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WO1995004041A1 - Carbazole compound - Google Patents

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WO1995004041A1
WO1995004041A1 PCT/JP1993/001077 JP9301077W WO9504041A1 WO 1995004041 A1 WO1995004041 A1 WO 1995004041A1 JP 9301077 W JP9301077 W JP 9301077W WO 9504041 A1 WO9504041 A1 WO 9504041A1
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WO
WIPO (PCT)
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compound
culture
strain
present
minutes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1993/001077
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Haruo Seto
Yoichi Hayakawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Taisho Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority to PCT/JP1993/001077 priority Critical patent/WO1995004041A1/ja
Priority to AU45863/93A priority patent/AU4586393A/en
Publication of WO1995004041A1 publication Critical patent/WO1995004041A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/56—Ring systems containing three or more rings
    • C07D209/80—[b, c]- or [b, d]-condensed
    • C07D209/82—Carbazoles; Hydrogenated carbazoles
    • C07D209/88—Carbazoles; Hydrogenated carbazoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the ring system

Definitions

  • the present invention relates to a compound having an antioxidant action and a cell death inhibitory action.
  • JP-A-3-227971 As a related compound having the same action as the compound of the present invention, a compound described in JP-A-3-227971 is known, but it is structurally unstable. Disclosure of the invention
  • the present inventors have isolated a large number of strains from soil and conducted various studies on cultures of the strains.As a result, the inventors have found that compounds produced by certain strains have strong antioxidant activity and cell death inhibitory activity. They have found and completed the present invention. That is, the present invention provides a formula
  • the strain that produces CS-79 is a strain newly isolated from the soil collected by the present inventors in Matsumoto City, Nagano Prefecture, and has the microorganism name “Streptomyces ex fo l iatus 24 19—S VT 2J and deposited under Microorganisms Deposit No. “Micro-organism Deposit No. 12707 (FERM P-12707)” with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • the aerial hyphae form the main axis, thereby forming a curved or looped sporangium consisting of 10 to 50 or more at the irregularly branched tip.
  • the spores are non-motile, cylindrical or oblong in shape, 0.6-0.8 m wide, 0.8-1.0 m long, and the spore surface is smooth.
  • the cell wall chemical type is type I.
  • Table 27 shows the results of visual observation when cultured for 14 days at 27 on various media.
  • the flora color on the colony surface is a gray series, and the reverse color is unclear, slightly changing at pH.
  • the diffusible dye was light brown.
  • the strain was grown in a range of 2 0 4 5 ° C, the optimum temperature for growth because in 2 0 3 7 0
  • S. species of the genus Streptomyces (hereinafter abbreviated as S.) described in the “List of Approved Bacteria Names 1980” and the list of valid names thereafter. , And two closely related species were selected. Comparison of the diagnostic properties of S. nash virensis (S. nash V i 11 e_ns_is—) and _S. Only the assimilation of carbon sources is different.
  • S. soft skulls have morphology, surface color, pH sensitivity of diffusible dyes, carbon Source assimilation is different. Therefore, this strain is most similar to S. nasivirensis, but is described in “Bergey's Manual of Systematic B acteriology Vol. According to Williams et al. (Williams, et. A 1.), S. nasibirensis is a synonym of S. exfoliatus. Therefore, the present strain 24 19— SVT 2 was identified as one strain contained in S. ixhorietus, and S. tomvcesexfo 1 iatus (Stre. Tomvcesexfo 1 iatus) was identified. Called SVT 2 shares
  • Production of CS-79 is carried out by culturing the strain under aerobic conditions in a medium containing various nutrients, in a manner similar to the production of general fermentation products.
  • a carbon source glucose, lactose, starch, etc. are used alone or in combination.
  • a nitrogen source meat extract, automeal, yeast extract, soybean powder, polybebutone, etc. are used alone or in combination.
  • organic and inorganic salts that promote the growth of the strain and promote the production of CS-79 can be added as necessary.
  • Adekinol, silicon, or the like can be used as the defoaming agent.
  • Aerobic culture such as shaking culture and aeration / agitation culture is suitable for the culture method, and is performed at pH 4 to 8, 24 to 30 for 2 to 6 days, preferably at pH 6 to 7, 24 to 27. Incubate in C for 2-3 days.
  • the CS-79 produced by this culture can be isolated according to a general method for collecting S-produced products. Since C S _ 79 is accumulated in the satellite, for example, the following method is effective.
