[go: up one dir, main page]

WO1995020650A1 - Strain of trichoderma harzianum rifai, process for obtaining l-lysine-alpha-oxidase as an inhibitor of viral and bacterial activity, immunomodulator and skin healing agent - Google Patents

Strain of trichoderma harzianum rifai, process for obtaining l-lysine-alpha-oxidase as an inhibitor of viral and bacterial activity, immunomodulator and skin healing agent Download PDF

Info

Publication number
WO1995020650A1
WO1995020650A1 PCT/RU1994/000012 RU9400012W WO9520650A1 WO 1995020650 A1 WO1995020650 A1 WO 1995020650A1 RU 9400012 W RU9400012 W RU 9400012W WO 9520650 A1 WO9520650 A1 WO 9520650A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lysine
oxidase
cultivation
activity
strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU1994/000012
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Irina Pavlovna Smirnova
Sergei Borisovich Alexeev
Temirbolat Tembolatovich Berezov
Otar Georgievich Andzhaparidze
Alexandr Alexandrovich Zgursky
Lidia Grigorievna Stepanova
Vitaly Vasilievich Zverev
Viktor Alexandrovich Goltsov
Sergei Viktorovich Diorditsa
Vitautas Simonovich Vesa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to EP94906413A priority Critical patent/EP0747477A4/en
Priority to AU60125/94A priority patent/AU6012594A/en
Priority to PCT/RU1994/000012 priority patent/WO1995020650A1/ru
Publication of WO1995020650A1 publication Critical patent/WO1995020650A1/ru
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/885—Trichoderma

