[go: up one dir, main page]

WO1995026399A1 - Epimerase - Google Patents

Epimerase Download PDF

Info

Publication number
WO1995026399A1
WO1995026399A1 PCT/JP1995/000541 JP9500541W WO9526399A1 WO 1995026399 A1 WO1995026399 A1 WO 1995026399A1 JP 9500541 W JP9500541 W JP 9500541W WO 9526399 A1 WO9526399 A1 WO 9526399A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
leu
gly
glu
ala
arg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1995/000541
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Isafumi Maru
Yasuhiro Ohta
Yoji Tsukada
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Marukin Shoyu Co Ltd
Original Assignee
Marukin Shoyu Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Marukin Shoyu Co Ltd filed Critical Marukin Shoyu Co Ltd
Priority to DE69534484T priority Critical patent/DE69534484T2/de
Priority to KR1019950705274A priority patent/KR100294996B1/ko
Priority to AU20827/95A priority patent/AU696154B2/en
Priority to EP95913330A priority patent/EP0708177B1/en
Priority to JP52508495A priority patent/JP3418764B2/ja
Priority to US08/553,703 priority patent/US5795767A/en
Publication of WO1995026399A1 publication Critical patent/WO1995026399A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)

Definitions

  • the present invention relates to a silk "lucosamine 2 merase” and a derivative thereof, a DNA molecule encoding the enzyme, a recombinant vector incorporating the DNA molecule, and a trait carrying the vector.
  • the present invention relates to a transformant and a method for producing the epimerase.
  • the present invention relates to a novel polypeptide, asil 'having renin binding activity,' recosamine 2-emerase 'and its derivatives, a DNA molecule encoding the enzyme, and the like, and a DNA molecule incorporating the enzyme.
  • a transformant having the vector, a method for producing the epimerase, a hypotensive agent and an epimerizing agent comprising the enzyme or a derivative thereof as an essential component
  • a method for producing N-acetylmannosamine and N-acetyllaminic acid a method for producing N-acetylmannosamine and N-acetyllaminic acid.
  • N-Acetylneuramin II has recently been attracting attention as a pharmaceutical raw material. It is known that this ⁇ -acetyl meylamic acid can be synthesized enzymatically from ⁇ cetyl mannosamine and pinolevic acid by using ⁇ -acetyl neuraminate ria. I have. However, since ⁇ ⁇ -acetyl mannosamine is expensive and it is difficult to obtain a large amount, ⁇ ⁇ ⁇ -acetylc 'lucosamine and pyruvic acid are used as ashiru and lucosamine 2-ehi.
  • This method is asil, lucosamine 2-eh. It uses the method of converting N-acetyl lucosamine to N-acetyl mannosamine. This method is used for power and power.
  • the alkylamine "Rukosamine 2-ethyl melase” is practically used because it is present only in trace amounts in animal tissues and its mass production technology has not been established. It is not something you can do.
  • lucosamine 2-1 melase has been desired. It is known to be present in animal tissues, for example, Assis Datta (Meso 'No ⁇ in-ensa', Imology, et al., Methods in Enzymology, 41 , 407-412 (1975)] has a silk 'lucosamine 2-emerase' in pig kidney. Reports that In addition to pig kidney, it is also known to be widely found in human and rat kidneys, liver, mucosal cells, submandibular glands, large and small intestinal mucosa, salivary glands, etc. I have.
  • the present inventor further carried out the operations of gel filtration, various chromatographies such as gels and hydrophobic gels, and ⁇ -mat-casin; r. Performed, but did not show enzyme activity due to dispersion of enzyme activity or deactivation of enzyme. Therefore, the enzyme could not be recovered in a pure form. It is one of the reasons that purification is difficult because 'acyl. Glucosamine 2-emera' is only present in trace amounts in the kidney.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a large amount of silk "lucosamine 2-emerase” at low cost.
  • Another object of the present invention is to provide acyl percosamine 2-emera.
  • the present invention relates to a silkworm, "Le. Cosamine 2- ⁇ !.
  • the purpose is to provide a DNA molecule that encodes "merase”.
  • the present invention provides a transformant obtained by introducing into a cell a recombinant vector into which a DNA molecule encoding the silk "lucosamine 2-eh. Melase” has been incorporated. The purpose is to provide.
  • Still another object of the present invention is to provide a hypotensive agent.
  • the present study aims to provide a novel epimerizing agent that converts N-cetyluc ', lucosamine to N-cetylmannosamine.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing N-acetylmannosamine.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing N-acetyl / ilamic acid.
  • the present invention aims to provide a novel polypeptide.
  • FIG. 1 shows the silk lucosamine 2, ⁇ hi.
  • FIG. 1 is a view showing the nucleotide sequence of "merase” and the amino acid sequence.
  • FIG. 2 is a diagram showing a restriction map of the plasmid pEPIl.
  • ⁇ indicates pBluescript, which is vector DNA
  • ⁇ indicates inserted DNA.
  • AGE indicates the region of the gene coding for the silkworm “lucosamine 2-1 peptide”
  • PI ⁇ indicates the lac promoter.
  • FIG. 3 shows the results obtained by reacting the extracts of the cells transformed with the recombinant plasmid and the untransformed cells in a reaction mixture using N-acetylmethyl mannosamine as a substrate.
  • FIG. 3 is a view showing a chromatogram analyzed by HPLC after the chemical conversion.
  • GlcNAc indicates N-acetyl cool cosamine subjected to PMP
  • ManNAc indicates N-acetyl manzosamine converted to PMP.
  • Fig. 4 shows the immunostaining of purified silkworm “rucosamine 2- ° melase” from kidney and SDS-electrophoresis of the cell extract. is there.
  • Lane 1 is purified silk “lucosamine 2-e !: Melase” derived from porcine kidney
  • Lane 2 is an extract of Pseudomonas aeruginosa
  • Is an extract of I. coli transformed with pEPIl
  • Lane 4 is an extract of P. coli transformed with pEP114.
  • Figure 5 shows the partially purified enzyme in hydroxya.
  • FIG. 4 is a view showing a pattern when eluted after passing through a tight column. The solid line shows the elution of the protein, which can be measured from the UV absorption at 280 nm, and the broken line shows the activity of the silk "lucosamine 2-emerase". The 'collected' fractions are indicated by arrows.
  • the present inventor has purified silk lucosamine 2-emera to the extent that an antibody can be produced, and obtained a gene using the antibody.
  • the cloning and production of the silk, lucosamine 2-merase, were carried out by the replacement method, and the biological activity of the resulting silk, lucosamine 2-1 heat-melase,
  • the silk "lucosamine 2-emerase" has a renin binding activity.
  • the present invention has been completed based on the above findings. .
  • the present invention provides an acyl lucosamine 2-emerase- 'and a derivative thereof described in the following items 1 to 22; a DNA molecule encoding the enzyme; and a set incorporating the DNA molecule.
  • Item 1 Substantially pure asilk, 'Lucosamine 2-1 Melase'.
  • Item 2. Amino acid sequence of the following formula (A) or a part thereof is substituted X is amino acid in which X is deleted
  • Derivatives having the enzymatic activity (provided that the amino acid sequence in which a part of the amino acid sequence is substituted or deleted as described below is an amino acid sequence) Has):
  • Item 3 A DNA molecule that encodes "silk” lucosamine 2-pimelliase, '. Item 4. A nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the above formula (A) or a part thereof is substituted or deleted. Item 4. The DNA molecule according to Item 3, which comprises a nucleotide sequence encoding the lost amino acid sequence. (However, the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence in which a part of the amino acid sequence of the above formula (A) is substituted or deleted is 'asil': lucosa.min 2-1. It encodes a polypeptide having mela-activity). Item 5. The DNA molecule according to claim 4, which has a base sequence represented by the following formula (X).
  • Item 6 A recombinant vector in which a DNA molecule coding for silk lucosamine 2- ⁇ merase is incorporated.
  • Item 7 The DNA molecule in which a base sequence encoding the amino acid sequence of the formula (A) or a part thereof is substituted or deleted.
  • Item 7. The recombinant vector according to Item 6, which contains a nucleotide sequence encoding a amino acid sequence. ⁇
  • Item 8 The DNA vector The recombinant vector according to Item 7, comprising the nucleotide sequence of the formula (X).
  • Item 9 A transformant obtained by introducing a recombinant vector containing the DNA molecule according to Item 3 into a cell.
  • Transformants are prepared by introducing a recombinant vector into which a DNA molecule encoding asil and 'lucosamine 2- ° melase' has been incorporated into cells, and the transformant is used as a medium.
  • acyl ⁇ 'lucosamine 2-merase "in the culture, and from the culture, asil, lucosamine 2-ethyl. Melase, ⁇ silk, ⁇ lucosamine 2-eh. Melase,
  • Item 11 Silk containing "renin-binding activity", "Rucosamine 2-emerase”.
  • Item 12 The epimerase according to Item 11, comprising the polypeptide described in any one of (1) to (3) below as an essential component.
  • Item 13 Any one of the following polypeptides (1) to (3) (however, the polypeptide represented by the general formulas (R-1), (R-2) and (R-3)) except for ) .
  • amino acid sequence represented by the formula (A) is an essential sequence Polypeptide
  • Trp Trp Pro His Thr Glu Ala Met lie Ala Phe Leu
  • Item 14 A DNA molecule encoding the polypeptide described in Item 13.
  • Item 15 The DNA molecule according to item 14, which has a base sequence represented by the formula (X).
  • a transformant is introduced into cells by introducing a recombinant vector into which a DNA molecule encoding 2-merase, 'has been incorporated, and the transformant is cultured in a culture medium.
  • Has a renin-binding activity characterized in that it produces and accumulates luciramine "lucosamine 2-pimelase” and collects luciramine "lucosamine 2-emerase” from the culture.
  • An anti-hypertensive agent comprising, as an essential ingredient, asil "lucosamine 2-emerase, or a derivative thereof according to Item 11 or 12.
  • Item 20 An epimerizing agent that converts a N-acetyl-coursamine cap into N-acetyl-mannosamine, comprising a protein having a renin-binding activity as an essential component.
  • Item 21 A method for producing N-acetyl mannosamine, which comprises causing a protein having renin-binding activity to act on N-acetylc "lucosamine.
  • Item 22 A method for producing N-acetylbalaminic acid, which comprises causing a protein having renin binding activity and N-acetyltilbamine-contacting lyase to act on N-acetyllucosamine and pyruvic acid.
  • the above proteins (R-1), (R-2) and (R-3) are Although a child with binding activity has been known (H. Inoue et al, J- Biochem , 110, p.493- 500 (1991)%) ⁇ , Ashiruku; 'benzalkonium the summing 2-1 Mela - Se However, it has never been known to have an activity. Therefore, the “protein having renin binding activity” used in the method for producing ⁇ -acetylmethyl mannosamine and the method for producing acetyl neuraminic acid of the present invention include the above-mentioned proteins (Rl), (R-2 ) And (R-3) are included.
  • the present invention is characterized in that at least one kind selected from the group consisting of the above proteins (R-1), (R-2) and (R-3) is acted on. It provides a method for producing cetyl manpamine.
  • the present invention provides at least one kind selected from the group consisting of the above-mentioned proteins (Rl), (R-2) and (R-3) in N-acetylpyrucosamine and pyruvate. And a method for producing N-acetylneuraminic acid, characterized by reacting N-acetyl / reamylamine.
  • the “protein having renin binding activity” which is an essential component of the epimerizing agent of the present invention includes the above-mentioned proteins (R-1), (R-2) and (R-3). It is.
  • the present invention comprises at least one essential component selected from the group consisting of the above-mentioned proteins (Rl), (R-2) and (R-3). It is intended to provide a epilimerizing agent for cetyluk, lucosaminka to N-acetylmannosamine.
  • novel polypeptides of the present invention include: Useful as
  • first invention should be considered as having only the activity of azil glucocholamine 2-1.It is irrelevant to the presence or absence of renin binding activity. Therefore, it is referred to as "first invention" hereinafter.
  • the above items 11 to 22 have both the luciferin 2-epimelase activity and the renin binding activity, and are hereinafter referred to as "second invention".
  • the “present invention” includes both the first invention and the second invention.
  • At least one part of the first silk "Lucosamine 2-eh. Melase” is at least part of the first silk "Lucosamin 2-il: ° melase” activity and renin binding.
  • the epimerase includes all proteins having ryosin 'and lucosamine 2-engineering activity, irrespective of the presence or absence of renin binding activity.
  • Cells transformed with a plasmid incorporating a DNA molecule encoding melanin include bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, actinomycetes and lactic acid bacteria, mold and yeast.
  • bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, actinomycetes and lactic acid bacteria, mold and yeast.
  • a cell in which plasmids such as cultured cells derived from mammals such as eukaryotic microorganisms, mouse cells, rat fibroblasts and COS cells, and plant cells are stably retained and function. If present, the cells are not limited to the cells exemplified in the present application. In the present invention, asil, lucosamine 2-eh.
  • the present invention discloses, for the first time, a method of isolating the asbestos "lucosamine 2-emerase” in a form substantially free from impurities, and discloses a method for producing the same. It has also been found for the first time in the present invention that at least a part has a renin binding activity. As long as it has an activity of "lucosamine 2-epimerase” and renin binding activity, it is included in the scope of the second invention regardless of its amino acid sequence. For example, in the present invention, FIG. The 5'-end and Z or 3'-end of the DNA molecule coding for silk 'lucosamine 2-emerase' having the amino acid sequence and the base sequence shown in Fig. 3 are exo-type nucleases.
  • DNA molecules cut and cut to several to hundreds and several tens more, and several to several tens of N-terminal or C-terminal amino acids encoded by the DNA Derivatives of the enzyme from which the acid has been removed are also included in the scope of the present invention as long as they retain the enzyme activity.
  • partial mutation is caused by a known method, so that the inside of the amino acid sequence is Polypeptides in which one or more of the amino acids have been replaced or deleted by mutation with other amino acids also have the ability to have asil, lucosamine 2-1 merase activity. Therefore, they are included in the scope of the present invention.
  • Possible positions for substitution and / or deletion include, for example, positions 10, 13, 21, 23, 27, 33, 45 of the polypeptide represented by the above general formula (A). , 47, 51, 71, 72, 76-79, 93, 94, 101, 1 10, 120, 136, 1 37, 139, 141, 142 , 145th, 149th, 155th,
  • the present invention further provides several to several tens of amino acids at the N-terminus and / or C-terminus of a polypeptide having an ashes "lucosamine 2-merase activity. Those to which an acid has been added are also included as long as they have the activity of silk lucosamine 2-1 melase.
  • the donor of the nucleic acid molecule encoding the silk lucosamine 2-glucose, used in the present invention is not particularly limited.
  • animal tissues having such enzyme activities such as kidney of kidney and human kidney, liver, mucous membrane cells, submandibular gland, large intestine and small intestine, dividing membrane of intestine and salivary gland, etc. No.
  • the nucleic acid molecule is obtained from these animal tissues.
  • Nucleic acid molecules include DNA and RNA, but are preferably RNA.
  • RNA encoding melase- ' was prepared by the method of Choyczynski et al. [Analytical-Hybrid Chemistry]
  • RNA molecules can be further prepared by the method described in Molecular Cloning, 2nd edition, Vol. It can also be obtained as RNA having poly (A tail).
  • the use of this poly A-tailed RNA facilitates the use of RNA, lucosamine 2-eh. It is possible to obtain a cDNA encoding melas'.
  • RNA to cDNA The conversion of RNA to cDNA is described in, for example, Current Protocols, Vol. 1, 5.5.1, Current Protocols in Molecular Biology. -5.5 ⁇ 10 (1990). Alternatively, it can be carried out using a commercially available cDNA synthesis kit (eg, manufactured by Amersham, Stratagene, etc.).
  • cDNA is a type of vector, for example, a phage vector.
  • CDNA libraries can be constructed by importing DNA into a vector or a plasmid vector. The construction of the cDNA library can be carried out by the method described in Molecular Cloning, 2nd edition, Volume 2, Sections 8.1 to 8.86, and the like.
  • a tight column and an ion exchange column are used in this order, and the fraction with the highest activity of the enzyme that is dispersed and eluted is analyzed. It was found that the enzyme was purified by removing a part of it and further performing the separation with an ion exchange column twice. The obtained enzyme fraction was further purified by high-performance liquid chromatography (HPLC) using a reversed-phase column (Micro Fonta Sphere-C4 (manufactured by Millipore)). The purified enzyme protein containing substantially no impurities can be obtained The enzyme is almost inactive when purified by reversed-phase HPLC, so it is hardly used for enzyme purification.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • an antibody that specifically reacts with the enzyme protein can be obtained by immunizing rabbits with silk, lucosamine 2-1 melase, purified by HPLC. .
  • the purified enzyme protein can be obtained from 5.6 kg of renal cortex of bushu.
  • the DNA molecule that encodes "melase” can be isolated from the constructed cDNA.
  • the isolation method is to use an expression vector such as Agt11 or ⁇ as a vector.
  • the transformant containing the DNA encoding acetyl glucosamine 2-1 melamine is Isofu. Muchihi.) --D-Cho force, producing 'akashiru, lucosamine 2- ⁇ .
  • Melase by exposure to lactrahan', which is combined with antibodies and further alkaline Binds phosphatase-conjugated anti-magpie antibody By reacting 5-fluoro-4- ⁇ -3-indolyl phosphate solution with 2-fluorotetra and perium solutions, the DNA that encodes the enzyme is retained. Recombinants can be selected and obtained.