  • the S-isomer is eluted with an organic solvent such as acetate by centrifugation or filtration.
  • the compound of the present invention can be purified and isolated by dissolving it in an organic solvent such as n-port form and subjecting it to silica gel column chromatography, gel filtration power chromatography, and high-performance liquid power chromatography.
  • Figure 1 shows the results determined in the KBr lock.
  • FIG. 2 shows the results measured at 500 MHz in els—DMSO.
  • FIG. 3 shows the results of measurement at 125 MHz in ds-DMS O.
  • Solubility in solvents :
  • FIG. 1 shows the infrared absorption spectrum of CS-79 measured in KBr tablets.
  • FIG. 2 shows the 1 H-NMR spectrum of CS-79 measured at 500 MHz in d 6 -DMSO.
  • FIG. 3 shows the 13 C-NMR spectrum of CS-79 measured at 125 MHz in cls-DMS0.
  • a 50 L jar fermenter containing 30 L of a sterile medium having the same composition as the seed medium was inoculated with 500 ml of the above-described seed culture, which had been precultured, and aerated for 27, 48 hours. Agitation culture was performed. After completion of the culture, 30 L of the culture solution was separated into a supernatant and cells, and then 15 L of acetone was added to the cells and extracted. The acetone extract was extracted twice with 3 L of ethyl acetate after the acetone was distilled off. The ethyl acetate fraction was dehydrated with anhydrous sodium sulfate, concentrated, and then added to the concentrated solution with 100 ml of n-butyl ether to obtain 5.5 g of a yellow precipitate.
  • the compound of the present invention Since the compound of the present invention has an antioxidant effect and a cell death inhibitory effect, it is useful for brain diseases, heart diseases, liver diseases and arteriosclerosis diseases.
  • the compound of the present invention is orally or parenterally administered in the form of tablets, pills, capsules, granules, injections, etc., manufactured according to conventional formulation techniques. be able to.
  • usual additives such as efficacious agents, tying agents, pH adjusters, dissolving agents, emulsifying agents, and suspending agents are used.
  • the administration of the compound of the present invention to a subject can vary depending on the age of ⁇ , the type and condition of the disease, and the like. 100 to 500 mg can be administered in 1 to several divided doses o
  • Test example 1 antioxidant action
  • the liver of a 10-week-old male male rat was taken, homogenized, centrifuged at 3 ° C. and 30000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was taken. The supernatant was collected, centrifuged at 100,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected. This was further centrifuged at 4 ° C and 300,000 rpm for 60 minutes, and the sedimented fraction was collected.
  • the buffer (0. OSS mol Zl tris-hydrochloric acid, 0.174m0 It was composed of 1/1 Shirayidari potassium ⁇ ml 7.4) 70 ml was added to obtain a microsome solution.
  • L-ascorbic acid (0.05 ml) was added. 0 1 511 0 1/1) was allowed to react for 0.5 hour with 0.5 calories. The reaction was stopped by the addition of 0.5 ml of 20% trifluoroacetic acid, and the mixture was centrifuged at 300 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected. To this was added 0.5 ml of 0.67% thiobarbituric acid.
  • Control 1 A group in which the cervical vein was exposed and the skin was sewn without being tied for 3 minutes
  • Control 2 A group in which the carotid artery was exposed and ligated for 3 minutes, and then the skin was sutured.
  • MK 80, an NMDA (N-methyl D-aparlarate) antagonist with a reported cytoprotective effect The result of 1 is described. The test was performed according to the same method as described above. MK-801 was dissolved in physiological saline and administered intraperitoneally immediately after ischemia for 3 minutes.
  • MK—801 (+) — 5—methyl 1 0, 11—dihid 5H—dibenzo [a, d] cycloheptene 1-5, 10—imin CS-79, which is a pedestal of the present invention, exhibited MK-80 action.