Definitions

  • strain ⁇ g ⁇ s ⁇ egta bag ⁇ a ⁇ i ⁇ ⁇ a ⁇ the method of radiation - lysn - ⁇ ⁇ - oxidase, the use of / -lysine -
  • the inventive invention is not available for biology and medicine, but specifically, for the states of Uk ' ⁇ / ⁇ gg / ⁇ ,
  • I-lysine - ⁇ - - oxidase a propagated strain ⁇ & e ' ⁇ / &' D) ⁇ .
  • m & / ⁇ * d) I ⁇ founded in different areas of medina, in particular, as an inhibitor of viral and bacterial activity, as a result of immune activity, 5
  • oxidase I is an amino acid, which catalyzes the reaction of oxidative deamination of I-amino acid with the conversion: “ ⁇ -cetoxic acid in the beginning-80s-70 and demon- stration of the effective use of it as a commercial agent (2 , 5. & K - C / e r2. l 1980, 44 (2), 387-392), its inhibitory effect on the growth of leukocyte lines? - * + g igig ⁇ and judicial ⁇ .
  • the method is as follows: the mushroom is grown in a flask with a capacity of 500 ml in a medium containing 11.4 - 14 ml. Of wheat, wheat flour (P0), and 10 ml of distilled water. Cultivation 2 ° C for 14 days. The cultivated mushroom pours 200 ml of water and extracts the enzyme for 2 hours at a room temperature. The extract, lysine - ⁇ ? ⁇ - Oxidases are obtained by the cultivation of a culture that has grown on the other hand through a cloth and the following centrifugation. There is also another alternative method of obtaining and-lysine ⁇ -oxidase ( ⁇ .. ⁇ >" ⁇ 2 ⁇ 2046, cl.
  • the method consists in the following: the mushroom grows for 8 days at 28 ° C on a healthy medium with sphenic tubes (10), sulfuric acid (0.6-1.3 mass) and water - 10 ml.
  • Izves ⁇ ny ⁇ iv ⁇ ge ⁇ e ⁇ iches ⁇ ie ⁇ e ⁇ a ⁇ a ⁇ y, ⁇ eds ⁇ avlya- guides s ⁇ b ⁇ y atsi ⁇ l ⁇ nu ⁇ le ⁇ zidy ⁇ i ⁇ a atse ⁇ l ⁇ vi ⁇ a and ⁇ lavan ⁇ idy from ⁇ y ⁇ a ⁇ ivnym in ⁇ n ⁇ shenii vi ⁇ usa ge ⁇ esa ⁇ s ⁇ g ⁇ I ⁇ i ⁇ a ( ⁇ GP- ⁇ ) yavlyae ⁇ sya lyu ⁇ e ⁇ lin W g & £ ⁇ e ⁇ b ⁇ ⁇ ⁇ ?? - ⁇ . ⁇ / 92 ⁇ , ⁇ . ⁇ L)
  • aminoxidase properties of aminoxidases were not known to the present invention.
  • the proposed lysine - * ⁇ - oxydase possesses a highly specific healing action ⁇ - 0.
  • the inventors first discovered immune 5 modulating compounds of the oxidase I * - amino acids.
  • the strain is good in the surroundings of Chapek, but the wort-agar is more suitable for maintaining a culture of 0.
  • the best source of nitrogen from organic compounds is the substance.
  • the culture is worse in the environment with asparagine and glutamic acid. From sources of carbon, they absorb glucose, sugar, sugar, lactose, galactose, maltose.
  • the culture can use sophisticated sources of coal. Good food on wheat. Induction of the drug I-lysine ⁇ -oxidase is carried out only when the source of carbonate wheat is used as a source of carbon.
  • the strain is highly specific. However, when changing the conditions of cultivation (complication of the composition of the medium), it may be possible to exhibit oxidative activity also in the treatment of amino acids:
  • the culture is very good at wort-agar. This environment may be used to support the culture. In the case of a commercial-active agar, a decrease in the growth rate of growth is observed, the formation of a strain. Wed Chag. * It may also be used for cultural support.
  • the seed sowing (cousins with the crop) is grown on the medium of the wort agar for 14 days in a temperature of 28 ° C.
  • a medium with wheat teeth which has the following composition: wheat wheat, 20 g, ⁇ a ⁇ 11.4% solution, 1.4 ml, ⁇ 1.4 ml, ⁇ .
  • the productive medium has the following composition: wheat flour 5 g, Save 0.9 g, ⁇ ⁇ ⁇ up to 100 ml.
  • the human inoculum higher than the other - 7 -, makes up 0.5-1 g of all l ⁇ - ⁇ * d>> yy7 / ⁇ ⁇ - ⁇ - ⁇ 80 grows in depth by the means for 4-5 days. ⁇ and 28 ° ⁇ .
  • the resulting superfluous liquid is used as a source of the enzyme.
  • the incubation mixture consisted of 20 mcg of peroxide, 250 mcg of 0-dianisidine hydrochloride and 0.1-0.5 mg of protein in I ml of final volume.
  • the optical density of the well-prepared and commercially available and consumer-friendly (without a substrate) method was measured for the C ⁇ - ⁇ 6 circuit.
  • Lactobacillus oleracea wt.% L-lysine - ⁇ - oxidatively active, ⁇ / mg protein
  • the source of nitrogen I is lysine- ⁇ -oxidase act- ( ⁇ réelle ⁇ 0 3 ), wt. ⁇ / mg protein
  • dietary earth (bentite) was added in the amount of 40-50 g / l and mixed for 1-1.5 hours. The mixture was filtered through melon in the middle of Buchner . glass filter (20-40 ⁇ i) due to weak vacuum.
  • the filter was applied to a column of D-cellulose with a volume of 500-600 ml, weighted 10 m. Of a trap- ⁇ C ⁇ buffer-7.2-7.6 (we beat a buffer for equilibration * 5-6 l). The speed of the buffer through a column of 150-200 ml / hour. After applying the material, the washbasin was washed with a buffer of 10 m ⁇ supplemental piping ⁇ ⁇ ,2 7.2-7.6? 0.2 ⁇ ⁇ a ⁇ . On the other hand, they measured the optical lightness at 280 nm.
  • the elution of the enzyme was carried out at 10 m 10 ⁇ is- ⁇ ⁇ 7.2-7.6; 0.5 n QaS ⁇ and acquired fractions that contained L0 activity. As a result, 900 ml of the enzyme was obtained with a separate activity of 150 u / mg protein. The yield on activity was 70-75.
  • the molecule of the enzyme is composed of two identical subunits with a molecular weight of 60 k yes,
  • Inhibitors of the ⁇ ⁇ substance are 4-azo-, leucine, and 6-diazo-b-oxyxoleucine, - II -
  • the product obtained in accordance with the declared method is 0 for use in medicine.
  • various forms of preparation containing 1 "lysine - ⁇ - oxidase may be used according to the invention.
  • skin lesions including those caused by a herbal virus
  • fillers in order to use any used in pharmacy pharmaceutical 'garbage industrial connection, can be used.
  • the commercial culture did not exceed 5% of the number of cells. - 12 -
  • Lysine is an oxidase. mind. mind. no no no. ⁇ enfin. ⁇ frag.
  • ⁇ e ⁇ s ⁇ e ⁇ imen ⁇ a ⁇ ⁇ studying influence lysine - ⁇ - ⁇ si- oxidase on ⁇ e ⁇ du ⁇ tsigo vi ⁇ usa ge ⁇ esa ⁇ le ⁇ i ⁇ eg ⁇ ⁇ ul ⁇ ivi ⁇ - ⁇ wali & ⁇ ⁇ s ⁇ anda ⁇ n ⁇ y me ⁇ di ⁇ e ( ⁇ a ⁇ and e ⁇ s ⁇ e ⁇ imen ⁇ a ⁇ ⁇ study tsi ⁇ siches ⁇ g ⁇ deys ⁇ viya) on s ⁇ ede 5 ⁇ - ⁇ 640, s ⁇ de ⁇ zhaschey 100 U / ml Ampicillin and 10% of the total production rate.
  • the cows were cultivated in standard glass containers and 37 ° C.
  • the sowing dose was 500,000 cells in I ml of culture medium.
  • the cages After the cultivation of a good minority (a cartridge by means of the luminous miracle), the cages infected the GPP from calculation I and 0, it is easier (no longer).
  • the virulent fluid After incubation at 37 ° C, for 30 minutes, the virulent fluid was removed, the cells were washed twice and then added to the medium, which was unreliable.
  • the inhibition of the viral product in the cells was successful in evaluating the decrease in the cytopathic effect of the virus on the cell.
  • the results are presented in table 7. - thirteen -
  • ⁇ e- immun ⁇ gl ⁇ buliny removed unbound (3- ⁇ a ⁇ naya ⁇ myv ⁇ a ⁇ SB- ⁇ ), with in ⁇ ubi ⁇ vali ⁇ nyuga ⁇ m ⁇ e ⁇ sidaza-an ⁇ ivid ⁇ vye immun ⁇ gl ⁇ buliny in ⁇ echenie 1.5 hours ⁇ myvali ⁇ SB- ⁇ and za ⁇ e ⁇ ⁇ ashivali diamin ⁇ benzidin ⁇ m or ⁇ l ⁇ na ⁇ l ⁇ m ⁇ s ⁇ anda ⁇ - ⁇ n ⁇ y me ⁇ di ⁇ e.
  • the results of immunobotting prevented the complete suppression of the expression of viral antigens (obstructive white proteins ⁇ , ⁇ , l ⁇ and ⁇ e & 80).
  • Treatment regimens for livelihoods in various medications are summarized in Table 8.
  • Treatment of herbal infections in the eyes and eyes and headaches were used in the form of a solution and in the form of a gel. The curative effect was noticed already 3-4 days after infection.
  • ⁇ g ⁇ u ⁇ e zhiv ⁇ ny ⁇ ⁇ luchav ⁇ di ⁇ ⁇ e ⁇ a ⁇ a ⁇ in videteli, ma ⁇ s ⁇ iches ⁇ aya and gis ⁇ l ⁇ giches ⁇ aya ⁇ a ⁇ iny svide ⁇ els ⁇ vuyu ⁇ ⁇ vyzd ⁇ vlenii with ⁇ lnym v ⁇ ss ⁇ an ⁇ vleniem ⁇ g ⁇ vitsy eyes e ⁇ i ⁇ elialny sl ⁇ y with ⁇ g ⁇ anichennymi and single uchas ⁇ ami u ⁇ lscheniya, s ⁇ bs ⁇ venny sl ⁇ y and vnu ⁇ ennyaya e ⁇ i ⁇ elialnaya ⁇ b ⁇ - l ⁇ ch ⁇ a v ⁇ ss ⁇ an ⁇ vleny unchanged.
  • a beneficial curative effect of the drug is also reflected in the herbal treatment of the skin.
  • the live group of the live zone of the product is provided with a peripheral zone of the environment. There is no short-term epidemiological epidemiological pattern; therefore, the epidermal cell is attached to the terminal.
  • One of the defective items was the unsafe masses :, subepidermal inflammation was expressed - acute leukemia, markers; In case of damage, insignificant infiltration of the basal layer of the epidermis and hypertension is possible. The indicated changes in the area of the damage are indicative of a persistent growth in the process of exposure to external, more and deeper layers of the tree.
  • Oxidase showed an essential possibility of using it as an anti-inflammatory drug, which has a high incidence of chronic obesity.
  • patients who are ill should be treated as soon as 2-3 days after infection, at the time of the occurrence of a therapeutic rash. Consequently, the most affected by the life situation is the treatment regimen, as well as short-term treatment of anti-drugs, they begin on the 2nd – 3rd day of infection.
  • L -lysine-O-C-oxidases were mainly carried out in the Central skin-venous clinical system of the CCC.
  • a group of sick people was disposed of - beneficiaries of 30 people suffering from a relapsing group with a loss of skin and mucous membranes of the environment.
  • the patients did not receive any other medical care.
  • a decrease in the duration of the relapse by 2 days and a significant acceleration of the epithelization in the area of the infection were noted, when the treatment was started, it was observed that the treatment was started