  • the DNA ability to encode the obtained silk lucium and lucosamine 2-merase is used. If the plasmid is inserted into plasmid DNA, E. coli having the DNA is used as it is in an appropriate medium. By culturing in the medium, it is possible to obtain the silk "Lucosamine 2-Emerase". When ZAP is used as a vector, the phage containing the obtained DNA and flHelha. -By co-infection of furba, it is possible to cut out a plasmid containing the DNA. By a series of these operations, for example, expressed by equation (X)
  • cells such as Escherichia coli were isolated using a plasmid containing a DNA fragment encoding the silk 'lucosamine 2-pimellase,' obtained as described above. Transform.
  • the transformed cells are cultured as described below to obtain cultured cells.
  • Culture conditions vary depending on the type of cells to be transformed, and those skilled in the art can easily determine culture conditions according to the type of cells.
  • the cells may be cultured by the usual solid culture method, but the liquid culture method may be used. It is desirable to culture them.
  • the medium used for cultivation includes a carbon source, a nitrogen source, inorganic compounds and other nutrients, and is generally used for culturing bacteria. Any medium, semi-synthetic, or natural medium can be used.
  • Carbon sources that can be used in the above medium include sugar solutions such as glucose, fructose, invert sugar, starch, saccharified solution, sorbitol, and glycerol, pyruvate, lingoic acid, and succinic acid. Examples of such organic acids can be given.
  • Examples of the nitrogen source include ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium phosphate, ammonium hydroxide, ammonium tartrate, ammonium acetate, and urea.
  • substances that can be used both as a carbon source and a nitrogen source include peptone, yeast extract, meat extract, and colonica.
  • the inorganic compounds include potassium phosphate, sodium phosphate, sodium phosphate, sodium phosphate, sodium phosphate, magnesium sulfate, magnesium sulfate, and magnesium chloride.
  • examples include shim, potassium chloride, sodium chloride, ferrous sulfate, ferric sulfate, ferric chloride, manganese sulfate, and manganese chloride.
  • the culturing time and culturing temperature of the transformed cells are not particularly limited.
  • the cells are Escherichia coli, they are usually around 20 ° C to 42 ° C, preferably 30 ° C to 37 ° C. Around C, usually 4 ⁇ 48 During the incubation, preferably for 8 to 14 hours. Under these conditions, culture by ordinary shaking culture or aeration-agitation culture.
  • the DNA encoding the azyl lucosamine 2-epimera-se 'of the present invention is ligated to a suitable vector and transformed into a suitable host cell, the enzyme inside or outside the transformed host cell is obtained.
  • the concentration can be increased, and the enzyme can be produced efficiently.
  • the vector used in the present invention has the following elements. That is, it comprises a promoter having a correct orientation and arrangement for expressing a DNA encoding the enzyme in a transformed host cell, and a translation activating sequence. Any vector with these elements can be used, but a preferred vector has an appropriate selection marker and has many Pee is preferred, for example
  • the intracellular concentration of asil, lucosamine 2-ethyl melase can be increased.
  • PPL-lambda a heat-induced expression vector, can also be used. When using the vector te this, this raising the temperature of the culture solution to 40 to 45 a C As a result, it is possible to increase the intracellular concentration of alkyl lucosamine 2-emerase.
  • the terminal DNA of the DNA encoding the asil'lucosamine 2-epimerase-se is used. Deletion can also increase the productivity of the enzyme and increase the efficiency. For example, by decomposing the 5 'end and / or 3' end of the DNA molecule with exonuclease or the like to such an extent that the silk "lucosamine 2-epimerases activity is not lost. In addition, it is possible to further enhance the ability to produce the asil “lucosamine 2- ⁇ merase”, and to introduce site-directed mutations ⁇ random mutations.
  • DNA molecule is also possible to enhance the productivity of the enzyme by substituting or deleting internal DNA, for example, by introducing the DNA molecule into a vector that can become a single strand of pBluescript M13ck.
  • a single-stranded DNA containing the DNA molecule is prepared, and the single-stranded DNA contains a sequence to be mutated or contains a deleted sequence.
  • a primer triphosphate, ATP, DNA
  • a partial mutation can be introduced by performing a primer extension reaction in the presence of a polymerase fragment and a T4 ligase.
  • cassil "lucosamine 2-eh. Is obtained by culture. Can be extracted from the cells. Extraction can be carried out according to a normal enzymatic extraction method from cells. For example: cells can be disrupted by sonication, various mechanical treatments, enzymatic treatments, etc., and the enzyme can be recovered in the supernatant after separating insolubles by centrifugation etc. .
  • the recovered crude enzyme can be purified by appropriately selecting and combining general enzyme purification methods. For example, by purifying nucleic acid, ammonium sulfate, diatomaceous earth, ion-exchange ⁇ -mat® rough, etc., a large amount of purified asil and 'lucosamine 2-1 merase' can be obtained.
  • the Escherichia coli strain containing the DNA molecule shown in Fig. 1 and containing pEPIl in Fig. 2 was deposited on March 11, 1994 with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry, Ministry of International Trade and Industry, and the accession number: FERM BP-4602 was attached.
  • the present inventors have conducted various studies on the biological activity of the polypeptide of the general formula (A) derived from the pig kidney obtained in the second invention, and as a result, the enzyme was found to be asil "lucosamine 2-emerase-se '. It was revealed that the polypeptide had not only the activity but also the renin binding activity, which means that the polypeptide binds to the renin,
  • the polypeptide of the general formula (A) was obtained according to the method for producing the silk "lucosamine 2-1 merase-se 'of the present invention.
  • the renin-binding protein of the general formula (R-3) derived from pig kidney was obtained by the method of Inoue et al. (H.
  • both proteins (A) and (R3) differing in purification method are very similar, having the same sequence except for the four amino acids at positions 149, 289, and 317 and 318. It is a protein.
  • both the protein (A) obtained in the present invention and rat kidney-derived epimerase have renin binding activity. From this, at least for some proteins, silk-lucosamine 2-emerase activity and renin binding activity are inseparable, and have a similar structure to protein (A). It is considered that all of the known Renin-binding proteins (Rl), (R-2) and (R-3) have epimerase activity.
  • the renin-binding protein when the renin-binding protein has the activity of asbestos and lucosamine 2-11: ° melase, the renin-binding protein can convert N-acetyllucosamine to N-acetylmanmine. It can also be used as a catalyzing epimerizing agent.
  • the protein of general formula (A) is at positions 10, 13, 21, 23, 27, 33, 45, 47, 51, 71, 72, 76-79, 93, 94th, 101st, 110th, 120th, 136th, 137th, 139th,
  • the present invention separates a DNA molecule coding for acylglucosamine 2-epimerase present in animal tissues, prepares a recombinant plasmid having the DNA molecule, and converts this plasmid into Escherichia coli.
  • a large amount of asil "lucosamine 2-1 merase” can be efficiently and efficiently introduced into the cells.
  • a method of producing and collecting the same is disclosed. Renin hydrolyzes the angiotensin-ken in the blood,
  • Angiotensin I produces antensin I.
  • Anchi, antensin and angiotensin I are converted to anchisin by tensin I-converting enzyme. Is expressed. It also acts on the spheroid layer of the adrenal cortex and promotes aldosterone secretion.
  • the renin-anchi-ottensin system plays an important role in regulating blood pressure. It is widely used as a therapeutic drug (antihypertensive).
  • the silk of the present invention 'le] Samin 2- ⁇ . Melase is useful as an antihypertensive because it binds to and inhibits the activity of Renin.
  • Renin-binding protein has the activity of ascyl'lucosamine 2-hemo-se ". Therefore, renin-binding protein converts, for example, N-acetylc" lucosamine to N-lycetyl mannosamine. Can be used as a pimmeling agent. That is, when the renin-binding protein is allowed to act on N-acetylc "lucosamine, N-acetylman / samine can be obtained. When acted on N-acetyl glucosamine and pyruvate, first, N-acetyl percosamine is converted to N-acetyl mannosamine by the renin-binding protein. N-acetylmethyl mannosamine and pyruvate are combined to give N-acetyl neuraminic acid.
  • a hypotensive agent can be obtained by using the protein having the renin binding activity of the present invention.
  • the protein having renin binding activity also has azilc "lucosamine 2-emerase” activity
  • the protein is converted from N-acetylc "lucosamine to N-acetilman / samine. It can be used as an epimerizing agent.
  • the bentonite treatment SI ⁇ DEAE-Cell ⁇ s-column chromatography, luffy treatment and canoleic acid phosphate gel treatment were used to purify 387 mg of sirlucosamine 2-engineer. A partially purified enzyme was obtained.
  • the partially purified enzyme was equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.6).
  • the solution was passed through a evening column (inner diameter 26 mm x length 95 mm; manufactured by Kagurako Pure Chemical Industries, Ltd.) and eluted with the same buffer.
  • the fraction having the enzyme activity was eluted in a widely dispersed state (see FIG. 5).
  • the enzyme was further purified by carrying out a ku Dokuto "raffy.
  • Q is a kind of ion exchangers - ceph ⁇ loin filled with (full Arumashia Co.) in mosquito ram having an inner diameter of 26 mm X length 100 mm, 20 mM of-phosphate buffer (P H7.6, (500 ml).
  • P H7.6, 500 ml
  • 75.6 mg of the above partially purified enzyme was adsorbed to the column, and eluted by a linear concentration gradient elution method of a phosphate buffer (pH 7.6) containing 100 mM to 300 mM rhodium.
  • the main peak (198 ml) of the protein eluted at a concentration of about 180 mM in the chloride room was collected and concentrated and dialyzed. 23.
  • Omg of the dialysis-treated enzyme was adsorbed on the Mono Q column (Pharmacia) by passing through the column.
  • the adsorbed enzyme was eluted by a linear concentration gradient elution method using a phosphate buffer (pH 7.6) containing 200 mM to 300 mM chlorinated readium.
  • the protein peak eluted at a chloride concentration of around 220 mM was collected, and desalted using a gel filtration column.
  • the obtained activity of 15.9 mg of the enzyme is 21 unit mg protein in specific activity, which is 3.5 times higher than the activity (6 unit protein mg) reported in the above-mentioned Assis P ⁇ ⁇ tta. High purity enzyme was.
  • the main peak of the protein which can be measured from ultraviolet absorption at 280 nm, was collected and dried under reduced pressure.
  • a 9-week-old pupa (Japanese white breed) was immunized with 5.2 mg of asil “Lucosamine 2 eh. Merase”, which had been purified, and about 150 ml of antiserum was obtained by partial and whole blood collection.
  • We Based on the antiserum, refer to the description of the Biochemical Society of Japan, Shinsei Chemistry Laboratory Course 12, Molecular Immunology III, (1992), p. 24, and ⁇ -tin A Sepharose (manufactured by Pharmacia). Was used to purify the IgG.
  • RNA having a poly A tail of 67 / g was obtained.
  • a cDNA library was prepared from the RNA having the poly A tail (5
  • the resulting library was 4.5 ⁇ 10 12 plaque forming units.
  • the screening of the recombinant having the DNA coding for the silk "Lucosamine 2-Emerase” was carried out by using the antibody described in Example 1 and a Stratagene picol- The immunostaining method was performed using an immnosk-nink 'kift.
  • the cells were inoculated into an LB medium (1 peptone, 0.5% yeast extract, lNaCl, pH 7.0) containing lOOmgZ littorane ampicillin, and cultured by shaking. Also, in order to produce the enzyme more efficiently, at the start of the cultivation, isopropnyl-D-tactile "lactopirand was added to the medium so that the final concentration became ImM 37 ° C. After culturing for 12 hours in C, the cells were pelleted by centrifugation (5000 rpm, 10 minutes) . The cell extract was obtained by sonication of the cells.
  • This cell extract can be obtained from 40 mM N-acetyl mannosamine (manufactured by Nakarai Tesque) or 40 mM N-acetilku'lucosamine (manufactured by Nakarai Tesk), 4 mM adenosine triphosphoric acid (Kojinsha), 10 mM magnesium chloride and 100 mM tris-in the presence of hydrochloric acid buffer ( ⁇ .5) (final volume 0.5 ml) ) For 37 and 30 minutes. The reaction was stopped by boiling the reaction mixture in boiling water for 3 minutes.
  • Ommx length 150mm (manufactured by Nakarai Tesque)
  • the mobile phase was a 2-to-8 mixed solution of sodium acetate and 50raM potassium phosphate buffer (pH 7.0.0). The solution was sent at a flow rate of. Detection was measured by the amount of ultraviolet absorption at 245 nm.
  • the unit showing the enzymatic activity is a unit, and one unit reacts with peracetyl mannosamine as a substrate, and mol of per-minute is converted into per-minute amount of peracetyl mannosamine. 'Defined as the activity to produce lucosamine.
  • plasmid pEPIl By constructing the above-mentioned plasmid pEPIl, a high-throughput microorganism, high-grade silk lucosamine 2-1 melase can be produced Became possible. Cleavage was performed at 37 ° C for 4 hours in a 500 // 1 solution of the plasmid pEPIl (20 // g) with 100 units of Sacl and 100 units of Xbal restriction enzyme. The restriction enzyme-treated solution was treated at 75 ° C for 15 minutes, extracted with phenol / chloroform (1: 1), and precipitated with ethanol.
  • the precipitate was dissolved in sterile water so as to be l / ig // l, and several dozen types were prepared using Kiso / man-te-iri-quip (product of Stratagene).
  • Kiso / man-te-iri-quip product of Stratagene.
  • the authors made a new “Irijon Rasmid”, and confirmed that the plasmid pEP114 produced Ryokusil ', ru] samine 2-emerase at a high level.
  • D Le -D-Chi Talent 'Lact I The cells were cultured in LB medium containing Rahand at 37 ° C for 12 hours, and a cell extract was prepared from the pellets of the culture. In the cell extract, the activity of alkosamine 2-lucomer-serum was approximately 1000 units per liter of culture, and the specific activity was 1.6 U / ing. An approximately 53-fold increase in the extract of pig renal cortex was observed.
  • the plasmid pEP114 provides an effective means of producing large amounts of silk "Lucosamine 2-X Pimella-se" in E. coli.
  • the cultures were 100 mg / liter / liter of ampicillin and ImM's Isoph. mouth Le-D-Chi Talent ', Lactohi. 1 liter of LB medium (1% peptone, 0.5% yeast extract, l ⁇ NaCl, ⁇ 7.0) containing runts into two 2-litre shaking flasks Then, each of them was inoculated with 1-Blue I.sup.x hybridia transformed with the plasmid PEP114, and the mixture was shaken. After culturing at 37 ° C for 12 hours, the culture was collected by centrifugation and washed twice with physiological saline. Cultures were incubated with ImM EDTA and 0.05% 2-mercuff.
  • the nucleic acid removal treatment was performed by adding prominin sulfate (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) to a concentration of 0.03% (W / V) and obtaining the supernatant by centrifugation. .
  • the supernatant was subjected to salting-out treatment with ammonium sulfate, and a 20-80% saturated fraction of ammonium sulfate was collected and dialyzed against the above-mentioned phosphate buffer.
  • the dialysis solution was adsorbed by passing through a DEAE-cellulose (made by Petman) column (diameter 5 cm x height 10 cm) equilibrated with the above phosphate buffer.
  • the adsorbed protein was eluted by adding a chlorinated readium at an appropriate concentration to the above-mentioned phosphate buffer passing through. Since the activity was eluted at a concentration of 75-100 mM potassium chloride, the active fractions were collected, and the membrane was filtered. Concentrated with a molecular weight of 10,000, manufactured by Amicon After desalting, the mixture was passed through a Q-Sepharose (manufactured by Phanolemacia) column (1 cm ID ⁇ 5 cin diameter) equilibrated with the above phosphate buffer.
  • the adsorbed protein was eluted by a linear gradient elution method using the above phosphate buffer containing 100 mM rhodium chloride and the above phosphate buffer containing 300 mM potassium chloride. Eluted.
  • the active fractions of luciramine 'lucosamine 2-emerase' are collected, concentrated and desalted with the above-mentioned membrane filter to purify the purified closin 'lucosamine 2-mercerase. '
  • Example 1 (1) Using a rat kidney (300 g), rat-derived asquel 'lucosamine 2-emerase-' was purified in the same manner as in Example 1 (1). However, the purification step using the reversed-phase column (Microphone, 'NTA' Sphere-5 // C4) in Example 1 (1) was not performed because the enzyme was inactivated, and the mono-Q column was not used. Purification was performed again to obtain asil, lucosamine 2-emerase- "(0.15 mg).
  • the rat silk "Lucosamine 2-emerase” of the rat obtained in Example 4 was used in place of the luciferase "Lucosamine 2-emerase” obtained in Example 3
  • the inhibitory activity of renin by acyl lucosamine 2-ethyl melase was measured in the same manner as in Example 5. The results are shown in Table 2.
  • the above 100 // 1 reaction mixture was used for gel filtration and ⁇ -mat "Raffy-[column, Superose 12HR 10/30; mobile phase. 50 mM sodium phosphate buffer (pH7.5)- 150raM sodium chloride; flow rate l mlZ; detection. Ultraviolet (280nm)] fractionation, and measurement of the renin activity of each fraction, changes in the molecular weight of renin. Measure
  • Example 7 In place of the cloned silk “lucosamine 2-epimerase” obtained in Example 3, the rat silk “lucosamine 2-emerase” of the rat obtained in Example 4 was used. In the same manner as in Example 7, the molecular weight was measured by gel filtration using ⁇ -matrix. As a result, as in Example 7, the molecular weight of lenin was increased to about 60,000 daltons.
  • N-Acetyl lucosamine is insoluble, N-acetyl mannosamine is soluble, so the precipitate (N-acetyl lucosamine) is removed by filtration, and the filtrate is concentrated under reduced pressure to a purity of 91%. 2 g of the above-mentioned N-cetylmanmin was obtained.
  • Example 3 In 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 5 mM ATP and 5 mM MgCl 2 , 22 g of N-acetylc "lucosamine and llg of pyruvate were dissolved, and 15 mg of this solution was obtained in Example 3. A protein having renin-binding activity and 500 units of N-acetyl / lyamate are added to make a total of 0.5 liter, and the reaction is performed at 30 ° (:, 48 hours). After the reaction, 12.4 g of N-acetyl / Ilamic acid was produced in the reaction solution.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

