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WO1996000579A1 - Wässrige zellextrakte und wässrige suspensionen von zellwandfraktionen aus mykobacterien - Google Patents

Wässrige zellextrakte und wässrige suspensionen von zellwandfraktionen aus mykobacterien Download PDF

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WO1996000579A1
WO1996000579A1 PCT/EP1995/002524 EP9502524W WO9600579A1 WO 1996000579 A1 WO1996000579 A1 WO 1996000579A1 EP 9502524 W EP9502524 W EP 9502524W WO 9600579 A1 WO9600579 A1 WO 9600579A1
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WO
WIPO (PCT)
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mycobacteria
aqueous
cell
cell wall
cells
Prior art date
Application number
PCT/EP1995/002524
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hans-Georg Laves
Anne Thomsen
Original Assignee
Laves-Arzneimittel Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Laves-Arzneimittel Gmbh filed Critical Laves-Arzneimittel Gmbh
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Priority to KR1019960707482A priority patent/KR970703777A/ko
Priority to PL95317892A priority patent/PL317892A1/xx
Priority to JP8502826A priority patent/JP3031718B2/ja
Priority to AU28884/95A priority patent/AU2888495A/en
Publication of WO1996000579A1 publication Critical patent/WO1996000579A1/de
Priority to NO965593A priority patent/NO965593L/no

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    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
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    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents

Definitions

  • the invention relates to aqueous extracts and aqueous suspensions of Zeil wall fractions from mycobacteria which are generally not human-pathogenic.
  • Mykobacterium tuberculosis in the variety hominis and Mykobacterium leprae are human pathogenic, but there are also a number of mycobacteria, which are usually only animal pathogenic; for example, Mycobacterium tuberculosis var. bovis is pathogenic for many mammals and Mycobacterium avium is a pathogen for birds.
  • Mycobacterium tuberculosis var. bovis is pathogenic for many mammals
  • Mycobacterium avium is a pathogen for birds.
  • tubercle bacteria which penetrate into a host organism which has already been in contact with mycobacteria in the sense of an infection which has already passed through trigger an allergy, that is to say an immunologically caused specifically altered reactivity.
  • the state of allergy to tubercle bacteria is checked by intracutaneous injection of tuberculin; Tuberculin consists of dissolved decay products from tubercle bacteria.
  • the tuberculin sample can therefore be used to determine whether a host organism is allergic to tubercle bacilli or not. An allergic organism reacts much faster to a natural infection and is therefore more likely to contain it than a non-allergic organism. This fact is used to correct a malfunction or a delayed response of the immune system by an unspecific modulation of the immune functions.
  • cytokines such as IL-1 and IL-6 play a central role in the regulation, proliferation and differentiation of immune cells.
  • An unspecific modulation of the immune function essentially arises from the activation of monocytes or macrophages, which then release cytokines to an increased extent.
  • Interleukin research is still at the experimental stage, but it is now known that interleukin 1 causes an increase in PHA-induced lymphocyte proliferation, fibroplast proliferation and an increase in the activity of natural killer cells in the presence of IFN.
  • interleukin 6 which also causes an increase in the activity of natural killer cells and a T cell proliferation.
  • the interleukins are therefore used in immunotherapy for the treatment of tumors and for the substitution of T cell defects.
  • Interleukin 2 is used successfully, for example, in metastatic renal cancer and the cytokines interferon- ⁇ and interferon- ⁇ 2B have been successful in rheumatoid arthritis and hairy cell leukemia. Recently, the granulocyte colony-stimulating factor G-CSF has also been used in the clinic for leukopenia in patients with previous myelosuppressive chemotherapy. In addition to the isolated cytokines, substances are also used therapeutically which stimulate or modulate the immune system non-specifically by activating monocytes or macrophages, which then release cytokines such as IL-1 and IL-6.
  • aqueous extracts or aqueous suspensions of cell wall fractions of mycobacteria which are generally not human-pathogenic are therefore proposed with the features of claims 1 and 2.
  • Mycobacteria which are generally not human pathogenic, can be used, inter alia, as M. tuberculosis var. Bovis, M. avium, M. kansasii, M. marinum, M. scrofulaceum, M. intercellulare, M. xenopi, M. fortuitum and M. chelonae ssp.chelone.
