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WO1995032985A1 - 3'-(4'-)nicht-radioaktiv markierte nukleoside und nukleotide mit aminocarbonsäure-, peptid- oder carbonsäure-spacer - Google Patents

3'-(4'-)nicht-radioaktiv markierte nukleoside und nukleotide mit aminocarbonsäure-, peptid- oder carbonsäure-spacer Download PDF

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WO1995032985A1
WO1995032985A1 PCT/EP1995/001950 EP9501950W WO9532985A1 WO 1995032985 A1 WO1995032985 A1 WO 1995032985A1 EP 9501950 W EP9501950 W EP 9501950W WO 9532985 A1 WO9532985 A1 WO 9532985A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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compounds
amino
group
mmol
general formula
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP1995/001950
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Konrad Faulstich
Siegfried Brandtner
Rainer Wechselberger
Joachin Engels
Christian Griesinger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Boehringer Mannheim GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Boehringer Mannheim GmbH
Priority to JP8500261A priority Critical patent/JPH10500963A/ja
Priority to EP95920863A priority patent/EP0763051A1/de
Publication of WO1995032985A1 publication Critical patent/WO1995032985A1/de
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J51/00—Normal steroids with unmodified cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton not provided for in groups C07J1/00 - C07J43/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
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    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure
    • C07K9/005—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure containing within the molecule the substructure with m, n > 0 and m+n > 0, A, B, D, E being heteroatoms; X being a bond or a chain, e.g. muramylpeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to nucleosides, nucleotides and oligonucleotides modified in the 3 '- (4'-) position with non-radioactively labeled groups, a process for their preparation and their use.
  • Labeled nucleotides have found an extraordinarily large number of applications in genetic engineering, since their use is easier than that of the DNA probes conventionally used as hybridization samples, which are produced by restriction digestion from native genetic material.
  • Modified oligonucleotides which are used in the form of so-called “antisense” DNA oligonucleotides, can intervene in a regulating manner in the cell process and thus gain z.
  • Labeled oligonucleotides e.g. B. the identification of gene fragments within a gene bank by probing and identifying blotted gene samples from the gene bank with the aid of a labeled oligonucleotide.
  • derivatized fluorescent dyes are used as a form of non-radioactive labeling, which offer the possibility of easier and safer handling.
  • the fluorescence label was either at the 5 'end of the nucleotide [L. E. Hood, L. M. Smith and C. Heiner, Nature 321, 674 (1986)] or on the nucleobase [J. M. Prober, G.L. Trainor and R.J. Dam, Science 238, 336 (1987)] [G. L. Trainor, Anal. Chem. 62, 418 (1990)].
  • This has the disadvantages that only certain polymerases can be used for the synthesis, the acceptance of the triphosphates by the polymerases decreases and that a large excess of substrate is also necessary.
  • a fluorescent dye is coupled directly via an amino or thiol group in the 3 'position of a nucleoside, nucleotide or oligonucleotide, and this compound is advantageous for the synthesis of counter-strands in the presence of a template strand and for the detection of genetic strands
  • Material in vivo and in vitro can be used (EP 0 490 281).
  • these compounds are associated with the disadvantage that the quantum yield is relatively low and the synthesis of the compounds is associated with lengthy, complex chromatographic purification steps.
  • the object of the present invention was therefore to make available new non-radioactive labeled nucleosides or nucleotides which do not have the disadvantages of the known compounds.
  • the problem is solved by nucleosides or nucleotides of the following general formula modified at the 3 'or 4' position:
  • R ' hydrogen, mono-, di- or triphosphate, alkylphosphonate, dialkylphosphinate or phosphoramidite
  • X oxygen, nitrogen, carbon or sulfur
  • Y oxygen, nitrogen or sulfur
  • Z hydrogen, hydroxyl, amino or thiol group
  • R spacer group, followed by a non-radioactive, detectable
  • Base purine, pyrimidine base or desazapurins or their derivatives, n: 0 or 1.
  • the spacer grouping preferably consists of a protected or unprotected bi-, tri- or polyfunctional carboxylic acid, aminocarboxylic acid or a peptide or corresponding derivatives or salts.
  • Particularly preferred spacers are all naturally occurring amino acids, such as, for example, glycine or aspartic acid, carboxylic acids or aminocarboxylic acids having 2 to 20 atoms, but also diamines, thiols and amino alcohols.
  • Dimers or tetramers of amino acid units have proven to be very particularly suitable for spacer groups; furthermore if the spacer group has a length which corresponds to a carbon lette of 2 to 12 atoms.
  • All chemically, physically or biologically detectable groups come into consideration as non-radioactive, detectable groups, so-called reporter molecules.
  • reporter molecules Such groupings are known to the person skilled in the art.
  • effector molecules are also suitable here, which are capable, directly or after chemical, physical or biological activation, of interactions of a chemical, physical or biological nature with certain target molecules (such as alkylating agents, ⁇ systems of aromatic compounds, enzymes, etc.).
  • Examples include the intercalation on DNA / RNA by acetylaminofluorenes, cleavage of DNA / RNA by nucleases or the partial or complete covalent binding of alkyl or alyl groups to DNA / RNA by alkylating agents or psoralenes, and z.
  • metal clusters that locally lead to a sharp increase in the cross-section of therapeutically effective electromagnetic radiation.
  • luminescent dyes which emit in the wavelength range from approximately 630 to 670 ⁇ m
  • enzymes such as peroxidase or alkaline phosphatase and haptens, such as, for example, biotin, come as reporter molecules.
  • fluorophers have proven to be suitable here, e.g. B. for Sanger sequencing.
  • the compounds substituted with effector groups are of particular value in particular for antisense therapy.
  • the OH group, amino or thiol group of a nucleoside, nucleotide or oligonucleotide located in the 3 'and / or 4' position is coupled to a spacer group, such as an aminocarboxylic acid, carboxylic acid or a peptide, and then a reporter or effector molecule attached.
  • a spacer group such as an aminocarboxylic acid, carboxylic acid or a peptide
  • the resulting 3'- or 4'-hydroxyl-, amino- or TT ⁇ iol-modified nucleosides, nucleotides and oligonucleotides can then be used for the synthesis of counter-strands in the presence of a natural or synthetic template strand as well as for the detection of certain sequences or the localization of a Effector molecule to be used at certain sequences in genetic material.
  • Another object of the invention is a method for producing the 3 * - (4 '-) modified nucleosides or nucleotides according to the general formula (1).
  • Base Carrier I ((LLiirnker) -X
  • Base purine, pyrimidine base or desazapurins or their derivatives, n: 0 or 1
  • nucleoside derivative is cleaved from the support matrix and, if appropriate, the 5'- Position.
  • the conversion to nucleosides bound to a solid support via a linker in the 5 '- (6' -) position can moreover be carried out by other methods known to the person skilled in the art.
  • All selectively cleavable anchor groups can be used as the linker group [z. BGB Fields and RL Noble, Int. J. Peptide Prot. Res. 35: 165-171 (1990)].
  • Groupings which can be cleaved under mild conditions, such as, for example, photochemically, by hydrogenation or in the acidic or alkaline range, have proven particularly suitable proven.
  • Preferred linker groups are trityl groups, which may be substituted. Methoxy and halogen radicals are suitable substituents here.
  • Dimethoxy and o-chlorotrityl groups have proven to be particularly suitable here.
  • the basic procedure for linking the linker grapple with the 5 'or 6' position of nucleosides is known to the person skilled in the art (MJ Gait: "Oligonucleotide synthesis; a practical approach”; IRL Press, Oxford, Washington DC (1984 ), P. 12 ff).
  • any solid, chemically inert material which is insoluble in the solvent used in each case and which should be as easy to filter as possible is suitable as the support material according to the invention.
  • Preferred carrier materials are inorganic, polymeric materials (resins) based on polystyrene or polyethylene glycol.
  • nucleosides bound to solid supports are then mixed with a corresponding carboxylic acid, aminocarboxylic acid or peptide derivative in the presence of an activation reagent, such as, for example, condensing agents such as DCC, DIC or HOBT.
  • an activation reagent such as, for example, condensing agents such as DCC, DIC or HOBT.
  • one or more identical or different reporter Zeffector molecules are introduced covalently selectively in the side chain or C or N-te ⁇ ninal, for example via esterification, amidation, sulfonamidation, sulfonic acid esterification or by reaction with isothiocyanates or N-hydroxysuccinimide esters.
  • Appropriate methods are known to the person skilled in the art.
  • the nucleoside derivatives are preferably cleaved from the linker group under weakly acidic, basic, photochemical or reductive conditions.
  • Nucleoside derivatives which have one or more protective groups or side chains on the spacer group can be prepared accordingly.
  • the nucleoside derivatives prepared in this way can then be converted into the corresponding 5'- or 6'-mono-, di- or triphosphates (nucleotides), alkylphosphonates, dialkylphosphinates or phosphoramidite by methods known to those skilled in the art.
  • the synthesis of the 5'- or 6'-modified nucleosides according to the invention is particularly advantageous because, unlike in known processes, a large excess of the dye component can be used without problems and can be easily separated off. For the previously known processes, lengthy and expensive chromatographic purification steps follow the actual production process for separating the unreacted dye.
  • the compounds of the general formula (1) according to the invention can advantageously be used as substrates for DNA / RNA polymerases by means of a primer and a template strand and in the presence of the four nucleoside triphosphates.