明 細 書
ェ ピメ ラ ーゼ
^
本発明は、 ァシルク"ルコサミン 2 メラ-セ"及びそ の誘導体、 該 酵素を コ ー ドする D N A分子、 該 D N A分子を組み込ん でな る組換え体ベク タ ー、 該ベク タ ーを保有する形質転 換体及び該ェ ピメ ラ ーゼの製造方法に関する。
本発明は、 新規ポ リ ペプチ ド、 レニ ン結合活性を有す るァシルク';レコサミン 2-ェ メラ-セ"及びその誘導体、 該酵素等を コ — ドする DNA分子、 該 DNA分子を組み込んでな る組換え体 ベク タ ー、 該ベク タ ーを保有する形質転換体、 該ェ ピメ ラ ーゼの製造方法、 該酵素又はその誘導体を必須成分と する 降圧剤、 ェ ピメ リ 化剤並びに N-ァセチルマンノサミン及び N-ァセ チル ラミン酸の製造法に関する。
背 景 技 術
N-ァセチルノイラミン ϋは、 近年医薬品原料と して注目 さ れてい る。 こ の Ν-ァセチルメイラミン酸は、 Ν ァセチルマンノサミンと ピノレ ビ ン酸と か ら、 Ν-ァセチルノイラミン酸リア- を用 いて酵素的に合成でき る こ とが知 られている。 しか し、 Ν-ァセチルマンノサミンは高価力ヽっ大 量の入手が困難であ る ため、 安価な Ν-ァセチルク'ルコサミンと ピル ビ ン酸をァシルク、、ルコサミン 2—ェヒ。メラ-セ、、及び Ν ァセチルノイラミン酸リア-セ、、の 存在下で反応させて Ν-ァセチル ラミン酸を得る方法が提案さ れ て い る 〔ゥト " ·クラーク、、ル（Udo Kragl)ら、 アンケ、、ハ"ンテ '· ·へミーインタ一 ノ ナショナル ·ェテ'、イシヨン-イン ·インク、、リ 7シュ（Angewandte Chemi- ■'
International Edition in English), 30. 827-828 (1991)〕 o こ の方法は、 ァシルク、、ルコサミン 2-ェヒ。メラ一セ'、力 N-ァセチル ク"ルコサミンを N-ァセチルマンノサミンにェ ピメ リ ィ匕する こ と を利用 して い る。 し力、 しな力 ら、 こ の方法で用 い られてい る ァシルク"ル コサミン 2-ェヒ°メラ-セ は動物組織中 に微量 しか存在 してお ら ず、 ま た、 そ の大量生産技術 も確立さ れていな いため、 実用 的に使用 でき る も のではな い。
一方、 テシマ（Teshima)ら 〔クリニカル ·ケミストリー（ CI ini cal
Chemistry), 34. 2291 -2294 ( 1988)〕 は、 N-ァセチルノイラミン酸 の定量にァシルク"ルコサミン 2-ェ メラ-セ'が有効であ る こ と を示 し て お り、 さ ら に林 ら （特開昭 60- 186300号公報） は、
N-ァセチルへキソサミンの定量に も該酵素が有用であ る こ と を示 し て い る。
以上の よ う に、 ァシルク"ルコサミン 2-ェ メラ-セ 'Ίま非常に重要な 酵素であ り、 その効率的な製造法の確立が切望さ れて き ァシル ルコサミン 2-1 メラ-セ は、 動物の組織に存在す る こ と が知 ら れて お り、 例えばアシス 'タ"フタ（Asis Datta) 〔メソ 'ノ Γ · イン -ェンサ'、ィモロジ、、一（Methods in Enzymology), 41, 407一 412 ( 1975 )〕 は、 ブタ の 腎臓に了シルク'ルコサミン 2-ェ メラ-セ'が存在 する こ とを報告 している。 ま た、 ブタ 腎臓の他に も ヒ 卜 やラ ッ. ト の腎臓、 肝臓、 粘膜細胞、 顎下.腺、 .太腸及び小 腸粘膜、 唾液腺等に広 く 存在する こ と も知 られている。
しか しなが ら、 動物組織か らァシルク"ルコサミン 2-ェ メラ-セ"を 精製す る のはきわめて困難であ り、 現在ま での と こ ろ粗 製物の状態で しか得 られていな い。 例えば： Τ-シュ（Ghosh) ら 〔メソフス '、 ·イン-ェンサ、、ィモロシ"一（Methods in Enzymology ), 8, 191 - 195 ( 1966 ) ] や、 了シス 'タ、 タ 〔メ ' ス、、 'イン '工ン Γィモロシ、'一 (Methods in Enzymology), 41. 407—412 (1975)〕 は、 い ずれ もァシルク'ルコサミン 2-ェ メラ- の単離精製を試みてい る 力 、 ゴー シ ュ の報告では精製の程度が低 く、 了シス ·Γ 7タも比活 性で 6ュ 蛋白質程度ま での精製であ る。
すなわち、 これ らの従来技術はブ夕 の腎皮質をホモ ジ ナイ ザーで抽出 した粗抽出液をプロ 夕 ミ ン濃縮、 ベ ン ト ナイ 卜 処理、 DEAE—セルロースカラムク πマトク、'ラフィー及び リ ン酸カ ノレシ ゥ ムゲル吸着等の通常の精製手段を組み合わせる こ とだ けでは、 ァシル ルコサミン 2-ェ メラ- の精製が困難であ る こ と を示 している。
本発明者は、 上記従来の精製方法に加えて さ ら にゲル 濾過、 ヒに口キシ了ハ°タイト及び疎水性ゲル等の各種クロマトク'ラフィ- や、 ク πマト -カシン; rの操作を行っ たが、 酵素活性の分散化 や酵素の失活によ り 酵素活性を示さ な く な る こ と な どの ため、 該酵素を純粋な形で回収する こ と はでき なか っ た。 ァシル.ク ルコサミン 2 -ェ メラ- は、 腎臓中に微量 しか存在：しない' こ と も精製が困難であ る原因の 1 つであ る。
近年、 遺伝子組換え技術の進歩によ り 微生物な どを用 いて異種蛋白質を比較的容易に得る こ とが可能にな っ て きた。 しか しなが ら、 こ の方法を用いる ためには 目 的 と する蛋白質を単離する こ とが必要であ り、 精製度の低い 蛋白 しか得 られていないァシルク、、ルコサミン 2 -ェヒ。メラ-セ、'の場合に は、 該酵素を特定する ための材料、 例えば DN Aプロ ーブや 抗体を作成する こ と はでき ない。 こ のよ う な場合には代 替手段と して部分精製酵素を S D S リアクリルアミにケ ル電気泳動 し、 ホ°リ ニリテ"ンシ 'フルオリに（P VDF )膜にブロ ッ テ ィ ン グ した 後、 ア ミ ノ 酸配列の解析を行い、 そのア ミ ノ 酸配列を基 に D N Aプロ 一ブを合成 して、 目 的遺伝子の検出を行う こ と が常法であ る。 しか しながら、 本酵素の場合には、 こ の 方法で もア ミ ノ 酸配列を決定する こ とができない。 何故 な ら、 ァシルク、'ルコサミン 2 - 1ヒ。メラ-セ"は、 N末端が何 らかの残基 でブロ ッ ク されている ためであ る。
以上の よ う に、 ァシルク"ルコサミン 2 -工 メラ-セ"に関 しては、 通 常、 遺伝子組換えの手段と して用い られる方法のいずれ も用い る こ とができず、 従っ て遺伝子組み換え技術に よ る本酵素の製造の道は閉 ざさ れたま ま であ っ た。 本発明 は、 了シルク"ルコサミン 2 -ェ メラ-セ"を大量且つ安価 に製 造する 方法を提供する こ とを 目 的 とする。
ま た本発明は、 ァシル Γルコサミン 2 -ェ メラ- を提供する こ と を 目 的 とする。
さ ら に本発明 は、 ァシルク、'ル.コサミン 2 -ヱ!:。メラ-セ"を コ ー ドす る DNA分子を提供する こ とを 目 的 とする。
さ ら にま た本発明は、 ァシルク"ルコサミン 2 -ェ メラ- を コ ー ド する DNA分子を組み込んだ組換え体ベク タ ーを提供する こ と を 目 的 とする。
さ ら に ま た本発明 は、 ァシルク"ルコサミン 2 -ェヒ。メラ-セ"を コ ー ド する DNA分子を組み込んだ組換え体べク タ ーを細胞に導入 してな る形質転換体を提供する こ とを 目 的 とする。
さ ら にま た本発明は、 降圧剤を提供する こ とを 目 的 と する。
さ ら に ま た本究明は、 N -了セチルク'、ルコサミンを N 了セチルマンノサミンに 変換する新規ェ ピメ リ 化剤を提供する こ と を 目 的 とする。
さ ら にま た、 本発明は、 N -ァセチルマンノサミンの製造法を提供 する こ と を 目 的 とする。
さ ら にま た、 本発明は、 N -ァセチル /イラミン酸の製造法を提供 す る こ と を 目 的 と す る。
さ ら にま た、 本発明は、 新規ポ リ ペプチ ドを提供する こ とを 目 的 とする。 図面の簡単な説明
図 1 は、 ァシルク'ルコサミン 2，ヱヒ。メラ-セ"の塩基配列と ァ ミ J 酸： 配列を示す図であ る。
図 2 は、 プラ ス ミ ド pEPIlの制限地図を示す図であ る。 なお、 図 2 中、 □は、 ベク タ 一 DNAであ る pBluescript を示 し、 釅は、 挿入された DNAを示す。 ま た、 AGEは 了シルク'ルコサミン 2-1ヒ°メラ-セ"をコー ド化 している遺伝子の領域 を示 し、 PI^は、 lacプロ モー タ ーを示 している。
図 3 は、 組換え体プラ ス ミ ドで形質転換された細胞と 非形質転換細胞の抽出液をそれぞれ N-ァセチルマンノサミンを基質 と した反応液中で反応 し、 その反応液を PMP化の後 HPLCで 分析 した ク ロマ ト グラ ムを示す図であ る。 図 3 中の
GlcNAcは、 PMPィ匕された N-ァセチルクールコサミンを示 し、 ManNAcは、 PMP化された N-ァセチルマンゾサミンを示 している。
図 4 は、 純化 したブ夕 の腎臓由来のァシルク"ルコサミン 2 - °メ ラ-セ "と細胞抽出液を SDS-電気泳動 し、 ウェスタンフ " π '/ト後の免 疫染色を示す図であ る。
図 4 中、 レー ン 1 は純化 したブタ 腎臓由来のァシルク"ルコサ ミン 2-ェ!:。メラ-セ 'であ る。 レー ン 2 は、 ヱシエリヒア *コリの抽出液で あ る。 レー ン 3 は、 pEPIlで形質転換 した Iシエリ tァ 'コリの抽 出液であ る。 レー ン 4 は、 pEP 114で形質転換 したヱシエリヒア •コリの抽出液であ る。 図 5 は、 部分精製酵素をヒ ロキシァハ。タイトカラムに通液 した後. 溶出 した と きのパタ ー ンを示す図であ る。 実線は 280 nmの 紫外線吸収か ら測定でき る蛋白質の溶出を示 し、 破線は ァシルク"ルコサミン 2 -ェ メラ-セ"活性を示 した。 集めた'画分を矢印 で示 した。
_ _ © _開 示
本発明者は、 上記従来技術に鑑み鋭意検討を重ねた結 果、 了シルク"ルコサミン 2 -ェ メラ- を抗体の製造が可能と な る程 度ま で精製 し、 該抗体を用いた遺伝子組換えの方法によ り ァシルク、'ルコサミン 2 -ェ メラ-セ の ク ロ ー ン化及び製造を行っ た。 ま た、 得 られたァシルク'ルコサミン 2 - 1ヒ°メラ-セ、'の生物活性につい て種々 検討 した結果、 意外に もァシルク"ルコサミン 2 -ェ メラ-セ"は レニ ン結合活性を有する こ とが判明 した。 本発明は、 以 上の知見に基づき完成された ものであ る。
すなわち、 本発明は、 下記の項 1. 〜項 22. に記載のァシル ルコサミン 2 -ェ メラ-セ'及びその誘導体、 該酵素を コ ー ドする DNA分子、 該 DNA分子を組み込んでな る組換え体ベク タ ー、 該べク タ ーを保有する形質転換体およ び該酵素の製造方 法、 並びに該酵素を有効成分とする 降圧剤、 ェ ピメ リ 化 剤及び N _了セチルノイラミン酸および N -了セチルマン ミンの製造法を提供 する も のであ る。
項 1 . 実質的に純粋なァシルク、'ルコサミン 2 - 1 メラ-セ"。 項 2. 下記式（A)のァ ミ ノ 酸配列又はその一部が置換 Xは 欠失さ れたア ミ ノ 酸 |Ξ列を含むァシル Γルコサミン 2-ェ メラ-セ、、又 , は該酵素活性を有する誘導体 （但 し、 下記のア ミ ノ 酸配 列の一部が置換又は欠失されたァ ミ ノ 酸配列は、 ァシルク"ル ]サミン 2-ェ メラ-セ、、活性を有する ） ：
( A )
Met Glu Lys Glu Arg Glu Thr Leu Gin Ala Trp Lys
Glu Arg Val Gly Gin Glu Leu Asp Arg Val Met Ala
Phe Trp Leu Glu His Ser His Asp Arg Glu His Gly Gly Phe Phe Thr Cys Leu Gly Arg Asp Gly Arg Val
Tyr Asp Asp Leu Lys Tyr Val Trp Leu Gin Gly Arg
Gin Val Trp Met Tyr Cys Arg Leu Tyr Arg Lys Leu
Glu Arg Phe His Arg Pro Glu Leu Leu Asp Ala Ala
Lys Ala Gly Gly Glu Phe Leu leu Arg His Ala Arg Val Ala Pro Pro Glu Lys Lys Cys Ala Phe Val Leu
Thr Arg Asp Gly Arg Pro Val Lys Val Gin Arg Ser lie Phe Ser Glu Cys Phe Tyr Thr Met Ala Met Asn
Glu Leu Trp Arg Val Thr Ala Glu Ala Arg Tyr Gin
Ser Glu Ala Val Asp Met Met Asp Gin lie Val His Trp Val Arg Glu Asp Pro Ser Gly Leu Gly Arg Pro
Gin Leu Pro Gly Ala Val Ala Ser Glu Ser Met Ala
Val Pro Met Met Leu Leu Cys Leu Val Glu Gin Leu Gly Glu Glu Asp Glu Glu Leu Ala Gly Arg Tyr Ala Gin Leu Gly His Trp Cys Ala Ar Arg lie Leu Gin His Val Gin Arg Asp Gly Gin Ala Val Leu Glu Asn Val Ser Glu Asp Gly Glu Glu Leu Ser Gly Cys Leu Gly Arg His Gin Asn Pro Gly His Ala Leu Glu Ala Gly Trp Phe Leu Leu Arg His Ser Ser Arg Ser Gly Asp Ala し ys Leu Arg Ala His Val lie Asp Thr Phe Leu Leu Leu Pro Phe Arg Ser Gly Trp Asp Ala Asp His Gly Gly Leu Phe Tyr Phe Gin Asp Ala Asp Gly Leu Cys Pro Thr Gin Leu Glu Trp Ala Met Lys Leu Trp Trp Pro His Ser Glu Ala Met lie Ala Phe Leu Met Gly Tyr Ser Glu Ser Gly Asp Pro Ala Leu Leu Arg Leu Phe Tyr Gin Val Ala Glu Tyr Thr Phe Arg Gin Phe Arg Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly Tyr Leu Asn Arg Glu Gly Lys Val Ala Leu Thr lie Lys Gly Gly Pro Phe Lys Gly Cys Phe His Val Pro Arg Cys Leu Ala Met Cys Glu Glu Met Leu Ser Ala Leu Leu Ser Arg Leu Ala
項 3. ァシルク"ルコサミン 2-工ピメラ-セ、'をコー ドする D N A分子。 項 4. 上記式（A)のア ミ ノ 酸配列をコー ドする塩基配列又 はその一部が置換又は欠失されたァ ミ ノ 酸配列をコー ド する塩基配列を含む項 3 に記載の D N A分子 (但 し、 上記式（A )のァ ミ ノ 酸配列の一部が置換又は欠失 されだァ.ミ ノ 酸配列を コ ー ドする塩基配列は、' ァシルク':ルコサ . ミン 2 - 1 メラ- 活性を有する ポ リ ペプチ ドを コ ー ドする ） 。 項 5 . 下記式（X )の塩基配列を有する請求項 4 に記載の D N A分子。
( X )
ATG GAG AAG GAG CGC GAA ACT CTG CAG GCC TGG AAG GAG C GT GTG GGC CAA GAG CTG GAC CGC GTG ATG GCT TTC TGG CTG GAG CAC TCC CAC GAT CGG GAG CAC GGG GGC TTC TTC ACG TGC CTG GGC CGC GAC GGG CGG GTG TAT G AC GAC CTC AAG TAC GTC TGG CTG CAG GGG AGG CAG G TG TGG ATG TAC TGT CGC CTG TAC CGC AAG CTT GAG CGC TTC CAC CG C CCT GAG CTT CTG GAT GCG GCT AAA G CA GGG GGC GAA TTT TTG CTG CGC CAT GCC CGA GTG GCA CCT CCT GAA AAG AAG TGT GCC TTT GTG CTG ACG CGG GAC GGC CGG CCC GTC AAG GTG CAG CGG AGC ATC TTC AGT GAG TGC TTC TAC ACC ATG G CC ATG AAC GAG CTG TGG AGG GTG ACG GCG GAG GCA CGG TAC CAG AGC G AA GCG GTG GAC ATG ATG GAT CAG ATC GTG CAC TGG G TG CGA GAG GAC CCC TCT GGG CTG GGC CGG CCC CAG CTC CCC GGG GCC GTG GCC TCG GAG TCC ATG GCA GTG CCC ATG ATG CTG CTG TGC CTG GTG G AG CAG CTC GGG G AG GAG GAC GAG GAG CTG GCA GGC CGC TAC GCG