  • These strains are known as such and can be obtained, for example, from the comprehensive London strain collection of the Center for Public Health Laboratory, National Collection of Type Cultures. This institute also provides information about the culture conditions of the respective species or subspecies.
  • the extracts or suspensions prepared according to the invention have proven to be effective immunomodulators in the first clinical trials and can be used, for example, as supportive therapy for infectious diseases, neoplastic diseases, bronchial asthma, allergies of unknown origin and rheumatoid arthritis.
  • aqueous extract or the cell wall fraction For the preparation of the aqueous extract or the cell wall fraction, 250 ml of liquid medium from 5 g / liter sodium chloride, 14 g / liter peptone, 7 g / liter Na2HP0 4 x 2H 2 0, 2 g / liter KH2PO4, 3% glycerol (85% ) inoculated with a bacterial loop with a mycobacterial culture and incubated for 4 weeks at 35 ° C. 4.5 g of moist bacteria are filtered through a sterile suction filter with a glass frit and then triturated homogeneously. After adding 100 ml of sterilized isotonic sodium chloride solution, the bacterial count is 9.7 x 10 ⁇ CFU per ml.
  • the resuspended bacterial cells are centrifuged at 12,000 RPM for 20 minutes.
  • the pellet is mixed dry with glass beads, again taken up in sodium chloride solution and broken with a Vibrogen cell mill at 4 ° C. for 20 minutes. After suction filtering over a glass frit and adding 3 drops of an anti-foaming agent, centrifugation is carried out again (18,000 RPM, 20 minutes). The supernatant obtained is used to produce the mycobacteria extract and the pellet to produce the cell wall fraction.
  • Example 2 To obtain the cell wall fraction, the pellet is resuspended in 27 ml isotonic sodium chloride solution.
  • Example 2 To obtain the cell wall fraction, the pellet is resuspended in 27 ml isotonic sodium chloride solution.
  • Cytokines are vital messenger substances that are found between cells, e.g. mediate the cells of the immune system.
  • IL-1 and IL-6 are pleiotropic cytokines that are produced by different cells and play a central role in immune defense and hematopoiesis. They cause proliferation and differentiation of T and B cells (immunomodulating effect), the regulation of acute phase proteins by the liver in the course of an inflammatory process (anti-inflammatory effect) and the stimulation of colony-forming cells for megakaryocytes and megakaryocytes themselves (regulation of hematopoiesis ). IL-1 also induces the synthesis of other lymphokines such as IL-4, IL-5 and IL-6.
  • Heparinized blood from healthy donors was isolated by gradient centrifugation over Ficoll, washed several times and incubated in serum-free RPMI 1640 (1) with L-glutamine and antibiotics. The various stimuli were incubated with the cells for 24 hours for cytokine production (2). The supernatants were removed, provided with protective protein, stored at -20 ° C. and then examined in the corresponding cytokine test.
  • Endothelial and smooth muscle cells were isolated from pieces of the saphenous vein that could not be used in bypass surgery. EC were isolated by collagenase treatment (3) and SMC by a balancing technique (4). The cells were incubated in M199, ECGF and heparin or DMEM with 10% FCS, L-glutamine and antibiotics (5, 6, 7). The various stimuli were incubated with the cells for 24 hours for cytokine production. The supernatants were removed, provided with protective protein, stored at -20 ° C. and then examined in the corresponding cytokine test. 7TD1 assass for the detection of IL-6:
  • the above-mentioned supernatants of mono-cellular and vascular cells were diluted in 96-well culture plates in 8 to 12 steps. 2,000 cells / well of the IL-6-dependent murine B cell line 7TD1 (8) were added to these dilution series, similarly as described for B9 cells. The cultures were incubated for 72 hours, radioactive thymidine was added for a further 6 hours and the proliferation of the cells was determined by measuring the built-in radioactivity. The activity of the samples was determined by comparing the samples with a defined standard using probit analysis (9).
  • Fibroblasts were cultivated in 96 well plates. After 24 hours, the medium was changed and samples were added to the fibroblast cultures in dilution series. After 72 hours, the cultures were provided with radioactive thymidine and, after a further 24 hours, evaluated as described for 7TD1 cells.