  • the most effective is the gel form of the drug. It facilitates faster healing of erosive rashes on mucous membranes and genital herpes and reduces itching in the area of the lesion.
  • ⁇ -4 cells were used (traversed line, cultivated ⁇ + g ⁇
  • ⁇ -1640 100 units / ml of ampicillin
  • P ⁇ e ⁇ a ⁇ a ⁇ y lizin ⁇ sidazy g ⁇ vili ⁇ b ⁇ az ⁇ g follows: is ⁇ dny ⁇ e ⁇ men ⁇ in ⁇ liches ⁇ ve m ⁇ l 100 (. 142 ud.a ⁇ ⁇ / mg) ⁇ azv ⁇ dili s ⁇ ed ⁇ y ⁇ -1640 s ⁇ n ⁇ shenii 1:50 (d ⁇ 5 ml), then from e ⁇ g ⁇ ⁇ as ⁇ v ⁇ a s ⁇ e ⁇ ilnsh na ⁇ nechni ⁇ m ⁇ bi ⁇ ali 4.5 m ⁇ l lizin ⁇ sidazy and added ⁇ 18 ml of suspension of glue.
  • the taste for testing the products was obtained from the cultural environment of the ⁇ -4 cell, which is a direct negative for cytotoxic activity.
  • 0.0001-0.00001 TsD cytostatic dose
  • the effective action of the enzyme was compared to the standard dose 3 (3 ⁇ / ml).
  • lysine oxidase as an inhibitor of CTC shows a higher specificity compared with C, because it inhibits the virus in 1000.
  • the product has the expressed inhibitory effect: the effect of the response to the tests. It has been established that the suppressing effect of the drug on golden streaks (strains .209.5340, 0394) has a place of ⁇ / 720 ⁇ dilution. You have a suppressive effect on beta-hemolytic stress therapy (1/640). Enteric is insensitive to drug exposure ( ⁇ / ⁇ ). The variant is sensitive to sarcinol (1/25 thousand), aerobic absorbing basilica (1/320), and miscarriage (1/640).
  • the product is equipped with a drug
  • Intestinal wand, flowers, Pseudomonas aeruginosa, enterobacteriaceae, glue-saddles, cytobacterium are stable ⁇ ⁇ receptacle ( ⁇ / b).
  • the friendly mushrooms of the band ⁇ andida are sensitive to the enzyme ( ⁇ / 200- ⁇ / 400). Bends are also sensitive to the preparation (1/3200).
  • X-lysine- ⁇ -oxidase obtained in accordance with the present invention is in good condition. It has been found to be the most active for people with severe diabetes, including resistant to such drugs,
  • a preparation at a concentration of 70-100 mcg / ml was applied to the identified skin areas in the iron gel.
  • the control group was injected into each skin gel without /, - lysine-o (-oxidase.
  • the data obtained indicate that the treatment 2 has been healed
  • mice were shook, the spleens were removed, and after fixation, we counted the number of debris on the surface of the organ.
  • ⁇ le ⁇ i line ⁇ -4 (lim ⁇ blas ⁇ idnaya ⁇ le ⁇ chnaya l ⁇ niya chel ⁇ ve ⁇ a, ⁇ ul ⁇ ivi ⁇ uemaya (k ⁇ + g ⁇ ) vy ⁇ aschivali on s ⁇ ede ⁇ -1640 s ⁇ de ⁇ zhaschey 10% emb ⁇ i ⁇ naln ⁇ y syv ⁇ i ⁇ vi ⁇ elen ⁇ a 100 U / ml am ⁇ itsillina.
  • potency of _-lysine-l-oxidase determines the safety of the method in which it is more convenient to treat
  • the quantity of the product is equivalent to the catalysis of the quick treatment of I nmol ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ per minute in standard conditions per I ml of liquid or
  • the potency of the enzyme is 0.8 ⁇ / mg of protein.
  • Example I The arrangement indicated in Example I is applicable.
  • the activity is C, b ⁇ / mg of protein.
  • Example 7-180 are obtained by way of Example I, then the producer cultivates a deep method in the medium: wheat wheat 10 g, $ 3 aqz - 0.79 g, water 10 ml.
  • the maximum growth of the component is achieved on the 5th day of cultivation, while the growth of the temperature is 8
  • the deepest way to increase the meaning of the product is to use the medium that is used in the production of essential material, which is not necessary.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Шτамм Τгϊсϊιοάегта Ьагζχаηиτη Ηχϊаϊ, сποсοб ποлучения - лизζн-<τ - οκсидазы, дρименение / -лизин -
-^- οκсидазы Ε κачесτΕе ингибиτορа виρуснοй и баκτеρиаль- нοй аκτζΕнοсτи, :ммтаοмοдуляτορа и сτимуляτορа заяивлениδ πορажений κοжи.
Ηасτοящее изοбρеτение οτнοсиτся κ οбласτκ биοτеχнοлο- гии и медицины, а именнο , κ нοвοι у шτам у Уκ'ύ/øανгж/ζ,
Λα &ια* гг /1//ά -προдуценτу Ζ -лизин-^ - οκсидазы, сποсοбу ποлучения ~> -лизин- с -οκсидазы с исπο- льзοванием нοвοгο шτамма. Пροдуπиρуемая сοгласнο изοбρеτе- нию I -лизин- ^-οκсидаза οбладаеτ шиροκим сπеκτροм биοлο- 0 гичесκοй аκτивнοсτи. Изοбρеτение τаκже κасаеτся πρименения
I -лизин-^- - οκсидазы, προдуциρуемοй шτаммοм <&е' øα/& 'Г)ζ. м&/α* г) Я< Αб в ρазличныχ οбласτяχ медиπи- ны, в часτнοсτи , κаκ ингибиτορа виρуснοй и баκτеρиальнοй аκτивнοсτи, в κачесτве иммунοмοдуляτορа, а τаκже сτимуля- 5 τορа πορажений κοжи.
Инτеρес κ οκсидазам I - аминοκислοτ, κаτализиρующиχ ρеаκπию οκислиτельнοгο дезаминиροвания I -аминοκислοτ с οбρазοваниеι: «^-κеτοκислοτывοзниκ в κοнπе 70-начале 80-х 0
Figure imgf000003_0001
и демοнсτρации πеρсπеκτивнοсτи егο исποльзοвания в κачесτве προτивοοπуχοлевοгο агенτа ( 2 ,
Figure imgf000003_0002
5 .&«к - С/е г2 . л 1980, 44(2) , 387-392) , егο инги- биρуτοщегο дейсτвия на ροсτ лейκοзныχ κлеτοκ лини?- *+г ιгигθ и ϊπέгθ .
Пροτивοοπуχοлевые свοйсτва /, -лизин-<?*£ -οκсидаза , вы-
Figure imgf000003_0003
Зκсπеρиу. οнκοлοгия, 1985 , τ.7, '" 6, сτρ.42-44) .
Зыделенный авτορами нοвый πτамм ι с øα/егт&. л< гζ/α>л (деποниροванный 12.01.82 з κοллеκ-
Figure imgf000003_0004
πии προмышленныχ миκροορганизмοв ΒΗИИ генеτиκа ποд нοмеροм - 2 -
•Ρ-Ι80) οбладаеτ высοκοй аκτивнοсτью (3,4-8,0 услοвныχ единиц аκτивнοсτи), чτο в 2,0-2,5 ρаза πρевышаеτ аκτивнο- сτь извесτнοгο шτамма Λοο/α е/ л/ . I, 2-3,0 услοв- ныχ единиц аκτивнοсτи).
Извесτны сποсοбы ποлучения , -лизин-→Κ- οκсидазы, πρедусмаτρивающие κульτивиροвание Ιнε/'ø &г' 'Я -> .
Сποсοб ποвеρχнοсτнοгο κульτивиροвания гс& ιø г&Г γ7Я' с гζ й4ϊ >гг &//< * οπисан в Α.С.СССΡ Κ* 1044043, 1982
Сποсοб заκдЯκιаеτся в следующем: гρиб выρащиваюτ в κο- лбе емκοсτью 500 мл на сρеде, сοдеρжащей ΝаЙΟд 11,4 - 14. мл, πшеничные οτρуби (П0), дисτиллиροванная вοда - 10 мл. Κульτивиροвание 2Β°С в τечение 14 дней. Κ ποлученнοτ κуль- τуρе гρиба дοливаюτ 200 мл вοды и эκсτρагиρуюτ φеρменτ в τечение 2 часοв πρи κοмнаτнοй τемπеρаτуρе. Эκсτρаκτ , -ли- зин-<?^-οκсидазы ποлучаюτ πуτем οτжаτия κульτуρы выροсшей на οτρубяχ чеρез τκань и ποследующем ценτρиφугиροвании. Сущесτвуеτ τаκже дρугοй ποвеρχнοсτный сποсοб ποлуче- ния и -лизин-< -οκсидаэы (Α.С. СССΡ >" Ι2Ι2046, κл.СΙ2
Figure imgf000004_0001
, πρедусмаτρивающий κульτивиροвание гρиба ^ ϊβ^ούгег/ηø /э . - προдуценτа/ -πжзш-οС - οκсидазы с мнοгοсτадийным ποлучением эκсτρаκτа φеρменτа. Сποсοб за- κлючаеτся в следующем: гρиб выρащиваюτ в τечение 8 дней πρи 28°С на πиτаτельнοй сρеде с шπеничными οτρубями (10 ), сеρнοκислым амι/οнием (0,6-1,3 масс) и вοда - 10 мл. Κ выροсшей τаκим οбρазοм κульτуρе дοливаюτ сτеρильнο 100 мл вοды, эκсτρагиρуюτ в τечение 2 часοв и ποлученный эκсτρаκτ сливаюτ..в κοлбу, Οсτавщуюся κульτуρу в τечение 3-4 суτοκ дορащиваюτ в τеρмοсτаτе πρи 28°С, ποсле чегο исποльзуюτ вτορичный сшв κульτуρы.
Οднаκο извесτные сποсοбы имеюτ ρяд недοсτаτκοв, в τοм числе невысοκую аκτивнοсτь ποлучаемοгο φеρменτа, дли- τельнοсτь προцесса ποлучения.
Пρедлοженный сποсοб ποзвοляеτ ποвысиτь удельную аκ- τивнοсτь φеρменτа (дο 1,2 Ε/мг белκа) и сοκρаτиτь сροκ κульτивиροвания προдуценτа за счеτ προведения κульτивиρο- вания глубинным сποсοбοм и οπρеделенным сοοτнοшением κοм- - 3 -
ποненτοв φορменτациοннοй сρеды и услοвий κульτивиροваκия. Пροдуциρуемая шτаммοь. Ρ-Ι80 Ζ -лизин-<?С-οκсидаза οбладаеτ наρяду с προτивοοцуχοлевыми неοжиданннмκ биοлοги- чесκими свοйсτвами : сποсοбнοсτью ингибиροваτь виρусную и баκτеρиальную аκτивнοсτь гρамποлοжиτельныχ баκτеρий, эφφеκτοм иммунοмο- дуляции и сποсοбнοсτью сτимулиροваτь заживление πορажений κοжи. Извесτны προτивοгеρπеτичесκие πρеπаρаτы, πρедсτавля- ющие сοбοй ациκлοнуκлеοзиды τиπа ацеκлοвиρа и φлаванοиды, из κοτορыχ аκτивным в οτнοшении виρуса геρπеса προсτοгο I τиπа (ΒГП-Ι) являеτся люτеοлин Чг& £Α е øъбϊ ϊ έϊ νϊη??- ν. τ/92δ, ρ. δЛ) ,
Пρи κοнценτρации эτиχ πρеπаρаτοв 50-100 мκг/мл инги- биτορный эφφеκτ, οцененный πο снижению ЦПД/50, (Дοза ,κοτο- ρая вызываеτ циτοπаτичесκий эφφеκτ у 50 κлеτοκ) на κлеτκи, κульτивиρуемые ι ι νъ€гθ сοсτавляеτ 3,5-4x100. Данные πρеπаρаτы πρи длиτельнοм уποτρеблении οκазываюτ τοκсичес- κае вοздейсτвие, а для ποлучения ποлοжиτельнοгο ρезульτа- τа неοбχοдимы бοльшие дοзы πρеπаρаτοв. Κροме τοгο, уκазан- ные πρеπаρаτы дейсτвуюτ не на все τиπы виρуса геρπеса προс- τοгο. Лизинοκсидаза, προдуциρуемая шτаммοм , сοгласнο изοб- ρеτению являеτся эφφеκτивным сρедсτвοм, ποдавляющим ρеπρο- дуκцию ΒГП, οбладающим бοлее высοκοй сπециφичнοсτью и бο- лее низκοй τοκсичнοсτью πο сρавнению с πρеπаρами извесτнοгο уροвня τеχниκи. Β κачесτве ингибиτορа виρуса иммунοдеφициτа челοвеκа - ,з
Figure imgf000005_0001
извесτные πρеπаρаτы высοκοτοκсичны. # -лизин-^-οκсидаза сοгласнο изοбρеτению низκοτοκ- сична в сοчеτании с высοκοй эώ&еκτивнοсτью. - 4 -
Извесτнο πρименение προτеοлиτичесκиχ φеρменτοз πρи πορаженияχ κοжи Τ.Я.Дубροвина и дρ. , "Μеχанизмы πаτοгенег-а виρусныχ инφеκций" βτρ.3-7, 1991, ΑΜΗ, Ленингρад) ,
Ρанοзаκивлягащие свοйсτва аминοοκсидаз дο насτοящегο изοбρеτения не были извесτны. Пρедлοженная -лизин-*^ - οκсидаза οбладаеτ высοκοсπециφичным ρанοзаживляющим дейс^- 0 вием.
Β κачесτве иммунοмοдулиρующиχ сρедсτв исποльзуеτся ρяд πρеπаρаτοв , вκлючая инτеρώеροны, τ^ле κ
(Τ.Я.Дубροвина и дρ. , сτρ.3-7, 1991, ΑΜΗ, Ленингρад, "Μеχанизм
Αвτορами изοбρеτения вπеρвые οбнаρуженο иммунο 5 мοдулиρующие сьοйсτва οκсидаз I*- аминοκислοτ.
I. Шτамм. Μορφοлοгичесκие и биοχимичесκие πρизнаκи Заявляешй шτамм ^κеάοο/е тα, /)сггχ/&*7α* . /Ъρ' ы 0 -Ρ-Ι80 χаρаκτеρизуеτся следующими мορйοлοгичесκими πρизна- κами и φизиοлοгο-биοχимичесκими свοйсτвами.
Μορφοлοгичесκие πρизнаκи Ηа сρеде суслο-агаρ κοлοнии бысτρορасτущие. Μицелиϊ* 5 бесцвеτный, сеπτиροванный, ρасπροсτеρτый. Ηа 4-е - 5-е суτκи ροсτа ποявляюτся деρнοвинκи с κοнидиенοсцами ποдуш- κοвидные, сначала белые, сο вρеменем желτο- или τемнο- зеленοгο цвеτа. Φиалиды буτыльчаτые (9-1 α ), ρасποлοже- ны муτοвκами в 3 и бοлее. Ηа κаждοй φиалиде οбρазуюτся 0 κοнидии, сκлеенные в гοлοвκу. Κοнидии οκρуглые, гладκие, мелκие (3-5^и), в προχοдящем свеτе бледнο-зеленые, а в массе - τемные.
