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WO1995000639A1 - Fragment d'adn de clostridium bifermentans portant les genes codant pour des proteines associees a une activite insecticide - Google Patents

Fragment d'adn de clostridium bifermentans portant les genes codant pour des proteines associees a une activite insecticide Download PDF

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Publication number
WO1995000639A1
WO1995000639A1 PCT/FR1994/000768 FR9400768W WO9500639A1 WO 1995000639 A1 WO1995000639 A1 WO 1995000639A1 FR 9400768 W FR9400768 W FR 9400768W WO 9500639 A1 WO9500639 A1 WO 9500639A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fragment
protein
sequence
polypeptide
nucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1994/000768
Other languages
English (en)
Inventor
Luc Nicolas
Jean-François CHARLES
Armelle Delecluse
Frédérique BARLOY
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Pasteur
Original Assignee
Institut Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur filed Critical Institut Pasteur
Priority to CA002166124A priority Critical patent/CA2166124A1/fr
Priority to EP94920513A priority patent/EP0705337A1/fr
Priority to US08/569,166 priority patent/US5830722A/en
Priority to JP7502527A priority patent/JPH08511686A/ja
Publication of WO1995000639A1 publication Critical patent/WO1995000639A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins

Definitions

  • the invention relates to new toxins isolated from a strain of anaerobic bacteria of the species Clostridium bifermentans.
  • the CH18 strain of Clostridium bifermentans serovar alaysia (Cbir, has been described by H. de Barjac and M. Sebald, in C.R. Acad. Sci. Paris t. 310, Series III, p. 383-387, 1990.
  • the inventors have demonstrated in a bacterium of the species Clostridium bifermentans, the existence of larvicidal activity.
  • the invention provides for the first time toxins present in anaerobic bacteria, capable of having an activity toxic and in particular larvicide towards arthropods, and in particular Diptera type insects.
  • the Clostridium bifermentans seromen malaysia strain used is harmless vis-à-vis the mammals and fish tested as well as vis-à-vis all aquatic organisms apart from the natural target of the larvicidal activity of Cb (Thiery and al. (1992) J. econ. Entomol. 85 (5), 1618-1623).
  • the subject of the invention is therefore nucleotide sequences coding for polypeptides capable of participating in the toxic activity vis-à-vis arthropod larvae and in particular insects, in particular Diptera such as mosquitoes or black flies.
  • the invention also relates to these polypeptides as well as to recombinant cells containing the nucleotide sequences and the nucleotide fragments of the invention, under conditions allowing their expression.
  • antibodies recognizing the polypeptides of the invention as well as compositions with larvicidal activity.
  • oligonucleotide probe 18A TGT GAA GTI AAT TGT GA
  • oligonucleotide probe 16A TGT CAT ATI GAA GCI GTI AAT GAA GG
  • probes 66A ATG AAT ACI AAT ATI TTT TCI ACI AA
  • 66B TC IGG TTC ICC ATA IAT CCA TTC ATC
  • This "target” is generally an arthropod and more particularly an insect, in particular of the Diptera family and for example, a mosquito or blackfly larva.
  • a nucleotide sequence codes for a protein or a polypeptide having the capacity to participate in the toxic activity of the expression products of the 7 kb Xbal fragment contained in the plasmid pCBM1 deposited at the CNCM under the n ° 1-1317, since the deletion or the alteration of this sequence within the said plasmid leads to a reduction or a suppression of the toxic activity with regard to Diptera larvae and in particular of mosquito or blackfly larvae, observed when this plasmid is introduced into a recombinant cell which does not naturally have larvicidal activity, for example a Clostridium bifermentans cell.
  • Other recombinant cells such as those described by Delécluse A. et al (1988) Mol. Gen. Broom. 214: 42-47) can be implemented.
  • the toxic activity can be evaluated by measuring the LC 50 (lethal dose for 50% of the insects or more generally of the "target" on which we want to evaluate the toxic activity).
  • a nucleotide sequence according to the invention can code for a protein, a polypeptide or a peptide necessary for the induction of larvicidal activity or / and can code for a protein, a polypeptide or a peptide influencing the level of expression of the toxicity vis-à-vis a given target.
  • tests carried out with recombinant cells naturally lacking larvicidal activity, transformed by the plasmid pCBM1 under conditions allowing the expression of the genes contained in the inserted DNA fragment can be used as a basis comparison for testing the larvicidal activity of proteins or parts of proteins expressed by a nucleotide sequence according to the invention.
  • protein denotes within the scope of the application, any amino acid sequence, this sequence being able, moreover, to be modified by groups of a non-protein nature.