  • the extract induces IL-1 (pg / ml) as follows:
  • the extract induces IL-6 (pg / ml) depending on the dose as follows:
  • the cell wall fraction induced dose-dependent IL-1 (pg / ml) as follows:
  • the cell wall fraction induced dose-dependent IL-6 (pg / ml) as follows:
  • T-cell growth factor parameters for production and a quantitative microassay for activity. J. Immunol. 120: 2027-2032.

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Abstract

Die Erfindung betrifft wäßrige Extrakte aus in der Regel nicht menschenpathogenen Mykobacterien, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Extrakte im Cytokintest nach J.Immunol. 120:2027-2032 bei einer Konzentrationsänderung von 1 auf 4 auf 1 auf 16 eine Erhöhung des Gehaltes an Cytokinen IL-1 und IL-6 im Verhältnis von 1:6 bzw. 1:1,25 ergeben.

Description

Wässrige Zβltextrakte und wässrige Suspensionen von Zellwandfraktionen ans Mvkohacterien.
Die Erfindung betrifft wässrige Extrakte und wässrige Suspensionen von Zeil wandfraktionen aus in der Regel nicht menschenpathogenen Mykobacterien.
Es ist bekannt, daß Mykobacterium tuberculosis in der Varietät hominis und Mykobacterium leprae humanpathogen sind, aber daneben gibt es eine ganze Reihe Mykobacterien, die in der Regel nur tierpathogen sind; für viele Säugetiere ist beispielsweise Mycobacterium tuberculosis var. bovis pathogen und für Vögel ist Mycobacterium avium ein Krankheitserreger. Allerdings hat sich herausgestellt, daß gelegentlich in seltenen Fällen bei Menschen mit stark angegriffenem Immunsystem auch Infektionen mit an und für sich nur tierpathogenen Mykobacterien zu beobachten sind. Es ist auch bekannt, daß sowohl die Proteine als auch die verschiedenen Lipoidfraktionen der Mykobacterien antigenen Charakter haben, während die Polysacharide wahrscheinlich nur als Haptene im Sinne von Halbantigenen funktionieren. Es ist des weiteren bekannt, daß Tuberkelbakterien, die in einen Wirtsorganismus eindringen, der im Sinne einer durchgemachten Infektion schon zuvor mit Mykobacterien Kontakt hatte, eine Allergie auslösen, also eine immunologisch bedingte spezifisch veränderte Reaktionsbereitschaft. Der Zustand der Allergie gegen Tuberkelbakterien wird durch intrakutane Injektion von Tuberkulin geprüft; Tuberkulin besteht aus gelösten Zerfallsprodukten von Tuberkel bakterien. Mit der Tuberkulinprobe kann also abgeklärt werden, ob ein Wirtsorganismus gegenüber Tuberkelbazillen allergisch ist oder nicht. Ein allergischer Organismus reagiert viel rascher auf eine natürliche Infektion und vermag diese demzufolge eher einzudämmen als ein nicht allergischer Organismus. Diese Tatsache macht man sich zu nutze, um durch eine unspezifische Modulation der Immunfunktionen eine Fehlfunktion oder eine verzögerte Reaktionsbereitschaft des Immunsystems zu korrigieren.
Bei der Immunantwort des Körpers spielen Cytokine wie IL-1 und IL-6 eine zentrale Rolle in der Regulation, Proliferation und Differenzierung von Immunzellen. Eine unspezifische Modulation der Immunfunktion entsteht im wesentlichen durch eine Aktivierung von Monozyten bzw. Makrophagen, die daraufhin Cytokine im verstärkten Maße freisetzen. Die Interleukinforschung befindet sich zwar noch im Stadium des Experiments, aber zwischenzeitlich ist bekannt, daß Interleukin 1 eine Steigerung der PHA- induzierten Lymphozytenproiiferation, Fibroplastenproliferation und eine Aktivitätssteigerung von natürlichen Killerzellen in Anwesenheit von IFN verursacht. Das Gleiche trifft im wesentlichen für Interleukin 6 zu, das ebenfalls eine Aktivitätssteigerung von natürlichen Killerzellen und eine T-Zellproliferation bedingt. Versuchsweise werden die Interleukine daher bei der Immuntherapie zur Behandlung von Tumoren wie zur Substitution bei T-Zelldefekten eingesetzt. Interleukin 2 wird beispielsweise mit Erfolg bei metastasierenden Nierenkarzinomen klinisch eingesetzt und die zu den Cytokinen zählenden Interferon-δ und Interferon-α 2B haben Erfolge bei rheumatoider Arthritis bzw. Haarzellenleukämie gebracht. Seit kurzem wird auch der granulocytenkolonie- stimulierende Faktor G-CSF bei Leukopenien von Patienten mit vorangegangener myelosuppressiver Chemotherapie in der Klinik angewendet. Neben den isolierten Cytokinen finden aber auch Substanzen therapeutische Anwendung, die das Immunsystem unspezifisch stimulieren bzw. modulieren durch eine Aktivierung von Monozyten bzw. Makrophagen, die daraufhin Cytokine wie IL-1 und IL-6 freisetzen.