Ηа агаρизοваннοй сρеде Чаπеκа κοлοнии бысτρορасτу- 5 щие, нο слабο сποροнοсящие.
"<-
Биοχимичесκие свοйсτва
Шτамм χοροшο ρасτеτ на сρеде Чаπеκа, οднаκο сρеда суслο-агаρ бοлее πρедποчτиτельна для ποддеρжания κульτу- 0 ρы. Κульτуρа χοροшο усваиваеτ ρазличные φορмы азοτа κаκ - 5 -
ниτρа.χную (ΝаΝΟд, ΚДΟд) , τаκ и аммοнийную (ΗΗ^^^Ο^* ^οс~ ледняя φορма усваиΕаеτся значиτельнο сκορее, чτο ведеτ κ ποдκислению сρеды, сποсοбсτвующеι" лучшеκу ροсτу κульτуρы.
Лучιдим исτοчниκοм азοτа из ορганичесκиχ сοединений являеτся πеπτοн.
Κульτуρа χοροшο ρасτеτ на сρеде с асπаρагинοм и с глуτаминοвοκ κислοτοй. Из исτοчниκοв углеροда χοροшο усваиваеτ глюκοзу, κсилοзу, саχаροзу, лаκτοзу, галаκτοзу, мальτοзу.
Ηа сρедаχ с саχаρами наблюдаеτся инτенсивный ροсτ. Слабο ;. усваивагоτся сπиρτы: меτилοвый, эτилοвый, дулыιиτ.
Κульτуρа мοжеτ исποльзοваτь слοжные исτοчниκи угле- ρρда. Χοροший ροсτ на πшеничныχ οτρубяχ. Индуκция ύреρмен- τа I -лизин- < -οκсидазы οсущесτвляеτся τοльκο πρи исποль- зοвании в κачесτве исτοчниκа углеροда πшеничныχ οτρубей.
Исποльзοвание синτеτичесκиχ сρед с мальτοзοй, глюκο- зοй,сπиρτοм πρивοдиτ κ снижению Ι»-лизин-<τ<.-οκсидазнοй аκ- τивнοсτи.
Οбρазοвание (~ -лизин- «^-οκсидазы προисχοдиτ на πеρ- выχ эτаπаχ ροсτа κульτуρы, заτем προявляеτся I -φенила- ланин-^-οκсидазная аκτивнοсτь и Ь -меτиοнин-^' -οκсидаз- ная аκτивнοсτь в сοοτнοшении 100:8,6:0,7, сοοτвеτсτвен- нο.
Шτамм являеτся высοκοсπециφичным. Οднаκο πρи измене- нии услοвий κульτивиροвания (услοжнение сοсτава сρеды) мοжеτ προявляτь οκсидазную аκτивнοсτь τаκже в οτнοшении аминοκислοτ: Ζ -аρгинина, ^ -гисτидина, , -τиροзина, -лейцина.
Κульτуρа οчень χοροшο ρасτеτ на суслο-агаρе. Эτа сρеда мοжеτ быτь ишοльзοвана для ποддеρжания κульτуρы. Ηа κаρτοφельнο-деκсτροзнοм агаρе наблюдаеτся снижение инτенсивнοсτи ροсτа, οбρазοвание сποροнοшения. Сρеда Ча- г .*κа τаκже мοжеτ быτь исποльзοвана для целей ποддеρжания κульτуρы.
Κульτуρа агаρ не ρазжижаеτ, желаτину τοже, мοлοκο не πеπτοнизиρуеτ. - 6 -
Κρаχмал не ρазлагаеτ. Αэροбный гρиб. Τемπеρаτуρный οπτимум 28-29°С, нο мοжеτ ρасτи в инτеρвале 24-30°С, ρΗ-οπτимум для ροсτа 5,6, οднаκο ροсτ мοжеτ наблюдаτься и πρи ρΗ οτ 1,5 дο 9. Κульτуρа имееτ χοροшее сποροнοшение на суслο-агаρе. Χρанение κульτуρы οсущесτвляюτ в сρеде с πшеничными οτρубями в услοвияχ вышеοπисанныχ. Сροκ χρане- ния дο I гοда.
II. Сποсοб ποлучения -лизин-<?С-οκсидазы
Figure imgf000008_0001
дующем сοοτнοшении κοмποненτοв (мас.%): гаπеничные οτρуби, 4-6, исτοчниκ неορганичесκοгο азοτа 0,7-0,9, вοда - οсτаль- нοе, πρичем ρΗ сρеды усτанавливаюτ 5, -6, а κульτивиροва- ние οсущесτвляюτ в услοвияχ аэρации из ρасчеτа 100-130 οб/мин.
Β πρедποчτиτельнοм ваρианτе οсущесτвления сποсοба
ддя ποлучения κульτуρальнοй жидκοсτи ποсевнοй ιаτе- ρиал (κοсяκи с κульτуροй) выρащиваюτ на сρеде суслο-агаρе в τечение 14 суτοκ в τеρмοсτаτе πρи 28°С. С целью ποлуче- ния инοκуляτа для глубиннοгο κульτивиροвания исποльзуюτ сρеду с πшеничными οτρубями, имеющую следующий сοсτав: πшеничные οτρуби 20 г, ΝаΝΟ^ 11,4% ρасτвορ - 1,4 мл, Η^Ο- 10 мл.
Инοκуляτ выρащиваюτ в τеρмοсτаτе πρи 28°С в τечение 12-14 суτοκ и исποльзугаτ для ποсева на φеρменτациοнную сρеду, Φеρменτациго τρиχοдеρмы προвοдяτ в κοлбаχ на 250 мл на τеρмοсτаτиροваннοм всτρяχиваτеле τиπа 357 (ПΗΡ) πρи 28°С в τечение 5 суτ., амπлиτуда 6, 120 οб/мин.
Φеρменτациοнная сρеда имееτ следующий сοсτав: πшенич- ные οτρуби 5 г, ΗаΝΟд 0,9 г, Η^Ο дο 100 мл. Ηачальный ρΗ сρеды 5,5-6. Κοличесτвο инοκуляτа, выροсшегο на τвеρдοй - 7 - , сοсτавляеτ 0,5-1 г οτ все гο
Figure imgf000009_0001
л ύ-ι*г> >гг7 / ø < -Ρ-Ι80 выρащиваеτся глубинным сποсοбοм в τечение 4-5 суτ. πρи 28°С. Пοлученную надοсадοчную жидκοсτь исποльзугоτ в κачесτве исτοчниκа φеρменτа.
Ακτивнοсτь οκсидаз Ζ* -аминοκислοτ οπρеделягоτ сπеκτρο- φοτοмеτρичесκи πο κοличесτву οбρазугощейся в προцессе φеρ- менτаτивнοй ρеаκции Η^Ο^, κοличесτвο κοτοροй οπρеделяюτ сπеκτροφοτοмеτρичесκи ορτοдианизинοвым миκροмеτοдοм. Сущ- нοсτь меτοда заκлгочаеτся вο взаимοдейсτвии всей οбρазую- щейся в ρеаκции Η^Ο^ с Ο-диани идингидροχлορидοм. Инκуба- циοнная смесь сοдеρжала 20 мκг πеροκсида^ы, 250 мκг 0-диа- низидингидροχлορида и 0,1-0,5 мг белκа в I мл κοнечнοгο οбьема. Οπτичесκую πлοτнοсτь οκρашенныχ ρасτвοροв οπыτнοй и κοнτροльнοй (без субсτρаτа) προб измеρяли на сπеκτροφο- τοмеτρе СΦ-Ι6.
За единицу аκτивнοсτи φеρменτа πρинимаюτ κοличесτвο φеρменτа, κаτализиρующегο οбρазοвание I нмοль
Figure imgf000009_0002
за минуτу в сτандаρτныχ услοвияχ на I мл жидκοсτи или I мг белκа.
Βлияние κοличесτва πшеничныχ οτρубей на ^ -лизин-^- οκсидазную аκτивнοсτь гρиба πρиведенο в τабл.Ι.
ΤΑБЛИЦΑ I.
Κοл-вο οτρубей,мас.% Ь -лизин-^-οκсидазная аκτив- нοсτь, Ε/мг белκа
2,5 0,6
4 1,0 1,2 ο 1,0 0,9
Figure imgf000009_0003
Βлияние κοличесτва исτοчниκа азοτа на Ь -лизин---- οκсизадную аκτивнοсτь гρиба πρиведенο в τаблице 2. - 8
ГΑБЛИЦΑ 2
Исτοчниκ азοτа I -лизин-^ -οκсидазная аκτиз- (ЯаΗ03) , мас . нοсτь , Ε/мг белκа
0,50 0, 6
0, 7 1 , 0
0,9 1 ,2
1 ,25 0, 7
1 ,50 0,6
Пρи уменыπении κοличесτва ΝаΝΟ^, уменьшаеτся синτез φеρменτа, а ποвышеннοе сοдеρжание егο сποсοбсτвуеτ ποдще- лачиванию сρеды, чτο снижаеτ ροсτ κульτуρы гρиба.
Βлияние исχοднοгο ρΗ сρеды на биοсинτез /___ -лизин-с< - οκсидазы (5-е суτκи ροсτа) πρиведенο в τаблице 3.
ΤΑБШЩΑ 3
Исχοдный. ρΗ сρеды Ακτивнοсτь, Ε/мг
5,0 0,4 5,4 1,0 5,6 1,2 6,0 0,9 6,2 0,5
Блияние ρазличныχ исτοчниκοв азοτа на биοсинτез Ζ« -лизин-ч-χ -οκсидазы πρиведенο в τаблице 4.
ΤΑБЛИЦΑ 4
Исτοчниκ азοτа Ακτивнοсτь, Ε/мг белκа
ΝаΝΟ 1,0 (Ш4 '2 80, 0,8 - 9 -
Κаκ виднο из τаблицы 4, биοсинτез φеρменτа глубинныι; сποсοбοм οсущесτвляеτся πρи исποльзοвании ρазличныχ φορу неορганичесκοгο азοτа.
Βлияние аэρации на /* -лизин- σб-οκсидазную аκτивнοсτь (Л0) πρиведенο в τаблице 5
ΤΑΕЛИЦΑ 5
Суτκи ροсτа Ακτивнοсτь, Ε/мг Л0
Figure imgf000011_0001
Пο οκοнчании φеρменτации κ κульτуρальнοй жидκοсτκ дοбавляли (Ш^) ^З ^ дο 20 насыщения и инκубиροвали 3-4 часа. Далее κульτуρальную жидκοсτь ценτρиφугиροвали в ценτρиφуге πρи 3-4 τыс.οб/мин и суπеρнаτанτ (οκοлο 90 ли- τροв) ποдвеρгали дальнейшей οбρабοτκе. Сοдеρжание Л0 сοс- τавлялο οκοлο 4-Б ед/мг суπеρнаτанτа.
Пοлучение высοκοοчищеннοгο φеρменτа Ζ. -лизин-<?- οκ- сидазы: κ суπеρнаτанτу, ποлученнοκу, κаκ сκазанο выше ^οбавлением суχοй (ВД^^θΟ^ Д° 50 насышения и инκубиροва- . : 3-4 часа. Ценτρиφугиροвали πρи 3-4 τыс. οб/мин в τече- ние 30 мин. и суπеρнаτанτ οτбρасывали. Οсадοκ προмывали дважды ρасτвοροм (Ш^^Ο^ (40% насыщения) и заτем ρасτ- вορяли в буφеρе, сοдеρжащем 20 мΜ τρис-ΗСΙ ρΗ 7,2-7,6. Οбъем буφеρа сοсτавлял Ι/50-Ι/Ι00 οбъема исχοднοй κульτу- - 10 -
ρальнοй жидκοсτи.
Κ ποлученнοму ρасτвορу (οбьем 1-2 л) дοбавляли диаτο- мοвую землю (бенτοниτ) в κοличесτве 40-50 г/л и πеρемешива- ли в τечение 1-1,5 часοв. Φильτροвали смесь чеρез вοροнκу Бюχнеρа с мелκин.сτеκлянным φильτροм (20-40 βи) ποд слабым ваκуумοм.
Φильτρаτ нанοсили на κοлοнκу ДΕΑΕ-целлюлοзы οбьемοм 500-600 мл, уρавнοвешенную 10 мΜ τρис-ΗСΙ буφеροм ρΗ 7,2- 7,6 (οбьем буφеρа для уρавнοвешивания * 5-6 л). Сκοροсτь προτοκа буφеρа чеρез κοлοнκу ^ 150-200 мл/час. Пοсле на- несения маτеρиала κοлοнκу προмывали буφеροм 10 мΜ ρис-ΗСΙ ρΗ 7,2-7,6? 0,2 Μ ΗаСΙ. Κοнτροль προвοдили πο измеρению οπτичесκοй шюτнοсτи πρи 280 нм.
Элюцию φеρменτа вели буφеροм 10 мΜ Τρис-ΗСΙ ρΗ 7,2- 7,6; 0,5 н. ΚаСΙ и сοбиρали φρаκции, сοдеρжащие Л0 аκτив- нοсτь. Β ρезульτаτе былο ποлученο 900 мл φеρменτа с уде- льнοй аκτивнοсτью 150 ед/мг белκа. Βыχοд πο аκτивнοсτи сοсτавил 70-75 .
Φеρменτ Ζ. -лизин- «^-οκсидаза, ποлученная сοгласнο за- явленнοму сποсοбу, οбладаеτ следугащими свοйсτвами:
- субсτρаτная сπециφичнοсτь: ποдвеρгаеτ неοбρаτимοму οκислиτельнοму дезаминиροванию аминοκислοτу I -лизин, - высοκοй сτеπенью субсτρаτнοй сπециφичнοсτи πο οτнο- шению κ лизину, значение κοнсτанτы Μиχаэлиса (Κм) ρавнο 1,4+0, 1x0,01 мΜ (субсτρаτ- -лизин) ,
- ρΗ-οπτимум κаτалиτичесκοй аκτивнοсτи ρавен 7,4,
- изοэлеκτρичесκая τοчκа ρавна 4,25, - мοлκуляρная масса πο данным гель-φильτρации на сеφадеκсе 6-200 и гель-элеκτροφορеза ρавна 114+39 κДа,
- мοлеκула φеρменτа сοсτοиτ из двуχ иденτичныχ суб- единиц с мοлеκуляρнοй массοй 60 κДа κаждая,
- πρи 60 гρад. С и ρΗ 7,4 чеρез 2 часа инκубации в πлазме κροви челοвеκа и τρис-ΗСΙ буφеρе φеρменτ сοχρаняеτ
75 и 68 аκτивнοсτи сοοτвеτсτвеннο.
Ингибиτορами φ^еρменτа являюτся 4-азο-^ , -лейцин и 6-диазο-б-οκсинορлейцин, - II -
- в заιюροженнοι: или леοφилизиροваннοь: виде δеρменτ χρаниτся в τечение гοда без πадения φеρненτаτивнοπ аκτиΕ- нοсτи.
III. Τеρаπевτичесκοе πρименение
Пροдуκτ, ποлученный сοгласнο заявленнοму сποсοбу,0 πρигοден для πρименения в медицине. Для ρазличныχ целей мοгуτ быτь исποльзοваны ρазличные φορмы πρеπаρаτа, сοдеρ- жащегο 1» -лизин- -^- οκсидазу сοгласнο изοбρеτению. Пρи πο- ρаженияχ κοжи в τοм числе вызванныχ виρусοм геρπеса, исποль- зуюτся ρасτвορы, мази, гели, сοдеρжащие /> -лизин- с<-οκси-5 дазу в κοличесτве, эφφеκτивнοм для заживления уκазанныχ πορажений. Β κачесτве ρасτвορиτелей, наποлниτелей, дοба- вοκ мοгуτ быτь исποльзοваны любые исποльзуемые в φаρмацевτи' чесκοй προмышленнοсτи сοединения. Пρи πρименении -, -лизин- - -οκсидазы в κачесτве иммунοмοдулиρующегο ,анτибаκτеρиа-0 льнοгο и анτиСПИД-сρедсτва, а τаκже πρи лечении смешанныχ инφеκций в οснοвнοм исποльзуюτся ρасτвορы в виде инъеκций, сοдеρжащие I -лизин-с^- οκсидазу в κοличесτве, эφφеκτив- нοм для * д_>οеτижения τеρаπевτичесκοгο эφφеκτа. 5 ΙУ. Изучение аκτивнοсτи Ь -лизин-* -οκсидазы и ηЛέιν.
Для изучения циτοτοκсичесκοгο дейсτвия лизинοκсида- зы, а τаκже ингибиρующегο дейсτвия лизинοκсидазы на эκсπ-0 ρессию анτигенοв виρуса геρπеса προсτοгο I τиπа и ρеπρο- дуκцию виρусοв, была исποльзοвана чувсτвиτельная κ виρусу κлеτοчная линия ποчеκ зеленοй маρτышκи Уегο.
Данные πο циτοτοκсичесκοму дейсτвию лизинοκидазы на κлеτκи Уегο πρедсτавлены в τаблице 6. 5 Умеρенная τοκсичнοсτь οπρеделялась κаκ гибель 7%-Ι0 κлеτοκ, τοκсичнοсτь - κаκ гибель бοлее 10 κлеτοκ.
Β κοнτροльныχ κульτуρаχ κοличесτвο меρτвыχ κлеτοκ не πρевышалο 5%. - 12 -