CAG CTG GGG CAC TGG TGC GCT CGG AGG ATC CTG CAG ■
CAC GTC CAG AGG GAT GGA CAG GCT GTG CTG GAG AAT
GTG TCG GAA GAT GGC GAG GAA CTT TCT G GC TGC CTG GGG AGA CAC CA G AAC CCA GGC CAC GCG C TG GAA GCT
GGC TGG TTC CTG CTC CGC CAC AGC AGC CGG AGC GGT
GA C GCC AAA CTT CGA GCC CAC GTC ATC G AC ACG TTC
CTG C TA CTG CCT TTC CGC TCC GGA TGG GAC GCT GAT
CAC G G A GGC CTC TTC TAC TTC CAG GAT GCC GAT GGC CTC TGC CCC ACC CAG CTG GAG TGG GCC A TG AAG CTC
TGG TGG CCG CAC AGC GAA GCC ATG ATC GCC TTT CTC
ATG GGC TAC AGT GAG AGC GGG GAC CCT GCC TTA CTG
CGT C TC TTC TAC CAG GTG GCC GAG TAC ACG TTT CGC
CAG T TT CGT GAT CCC GAG TAC GGG GAA TGG TTT GGC TAC C TG AAC CGA GAG GGG AAG GTT GCC CTC ACT ATC
AAG GGG GGT CCC TTT AA.A GGC TGC TTC CAC GTG CCG
CGG TGC CTT GCC ATG TGC GAA GAG ATG C TG AGC GCC CTG CTG AGC CGC CTC GCC TAG
項 6 . ァシルク'ルコサミン 2 -ヱ メラ-セ'を コ ー ドする D N A分子が 組み込ま れた組換え体ベク タ ー。
項 7 . 前記 D N A分子が、 前記式（A )のア ミ ノ 酸配列を コ 一 ドす る塩基配列又はその一部が置換又は欠失さ れたァ ミ ノ 酸配列を コ ー ドする塩基配列を含む項 6 に記載の組 · . 換え体べグタ ー。 ·
(但 し、 上記式（A)のア ミ ノ 酸配列の一部が置換又は欠失 されたァ ミ ノ 酸配列を コ ー ドする塩基配列は、 ァシルク、'ルコサ 5 ミン 2-ェ メラ-セ'、活性を有する ポ リ ペプチ ドを コ ー ドする。 ） 項 8. 前記 D N A力 前記式（X)の塩基配列を含む項 7 に 記載の組換え体ベク タ ー。
項 9. 項 3 に記載の D N A分子を含む組換え体ベク タ ー を細胞に導入 してな る形質転換体。
10 項 10. ァシルク、'ルコサミン 2- °メラ-セ"を コ ー ドする D N A分子を 組み込んだ組換え体べク タ 一を細胞に導入 して形質転換 体と し、 該形質転換体を培地に培養 し、 培養物中に ァシル Γ'ルコサミン 2-ェ メラ-セ"を生成蓄積させ、 該培養物か ら ァシルク、、ルコサミン 2—ェヒ。メラーセ、、を ^ する ァシルク、、ルコサミン 2—ェヒ。メラーセ、、
15 の製造方法。
項 11. レニ ン結合活性を有するァシルク"ルコサミン 2-ェ メラ-セ"。 項 12, 下記（ 1 )〜（ 3 )のいずれかに記載のポ リ ペプチ ドを 必須成分とする項 11に記載のェ ピメ ラ ーゼ。
(1)前記式（Α)で表される ア ミ ノ 酸配列を必須配列 とする 0 ポ リ ペプチ ド ；
(2)前記式（Α)で表さ れる ア ミ ノ 酸配列の 10位、 13位、 21 位、 23位、 27位、 33位、 45位、 47位、 51位、 71位、 72位、 76- 79位、 93位、 94位、 101位、 110位、 120位、 136位、137位、 139位、 141位、 U2位、 145位、 149位、 155位、.
159位、 162位、 163位、 171位、 173位、 174位、 176位、
178位、 187位、 195位、 199-202位、 205位、 208位、 212位. 224位、 232位、 234位、 237位、 243位、 249位、 258— 261 位、 263位、 266位、 267位、 269位、 270位、 272位、 275位-
282位、 287-289位、 300位、 301位、 309位、 317位、 318位、
328位、 329位、 334位、 337位、 348位、 363位、 364位、 371位、 392位、 393位、 395位、 399位、 401位及び 402位か らな る 群か ら選ばれる少な く と も 1 つの位置が置換又は 欠失さ れたポ リ ペプチ ド ； あ る いは
(3)式（A)で表さ れる ポ リ ぺプチ ドの N末端又は C末端に
Pro Ala Pro Ser Pro Ala Pro Thr Pro Ala Cys
Arg Gly Ala Glu ； Pro Ala Pro Leu Gly Ser Leu Pro Ala Val Pro Thr Arg Glu Gly Ser Lys ； ま たは Lys Gly Asn Lys Ser Trp Gin Asp力、'付加 したポ リ べプチ ド。 ； (但 し、 前記式（A)の一部が置換又は欠失されたポ リ ぺプ チ ドは、 ァシルク"ルコサミン 2-ェ メラ-セ'、活性を有する。 ）
項 13. 下記（1)〜（3)のいずれかのポ リ ペプチ ド （但 し、 一般式（R- 1)、 （R-2)及び（R- 3)で表さ れる ポ リ ペプチ ドを 除 く ） 。
(1)前記式（A)で表さ れる ァ ミ ノ 酸配列を必須配列 とする ポ リ ペプチ ド ；
(2)前記式. (A)で表される ァ ミ ノ .酸配列の 10位、 13位、 21 位、 23位、 27位、 33位、 45位、 47位、 51位、 71位、 72位、 76 - 79位、 93位、 94位、 101位、 110位、 120位、 136位、 137位、 139位、 141位、 142位、 145位、 149位、 155位、 159位、 162位、 163位、 171位、 173位、 174位、 176位、 178位、 187位、 195位、 199-202位、 205位、 208位、 212位. 224位、 232位、 234位、 237位、 243位、 249位、 258 - 261 位、 263位、 266位、 267位、 269位、 270位、 272位、 275位. 282位、 287-289位、 300位、 301位、 309位、 317位、 318位. 328位、 329位、 334位、 337位、 348位、 363位、 364位、 371位、 392位、 393位、 395位、 399位、 401位及び 402位か らなる群から選ばれる少な く と も 1 つの位置が置換又は 欠失されたポ リ べプチ ド ； あるいは
(3)前記式（A)で表されるポ リ ペプチ ドの N末端又は C末 端に Pro Ala Pro Ser Pro Ala Pro Thr Pro Ala Cys Arg Gly Ala Glu； Pro Ala Pro Leu Gly Ser Leu Pro Ala Val Pro Thr Arg Glu Gly Ser Lys ； または Lys Gly Asn Lys Ser Trp Gin Aspカヽ'付加 したポ リ ぺプチ ド ；
( R - 1 )
Met Glu Lys Glu Arg Glu Thr Leu Gin Ala Trp Lys Glu Arg Val Gly Gin Glu Leu Asp Arg Val Val Ala Γ t 1 •"3 ™1 »—9 O α> W ド · r I—1 1— »
Ό h-1 *<3 1 ~~ 1 t-i Π)
•Τί C3 <ί r- -σ <J 4 - —3
Π) CD CD o w
Ο c c o 1 "― 1 CD OQ OQ >
»-a - *-o ο 1—· CD cn CO Π)
* CD o
> - C75 7)
CD cn Q H- » CD 1— » ο r+ OQ o OQ ·-(
tr* •-3 o > tT"1 cn cn > I— » CO
S3 Ό Ό OQ W cn n
CD t- -o -a · o t— 1 C3
Η- Π) Π3 cn O CO O CD o cn CO cn H
00 r- n to
0) · 1— » »— 1 CO I— * D 1— » * CD Π) 1— 1 til I—1
cn * c * ί 1― 1 OQ ^ cn
- r- CD -3 -9 >
H- CD n> 1— » cn I—* cn in n OQ cn cn OQ-9 -9 > -
I—1 P 1— » CD CD CD ' >— *
Π) CD o 1— ' OQ c: r-f OQ
r- t-1 * t—t > > D -a —3
cn n> 1—· CD 1— » r 1— » I—1
(=: O CD OQ >
c-* ¾ <J > > - - ixj
1—· 03 Q
Ο tl CO c £3 <-+■ OQ OQ 1— » in
- t- t-1 ■ 75n I—* Π) Π) · cn S3- 0) »— *
Co t=: 3 3 P3 o CO 3 OQ 03 CD
s6d〕
a o ca の 0)
~ 1 ― 1 n3 1
»— 3 -< -<
w CD o 0) w > ca w ぶ 03
»— 3 ta - - cd o* w » U)
> - O - - a o +-> o cd w (U
+-» a ft
> ί > (U (υ
-< -< -<
<u ca. >. o w
» ί a)
CO - in ca bO ω » ぶ - -<ί -< o -
(U c¾ o O w bo ぶ ~ 1 ぶ >* .
CD CO -, - J - CD
o 03 ;3 » bfl 、 O ぶ
、 (D
/5 -<! ^ -<；
» 〇 +-> 0) cx o
» 1 0) 0) ^ <υ
a. 3 - w ¾
M (U > . 0) 03
e O
Figure imgf000018_0001
Thr Gin Asp Gly Arg Pro Val Lys Val Gin Arg Thr lie Phe Ser Glu.Cys Phe Tyr Thr Met Ala Met Asn-
Glu Leu Trp Lys Val Thr Gly Glu Met His Tyr Gin
Arg Glu Ala Val Glu Met Met Asp Gin lie lie His Trp Val Arg Glu Asp Pro Ala Gly Leu Gly Arg Pro
Gin Leu Ser Gly Thr Leu Ala Thr Glu Pro Met Ala
Val Pro Met Met Leu Leu Asn Leu Val Glu Gin Leu
Gly Glu Glu Asp Glu Glu Met Thr Asp Lys Tyr Ala
Glu Leu Gly Asp Trp Cys Ala His Arg lie Leu Gin His Val Gin Arg Asp Gly Gin Val Val Leu Glu Asn
Val Ser Glu Asp Gly Lys Glu Leu Pro Gly Cys Leu
Gly Arg His Gin Asn Pro Gly His Thr Leu Glu Ala
Gly Trp Phe Leu Leu Gin Tyr Ala Leu Arg Lys Gly
Asp Pro Lys Leu Gin Arg His lie lie Asp Lys Phe leu Leu Leu Pro Phe His Ser Gly Trp Asp Pro Glu
His Gly Gly Leu Phe Tyr Phe Gin Asp Ala Asp Asp
Leu Cys Pro Thr Gin Leu Glu Trp Asn Met Lys Leu
Trp Trp Pro His Thr Glu Ala Met lie Ala Phe Leu
Met Gly Tyr Arg Asp Ser Gly Asp Pro Ala Leu Leu Asn Leu Phe Tyr Gin Val Ala Glu Tyr Thr Phe His
Gin Phe Arg Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly
Tyr Leu Asn Gin Glu Gly Lys Val Ala Leu Thr lie /S6fc7:>d
w O 03
Figure imgf000020_0001
W w DO O t tiO -+-» -H c:
ί , i (U (D J -4 ¾ w &0 w O U)
ci> (D i —l D
O - GO
0) o bo bo a< CO
r-H in w (U cd
P ,一 < O
c a >!
1 w <υ 0) u
-< CD CD t→
O b Π3 +-» w
•H cd » -H <u 1 » oo Ο-· CO •-3 m -J e—
+-» o
ω in
Figure imgf000020_0002
+-» 〇 O W 1 bO W
. ,
o bO , 4-» W o
VH (D Ή 03
-*c! - ! - CD OH
a W r-H CD O O bO 〇
0) r-i OJ
-< OH DH oo a.
〇 r—i o
<D CO -H ： 0) cd (U
Figure imgf000020_0003
W DO +-> P 0) <υ c
(D (ϋ ί , ί D cd
-< . -J C 0
t
Gly Glu Glu Asp Glu Glu Leu Ala Gly Arg Tyr Ala'
Gin Leu Gly His Trp Cys Ala Arg Arg lie Leu Gin
His Val Gin Arg Asp Gly Gin Ala Val Leu Glu Asn
Val Ser Glu Asp Gly Glu Glu Leu Ser Gly Cys Leu Gly Arg His Gin Asn Pro Gly His Ala Leu Glu Ala
Gly Trp Phe Leu Leu Arg His Ser Ser Arg Ser Gly
Asp Ala Lys Leu Arg Ala His Val lie Asp Thr Phe
Leu Leu leu Pro Phe Arg Ser Gly Trp Asp Ala Asp
Tyr Gly Gly Leu Phe Tyr Phe Gin Asp Ala Asp Gly Leu Cys Pro Thr Gin Leu Glu Trp Ala Met Lys Leu
Trp Trp Pro His Arg Gin Ala Met lie Ala Phe Leu
Met Gly Tyr Ser Glu Ser Gly Asp Pro Ala Leu Leu
Arg Leu Phe Tyr Gin Val Ala Glu Tyr Thr Phe Arg
Gin Phe Arg Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly Tyr Leu Asn Arg Glu Gly Lys Val Ala Leu Thr lie
Lys Gly Gly Pro Phe Lys Gly Cys Phe His Val Pro
Arg Cys Leu Ala Met Cys Glu Glu Met Leu Ser Ala
Leu Leu Ser Arg Leu Ala
項 14. 項 13に記載のポ リ べプチ ドをコ一 ドする D N A分 子。
項 15. 前記式（X)で表される塩基配列を有する項 14に記載 の D N A分子。 項 16. 項 14又は 15に記載のァシルク レコサミン 2-ェ I：。メラ-セ"を コ 一 ドする D. N A分子が組み込ま れた組換え体べク タ ー/ 項 17. 項 16に記載の組換え体ベク タ ーを細胞に導入 して な る形質転換体。
項 18. 項 12に記載の レニ ン結合活性を有す るァシルク レコサミン
2-ェ メラ-セ、'を コ ー ドする D N A分子を組み込んだ組換え 体ベク タ ーを細胞に導入 して形質転換体と し、 該形質転 換体を培地に培養 し、 培養物中にァシルク'ルコサミン 2-1ピメラ-セ" を生成蓄積させ、 該培養物か らァ'ンルク"ルコサミン 2-ェ メラ -セ"を 採取する こ と を特徴とする レニ ン結合活性を有する
ァシルク"ルコサミン 2-ェ メラ-セ、、の製造方法。
項 19. 項 11又は 12に記載のァシルク"ルコサミン 2 -ェ メラ-セ、、又はそ の誘導体を必須成分とする 降圧剤。
項 20. レニ ン結合活性を有する蛋白質を必須成分とする、 N ァセチルク ルコサミンカヽ ら N-ァセチルマンノサミンへの変換を行う ェ ピメ リ 化剤。
項 21. N-ァセチルク"ルコサミンに レニ ン結合活性を有する蛋白質を 作用 さ せる こ とを特徴とする N-ァセチルマンノサミンの製造法。
項 22. N-ァセチル ルコサミンと ピルビ ン酸に レニ ン結合活性を有 する蛋白質及び N-ァセチルバラミン接リア-セ"を作用 させる こ と を特 徵とする N-ァセチルバラミン酸の製造法。