  • Suitable polymerases here are T7, Taq polymerase, DNA polymerase I and reverse transcriptases.
  • the compounds are also suitable as terminators in enzymatic DNA RNA sequencing.
  • the termination of the synthesis can in each case be determined specifically by using a 3 '- (4' -) modified A, C, G, T nucleotide of the formula (1). This is of particular importance for the synthesis of DNA counter-strands in the presence of a template strand (and thus also for the sequencing of DNA strands), since the use of a modified nucleotide ensures a very base-specific termination of the reaction.
  • RNA nucleosides and oligonucleotides takes place in an analogous manner.
  • the derivatizable oligonucleotides can be synthesized using a start nucleotide which has a spacer group at the 3 '- (4') end and has been amino- or thiovariated and fixed to a polymeric support.
  • All DNA and RNA nucleotides produced in the conventional sense are considered oligonucleotides, but preferably in a length of 2 to 100, particularly preferably 12 - 50 nucleotides (chemical synthesis) or in a length of up to approx. 3,000 nucleotides (enzymatic synthesis), depending on the efficiency of the used
  • the oligonucleotide synthesis takes place, starting from the starting nucleotide-carrier complex, in the conventional sense, i. H. in the 3 'and 5' direction and enables the synthesis of an oligonucleotide of a defined sequence.
  • the start nucleoside is fixed to commercially available carriers via a connecting arm (spacer) which can be cleaved after synthesis; for example via the succinic acid linkage known from the literature or else via a linkage with urethane (Efimov et al, Nucl. Acids. Res. 11, 8369, 1983).
  • the oligonucleotide After synthesis has taken place, the oligonucleotide must be cleaved from the support using suitable reagents. The derivatization with any fluorescent dye takes place immediately afterwards.
  • the reverse synthesis direction (5 1 -. 3 ') of oligonucleotides is also possible in that the starting nucleoside is linked to the linker grouping of the support material via the 5'-OH group and the procedure is analogous to conventional oligonucleotide synthesis.
  • the dye labeling of the oligonucleotide can take place on the solid phase.
  • oligonucleotides thus synthesized and modified at the 3 '(4') end can then be used for the detection of e.g. B. complementary oligonucleotides or nucleic acids and corresponding derivatives can be used.
  • the compounds according to the invention are also suitable as in vivo and in vitro sensors in analysis and as gene probes in gene therapy and for related analytical purposes.
  • Example 1 The following examples further illustrate the invention: Example 1:
  • the coated resin is filtered off and washed several times with DMF, DCM, isopropanol and finally with diethyl ether. After drying in an oil pump vacuum, the amino acid loading is determined using the quantitative ninhydrin test (Example 7b) or by UV spectrometric determination of the Fmoc elimination. By varying the amount of amino acid, amino acid loads between 0.05 and 1.1 mmol / g are obtained.
  • Orthogonality of the protective groups also allows the introduction of one or more identical or different fluorescent dyes selectively into the side chain or N-terminal.
  • the introduction of fluorescent dyes into the side chain of trift-functional amino acids proceeds analogously to the N ⁇ coupling, but the proportion of DMAP must be increased.
  • the ester cleavage is carried out under weakly acidic conditions. Approx. 20 ml of a mixture of glacial acetic acid / TFE / DCM in a ratio of (v / v / v 1: 2: 7) [K. Barlos, O. Chatzi, D. Gatos, G. Stauropoulos, Int. J. Peptide Prot. Res. 37, (1991), 513-520].
  • the cleavage time is usually approximately 90 minutes. If no His (N TM 1 Trt) residue is contained, it can be split off with a mixture of DCM / TFE (v / v 1: 1).
  • the resin is then filtered off and the peptide solution is made up with about 100 ml of water. The added water prevents the acetic acid from concentrating when the volatile components are subsequently distilled off on a rotary evaporator.
  • the hydrophobic amino acid and peptide derivatives are precipitated on spinning in and are now dried in the freeze dryer.
  • the resin loading is carried out with the quantitative ninhydrin test, in the case of the 3'-amino nucleotides (example 7b), by UV spectrometric determination after suitable derivatization of the 3'-functionality of the nucleoside or by weighing the resin certainly.
  • the amount of nucleosides resin loads between 0.1 and 1 mmol g are obtained.
  • the ether cleavage is carried out under acidic conditions. About 1 ml of a solution of dichloroacetic acid / DCM in a ratio of (v / v 3:97) is used per 1 g of loaded resin. The split-off time is approx. 1 min. The resin is then filtered off and the product solution is immediately neutralized with an equimolar solution of DIEA DCM in the ratio (v / v 63: 937). The resin is washed several times with a little ACN. About 10 ml of water are added. The product is now dried in the freeze dryer.
  • Solution 1 A solution of 80 g phenol in 20 ml ethanol.
  • Solution 2 A 2% solution of 33 mg potassium cyanide KCN in 50 ml water in pyridine.
  • Solution 3 A solution of 500 mg ninhydrin in 10 ml ethanol
  • Fluoresscein - 5 aminothiono-N-triglycylglycine (FITC-Gly 4 (OH)) 5
  • Vydac RP18 column 5 ⁇ m, 300A, 4 x 250 mm
  • Vydac RP18 column 5 ⁇ m, 300A, 4 x 250 mm
  • Vydac RP18 column 5 ⁇ m, 300A, 4 x 250 mm
  • Example 17 compound 9 was built up successively on the support (1. coating of the resin with thymidine, 2. coupling of a (Fmoc) amino acid, 3. deprotection of the amino acid, 4. coupling of the dye).
  • Triphosphate synthesis was carried out according to [Ludwig, Eckstein, J. Org. Chem. 54,
  • the carrier resin was cleaved off and the 5'-triphosphate was obtained after phosphorylation.
  • each mix also contains: 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, 50 mM NaCl, 40 mM Tris • HC1, pH 7.5) pipetted into four reaction vessels and at least 1 minute at approx. 37 ° C warmed up. Then 3.8 ⁇ l of the first mix (annealing mix) are pipetted into the preheated termination mixes.
  • a stop reagent deionized formamide solution, dextran blue
  • the reaction solutions are heated for 2 minutes at about 90 ° C and to a 6% denaturing Sequence gel added to the individual pockets (a 6 ⁇ l). The individual DNA fragments were then detected and identified using a fluorescence detection device.

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Abstract

An der 3'-(4'-)Position modifizierte Nukleoside bzw. Nukleotide der allgemeinen Formel (1), wobei R': Wasserstoff, Mono-, Di- oder Triphosphat, Alkylphosphonat, Dialkylphosphinat oder Phosphoramidit; X: Sauerstoff, Stickstoff, Kohlenstoff oder Schwefel; Y: Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel; Z: Wasserstoff, Hydroxyl-, Amino- oder Thiolgruppe; R: Spacergruppierung, woran eine nicht-radioaktive, detektierbare Gruppe oder ein Effektormolekül gebunden ist; Base: Purin, Pyrimidinbase oder Desazapurine oder deren Derivate darstellen; n: 0 der 1 ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen sowie deren Verwendung in der Nukleinsäureanalytik und zur Herstellung von Arzneimitteln. Insbesondere 3'-Amino-3'-desoxynukleotidfluoreszeine, in denen die Fluoreszeingruppe über mono-, di- und tetra-Glycineinheiten an den Zucker gebunden ist, haben sich als vorteilhaft bei der Sequenzierung erwiesen.

Description

3 '-(4'-) nicht-radioaktiv markierte Nukleoside und Nukleotide mit Aminocarbonsäure-, Peptid- oder Carbonsäure-Spacer
Die Erfindung betrifft in 3 '-(4'-) Position mit nicht-radioaktiv markierten Gruppen modifizierte Nukleoside, Nukleotide und Oligonukleotide, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie ihre Verwendung.
Markierte Nukleotide haben in der Gentechnologie außerordentlich viele Anwen¬ dungen gefunden, da ihre Anwendung leichter ist als die der herkömmlich als Hy- bridisierungsproben verwendeten DNA-Sonden, die durch Restriktionsverdau aus nativem Genmaterial hergestellt werden.
Modifizierte Oligonukleotide, die in Form von sogenannten "antisense" -DNA- Oligonukleotiden eingesetzt werden, können regulierend in das Zellgeschehen ein¬ greifen und gewinnen damit z. B. für die in vivo-Untersuchung der Expression von Proteinen sowie in der Krebs-, Virus- und Gentherapie immer größere Bedeutung. Der Mechanismus läuft dabei über DNA-DNA-, DNA-RNA- und RNA-RNA- Wechselwirkungen ab, bedarf im einzelnen aber noch vollständiger Klärung.
In vitro dienen markierte Oligonukleotide, z. B. der Identifizierung von Genfrag¬ menten innerhalb einer Genbank, indem man mit Hilfe eines markierten Oligo- nukleotids geblottete Genproben der Genbank sondiert und identifiziert.
Neben der radioaktiven Markierung durch geeignete Isotope werden als Form einer nicht-radioaktiven Markierung beispielsweise derivatisierte Fluoreszenzfarbstoffe verwendet, die die Möglichkeit einer leichteren und ungefährlicheren Handhabung bieten.
Bislang wurde eine solche Technik erfolgreich zur nicht-radioaktiven Sequenzie¬ rung von DNA angewendet. Hier sind im wesentlichen auf der Methode von Sanger [F. Sanger, S. Nicklen und S. Coulsen, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463 (1977)] basierende Ansätze durchgeführt worden.