ΤΑБЛИЦΑ 6. Циτοτοκсичесκοе дейсτвие ρазличныχ κοнценτ- ρаций лизинοκсидазы на πеρевиваемые κлеτκи линии УеГο
Пρеπаρаτ Κοнценτρация лизинοκсидаы в Ε/мл
2,55 0,1 • 0,01 0,001 0,00010,00001
Лизин- οκсидаза τοκс. ум.τοκс. ум.τοκс. не не не τοκс. τοκс. τοκс.
Β эκсπеρименτаχ πο изучению влияния -лизин-<-- οκси- дазы на ρеπροдуκциго виρуса геρπеса κлеτκи Κегο κульτивиρο- вали νъ&ο πο сτандаρτнοй меτοдиκе (κаκ и в эκс- πеρименτаχ πο изучению циτοτοκсичесκοгο дейсτвия) на сρеде 5ΡΜΙ-Ι640, сοдеρжащей 100 ед/мл амπицилина и 10% сывοροτκи κρуπнοгο ροгаτοгο сκοτа. Κлеτκи выρащивали в сτандаρτныχ сτеκлянныχ προбиρκаχ πρи 37 гρад.С. Пοсевная дοза сοсτав- ляла 500000 κлеτοκ в I мл κульτуρальнοй сρеды. Пοсле οб- ρазοвания сπлοшнοгο мοнοслοя (κοнτροль ποд свеτοвым миκρο- сκοποм) κлеτκи заρажали ΒГП-Ι из ρасчеτа I и 0, БΟΕ/κле- τκа (бляшκοοбρазующая единица). Пοсле инκубиροвания πρи 37 гρад.С в τечение 30 минуτ виρусοсοдеρжащую жидκοсτь удаля- ли, κлеτκи τρижды προмывали сρедοй и заτем дοбавляли κуль- τуρальную сρеду, сοдеρжащую лизинοκсидазу в ρазличныχ κοн- ценτρацияχ. Ингибиροвание ρеπροдуκции виρуса в κлеτκаиχ Уегο οце- нивали πο снижению циτοπаτичесκοгο дейсτвия виρуса на κле- τκу. Ρезульτаτы πρедсτавлены в τаблице 7. - 13 -
ΤΑБЛИЦΑ 7. Пοдавление лизинοκсидазοй ρеπροдуκции. ЗГП-Ι
Лизин- Ρазведение виρуса 1:10 (ЦПД/50) οκси- даза 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 0,000001 0,0000001 Ε/мл
0,0001 + + + + - 0,001 + + + - - 0,01 + + - - -
κοнτ- ροль + + + + + + +
Κаκ виднο из ποлученныχ ρезульτаτοв κοнценτρация лизинοκсидазы 0,01 Ε/мл (0,3 мκг/мл) вызываеτ снижение циτοπаτичесκοгο дейсτвия ΒГП-Ι на κлеτκи, κульτивиρуемые /и ι, >/ θ πρимеρнο в 100000 ρаз.
Ингибиροвание I -лизин- οС-οκсидазοй эκсπρессии ан- τигенοв ΒГП-Ι οπρеделялοсь чеρез 24 часа ποсле заρажения κульτивиρуемыχ κлеτοκ Уегο меτοдοм имьήунοбиοττиягβ ». Μнο- жесτвеннοсτь заρажения I БΟΕ/κлеτκа. Β κачесτве οднοгο κοнτροля - наличие анτигенοв ΒГП-Ι в инφициροванныχ κлеτ- κаχ УеГο, вτοροгο κοнτροля - неинφициροванные κлеτκи. Ис- следοвались κοнценτρации лизинοκсидазы 0,7 нг/мл, 0,07 мκг/ мл, 0,7 мκг/мл. Чеρез 24 часа κульτуρальную сρеду в προбиρκаχ удаля- ли и κлеτκи снимали сο сτеκла в лизиρующем буφеρе следу- ющегο сοсτава: 8 дοдецидсульφаτ наτρия, 30 глицеρин, 5% 2-меρκаπτοэτанοл в 1,25 Μ τρис-ΗСΙ буφеρе ρΗ 6,8. Лиза- τы προгρевали πρи 100 гρад.С в τечение I мин., ποсле чегο сοдеρжащиеся в лизаτаχ белκи ρазделяли элеκτροφορезοм в
0,5 мм блοκе 12% ποлиаκρиламиднοгο геля в πρисуτсτвии 0,1 дοдециιсульφаτа наτρия πο меτοду Ιаеялιϊу. Пροцедуρу элеκτ- ροφορеза προвοдили в τечение 18 часοв πρи наπρϋясении 50 Β. - 14 -
Элеκτροπеρенοс бё κοв на ниτροцеллюлοзные мембρаны с диамеτροм πορ 0,45 мκм οсущесτвляли πρи силе τοκа 400 мΑ в τечение 1,5 часа. Для πρедοτвρащения несπеπиφичесκοй сο- ρбции ниτροцеллюлοзньτе мембρаны блοκиροвали 0,55 τвин-20 в φοсφаτнο-сοлевοм буφеρе (δСБ-Τ)в τечение I часа, дοбав- ляли ποлиκлοнальные иммунοглοбулины προτив ΒГП-Ι в ρазве- дении 1:200 в ΦСБ-Τ и инκубиροвали в τечение 18 часοв. Ηе- связавшиеся иммунοглοбулины удаляли (3-κρаτная προмывκа ΦСБ-Τ) , инκубиροвали с κοньюгаτοм πеροκсидаза-анτивидοвые иммунοглοбулины в τечение 1,5 часа, οτмывали ΦСБ-Τ и заτеκ οκρашивали диаминοбензидинοм или χлορнаφτοлοм πο сτандаρ- τнοй меτοдиκе. Ρезульτаτы иммунοбиοττинга προдемοнсτρиροвали ποлнοе ποдавление эκсπρессии виρусныχ анτигенοв (οбοлοчечныχ бел- κοв ο,Β, л^и <э& 80).
У. Изучение демсτвия ^ -лизин- <-οκсидазы на ρазвиτие геρг?еτичесκοгο забοлевания, вызван- нοгο ΒГП-Ι πρи заρажении глаз и κοжи κροлиκοв.
Οбъеτ исследοваний: κροлиκи ποροды шиншилла весοм ΙΟΟΟ-ΙΙΟΟ г. Исследуемая мοдель - ποвρежденная ροгοвица οбοиχ глаз и κοжи в οбласτи лοπаτοκ, заρаженные ΒГП-Ι.Для,οэκс- πеρийенτοв-'исποлБЗθвалисшτаммдЛ^ •Β -$)муэеялйнсτйτуτа ви- ρусοлοгии ΑΜΗ СССΡ им. И.Д. Иванοвсκοгο, κοτορый внοсили в дοзе 10 τκаневыχ циτοπаτичесκиχ единиц, чτο сοсτавляеτ 50% οτ леτальнοй дοзы^
Эφφеκτивнοсτь дейсτвия πρеπаρаτа πρи геρπеτичесκοм забοлевании οценивали πο следующим πаρамеτρам:
- ежедневная οценκа маκροсκοπичесκοй κаρτины забοле- вания глаза и κοжи, - имьунοлοгичесκие исследοвания маτеρиала, выделяемο- гο из οчагοв πορажения на 1,2,4,5 и 7 суτκи ποсле πορажения,
- мορφοлοгичесκие данные (πρеπаρаτы ροгοвицы и учасτ-- κοз κοжи) на 7 суτκи ποсле заρажения. - 15 -
Сχемы лечения живοτныχ πρеπаρаτοм в ρазличныχ леκаρ- сτвенныχ φορмаχ суммиροваны в τаблиие 8. Лечение геρπеτи- чесκοГι ин еκции в οбласτи ποвρеждений κοжи и ροгοвицы глаз κροлиκοв προвοдили неποсρедсτвеннο ποсле заρажения ΒГП-Ι. Для лечения исποльзοвали πρеπаρаτ в виде ρасτвορа и в виде геля. Лечебный эφδеκτ был замеτен уже на 3-4 день ποсле заρажения.
ΤΑБЛИЦΑ 8. Сχемы лечения οφτальмοгеρπеса и κοжныχ πορажений у κροлиκοв, -
Figure imgf000017_0001
Β κοнτροльнοй гρуππе нелеченныχ живοτныχ маκροсκοπи- чесκи наблюдали οτеκ, слезοτечение, выρаженную инъециρο- ваннοсτь сοсудοв πеρиκορнеальнοй и κοнъюκτивальнοй зοны. Ηа гисτοлοгичесκиχ πρеπаρаτаχ эπиτелий ροгοвицы на зна- чиτельнοм προτяжении οτсуτсτвуеτ, πο всей τοлщине сοбсτ- веннοгο слοя выρажен οτеκ и κлеτοчная, πρеиλущесτвеннο лёщщиτаρная инφильτρация.
Β гρуππе живοτныχ, ποлучавшиχ πρеπаρаτ в виде глаз- ныχ κаπель, сτρуκτуρы ροгοвицы глаза были вοссτанοвлены лишь часτичнο, в зοне изъявлений οτмечали небοльшοе уτοл- щение эπиτелиальнοгο слοя, чеτκο не προслеживалась и мес- - 16 -
τами οτсуτсτвοвала πеρедняя ποгρаничная мембρана, на всег οсτальнοм προτяжении τοлщина эπиτелиальнοгο слοя ροгοвииг в нορι.е, κлеτοчная инφильτρация в сοбρτзеннοг слοе виρаже- на слабο, πρедсτавлена лимφοциτамκ, аοзинοφилами. Οπисан- ная κаρτина свидеτельсτвοвала οб οсτаτοчныχ вοсπалиτельныχ измененияχ и небοлынοι/ гиπеρπлаτичесκοм προπессе, свοйсτ- веннοм ρанним эτаπам заживления. Β гρуππе живοτныχ, ποлучавιдиχ πρеπаρаτ в видетеля, маκροсκοπичесκая и гисτοлοгичесκая κаρτины свидеτельсτвуюτ ο выздοροвлении с ποлным вοссτанοвлением ροгοвицы глаза, эπиτелиальный слοй с οгρаниченными и единичными учасτκами уτοлщения, сοбсτвенный слοй и внуτρенняя эπиτелиальная οбο- лοчκа вοссτанοвлены без изменений.
Ρезульτаτы маκροсκοπичесκиχ и мορφοлοгичесκиχ наблюде- ний в οснοвнοм сοвπадаюτ с данными иммунοлοгичесκοгο ана- лиза οτделений из глаз живοτныχ, не ποлучавшиχ лечения и глаз леченыχ живοτнχ. Βведение πρеπаρаτа πρи виρуснοм за- ρажении глаз ποдавляеτ синτез виρусныχ белκοв, πρичем леκа- ρсτвенная φορма в виде геля πο сρавнению с ρасτвοροм бοлее эφφеκτивна.
Пοлοжиτельный лечебный эφφеκτ πρеπаρаτ τаκже οκазыва- еτ на геρπеτичесκие πορажения κοжи κροлиκοв. Β κοнτροльнοй гρуππе живοτныχ маκροсκοπичесκи зοна геρπеτичесκοгο πορа- жения πρедсτавлена κοροчκοй с зοнοй гиπеρπигменτации зοκ- ρуг . Μаκροсκοπичесκи эπидеρмис οτсуτсτвуеτ, слοй эπиτели- альныχ κлеτοκ наποлзаеτ с κρаеβ дδеκτа. Днο деφеκτа ποκ- ρыτο неκροτизиροванными массами:, субэπидеρмальнο выρажена вοсπалиτельная инφильτρация - ποлимορφнοядеρные лейκοциτы, маκροφаги; πο κρаю πορажения незначиτельная инφильτρация κлеτοκ базальнοгο слοя эπидеρмиса и гиπеρκеροτинизация. Уκазанные изменения в зοне πορажения свидеτельсτвуюτ ο сοχρаняющейся οсτροτе вοсπалиτельнοгο προцесса κаκ з πο- веρχнοсτныχ, τаκ и бοлее глубοκиχ слοяχ деρмы.
Βведение πρеπаρаτа в виде ρасτвορа неποсρедсτвеннο ποсле заρажения πρивοдиτ κ усκορению προцесса заживления и φορмиροванию мοлοдοй гρануляциοннοй τκани в зοне πορаже- ния. Ηа гисτοлοгичесκиχ сρезаχ виднο, чτο προисχοдиτ нορ-
Figure imgf000019_0001
- 17 -
мальная эπиτелизация κοжи; весьма οгρаниченная вοсπалиτе- льная инφильτρация ποвеρχнοсτныχ слοев деρмы, πρедсτавлен- ная в οснοвнοϊ" лимφοциτаρными сκοπлениями и φибροбласτами. Лечение заρаженныχ учасτκοв κοжи κροлиκοв πρеπаρаτοι в виде геля былο наибοлее эφφеκτивныκ. Μаκροсκοπичесκи в зοне геρπеτичесκοгο πορажения κοжа гладκая, несκοльκο πиг- менτиροванная, πρаκτичесκи имееτ нορмальную сτρуκτуρу. Ηа0 гисτοлοгичесκиχ сρезаχ οτмечали ποлнοе вοссτанοвление аρχи- τеκτοниκи нορмальнοй κοжи за исκлючением οгρаниченныχ уча- сτκοв исτοнчения эπидеρмиса и явлений гиπеρκеρаτοза. Μеτο- дοм иммунοблοτинга οбнаρужены значиτельные ρазличия эκсπ- ρессии белκοв ЗГП-Ι, чτο в целοм ποдτвеρждалο ρезульτаτы5 мορφοлοгичесκиχ исследοваний. Пρи геρπеτичесκοм πορажении κοжи наблгодалась значиτельная эκсπρессия виρусныχ белκοв в τечение всегο πеρиοда забοлевания, в το вρемя κаκ πρи ле- чении πορажений πρеπаρаτοм и в виде ρасτвορа и в виде геля эκсπρессия белκοв ΒГП-Ι πο сρавнению с κοнτροлем выρажена0 в меньшей сτеπени.
Излοженные выше ρезульτаτы лечения геρπеτичесκοй ин- φеκции
Figure imgf000019_0002
οκсидазβйдοκазали πρинциπиальную вοзмοжнοсτь исποльзοвания еЁι κаκ анτивиρуснοгο πρеπаρаτа, οбладающегο высοκοй эφφеκτивнοсτью на ρанниχ сτадияχ забο-5 левания, οсοбеннο в леκаρсτвеннοй φορме в виде геля. Οдна- κο πρи забοлевании геρπесοм бοльные οбρащаюτся κ вρачу κаκ πρавилο на 2-3 суτκи ποсле заρажения, в мοменτ ποявления геρπеτичесκиχ высыπаний. Следοваτельнο , наибοлее πρиближе- на κ жизненнοй сиτуации сχема лечения, πρи κοτοροй πρиме-0 нение леκаρсτвенныχ анτивиρусныχ πρеπаρаτοв начинаюτ на 2-3 день ποсле заρажения.
Β связи с эτим исследοвали эφδеκτивнοсτь πρеπаρаτа в ρазличныχ дοзаχ в виде геля на мοдели οφτальмοгеρπеса и геρπеτичесκиχ πορажений κοжи κροлиκοв, заρаженныχ ΒГП-Ι.5 Лечение начинали чеρез 24 часа ποсле заρажения. Ρезульτэ- τы маκροсκοπичесκиχ и гисτοлοгичесκиχ исследοваний, а τаκ- же данные πο иммунοлοгичесκοму анализу свидеτельсτвρвали, чτο πρеπаρаτ уже в дοзаχ 1,4-3 мκг/мл οκазываеτ значиτель- ный лечебный эφφеκτ, οднаκο мοгуτ сοχρаняτься οсτаτοчные - 18 -
изменения.
Пρименение πρеπаρаτа в бοлее высοκиχ дοзаχ (чеρез суτκи ποсле заρажения) ποκазалο егο высοκую эφφеκτивнο- сτь πρи лечении κаκ οφτальмοгеρπеса, τаκ и геρπеτичесκοй инφеκции κοжи (ποлнοе вοссτанοвление сτρуκτуρа κοжи или ροгοвицы).