なお、 上記の蛋白質（R- 1)、 （R- 2)及び（R-3)は、 レニ ン 結合活性を有する こ と は知 られていたが （ H. Inoue et al. , J-. Biochem. , 110, p.493— 500 ( 1991 ))·、 ァシルク ; 'ルコ サミン 2-1 メラ-セ、'活性を有する こ と は全 く 知 られていなかつ た。 従っ て、 本発明の Ν-ァセチルマンノサミンの製造法及び Ν ァセチル ノィラミン酸の製造法に用い られる 「 レニ ン結合活性を有する 蛋白質」 には、 上記の蛋白質（R-l)、 （R-2)及び（R- 3)が包 含される。
本発明は、 上記蛋白質（R- 1)、 （R-2)及び（R-3)か らな る 群か ら選ばれる少な く と も 1 種を作用 させる こ とを特徴 とする N-ァセチルマンパミンの製造法を提供する ものであ る。
ま た、 本発明は、 N-ァセチル Γルコサミンと ピル ビン酸に上記蛋 白質（R-l)、 （R- 2)及び（R-3)か らな る群か ら選ばれる少な く と も 1 種及び N-ァセチル /イラミン酸リア-セ"を作用 させる こ と を特 徴とする N-ァセチルノイラミン酸の製造法を提供する も のであ る。
本発明のェ ピメ リ 化剤の必須成分であ る 「 レニ ン結合 活性を有する蛋白質」 には、 上記の蛋白質（R- 1)、 （R- 2) 及び（R-3)が包含さ れる。
従っ て、 本癸明は、 上記蛋白質（R-l)、 （R-2)及び（R- 3 )か らな る群か ら選ばれる少な く と も 1 種を必須成分 とす る、 N-了セチルク、、ルコサミンカヽ ら N-ァセチルマンノサミンへの を ぅ ェ ピ メ リ 化剤を提供する ものであ る。
本発明の新規ポ リ ぺプチ ドは、 了シルク'ル：]サミン 2-1ヒ°メラ-セ" と して有用であ る。
なお、 上記項 1 〜 10は、 .アジルク ルコラミン 2- 1 んラ-セ:、、活.性の みを有 していればよ く、 レニ ン結合活性の有無と は無関 係の も の であ り、 以下 " 第 1 発明 " と称する。
ま た、 上記項 11〜22は、 了シルク'ルコラミン 2-ェピ メラ-セ 活性 と レニ ン結合活性の両方を有する ものであ り、 以下 " 第 2 発明 " と称する。
ま た、 " 本発明 " は、 第 1 発明及び第 2発明の両方を 含むも のであ る。
第 1 発明のァシルク"ルコサミン 2-ェヒ。 メラ-セ、、 は、 少な く と も そ の 一部 の も の は、 ァシルク'ルコサミン 2-il:°メラ-セ"活性と レ ニ ン結合 活性の両方を有する力^ 該ェ ピメ ラ ーゼは レニ ン結合活 性の有無にかかわ らず、. 了シルク'、ルコサミン 2-工 メラ- 活性を有 する蛋白質を全て含む。
本究明において、 ァシルク、'ルコサミン 2-ェヒ。メラ一セ、、を コ ー ドする DNA分子を組み込んだプラ ス ミ ドで形質転換さ れる細胞と しては、 大腸菌、 枯草菌、 緑膿菌、 放線菌及び乳酸菌な どの細菌、 かびや酵母及び他の真核微生物、 マ ウ ス細胞、 ラ ッ ト 繊維芽細胞および C O S細胞等の哺乳類由来の培 養細胞、 及び植物細胞な どのプラ ス ミ ドが安定に保持さ れ、 機能する細胞であれば、 本願に例示 した細胞に限定 さ れない。 本発明で、 ァシルク、、ルコサミン 2 -ェヒ。メラーセ を コ ー ドする DNA分子 を組み込んだブラ ス ミ ドを上記細胞に導入す.る方法と し' ては、 当業者であれば細胞の種類に応 じて適宜適切な方 法を選択する こ とができ、 例えば大腸菌の場合ではハナハン ( Hanahai の方法 [ DNAク ロ ーニ ン グ（DNA Clon i ng ) , 第 1 卷、 p 1 0 9 — 1 3 6 ( 1 9 8 5 ) ] な どによ り 行う こ とができ る。
本発明は、 ァシルク"ルコサミン 2 -ェ メラ-セ"を初めて実質的に不 純物を含ま ない形態で単離 し、 その製造方法を開示 した ものであ り、 該ェ ピメ ラ ーゼの少な く と も一部が レニ ン 結合活性を有する こ と も本発明で初めて明 らかに された。 ァシルク"ルコサミン 2 -エピメラ _セ '活性及び レニ ン結合活性を有する ものであれば、 そのア ミ ノ 酸配列に関わ らず第 2 発明の 範囲に包含される。 例えば、 本発明では、 図 1 に示すァ ミ ノ 酸配列及び塩基配列を有する了シルク'ルコサミン 2 -ェ メラ-セ" を コ ー ドする DNA分子の 5 ' 末端及び Z又は 3 ' 末端をェ キソ型 ヌ ク レアーゼな どによ り 数個か ら百数十個程度切 断 して短 く した D N A分子およ び該 D N A に よ り コ ー ド される N末端又は C 末端の数個ない し数十個のァ ミ ノ 酸 が削除さ れた該酵素の誘導体も、 該酵素活性を保持 して いる 限 り 本発明の範囲に含まれる。 ま た、 公知の方法に よ り 部分的突然変異を起こ させ、 該ア ミ ノ 酸配列の内部 の 1 個又はそれ以上を突然変異によ り 他のァ ミ ノ 酸に置 換 し又は欠失させたポ リ ぺプチ ドも、 ァシルク、、ルコサミン 2 - 1 メ ラ-セ "活性を有する 限 り、 本発明の範囲に包含さ れる。
置換及び 又は欠失の可能な位置と しては、 例えば、 前記一般式 （ A ) で表される ポ リ ペプチ ドの 10位、 13位、 21位、 23位、 27位、 33位、 45位、 47位、 51位、 71位、 72 位、 76 - 79位、 93位、 94位、 101位、 1 10位、 120位、 136位, 1 37位、 139位、 141位、 142位、 145位、 149位、 155位、
159位、 1 62位、 1 63位、 1 71位、 173位、 174位、 176位、
178位、 187位、 195位、 199 - 202位、 205位、 208位、 212位, 224位、 232位、 234位、 237位、 243位、 249位、 258— 261 位、 263位、 266位、 267位、 269位、 270位、 272位、 275位、 282位、 287 - 289位、 300位、 301位、 309位、 317位、 3 18位、 328位、 329位、 334位、 337位、 348位、 363位、 364位、
37 1位、 392位、 393位、 395位、 399位、 401位及び 402位が 例示さ れる力、'、 こ れ らに限定さ れない。
さ ら に、 本発明は、 ァシルク"ルコサミン 2 -ェ メラ-セ 活性を有す る ポ リ ぺプチ ドの N末端及び/又は C末端に さ ら に数個 か ら数十個のア ミ ノ 酸を付加 した もの もァシルク'ルコサミン 2 - 1 メラ-セ、'活性を有する 限 り 包含する。
本発明で用い られるァシルク'ルコサミン 2 -ヱ メラ -セ、 'をコ 一 ドす る核酸分子の供与体と しては、 特に限定さ れる ものでは ないが、 例えばブ夕 腎臓や ヒ ト ゃラ ッ ト の腎臓、 肝臓、 粘膜細胞、. 顎下腺、. 大腸およ び小腸の拈膜、 唾液腺な ど の該酵素活性を有する動物組織等が挙げ られる。 こ れ ら の動物組織か ら該核酸分子を得る。 核酸分子と しては、 DNAと RNA力 挙げ られるが、 好ま し く は RNAであ る。
ァシルク'ルコサミン 2—ェヒ。メラーセ-'をコ ー ドする RNAは、 チヨム 7クシ、、ンス キー（Chomczynski)らの方法 〔アナリティカル-ハ "ィ才ケミストリー
(Analytical Biochemistry), 1_62, 156- 159， ( 1987)) に 従っ て取得する こ とができ る。 該 RNA分子は、 さ ら に、 モレキュラー ·クローニンク、'（Molecular Cloning;)第 2 版、 第 1 巻ヽ 第 7.26項〜 7.29項に記載の方法に よ り ポ リ アデ二ル酸テ一 ル （ポ リ Aテール） を有する RNAと して も得る こ とができ る。 そ して、 こ のポ リ Aテールを有する RNAを用いる こ と によ り 容易に了シルク、、ルコサミン 2—ェヒ。メラーセ'、を コ ー ドする cDNAを 得る こ とができ る。
RNAカヽ ら cDNAへの変換は、 例えばカレント 'フ°ロト]一ルス、、《ィン* モレキュラー *ハ、'ィ才ロシ-、一 (Current Protocols in Molecular Biology). 第 1 巻、 5.5.1-5.5· 10 ( 1990 )に従い行う こ と ができ る。 ま た、 市販の cDNA合成キ ッ ト （例えば、 アマ 一シ ャ ム社製、 ス ト ラ タ ジー ン社製な ど） を用 いて行う こ と も でき る。
cDNAは、 あ る種のベク タ ー、 例えばフ ァ ー ジベク タ ー やプラ ス ミ ドベク タ ーに揷入する こ と によ っ て、 cDNAラ イ ブラ リ ーを構築する こ とができ る。 cDNAラ イ ブラ リ 一 の構築は、 モレキュラー-ク π—ニンク"（Molecular Cloning)第 2 版、 第 2 巻、 第 8.1項〜 8.86項に記載の方法等によ り 行う こ と ができ る。
構築された cDNAラ イ ブラ リ ー力ヽ ら、 ァシルク、'ルコサミン 2—ェヒ。メ ラ-セ "を コ一 ドする cDNAを保有する形質転換体を選択する 手段が必要であ る。 こ の酵素は、 上述の よ う に上記文献 記載の精製手段では、 遺伝子組換えの分野で必要 と され る程度にま で精製された酵素は得 られない。 本発明者は、 以下の よ う な方法を用いて抗体産生が可能な程度にま で ¾ィ匕 したァシルク、'ルコサミン 2—ェヒ。メラーセ を ί ナこ。
先ず、 アシス-夕、、フタ 〔メソ -/ス ·' ·イン-ェンサ、、ィモロシ、、一（Methods in Enzymology), 41, 407-412 ( 1975 )〕 の方法に準 じて、 了シルク"ルコサミン 2-1 メラ-セ"を部分的に精製する。 こ の後の精 製工程は、 精製の過程で活性を有する画分が分散 してい く ため、 活性が高 く、 蛋白質量の少ない画分、 すなわち、 溶出 した試料の比活性 （蛋白質 1 m g当た り の活性） が、 カ ラ ム に通液前の試料の比活性よ り も高い画分のみを得 る こ と と した。 具体的には、 上記部分精製試料について ヒにロキシァハ。タイトカラム及びイオン交換カラムク Dマト Γラフィ-を こ の順に行 い、 分散 して溶出 さ れる該酵素の活性の最 も高い画分の 一部を取 り 出 し、 さ ら にイ オ ン交換カ ラ ム によ る 分離を 2 回繰 り 返すこ と によ り、 該酵素が純化さ れる こ と を見 出 した。 得 られた酵素画分をさ ら に、 逆相カ ラ ム （マイクロ ホ'ンタ"スフエア- C4 ( ミ リ ポア社製） ） を用いた高速液体クロマト ラフィ -(HPLC)によ り 精製 し、 実質的に不純物を含ま ない 純化さ れた該酵素蛋白質を得る こ とができ る。 逆相 HPLC で精製する と酵素は失活 しゃすいために酵素の精製には 殆ど用い られていない。 了シルク"ル]サミン 2-ェピ セ'、の場合に おいて も酵素活性は失われる力 抗体の生産を惹起する 能力は維持される。 こ のため、 HPLCで精製 したァシルク、、ルコサ ミン 2-1 メラ-セ"をゥ サギに免疫する こ と によ り、 該酵素蛋 白質に特異的に反応する抗体を得る こ とができ る。
上記の精製工程によ り、 例えばブ夕 の腎皮質 5, 6kgか ら. 10.5mgの精製された該酵素蛋白質を得る こ とができ る。
本努明のァシルク、'ルコサミン 2—ェヒ。メラ一セ"を コ ー ドす る DNA分子は. 構築 した cDNAか ら単離する こ とができ る。 単離の方法は、 ベク タ 一 と して Agt 11や λΖΑΡ等の発現ベク タ ーを使用する こ と に よ り、 抗体を用いた検出が可能であ る。 ァシル Γルコサ ミン 2-1 メラ- を コ 一 ドする DNAを保有する形質転換体は、 イソフ。口ヒ。）レ- - D-チォ力、'ラクト ラハン にさ ら される こ と によ り ァシルク、、ルコサミン 2-ヱヒ。メラ-セ、'を産生する。 これを抗体に結合さ せ、 さ ら にアルカリホスファタ-セ が結合 した抗ゥサギ抗体を結合 させ 5 -フ"ロモ - 4 -ク α α - 3 -インドリルリン酸溶液 と二 フ"ルーテトラ、 Γリウム溶 液を反応させる こ と によ り、 該酵素を コ ドする DNAを保' 有する組換え体を選択 し、 取得する こ とができ る。
得 られたァシルク'、ルコサミン 2 -ェ メラ一セ"を コ ー ドする DNA力、'プラ ス ミ ド DNA中に挿入されている場合には、 該 DNAを有する 大腸菌をそのま ま 適当な培地中で培養する こ と によ り、 ァシルク"ルコサミン 2 -ェ メラ-セ'を得る こ とができ る。 ま た、 ZAP をベク タ ー と して使用 した場合、 取得 した DNAを含有する フ ァ ー ジ と f lヘルハ。 -ファーバを同時感染させる こ と によ り、 該 DNAを含むプラ ス ミ ドへと切 り 出すこ と も可能であ る。 こ れ ら一連の操作によ り、 例えば式（X )で表される
1. 2kbp( 了シルク" ^ルコサミン 2—ェヒ。メラーセ、、を コ ー Kす る DNAを含有す る新規な組換え体プラ ス ミ ドを取得する こ とができ る。
次に、 上記の様に して得 られた了シルク'ルコサミン 2 -ヱピメラ-セ、' を コ ー ドする DNA断片が揷入さ れたプラ ス ミ ドを用いて大 腸菌等の細胞を形質転換する。 形質転換さ れた細胞か ら ァシルク"ルコサミン 2 -ェヒ。メラ-セ"を生産する には、 下記の よ う に し て形質転換された細胞を培養 し、 培養細胞を得る。
培養条件は、 形質転換される細胞の種類に よ り 異な り、 当業者であれば、 細胞の種類に応 じて、 容易に培養条件 を定め る こ とができ る。 例えば、 大腸菌の場合には、 通 常の固体培養法で培養 して も よ いが、 液体培養法を用い て培養するのが望ま しい。 また、 大腸菌の場合を例に取 る と、 培養に使用する培地と しては、' 炭素源、 窒素源、 無機化合物その他の栄養成分を含み、 細菌の培養に一般 的に用い られている合成培地、 半合成培地、 或いは天然 培地のいずれも使用する こ とができ る。 上記培地に使用 でき る炭素源と しては、 ブ ドウ糖、 果糖、 転化糖、 澱粉、 糖化液、 ソルビ ト ール、 グリ セロールなどの糖質液や、 ピルビン酸、 リ ンゴ酸、 コハク酸等の有機酸等を例示す る こ とができ る。 窒素源と しては、 硫酸ア ンモニゥム、 塩化ア ンモニゥ ム、 硝酸ア ンモニゥ ム、 リ ン酸ア ンモニ ゥ ム、 水酸化ア ンモニゥ Λ、 酒石酸ア ンモニゥ ム、 酢酸 ア ンモニゥム、 尿素等を例示できる。 炭素源と して も窒 素源と して も利用でき る ものと しては、 ペプ ト ン、 酵母 エキス、 肉エキス、 コ -ンスティ- リカ-などを例示でき る。 無 機化合物と しては、 リ ン酸一カ リ ウム、 リ ン酸二力 リ ウ ム、 リ ン酸一ナ ト リ ウム、 リ ン酸ニナ ト リ ウ ム、 硫酸マ グネ シゥム、 塩化マグネ シ'ゥム、 塩化カ リ ウム、 塩化ナ ト リ ウ ム、 硫酸第一鉄、 硫酸第二鉄、 塩化第二鉄、 硫酸 マ ンガン、 塩化マ ンガンなどを例示でき る。
形質転換された細胞の培養時間及び培養温度は特に制 限されないが、 例えば該細胞が大腸菌の場合、 通常 2 0 °C 〜 4 2 °C前後、 好ま し く は 3 0 °C〜 3 7 °C前後で、 通常 4〜 48時 間、 好ま し く は 8〜 14時間培養する。 こ の よ う な条件下で. 通常の振盪培養或いは通気攪拌培養にて培養す 'る。
本発明のアジル ルコサミン 2-ェピメラ-セ'をコ ー ドする DNAを適当 なベク タ ー と連結 し、 適当な宿主細胞に形質転換する と、 形質転換された宿主細胞の内部又は外部の該酵素濃度を 高める こ とができ、 該酵素を効率的に生産する こ とがで き る。
本発明に用い られるベク タ ーは、 以下の要素を備えて いる。 すなわち、 形質転換される宿主細胞内で該酵素を コ ー ドする DNAを発現させる正 しい配向 と配置を備えたプ 口 モー タ 一及び翻訳活性化配列を備えている。 これ らの 要素を備えたベク タ 一であれば、 どのよ う なベク タ ーで あ っ て も よ いが、 好ま しいベク タ ー と しては適当な選択 マーカ 一を有 し、 多 コ ピーの ものが好適で、 例えば
pBluescript, pUC18, pUC19, pKK223 - 3及び pTrc99A等力、' 挙げ られる。 これ らのべク タ一を使用 した場合、
イソフ。ロヒ。ル D チ才力"ラクトヒ。ラノシト'を培養液の培地に、
0.01mM〜 100πιΜ、 好ま し く は 0. lmM〜 10mM程度添加する こ と に よ り、 ァシルク、、ルコサミン 2-ェヒ°メラ-セ、'の細胞内濃度を増大さ せる こ とができ る。 ま た、 熱誘発性の発現ベク タ ーであ る pPL- lambdaも使用する こ とができ る。 こ のベク タ ーを 使用 した場合、 培養液の温度を 40〜45aCに上昇させる こ と によ り、 ァシルク ルコサミン 2-ェ メラ-セ"の細胞内濃度を増大さ せる こ とができ る。