Das Fluoreszenzlabel wurde dabei entweder am 5'-Ende des Nukleotids [L. E. Hood, L. M. Smith und C. Heiner, Nature 321, 674 (1986)] oder an der Nukleobase [J. M. Prober, G. L. Trainor und R. J. Dam, Science 238, 336 (1987)] angebracht [G. L. Trainor, Anal. Chem. 62, 418 (1990)]. Dies ist mit den Nachteilen verbunden, daß nur bestimmte Polymerasen für die Synthese eingesetzt werden kön¬ nen, die Akzeptanz der Triphosphate durch die Polymerasen sinkt und daß außer¬ dem ein großer Substratüberschuß notwendig ist.
Auch die chemische Sequenzierung nach Maxam-Gilbert mit Fluoreszenzlabel ist bekannt [H. Voss, C. Schwager, U. Wirkner, B. Sproat, J. Zimmermann,
A. Rosenthal, H. Erfle, J. Stegmann und W. Ansorge, Nucl. Acids. Res. 17, 2517
(1989)].
Außerdem ist bekannt, daß ein Fluoreszenzfarbstoff direkt über eine Amino- oder Thiolgruppe in 3' -Position eines Nukleosids, Nukleotids oder Oligonukleotids ge¬ koppelt und diese Verbindung vorteilhaft für Synthese von Gegensträngen in An¬ wesenheit eines Template-Stranges sowie für die Detektion von genetischem Mate¬ rial in vivo und in vitro eingesetzt werden kann (EP 0 490 281). Diese Verbindun¬ gen sind jedoch mit dem Nachteil verbunden, daß die Quantenausbeute relativ gering ist und die Synthese der Verbindungen mit langwierigen, aufwendigen chromatographischen Reinigungsschritten verbunden ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, neue nicht-radioaktiv markierte Nukleoside bzw. Nukleotide zur Verfugung zu stellen, die die Nachteile der vorbe¬ kannten Verbindungen nicht aufweisen. Gelöst wird die Aufgabe durch an 3'- bzw. 4'-Position modifizierte Nukleoside bzw. Nukleotide der folgenden allgemeinen Formel:
Base
Figure imgf000005_0001
wobei: R': Wasserstoff, Mono-, Di- oder Triphosphat, Alkylphosphonat, Dial- kylphosphinat oder Phosphoramidit
X: Sauerstoff, Stickstoff, Kohlenstoff oder Schwefel Y: Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel Z: Wasserstoff, Hydroxyl-, Amino- oder Thiolgruppe R: Spacergruppierung, woran eine nicht-radioaktive, detektierbare
Gruppe oder ein Effektormolekül gebunden ist
Base: Purin, Pyrimidinbase oder Desazapurine oder deren Derivate darstellen, n: 0 oder 1 ist.
Die Spacergruppierung besteht vorzugsweise aus einer geschützten oder unge¬ schützten bi-, tri- oder polyfunktionellen Carbonsäure, Aminocarbonsäure oder einem Peptid bzw. entsprechenden Derivaten oder Salzen. Besonders bevorzugte Spacer stellen alle natürlich vorkommenden Aminosäuren, wie beispielsweise Glycin oder Asparaginsäure, Carbonsäuren bzw. Aminocarbonsäuren mit 2 bis 20 Atomen, aber auch Diamine, Thiole und Aminoalkohole dar.
Als ganz besonders geeignet für Spacergruppierungen haben sich Di- bzw. Tetra- mere von Aminosäureeinheiten erwiesen; desweiteren, wenn die Spacergruppierung eine Länge aufweist, die einer Kohlenstoffl ette von 2 bis 12 Atomen entspricht. Als nicht-radioaktive, detektierbare Gruppe, sogenannte Reportermoleküle, kommen alle chemisch, physikalisch oder biologisch nachweisbaren Gruppen in Betracht. Solche Gruppierungen sind dem Fachmann bekannt. Auch sind hier sogenannte Effektormoleküle geeignet, die direkt oder nach chemischer, physikalischer oder biologischer Aktivierung zu Wechselwirkungen chemischer, physikalischer oder biologischer Art mit bestimmten Zielmolekülen in der Lage sind (wie Alkylierungs- mittel, π-Systeme aromatischer Verbindungen, Enzyme usw.). Beispielhaft sei hier die Interkalation an DNA/RNA durch Acetylaminofluorene, Spaltung von DNA/RNA durch Nukleasen oder die teilweise oder vollständige kovalente Bindung von Alkyl- oder Aiylgruppen an DNA/RNA durch Alkylierungsmittel oder Psora- lene, sowie z. B. Metallcluster, die lokal zu einer starken Erhöhung des Ein¬ fangquerschnitts von therapeutisch wirksamer elektromagnetischer Strahlung füh¬ ren, genannt. Als Reportermoleküle kommen insbesondere Lumineszenzfarbstoffe, die im Wellenlängenbereich von ca. 630 bis 670 um emittieren, Enzyme, wie Peroxidase oder alkalische Phosphatase und Haptene, wie beispielsweise Biotin. Iminobiotin oder Digoxxigenin, in Betracht. Insbesondere haben sich hier Fluorophere als geeignet erwiesen, z. B. für die Sequenzierung nach Sanger. Die mit Effektorgruppen substituierten Verbindungen sind insbesondere für die Antisense- Therapie von besonderem Wert.
Die in 3'- und/oder 4'-Position befindliche OH-Gruppe, Amino- oder Thiolgruppe eines Nukleosids, Nukleotids oder Oligonukleotids wird mit einer Spacergruppe, wie beispielsweise eine Aminocarbonsäure, Carbonsäure oder einem Peptid, ge¬ koppelt und anschließend ein Reporter- oder Effektormolekül angeknüpft. Die ent¬ standenen 3'- bzw. 4' -Hydroxyl-, Amino- oder TTιiol -modifizierten Nukleoside, Nukleotide und Oligonukleotide können dann für die Synthese von Gegensträngen in Anwesenheit eines natürlichen oder synthetischen Templatestranges sowie für die Detektion bestimmter Sequenzen oder die Lokalisierung eines Effektormoleküls an bestimmte Sequenzen in genetischem Material verwendet werden. Sie bieten ins¬ besondere den Vorteil, daß die Modifizierung nicht mehr, wie in bisher bekannten Markierungstechniken, am 5'-Ende des Nukleotids oder an der Nukleobase ange¬ bracht wird. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der 3*- (4'-)modifizierten Nukleosiden bzw. Nukleotiden gemäß der allgemeinen For¬ mel (1). Verbindungen der allgemeinen Formel (2)
Base Träg eerr I —— ((LLiirnker)-X
Figure imgf000007_0001
wobei: Linker: eine selektiv spaltbare Ankergruppierung
X: Sauerstoff, Stickstoff, Kohlenstoff oder Schwefel
Y: Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel
Z: Wasserstoff, Hydroxyl-, Amino- oder Thiolgruppe
R: Wasserstoff
Base: Purin, Pyrimidinbase oder Desazapurine oder deren Derivate darstellen, n: 0 oder 1 ist
über die Linker-Gruppierung an einen festen Träger gebunden werden, eine gegebenenfalls durch Schutzgruppen versehene bi-oder polyfunktionelle Verbindung, anschließend eine gegebenenfalls reaktivierte, detektierbare Signalkomponente zugegeben wird, die Abspaltung des Nukleosidderivats von der Trägermatrix vorgenommen wird und gegebenenfalls eine Derivatisierung der 5'- Position erfolgt.
Die Umsetzung zu über einen Linker in 5'-(6'-)Position an einen festen Träger ge¬ bundenen Nukleosiden kann darüber hinaus nach anderen, dem Fachmann bekann¬ ten, Methoden erfolgen. Als Linker-Gruppierung können sämtliche selektiv spaltba¬ ren Ankergruppierungen verwendet werden [z. B. G. B. Fields und R. L. Noble, Int. J. Peptide Prot. Res. 35 (1990), 165 - 171]. Gruppierungen, die unter schonen¬ den Bedingungen spaltbar sind, wie beispielsweise photochemisch, durch Hydrie¬ rung oder im sauren bzw. alkalischen Bereich, haben sich als besonders geeignet erwiesen. Bevorzugte Linker-Gruppen sind Tritylgruppierungen, die gegebenenfalls substituiert sein können. Methoxy- und Halogenreste sind hier geeignete Substitu- enten. Dimethoxy- und o-Chlortritylgruppen haben sich hier als besonders geeignet erwiesen. Außerdem ist das prinzipielle Vorgehen für die Verknüpfung der Linker- grappierung mit der 5'- bzw. 6'-Position von Nukleosiden dem Fachmann bekannt (M.J. Gait: "Oligonucleotide synthesis; a practical approach"; IRL Press, Oxford, Washington DC (1984), S. 12 ff).
Als Trägermaterial ist erfindungsgemäß jedes feste, chemisch inertes Material ge¬ eignet, welches unlöslich in dem jeweils verwendeten Lösungsmittel ist und mög¬ lichst leicht filtrierbar sein sollte. Bevorzugte Trägermaterialien sind anorganische, polymere Materialien (Harze) auf Polystyrol- bzw. Polyethylenglykolbasis.