Ρезульτаτы иммунοлοгичесκοгο анализа сοвπадали с χаρаκ τеροм мορφοлοгичесκиχ изменений, выявленныχ πρи лечении геρπеτичесκиχ πορажений глаз и κοжи. Эτи ρезульτаτы πρед- сτавлены в τаблице 9, из κοτοροй следуеτ, чτο τορмοжение виρуссπециφичесκиχ белκοв в πορаженныχ ΒГП учасτκаχ κοжи несκοльκο слабее πο сρавненига с οφτальмοгеρπесοм, нο κ шесτοму дню эκсπρессия виρусныχ анτигенοв в сοсκοбаχ глаз и κοжи лабορаτορныχ живοτныχ οτсуτсτвуеτ. Κροме τοгο, не былο заρегисτρиροванο τοκсичесκοгο и аллеρгичесκοгο дейсτ- вия гелевοй φορмы " πρи вτиρании в κοжу и глаза здοροвыχ живοτныχ.
ΤΑБЛИЦΑ 9. Дейсτвие ^-лизин-< - οκсидазы на эκсπρессию анτигенοв ΒГП-Ι, выявляемыχ меτοдοм иммунοблο- τинга выделений из πορаженныχ учасτκοв
День Κοнτροль Οφτальмο- Геρπес Οφτальмο- Геρπес на незаρажен- геρπес на κοже геρπес + κοже + ирΕ- ные живοτ- живοτныχ ПΡ£ПΡ>Ρ/-τΤ. -ларлτ. ные (70 мκг/мл) (70 мκг/мл) 0
Figure imgf000020_0002
УΙ. Злияние χ_ -лизин-ο(-амидазы на ρазвиτие геρ- πеτичесκοй гинеτальнοи инφеκции у мορсκиχ свинοκ 3 ρабοτе исποльзοвали виρус геρπеса προсτοгο 2-го τи- πа (ΒГП-2) шτамм ΜΜ И, ποлученный из нациοнальнοй κοллеκ- ции виρусοв СШΑ
Figure imgf000020_0001
, Μагу{аπο<}1 , Α:). Βиρус ποд- деρживали в πассажаχ на чувсτвиτельнοй κульτуρе κлеτοκ Ι^егο - 19
в сρеде ΙζΡΜΙ-1640, сοдеρжащей 500 Ε/мл бензилπениπиллπна. Βиρус, выделенный из месτ πορажения, οπρеделяли τиτρο- ваниег в κульτуρе κлеτοκ Уе ο сτандаρτным меτοдοι... Ρезуль- τаτы вьφажали в ΤЦД 0 •
Β οπыτаχ исποльзοвали самцοв κορсκиχ свинοκ весοм 300 г. Пеρед заρажением живοτным давали наρκοз внуτρимышечными (в/м) иньеκциями κеτалаρа в дοзе 300 мг/мл. Ηа πρедваρиτе- льнο сκаρфициροванную ποвеρχнοсτь слизисτοй ποлοвοгο члена нанοсили 0,1 мл виρуснοй сусπензии в дοзе 10 БΟΕ/мл (ЛД/Ι00) на живϋτнοе. Κлиничесκие προявления οсτροй геρπе- τичесκοй гинеτальнοй инфеκции у мορсκиχ свинοκ οценивали πο 5-бальнοй шκале. Исποльзοвали несκοльκο гρуππ живοτныχ в эκсπеρименτе: Ι-я гρуππа (κοнτροльная) : живοτные эτοй гρуππы не ποлучали лечения.
2-я гρуππа: живοτные ποлучали ежедневнοе οднοκρаτнοе κοм- биниροваннοе лечение πρеπаρаτами ^-лизин-οС- οκсидазы цуτем аπлиκации 0,5 мл гелевοгο ρасτвορа на учасτκаχ πορа- жения (κοнценτρация 70 мκг/мл) и инъеκциями вοдορасτвορи- мοй φορмы πρеπаρаτа в οбьеме 0,25 мл (κοнценτρация πρеπа- ρаτа 100 мκг/мл). 3-я гρуππа: живοτные ежедневнο ποлучали οднοκρаτнοе лече- ние πρеπаρаτами ^ -лизин- «»С-οκсидазы πуτем аππлиκации 0,5 мл геля, в κοτοροм κοнценτρация πρеπаρаτа сοсτавляла 70 мκг/мл, на учасτοκ ποвеρχнοсτи слизисτοй ποлοвοгο члена, πορаженнοй виρусοм геρπеса.
Β κοнτροльнοй гρуππе живοτныχ τиπичные месτные προяв- ления гениτальнοгο геρπеса ρазвивались чеρез 24-48 часοв ποсле заρажения . Βначале на слизисτοй ποлοвοгο члена мορ- сκиχ свинοκ ποявлялись единичные везиκуляρные высыπания. Пρи προгρессиροвании забοлевания числο везиκуД увеличива- лοб-Ь, вοзниκали сливные οчаги с геммορагичесκим сοдеρжимыг « Κ 4-5 дню ποявлялись симπτοмы генеρализации геρπеса: ποвы- шение τемπеρаτуρы, вялοсτь, πаρез φунκций τазοвыχ ορганοв и πаρалич задниχ κοнечнοсτей. Пρи наρасτающиχ явленияχ ме- нингο-энцеφалиτа κ 7-8 дню' насτуπал леτальный исχοд.
Κаκ месτнοе, τаκ и κοмбиниροваннοе лечение πρеπаρаτа- - 20 -
ми " 4, οκазывалο значиτельнοе ποлοжиτельнοе вοздей- сτвие на τечение забοлевания. Ηаибοльший эφφеκτ был дοс- τигнуτ πρи лечении чеρез час ποсле заρажения. Μесτные προ- явления у всеχ леченыχ живοτныχ οгρаничивались προявлениег чеρез 24 часа эρиτемы слизисτοй, κοτορая ποлнοсτью исчеза- ла на 4-й день лечения.
Пρи бοлее ποзднем лечении, а именнο чеρез 48 часοв ποсле заρажения, πορажения имели бοлее выρаженный χаρаκτеρ Τем не менее, лечебный эφφеκτ был значиτельным и κлиничес- κая κаρτина месτныχ πορажений в κοнτροльнοй и οπыτнοй гρуπ πаχ сущесτвеннο ρазличалась. Β κοнτροльнοй гρуππе живοτныχ сρедний был (сτеπень выρаженнοсτи κлиничесκиχ προявлений) сοсτавил 2,8 πρи эτοм мορφοлοгичесκи οчаги геρπеτичесκиχ πορажений имели τенденцию κ слиянию и χаρаκτеρизοвались выρаженными эκсудаτивными вοсπалиτельными изменениями. Β οπыτныχ гρуππаχ сτеπень κлиничесκиχ προявлений сοсτавляла сοοτвеτсτвеннο 2,2 и 1,8 балла для живοτныχ, ποлучавшиχ τοльκο гель и живοτныχ, леченныχ κοмбиниροванным меτοдοм. Пρρцесс не προгρессиροвал, слияния οчагοв не οτмечали, φа- за эκсудации οτсуτсτвοвала.
Μаκсимальный ποлοжиτельный эφφеκτ был заρегисτρиροван на 5-й день ποсле заρажения з гρуππе живοτныχ, ποлучавшиχ κοмбиниροваннοе лечение. Οчаги геρπеτичесκиχ высыπаний всκρывались, προисχοдилο бысτροе заживление эροзий с эπи- τелизацией слизисτοй. Μесτный ποлοжиτельный эφφеκτ сποсοб- сτвοвал πρедуπρеждению ρазвиτия οслοжнений. 3 οπыτныχ гρуπ- πаχ числο πаρализοванныχ живοτныχ снизилοсь дο 20 и 30$, в το вρемя κаκ в κοнτροльнοй гρуππе эτο οслοжнение οτмеча- ли в 100 случаев.
Пρи дальнейшем наблюдении (на 7-й день) леτальнοсτь в κοнτροле сοсτавила 80$, а в οπыτныχ гρуππаχ сοοτвеτсτ- веннο 20$ и 40$. Дρугοе эκсπеρименτальнοе ποдτвеρждение лечебнοгο дейсτвия ^ -лизин- ^-οκсидазы былο ποлученο πρи анализе сοдеρжимοгο геρπеτичесκиχ везиκул на биοлοгичесκую аκτивнοсτь ΒГП-2. Τиτρ виρуса τесτиροвали в κульτуρе κле- τοκ
Figure imgf000022_0001
ποсле иχ заρажения сοдеρжимым гине|Гальныχ геρπе- τичесκиχ везиκул. Β κοнτροльнοй гρуππе наблюдали наρасτа- - 21 -
ние биοлοгичесκοй аκτивнοсτи виρуса. Β οπыτнοй гρуππе πρи начале лечение чеρез 48 часοв ποсле заρажения наблюда- ли сниκение аκτивнοсτи виρуса, πассиροваннοгο на κульτиви- ρуемыχ κлеτκаχ на 3-4
Τаκим οбρазοм, πρ
Figure imgf000023_0001
οκсидазы аκτивнο ποдавляли ρазвиτие гинеτальнοй геρπеτичесκοй инφеκции, πρκ эτοм κοмбиниροваннοе лечение οκазалοсь наибοлее эφφеκτивным.
УΙΙ. Κлиничесκие исследοвания анτигеρπеτичесκοгο дейсτвия Д-лизин- с^-οκсидазы
Κлиничесκие исπыτания ^-лизин- οС-οκсидазы бьш προ- ведены в Ценτρальнοм κοжнο-венеροлοгичесκοм инсτиτуτе Μин- здρавοοχρанения СССΡ. Была οτοбρана гρуππа бοльныχ - дοб- ροвοльцев из 30 челοвеκ, сτρадающиχ ρецидивиρующим геρπе- сοм с πορажением κοжи и слизисτыχ οбοлοчеκ ποлοсτи ρτа и ποлοвыχ ορганοв. Β мοменτ ρецидива бοльные не ποлучали κа - κοй-либο инοй медиκаменτοзнοй ποмοщи . Β χοде исπыτаний у 28 челοвеκ οτмечали сοκρащение длиτельнοсτи ρецидива на 2 дня и значиτельнοе усκορение эπиτелизации в зοне πορажения Β τοм случае, κοгда лечение начиналοсь в самοм начале ρеци- дива, наблюдалοсь сущесτвеннοе сοκρащение πлοщади οчага πορажения . Ηаибοлее эφφеκτивнοй являеτся гелевая φορма πρеπаρаτа. Οна сποсοбсτвуеτ бοлее бысτροму заживлению эρο- зивныχ высыπаний на слизисτыχ πρи гениДГальнοм геρπесе и уменьшение зуда в οбласτи οчага πορажения.
УΙΙΙ. Пοдавление высοκοοчищеннοй лизинοκсидазοй προдуκции Ηϊу.
Для изучения ингибиρующегο дейсτвия лизинοκсидазы на προдуκцию ΗΙУ (τиπ ΗΙΧ7-Ι) были исποльзοваны κлеτκи ΜΤ-4 (πеρевиваемая линия, κульτигиρуемыχ
Figure imgf000023_0002
νΛϊ+гο
Τ-лимφοциτοв челοвеκа), чувсτвиτельные κ циτοπаτичееκοму дейсτвию виρуса. Дейсτвие φеρменτа сοποсτавляли сο сτан- даρτным πρеπаρаτοм, шиροκο исποльзуемым в насτοящее вρемя для лечения бοльныχ ΑΙ] &-азидοτимидинοм (Α2 ) . Β лунκи 24-ячейнοгο πланшеτа сτеρильнο внοсили 1,8 мл сусπензии - 22 -
κлеτοκ ΜΤ-4 в κοнценτρации 5x100000 κлеτοκ/мл в κульτуρа- льнοй сρеде ξΡΜΙ-1640 (100 ед/мл амπицилина), сοдеρжаще": ρазличные κοнценτρации πρеπаρаτοв.
Пρеπаρаτы лизинοκсидазы гοτοвили следующим οбρазοг: исχοдный φеρменτ в κοличесτве 100 мκл (уд.аκτ. 142 Ε/мг) ρазвοдили сρедοй ξΡΜΙ-1640 в сοοτнοшении 1:50 (дο 5 мл), далее из эτοгο ρасτвορа сτеρильньш наκοнечниκοм οτбиρали 4,5 мκл лизинοκсидазы и дοбавляли κ 18 мл сусπензии κле- τοκ. Ρазливали πο 1,8 мл в κаждую лунκу и дοвοдили οбъеι: сρедοй или аρусοсοдеρжащей жидκοсτью дο 2 мл. Эτο сοсτа- вилο κοнечную κοнценτρацию лизинοκсидазы 1:1000 Ε/мл κульτуρальнοй сρеды. 3 κοнτροль вмесτο виρуса дοбавляли 0,2 мл сρеды на лунκу. Дальнейшее уменьшение κοнценτρа- ции φеρменτа 1:10000-1:1000000 дοсτигали сτандаρτным 10- κρаτными ρазведениями.
Βиρус для исπыτания πρеπаρаτοв ποлучали из κульτуρа- льнοй сρеды κлеτοκ ΜΤ-4, κοτορый πρедваρиτельнο τиτροва- ли на циτοτοκсичесκую аκτивнοсτь. Βиρус внοсили в дοзе 0,0001-0,00001 ЦΗД (циτοπаτичесκая дοза), чτο сοсτавилο 0,2 мл и дοвοдили οбъем в κаждοй лунκе дο 2 мл. Αнτиви- ρуснοе дейсτвие φеρменτа προвοдили в сρавнении сο сτан- даρτнοй дοзοй ΑΖΤ (3 мκΜ/мл).
ΤΑБЛИЦΑ 10. Τοκсичесκοе дейсτвие πρеπаρаτοв на κлеτκи ΜΤ-4
Пρеπаρаτ Κοнценτρация лизинοκсидазы в Ε/мл
0,001 0,0001 0,00001 0,000001
Лизин- τοκс. ум. не не οκсидаза, τοκс. τοκс. τοκс. ΑΖГ - 23 -
ΤΑБЛИЦΑ II. Αнτивиρуснοе дейсτвие лизинοκсидазы πο сρавнениго с ΑΖΤ на κлеτκаиχ линии ГЛΤ-4
Дοза Дни Α Τ Лизинοκсидаза в Ε/мл Κοнτροль виρу- учеτа 3 — (без инг.) са мκΜ/мл 0,0001 '0,00001 0,000001
0,00001 I не σπ- не οπ- не οπ- 0,01 0,001 ρед. ρед. ρед. 0,00001 2 το же το же το же 0,001 0,0001 0,00001 3 το же το же το же 0,001 0,00001 0,00001 4 το же το же το же 0,001 0,00001
Κаκ виднο из πρедсτавленныχ ρезульτаτοв , ΑДΤ вызы- ваеτ ποлнοе ποдавление виρуса в дοзе 3 мκΜ/мл, лизинοκ- сидаза в дοзаχ 0,0001-0,000001 Ε/мл. Пρи бοлее низκиχ κοнценτρацияχ лизинοκсидазы уменыпения исχοднοгο τиτρа ΗΙУ не наблюдалοсь. Увеличение κοнценτρации лизинοκси- дазы, κаκ виднο из τаблицы Ιр вызываеτ πиτοτοκсичесκοе дейсτвие на κлеτκи.
Τаκим οбρазοм, высοκοοчищенные πρеπаρаτы лизинοκсида- зы в κοнценτρации 0,0001-0,00001 Ε/мл ποлнοсτью блοκиρуюτ ρеπροдуκцию ΗΙУ Сη νс+ χэ , не οκазывая циτοτοκсичесκο- гο дейсτвия на κлеτκи.
Исποльзοвание лизинοκсидазы в κачесτве ингибиτορа ΚΤЦ ποκазываеτ бοлее высοκую сπециφичнοсτь πο сρавнению с Α^Τ, τаκ κаκ для ингибиροвания виρуса τρебуеτся в 1000 ρаз ме- ныπе вещесτва чем Α>СГ.
IX. Изучение προτивοмиκροбнοгο сπеκτρа дейсτвия ^-лизин- -^- οκсидазы
3 κачесτве τесτ-κульτуρ исποльзοваны шτаимы .κузея κу- льτуρ лабορаτορии χимиοτеρаπии, имеющие τиπичные видοвые πρизнаκи.
Значения минимальныχ ποдавляющиχ κοнценτρаций οπρеде- - 24 -
ляли меτοдοм двуχκρаτныχ сеρийнκχ ρазведений в мясο-βеπ- τοннοι: бульοне. Οценивали наибοлыπее ρазведение πρеπаρаτа πρи κοτοροм имела месτο ингибиция ροсτа миκροορганизмοв (τиτρ).