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Description

明 細 書 力ルバゾ一ル系化台物 技術分野
本発明は、 抗酸化作用及び細胞死抑制作用を有する力ルバゾール系化台 物に関する。 背景技術
本発明の化合物と同様の作用をもつ類縁の化合物としては、 特開平 3— 2 2 7 9 7 1号公報に記載された化合物が知られているが、 構造上不安定 であった。 発明の開示
本発明者らは、 多数の菌株を土壌より分離し、 その菌株の培養物につい て種々検討した結果、 ある種の菌株の生産する化合物が強い抗酸化作用及 び細胞死抑制作用を有することを見いだし、 本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明は、 式
Figure imgf000003_0001
で表わされる化合物である （以下、 これを C S— 7 9と称する。 ） 。
C S - 7 9を生産する菌株は、 本発明者らが長野県松本市で採取した土 壊より新たに分離した菌株であり、 微生物の名称 「S t reptomyces ex fo l iatus 24 1 9— S VT 2J 及び微生物寄託番号 「微ェ研菌寄第 1 2 7 0 7号 （FERM P - 12707) 」 として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託 されている。
この菌株の菌学的性状を以下に示す。 '
1 ) 形態
本菌株の基生菌糸は分断しない。
気菌糸は主軸を形成し、 それにより不規則に分岐した先端に、 1 0〜 5 0個またはそれ以上からなる曲状またはループ状の胞子鎮を形成する。 胞子は非運動性で、 円柱形あるいは長楕円形を呈し、 幅 0. 6 ~0. 8 m、 長さ 0. 8〜 1. 0 mで、 胞子表面は平滑である。
菌核、 胞子のう、 その他の特殊形態は観察されない。
細胞壁化学型は I型である。
2 ) 培地上での生育状態
各種培地上で 27で、 1 4日間培養したときの肉眼による観察結果を表
1 に不す
集落表面の菌叢色は灰色系列で裏面色は不鮮明色を呈し、 p Hで僅かに 変化する。
拡散性色素は明茶色が認められた。
【表 1】
Figure imgf000005_0001
( ) 内はカラー ハーモニー マニュアル （コンテナー コーポレイ シヨ ン ォブ アメ リカ、 1 9 5 0 ) の色調コ一ド。
3 ) 生理的性質
①生育温度範囲
本菌株は 2 0 4 5 °Cの範囲で生育し、 最適生育温度は 2 0 3 7 で め 0
②生化学的性質
a ) 好気性、 嫌気性の区別：好気性
b) ゼラチンの液化： +
c) 脱脂乳の凝固：一 d) 脱脂乳のぺプト ン化： 一
e ) スターチの加水分解： +
f ) メ ラニン様色素の生成： +
g) 細胞壁の型： I型 '
③炭素源の利用
(プリ ドハム · ゴドリ一ブ寒天培地上）
利用する ： グルコース、 ァラ ビノース、 キシロース、 フラク ト一ス、 ラ ムノース、 ラフ イ ノース、 イ ノ シ トール、 マンニッ ト
利用しない ： シュク ロース
以上の性状を基に 「細菌名承認リス ト 1 9 8 0」 およびそれ以後の有 効名リ ス トに言己載されたス ト レプトマイセス (S t r e p t o mv c e s 以後 S. と略す） 属の種について検索し、 近縁の 2種を選出した。 S . —ナシビレンシス （ S . n a s h V i 1 1 e_n s_ i s— ) と _S . ぺ ォフスカス （S. p e r p e o f u s c u s ) の診断的性状を比較すると 本菌株と S. ナシビレンシスの性状はよ く一致しており、 炭素源の同化の み異なつている。
【表 2】
太 -卞、 c=J レノ Γ、じ ·Α 7 レノ Γ しス
2 4 1 9 S V T？ /ノ レノノ /\* 一へ' つ 7 "ή 7 へ ノ 胞子鎮形態 曲状 4- 丄 十 ループ状 + +
胞子表面 平滑 + 4- t t ^ 灰色 4つ- 卞
M^ 不鲜明 + 赤ノ橙色 r p H感受性 ，
十
拡散性色素库生 + 卞
ρ Η咸 ΐ t
卞 +
メラ二 w^1^ 4- スターチの加水分解 + 卞
S肖酸塩の環元 + 4- 1 生育温度 1 0で
3 7で 4- +
4 5で +