Es besteht daher immer noch ein starkes Bedürfnis nach Substanzen, die in der Lage sind eine unspezifische Immunmodulation erzeugen zu können, da durch eine erhöhte Freisetzung von Cytokinen und Interferonen eine ganze Reihe von Krankheiten bzw. deren Begleitsymptome therapeutisch beeinflußbar sind.
Erfindungsgemäß werden daher wässrige Extrakte bzw. wässrige Suspensionen von Zellwandfraktionen von in der Regel nicht humanpathogenen Mykobacterien mit den Merkmaien der Ansprüche 1 und 2 vorgeschlagen.
Als in der Regel nicht humanpathogene Mykobacterien können unter anderem eingesetzt werden M. tuberculosis var. bovis, M.avium, M.kansasii, M. marinum, M. scrofulaceum, M. intercellulare, M. xenopi, M. fortuitum und M. chelonae ssp.chelone. Diese Stämme sind als solche bekannt und können beispielsweise aus der umfassenden Londoner Stammsammlung des Centre for Public Health Laboratory, National Collection of Type Cultures bezogen werden. Dieses Institut informiert auch über die Kulturbedingungen der jeweiligen Spezies bzw. Subspezies. Die erfindungsgemäß hergestellten Extrakte bzw. Suspensionen haben sich in den ersten klinischen Prüfungen als wirksame Immunmodulatoren erwiesen und können beispielsweise als unterstützende Therapie bei Infektionskrankheiten, neoplastischen Erkrankungen, Asthma bronchiale, Allergien unbekannter Genese und rheumatoider Arthritis eingesetzt werden.
Die Erfindung wird im folgenden anhand der Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1 :
Herstellung des Extraktes bzw. der Zellwandfraktionen
Für die Herstellung des wässrigen Extraktes bzw. der Zellwandfraktion werden 250 ml Flüssigkeitsmedium aus 5 g/Liter Natriumchlorid, 14 g/Liter Pepton, 7 g/Liter Na2HP04 x 2H20, 2 g/Liter KH2PO4, 3 % Glycerin (85%) mit einer Bakterienöse mit einer Mykobacteriengebrauchskultur beimpft und 4 Wochen bei 35 ° C bebrütet. 4,5 g Bakterienfeuchtmasse werden über eine sterile Nutsche mit Glasfritte filtriert und anschließend homogen verrieben. Nach Zugabe von 100 ml sterilisierter isotonischer Natriumchloridlösung beträgt die Keimzahl 9,7 x 10^ KBE pro ml.
Die resuspendierten Bakterienzellen werden bei 12.000 RPM 20 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wird mit Glasperlen trocken vermengt, wiederum in Natriumchloridlösung aufgenommen und mit einer Vibrogen-Zellmühle bei 4 °C 20 Minuten zerschlagen. Nach Abnutschen über eine Glasfritte und einer Zugabe von 3 Tropfen eines Antischaummittels erfolgt eine erneute Zentrifugation (18.000 RPM, 20 Minuten). Der gewonnene Überstand dient der Herstellung des Mykobacterien-Extraktes, das Pellet der Herstellung der Zellwandfraktion.