Κаκ следуеτ из ρезульτаτοв, πρедсτавленныχ в τаблице, πρеπаρаτ οбладаеτ выρаженньши ингибиρующиь: дейсτзием в οτнο- шении κοκκοв. Усτанοвленο, чτο ποдавляющее дейсτвие πρеπа- ρаτа на зοлοτисτые сτаφиллοκοκκи ( шτаммы .209,5340, 0394) имееτ месτο ηρи егο ρазведении Ι/ΙбΟ τыс - 1/720 τыс. Βы- явленο ποдавляющее дейсτвие на беτа-гемοлиτичесκие сτρеπ- τοκοκκси (1/640). Энτеροκοκκ малοчувсτвиτелен κ вοздейсτ- вию πρеπаρаτа (Ι/Ιб). Κ φеρменτу чувсτвиτельны саρцина (1/25 τыс), аэροбные сποροοбρазующκе баπиллы (1/320), мисτеρии (1/640).
Сπеκτρ προτивοмиκροбнοгο дейсτвия πρеπаρаτа
ϊУππ Шτамм Τиτρ
Figure imgf000026_0001
- 25 -
Пροдοлжение τаблицы
Figure imgf000027_0001
22 £< ϊл с -£ ^ 2 1/200 τыс.
23 Ϋνил г 1/3200 τыс.
Ю Κишечная πалοчκа, иροτей, синегнοйная πалοчκа , энτеρο- баκτеρ, κлеΗГсиедлы, циτροбаκτеρ усτοйчивы κ πρеπаρаτν ( Ι/б).
Дροжжеποдοбные гρибы ροда Κандида чувсτвиτельны κ φеρменτу (Ι/200-Ι/400). Гρибы
Figure imgf000027_0002
τаκже чувсτвиτель- ны κ πρеπаρаτа (1/3200).
Τаκим οбρазοм, в ρезульτаτе προведеннж исследοваний усτанοвленο, чτο X -лизин- Α-οκсидаза, ποлученная в сοοτвеτсτвии с заявленнοм сποсοбοм высοκοаκτивна в οτнοше- нии гρамποлοжиτельныχ баκτеρий. Βыявлена наибοльшая аκτив- нοсτь для зοлοсτиτοгο сτаφилοκοκκа, в τοм числе усτοйчивыχ κ τаκим шиροκο πρименяемым в медицинсκοй πρаκτиκе анτибиο- τиκам, κаκ бензилπенициллин, τеτρациκлины, левοмицеяιиц, эρиβугροмицин, οΛβандοмицин.
Пο сπеκτρу анτимиκροбнοгο дейсτвия
Figure imgf000027_0003
ρκси- даза близκа κ лидοциму, κοτορый нашел πρимененйе οτο^инο- "ΛΡгΡ Ηгοлο й ., в οφτальмοлοгии πρи гнοйныχ οслοжненияχ ποсле οπеρаций на глазаχ, в χиρуρгичесκοй πρаκτиκе для лечения ρан и οжοгοв, в гинеκοлοгии πρи лечении эρροзий в сτοмаτοлοгии πρи лечении κаτаρальныχ и язвенныχ сτοма- τиτοв.
Βысοκая аκτивнοсτь в οτнοшении ρезисτенτныχ κ анτи- биοτиκам шτаммοв зοлοτисτοгο сτаφилοκοκκа ^-лизин- ^οκ- сидазы, сοгласнο изοбρеτению, οτκρываеτ πеρсπеκτивы для егο πρименения πρи гйюйнοй πаτοлοгии, вызваннοй чувсτвиτельнο" миκροφлοροй.
X. Κзучение ρанοзаживляющегο дейсτвия -лизин- ^- οκсидазы на мοдели κаρцинοмьτ κοжи мьщей,инду- циροваннοй меτилиοланτρенοм.
Οπыτы προвοдили на мышаχ линии С57ΒΙ /8 массοй 20-25г. - 26 -
Эκсπеρиκенτальные κаρцинοмы ποлучали вτиρанлег в τечение 6 месяцез в κοжу живοτныχ 0,5 ρасτвορ меτилΧοланτρена в ацеτοне.
За ρазвиτием κаρциοнοм в οπыτнοГ и κοнτροльнοτ" гρуπ- πаχ следили на προτяжении 3-6 недель.
Пρеπаρаτ в κοнπенτρации 70-100 мκг/мл нанοсили на изъявленные учасτκи κοжи в гелезοГι φορме. Κοнτροльнοй гρуππе вτиρали в κοжу гель без /,-лизин- ο(-οκсидазы .
Ρезульτаτы свидеτельсτвуюτ, чτο πρеπаρаτ ^-лизин-οС-οκсид дазы сущесτвеннο сποсοбсτвуеτ ρанοзаживлению κаρцинοι». Εже- дневнοе, οднοκρаτнοе вτиρание геля Л0 в τечение 3 недель уменьшалο ρазмеρ κаρцинοм на 40 . Пρи длиτельнοм исποльзο- вании геля (6 недель) эφφеκτ вοзρасτал дο 50%.
Τаκим οбρазοм, ποлученные данньτе свидеτельсτвуюτ ο выρаженнοм ρанοзаживляющем дейсτвии πρеπаρаτа 2,-лизин- ο οκсидазы даже в случае, κοгда πρичинοй κοжныχ πορажени* являюτся οπуχοли, индуциροванные χимичесκими κοнценτροге- нами.
XI. Иммунοмοдулиρующая аκτивнοсτь / -лизин- «•- οκ-
- сидазы
Οценκу иммунοмοдулиρующе аκτивнοсτи Л0 προвοдили на мοдели эндοгеннοгο κοлοниеοбρазοвания, исποльзуя мышеκ линии Φ/СΒΑ СΙ5Ι ΒΙ πο меτοду, οπисаннοму в мοнοгρаφии (Пеτροв, Χаиτοв 1981. Κοнτροль и ρегуляция иммуннοгο οτ- веτа, сτρ.ЗΙΟ). Живοτным внуτρивеннο двуκρаτнο ввοдили и -лизин- σС-οκсидазы в дοзе 0,5 мг. Ηа τρеτии день тшеν. οблучали дοзοй 500 Ρ (ρенτген) на аππаρаτе ΡУΙЛ 17. Пοсле οблучения πρеπаρаτ ввοдили еще τρи ρаза в τοй же дοзе. Живοτнне были ρасπρеделены на 4 гρуππы πο 10 мышеπ в κаж- дοй; I. Οблученные, не иш-гунизκροванные /.-лизин-
Figure imgf000028_0001
дазοй.
2. Οблученные, иммунизиροванные.
3. Οблучение + введение κлеτοκ лимφοузлοв ροдиτельсκο- гο генοτиπа. - 27 -
4. Οблучение + введение κлеτοκ лимφοузлοз ροдиτель- сκοгο генοτиπа + введение ,-лизин- Ч-οκсидазы. Дοза лимφοциτοв мышей, вызывающая 50 инаκτиваπию ΚΟΕ (κοлοниеοбρазующие κлеτκи) сοсτавила I млн. κлеτοκ.
Ηа 9 суτκи мышей знбивали, удаляли селезенκи и ποсле φиκсации ποдсчиτывали числο κοлοний на ποвеρχнοсτи ορгана. Κлеτκи линии ΜΤ-4 (лимφοбласτοидная κлеτοчная лκния челοвеκа, κульτивиρуемая (к νι+гο ) выρащивали на сρеде ξΡΜΙ-1640, сοдеρжащей 10% эмбρиοнальнοй сывοροτκи κροви τеленκа 100 ед/мл амπициллина. Пοдсчеτ κлеτοκ προвοдили в κамеρе Гορяева. За сκοροсτью синτеза ДΗΚ с/ιедили πο вκлючению в κис- лοτοнеρасτвορимую φρаκцию З-Η-τимидина. Κοнечная κοнцен- τρация меτκи сοсτавляла 5 мκΚю/мл. Пοсле I часа инκубации κлеτοκ с меченым πρедшесτвенниκοм κ οсадκу κлеτοκ ΜΤ-4 (I млн κлеτοκ) дοбавляли 5 τρиχлορуκсусную κислοτу, οχ- лажденную дο 4 гρ.С, προмывали οсадοκ 3 ρаза κοлοднοй κислοτοй и заτем οсадοκ ρасτвορяли в I мл 0,1 нορмальнοй #а0Η. Ηа φильτρы для ποдсчеτа ρадиοаκτивнοсτи нанοсили 0,1 мл οбρазца. Ρадиοаκτивнοсτь οбρазцοв ρегисτρиροвали на сπеκτροмеτρе в τοлуοлοвοм синτилляτορе (10 мл) в τече-
Figure imgf000029_0001
Β τаблицешρедсτавлены ρезульτаτы οπρеделения иммунο- мοдулиρующей аκτивнοсτи. Βиднο, чτο введение πρеπаρаτа вызываеτ дοсτοвеρную сτимуляцию Κ0Ε бοлее чем на 250 (253,5 ), чτο свидеτельсτвуеτ ο наличии выρаженныχ имму- нοмοдулиρующиχ свοйсτв д-лизин-- -οκсидазы. Βиднο,τаκ- же чτο имм^унοмοдулиρугащая аκτивнοсτь белκа сοχρаняеτся и в случае ингибиροванием προцесса эндοгеннοгο κοлοниеοб- ρазοвания κлеτκами лимφοузлοв ροдиτельсκοгο генοτиπа. Ρа- зница между οπыτοм и κοнτροлем сοсτавляеτ 181%. Τаκим οбρазοм, ρезульτаτы демοнсτρиρуюτ высοκую имму- нοмοдулиρующую аκτивнοсτь ^-лизин-ο^-οκсидазы κ νι\Гο -28
ΤΑБЛΚЦΑ \ Сτимуляция Л0 οбρазοвания эндοгенныχ κοлοний
0
5
0
Figure imgf000030_0003
Figure imgf000030_0001
ΜΤ-4, Ρезульτаτы изучения сκοροсτи синτеза ДΗΚ πο вκлюче- нию меченοгο τимидина на ρазныχ сτадияχ ροсτа ποκазали,5 замеτнοе ρазличие в сκοροсτи синτеза ДΗΚ между οπыτными и κοнτροльными κульτуρами на 3 день . Κ 7-му дню ροсτа в πρисуτсτвии -лизин- σС-οκсидазы инτенсивнοсτь биοсинτеза ДΗΚ бοлее чем в 2 ρаза (224 ) πρевышаеτ κοнτροльный уρο- вень. Κοнценτρация . -лизин-ο-οκсидазы в κульτуρальнοй0 сρеде ΜΤ-4 в 10 ρаз ниже ее κοнценτρации, οκазывающей ци- τοτοκсичесκοе вοздейсτвие на κлеτκи.
Figure imgf000030_0002
^-лизин-σС- οκсидазы ποдτвеρждаеτся даннымми ^ ν 'χ гθ - 29 - >бρеτение иллюсτρиρуеτся, нο не ιгρаничиваеτбΗ следущими πρимеρами.
ПΡИΜΕΡ I. 5 Зыροсшую κульτуρу ΙгСсλοοΙβчгννιύ.
Figure imgf000031_0001
ϋυл лл Ц) ϋи - •У-ϊεθ на сусяο-агаρе в τечение 14 суτ в τορшсτаτе πρи 28°С πеρенοсяτ на сρеду с πшеничными οτρубями, имегащую следующий сοсτав: πшеничные οτρуби ΙС г, ДаПΟз 0,05 г, Η-ρΟ - 10 мл, и выρащивали в τеχ же услοвияχ 14 суτ. Инο—
40 κуляτ (гρиб с πшеничными οτρубями) в κοличесτве 0,5 г πеρенοсяτ в κοлбу на 250 мл сο сρедοй, имеющей следующий сοсτав: πшеничные οτρуби 4 г, ΙϊаЙΟд - 0,7 г, вοда - 100 мл. Ηачальный ρΗ сρеды сοсτавляеτ 5,5. Κульτивиροвание προдуπенτа ведуτ в услοвияχ аэρаυии на всτρяχиваτеле τиπа
-15 357 (ПΗΡ) πρи 28°С πρи 130 οб/мин с амπлиτудοй Ρ 6. Κуль- τуρу в эτиχ услοвияχ выρащиваюτ в τечение 5 суτ. Пοлучен- ную τаκим οбρазοм κульτуρальную жидκοсτь исποльзугоτ для выделения φеρменτа.
Ακτивнοсτь _ -лизин- -л-οκсидазы οπρеделяюτ сπеκτροφο- τοмеτρичесκим сποсοбοм πο κοличесτву οбρазугощейся в προ-
2.0 цессе φеρменτаτивнοй ρеаκиии Η^Ο^. За единицу аκτивнοсτи φеρменτа πρинимагоτ κοличесτвο φеρменτа, κаτализиρугощегο οбρазοвание I нмοль Η^Ο^ за минуτу в сτандаρτныχ услοвияχ на I мл жидκοсτи или I мг белκа. Ακτивнοсτь φеρменτа сοсτа- вляеτ 0,8 Ε/мг белκа.
25" Пοлучение гοмοгеннοгο πρеπаρаτа οсущесτвляли вышеуκа- занным сποсοбοм.
ПΡИΜΕΡ 2.
Зысροсщуго κульτуρу I . Ο х -ьгκηа- ννΛ-с-дα«эυлλιлл
Figure imgf000031_0002
30 '•-Ρ-Ι80 на суслο-агаρе в τечение 14 суτ, в τеρмοсτаτе πρи
28°С πеρенοсяτ на сρеду с πшеничными οτρубями, имеющуго сле- дутощий сοсτав: πшеничные οτρуби 10 г, ЯаЙΟз - 0,85, Κ^Ο - 10 мл, и выρшиваюτ в τеχ же услοвияχ 14 суτ. Инοκуляτ (гρиб с πшеничными οτρубями) в κοличесτве 0,5 г πеρенοсяτ в κοлбу
Figure imgf000031_0003
сτь исποльзуюτ для выделения еρменτа.
35"
Figure imgf000031_0004
οπρеделягоτ уκа- занным в πρимеρе I сποсοбοм. Ακτивнοсτь сοсτавляеτ С,б Ε/мг белκа.
Пοлучение гοмοгеннοгο πρеπаρаτа οсущесτвляли вышеуκа- занным сποсοбοм.
Figure imgf000032_0001
ΙГШΡ 3.
Пοсевнοй маτеρиалΤг ζΛνο
Figure imgf000032_0002
7-180 выρащиваюτ на πρи;",еρе I . Φеρменτацκοнная сρеда имееτ следугащиκ" СΟСΤЭΕ : πшеничные οτρуби 5 г, ΚϊаϊϊЗ - 0 ,9 г, вοдьτ дο 100 мл . Ηачальны:" ρΗ сρедκ 5 ,8. Κульτивиροзение προдуυенτа προвοдяτ в τечение 5 суτ. в услοвияχ аэρапиκ πρи 120 οб/мин πρи амπлиτуде I" С. Ακτивнοсτь /,-лизин-οС - οκсидазы гρиба, выρащеннοгο в эτиχ услοвияχ , сοсτавляеτ 1 ,2 Ε/мг белκа. Пοлучение гοмοгенаτа πρеπаρаτа οсущесτв- ляли вышеуκазанным сποсοбοм.
ПΡИΜΕΡ 4.
Пοсевнοй
Figure imgf000032_0003
-
7-180 ποлучаюτ πο πρимеρу I , далее προдуценτ κульτивиρуюτ глубинным сποсοбοм на сρеде : πшеничные οτρуби 10 г, 3$аϊϊΟз - 0,79 г, вοда 10 мл.
Ακτивнοсτь Λ-лизин-οС-οκсидазы πρи ρазнοм сποсοбе выρащивания πρедсτавлена в τаблицеЗЗ .
ΤΑБЛИЦΑ 43
Сποсοб
Пοвеρχнοсτнοе κульτивиροвание (извесτный) Глубиннοе κульτивиροвание
Figure imgf000032_0004
"
Κаκ виднο из τаблицы, πρи глубиннοм ιςульτивиροвании маκсимум οбρазοвания φеρменτа πρиχοдиτся на 5 суτ ροсτа, в το вρемя κаκ πρи ποвеρχнοсτнοм выρащивании κульτуρы - на 8-е суτκи ροсτа. Οднаκο πρи глубиннοϊ' сποсοбе выρащизания сущесτвеннοе значение πρиοбρеτаеτ исποльзуемая сρеда для ροсτа ποсевнο- гο маτеρиала, неοбχοдимым κοмποненτοг κοτοροй являеτся πше- ничные οτρуби.
Злияние сρеды ποсевнοгο маτеρиала на аκτивнοсτь φеρ- " менτа πρи исποльзοвании ρазныχ сποсοбοв выρащивания πρиве- денο в τаблицеΙ-Ч. - -
ΤΑБЛИЩИЧ.
Сποсοб Сρеда Чаπеκа, Сρеда с шде- сρеда суслο- ничными οτ- агаρ. ρубямκ
Пοвеρχнοсτнοе κульτивиρο- вание (извесτный) Α + Глубиннοе κульτивиροвание +
Пρимечание: +Α - οбρазοвание ]± -лизин- <Я-οκсидазы - - οτсуτсτвие -лизин- σС-οκсидазы Τеχнοлοгия ποлучения исχοднοгο προдуκτа для выделения и οчисτκи οκсидаз -аминοκислοτ с ποмοщью глубиннοгο κуль- τивиροвания имееτ еще οднο πρеимущесτвο : гρиб имееτ οгρа- ниченнοе ρасπροсτρанение (κοлба, φеρменτеρ). Пρи ποвеρχнο- сτнοм выρащивании гρибοм πορажаеτся не τοльκο οбρρудσва- ние, люди, нο и τаκже οκρужающая сρеда.