炭索源の同化
ァラビノース + + + キジロース + + 1 イノ シ トール +―
マンニッ 卜 +
ラムノース + + ラフィ ノース +一
シュクロース
S . ぺォフスカ スは形態、 ¾面色、 拡散性色素の p H感受性、 炭素 源の同化が異なっている。 従って本菌株は S. ナシビレンシスに最も近 似であるが 「バ一ジエイ氏細菌系統分類学便覧 4巻」 、 （B e r g e y' s Ma n u a l o f S y s t e m a t i c B a c t e r i o l o g y Vo l . 4) の S. 属に関する ウイ リアムス等 （W i l l i a ms、 e t . a 1. ) の記載によれば、 S. ナシビレンシスは、 S. イ ク スホリ ェタス （S. e x f o l i a t u s) のシノ ニム (異名） となっている。 従って、 本菌株 24 1 9— S V T 2は、 S. イ ク スホリエタ スに含ま れる一菌株と同定し、 ス ト レブ トマイ セス イ ク スホ リ エタ ス （S t r e 。 t o m v c e s e x f o 1 i a t u s) 24 1 9— S VT 2株と称す
O o
C S - 7 9の生産は大略一般の発酵生産物を生産する場合に準じ、 各種 の栄養物を含む培地で本菌株を好気的条件下で培養することにより行なう： 培地は主として液体培地を用い、 炭素源としてはグルコース、 廃糖密、 スターチなどを単独または混合して用いる。 窒素源としては肉エキス、 ォ ー ト ミール、 酵母エキス、 大豆粉、 ポリベブトンなどを単独または混合し て用いる。 その他、 本菌株の生育を助け C S— 7 9の生産を促進する有機 物及び無機塩を必要により添加することができる。 消泡剤としては、 アデ 力ノール、 シ リ コ ンなどを用いることができる。
培養方法は振盪培養、 通気攪拌培養などの好気的培養が適しており、 p H 4~8、 24〜 30 で2〜6日間、 望ましくは p H 6〜7、 24〜2 7。Cで 2 ~ 3日間培養する。
この培養により生産された C S— 7 9を単離するには発 S生産物を採取 する一般的な方法に準じて行えばよい。 C S _ 79は隨体中に蓄積される ので、 例えば次の方法が効 ¾的である。
すなわち、 培 ¾終了後、 遠心分離または^過により S体を 、 アセ ト ン などの有機溶媒で溶出する。
次いでこの薩体抽出液を ¾縮後、 酢酸ェチル、 ベンゼン、 ク ロ口ホルム などの非水溶性有機溶媒に転溶し、 これを濃縮してシロップ状とする。 このシロ ップを再度べンゼン、 酢酸ェチル、 アセ ト ン、 メ タノール、 ク n口ホルムなどの有機溶媒に溶解し、 シリカゲルカラムク ロマ トグラフィ ―、 ゲル濾過力ラムク ロマ トグラフィ一及び高速液体力ラムクロマ トグラ フ ィ一に付すことにより本発明化合物を精製単離することができる。
以上の精製法によって得られた C S - 7 9の理化学的性質を以下に示す
( a) 元素分析値：
実測値 （％) C 7 4. 6 6, H 6. 7 9 , N 4. 2 5 理論値 （％) C 7 4. 7 8, H 6. 82, N 4. 1 5 (C2lH23N〗03として計算）
( b) 質量分析値：
高分解能 F A B— MS / z 3 3 8. 1 7 5 7 (M+H) 十 理論値 3 3 8. 1 7 5 6
( c) 分子量： 3 3 7
( d ) 融点： 1 44〜 1 45 °C
( e ) 比旋光度：
着色のため測定不能
( f ) 紫外線吸収スぺク ト ル ：
M e 0 H中
λ nax 2 3 0 nm ( ε = 3 2 2 0 0)
2 6 7 η m ( ε = 2 9 7 0 0 )
4 2 5 η m ( ε = 54 0 0 ) 一
0. 0 1 Ν N a O H— M e O H中
λ nax 24 2 n m ( ε = 3 0 4 0 0)
2 87 n m ( ε = 2 8 0 0 0 )
4 7 0 n m ( ε = 8 1 0 0 )
( g) 赤外線吸収スぺク トル ：
K B r錠中で则定した結 ¾を^ 1図に示す。
( h ) — NMRスぺク 卜 ノレ ：