Bei der Weiterverarbeitung zum Extrakt werden 43 ml des Überstandes 20 Minuten bei 121 ° C autoklaviert und bei 4° C gelagert. Es folgt eine Filtration über Tiefenfilter (EKS) und eine Sterilfiltration (Sterilfilter mit Porengröße 0,54 μm). Abschließend wird der filtrierte Extrakt 2 Stunden bei 80° C im Wasserbad gehalten.
Zur Gewinnung der Zellwandfraktion wird das Pellet in 27 ml isotonischer Natriumchloridlösung resuspendiert. Beispiel 2:
Versuche zur Quantifizierung der Cytokininduktion
Bei diesen Versuchen wird auf eine Reihe von Veröffentlichungen Bezug genommen; die in Klammern gesetzten Ziffern beziehen sich auf die beigefügte Literaturliste.
Zellextrakt und Zellwandfraktion zeigen in einer dosisabhänigen Reaktion eine signifikante Induktion der Cytokine lnterleukin-1 (IL-1 ) und lnterleukin-6 (IL-6). Cytokine sind lebensnotwendige Botenstoffe, die zwischen den Zellen, u.a. den Zellen des immunsystems vermitteln.
IL-1 und IL-6 sind pleiotrope Cytokine, die von verschiedenen Zellen produziert werden und eine zentrale Rolle bei der Immunabwehr und der Hämatopoese einnehmen. Sie bewirken eine Proliferation und Differenzierung von T- und B- Zellen (immunmodulierende Wirkung), die Regulation der Akutphase-Proteine durch die Leber im Rahmen eines Entzündungsprozesses (antiinflammatorische Wirkung) sowie die Stimulation der koloniebildenden Zellen für Megakaryozyten und Megakaryozyten selbst (Regulation der Hämatopoese). Außerdem induziert IL- 1 die Synthese anderer Lymphokine wie IL-4, IL-5 und IL-6.
Isolierung von mononukleären Zellen:
Heparinisiertes Blut aus gesunden Spendern wurde mit Hilfe einer Gradientenzentrifugation über Ficoll isoliert, mehrere Male gewaschen und in serumfreiem RPMI 1640 (1 ) mit L-Glutamin und Antibiotika inkubiert. Zur Cytokinproduktion (2) wurden die verschiedenen Stimuli 24 Stunden mit den Zellen inkubiert. Die Überstände wurden abgenommen, mit Schutzprotein versehen, bei -20° C aufbewahrt und anschließend im entsprechenden Cytokin- Test untersucht.
Isolierung von va.skulären Endothel- und glatten Muskelzpllen: Endothel- und glatte Muskelzellen (EC und SMC) wurden aus Stücken der Vena saphena isoliert, die bei Bypass-Operationen nicht verwendet werden konnten. EC wurden durch Kollagenase-Behandlung (3) und SMC durch eine Auswuchstechnik (4) isoliert. Die Zellen wurden in M199, ECGF und Heparin bzw. DMEM mit 10 % FCS, L-Glutamin und Antibiotika (5, 6, 7) inkubiert. Zur Cytokinproduktion wurden die verschiedenen Stimuli 24 Stunden mit den Zellen inkubiert. Die Überstände wurden abgenommen, mit Schutzprotein versehen, bei -20° C aufbewahrt und anschließend im entsprechenden Cytokin-Test untersucht. 7TD1 -Assav zum Nachweis von IL-6:
Die oben erwähnten Überstände von monoukleären und vaskulären Zellen wurden in 96 Loch Kulturplatten in 8 bis 12 Stufen verdünnt. Zu diesen Verdünnungsreihen wurden 2.000 Zellen/Loch der IL-6-abhängigen murinen B- Zellinie 7TD1 (8) hinzugefügt, ähnlich wie für B9-Zellen beschrieben. Die Kulturen wurden 72 Stunden inkubiert, für weitere 6 Stunden mit radioaktivem Thymidin versehen und die Proliferation der Zellen durch Messung der eingebauten Radioaktivität ermittelt. Die Aktivität der Proben wurde durch Vergleich der Proben mit einem definierten Standard mit Hilfe der Probit-Analyse (9) ermittelt.