  • polypeptides may be grouped together in the expression "polypeptides”.
  • a particular nucleotide sequence is characterized in that it hybridizes with the four probes 16A, 18A, 66A and 66B, under stringent conditions.
  • the stringent conditions which are discussed here, are described in detail in the experimental part of the present application.
  • a particular sequence is characterized in that it hybridizes with the four probes 16A, 18A, 66A and 66B, under non-stringent conditions (less stringent compared to the conditions given below in title of stringent conditions).
  • the invention relates in particular to the nucleotide sequence characterized in that it is the 7 kb Xbal fragment of the plasmid pCMBl deposited at the CNCM under the number 1-1317.
  • the invention relates to a nucleotide sequence chosen from the sequences designated by the expressions Seql, Seq2.1, Seq2.2 or Seq3, represented in FIG. 6.
  • the invention also relates to a nucleotide sequence characterized in that it hybridizes with one of the sequences previously described, in that it is present in the DNA of a bacterium of the species Clostridium bifermentans, and in that '' It encodes a protein, polypeptide or peptide with the ability to participate in toxic activity against Diptera larvae and in particular against Mosquito or Blackfly larvae.
  • nucleotide sequences of the invention can be isolated for example from anaerobic bacteria of the Clostridium bifermentans species and in particular from the Clostridium bifermentans malaysia strain. They can also be synthesized chemically according to conventional techniques.
  • nucleotide sequences can be constituted by single or double stranded DNA, by cDNA or even by RNA.
  • the subject of the invention is also, according to a particular embodiment, a nucleotide sequence characterized in that it contains fragments coding for the following amino acid sequences: MNTNIFSTNL and / or for NNDEIYGEPDSSNI and / or for MNN (X) CEVNCE (X) T and / or for NASLGK and / or for FEL and / or for QVK and / or for ENTASGTE and / or for IEYHNNLR and / or for
  • the identification of amino acid sequences is carried out using the letter code for the designation of amino acids.
  • the invention also relates to a nucleotide fragment contained in one of the sequences defined above, characterized by the following properties:
  • a preferred nucleotide fragment coding for a 66 kDa protein is characterized in that it contains a sequence coding for the amino acid chain MNTNIFSTNL at its NH 2 -terminal end, and a sequence coding for the chain of amino acids NNDEIYGEPDSSNI as internal fragment.
  • nucleotide fragment according to the invention contained in one of the previously defined sequences, is characterized by the following properties:
  • Pi6 protein having a molecular weight of approximately 16 kDa.
  • a preferred fragment coding for a protein having a molecular weight of approximately 16 kDa is further characterized in that it contains a sequence coding for the chain of amino acids AY (R) QVKFHIEAVNEGLKI at its NH end. 2 -terminale and a sequence coding for the chain of amino acids DIPISPEDISK as an internal fragment.
  • nucleotide fragment according to the invention contained in one of the preceding sequences is characterized in that it codes for a P20 protein having a molecular weight of approximately 20 kDa, precursor of the P16 protein, P20 being synthesized during the sporulation phase of bacteria of the species C. bifermentans, in particular of Cbm.
  • the subject of the invention is also a fragment of nucleotides contained in one of the preceding sequences, characterized by the following properties:
  • Such a fragment can preferably be characterized in that it codes for a protein having a molecular weight of approximately 18 kDa and in that it contains a sequence coding for 1 • amino acid chain MNN (X) CEVNCE (X) has its NH 2 -terminal end and sequences coding for the amino acid sequences of NASL T-.WGK, FEL, QVK, ENTASGTE, and IEYHNNLR as internal fragments.
  • vectors characterized in that they contain a nucleotide sequence or a nucleotide fragment corresponding to the preceding definitions, this sequence or this fragment being inserted at a site which is not essential for the replication of the vector.
  • these vectors are plasmids.
  • a particular vector is characterized in that it is the plasmid pCBM1 deposited at the CNCM under the number "1-1317.
  • Another recombinant vector according to the invention is the plasmid pHT316 resulting from the introduction into the plasmid pHT315 (Arantes and Lereclus, 1991, Gene, 108: 115-119), of a 0.5 kb BamHI-EcoRI fragment (Nicolas et al (1993) FEMS Microbiol. Letter 106, 275-280) containing the promoter of the cytolysin of B_ ⁇ thurinqiensis (ard and Ellar, 1986, J. Mol. Biol., 191: 1-11).
  • This vector can be modified by the sequence Cbm.
  • the plasmid pHT316 advantageously allows the overproduction in Bt, of Cbm proteins, toxic towards insects.