els— DMS O中、 5 0 0 MH zで则定した結果を第 2図に示す。 ( i ) 13C— NMRスぺク ト ノレ ： ds—DMS O中、 1 2 5 MH zで測定した結果を第 3図に示す。 ( j ) 溶剤に対する溶解性：
DMS 0、 DM Fに易溶
M e OH、 E t OH、 CH C 13、 E t OA cに可溶
n—へキサン、 水に難溶
( k ) 呈色反応：
陽性： H2S 04、 ョード
( 1 ) 塩基性、 酸性、 中性の区別：
図面の簡単な説明
第 1図は K B r錠中で測定した C S— 7 9の赤外線吸収スぺク トルを 示す。
第 2図は d 6— DM S O中、 5 0 0 MH zで測定した C S— 7 9の1 H 一 N M Rスぺク トルを示す。
第 3図は cls— DMS 0中、 1 2 5 MH zで測定した C S - 7 9の13 C 一 N M Rスぺク トルを示す。 発明を実施するための最良の形態
次に、 実施例を挙げて本発明化合物の製造方法を更に詳細に説明する。 実施例
( 1 ) 1 0 0 m l当り、 デキス ト リ ン 2. 5 g、 大豆粉 2. 1 g、 乾燥酵 母 0. 2 g， 炭酸カルシウム 0. 4 gを含む液体培地を 5 0 0 m 1 の三角 フ ラスコに 1 0 0 m l入れ滅菌したのちス ト レプ トマイセス イ ク スホ リ ェタス （S t r e p t omy c e s e x f o l i a t u s ) 24 1 9 S V T 2株を接種し、 2 7°C、 48時間回転培養した。
次に種培地と同じ組成の無菌培地 3 0 Lを入れた 5 0 L容のジャーファ ーメ ンターに、 前培養の終了した上記種培養液 5 0 0 m l を接種し 2 7 、 4 8時間通気攪拌培養した。 培養終了後、 培養液 3 0 Lを上清と菌体に分離した後、 菌体に 1 5 Lの ァセトンを加え抽出した。 ァセ トン抽出液を、 ァセ 卜ン溜去後、 3 Lの酢 酸ェチルで 2回抽出した。 この酢酸ェチル画分を無水硫酸ナ ト リゥムで脱 水後、 濃縮したのち濃縮液に 1 0 0 m 1 の n—へ牛サ ;加え 5. 5 gの黄 色の沈^を得た。
( 2 ) 前項 1で得られた沈殺をクロ口ホルム 1 5 m l に溶解し、 シリカゲ ルを充塡したカラム （容量 5 0 0 m l , 溶媒； ク ロ口ホルム） に吸着させ た。 クロ口ホルム 1 Lで洗浄後、 ク ロ 口ホルム一メタノール （5 0 ： 1 ) の混台溶媒で溶出される区分を除いた。 次いで、 クロ口ホルム—メタノー ノレ （2 0 ： 1 ) の混合溶媒で溶出を行い、 濃縮乾固することにより 2. 2 gの黄色物質を得た P
得られた試料をク ロロホルム一メ タノール （ 1 ： 1 ) で調製したセファ デックス L H— 2 0 (商品名， フアルマシア社製） にてゲル濾過を行い、 活性区分を集めて濃縮乾固し、 黄色粉末として C S— 7 9を 3 0 0 mgを 得た。 産業上の利用可能性
本発明の化合物は、 抗酸化作用及び細胞死抑制作用を有するので脳疾患、 心疾患、 肝疾患及び動脈硬化疾患などに有用である。
この目的のためには、 本発明化合物を慣用的な製剤技術に従って製造さ れる錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 注射剤などの投与型で経口的にあ るいは非経口的に投与することができる。 上記の各製剤においては、 通常 の增 ffi剤、 結台剤、 P H調製剤、 溶解剂、 乳化剤、 懸濁剂などの添加剤を
Hiいることができる。
本発明化合物の治 ¾S 者に対する投与 ·Κは、 ^ の^齢、 疾病の 類お よび状態などにより変 ϋし得るが、 迎' 、 1 曰あたり 1 0〜 1 0 ϋ 0 m g、 好ましくは、 1 0 0〜 5 0 0 m gを 1 〜数回に分けて投与することができ る o
次に試験例を挙げて本発明化合物の抗酸化作用及び細胞死抑制作用の結 果を示す。 試験例 1 (抗酸化作用）
( 1 ) ミ ク ロソ一ムの調製法 '
1 0週令のゥィスター系雄性ラッ トの肝臓をとり、 ホモジナイズ後、 4 °C、 3 0 0 0 r pmで 1 0分間遠心分離しその上清をとつた。 この上清 を 4て、 1 0 0 0 0 r p mで 1 0分間遠心分離し、 上清をとつた。 これ をさらに 4 °C、 3 0 0 00 r p mで 6 0分間遠心分離し、 沈殺画分をとり、 緩衝液 （0. O S S mo l Z l ト リ ス一塩酸、 0. 1 7 4 m 0 1 / 1塩 ィ匕カ リ ウムよりなる。 ρ Η 7 · 4 ) 7 0 m l を加え、 ミ クロソーム液と した。