さ ら に、 宿主細胞のァシルク"ルコサミン 2-ェ メラ-セ"の細胞内濃 度を増大させる手段と し て、 ァシルク'ルコサミン 2-ェピ メラ-セ を コ — ドする DNAの末端 DNAを削除する こ とによ つ て も、 該酵 素の生産性を増大させ、 且つ効率化する こ とができ る。 例えば、 該 DNA分子の 5'末端及び 又は 3'末端をェ キ ソ型 ヌ ク レアーゼな どによ り 了シルク"ルコサミン 2-ェピメラ-セ 活性を失 わない程度に分解する こ とによ り、 ァシルク"ルコサミン 2 -ヱ メラ- セ"の産生能を さ ら に高め る こ と もでき る。 ま た、 部位指 定突然変異ゃラ ンダムな突然変異を導入する こ と に よ つ て、 内部 DNAを置換又は欠失させる こ と に よ り、 該酵素の 生産能を高める こ と もでき る。 例えば、 該 DNA分子を pBluescript M13 ck 1 本鎖にな り 得るべク 夕 一に 導入 し、 該 DNA分子を含む 1 本鎖 DNAを調製する。 こ の 1 本鎮 DNAに変異 し ょ う とする配列を含むか又は欠失 した配 列を含むオリ] 'ヌクレオチド'をァニール した後、 これをプラ イ マ 一 と して、 テ 才キシリホ'ヌクレ才シに 3リン酸、 ATP、 DNAポ リ メ ラ 一ゼ の ク レ ノ 一断片及び T4リ ガーゼ存在下でプラ イ マ 一伸長 反応を行 う こ と に よ り、 部分的突然変異を導入する こ と ができ る。
一方、 ァシルク"ルコサミン 2—ェヒ。 メラ一セ、、 は、 培養 に よ っ て 得 ら れ る細胞か ら抽出する こ とができ る。 抽出は、 細胞か ら の 通常の酵素抽出法に従い行う こ とができ る。 例えば:、 超 音波処理、 各種機械的処理、 酵素処理な どの方法によ り 細胞を破砕 し、 不溶物を遠心分離な どによ り 分離 した上 清に該酵素を回収する こ とができ る。 回収さ れた粗酵素 は、 一般的な酵素精製法を適宜選択、 組み合わせる こ と によ り、 精製する こ とができ る。 例えば、 除核酸処理、 硫安処理、 珪藻土処理、 イオン交 πマト Γ'ラフ 等によ り、 純化 さ れたァシルク、'ルコサミン 2-1 メラ-セ を大量に得る こ とができ る。
なお、 図 1 に示す DNA分子を組み込んだ、 図 2 の pEPIl を含む大腸菌株は、 平成 6年 3 月 1 1 日 に通産省工業技 術院生命工学工業技術研究所に寄託され、 受託番号 ： FERM BP-4602が付された。
本発明者は、 第 2 発明で得 られたブタ 腎臓由来の一般 式（A)のポ リ ぺプチ ドの生物活性について種々 検討 した結 果、 該酵素はァシルク"ルコサミン 2-ェ メラ-セ'活性だ け でな く、 レ ニ ン結合活性を も有する こ とが明 らかにな っ た。 こ こ で レ ニ ン結合活性と は、 該ポ リ ペプチ ドが レ ニ ン に結合 し、 レニ ン活性を阻害する こ とを言 う。 一般式（A)のポ リ ぺプ チ ドは、 本発明のァシルク"ルコサミン 2-1 メラ-セ'、の製造法に従い 得 られた。 一方、 ブタ 腎臓由来の一般式（R-3)の レニ ン結 合蛋白 は井上 らの方法（H. Inoue et al. , J. Biochem. , 110. p.493- 500. ( 1991 ))に従い得 られた。 精製方法の 異なる 両蛋白質（A)及び（R 3)は、 149位、 289位、： 317位及 び 318位の 4 個のア ミ ノ 酸を除いて同一の配列を有する極 めて類似 した蛋白質であ る。 一方、 以下の実施例で示さ れる よ う に、 本発明で得 られた蛋白質（A)及びラ ッ ト 腎臓 由来のェ ピメ ラ ーゼは、 いずれ も レニ ン結合活性を有 し ている。 こ の こ とか ら、 少な く と も一部の蛋白質につい ては了シルク'ルコサミン 2-ェ メラ- 活性と レニ ン結合活性は不可 分の も のであ り、 蛋白質（A)と構造の類似 した公知の レニ ン結合蛋白質（R-l)、 （R-2)およ び（R-3)はいずれ もェ ピメ ラ ーゼ活性を有 している と考え られる。
従っ て、 レニ ン結合蛋白が、 ァシルク、、ルコサミン 2-11:°メラ-セ '活 性を有する と き には、 レニ ン結合蛋白は N-ァセチル ルコサミンか ら N-ァセチルマン ミンへの変換を触媒するェ ピメ リ 化剤 と して 使用す る こ と もでき る。
一般式（A)の蛋白質は、 10位、 13位、 21位、 23位、 27位、 33位、 45位、 47位、 51位、 71位、 72位、 76-79位、 93位、 94位、 101位、 110位、 120位、 136位、 137位、 139位、
141位、 142位、 145位、 149位、 155位、 159位、 162位、
163位、 171位、 173位、 174位、 176位、 178位、 187位、
195位、 199-202位、 205位、 208位、 212位、 224位、 232位, 234位、 237位、 243位、 249位、 258 - 261位、 263位、 266 位、 267位、 269位、 270位、 272位、 275位、 282位、 287 - 289位、 300位、 30.1位、 309位、 317位、 318位、 328位、 329位、 334位、 337位、 348位、 363位、 364位、 371位、 392位、 393位、 395位、 399位、 401位及び 402位のいずれ かの部位において公知の蛋白である（R-l)、 （R- 2)および (R- 3)と異なっている。 しか しながら、 これら蛋白質は、 いずれも レニ ン結合活性及びェ ピメ ラーゼ活性を有 して いるため、 これらの部位は活性の発現に必須ではな く、 置換又は欠失が可能である。 また、 N末端、 C末端に数 個から数十個のァ ミ ノ 酸が付加 して も蛋白質の活性発現 には影饗しない。 なお、 本発明者は実際に一般式（A)のポ リ ぺプチ ドの N末端に Lys Gly Asn Lys Ser Trp Gin As pのア ミ ノ 酸を付加 したェピメ ラーゼを得ているカ^ 該ェ ピメ ラーゼが十分な酵素活性を有する こ とは確認されて いる。
本発明は、 動物の組織に存在するァシルグルコサ ミ ン 2 —ェピメ ラーゼをコー ドする D N A分子を分離し、 該 D N A分子を有する組換えプラ ス ミ ドを作成し、 このプ ラ ス ミ ドを大腸菌などの宿主細胞内に導入 して細胞を形 質転換し、 該形質転換体を培養する こ とによ り、 ァシルク " ル コサミン 2-1 メラ-セ'を細胞内に大量に且つ効率的に生産させ、 これを採取する方法を開示する。 レニ ンは、 血液中のアンキ'ォテンシノ -ケ"ンを加水分解 してアンキ
" 'ォテンシン Iを産生す る。 アンキ、'ォテンシン Πま さ ら にアンキ 才テンシン I変換 酵素に よ っ てアンキ "ォテンシン I Iとな り、 末梢血管の平滑筋を直 接収縮 させ、 強い昇圧作用を発現する。 ま た、 副腎皮質 球状層に作用 し、 アル ドステ ロ ンの分泌を促進する。 こ のよ う に、 レニン'アンキ'ォテンシン系は、 血圧の調節に重要な役割 を果た してお り、 現在にン 'ァンキ、'ォテンシン系の阻害剤が開発さ れ、 その薬剤が高血圧治療薬 （降圧剤） と して広 く 利用 されている。 本発明のァシルク、 'ル]サミン 2 -ヱヒ。メラ-セ、、は、 レニ ン に結合 しその活性を阻害する こ とか ら、 降圧剤 と して有 用であ る。
レニ ン結合蛋白質は、 ァシルク'ルコサミン 2 -ェ メラ-セ"活性を有 する。 従っ て、 レニ ン結合蛋白質は、 例え ば N -ァセチルク"ルコ サミンを N -了セチルマンノサミンに変換する ェ ピメ リ 化剤 と して使用で き る。 すなわち、 レニ ン結合蛋白質を N -ァセチルク"ルコサミンに作 用 させる と、 N -ァセチルマン/サミンが得 られる。 さ ら にま た、 レ ニ ン結合蛋白質を N -ァセチル ラミン酸リア- と と も に、 N -ァセチル ク ルコサミン及び ピル ビ ン酸に作用 させる と、 まず、 レニ ン結 合蛋白質によ り N -ァセチル Γルコサミンが N -ァセチルマンノサミンに変換さ れ, いで、 N ァセチルメイラミン酸リア一セ、、の F用 ίこ =t り N ァセチルマンノサミンと ピル ビ ン酸が結合 して N -ァセチルノイラミン酸が得 られる。
本発明によれば、 以下のよ う な優れた効果が達成さ れ る ο
(1)高度に精製さ れたァシルク、'ルコサミン 2-ェ メラ-セ、、を安価且つ大 量に製造する こ と ができ る。
(2)微生物を 出発原料とす る ため、 動物組織を原料 と する 従来法 と 異な り、 原料供給の制約を受け る こ と な く、 必 要な と き に必要な場所で所望量の生産が可能であ る。
(3)アジルク ルコサミン 2-ェピメラ- の生産量が高いため、 容易 に該 酵素を単離でき る。
(4)高純度のァシルク'ルコサミン 2-ェ メラ-セ"を安価に得る こ とがで き る ため、 該酵素を用 いて Ν-ァセチルノイラミン接や Ν-ァセチルマンノサミン を安価に製造でき る。
(5)高純度のァシル Γルコサミン 2-ェ メラ-セ'を得る こ とができ る た 、 Ν-ァセチルノイラミン酸や Ν ァシルへキ'ノサミン © ¾ ίこ禾 lj用でさ る。
(6)本発明の レニ ン結合活性を有する 蛋白質を用 い る こ と に よ り 降圧剤を得る こ とができ る。
(7)レニ ン結合活性を有す る蛋 白質は、 アジルク"ルコサミン 2-ェ メラ-セ"活性を も有す る ため、 該蛋白質は、 N-ァセチルク"ルコサミン か ら N-ァセチルマン/サミンへのェ ピメ リ 化剤 と して使用でき る。
(8)レニ ン結合活性を有す る 本発明の蛋白質 と、 N-ァセチルノ イラミン酸リア- を、 場合に よ り アルカ リ 性条件下に N-ァセチル Γ ルコサミン及び ピル ビ ン酸 と反応さ せ る こ と に よ り、 効率よ く N-ァセチルズイラミン接を得 る こ と ができ る。 発明を実施する ための最良の形態
以下、 本発明を実施例を用いて よ り 詳細に説明するが、 本発明は こ れ ら実施例に限定さ れる も のではない。
実施例 1
ブ夕 の 賢臓由来のァシルク"ルコサミン 2—ェヒ。メラーセ"
( 1 ) ブ夕 の腎臓由来のァシルク"ルコサミン 2-ェ メラ-セ"の精製 新鮮なブ夕 の腎皮質（5.6kg)に 3mMの リ ン酸緩衝液
(pH7. 6)12リ ッ ト ルを加えてホモ ジナイ ザーで均一化 した c 連続遠心分離（10, OOOrpn 200mlZ分） に よ り 上清 （ 11リ ッ ト ル） を得た後、 上清と等量の冷却 した蒸留水を加え てよ く 攪拌 し、 連続遠心分離（10， OOOrpnu 2001111 分） に よ っ て得 られた上清を腎臓抽出液と した。 こ の腎臓抽出 液をアシス *タ、、ッ夕の方法 〔 メソッス、、 -イン-ェンサ ィモロシ'、一（Methods in Enzymology), 41. 407-412 ( 1975)) に従っ てプロ タ ミ ン濃縮、 ベ ン 卜 ナイ 卜処 SIヽ DEAE-セル π スカラムクロマトク-、ラフィー処 理及び リ ン酸カノレシ ゥ ムゲル処理によ り、 了シル Γルコサミン 2- 工 メラ- の精製を行い、 387mgの部分精製酵素を得た。
次に、 該部分精製酵素を 10mMの リ ン酸緩衝液（pH7.6)で 平衡ィ匕 した匕ト、、ロキシァハ。夕イトカラム （内径 26mm X 長さ 95mm ； 禾卩光 純薬社製） に通液 し、 同緩衝液で溶出 した。 本処理に よ り 該酵素活性を有する画分は広 く 分散 した状態で溶出 さ れた （図 5 参照） 。 該酵素活性を有する第 12〜 17画分 (18ml x 6= 108ml)を硫酸ア ンモニゥムによ り塩析処理し、 硫酸ア ンモニゥム 0から 80重量％飽和沈殿画分を集め、 20mMの リ ン酸緩衝液（pH7.6)で透析を行い、 透析酵素
75.6mgを得た。 さ らに、 以下に示す条件でイオン交換
ク Dマトク"ラフィ-を行う こ とによ り、 該酵素をさ らに精製 した。
まず、 イオ ン交換体の 1 種である Q —セフ ァ ロース (フ アルマシア社製） を内径 26mm X長さ 100mmのカ ラ ムに 充填 し、 20mMの リ ン酸緩衝液（PH7.6、 500ml)を通 して平 衡化 した。 次いで、 上記部分精製酵素 75.6mgを該カ ラム に吸着させ、 100mMから 300mMの塩化力 リ ゥ 厶を含む リ ン 酸緩衝液（pH7.6)の直線的濃度勾配溶出法にて溶出 した。 塩化力 リ ゥムの濃度が 180mM付近に溶出される蛋白質の主 ピーク （198ml)を集めて濃縮及び透析を行つた。 こ の透析 処理酵素 23. Omgをモノ Qカ ラ ム （ フ ア ルマ シア社製） に 通液する こ とによ り、 該カラム中に吸着させた。 次いで 吸着された酵素を 200mMから 300mMの塩化力 リ ゥムを含む リ ン酸緩衝液（pH7.6)の直線的濃度勾配溶出法によ り 溶出 した。 塩化力 リ ウム濃度が 220mM付近に溶出される蛋白質 の ピーク を集めて、 ゲル濾過カ ラムによ る脱塩を行っ た。 得られた該酵素 15.9mgの活性は、 比活性で 21ュニ ッ トノ mg蛋白質で、 前述のアシス ·Γ'ッタの報告にある活性 （ 6ュニ ッ トノ mg蛋白質） よ り も 3.5倍もの純度の高い酵素が得られ た。 さ らに、 低分子量の物質や微量の不純物を除 く ため、 逆相力 ラムを用いた HPLCによ る精製を行っ た。 逆相カ ラ ム は、 マイクロホ'、ン夕、、スフエア一 5#C4— 300才ンク、、スト口一ム （内径 3.9mmx 長さ 150mm) ( ミ リ ポア社製） を使用 し、 0.1%(V/V)の ト リ フルォ口酢酸（TFA)水溶液で平衡化したこのカラムへ、 精製酵素 2mgを注入 した。 カ ラ ム内に保持された該精製酵 素は、 0から 80¾(V/V)のァセ トニ ト リ ルを含む 0.1%(V/V) の TFA水溶液の直線的濃度勾配溶出法によ り溶出 し、
280nmの紫外線吸収から測定でき る蛋白質の主ピーク を集 めて減圧乾燥した。 同操作を 6 回繰り返すこ と に よ り得 られた酵素（10.5mg)は、 活性は失つていたが実質的に不 純物を含まない純化された蛋白質であった。
(2)ァシルク'ルコサミン 2-ェ メラ-セ に特異的 に結合する抗体
純ィ匕 し た 5.2mgの ァシルク"ルコサミン 2 ェヒ。 メラーセ"を、 生後 9週齢 のゥサギ （ 日本白色種） に免疫 し、 部分採血及び全採血 によ り、 約 150mlの抗血清を得た。 該抗血清から 日本生化 学会編、 新生化学実験講座 12、 分子免疫学 III、 （ 1992)、 第 24頁の記載を参考に して、 フ° πティン Aセファロ-ス （フ アルマシ ァ社製） を用いて IgGを精製した。
実施例 2
ァシルク、、ルコサミン 2—ェヒ。 メラーセ、、の cDNAの ク ロ ー ンィ匕
(1)ブ夕の腎臓からの mRNAの取得 ブ夕 の腎臓か ら 腎皮質を切 り 取 り、 腎皮質 2gか ら上記 のチヨム'/クシ、、ンスキー（Chomczynski)ら の方法 〔アナリティカ '· ハ"ィ才ケミストリー（Analytical Biochemistry), 162, 156, ( 1987 ) J によ り 4.9mgの RNAを取得 した。 さ ら に、 こ の RNAをオリ: T dTセル口-スカラムに吸着、 溶出する こ と に よ り、
67/gのポ リ Aテールを有する RNAを取得 した。
(2) cDNAラ イ ブラ リ ーの作成
上記で得 られたポ リ Aテールを有する RNA(5|/g)か ら、 ス 卜 ラ タ ジー ン社製の ZAP-cDNA合成キ ッ ト を用いて、 cDNAラ イ ブラ リ ーを作成 した。 得 られたラ イ ブラ リ ーは、 4.5x 1012プラ ー ク形成単位であ っ た。
(3)ァシルク "ルコサミン 2-ェヒ。 メラーセ"遺伝子のス ク リ ー ニ ン グ
ァシルク"ルコサミン 2-ェ メラ-セ"をコ ー ドする DNAを有する組換え 体のス ク リ ーニ ングは、 実施例 1 記載の抗体と、 ス ト ラ タ ジー ン社製のピコ ル-ィムノスクリ-ニンク 'キフトを用いた免疫染色 法によ り 行っ た。
上記方法によ り、 約 120万個のプラ ー ク をス ク リ ーニ ン グ した と こ ろ、 64個の陽性フ ァ ー ジを取得 した。 こ の陽 性フ ァ ー ジの う ち、 任意に 12株を選択 し、 Xリヒア'コリに flヘルハ。 -フ了-'バと と も に感染する こ と によ り、 プラ ス ミ ド への切 り 出 しを行っ た。 こ のプラ ス ミ ドを有する 1シ Iリヒア •コリの う ち、 ァシル ルコサミン 2-ェ メラ-セ"活性を有する株を選び 出 し、 プラ ス ミ ドを取 り 出 した と こ ろ、 1.4kbpの揷入断 片を有する組換えプラ ス ミ ド pEPIl(4.3kbp)を取得 した。 pEPIlの制限酵素地図を図 2 に示す。
こ の pEPIl(4.3kbp)を導入 した組換え大腸菌は、 FERM BP-4602の受託番号で、 通産省工業技術院生命工学工業技 術研究所に 1 9 9 4年 3 月 1 1 日 に寄託さ れた。
(4)了シルク' Jレコサミン 2 ェヒ°メラーセ'活性の測定
ェシエリヒア ·]リ中のァシルク'ルコサミン 2-ェ メラ-セ'活性を調べる ため、 プラ ス ミ ド pEPIlで形質転換 した シ iリヒア ·: Χ14- Blueを