  • a subject of the invention is also recombinant prokaryotic or eukaryotic host cells, characterized in that they contain a sequence or a fragment corresponding to one of the definitions given above, or else a vector of the invention under conditions allowing the cloning and / or expression of said sequence or of said fragment.
  • a particular host can be a bacterial cell, for example a strain of Clostridium bifermentans, a strain of Bacillus thurinqiensis or a strain of Bacillus sphaericus.
  • Another cell according to the invention can be a eukaryotic cell, for example a plant cell.
  • the subject of the invention is also a polypeptide or a composition of polypeptides, characterized in that it is encoded by a nucleotide sequence or a fragment of nucleotides defined above.
  • a particular polypeptide according to the invention is involved in a larvicidal activity with regard to Diptera larvae, in particular of Mosquitoes or Simulia, and is characterized by the following properties: - it is characteristic of an anaerobic bacterium of the species Clostridium bifermentans;
  • polypeptides of the invention comprise in particular a first protein characterized in that it has a molecular weight of approximately 16 kDa and in that it is the product of the expression in a recombinant cell of a fragment of nucleotide hybridizing with oligonucleotide 16A under stringent conditions, this fragment being contained in the Nsil-Xbal sequence of the Xbal fragment contained in the plasmid pCMB1 deposited at the CNCM under the number 1-1317.
  • Another protein of the invention is characterized in that it has a molecular weight of approximately 18 kDa and in that it is the product of the expression in a recombinant cell of a fragment of - nucleotides hybridizing with Oligonucleotide 18A under stringent conditions, this fragment being contained in the EcoRI-Xbal sequence of the Xbal fragment contained in the plasmid pCMB1 deposited at the CNCM under the number 1-1317 and described in FIG. 4A.
  • a third protein according to the invention is characterized in that it has a molecular weight of approximately 66 kDa and in that it is the product of the expression in a recombinant cell of a nucleotide fragment hybridizing with 1 ' oligonucleotide 66A and / or 66B under stringent conditions, this fragment being contained in the Xbal-EcoRI sequence of the Xbal fragment contained in the plasmid pCMB1 deposited at the CNCM under the number 1-1317.
  • the invention also relates to polypeptide fragments of the proteins P16, P18 or P66, or any fragment as obtained from the proteins previously defined when it is involved in larvicidal activity against Diptera larvae, especially mosquitoes or black flies.
  • Another sequence of interest is the amino acid sequence corresponding to the cbmll gene as shown in Figure 6-
  • a polypeptide of the invention is characterized in that it is recognized by antibodies directed against the P16 protein and / or by antibodies directed against the P18 protein and / or by antibodies to the P66 protein.
  • polypeptides of the invention are for example polypeptides comprising an amino acid sequence encoded by one of the sequences Seql, Seq2.1, Seq2.2 or Seq3 and recognized respectively by anti-P66 protein antibodies for the polypeptide comprising at least one of the Seql, Seq2.1 or seq2.2 sequences and with anti-P16 protein or anti-P18 protein antibodies for the polypeptide comprising the Seq3 sequence.
  • the application also relates to a polypeptide characterized in that it is modified by addition, deletion, substitution of amino acids since it retains the capacity of the corresponding unmodified polypeptide to intervene in the toxic activity with respect to Diptera larvae, in particular mosquitoes or black flies.
  • the present application also relates to polypeptide compositions characterized in that they comprise for example the P16 protein and the P18 protein or in that they comprise the P16, P18 and P66 proteins.
  • proteins are preferably in purified form, if necessary co-purified, either after isolation from a strain, either after expression in a recombinant cell host.
  • the invention also relates to a protein extract having a larvicidal activity vis-à-vis the larvae of Diptera, in particular of mosquitoes or black flies as obtained by:
  • composition of polypeptides according to the invention can also be characterized in that it has the larvicidal activity of a crude extract as defined above.
  • the present application also relates to monoclonal antibodies directed against a protein according to the definitions given above.
  • It also relates to a polyclonal antiserum characterized in that it is directed against a protein of the invention or against a composition of these proteins or against an extract as described above.
  • nucleotide sequences or fragments thereof according to 1 • invention also allow the preparation of nucleotide probes obtained by classification according to the conventional techniques fragments or sequences described above.
  • compositions with larvicidal activity comprising, as active principle, one or more polypeptides according to any one of the definitions given above.
  • Other compositions with larvicidal activity according to the invention can also be characterized in that they comprise, as active principle, recombinant cells corresponding to the definitions given above.