In dieser Art an feste Träger gebundene Nukleoside werden anschließend mit einem entsprechenden Carbonsäure-, Aminocarbonsäure- oder Peptidderivat in Gegenwart von Aktivierungsreagenz, wie beispielsweise Kondensationsmittel wie DCC, DIC oder HOBT, versetzt.
Nach Verknüpfung der Aminocarbonsäure, des Peptides oder der Carbonsäure oder deren Derivaten oder Salzen mit dem an fester Phase gebundenen Nukleosid oder seinem Analogon, erfolgt die Einführung eines oder mehrerer, gleicher oder ver¬ schiedener Reporter-ZEffektormoleküle kovalent selektiv in der Seitenkette oder C- oder N-teπninal, beispielsweise über Veresterung, Amidierung, Sulfonamidierung, Sulfonsäureveresterung oder durch Umsetzung mit Isothiocyanaten oder N- Hydroxysuccinimidestern. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Als Reportermoleküle bzw. Effektormoleküle kommen solche Verbindungen bzw. Verbindungsklassen in Betracht, die sich an eine Hydroxy-, Amino- oder Thiol- gruppe kovalent anknüpfen lassen (s. o.).
Die Abspaltung der Nukleosidderivate von der Linkergruppe erfolgt bevorzugt unter schwach sauren, basischen, photochemischen oder reduktiven Bedingungen.
Nukleosidderivate, die an der Spacergruppierung eine oder mehrere Schutzgruppen oder Seitenketten aufweisen, können entsprechend hergestellt werden. Die auf diese Weise hergestellten Nukleosidderivate können anschließend, nach dem Fachmann bekannten Verfahren, in die entsprechenden 5'- bzw. 6'-Mono-, Di¬ oder Triphosphate (Nukleotide), Alkylphosphonate, Dialkylphosphinate oder Phos- phoramidit überführt werden.
Vorteilhaft ist die erfindungsgemäße Synthese der 5'- bzw. 6'-modifizierten Nu¬ kleosiden insbesondere deshalb, da - anders als bei bekannten Verfahren - problem¬ los ein hoher Überschuß der Farbstofϊkomponente eingesetzt und einfach abgetrennt werden kann. Für die vorbekannten Verfahren schließen sich für Abtrennung des nicht-umgesetzten Farbstoffs langwierige und teure chromatographische Auf- reinigungsschritte an das eigentliche Herstellungsverfahren an.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (1), wobei Rest R' eine Triphosphatgruppe darstellt, sind mittels eines Primers und eines Templatestranges und in Gegenwart der vier Nukleosidtriphosphate vorteilhaft als Substrate für DNA/RNA-Polymerasen verwendbar. Als geeignete Polymerasen sind hier T7-, Taq-Polymerase, DNA-Polymerase I und reverse Transcriptasen zu nen¬ nen. Außerdem sind die Verbindungen als Terminatoren bei der enzymatischen DNA RNA-Sequenzierung geeignet. Die Termination der Synthese kann dabei je¬ weils durch Einsatz eines 3'-(4'-)modifizierten A, C, G, T-Nukleotids der Formel (1) spezifisch bestimmt werden. Dies ist für die Synthese von DNA-Gegensträngen in Anwesenheit eines Templatestranges (und damit auch für die Sequenzierung von DNA-Strängen) von besonderer Bedeutung, da der Einsatz eines modifizierten Nu¬ kleotids einen sehr basenspezifischen Abbruch der Reaktion gewährleistet.
Die Synthese von RNA-Nukleosiden und Oligonukleotiden erfolgt in analoger Art und Weise.
Darüber hinaus ist die Synthese von derivatisierbaren Oligonukleotiden mit Hilfe eines Startnukleotids, welches am 3'-(4')-Ende eine Spacergruppierung trägt und amino- oder thiovariiert und an einem polymeren Träger fixiert wurde, möglich.
Als Oligonukleotide gelten alle im herkömmlichen Sinn hergestellten DNA- und RNA-Nukleotide, vorzugsweise jedoch in einer Länge von 2 bis 100, besonders be- vorzugt 12 - 50 Nukleotiden (chemische Synthese) bzw. in einer Länge bis ca. 3.000 Nukleotiden (enzymatische Synthese), je nach Effizienz der verwendeten
Polymerase.
Die Oligonukleotidsynthese erfolgt, ausgehend von dem Startnukleotid-Träger- Komplex, im herkömmlichen Sinn, d. h. in 3'- und 5'-Richtung und ermöglicht die Synthese eines Oligonukleotids definierter Sequenz.
Die Fixierung des Startnukleosids an handelsüblichen Trägern erfolgt über einen Verbindungsarm (Spacer), der sich nach der Synthese spalten läßt; beispielsweise über die literaturbekannte Bernsteinsäureverknüpfung oder aber über eine Ver¬ knüpfung mit Urethan (Efimov et al, Nucl. Acids. Res. 11, 8369, 1983).
Nach erfolgter Synthese muß das Oligonukleotid mit geeigneten Reagenzien vom Träger abgespalten werden. Die Derivatisierung mit einem beliebigen Fluoreszenz¬ farbstoff erfolgt direkt danach.
Auch die umgekehrte Syntheserichtung (51 — . 3') von Oligonukleotiden ist möglich, indem das Startnukleosid über die 5'-OH-Gruppe mit der Linkergruppierung des Trägermaterials verknüpft wird und man analog zur herkömmlichen Oligonukleotid¬ synthese verfahrt. Die Farbstoffinarkierung des Oligonukleotids kann dabei an der festen Phase erfolgen.
Die so synthetisierten und am 3'(4')-Ende modifizierten Oligonukleotide können dann zur Detektion von z. B. komplementären Oligonukleotiden bzw. Nucleinsäu- ren und entsprechender Derivate verwendet werden.
Aber auch als in vivo- und in vitro-Sensoren in der Analytik und als Gensonden in der Gentherapie und für diesbezügliche analytische Zwecke sind die erfindungsge¬ mäßen Verbindungen geeignet.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter: Beispiel 1:
Veresterung von Fmoc-Aminosäurederivaten mit dem 2-Chlorotrityl Harz
1 Gramm Harz, das mit l,l-l,6mmol 2-Chlororritylchlorid-Linker [K. Barlos, O. Chatzi, D. Gatos, G. Stauropoulos, Int. J. Peptide Prot. Res. 37, (1991), 513 - 520] beladen ist, wird mehrere Minuten in abs. DCM geschüttelt. Nach Zu¬ gabe von 3 mmol DIEA werden 1,2 mmol Fmoc geschützte Aminosäure zugegeben. Die Reaktionszeit beträgt 90 min. Nach der Zugabe von weiteren 3 mmol DIEA wird mit 5 ml abs. Methanol während ungefähr 30 min die unveresterte Linkerfunk¬ tionalität verethert. Das belegte Harz wird abfiltriert und mehrmals mit DMF, DCM, Isopropanol und letztlich mit Diethylether gewaschen. Nach dem Trocknen im öl- pumpenvakuum wird mit dem quantitativen Ninhydrintest (Beispiel 7 b) oder durch UV-spektrometrische Bestimmung der Fmoc -Abspaltung die Aminosäurebeladung bestimmt. Durch die Variation der Aminosäuremenge erhält man Aminosäurebela¬ dungen zwischen 0,05 und 1,1 mmol/g.
Beispiel 2:
Nα-Ankupplung von Fluoreszenzfarbstoffen auf harzgebundene Aminosäuren oder Peptide
Für Farbstoffe mit Carboxy-Gruppen gilt:
Pro Äquivalent harzgebundener Aminosäure oder Peptid werden 3 Äquivalente Farbstoff, 3,3 Äquivalente DIC und 4,5 Äquivalente HOBt in ein Schüttelgefäß gegeben und 50 Stunden bei Raumtemperatur in DMF DCM unter Lichtausschluß geschüttelt. Anschließend wird mit reinem DMF, DCM, Methanol, Isopropanol und Ether mehrmals gewaschen und das Aminosäure- bzw. Peptid-Konjugat, wie weiter unten beschrieben, vom festen Träger abgespalten.
Pro Äquivalent des harzgebundenen, N-terminal entschützen Peptids oder der zu markierenden Aminosäure werden 3 Äquivalente des Fluoreszenzfarbstoffs, 1,2 Äquivalente DEEA und eine katalytische Menge DMAP (4,4' -Dimethylamino- pyridin) in einer Lösung aus DMF/DCM (v/v 4: 1) in einem Schütteigefaß mit Fritte während 48 h zur Reaktion gebracht. Um Zersetzungsreaktionen der Farbstoffe zu vermeiden, wird unter Lichtausschluß geschüttelt. Der Reaktions verlauf kann mit der Ninhydrin-Reaktion oder mit DC verfolgt werden. Sollten noch freie Amino- funktionalitäten vorhanden sein, so kann mit Ac20/DIEA (Äquivalente/Äqui¬ valente 1:2) acetyliert werden. Nicht umgesetzter Farbstoff wird abfiltriert und mehrmals mit jeweils 10 ml DMF, DCM, DMSO, MeOH und letztlich mit Diethylether gewaschen. Nach dem Trocknen im ölpumpenvakuum können die Aminosäure-Peptid-Farbstofϊkoηjugate im Kühlschrank gelagert werden.