Fibroblasten-Assav zum Nachweis von lnterlenkin-1 :
Fibroblasten wurden in 96 Loch Platten kultiviert. Nach 24 Stunden wurde das Medium gewechselt und Proben in Verdünnungsreihen zu den Fibroblastenkulturen hinzugefügt. Nach 72 Stunden wurden die Kulturen mit radioaktivem Thymidin versehen und nach weiteren 24 Stunden ausgewertet wie für 7TD1 Zellen beschrieben.
Ergebnisse;
Der Extrakt induziert dosisabhängig IL-1 (pg/ml) wie folgt:
Konzentration 1 : 4 : 206 pg/ml; 1 : 16 : 1 .250 pg/ml; 1 : 64 : 947 pg/ml; 1 : 1 .024 : 625 pg/ml
Der Extrakt induziert dosisabhängig IL-6 (pg/ml) wie folgt:
Konzentration 1 : 4 : 95.082 pg/ml; 1 : 16 : 1 18.447 pg/ml; 1 : 64 : 76.326 pg/ml; 1 : 1 .024 : 51 .961 pg/ml
Die Zellwandfraktion induziert dosisabhängig IL-1 (pg/ml) wie folgt:
Konzentration 1 : 4 : 103 pg/ml; 1 : 16 : 1 .649 pg/ml; 1 : 64 : 1 .539 pg/ml; 1 : 1 .024 : 54 pg/ml
Die Zellwandfraktion induziert dosisabhängig IL-6 (pg/ml) wie folgt:
Konzentration 1 : 4 : 2.013 pg/ml; 1 : 16 : 41 .71 1 pg/ml; 1 : 64 : 35.374 pg/ml; 1 : 1 .024 : 19.331 pg/ml Literatur
1. Loppno , H. , H. Brade, I. Dürrbaum, C. A. Dinarello, S. usumoto, E. T. Rietschel and H.-D. Flad. 1989.
IL1 induction capacity of defined lipopolysaccharide partial structures. J. Immunol. 142: 3229 - 3238.
2. Loppnow, H., H. Brade, E. T. Rietschel and H.-D. Flad. 1994. Induction of cytokines in mononuclear and vascular cells by endctoxin and other bacterial products. In : Virginia L. Clark anc Patrik M. Bavoil (eds.), Methods in Enzy ology; Bacterial pathogenesis, Part B; Interaction of pathogenic bacteria with host cells. Academic Press, Orlando. In press.
3. Jaffe, E. A. , R. L. Nachmann, C. G. Becker and C. R. Minick. 1973. Culture of human endothelial cells derived fro umbilical veins. J. Clin. Invest. 52: 2745 - 2756.
4. Ross, R. and B. Kariya. 1980. Morphogenesis of vascular smooth muscle in atherosclerosis and cell structure. In : "Handbook of Physiology" The Cardiovascular System, Section 2.
(D. F. Bohr, A. P. Somlyo and H. Y. Sparks, eds.), American
Physiological Society, Bethesda. p. 66 - 91.
5. Loppnow, H. and P. Libby. 1989. Adult human vascular endo¬ thelial cells express the IL6 gene differentially in response to LPS or IL1. Cell. Immunol. 122: 493 - 503.
6. Loppnow, H. and P. Libby. 1990. Proliferating or Inter¬ leukin 1-activated Human Vascular Smooth Muscle Cells Secrete Copious Interleukin 6. J. Clin. Invest. 85:
731 - 738."
7. Loppnow, H. and P. Libby. 1992. Functional significance of human vascular smooth muscle cell-derived interleukin 1 in paracrine and autocrine regulation pathways. Exp. Cell Res. 198: 283 - 290.
8. Van Snick, J. , S. Cayphas, A. Vink, C. Uyttenhove, P. G. Coulie, M. R. Rubira and R. J. Simpson. 1986. Purification and NH2-rerminal amino acid sequence of a T-cell derived lymphokine with growth factor activity for B-cell hybridomas. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 9679 - 9683.
9. Gillis, S., M. M. Ferm, W. Ou and K. A. Smith. 1978.
T-cell growth factor: parameters for produetion and a quantitative microassay for activity. J. Immunol. 120: 2027 - 2032.