  • compositions can also comprise recombinant cells modified by sequences coding for one or more polypeptides with larvicidal activity of B. thurinqiensis and / or of B. sphaericus.
  • Figures 1 to 3 Immunological relationships, distribution and kinetics of synthesis of P66, P18 and P16.
  • Figure 1 SDS-PAGE of the toxic Cbm extract. The molecular weights of standard proteins are indicated in the right margin (in kDa).
  • Figure 2 Detection of proteins P66, P18 and P16 in Cbm and in non-toxic strains of C. bifermentans. 100 ⁇ l samples of spore-forming cultures were subjected to polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), transferred to a nitrocellulose membrane and subjected to immunodetection with affinity purified IgG directed against P66 (A66), P18 ( A18) or P16 (A16). Well a, ⁇ Jb; well b, strain ATCC 638; well c, strain 744-83; well d, strain VPI 4407; well e, strain VPI 4413A.
  • Figure 3 Synthetic kinetics of P66, P18 and P16 during the sporulation of Cbm, at 34 "C (high) or at 42 ° C
  • P66 A66
  • P18 A18
  • P16 A16
  • Culture time in hours a, 4.5; b, 6 (corresponding to the sporulation t 0 ); c, 7.5; d, 9; e, 10.5; f, 13; g, 30.
  • the molecular weights of standard proteins are indicated in the margin (in kDa).
  • Figures 4A and 4B Structure of the plasmid pCBM1 and restriction map of the Xbal fragment.
  • Fragment Xbal Bg: BqlII; N: Nsil; P: PvuII; A:
  • H HindIII
  • S SphI
  • Ps PstI
  • Sal -.Sali
  • Bm
  • Xbal are fragments of the vector plasmid pHT304
  • the fragments on which the oligonucleotide probes hybridize are shown in hatched lines, under the Xbal fragment.
  • the arrow corresponds to the 5 ′ end of the P16 gene hybridizing with the 16A probe.
  • Figure 5 Location of the oligonucleotides used for the sequencing of the sequences read.
  • 16A ' complementary 16 A:: ace cat tgt cta tat gc
  • 16B ' complementary 16 B' * : ceg ata tet cet gaa ga 18 B * : oligo 18 B not degenerate: tct gta ccg gaa gca gt
  • 18 B ' complementary 18 b * : gct tcc ggt aca gaa gg
  • Figure 6 Sequences of nucleotides read.
  • 6C and 6D Seq.2.2, read with the primers 66B, 66D-A and
  • 6H and 6J SEq4, read with the universal primer R-40.
  • Figure 7 Amino acid sequence corresponding to the Cbmll gene and localization of the NH 2 -terminal and internal sequences of the proteins P18 and P16.
  • Figure 8 Location of copies of cbm 11 on the Xbal fragment.
  • Figure 9A and 9B Location of the Xbal fragment on the resident plasmid.
  • Line 1 CCC size marker from 16 to 2.06 Kb
  • Line 1 E. coli + pHT 304 (shuttle vector used)
  • Line 2 E. coli + pCBM 1 Probe used: total anti Cbm antibody.
  • Figures 11A, 11B and 11C Sequence homologies found between the protein Cbm 11 and the proteins described in the Swissprot database.
  • An extract was prepared from a Cbm culture carried out at 34 ° C. anaerobically in TYG medium (based on Biotrypcase 3%, yeast extract 2%, glucose 0.5 to 1%, cysteine hydrochloride 0, 05%) in a fermenter with a capacity of 6 liters, in the presence of a gas stream containing 5% H 2 , 5% C0 2 and 90% N 2 .
  • the sporulating bacterial culture was harvested after 16 h, at the end of the sporulation phase. The culture was then washed with 1M NaCl, rinsed twice with 20 mM Tris HCl, 5 mM EDTA, pH8 (TE buffer) and -reserved at -70 ° C until use.
  • the frozen pellets were thawed resuspended in a TE buffer treated in a sonicator for a total duration of l minute including a real time of sonication of 15 seconds on the ice (Branson sonicator, large probe, 40% output scale, duration of the cycle sonication ("duty cycle": 25%) and centrifuged at 5000 g for 15 min. The resulting supernatant (corresponding to the crude protein extract) was collected.
  • the protein concentration of the extract was determined using the Biorad protein test with bovine serum albumin as standard. Electrophoresis on polyacrylamide gel was carried out according to the technique of Laemmli, UK (1970) (Nature 227, 680-685) on 13% polyacrylamide gels.