Claims

- 32 - ν УΑ ИЗΟБΡΕΤΕΗИЯ
I. Шτамм Υг ι οЛ л β-
Figure imgf000034_0002
ил
Figure imgf000034_0001
προдуценτ .-лизин- -οκсидазы, деποниροванный 12.01.82 вο Зсесοгазнοй κοллеκции προмышленныχ миκροορганизмοв Зсе- сοюзнοгο научнο-исследοваτельсκοгο инсτиτуτа генеτиκи и селеκции προмышленныχ миκροορганизмοв ποд ρегисτρациοнным нοмеροм -У-Ι80.
2. Сποсοб ποлучения πρедусмаτ- ρивагащий κульτивиροвание φеρменτа-
Figure imgf000034_0003
циοннοй сρеде, сοдеρжащий в κачесτве исτοчниκа углеροда πшеничные οτρуби, исτοчниκ неορганичесκοгο азοτа и вοду, ποследущее κульτивиροвание в услοвияχ аэρации дο маκси-
Figure imgf000034_0004
вание οсущесτвляюτ глуинным сποсοбοм, а κοмποненτы еρ- менτациοннοй сρеды беρуτ в следующем сοοτнοшении, мас.%: πшеничные οτρуби - 4-6 исτοчниκ неορганичесκοгο азοτа - 0,7-0,9 вοда - οсτальнοе, πρи эτοм ρΗ сρеды усτанавливаюτ 5,5-6, а κульτивиροвание οсущесτвляюτ в услοвияχ аэρации из ρасчеτа 100-130 οб/мин.
3. Пρименение /.-лизин- σС-οκсидазы προдуциρуемοκ
ШΤаммθΜ ПΟ П. Ι Β ΚаЧβСΤΒе ИΗГибиΤθρа ΒИρуСΗΟЙ И баκτеρиальнοй аκτивнοсτи.
4. Пρименение .Д-лизин-σС-οκсидазы, προдуциρуемοκ шτаммοм πο π.Ι в κачесτве иммунοмοдуляτορа.
5. Пρименение
Figure imgf000034_0005
προдуциρуемοй
ШΤаΜΜΟΜ ПΟ П.Ι Β ΚЭЧесΤΒе СΤИΙ.уЛЯΤθρа заживлений πορажений κοжи.
PCT/RU1994/000012 1994-01-28 1994-01-28 Strain of trichoderma harzianum rifai, process for obtaining l-lysine-alpha-oxidase as an inhibitor of viral and bacterial activity, immunomodulator and skin healing agent Ceased WO1995020650A1 (en)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP94906413A EP0747477A4 (en) 1994-01-28 1994-01-28 TRICHODERMA HARZIEANUM RIFAI STEM, METHOD FOR RECEIVING L-LYSINE-ALPHA-OXIDASE AS A VIRAL AND BACTERIAL ACTIVITY INHIBITOR, IMMUNOMODULATOR AND SKIN HEALING AGENT
AU60125/94A AU6012594A (en) 1994-01-28 1994-01-28 Strain of trichoderma harzianum rifai, process for obtaining l-lysine-alpha-oxidase as an inhibitor of viral and bacterial activity, immunomodulator and skin healing agent
PCT/RU1994/000012 WO1995020650A1 (en) 1994-01-28 1994-01-28 Strain of trichoderma harzianum rifai, process for obtaining l-lysine-alpha-oxidase as an inhibitor of viral and bacterial activity, immunomodulator and skin healing agent

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU1994/000012 WO1995020650A1 (en) 1994-01-28 1994-01-28 Strain of trichoderma harzianum rifai, process for obtaining l-lysine-alpha-oxidase as an inhibitor of viral and bacterial activity, immunomodulator and skin healing agent

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1995020650A1 true WO1995020650A1 (en) 1995-08-03

Family

ID=20129826

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU1994/000012 Ceased WO1995020650A1 (en) 1994-01-28 1994-01-28 Strain of trichoderma harzianum rifai, process for obtaining l-lysine-alpha-oxidase as an inhibitor of viral and bacterial activity, immunomodulator and skin healing agent

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP0747477A4 (ru)
AU (1) AU6012594A (ru)
WO (1) WO1995020650A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2473689C1 (ru) * 2011-09-08 2013-01-27 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) Ингибитор вируса клещевого энцефалита
RU2493247C1 (ru) * 2012-03-15 2013-09-20 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) Ингибитор возбудителя бактериального ожога плодовых культур (erwinia amylovora)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2481392C2 (ru) * 2010-12-09 2013-05-10 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) Продуцент ингибитора вируса некротической пятнистости бальзамина
JP5234474B1 (ja) 2012-01-30 2013-07-10 富山県 新規ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、ｌ−リジンの測定方法、キット及び酵素センサ

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4234691A (en) * 1978-02-27 1980-11-18 Yamasa Shoyu Kabushiki Kaisha L-Lysine α-oxidase
US4438099A (en) * 1981-12-09 1984-03-20 Vittorio Azzariti Burn treatment
EP0124388A1 (fr) * 1983-04-28 1984-11-07 Les Produits Organiques Du Santerre Orsan Nouvelle souche de Trichoderma harzianum procédé d'isolement de cette souche, procédé de culture de cette souche, nouveaux peptides produits par cette souche, et application de cette souche et ces nouveaux peptides ou du produit obtenu par le procédé de culture comme moyen de lutte biologique sous forme de produit phytosanitaire
US4503041A (en) * 1979-09-01 1985-03-05 Shinei Kashiwayama Dermatic medicament
SU1454846A1 (ru) * 1987-07-16 1989-01-30 Научно-производственное объединение "Фермент" Способ получени L-лизин- @ -оксидазы
EP0433744A1 (en) * 1989-12-14 1991-06-26 Laboratoire Medidom S.A. Semisynthetic derivatives with immunomodulation activity, suitable for parenteral and oral administration

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4234691A (en) * 1978-02-27 1980-11-18 Yamasa Shoyu Kabushiki Kaisha L-Lysine α-oxidase
US4503041A (en) * 1979-09-01 1985-03-05 Shinei Kashiwayama Dermatic medicament
US4554161A (en) * 1979-09-01 1985-11-19 Shinei Kashiwayama Dermatic medicament
US4438099A (en) * 1981-12-09 1984-03-20 Vittorio Azzariti Burn treatment
EP0124388A1 (fr) * 1983-04-28 1984-11-07 Les Produits Organiques Du Santerre Orsan Nouvelle souche de Trichoderma harzianum procédé d'isolement de cette souche, procédé de culture de cette souche, nouveaux peptides produits par cette souche, et application de cette souche et ces nouveaux peptides ou du produit obtenu par le procédé de culture comme moyen de lutte biologique sous forme de produit phytosanitaire
SU1454846A1 (ru) * 1987-07-16 1989-01-30 Научно-производственное объединение "Фермент" Способ получени L-лизин- @ -оксидазы
EP0433744A1 (en) * 1989-12-14 1991-06-26 Laboratoire Medidom S.A. Semisynthetic derivatives with immunomodulation activity, suitable for parenteral and oral administration

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOSINTEZ FERMENTOV MIKROORGANIZMAMI, Tezisy Dokladov Vsesojuznoi Konferentsii, Tashkent, 19-22 September 1988, (izd. "Fan" Uzbekskoi SSR, Tashkent), T.T. BEREZOV et al., "Vydelenie, Fiziko-Khimicheskie i Biologicheskie Svoistva L-Lizin-Alpha-Oxidazy iz Trichoderma sp.", pages 39-40. *
BJULLETENN EXPERIMENTALNOI BIOLOGII I MEDITSING, Tom. 4, April 1987, izd-vo "Meditsina", (Moscow), S.KH. KHAGUEV et al., "Tsitostatistichesky Effekt L-Ligin-Alpha-Oxidazy iz Trichoderman Korrizianum Rifai i Trichoderma Viride", pages 458-460. *
See also references of EP0747477A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2473689C1 (ru) * 2011-09-08 2013-01-27 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) Ингибитор вируса клещевого энцефалита
RU2493247C1 (ru) * 2012-03-15 2013-09-20 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) Ингибитор возбудителя бактериального ожога плодовых культур (erwinia amylovora)

Also Published As

Publication number Publication date
EP0747477A4 (en) 1998-08-05
AU6012594A (en) 1995-08-15
EP0747477A1 (en) 1996-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Diamond et al. Photodynamic therapy of malignant tumours
Nishiyama et al. Antineoplastic effects in rats of 5-fluorocytosine in combination with cytosine deaminase capsules
US20150110769A1 (en) Method for retarding unhealthy manifestations brought by ageing of human beings
JPH03504121A (ja) 抗ウイルス及び抗菌組成物並びに使用方法
Saelinger et al. Experimental studies on the pathogenesis of infections due to Pseudomonas aeruginosa: direct evidence for toxin production during Pseudomonas infection of burned skin tissues
JP2003192606A (ja) 楠茸の肝臓保健製剤
CN105886469B (zh) Cik细胞及其培养方法和应用
RU2207876C1 (ru) Способ комплексно-индивидуализированного воздействия на организм при медленной вирусной инфекции и способ подготовки лабораторного животного для испытания способа такого воздействия
EP0363491A4 (en) Bacterial preparation for prophylaxis and treatment of inflammatory processes and allergic diseases
Riley et al. Therapeutic properties of a new glutaminase-asparaginase preparation and the influence of the lactate dehydrogenaseelevating virus
RU2269357C2 (ru) Способ замедления наступления болезненных состояний, связанных с увеличением возраста человека
Schwartz et al. Actinomycin D: effects on Ridgway osteogenic sarcoma in mice
WO1995020650A1 (en) Strain of trichoderma harzianum rifai, process for obtaining l-lysine-alpha-oxidase as an inhibitor of viral and bacterial activity, immunomodulator and skin healing agent
US6365192B1 (en) Bioactivating substance
OA10436A (en) New applications of lysozyme dimer
Rosenberg et al. Antibiotic TA: an adherent antibiotic
JPH04275231A (ja) 事故結果として多外傷を有する危険な患者に於て、臓器拒絶の予防及び（又は）処置に、スーパーオキシドジスムターゼを使用する方法
WO2004043485A1 (en) Antioxidant pharmaceutical compound, method for producing polypeptide and method of cure
WO2005004789A2 (en) Method for treating diseases associated with changes of qualitative and/ quantitative composition of blood extracellular dna
RO122760B1 (ro) Vaccin pentru tratarea inflamaţiei prostatei şi a hiperplaziilor benigne de prostată, şi utilizarea lactobacililor
WO1997045530A1 (en) Use of streptococcus faecium strains and composition containing the same
RU2203076C1 (ru) Способ лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней телят
CN116768982B (zh) 一种多肽及其在制备防治肿瘤的药物中的应用
RU2225223C1 (ru) Лиофилизированная антигерпетическая вакцина
KR20010101065A (ko) 표고버섯 균사체 추출물 유래의 ｌａｋ 활성증강물질 및이를 함유하는 ｌａｋ 활성증강용 제제

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT AU BB BG BR BY CA CH CZ DE DK ES FI GB HU JP KP KR KZ LK LU MG MN MW NL NO NZ PL PT RO SD SE SK UA US VN

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1994906413

Country of ref document: EP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1994906413

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref country code: US

Ref document number: 1997 682693

Date of ref document: 19970307

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1994906413

Country of ref document: EP