RSATZBLÄTT(REGEL26)

Claims

Patentansprüche
1 . Wässriger Extrakt aus in der Regel nicht menschenpathogenen Mykobakterien, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt im Cytokintest nach J. Immunol. 120 : 2027 - 2032 bei einer Konzentrationsänderung von 1 : 4 auf 1 : 16 eine Erhöhung des Gehaltes an Cytokinen IL-1 und IL-6 im Verhältnis von 1 : 6 bzw. 1 : 1 ,25 ergibt.
2. Wässrige Suspension von Zellwandfraktionen von in der Regel nicht humanpathogenen Mykobakterien, dadurch gekennzeichnet, daß diese Fraktionen im Cytokintest nach J. Immunol. 120 : 2027 - 2032 bei einer Konzentrationsänderung von 1 : 4 auf 1 : 16 IL-1 und IL-6 Cytokine im Verhältnis von 1 : 16 bzw. 1 : 20 induzieren.
3. Verfahren zur Herstellung eines wässrigen Extraktes bzw. einer wässrigen Suspension von Zellwandfraktionen von in der Regel nicht menschenpathogenen Mykobakterien, dadurch gekennzeichnet, daß die Mykobakterien 4 Wochen bei 35 ° Celsius auf einem Peptonagar bebrütet, vom Nährmedium abfiltriert, in isotonischer Kochsalzlösung resuspendiert und dann 20 Minuten bei 12.000 RPM zentrifugiert, das Sediment in Kochsalzlösung aufgenommen und bei 4 ° Celsius in einer Zellmühle zermahlen und erneut 20 Minuten bei 18.000 RPM zentrifugiert und der Überstand abgetrennt, autoklaviert und sterilfiltriert und anschließend bei 80 ° Celsius für eine Zeitspanne von 2 Stunden gehalten wird.
PCT/EP1995/002524 1994-06-30 1995-06-29 Wässrige zellextrakte und wässrige suspensionen von zellwandfraktionen aus mykobacterien WO1996000579A1 (de)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP95924332A EP0804211A1 (de) 1994-06-30 1995-06-29 Wässrige zellextrakte und wässrige suspensionen von zellwandfraktionen aus mykobacterien
KR1019960707482A KR970703777A (ko) 1994-06-30 1995-06-29 마이코박테리아의 세포벽 분획으로 구성된 수성 현탁액 및 수성 세포 추출물(aqueous cell extracts and aqueous suspensions of cell wall fractions from mycobacteria)
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AU28884/95A AU2888495A (en) 1994-06-30 1995-06-29 Aqueous cell extracts and aqueous suspensions of cell wall fractions from mycobacteria
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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998020900A1 (en) * 1996-11-13 1998-05-22 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Bi Mycobacterium cell wall compositions
US6013485A (en) * 1996-05-07 2000-01-11 Thymopharma, Ag Low-molecular weight active ingredient extract from yeasts and method for producing it
AU726734B2 (en) * 1996-11-13 2000-11-16 Centenary Institute Of Cancer Medicine & Cell Biology Mycobacterium cell wall compositions
WO2001048154A1 (en) * 1999-12-28 2001-07-05 Toyoshima, Kumao Maturation-promoting agent for immature dendritic cells
WO2001049319A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-12 Erika Mutius Von Zusammensetzung, enthaltend bakterielle antigene, zum vorbeugen und behandeln von allergischen erkrankungen
WO2003075827A3 (en) * 2002-03-13 2003-12-24 Bakulesh Mafatlal Khamar Use of mycobacterium w in the treatment of asthama(obstructive lung disease)
US6896887B2 (en) 2001-06-11 2005-05-24 Applied Nanosystems B.V. Bacterial ghosts provided with antigens
DE202007003266U1 (de) 2007-03-02 2008-07-17 Bufe, Albrecht, Prof. Dr. Med. Pharmazeutische Zusammensetzung zum Schutz vor Allergien und entzündlichen Erkrankungen
US9375444B2 (en) 2008-08-16 2016-06-28 Protectimmun Gmbh Composition for prevention and treatment of allergic and/or inflammatory diseases
US9950017B2 (en) 2007-03-02 2018-04-24 Forschungszentrum Borstel Pharmaceutical composition for protection from allergies and inflammatory disorders
US20220047630A1 (en) * 2018-12-14 2022-02-17 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Barn dust extract for the prevention and treatment of diseases