lOOmgZ リ ッ ト ノレのア ン ピシ リ ンを含む L B培地 （ 1¾ぺプ ト ン、 0.5%酵母エキス、 l¾NaCl、 pH7.0) に接種 し、 振盪 する こ と に よ り 培養を行っ た。 ま た、 よ り 効率よ く 該酵 素を生産させる ために、 培養開始時にイソフ° nピル - D- チ才力"ラクトピラ ンドを最終濃度が ImMとな る よ う に培地へ添加 した 37°Cで 12時間培養の後、 遠心分離 （ 5000rpm, 10分間） によ り 菌体をペ レ ッ ト 化 した。 こ の菌体を超音波破砕す る こ と によ っ て、 細胞抽出液を得る こ とができ る。 こ の 細胞抽出液は、 40mMの N-ァセチルマンノサミン （ナカ ラ イ テス ク 社 製） 又は 40mMの N-ァセチルク'ルコサミン （ナカ ラ イ テス ク 社製） 、 4mMのアデノ シ ン 一三 リ ン酸 （興人社製） 、 10mMの塩化マ グネ シ ゥ ムおよ び lOOmMの ト リ ス —塩酸緩衝液（ρΙΠ.5)の 存在下 （最終容積 0.5ml) で 37 、 30分間反応 した。 得 ら れた反応混合物を沸騰水中で 3 分間煮.沸する こ と によ り、 反応を停止 した。 次いで、 こ の反応.混合物か ら、 遠心分 離 （ 12, 000rpm， 5分間） によ っ て得 られた反応上清液の N-ァセチルマンパミンま たは N-ァセチルク、、ルコサミンを測定する こ と によ り . 該酵素の活性を測定 した。 但 し、 N-ァセチルマンノサミンと N-ァセチル ルコサミンを、 そのま ま HPLCで分離する こ と は困難であ る。 こ れ らの化合物をホ ンダ（Honda)ら 〔アナリティカル ·/ ィオケミスト' J - ( Analytical Biochemistry), 180. 351-357 (1989) に 記載〕 の方法に従っ て 1-フ1ニル-3 チル_5-ピラ'厂' 0ン 》1?)誘導 体とする ために、 10/ 1の上記反応上清液を 1.5ml容のマイ ク ロチ ュ ーブ （エ ツ ペン ドルフ社製） に移 し、 減圧乾燥 後、 50//1の 0.5¾1 PMPメ タ ノ ール溶液と 50 の 0.3M NaOfi 溶液を添加 し、 70°Cで 30分間反応 した。 こ の反応液を室 温で 10分間冷却後、 150tflの 0.1M塩酸水溶液で中和 した。 中和 した溶液に 200iilのク ロ 口 ホルムを添加 し、 混合する こ と によ り、 未反応の PMPはク ロ 口 ホルム層に、 ま た、 誘 導体化 した N-ァセチルへキソサミンは水層に分離 した。 ク ロ ロ ホル ム層を取 り 除いた後に、 水層を減圧乾燥 した。 乾燥物を 250 1の蒸留水に溶解 し、 その う ち 10//1を HPLCに注入する こ と に よ り 分離、 定量 した。 HPLC分析は、 LC- 6Aシステム (島津製作所社製） とカ ラ ム 〔 コスモシ-ル 5C18- AR (内径
6. Ommx長さ 150mm) (ナカ ラ イ テス ク 社製） 〕 を用いて 行い、 移動相は、 ァセ 卜 二 ト リ ノレと 50raMリ ン酸カ リ ウ ム 緩衝液（pH7..0 )の 2対 8の混合液であ り、 こ の移動相を im l Z分の流速で送液 した。 検出は、 245nmにおける紫外線の 吸収量によ り 測定 した。 ま た、 該酵素活性を示す単位は ユニ ッ ト であ り、 1 ユニ ッ ト は、 Ν ァセチルマンノサミンを基質と して反応 し、 1 分間当た り に mo lの Ν -ァセチル Γ'ルコサミンを生 成する 活性と定義 した。
その結果、 Ν -ァセチルマンノサミンが反応混合物に含まれている 場合には、 細胞抽出液の存在下、 Ν -ァセチルマン/サミンは Ν -ァセチル ク"ルコサミンに変換 した （図 3 参照） 。 同様に Ν -ァセチルク、、ルコサミン は、 細胞抽出液の存在下、 Ν -了セチルマン ミンに変換 した。 各 々 の反応において、 Ν-ァセチルク'ルコサミン対 Ν-ァセチルマンノサミンは、 75対 25の平衡状態に達した。 上記の細胞抽出液を前記混 合物に添加 しなかっ た と き は、 変換が全 く 見 られなかつ た。 その上、 純化 したァシル Γ'ルコサミン 2 -ェ メラ-セ'に対する抗 体は、 ウェスタンフ "ロフトにおいて、 約 45000ダノレ 卜 ン のノく、 ン ド と 反応 した （図 4 参照） 。 これ らの試験結果は、 全体的に 見て、 ク ロ ー ン化された遺伝子が、 ァシルク"ルコサミン 2 - 1ピメラ- セ"活性に対応する蛋白質を生産 している こ とを示 してい る。 ま た、 細胞抽出液のァシルク"ルコサミン 2 -ェ メラ-セ"活性は、 培養液 1リ ッ ト ル当た り 10ュニ ッ ト の生産が認め られ、 比 活性は 0. 03U/mgと、 ブタ の腎皮質の抽出液 と ほぼ同程度 であ る。 こ の こ と は、 従来動物の組織で しか得 られな力、 つ たァシルク、、ルコサミン 2-iヒ。メラ-セ、、力、'、 プラ ス ミ ド pEPIlで形寶転 換された微生物で生産でき る こ と を示 している。
(5)ァシルク、、ルコサミン 2-11:。メラ-セ"の塩基配列の決定
pEPIlの EcoRIか ら Xho Iの制限酵素切断部位間に揷入さ れたァシルク'ルコサミン 2 -ェ メラ-セ"を コ 一 ド化する DNAを含有する 約 1.4kbpの MA断片をサ ンガー (Sanger)ら 〔 Proceedings of 1 he National Academy of Sciences of the United States of America, 74- 5463-5467 ( 1977)] に記載の 方法を基本原理とする ジデォキ シ法に よ り、 塩基配列を 決定 した。 pEPIlに使用 されているベク タ ーは、 1 本鎖べ ク タ 一 とな り う る pBluescriptであ る ため、 こ のベク タ ー のま ま テ"イリ-シヨンミュ-タントを作成 し、 常法に従い塩基配列の 決定を行っ た。 ァシルク"ルコサミン 2-ェ メラ-セ'を コ ー ド化 してい る塩基配列を図 1 に示 した。 ま た、 該酵素を コ ー ド化 し ている塩基配列か ら翻訳されて得られる ポ リ べプチ ドの ア ミ ノ 酸配列 も 同時に示 した。
実施例 3
微生物によ る了シルク'ルコサミン 2-ェピメラ-セ'の生産
(1)ァシルク"ルコサミン 2-ェピメラ-セ"高生産プラ ス ミ ドの構築
上記プラ ス ミ ド pEPIlのテ'イリ-シヨンフ°ラスミドを構築する こ と によ り、 ァシルク'ルコサミン 2-1 メラ-セ'の微生物によ る高生産 が可能 とな っ た。 プラ ス ミ ド pEPIl(20//g)の 500//1溶液中 で 100ュニ ッ 卜 の Saclと 100ュニ ッ 卜 の Xbalの制限酵素を 用いて 37°Cで 4時間切断 した。 制限酵素処理液を 75°Cで 15分間処理 した後、 フエノ-ル /クロ口ホルム（1:1)で抽出 し、 ェタ ノ —ルで沈殿 した。 沈殿物を l/ig//lにな る よ う に滅菌水に 溶解 した ものを、 キソ /マン Γ·テ"イリ-シヨンキプト （ス ト ラ タ ジー ン社製） を用いて、 数十種のテ"イリ-ジョン ラスミドを作成 し、 こ の う ちプラ ス ミ ド pEP114が、 了シルク'、ル]サミン 2-ェ メラ-セ を 高生産する こ とを認めた。 プラ ス ミ ド pEP114で形質転換 されたェシエリヒア ·]リ XL 1 -Blueを、 100/ig/mlのア ン ピシ リ ン及 び ImMのイソフ。 D ル -D-チ才力'ラクト I：。ラハンドが入 つ た LB培地で、 37°C、 12時間培養 し、 その培養物のペ レ ツ ト か ら細胞抽 出液を調製 した。 細胞抽出液のァシルク"ルコサミン 2-ェ メラ-セ'活 性は、 培養液 1リ ッ ト ル当た り 約 1000ュニ ッ ト の生産が認 め られ、 比活性は 1.6U/ingと、 ブタ の腎皮質の抽出液の約 5 3倍の上昇が認め られた。
(2)ァシルク、、ルコサミン 2-ェヒ。メラーセ、、の生産
プラ ス ミ ド pEP114は、 ヱ'ンエリヒア 'コリ中で、 多量のァシルク"ルコ サミン 2 -Xピメラ-セ"を生産する有効な手段を提供する。
ェシ； Lリヒア *コリを培養 し、 了シルク'ルコサミン 2_ェ メラ- を得る こ と は 動物組織か ら得る よ り も は る かに容易であ る。
培養は、 lOOmg/リ' /トルのァ ン ピ シ リ ン及び ImMのイソフ。口 ル - D-チ才力'、ラクトヒ。ラ ンにを含む LB培地（1%ぺプ ト ン、 0· 5%酵 母エキス、 l¾NaCl、 ρΗ7· 0)1リ ッ ト ソレを 2本の 2リ ツ ト ノレ容 振盪フ ラ ス コ に入れ、 それぞれにプラ ス ミ ド PEP114で形 質転換 した Iシ Xリヒア 'コリ し1- Blueを接種 し、 振盪する こ と に よ り 行っ た。 37°Cで 12時間培養を行っ た後、 遠心分離に て培養物を集め、 生理食塩水で 2 回洗浄 した。 培養物を、 ImMの EDTA及び 0. 05%の 2-メルカフ。 トエタノールの入 っ た 50mMの リ ン 酸緩衝液（pH7.6) 50mlに懸濁 し、 超音波発生装置（UR- 200 P, ト ミ 一精ェ社製） に よ り 培養物を破砕後、 遠心分離に て沈殿物を除き、 細胞抽出液を得た。 細胞抽出液に、
0.03% (W/V)にな る よ う にプロ 夕 ミ ン硫酸 （ナカ ラ イ テス ク社製） を添加 し、 遠心分離で上清を得る こ と によ り、 除核酸処理を行っ た。 上清は、 硫酸ア ンモニゥ ムに よ り 塩析処理 し、 硫酸ア ンモニゥ ム 20〜 80%飽和画分を集め、 上記 リ ン酸緩衝液に対 し透析を行っ た。 透析処理液は、 上記 リ ン酸緩衝液で平衡化 した DEAE-セルロ-ス （ ヮ ッ ト マ ン 社製） カ ラ ム （直径 5cmx 高さ 10cm) に通液 して吸着させ た。 吸着 した蛋白質の溶出は、 通液 している上記 リ ン酸 緩衝液に適度な濃度の塩化力 リ ゥ ムを添加する こ と によ り 行っ た。 ァシルク、、ル]サミン 2 -ェ メラ-セ、'活性は、 75〜 100mMの塩 化カ リ ウ ム濃度で溶出 さ れたため、 こ の活性画分を集め、 メンフ "ランフィルタ- (分画分子量 10000、 ァ ミ コ ン社製） で濃縮 及び脱塩 した後、 上記 リ ン酸緩衝液で平衡化 した Q — セ フ ァ ロ ス （ フ ァ ノレマ シ ァ 社製） カ ラ ム （内径 1cm X 直径 5cin) に通液 した。 吸着 した蛋白質の溶出は、 lOOmMの塩 化力 リ ゥ ムを添加 した上記 リ ン酸緩衝液と、 300mMの塩化 カ リ ウ ムを添加 した上記 リ ン酸緩衝液の直線的濃度勾配 溶出法によ り、 溶出 した。 ァシルク'ルコサミン 2-ェ メラ-セ'活性画 分を集め、 上記メンフ " ランフィルタ-で濃縮及び脱塩する こ と によ り、 純化 した ク ロ ー ン化ァシルク"ルコサミン 2-ェ メラ-セ'を
約 700ュニ 7卜 （ 33mg) 得る こ とができた。
実施例 4
ラ ッ ト 腎臓由来ァシルク"ルコサミン 2-ェ 1:°メラ-セ"の精製
ラ ッ 卜 の腎臓 （ 300g) を用いて、 実施例 1(1)と 同様に して、 ラ ッ ト 由来のァシルク'ルコサミン 2-ェ メラ-セ、'の精製を行つ た。 但 し、 実施例 1(1)にある逆相カ ラ ム（マイクロホ、'ンタ"スフエア -5//C4)によ る精製工程は、 酵素が失活する ため行わず、 モノ Q カ ラ ムで再度精製する こ と によ り、 ァシルク、、ルコサミン 2- ェ メラ-セ"（0. 15mg)を得た。
実施例 5
ァシルク レコサミン 2-ェ メラ-セ"に よ る レニ ン活性の阻害（1)
40 μΐの緩衝液 A ( Ο, ΙΜリ ン酸ナ ト リ ゥ ム緩衝液
(pH6.5)、 ImM EDTA、 Mロ イ ぺプチ ン、 0· 05¾!牛血清アル ブ ミ ン） 中に、 2.5mUの市販の レニ ン （ シ グマ社製） 及び 0-25pmolの実施例 3 で得られたク ロ ー ン 化ァシルク、'ルコサミン 2- ェ . メラ-セ を加え、 °Cで 1時間反応した。 反応後.、 ..
960//1の冷却 した緩衝液 Aを加え、 全量を lralと した。
250//1の緩衝液 A中に、 得られた反応希釈液の一部
(25/ 1)と 0.4mg/mlの 了ン Γ才 Ϊンシ /-ケ、 'ン （ シグマ社製） 及び終 ^^2.5mMに な る ラ に フフ化フエ二ルメチルスルホニルを カロ 元、 37°Cで 30分間反応した。 該溶液を沸騰水中で 3 分間処理 して反 応を停止し、 遠心分離（ 14000rpm、10分）後、 上清液に遊離 するア ンギオテ ン シ ン I を定量した。 結果を表 1 に示す。
Figure imgf000050_0001
実施例 6
ァシルク、、ルコサミン 2 ラ-セ、' に よ る レ ニ 活 の阻害（21
実施例 3 で得られたク 口一ン 化ァシルク'ルコサミン 2 -ェ メラ-セ" の代わ り に実施例 4 で得られたラ ッ 卜のァシルク "ルコサミン 2- ェ メラ-セ'、を 用 い た 他 は、 実施例 5 と 同 様 に し て、 ァシル ル コサミン 2-ェヒ°メラ-セ"による レニ ン の阻害活性を測定した。 結 果を表 2 に示す。 2
Figure imgf000051_0001
実施例 7
レニ ン とァシルク、'ル：!サミン 2-ェ メラ- の結合反応（1)
ΙΟΟμΙの緩衝液 A中に、 25mUの レニ ン （ シ グマ社製） 及 び 140pmolの実施例 3 で得 られたク ロ ー ンィ匕了シルク"ルコサミン 2 -ェ メラ-セ'を加え、 37°Cで 1時間反応 した。
上記の 100//1の反応液を、 ゲル濾過ク πマトク"ラフィ - [カ ラ ム , Superose 12HR 10/30; 移動相. 50mMリ ン酸ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ pH7.5) -150raM塩化ナ ト リ ウ ム ； 流速 l mlZ分 ； 検出. 紫外線（280nm)] によ り 分画 し、 各画分の レニ ン活 性を測定する こ と に よ り、 レ ニ ン の分子量変化を測定 し
' 上記ゲル濾過ク πマトク"ラフィ-で溶出 された画分は、 実施例 5 の方法に準 じて レニ ン活性を測定 した。 その結果、 了シルク"ルコサミン 2-1ヒ。 メラ-セ"無添力 (1の場合は、 レ ニ ン の分子量 に相当する約 40000ダル ト ン の位置に レニ ン活性が溶出 さ れた。 しか し、 了シルク"ルコサミン 2- ピメラ-セ"を添加 した場合は、 約 60000ダル ト ン の位置に レニ ン活性が溶出 し、 該酵素が レニ ンに結合 して高分子化する こ とが認め られた。 · 本実験で得 られた高分子化 した レニ ン の分子量は、
Takahashiら [ J. Biochem. , 93. 1583-1594 (1983)] が 報告 した レニ ン結合蛋白質と レニ ンの複合体であ る高分 子型（HMW)レニ ン のゲル濾過ク πマトク"ラフィ-に よ る分子量 （約
60000ダル ト ン） と よ く 一致 した。 よ っ て、 了シルク"ルコサミン 2 -ェ メラ-セ"は レニ ン結合活性を有 していた。
実施例 8
レ ニ ン と ァシルク'、ルコサミン 2—ェヒ。 メラ一セ、、の結合反応（2)
実施例 3 で得られたク ロ ー ン化ァシルク"ルコサミン 2-ェピメラ-セ" の代わ り に実施例 4 で得 られたラ ッ ト のァシルク'ルコサミン 2- ェ メラ-セ'を用いた他は、 実施例 7 と同様に してゲル濾過 ク πマト ラフィ-によ る分子量の測定を行っ た。 その結果、 実 施例 7 と 同様に レニ ン の分子量が約 60000ダル ト ン に高分 子化 した。
実施例 9
レニ ン結合活性を有する蛋白蜇を用いた N-ァセチルマンノサミンの 製造法
iffiな N ァセチルク"ルコサミンカヽ ら N ァセチルマンノサミンの 5tを fi1つ た c 10gの N-ァセチルク'ルコサミン、 5mgの実施例 3 で得た レ ニ ン結合活 性を有する蛋白質、 4mM ATP及び 10mM MgCl2の水溶液 100mlを ρΗ7· 5に調整 し、 37°Cで 24時間反応 した。 反応液 は減圧濃縮 し、 シ ロ ッ プを得た。 得 られた シ 口 ッ プに 0 mlのエタ ノ ールを加えて沸騰水浴中 1 0 分間加温 した後、
4 °Cで 3 時間放置 した。 N-ァセチル ルコサミンは不溶性、 N-ァセチ ルマンノサミンは可溶性であ る こ とか ら沈殿物（N-ァセチルク"ルコサミン） を濾過によ り 取 り 除き、 濾液を減圧濃縮する こ と によ り 純度 91%以上の N-了セチルマン ミン 2gを得た。
実施例 1 0
レニ ン結合活性を有する蛋白晳を用いた シアル酸の製造 安価な N-ァセチルク"ルコサミンと ピル ビン酸か ら レニ ン結合活性 を有する蛋白質と N-ァセチル ラミン酸リア-セ"を作用 させ、
N-ァセチル ラミン酸の製造を行つ た。
5mM ATP及び 5mM MgCl 2を含む 50mMの ト リ ス塩酸緩衝液 (pH7.5)に N-ァセチルク"ルコサミン 22g及びピル ビ ン酸 llgを溶解 し、 こ の溶液に 15mgの実施例 3 で得た レニ ン結合活性を有す る蛋白質及び、 500ュニ ッ 卜 の N-ァセチル /イラミン酸リア-セ、、を加え て全量を 0.5リ ッ ト ルと し、 30° (：、 48時間反応を行っ た。 反応後の反応液中 には 12.4gの N-ァセチル /イラミン酸が生成 した。
Dowexll (ダウ ケ ミ カ ル社製） によ るイオン交換ク：！マト Γラフィ- によ り 反応物を単離 し、 濃縮後、 凍結乾燥に よ り 10.3gの N-ァセチルノイラミン を得た。