Orthogonalität der Schutzgruppen erlaubt auch die Einführung eines oder mehrerer, gleicher oder verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe selektiv in die Seitenkette oder N- terminal. Die Einführung von Fluoreszenzfarbstoffen in die Seitenkette von triftmk- tionalen Aminosäuren verläuft analog der Nα-Ankupplung, jedoch ist der Anteil von DMAP zu erhöhen. Beispiel 3:
Abspaltung vom 2-Chlorotrityl Harz zur Darstellung fluoreszenzmarkierter Aminosäuren oder Fluoreszenzmarkierter Peptide
Die Esterspaltung wird unter schwach sauren Bedingungen durchgeführt. Man ver¬ wendet je 1 g Peptidharz etwa 20 ml einer Mischung aus Eisessig/TFE/DCM im Verhältnis von (v/v/v 1:2:7) [K. Barlos, O. Chatzi, D. Gatos, G. Stauropoulos, Int. J. Peptide Prot. Res. 37, (1991), 513 - 520]. Die Abspaltzeit beträgt üblicher¬ weise ungefähr 90 min. Ist kein His (N™1 Trt)-Rest enthalten, so kann mit einem Gemisch aus DCM/TFE (v/v 1:1) abgespalten werden. Anschließend wird vom Harz abfiltriert und die Peptidlösung mit etwa 100 ml Wasser aufgefüllt. Das zugegebene Wasser verhindert die Aufkonzentration der Essigsäure beim anschließenden Ab- destillieren der leicht flüchtigen Komponenten am Rotationsverdampfer. Die hydro¬ phoben Aminosäure- und Peptidderivate werden beim Einrotieren ausgefällt und nun an der Gefriertrocknungsanlage getrocknet.
Beispiel 4:
Veretherung von Nukleosiden über die 5'-OH-Gruppe mit dem 2-Chlorotrityl Harz
1 Gramm Harz, das mit 1,1-1,6 mmol 2-Chlorotritylchlorid-Linker beladen ist, wird mehrere Minuten in einer Mischung aus CHCl3/DMSO (v/v 1:2) geschüttelt. Nach Zugabe von 2,5 mmol DIEA werden 0,52 mmol Nukleosid zugegeben. Die Reak¬ tionszeit beträgt ca. 120 min. Nach der Zugabe von weiteren 3 mmol DIEA wird mit 5 ml abs. Methanol während 30 min die unveretherte Linkerfunktionalität mit Methanol verethert. Das belegte Harz wird abfiltriert und mehrmals mit DMF, DCM, Isopropanol und letztlich mit Diethylether gewaschen. Nach dem Trocknen im Ölpumpenvakuum wird mit dem quantitativen Ninhydrintest, im Falle der 3'- Amino-Nukleotide (Beispiel 7 b), durch UV-spektrometrische Bestimmung nach geeigneter Derivatisierung der 3'-Funktionalität des Nukleosids oder durch Abwie¬ gen des Harzes die Harzbeladung bestimmt. Durch die Variation der Nukleosid- menge erhält man Harzbeladungen zwischen 0,1 und 1 mmol g. Beispiel 5:
Kupplung von Aminosäuren, Peptiden und Carbonsäuren und deren Derivate auf trägergebundene Nukleoside
Die Kupplung erfolgt nach den aus der Peptidchemie bekannten Aktivierungs¬ methoden (Dauer: ca. 12 Stunden). Die Verwendung basenlabiler Schutzgruppen erlaubt die Aminosäurekettenverlängerung oder Fragmentkondensationen nach den bekannten Methoden [M. Bodanszky Prmciples of Peptide Syntheses, 2nd Edition, Springer 1993, G. B. Fields & R. L. Noble, Int. J. Peptide Prot. Res. 35, (1990), 161 - 214]
Beispiel 6:
Abspaltung von Nukleosiden, Nukleosid -Aminosäuren, Nukleosid -Peptiden, sowie deren Farbstoffderivate vom 2-Chlorotrityl Harz
Die Etherspaltung wird unter sauren Bedingungen durchgeführt. Man verwendet je 1 g beladenem Harz etwa 10 ml einer Lösung aus Dichloressigsäure/DCM im Ver¬ hältnis von (v/v 3:97). Die Abspaltzeit beträgt ca. 1 min. Anschließend wird vom Harz abfiltriert und die Produktlösung sofort mit einer äquimolaren Lösung von DIEA DCM im Verhältnis (v/v 63:937) neutralisiert. Man wäscht das Harz mehr¬ mals mit wenig ACN nach. Es werden ca. 10 ml Wasser zugegeben. Das Produkt wird nun an der Gefriertrocknungsanlage getrocknet.
Beispiel 7:
Ninhydrin-Test
Zur Durchführung des Ninhydrin-Tests [I. Kaiser, R. L. Colescott, C. D. Bossinger, P. I. Cook, 3. Anal. Biochem, 34, (1970), 595] werden folgende drei Lösungen be¬ nötigt:
Lösung 1: Eine Lösung von 80 g Phenol in 20 ml Ethanol.
Lösung 2: Eine 2%ige Lösung von 33 mg Kaliumcyanid KCN in 50 ml Wasser in Pyridin. Lösung 3 : Eine Lösung von 500 mg Ninhydrin in 10 ml Ethanol
a) Qualitativer Ninhydrin-Test
Für den Nachweis, ob eine Acylierung quantitativ verlaufen ist, bringt man jeweils zwei bis drei Tropfen der drei Lösungen mit einer Mikrospatelspitze des belegten Harzes in einem Eppendorf- gefäß zur Reaktion. Man erwärmt das Reaktionsgemisch auf etwa 5 min im Wasserbad auf 100 °C. Ist die Acylierungsreaktion nicht vollständig verlaufen, so erhält die Lösung eine tiefdunkelblaue Farbe, während im Falle quantitativer Kupplungsreaktionen das Reaktionsgemisch seine gelbe Farbe behält.
b) Quantitativer Ninhydrin-Test
Zur quantitativen Bestimmung der Harzbeladung mit Aminosäure werden die Fmoc-Aminosäurederivate während 40 min mit Pipe- ridin/DMF (v/v 40:60) entschützt.
Nach dem Waschen mit DMF, Isopropanol und DCM wird das Harz getrocknet. Eine Probe von etwa 3 - 5 mg wird mit den Lö¬ sungen 1 (4 Tropfen), 2 (8 Tropfen) und 3 (4 Tropfen) im Ther- moheizblock während 7 min auf 100 °C erhitzt. Das Reaktions¬ gemisch wird sofort mit 60 % Ethanol verdünnt und in einen Meßkolben geeigneter Größe überführt. Nach der Kalibrierung des UV-Spektrometers mit 60 % Ethanol wird die Extinktion bestimmt und durch Einsetzen der entspre¬ chenden Werte in die folgende Gleichung wird die Harzbeladung in μmol/g ermittelt.
[Extinktion x Verdünnung (ml ,
Beladung [μmol/g] = Extinktionskoeffizient x eingewogene Masse (mg) x 10
Die im folgenden aufgeführten Verbindungen der Beispiele 8-23 wurden nach den allgemeinen Bedingungen der Beispiele 1 - 6 synthetisiert:
Aminosäure-/Peptid -Farbstoffko njugate
Beispiel 8:
Fluorescein - 5 (6)-aminothiono-N-glycin (FITC-Gly(OH)) 3
Figure imgf000017_0001
Ansatz:
0,17 mmol (673 mg) Harz-Gly-NH2 0,5 mmol (193 mg) FITC Ausbeute (77,9 mg) 91 %
HPLC-Analvtik:
Säule Nucleosil RP18, 5 μm, 300A, 4 x 250 mm
Gradient 20 - 100 % ACN (0,1 % TFA) 40' Flowrate 1 ml/min. Abs. bei 235,0 nm und 225,0 nm.
Retentionszeit: 10,05/11,00 Min.
Beispiel 9:
Fluorescein - 5(6)-aminothiono-N-glycyl-glycin (FITC-Gly2(OH)) 4
Figure imgf000018_0001
Ansatz:
0,43 mmol Harz-Gly2-NH2 1,3 mmol (504 mg) FITC Ausbeute (220,4 mg) 89 %
HPLC-Analvtik:
Säule Nucleosil RP18, 5 μm, 300A, 4 x 250 mm
Gradient 20 - 100 % ACN (0,1 % TFA) 40' Flowrate 1 ml/min.
Abs. 287,5 und 425,0 nm
Retentionszeit: 8,00 Min.
Beispiel 10:
Fluoresscein - 5(6)-aminothiono-N-triglycyl-glycin (FITC-Gly4(OH)) 5
Figure imgf000019_0001
Ansatz:
0,2 mmol Harz-Gly4-NH2 0,5 mmol (195 mg) FITC Ausbeute (77 mg) 74 %
HPLC-Analvtik:
Säule Nucleosil RP18, 5 μm, 300A, 4 x 250 mm
Gradient 0 - 80 % ACN (0,1 % TFA) 40' Flowrate 1 ml/min. Abs. bei 287,5 nm.
Retentionszeit: 17,5 Min.
Beispiel 11
Rhodamin MR 200-N-methylcarbonyl-N'-triglycyl-glycin
Figure imgf000020_0001
Ansatz:
44,4 mg Harz-Gly4-NH2 (entsprechend ca. 0,02 mmol)
30 mg Farbstoff MR 200, freie Carbonsäure
8,0 mg HOBT
6,3 μl DIC
Ausbeute: quantitativ
HPLC-Analvtil
Säule: Nucleosil RP 18, 5 μm, 300 A, 4x250 mm
Gradient: 0-80 % Acetonitril (0,1 % TFA) in 40 Min.