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002066055A1 (en) * 2001-02-20 2002-08-29 Maruho Co., Ltd. NOVEL MEDICINAL USE OF α ANTIGEN OR α ANTIGEN GENE
EP1637147B1 (de) * 2004-09-18 2008-12-10 Protectimmun GmbH Stallstaub-Extrakt zum Schutz vor Allergien
CN103354833B (zh) * 2010-10-13 2016-11-16 特莱斯塔治疗知识产权公司 细菌核糖核酸细胞壁组合物及其制备和使用方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3172815A (en) * 1962-04-24 1965-03-09 Warner Lambert Pharmaceutical Method for preparing reticulo-endo-thelial system stimulant and stimulant thereof
GB2015876A (en) * 1978-03-10 1979-09-19 Mitsui Toatsu Chemicals Bacterial extracts of mycobacterium microorganisms
WO1987002249A1 (en) * 1985-10-08 1987-04-23 Ragland William L Antiviral immunotherapeutic agent and preparation thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3172815A (en) * 1962-04-24 1965-03-09 Warner Lambert Pharmaceutical Method for preparing reticulo-endo-thelial system stimulant and stimulant thereof
GB2015876A (en) * 1978-03-10 1979-09-19 Mitsui Toatsu Chemicals Bacterial extracts of mycobacterium microorganisms
WO1987002249A1 (en) * 1985-10-08 1987-04-23 Ragland William L Antiviral immunotherapeutic agent and preparation thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARNES, P.F. ET AL: "Cytokine production induced by Mycobacterium tuberculosis Lipoarabinomannan", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 149, no. 2, BALTIMORE US, pages 541 - 547 *
STEVEN GILLIS ET AL: "T cell growth factor: Parameters of production and a quantitative microassay for activity", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 120, no. 6, BALTIMORE US, pages 2027 - 2032 *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6013485A (en) * 1996-05-07 2000-01-11 Thymopharma, Ag Low-molecular weight active ingredient extract from yeasts and method for producing it
WO1998020900A1 (en) * 1996-11-13 1998-05-22 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Bi Mycobacterium cell wall compositions
AU726734B2 (en) * 1996-11-13 2000-11-16 Centenary Institute Of Cancer Medicine & Cell Biology Mycobacterium cell wall compositions
US7083798B1 (en) 1996-11-13 2006-08-01 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Biology Method of immunomodulatory treatment of insulin dependent diabetes mellitus using mycobacterial cell wall compositions
WO2001048154A1 (en) * 1999-12-28 2001-07-05 Toyoshima, Kumao Maturation-promoting agent for immature dendritic cells
WO2001049319A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-12 Erika Mutius Von Zusammensetzung, enthaltend bakterielle antigene, zum vorbeugen und behandeln von allergischen erkrankungen
US6896887B2 (en) 2001-06-11 2005-05-24 Applied Nanosystems B.V. Bacterial ghosts provided with antigens
US7067639B2 (en) 2001-06-11 2006-06-27 Applied Nanosystems B.V. Method to provide bacterial ghosts provided with antigens
US7541039B2 (en) 2001-06-11 2009-06-02 Applied Nanosystems, B.V. Immunization with bacterial ghost-based vaccines
US7858357B2 (en) 2001-06-11 2010-12-28 Applied Nanosystems B.V. Immunization with bacterial ghost-based vaccines
WO2003075827A3 (en) * 2002-03-13 2003-12-24 Bakulesh Mafatlal Khamar Use of mycobacterium w in the treatment of asthama(obstructive lung disease)
DE202007003266U1 (de) 2007-03-02 2008-07-17 Bufe, Albrecht, Prof. Dr. Med. Pharmazeutische Zusammensetzung zum Schutz vor Allergien und entzündlichen Erkrankungen
US9950017B2 (en) 2007-03-02 2018-04-24 Forschungszentrum Borstel Pharmaceutical composition for protection from allergies and inflammatory disorders
US9375444B2 (en) 2008-08-16 2016-06-28 Protectimmun Gmbh Composition for prevention and treatment of allergic and/or inflammatory diseases
US20220047630A1 (en) * 2018-12-14 2022-02-17 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Barn dust extract for the prevention and treatment of diseases

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