8. 2のものと、 P H 7. 4のものとで、 始原生殖細胞を それぞれ 100個ずつ培養した。 培養液の組成は、 実施例 2の鳥類用培養液のものと 同じものを用いた。 培養開始後、 4時間と 24時間目に、 倒立位相差顕微鏡下で始原 生殖細胞の形態を観察し、 正常の形態を保っているものの割合を比較した。 形態 異常としたものは、 ①細胞膜表面が不明瞭に見えるもの、 ②細胞がブレツビング
(blebing) を起こしているもの、 ③明らかに細胞破壊が起こっているもの、 とし 4. 2 結果
培養 4時間で始原生殖細胞の、 生存していると考えられる正常形態を保持してる ものの割合を調べたところ、 p H7. 4のものと ρ H8. 2のもので、 それぞれ、 6¾と 94¾であった。 また、 培養 24時間では、 それぞれ、 4¾と 18%であった。 このことか ら、 p Hを 7. 4から 8. 2にすることにより、 始原生殖細胞の生存率を明らかに向上 させることが判明した。 このことは、 本発明の培養方法が、 始原生殖細胞を用い た発生工学的操作に有効に応用できることを示している。 産業上の利用の可能性
本発明の培養方法を用 t、ることにより、 従来継代培養が不可能であつた鳥類由 来の細胞を、 安定に長期間継代培養することが可能となった。 このことから、 鳥 類由来の細胞を、 トランスジュニック技術等を活用して有用物質の生産などの産 業に利用する道が開けた。

Claims

請求の範囲
1 . 培養液の p Hを 7. 8以上に設定することを特徴とする鳥類由来の細胞の培養方
2 . 培養液の p Hを 7. 8以上かつ 8. 2以下に設定することを特徴とする請求項 1に 記載の鳥類由来の細胞の培養方法。
3 . 培養する細胞が胚の細胞である、 請求項 1または 2に記載の鳥類由来の細胞 の培養方法。
4 . 培養する細胞がニヮトリ由来の細胞である、 請求項 1〜 3のいずれかに記載 の鳥類由来の細胞の培養方法。
5 . 培養する細胞がゥズラ由来の細胞である、 請求項 1〜 3のいずれかに記載の 鳥類由来の細胞の培養方法。
6 . 請求項 1〜5のいずれかに記載の方法で培養を行うことによって得られた鳥 類由来の細胞系。
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