Fluß: 1 ml/min.
Detektion: Abs. bei 617 nm
Retentionszeit: 19,5 Min.
PC: Kieselgel, CHCl3/MeOH 1: 1: Rf 0,55
Masse: berechnet 943,7 gefunden 943,5
Spektrale Daten: λmaχjϊχ 615 nm, λmax_ßm 642 nm (in MeOH) Beispiel 12:
Rhodamin JA 51-N-propylcarbonyI-N'-triglycyl-glycin
Figure imgf000021_0001
Ansatz:
0,047 mmol Harz-Gly4-NH2
0,141 mmol Farbstoff JA 51
0,2 mmol HOBT
0,2 mmol DIC
Ausbeute: fast quantitativ
HPLC-Analvtik:
Säule: Nucleosil RP18, 5 μm, 300 A, 4x250 mm
Gradient: 0-80 % Acetonitril (0,1 % TFA) in 40 Min.
Fluß: 1 ml min.
Detektion: Abs. bei 631 nm
Retentionszeit: 16,5 Min.
Masse: berechnet 774,8 gefunden 774,6
Beispiel 13:
Digoxigenin 3-O-methyIcarbonyl-triglycyl-glycin
Figure imgf000022_0001
Retentionszeit: 15 Min.
Ansatz:
0,2 mmol Harz-Gly4-NH2
0,5 mmol Digoxigenin-3-O-essigsäure-N-hydroxysuccinimidester
Ausbeute (94 mg) 72 %
HPLC-Analvtik: Säule: Nucleosil RP18, 5 μm, 300 A, 4x250 mm Gradient: 0-80 % Acetonitril (0,1 % TFA) in 40 Min. Fluß: 1 ml/min.
Detektion: Abs. bei 215 nm
Retentionszeit: 15 Min.
Nukleosid-/Nukleotid-Farbstoffkonjugate
Beispiel 14
3'-0-[S-Trippphenylmethyl-Nα-(9-flu°«*enylmethoxycarbonyl)-cysteinyl]-2'- desoxy-thymidin (Thymidin-Cys(Trt)(Fmoc)) 6
Figure imgf000023_0001
NH
I
(Fmoc)
Ansatz:
0,25 mmol Harz-Thymidin
0,5 mmol (Fmoc)Cys(Trt)OH
Retentionszeit: 28,5 Min.
Ausbeute: Die Abspaltung erfolgte im analytischen Maßstab
HPLC-Analvtik des Rohproduktes:
Säule Vydac RP18, 5 μm, 300A, 4 x 250 mm
Gradient 0 - 60 % ACN (0,1 % TFA) 20'. 60 - 100 % 25* 100 % 30'. 0 % 35'
Flowrate 1 ml/min
Abs. bei 265 nm
Retentionszeit: 28,5 Min Beispiel 15:
3'-0-N-[Nε-Pentamethylchromyl-Nα-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-arginyl]- 2 '-desoxy-thymidin (Thymidin-Arg(Pmc)(Fmoc)) 7
Figure imgf000024_0001
(Fmoc)
Ansatz:
0,25 mmol Harz-Thymidin
0,5 mmol (Fmoc)Arg(Pmc)OH
Ausbeute: Die Abspaltung erfolgte im analytischen Maßstab
HPLC- Analytik des Rohproduktes:
Säule Vydac RP18, 5 μm, 300A, 4 x 250 mm
Gradient 0 - 60 % ACN (0,1 % TFA) 20', 60 - 100 % 25' 100 % 30', 0 % 35'
Flowrate 1 ml/min
Abs. bei 265 nm
Retentionszeit 26,7 Min. Beispiel 16:
3'-0-[Nα-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-leucinyl]-2 'desoxy-thymidin (Thymidin-Leu(Fmoc)) 8
Figure imgf000025_0001
NH
I
(Fmoc)
Ansatz:
0,25 mmol Harz-Thymidin
0,5 mmol (Fmoc)LeuOH
Ausbeute: Die Abspaltung erfolgte im analytischen Maßstab
HPLC- Analytik des Rohproduktes:
Säule Vydac RP18, 5 μm, 300A, 4 x 250 mm
Gradient 0 - 60 % ACN (0,1 % TFA) 20', 60 - 100 % 25' 100 % 30', 0 % 35'
Flowrate 1 ml/min
Abs. bei 265 nm
Retentionszeit: 25,5 Min. Beispiel 17:
Beispiel 17, Verbindung 9 wurde sukzessive am Träger aufgebaut (1. Belegung des Harzes mit Thymidin, 2. Ankopplung einer (Fmoc)-Aminosäure, 3. Entschü tzung der Aminosäure, 4. Ankopplung des Farbstoffs).
3 '-O-Glycyl- {N-thiono-[5(6)-amino-fluoresceinyl] } -2 '-desoxy-thymidin (Thymidin-Gly-FITC) 9
Figure imgf000026_0001
Ansatz:
0,5 mmol Harz-Thymidin 0,5 mmol (Fmoc)Gly(OH) 1,0 mmol FITC
Ausbeute: Die Abspaltung erfolgte im analytischen Maßstab
Rf-Wert (Kieselgel 60, F254, Merck): 0,35; CHCl3/MeOH (v/v 9:1)
Die folgenden Beispiele 18-23 wurden ebenfalls am Träger aufgebaut, anschließend vom Harz abgespalten und in Lösung zu den Triphosphaten weiter umgesetzt.
Die Triphosphatsynthese wurde nach [Ludwig, Eckstein, J. Org. Chem. 54,
631 - 635, (1989)] durchgeführt. Beispiel 18:
Fluorescein-5(6)-amino-thiono-(N-glycyl)-[(3'-amino-2', 3'-didesoxy)-thymidin- 5'-triphosphat] (3*-Amino-Gly-FITC,3'-Desoxy,5'-Triphosphat-
Thymidin) 10
Figure imgf000027_0001
Ansatz:
0,031 mmol Harz-3'Amino-3'-Desoxy-Thymidin
0,047 mmol Fluorescein-Gly(OH)
Ausbeute: über alle Stufen (17,4 mg) 60,1 %
I^Wert (Kieselgel 60, F254, Merck): 0,59; Isoprop./NH4OH/Wasser (v/v/v 7:1:4)
HPLC-Analvtik des Rohproduktes:
Säule Supersphere RP18(e); 3 μm; 2 x 125 mm Grad. 0 - 2 % B 20';
2 - 4 % B 25'; 4 - 20 % B
A = TEAA, pH 7.0; B = ACN Flowrate 0,15 ml min. Abs. bei 265 mn
Retentionszeit: 11,95 Min. Beispiel 19:
Fluorescein-5(6)-amino-thiono-(N-dig.ycyI)-['-amino -2\ 3'-didesoxy)-thymidin-
5'triphosphat] 3*-Amino-Gly2-FITC,3'-Desoxy,5τ-Triphosphat-T hymidin 11
Figure imgf000028_0001
Ansatz:
0,031 mmol Haιτ:-3'.Amino-3'-Desoxy-Thyπιidin
0,052 mmol Fluorescein-Gly2(OH)
Ausbeute über alle Stufen (19,9 mg) 54 %
R^Wert (Kieselgel 60, F254, Merck): 0,29; CHCl3/MeOH (v/v 1:1)
HPLC-Analvtik des Rohproduktes:
Säule Supersphere RP18(e); 3 μm; 2 x 125 mm Grad. 0 - 2 % B 20';
2 - 4 % B 25*; 4 - 20 % B
A = TEAA, pH 7.0; B = ACN Flowrate 0,15 ml/min. Abs. bei 265 nm
Retentionszeit: 12,8 Min Beispiel 20:
Fluorescein -5(6)-amino-thiono-(N-tetraglycyl)-[(3 '-amino-2 ', 3 '-didesoxy)-tl thymidin-5 '-triphosphat] (3*-Amiπo-Gly4-FITC,3*-Desoxy,5*-Triphosphat- Thymidin) 12
Figure imgf000029_0001
Ansatz:
0,031 mmol Haι -3'Amino-3'-Desoxy-Thymidin
0,045 mmol Fluorescein-Gly4(OH)
Ausbeute über alle Stufen (21,9 mg) 64,2 %
R Wert (Kieselgel 60, F2J4, Merck): 0,53 Isoprop./NH4OH Wasser (v/v/v 7:1:4)
R^-Wert (Kieselgel 60, F254, Merck): 0,26 CHCl3/MeOH (v/v 1:1)
HPLC- Analytik des Rohproduktes:
Säule Supersphere RP18(e); 3 μm; 2 x 125 mm Grad. 0 - 2 % B 20";
2 - 4 % B 25'; 4 - 20 % B
A = TEAA, pH 7.0; B = ACN Flowrate 0,15 ml/min. Abs. bei 265 nm
Retentionszeit: 12,8 Min. Beispiel 21:
Rhodamin MR 200-N-methylcarboπyl-(N'-tetraglycyl)-[(3'-amino-2', 3'- didesoxy)-adenosin-5'-triphosphat]
Figure imgf000030_0001
Ansatz:
0,027 mmol Harz-3*-amino-2',3*-didesoxy-N6-benzoyl-adenosin
0,050 mmol Gly4 -MR200
0,1 mmol HOBT
0,1 mmol DIC
Nach erfolgter Abspaltung vom Trägerharz und anschheßender Triphosphat- Synthese wurde die Benzoylschutzgruppe mit konz. Ammoniaklösung entfernt.