(2 ) 抗酸化作用測定
ミ ク ロソ一ム液 0. 5 m l、 上記の緩衝液 0. 7 5 m l及びサンプル (本発明化合物の 1 %メタノール溶液） 0. 0 5 m l を混和した後、 L— ァスコルビン酸 （0. 0 0 1 511 0 1 / 1 ) を0. 5 m lカロえ、 3 0 に て 1時間反応させた。 2 0 %ト リク ロ口酢酸 0. 5 m l を添加し反応を 止め、 3 0 0 0 r pmで 1 0分間遠心分離し、 その上清をとつた。 これ に 0. 6 7 %チォバルビツール酸 0. 5 m l を加えた。
1 0 0°Cで 2 0分間反応させたのち、 5 3 0 n mでの吸光度を測定し、 抗酸化作用の指標とした。 C S— 7 9の I C 5B値は 0. 2 2 / Mであつ た。 試験例 2 (脳虛血スナネズミ の海馬 C A 1細胞脱落抑制作用）
" 基礎と臨床" （ 24巻、 NO.4、 -3 δ 9ページ、 1 9 9 0 iV-) に 記戕された方法に従って行った。
体 1E55〜80 gの雄性スナネズミを 1群 8匹とし、 3 ^川いた。 スナ ネズミはェ一テルで麻酔し、 背位に固定した。 キシロカインで局部浸^麻 酔後、 両则総頸勁脈を頸部正中線を切 して露出し、 注意深く近傍の迷走 神経から剝離した。 動脈を動脈瘤ク リ ップで 3分間留め、 その後ク リ ップ をはずし、 皮膚を縫合した。 偽手術群動物は閉塞しないこと以外は同様に 処理した。 エーテル麻酔したスナネズ ミは、 7日後に脳を 1 0 %ホルマリ ン緩衝液で左心室から灌流し、 海馬の領域は 3 〜 4 m mの/?さのスライ ス に冠状に切り出し、 パラフ ィ ン包埋後常法に従って切片'を^成した。 スラ ィ ドはへマ トキシレンとェォジン、 ク レシルバイ ォ レッ トで染色した。 薬物は、 5 %アラ ビアゴムにて懸濁し、 虚血再開放直後腹腔内投与した。 虚血性神経障害は、 0 〜 3の段階に分け評価した。
0 ( -） ：正常神経細胞
1 ( + ) ：数個の神経細胞の障害
( 1つか、 数個の神経細胞の障害）
2 ( + + ) ：多くの神経細胞の障害
3 ( + + + ) ： ほとんどの神経細胞の障害 本スク リーニング系では、 一 （正常神経細胞） 及び + (軽度の神経障害） 台わせて 5 0 %以上の場合は、 神経細胞死保護作用ありと判断している。
【表 3】
用量 神経障害発現率（％)
mg/kg, i . p. ) + + + + + + コ ン ト 口一ノレ 1 ― 100 0 0 0 コ ン ト ロ ーノレ 2 - 0 0 0 100 本願化合物 100 25 37. 5 25 12. 5
コ ン ト ロ ール 1 —頸勁脈を露出させ 3分問結さっさせることなく皮 を縫合した群 コ ン ト ロール 2—頸動脈を露出させ 3分間結さっさせた後皮膚を縫 合した群 細胞保護作用の報告されている N M D A ( N—メチル D—ァパルラ一 ト） 拮抗薬の MK— 8 0 1の結果を記載する。 前記と同様の方法に従って 試験を行った。 MK— 8 0 1は、 生理食塩水に溶解し、 3分間虚血直後に 腹腔内投与した。
【表 4】
用量 神経障害発現率（％)
(mg/kg, i. p. ) + ÷ - J L コ ン ト ロ一ノレ 1 一 100 0 0 0 つ ン ト ロ一ノレ 2 一 0 12.5 25 62.5
MK - 8 0 1 5 0 62.5 12.5 25
MK— 8 0 1 ： (+ ) — 5—メ チルー 1 0 , 1 1 —ジヒ ドロー 5 H— ジ ベ ンゾ [ a , d ] シク ロヘプテ ン一 5 , 1 0—ィ ミ ン 以上の結果より本願化台物である C S— 7 9は、 M K— 8 0 しょり強'、' 作用を示した。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 式
H3C
Figure imgf000015_0001
で表される化合物 c
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