Claims

請 求 の 範 囲 Φ アジルグ ルコサミン 2-ェヒ。メラ一セ、、。 ② 下言己 （1：)〜 （3)の いずれ力ヽ の ァシルク、、ルコサミン 2 ェヒ。メラーセ'、 ；(1)下記式（Α)で表されるア ミ ノ 酸配列を必須配列とする ァシルク、'ルコサミン 2 ェヒ。メラーセ、' ； (2)下記式（Α)で表されるァ ミ ノ 酸配列の 10位、 13位、 21 位、 23位、 27位、 33位、 45位、 47位、 51位、 71位、 72位、 76- 79位、 93位、 94位、 101位、 110位、 120位、 136位、 137位、 139位、 141位、 142位、 145位、 149位、 155位、 159位、 162位、 163位、 171位、 173位、 174位、 176位、178位、 187位、 195位、 199-202位、 205位、 208位、 212位， 224位、 232位、 234位、 237位、 243位、 249位、 258 - 261 位、 263位、 266位、 267位、 269位、 270位、 272位、 275位. 282位、 287- 289位、 300位、 301位、 309位、 317位、 318位， 328位、 329位、 334位、 337位、 348位、 363位、 364位、371位、 392位、 393位、 395位、 399位、 401位及び 402位か らなる群から選ばれる少な く と も 1 つの位置が置換又は 欠失 さ れ た ァシルク、'ルコサミン 2—ェヒ。メラ-セ、' ； あ る い は (3)下記式（Α)で表されるポ リ ぺプチ ドの Ν末端又は C末 端に Pro Ala Pro Ser Pro Ala Pro Thr Pro Ala CysArg Gly Ala Glu ； Pro Ala Pro Leu Gly Ser Leu Pro Ala Val Pro Thr Arg Glu Gly Ser Lys ； または Lys Gly Asn Lys Ser Trp Gin Asp力、'付力 Π したァシルク、、ルコサミン 2—ェ メ 7—セ' ； ·. ( A ) Met Glu Lys Glu Arg Glu Thr Leu Gin Ala Trp Lys Glu Arg Val Gly Gin Glu Leu Asp Arg Val Met AlaPhe Trp Leu Glu His Ser His Asp Arg Glu His GlyGly Phe Phe Thr Cys Leu Gly Arg Asp Gly Arg ValTyr Asp Asp Leu Lys Tyr Val Trp Leu Gin Gly ArgGin Val Trp Met Tyr Cys Arg Leu Tyr Arg Lys Leu Glu Arg Phe His Arg Pro Glu Leu Leu Asp Ala AlaLys Ala Gly Gly Glu Phe Leu Leu Arg His Ala ArgVal Ala Pro Pro Glu Lys Lys Cys Ala Phe Val LeuThr Arg Asp Gly Arg Pro Val Lys Val Gin Arg Ser lie Phe Ser Glu Cys Phe Tyr Thr Met Ala Met Asn Glu Leu Trp Arg Val Thr Ala Glu Ala Arg Tyr GinSer Glu Ala Val Asp Met Met Asp Gin lie Val HisTrp Val Arg Glu Asp Pro Ser Gly Leu Gly Arg ProGin Leu Pro Gly Ala Val Ala Ser Glu Ser Met AlaVal Pro Met Met Leu Leu Cys Leu Val Glu Gin Leu Gly Glu Glu Asp Glu Glu Leu Ala Gly Arg Tyr AlaGin Leu Gly His Trp Cys Ala Arg Arg lie Leu GinHis Val Gin Arg Asp Gly Gin Ala Val Leu Glu Asn Val Ser Glu Asp Gly Glu Glu Leu Ser Gly Cys Leu Gly Arg His Gin A.s.n Pro Gly His Ala Leu Glu Ala Gly Trp Phe Leu Leu Arg His Ser Ser Arg Ser Gly Asp Ala Lys Leu Arg Ala His Val lie Asp Thr Phe Leu Leu Leu Pro Phe Arg Ser Gly Trp Asp Ala Asp His Gly Gly Leu Phe Tyr Phe Gin Asp Ala Asp Gly Leu Cys Pro Thr Gin Leu Glu Trp Ala Met Lys Leu Trp Trp Pro His Ser Glu Ala Met lie Ala Phe Leu Met Gly Tyr Ser Glu Ser Gly Asp Pro Ala Leu Leu Arg Leu Phe Tyr Gin Val Ala Glu Tyr Thr Phe Arg Gin Phe Arg Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly Tyr Leu Asn Arg Glu Gly Lys Val Ala Leu Thr lie Lys Gly Gly Pro Phe Lys Gly Cys Phe His Val Pro Arg Cys Leu Ala Met Cys Glu Glu Met Leu Ser Ala Leu Leu Ser Arg Leu Ala ③ ァシルク、、ルコサミン 2-1ヒ。メラ-セ、、を コ ー ドする D N A分子。 ④ 上記式（A)のァ ミ ノ酸配列をコー ドする塩基配列又は その一部が置換又は欠失されたァ ミ ノ 酸'配列をコー ドす る塩基配列を含む請求項 3 に記載の D N A分子。 (但 し、 上記式（A)のア ミ ノ 酸配列の一部が置換又は欠失 されたァ ミ ノ 酸配列をコー ドする塩基配列は、 ァシルク'ルコサ ミン 2-1ピメラ-セ"活性を有するポ リ べプチ ドをコ一 ドする） 30 ⑤ 下記式（X )の塩基配列を有する請求項 4 に記載の D N A分子。 ( X ) ATG GAG AAG GAG CGC GAA ACT CTG CAG G CC TGG AAG GAG CGT GTG GG C CAA GAG CTG GAC CGC G TG ATG GCTTTC TGG CTG GAG CAC TCC CAC GAT CGG GAG CAC GGGGGC TTC TTC ACG TGC CTG GGC CGC GAC G GG CGG GTGTAT G AC GAC CTC AAG TAC GTC TGG CTG CAG GGG AGGCAG GTG TGG ATG TAC TGT CGC CTG TAC CGC AAG CTT GAG CGC TTC CAC CGC CCT GAG CTT CTG GAT GCG GCTAAA G CA GGG GGC GAA TTT TTG CTG CGC CAT GCC CGAGTG G CA CCT CCT GAA AAG AAG TGT GCC TTT GTG CTGACG CGG GAC GGC CGG CCC GTC AAG GTG CAG CGG AGCATC TTC AGT GAG TGC TTC TAC ACC ATG G CC ATG AAC GAG CTG TGG AGG GTG ACG GCG GAG GCA CGG TAC CAGAGC GAA GCG GTG GAC ATG ATG GAT CAG ATC GTG CACTGG GTG CGA GAG GAC CCC TCT GGG CTG GGC CGG CCCCAG CTC CCC GGG GCC GTG GCC TCG GAG TCC ATG GCAGTG C CC ATG ATG CTG CTG TGC CTG GTG GAG CAG CTC GGG G AG GAG GAC GAG GAG CTG GCA GGC C GC TAC GCGCAG CTG GGG CAC TGG TGC GCT CGG AGG A TC CTG CAGCAC GTC CAG AGG GAT GGA CAG GCT GTG C TG GAG AAT GTG TCG GAA GAT GGC GAG GAA CTT TCT GGC TGC CTG GGG AGA CAC CAG AAC CCA GGC CAC GCG C TG GAA GCT GGC TGG TTC CTG CTC CGC CAC AGC AGC CGG AGC GGT GA C G CC AAA CTT CGA GCC CAC GTC ATC GAC ACG TTC CTG C TA CTG CCT TTC CGC TCC GGA TGG G AC GCT GAT CAC G GA GGC CTC TTC TAC TTC CAG GAT GCC GAT GGC CTC T GC CCC ACC CAG CTG GAG TGG GCC ATG AAG CTC TGG TGG CCG CAC AGC GAA GCC ATG ATC GCC TTT CTC ATG GGC TAC AGT GAG AGC GGG GAC CCT GCC TTA CTG CGT CTC TTC TAC CAG GTG GCC GAG TAC A CG TTT CGC CAG TTT CGT GAT CCC GAG TAC GGG GAA TGG TTT GGC TAC CTG AAC CGA GAG GGG AAG GTT GCC CTC ACT ATC AAG GGG GGT CCC TTT AAA GGC TGC TTC CAC GTG CCG CGG TGC CTT GCC ATG TGC GAA GAG ATG CTG AGC GCC CTG CTG AGC CGC CTC GCC TAG ⑥ ァシルク、'ルコサミン 2 -ェ メラ-セ"を コ ー ドする D N A分子が組 み込ま れた組換え体ベク タ ー。 ⑦ 前記 D N A分子が、 前記式（A )のア ミ ノ 酸配列を コ ー ドする塩基配列又はその一部が置換又は欠失さ れたァ ミ ノ 酸配列をコ ー ドする塩基配列を含む請求項 6 に記載の 組換え体べク タ 一。 (但 し、 上記式（ A )のァ ミ ノ 酸配列の一部が置換又は欠失 さ れたァ ミ ノ 酸配列を コ 一 ドする塩基配列は、 ァシルク、'ルコサ ミン 2-i 1:°メラ-セ"活性を有する ポ リ.ペプチ ドを コ ー ドする。 ） ⑧ 前記 D N Aが、 前記式（X)の塩基配列を含む請求項 7 に記載の組換え体ベク タ ー。 ⑨ 請求項 3 に記載の D N A分子を含む組換え体べク タ 一を細胞に導入 してな る形質転換体。 ⑩ 了シルク'ルコサミン 2-1 メラ-セ、'を コ ー ドする D N A分子を組 み込んだ組換え体ベク タ ーを細胞に導入 して形質転換体 と し、 該形質転換体を培地に培養 し、 培養物中にァシルク'ル コサミン 2-ェ メラ- を生成蓄積させ、 該培養物か らァシル Γルコサ ミン 2—ェヒ°メラーセ を採取する ァシルク、'ルコサミン 2—ェヒ。メラーセ、、の製造方 ？ io ⑪ レニ ン結合活性を有するァシルク'ルコサミン 2-1 メラ-セ'。 ⑫ 下記（ 1 )〜（ 3 )のいずれかに記載のポ リ ぺプチ ドを必 須成分 とする請求項 11に記載のェ ピメ ラ ーゼ。 (1)前記式（A)で表される ァ ミ ノ 酸配列を必須配列 とす る ポ リ ペプチ ド ； (2)前記式（A)で表さ れる ァ ミ ノ 酸配列の 10位、 13位、 21 位、 23位、 27位、 33位、 45位、 47位、 51位、 71位、 72位、 76- 79位、 93位、 94位、 101位、 110位、 120位、 136位、 137位、 139位、 141位、 142位、 145位、 149位、 155位、 159位、 162位、 163位、 171位、 173位、 174位、 176位、 178位、 187位、 195位、 199- 202位、 205位、 208位、 212位. 224 " 位、 232位、 234位、 237位、 243位、 249位、 258 - 261位、 263位、 266位、 267位、 269位、 270位、 272位、 275位、 2 82位、 287- 289位、 300位、 301位、 309位、 317位、 318位、 328位、 329位、 334位、 337位、 348位、 363位、 364位、 371位、 392位、 393位、 395位、 399位、 401位及び 402位か らなる群から選ばれる少な く と も 1 つ の位置が置換又は 欠失されたポ リ ぺプチ ド ； あるいは (3)式（A)で表されるポ リ ペプチ ドの N末端又は C末端に Pro Ala Pro Ser Pro Ala Pro Thr Pro Ala Cys Arg Gly Ala Glu ； Pro Ala Pro Leu Gly Ser Leu Pro Ala Val Pro Thr Arg Glu Gly Ser Lys ； または Lys Gly Asn Lys Ser Trp Gin Asp力、'付力 Π したポ リ ぺプチ ド。 ； (但し、 前記式（A)の一部が置換又は欠失されたポ リ ぺプ チ ド は、 ァシルク"ルコサミン 2 -ェ メラ-セ'活性を有する。 ） ⑩ 下記（ 1 )〜（ 3 )のいずれかのポ リ ペプチ ド （但し一般 式（R-l)、 （R- 2)及び（R- 3)で表されるポ リペプチ ドを除く ） 。
(1)前記式（A)で表されるァ ミ ノ 酸配列を必須配列とする ポ リ ペプチ ド ；
(2)前記式（A)で表されるア ミ ノ 酸配列の 10位、 13位、 21 位、 23位、 27位、 33位、 45位、 47位、 51位、 71位、 72位、 76-79位、 93位、 94位、 101位、 110位、 120位、 136位、 137位、. 139位、 141位、 142位、 145位、 149位.、' 155位、' 159位、 162位、 163位、 171位、 173位、 174位、 176位、 178位、 187位、 195位、 199-202位、 205位、 208位、 212位. 224位、 232位、 234位、 237位、 243位、 249位、 258— 261 位、 263位、 266位、 267位、 269位、 270位、 272位、 275位, 282位、 287-289位、 300位、 301位、 309位、 317位、 318位， 328位、 329位、 334位、 337位、 348位、 363位、 364位、 371位、 392位、 393位、 395位、 399位、 401位及び 402位か らなる群から選ばれる少な く と も 1 つの位置が置換又は 欠失されたポ リ ペプチ ド ； あるいは
(3)前記式（A)で表されるポ リ べプチ ドの N末端又は C末 端に Pro Ala Pro Ser Pro Ala Pro Thr Pro Ala Cys Arg Gly Ala Glu； Pro Ala Pro Leu Gly Ser Leu Pro Ala Val Pro Thr Arg Glu Gly Ser Lys ； または tys Gly Asn Lys Ser Trp Gin Aspカヽ'付力 Bしたポ リ ペプチ ド ；
( R - 1 )
Met Glu Lys Glu Arg Glu Thr Leu Gin Ala Trp Lys Glu Arg Val Gly Gin Glu Leu Asp Arg Val Val Ala Phe Trp Met Glu His Ser His Asp Gin Glu His Gly Gly Phe Phe Thr Cys Leu Gly Arg Glu Gly Arg Val Tyr Asp Asp Leu Lys Tyr Val Trp Leu Gin Gly Arg S3 w ω » -.
Figure imgf000062_0001
V-i CO r— 1 4-» i-H ϋ i-H >> ΰθ r- 1 o ω P*
» <υ r cd i CD r as rH CO r r—l i-l r— 1
-< c? O n >— 1 1—4 cu CO cd O w w r-H
0) < » i— i w r-H CD i-H CO t-H r— 1 < -3 ■J -< O w
Figure imgf000062_0002
W CO O (U V-i +-» O > w o 03 w
r— « ぶ V-i r-H IH OJ f-H i— 1 4 •H <D r-H —3 → 0u -< . U ra
Figure imgf000062_0003
> O ;=» +-» bO ^ O w
CD p— ( CO r-H r-H > CO r-H r-H cu V-i <υ ■H
CD D - -J - t- M
O* o P. CO 4-» O >> P: 0) o O r-H w CD i— ί r-H CU r-H f-H r-H r-H rH
Figure imgf000062_0004
CO
M
»-3 > -
Π) Π)
O
c- tr1 cn Π)
Π) OQ Ό t■ <
• 3
cn —3 tn CO T3 -9
H CD l—1 ：
ο O r- ^3 r- •-3 > - CO
a cn
口 o Ό
-=J o O m o
- » CD cn
(/ OQ o CD O D
•-9 t- 00 O > - O -< C3
D3 Q < 1— «
CD o n CD I—1 CO cn P
t— t CD -
Μ· CD »— * *
f— 1 OQ h— 1 ^ σ C cn CO
CD •-3 t- O t- > > - r- -
* ： * CD Q CO cn CP tn
OQ Ό Ό o> »— »
> CO r- t- C3 -a
CD o CD CD CD »— »
OS c Ό S3 o CD Co o
-o CD CD r- r- ir CD CD tr n> TO cn
- > CD o •-a t— ca CU CD o
OQ 口 n Π) o n> c
Ή > - cn H n>
3 3 DP OQ 03 O a
Arg Glu Ala Val Glu Met Met Asp Gin lie lie His Trp Val Arg Glu Asp Pro Ala Gly Leu Gly Arg Pro Gin Leu Ser Gly Thr Leu Ala Thr Glu Pro Met Ala Val Pro Met Met Leu Leu Asn Leu Val Glu Gin Leu Gly Glu Glu Asp Glu Glu Met Thr Asp Lys Tyr Ala Glu Leu Gly Asp Trp Cys Ala His Arg lie Leu Gin His Val Gin Arg Asp Gly Gin Val Val Leu Glu Asn Val Ser Glu Asp Gly Lys Glu Leu Pro Gly Cys Leu Gly Arg His Gin Asn Pro Gly His Thr Leu Glu Ala Gly Trp Phe Leu Leu Gin Tyr Ala Leu Arg Lys Gly Asp Pro し ys Leu Gin Arg His lie lie Asp Lys Phe Leu Leu Leu Pro Phe His Ser Gly Trp Asp Pro Glu His Gly Gly Leu Phe Tyr Phe Gin Asp Ala Asp Asp Leu Cys Pro Thr Gin Leu Glu Trp Asn Met Lys Leu Trp Trp Pro His Thr Glu Ala Met lie Ala Phe Leu Met Gly Tyr Arg Asp Ser Gly Asp Pro Ala Leu Leu Asn Leu Phe Tyr Gin Val Ala Glu Tyr Thr Phe His Gin Phe Arg Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly Tyr Leu Asn Gin Glu Gly Lys Val Ala Leu Thr lie し ys Gly Gly Pro Phe Lys Gly Cys Phe His Val Pro Arg Cys Leu Ala Met Cys Glu Gin lie Leu Gly Ala Leu Leu Gin Arg Leu Gly Pro Ala Pro Leu Gly Ser us v η 9 ngq ΪΒΛ BTV UT0 AI3 dsy 3ュ v uio \Έ\ sig "TO nsq an 8jy 3 εχ V SAQ dJx sin Aid n3l "13 eiV ュ 3 ΑΤ9 ¾TV na ni9 ni9 dsy ^1 "13 ^13 02 Π9ΐ ux9 ηχο ΤΒΛ sAo Π91 nsi ;3H W o^d Ι^Λ
^TV ；91 ュ 3S ητο J3S BTV ΤΒΛ BTV ^χ ojd nsq uig
OJd SJV Αχθ ng Λχο JSS oュ d dsy ηχ9 T^A dユエ
S H Τ¾Λ 3TI UT9 dsy 13H ;8ίϊ "TO ΐΒΛ εχν ηχ9 J9S UTO ュ 3 -IV BTV "ΐ9 ^TV ュ iU ΪΒΛ SJV dユエ na ηχο 9ΐ
US V V -ΐ¾Ι ュ 3Md sAo ηχο J9S aqd 311 ュ 3JV ui9 sAi ΙΒΛ οュ d 3iv ^IO dsy Sjy J¾I nsi ΐ^Λ 3Md sA nig 0:13 OJJ Βχν T^A
s id "TO χ9 Αχ3 Βχγ sA
¾X V V ds v ii9 na η ο OJJ 3 STH ^Md ηχο Q I ιΑχ ng Sjy sAo 丄 W dii τ^Λ U19
3ιγ Αχο ui9 nsi dュ丄 IBA ιΛχ sAq ng dsy dsy ιΑ ΐ^Α 3iy AIO dsy S y Aif) nsi SAQ ュ i(ェ 9¾d Slid ^19 ΑΐΟ STH πχ9 3ュ V dsy sig ■iaS sin "13 naq dユエ aqj
¾TV H ΤΒΑ ηχο «19 ^ΐθ ΪΒΛ 3jy πτ 9 sAq dュ丄 Βΐν UT9 ngq ηΐθ 3ιγ ηχο sA ηχο ： n
( 2 一 H ) sA jas 19 ηχο 3ュ v Jqx OJJ TEA ^TV ◦ュ d na
画/ ^ S9 績 Val Ser Glu Asp Gly Glu Glu Leu Ser Gly Cys Leu Gly Arg His Gin As.n Pro Gly His Ala Leu Glu Ala Gly Trp Phe Leu Leu Arg His Ser Ser Arg Ser Gly Asp Ala Lys Leu Arg Ala His Val lie Asp Thr Phe Leu Leu Leu Pro Phe Arg Ser Gly Trp Asp Ala Asp Tyr Gly Gly Leu Phe Tyr Phe Gin Asp Ala Asp Gly Leu Cys Pro Thr Gin Leu Glu Trp Ala Met Lys Leu Trp Trp Pro His Arg Gin Ala Met He Ala Phe Leu Met Gly Tyr Ser Glu Ser Gly Asp Pro Ala Leu Leu Arg Leu Phe Tyr Gin Val Ala Glu Tyr Thr Phe Arg Gin Phe Arg Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly Tyr Leu Asn Arg Glu Gly Lys Val Ala Leu Thr lie Lys Gly Gly Pro Phe Lys Gly Cys Phe His Val Pro Arg Cys Leu Ala Met Cys Glu Glu Met Leu Ser Ala Leu Leu Ser Arg Leu Ala
⑭ 請求項 13に記載のポ リ ペプチ ドを コ ー ドする D N A 分子。
⑮ 前記式（X)で表される塩基配列を有する請求項 14に記 載の D N A分子。
⑯ 請求項 14又は 15に記載のァシルク"ルコサミン 2 -ェピメラ-セ'、を コ - ドす る D N A分子が組み込まれた組換え体ベク タ ー。 ⑰ 請求項 16に記載の組換え体べク タ ーを細胞に導入 し てな る形質転換体。
⑱ 請求項 12に記載の レニ ン結合活性を有するァシルク、、ルコサ ミン 2 -ェ メラ-セ、、を コ ー ドする D N A分子を組み込んだ組換 え体ベク タ ーを細胞に導入 して形質転換体と し、 該形質 転換体を培地に培養 し、 培養物中に了シルク、'ルコサミン 2 -ェ メラ- セ"を生成蓄積させ、 該培養物か らァシルク"ルコサミン 2-ェ メラ-セ" を採取する レニ ン結合活性を有するァシル ルコサミン 2-ェ メラ- セ、'の製造方法。
⑲ 請求項 11又は 12に記載の了シルク"ルコサミン 2-1 メラ-セー又は その誘導体を必須成分とする 降圧剤。
⑳ レニ ン結合活性を有する蛋白質を必須成分とする、 N-ァセチルク'、ルコサミン力、 ら N-ァセチルマンノサミンへの変換を行う ェ ピメ リ 化剤。
© N-ァセチルク"ルコサミンに レニ ン結合活性を有する蛋白質を作 用 させる こ とを特徴とする N-ァセチルマン ミンの製造法。
© N-ァセチル Γルコサミンと ピルビ ン酸に レニ ン結合活性を有す る 蛋白質及び N-ァセチルノイラミン酸リア-セ"を作用 さ せる こ と を特徴 とす る N-了セチル /イラミン酸の製造法。
PCT/JP1995/000541 1994-03-25 1995-03-24 Epimerase Ceased WO1995026399A1 (fr)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE69534484T DE69534484T2 (de) 1994-03-25 1995-03-24 Epimerase
KR1019950705274A KR100294996B1 (ko) 1994-03-25 1995-03-24 에피머라제
AU20827/95A AU696154B2 (en) 1994-03-25 1995-03-24 Epimerase
EP95913330A EP0708177B1 (en) 1994-03-25 1995-03-24 Epimerase
JP52508495A JP3418764B2 (ja) 1994-03-25 1995-03-24 エピメラーゼ
US08/553,703 US5795767A (en) 1994-03-25 1995-03-24 Epimerase

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP5627194 1994-03-25
JP6/56271 1994-03-25
JP6/216333 1994-09-09
JP21633394 1994-09-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1995026399A1 true WO1995026399A1 (fr) 1995-10-05

Family

ID=26397225

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1995/000541 Ceased WO1995026399A1 (fr) 1994-03-25 1995-03-24 Epimerase

Country Status (7)

Country Link
US (2) US5795767A (ja)
EP (1) EP0708177B1 (ja)
JP (1) JP3418764B2 (ja)
KR (2) KR100294996B1 (ja)
AU (1) AU696154B2 (ja)
DE (1) DE69534484T2 (ja)
WO (1) WO1995026399A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5994105A (en) * 1994-03-25 1999-11-30 Marukin Shoyu Co., Ltd. Epimerase
US7955825B2 (en) 2002-07-18 2011-06-07 Yamasa Corporation Process for producing CMP-N-acetylneuraminic acid
US8852891B2 (en) 2006-12-15 2014-10-07 Gene Chem, Inc. N-acetylglucosamine-2-epimerase and method for producing CMP-neuraminic acid using the same
WO2014193183A1 (ko) 2013-05-31 2014-12-04 주식회사 진켐 시알산 유도체의 제조방법

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4323571B2 (ja) 1997-01-31 2009-09-02 エックスワイ， インコーポレイテッド 光学装置
KR20010102019A (ko) 1999-02-09 2001-11-15 히라타 다다시 Ｎ-아세틸글루코사민 ２-에피머라아제 및 이 효소를코딩하는 ｄｎａ
UA95899C2 (ru) 2000-05-09 2011-09-26 Эксуай, Ллк Популяции сперматозоидов высокой чистоты с x-хромосомами и y-хромосомами
US7713687B2 (en) 2000-11-29 2010-05-11 Xy, Inc. System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations
US7169548B2 (en) 2002-09-13 2007-01-30 Xy, Inc. Sperm cell processing and preservation systems
MXPA05010492A (es) 2003-03-28 2006-05-25 Monsanto Technology Llc Aparato y metodos para propocionar esperma animal clasificado por sexo.
CN104974983A (zh) 2004-03-29 2015-10-14 英格朗公司 用于授精的精子悬浮液
CN101165190B (zh) * 2006-10-17 2011-08-24 中国科学院上海生命科学研究院 固定化双酶法制备n-乙酰神经氨酸
US20120040407A1 (en) * 2009-02-05 2012-02-16 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Cellobiose 2-epimerase, its preparation and uses

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03180190A (ja) * 1989-11-15 1991-08-06 Forschungszentrum Juelich Gmbh Ｎ‐アセチルノイラミン酸の酵素的製造方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU696154B2 (en) * 1994-03-25 1998-09-03 Daiso Co., Ltd. Epimerase

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03180190A (ja) * 1989-11-15 1991-08-06 Forschungszentrum Juelich Gmbh Ｎ‐アセチルノイラミン酸の酵素的製造方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, Vol. 110, No. 4, (1991), H. INOUE et al.: "Genetic and Molecular properties of human and rat renin-binding proteins with reference to the function of the leucine zipper motif", p. 493-500. *
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 265, No. 12, (1990), H. INOUE et al.: "Molecular cloning and sequence analysis of a cDNA encoding a porcine Kidney renin-binding protein", p. 6556-61. *
See also references of EP0708177A4 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5994105A (en) * 1994-03-25 1999-11-30 Marukin Shoyu Co., Ltd. Epimerase
US7955825B2 (en) 2002-07-18 2011-06-07 Yamasa Corporation Process for producing CMP-N-acetylneuraminic acid
US8852891B2 (en) 2006-12-15 2014-10-07 Gene Chem, Inc. N-acetylglucosamine-2-epimerase and method for producing CMP-neuraminic acid using the same
WO2014193183A1 (ko) 2013-05-31 2014-12-04 주식회사 진켐 시알산 유도체의 제조방법
US9637768B2 (en) 2013-05-31 2017-05-02 Genechem Inc. Method for preparing sialic acid derivative

Also Published As

Publication number Publication date
JP3418764B2 (ja) 2003-06-23
US5795767A (en) 1998-08-18
US5994105A (en) 1999-11-30
AU696154B2 (en) 1998-09-03
EP0708177B1 (en) 2005-09-28
EP0708177A4 (en) 1997-09-17
DE69534484D1 (de) 2006-02-09
KR960702514A (ko) 1996-04-27
KR100402564B1 (ko) 2003-10-22
DE69534484T2 (de) 2006-07-06
AU2082795A (en) 1995-10-17
KR100294996B1 (ko) 2001-09-17
EP0708177A1 (en) 1996-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6291219B1 (en) α1-6 fucosyltransferase
KR101200571B1 (ko) 테라박터 속 유래의 신규한 진세노시드 글리코시다제 및 이의 용도
JPH11504217A (ja) 抗肥満タンパク質を製造する方法
CN108026518A (zh) 新型endos突变型酶
WO1995026399A1 (fr) Epimerase
JPH11506927A (ja) 少なくとも二つのサッカリド・ユニットをポリグリコシルトランスフェラーゼで転移する方法
CN107604023A (zh) 岩藻糖基转移酶及其应用
CN108103039B (zh) 一组岩藻糖基转移酶突变体及其筛选方法和应用
CN1191572A (zh) 具有噬菌体内切唾液酸酶活力的重组蛋白
CN111315887A (zh) 免疫球蛋白结合性蛋白质
KR20210126019A (ko) 엔지니어링된 아릴 설페이트-의존 효소
JPWO1995026399A1 (ja) エピメラーゼ
JP4702819B2 (ja) コンドロイチン合成酵素
JP2001224377A (ja) α１，４−ガラクトース転移酵素およびそれをコードするＤＮＡ
JPH10313867A (ja) グルクロン酸転移酵素をコードするｄｎａ
CN101497863B (zh) 一种制备N-末端乙酰化的胸腺素α1的方法及其专用工程菌
JP4338038B2 (ja) コンドロイチン合成酵素および該酵素をコードする核酸
EP1111059B1 (en) A novel human lysozyme gene, its encoding polypeptide and the method preparing for them
JP2000500972A (ja) 哺乳類の合成α―Ｎ―アセチルグルコサミニダーゼおよびそれをエンコードする遺伝子配列
EP1111054B1 (en) A new gene of human lysoenzyme, the encoding polypeptide and methods for preparing them
CN113755469B (zh) 肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶及其应用
JP2001178453A (ja) Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの製造方法
JP2002523099A (ja) 新規なヒトリゾチーム遺伝子、それによりコードされたポリペプチド、およびそれらの作製方法
JPH01156999A (ja) ヒト癌壊死因子
CN1366049A (zh) 中华蜜蜂蜂毒AcHA基因及其编码的多肽和制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU JP KR US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 08553703

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1019950705274

Country of ref document: KR

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1995913330

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1995913330

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: KR

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1995913330

Country of ref document: EP