Ausbeute über alle Stufen: 49 % d. Th.
HPLC-Analvtik:
Säule: Hypersil ODS, 5 μm, 120 A, 4x250 mm Fluß: 1 ml/min Gradient: 0-20 % B in 10 min 80 % B in 20 min 100 % B in 25 min Solvent: A: 0, 1 M TEAA in Wasser
B: Acetonitril Detektion: Abs. 617 nm Retentionszeit: 18,3 Min.
Masse: berechnet 1411,9 gefunden 1411,5
Beispiel 22:
Rhodamin MR 200- -methylcarbonyl-(N,-tetraglycyl)-[(3,-amino-2,, 3'- didesoxy)-guanosin-5'-triphosphat]
Figure imgf000032_0001
Ansatz:
0,027 mmol Harz-3*-amino-2',3'-didesoxy-N2-isobutyryl-guanosin
0,050 mmol Gly4-MR200
0,1 mmol HOBT
0,1 mmol DIC
Nach erfolgter Abspaltimg vom Trägerharz und anschließender Triphosphat- Synthese wurde die Isobutyryl-Schutzgnippe mit konz. Ammoniaklösung entfernt.
Ausbeute über alle Stufen: 41 % d. Th.
HPLC-Analvtik:
Säule: Hypersil ODS, 5 μm, 120 A, 4x250 mm Fluß: 1 ml/min Gradient: 0-20 % B in 10 min 80 % B in 20 min 100 % B in 25 min Solvent: A: 0, 1 M TEAA in Wasser
B: Acetonitril Detektion: Abs. 617 nm Retentionszeit: 18,0 Min.
Masse: berechnet 1427,9 gefunden 1427,3
Beispiel 23:
Digoxigenin 3-0-methyIcarbonyI-(N-tetraglycyI)-[(3'-amino-2\ 3'-didesoxy)- thymidin-5'-triphosphat]
Figure imgf000034_0001
Ansatz:
0,03 mmol Harz-3'-amino-2',3'-didesoxy-thymidin
0,06 mmol Digoxigenin 3-0-methylcarbonyl-triglycyl-glycin
0,1 mmol HOBT
0,1 mmol DIC
Wie in den Beispielen 21 und 22 wurde nach erfolgter Kondensation vom Trägerharz abgespalten und nach Phosphorylierung das 5'-Triphosphat erhalten.
Ausbeute über alle Stufen: 58 % d. Th.
HPLC-Analvtik:
Säule: Hypersil ODS, 5 μm, 120 A, 4x250 mm Fluß: 1 ml/min Gradient: 0-20 % B in 10 min 80 % B in 20 min 100 % B in 25 min
Solvent: A: 0, 1 M TEAA in Wasser B: Acetonitril
Detektion: Abs. 260 nm Retentionszeit: 15,2 Min.
Masse: berechnet 1139,9 gefunden 1139,1 Beispiel 24:
Verwendung von 3'-modifizierten Nukleotiden für die enzymatische DNA-Se- quenzierung
Es wurden folgende, nach Beispiel 1 bis 6 hergestellte, Nukleotide verwendet:
Figure imgf000035_0001
3: n = 2 4: n = 4
1 μg M13mpl8 einsträngige DNA (5 μl), 2 μl Fluoreszin markierter Universal- Primer (1 pmol, Pharmacia LKB), 2 μl Mn-Puffer I (311 mM Tris • HC1, pH 7.5),
2 μl Mn-Puffer II (177 mM DTT) und 2 μl Mn-Puffer Iü (62 mM MnCl2, 460 mM Natriiunisocitrat) werden miteinander vermischt und auf 70 °C erhitzt und dann auf 25 °C gekühlt (ca. 40 min). Zum dem auf 37 °C erhitzten Template und Primer werden dann 2 μl einer verdünnten T7 DNA-Polymerase (4 Einheiten, Pharmacia) gegeben. In der Zwischenzeit werden 3 μl eines Termination-Mixes (T-mix 1:
150 μl/Verbindung 1; T-mix Verbindung 2: 200 μM II; T-mix Verbindung 3: 300 μM Verbindung 4; außerdem erhält jeder Mix: 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, 50 mM NaCl, 40 mM Tris • HC1, pH 7.5) in vier Reak¬ tionsgefäße pipettiert und mindestens 1 Minute auf ca. 37 °C erwärmt. An¬ schließend werden sofort 3,8 μl des ersten Mix (annealing mix) in die vorgewärmten Termination-Mixe pipettiert. Nach einer Inkubation von ca. 10 Minuten bei 37 °C werden zu jeder Reaktionslösung 4 μl eines Stopreagenzes (deionisierte Formamidlösung, Dextran Blau) gegeben. Die Reaktionslösungen werden für 2 Minuten bei ca. 90 °C erhitzt und auf ein 6%iges denaturierendes Sequenzgel in die einzelnen Taschen gegeben (a 6 μl). Anschließend wurden die einzelnen DNA-Fragmente mittels eines Fluoreszenz-Detektionsgerätes nachgewiesen und identifiziert.
Figur 1 zeigt den Quotient aus Fluoreszenzemission F (λex = 488 nm; λm = 520 mm) und Adsorption A (λ^ = 265 nm) für die Verbindungen 1 - 4 be¬ stimmt während RP-HPLC-Analyse.
Für Verbindung 1 wurden danach die geringste Fluoreszenzintensität erhalten. Die Intensität für die Verbindungen 2 bis 4 steigt deutlich mit Länge der Spacerfiinktion in 3'-(4'-)Position an.
Alle vier modifizierten Nukleotide werden von der angesetzten DNA-Polymerase als Substrat akzeptiert und zeigen vergleichbare Terminationsqualität, wie z. B. ddTTP. Dies ist bemerkenswert, da aufgrund der sperrigen Reste in 3'-(4'-)Position der Nukleotide der erfindungsgemäßen Verbindungen 2 bis 4 zu erwarten gewesen wäre, daß die Verbindungen von DNA-Polymerasen nicht als Substrate erkannt und umgesetzt werden.
Entsprechend eingesetzt werden die nach den Beispielen 20 und 21 hergestellten Triphosphate des Rhodamins und Digoxigenins.
Abkürzungen
entsprechen den Vorschlägen der IUPAC-IUB Kommission für biochemische Nomenklatur (J. Biochem. 138, (1984), 9; J.Biol. Chem. 247, (1972), 977; Biochemistry 9, (1970), 3471).
ACN Acetonitril AcOH Eisessig
AS Aminosäure
CDC13 Deuterochloroform
CH3OH Methanol
CHCI3 Trichlor ethan
DC Dünnschichtchromatographie
DCA Dichloressigsäure
DCC N-N'-Dicyclohexylcarbodiimid
DCM Dichlormethan ddTTp 2',3'-Didesoxy, 5'-Triphosphat
DIC N-N'-Diisopropylcarbodiimid
DIEA Diisopropylethylamin
DMAP 4,4'-Dimethylaminopyridin
DMF N,N-Dimethylformamid
DMTr 4,4'-Dimethoxytrityl
DNA Desoxynucleic Acid
Et20 Dieethylether
FITC Fluoresceinisothiocyanat (5-Isomer)
Fmoc 9-fluorenylmethoxycarbonyl
HOBt 1-Hydroxybenzotriazol
HPLC High Performance Liquid Chromatography
KCN Kaliumcyanid
Linker Ankergruppe zwischen AS und dem Harz
MeOH Methanol
MG Molgewicht ml Müliüter mM Millimolar
Mn Mangan nm Nanometer
NMR Nuclear Magnetic Resonance
Pmc pentamethylchroman
Rf Relative Wanderungsstrecke der Probe bei der DC
RNA Ribunucleic Acid
RP Reversed-Phase
RT Raumtemperatur
Rt Retentionszeit
SPPS solid phase peptide synthesis
T Thymidin
T7 Escherichia coli Phage T7
Taq Thermococcus aquaticus
TBTU 2-( 1H-B enzotriazol- lyl)- 1 , 1 ,3 ,3 -tetramethyl- uroniumtetrafluoroborat
TEAA Tetraethylammoniumac etat
TFA Trifluoressigsäure
TFE Trifluorethanol
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Trt Triphenylmethyl (Trityl)
TTp 5'-Triphosphat-Thymidin
UV Ultraviolett
VIS Visible μl Mikroliter

Claims

Patentansprüche
1. Verbindungen der allgemeinen Formel (1)
Base
Figure imgf000039_0001
wobei: R' Wasserstoff, Mono-, Di- oder Triphosphat,
Alkylphosphonat, Dialkylphosphinat oder Phosphoramidit X Sauerstoff, Stickstoff, Kohlenstoff oder Schwefel
Y Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel
Z Wasserstoff, Hydroxyl-, Amino- oder Thiolgruppe
R Spacergruppierung, woran eine nicht-radioaktive, detektierbare Gruppe oder ein Effektormolekül gebunden ist, Base Purin, Pyrimidinbase oder Desazapurine deren Derivate darstellen, n 0 oder 1 ist.
2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Spacergruppierung des Restes R 2 bis 12 Atome aufweist.
3. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Rest R eine (Aminoacyl)2-6-GruPPierung aufweist.
4. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht-radioaktive, detektierbare Gruppe ein Hapten, Fluorophor, Metall-Chelat, Lumiphor, Protein oder ein Interkalator bedeuten. 5. Verbindungen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichneζ daß die detektierbare Gruppe Digoxigenin oder Fluorescein ist.
6. 3'-Amino-(glygly)2-6-FITC-3'-deoxy-5'-triphosphat-Nukleotide.
7. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen einer der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß Verbindungen der allgemeinen Formel (2)
Base
Träger | — (Linker)-X
Figure imgf000040_0001
wobei: Linker eine selektiv abspaltbare Ankergruppierung
X Sauerstoff, Stickstoff, Kohlenstoff oder Schwefel
Y Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel
Z Wasserstoff, Hydroxyl-, Amino- oder Thiolgruppe
R Wasserstoff
Base Purin, Pyrimidinbase oder Desazapurine oder deren Derivate darstellen, n 0 oder 1 ist.
über die Linker-Gruppierung an einen festen Träger gebunden werden, eine gegebenenfalls durch Schutzgruppen versehene bi- oder polyfunktionelle Verbindung, anschließend eine gegebenenfalls reaktivierte, detektierbare Signalkomponente zugegeben wird, die Abspaltung des Nukleosidderivats von der Trägermatrix vorgenommen wird und gegebenenfalls eine Derivatisierung der 5'-Position erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der bi- bzw. poly-funktionellen Verbindung um ein oder mehrere Carbonsäure-, Aminocarbonsäure- oder Peptidderivate handelt. 9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäurekomponente in der ein- oder zweifachen äquimolaren Menge der Verbindung (2) zugesetzt wird und dieser Vorgang gegebenenfalls ein oder mehrere Male wiederholt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Linker-Gruppierung um einen unsubstituierten Methoxy- oder Halogen¬ substituierten Tritylrest handelt.
11. Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel (1) zur Sequenzierung von RNA- oder DNA-Sequenzen.
12. Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel (1) zum nicht¬ radioaktiven Nachweis von Oligo-, Polynukleotiden oder Nukleinsäuren.
13. Verwendung der Verbindungen/der allgemeinen Formel (1) als Antisense- bzw. Genther apeutika.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8637650B2 (en) 2003-11-05 2014-01-28 Genovoxx Gmbh Macromolecular nucleotide compounds and methods for using the same
US9315860B2 (en) 2009-10-26 2016-04-19 Genovoxx Gmbh Conjugates of nucleotides and method for the application thereof

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0214908A1 (de) * 1985-09-04 1987-03-18 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Verbindungen, enthaltend eine oligonukleotide Sequenz, gebunden an eine Interkalierungsverbindung und an eine aktivierbare chemische Verbindung, ihre Synthese und Verwendungen als artifizielle sequenzspezifische Nuklease
WO1988004301A1 (fr) * 1986-12-02 1988-06-16 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs OLIGONUCLEOTIDES alpha
EP0399330A1 (de) * 1989-05-24 1990-11-28 Roche Diagnostics GmbH Modifiziertes Phosphoramidit-Verfahren zur Herstellung von modifizierten Nukleinsäuren
EP0490281A1 (de) * 1990-12-11 1992-06-17 Hoechst Aktiengesellschaft 3'- Amino- oder thiolmodifizierte, Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelte Nukleoside, Nukleotide und Oligonukleotide sowie ein Verfahren zur Herstellung und ihre Verwendung
EP0552767A2 (de) * 1992-01-22 1993-07-28 Hoechst Aktiengesellschaft 3'-Derivatisierte Oligonucleotidanaloga mit nichtnucleotidischen Gruppierungen, deren Herstellung und Verwendung
WO1994023064A1 (fr) * 1993-03-26 1994-10-13 Institut Pasteur Nouveaux derives utilisables en sequençage d'acides nucleiques

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2596761B1 (fr) * 1986-04-08 1988-05-20 Commissariat Energie Atomique Derives de nucleosides et leur utilisation pour la synthese d'oligonucleotides
EP0260032B1 (de) * 1986-09-08 1994-01-26 Ajinomoto Co., Inc. Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere
US4962045A (en) * 1988-05-02 1990-10-09 The Perkin-Elmer Corporation Time-resolved fluorimetric detection of lanthanide labeled nucleotides
JPH0275957A (ja) * 1988-09-13 1990-03-15 Kao Corp Ｄｎａの蛍光色素標識方法
JPH0275958A (ja) * 1988-09-13 1990-03-15 Kao Corp Ｄｎａ検出法
DE3916595A1 (de) * 1989-05-22 1990-11-29 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur nichtradioaktiven messung der nucleinsaeuresynthese in eukaryontischen zellen
DE69033495T2 (de) * 1989-10-24 2000-07-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modifizierte nukleotide
WO1992018650A1 (en) * 1991-04-11 1992-10-29 Baxter Diagnostics Inc. Detection of dna/rna by fluorescence polarization
JP2562862B2 (ja) * 1991-08-28 1996-12-11 ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 鋳型依存性酵素的核酸合成用プライマーとしてのオリゴヌクレオチド同時合成および直接標識化のための機能性担体

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0214908A1 (de) * 1985-09-04 1987-03-18 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Verbindungen, enthaltend eine oligonukleotide Sequenz, gebunden an eine Interkalierungsverbindung und an eine aktivierbare chemische Verbindung, ihre Synthese und Verwendungen als artifizielle sequenzspezifische Nuklease
WO1988004301A1 (fr) * 1986-12-02 1988-06-16 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs OLIGONUCLEOTIDES alpha
EP0399330A1 (de) * 1989-05-24 1990-11-28 Roche Diagnostics GmbH Modifiziertes Phosphoramidit-Verfahren zur Herstellung von modifizierten Nukleinsäuren
EP0490281A1 (de) * 1990-12-11 1992-06-17 Hoechst Aktiengesellschaft 3'- Amino- oder thiolmodifizierte, Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelte Nukleoside, Nukleotide und Oligonukleotide sowie ein Verfahren zur Herstellung und ihre Verwendung
EP0552767A2 (de) * 1992-01-22 1993-07-28 Hoechst Aktiengesellschaft 3'-Derivatisierte Oligonucleotidanaloga mit nichtnucleotidischen Gruppierungen, deren Herstellung und Verwendung
WO1994023064A1 (fr) * 1993-03-26 1994-10-13 Institut Pasteur Nouveaux derives utilisables en sequençage d'acides nucleiques

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B. CANARD ET AL.: "DNA polymerase fluorescent substrates with reversible 3'-tags", GENE, vol. 148, pages 1 - 6 *
C.R. CREMO ET AL.: "Interaction of myosin subfragment 1 with fluorescent ribose modified nucleotides", BIOCHEM., vol. 29, pages 3309 - 3319 *
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 87, no. 9, Columbus, Ohio, US; abstract no. 64878w, T.A. ROSOVSKAYA ET AL.: "Addition of fluorescent label to the 3'-hydroxyl terminal of DNA and to the 3'-hydroxyl terminal of the nascent RNA chain" page 253; *
G. ONUR ET AL.: "Synthesis of 2'-/3'-O acylated adenine nucleotide analogs and their interaction in photophosphorylation", Z. NATURFORSCH. SECTION C BIOSCIENCES, vol. 38c, pages 49 - 59 *
G. SCHÄFER ET AL.: "3'-Esters of ADP as energy-transfer inhibitors and probes of the catalytic site of oxidative phosphorylation", EUR. J. BIOCHEM., vol. 97, pages 415 - 424 *
G. SCHÄFER ET AL.: "Use of modified adenine nucleotides in mechanistic studies on oxidative phosphorylation", J. BIOENERGETICS AND BIOMEMBRANES, vol. 12, pages 213 - 232 *
I. MAYER ET AL.: "Interaction of fluorescent adenine nucleotide derivatives with the ADP/ ATP carrier in mitochondria", BIOCHEM., vol. 23, pages 2436 - 2442 *
INT. J. PEPTIDE PROT. RES., vol. 35, pages 165 - 171 *
M. SEKINE ET AL.: "Synthesis and properties of dansylated deoxycytidine 3',5'-biphosphate derivatives useful for 3'-labeling of oligonucleotides", NUCLEOSIDES NUCLEOTIDES, vol. 11, pages 1713 - 1730 *
MOL. BIOL. (MOSCOW), vol. 11, pages 598 - 610 *
R.S. BEABEALASHVILLI ET AL.: "Nucleoside 5'-triphosphates modified at sugar residues as substrates for calf thymus terminal deoxynucleotidyl transferase and for AMV reverse transcriptase", BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA, vol. 868, pages 136 - 144 *
T.C. MUESER ET AL.: "Synthesis of Dansyl ribonucleotides and their use in steady-state fluorescence anisotropy studies of nucleotide binding by initiation factor-2 (eIF-2) and histone H1", J. BIOCHEM., vol. 25, pages 1689 - 6 *
U. ASSELINE ET AL.: "Oligothymidylates substitués par un dérivé de l'acridine en position 5', à la fois en position 5' et 3' ou sur un phosphate internucléotidique", NUCLEOSIDES NUCLEOTIDES, vol. 7, pages 431 - 455 *

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Publication number Publication date
EP0763051A1 (de) 1997-03-19
CA2190982A1 (en) 1995-12-07
DE4418691A1 (de) 1996-02-22
JPH10500963A (ja) 1998-01-27
ZA954333B (en) 1996-11-26

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