  • the molecular weight markers used in this Analysis of proteins by SDS-PAGE under denaturing conditions are those of the Pharmacia protein electrophoresis kit (LMW Ref. 17-0446-01), containing the following proteins: phosphorylase B (of molecular mass 94,000 daltons), albumin (67,000) , ovalbumin (43,000), anhydrase (30,000) tryptic inhibitor (20,100) and alpha lactalbumin (14,000).
  • Polyclonal antisera against the crude Cbm protein extract were obtained in rabbits after two series of 10 to 15 intradermal microinjections of 500 ⁇ g of proteins emulsified in the complete Freund's adjuvant, 3 weeks apart. The rabbits received subcutaneous injections of a booster dose without adjuvant from Freund, 3 weeks later.
  • the IgGs were purified from the sera by precipitation with ammonium sulphate and chromatography on a DEAE-52 column (What ann) and then stored at 4 ° C.
  • Polyclonal antisera against the individualized denatured polypeptides P66, P18 and P16 were produced in rabbits as follows: the three proteins were separated by SDS-PAGE preparative electrophoresis and detected with 1M KC1. The strips were cut on the gels and the cut acrylamide strips were rinsed with 1 • deionized water, then immersed in water, emulsified with complete Freund's adjuvant and injected into the rabbits according to the technique described above. . After recovery of the antisera, the IgGs were purified by affinity on nitrocellulose bands containing the polypeptide used for injection into rabbits, according to the technique of Burke et al (1982). EMBO J. 1, 1621-1628. Enzymatic hydrolysis of Cbm extract
  • the larvicidal activity was tested on larvae of Anopheles stephensi at the third larval stage.
  • the capacity of the different antisera to inhibit the larvicidal activity of the extract was tested according to the following method: serial dilutions of the extract were incubated with a fixed volume of anti-extract IgG in a TE buffer. 20 ⁇ C for 1 hour. The toxicity of the untreated samples and control samples was tested using larvae of A. stephensi. Neutralization tests have been also carried out under the same conditions with the antisera or the antibodies purified by affinity, directed against the denatured proteins P66, P18 or P16. The proteins were immunoprecipitated from the extract with the antisera directed against the extract or against the individual proteins P66, P18 or P16 denatured by the technique of Howe et al, ((1982). Mol. Gen. Genet. 186 , 525-530), using Protein A Sepharose (Sigma) beads as carriers.
  • P66, P18 and P16 were detected with affinity purified IgG directed against each protein (A66, A18 and A16) and visualized with a detection system in Western blot ECL ® (Amersham).
  • the cultures were carried out at 34 ° C. and 42 ° C. in flasks in which a gas exchange was possible.
  • Samples of bacterial culture or protein extracts were tested on 20 larvae of Culex pipiens in the fourth larval stage and / or of A. stephensi in the third larval stage in plastic petri dishes with a capacity of 6 ml. Mortalities were recorded after 24 h and 48 h of exposure.
  • a crude extract of Cbm was tested with antisera directed against the crystals of B. thurinqiensis serovar israelensis 1884, B. thurinqiensis serovar aizawai 7.29, B. thurinqiensis serovar thurinqiensis 1715 and B. thurinqiensis serovar entomocidus HD9, as well as antisera HD9 crystal proteins of 42 and 51 kDa from B. sphaericus 2362.
  • the Cbm extract contained three major proteins with apparent molecular weights 66, 18 and 16 kDa, designated by the abbreviations P66, P18 and P16, as well as various minor components of a protein nature (Figs. 1 to 3). 1. Characterization of the proteins P66, P18 and P16
  • the extract obtained is toxic to the larvae of the Culex pipiens mosquitoes, Anopheles stephensi and Aedes aegypti.
  • P66, P18 and P16 are the main components of the toxic extracts of Cbm.
  • P66, P18 or P16 are not immunologically related ( Figure 2, lines a). P18 and P16 were only present in Cbm whereas a 66 kDa protein immunologically related to P66 from Cbm was detected in 4 non-entomopathogenic C. bifermentans strains tested ( Figure 2, lines b to e).
  • P18 and P16 in a culture carried out at 34 ° C. was concomitant with the sporulation of Cbm (FIG. 3) and the appearance of larvicidal activity.
  • P16 was synthesized in the form of a 20 kDa precursor (P20), gradually converted into a 16 kDa polypeptide during cell lysis (Fig. 3).
  • P18 and P20 / P16 are not detected immunologically in strains of C. bifermentans lacking larvicidal activity (Fig 2).
  • P18 and P20 / P16 are very weakly detected in Cbm cultured at 42 ° C, under conditions where the bacteria is not toxic (Fig 3).
  • P66 was detected in Cbm cells during the vegetative stage and during sporulation. In sporulating cells, other polypeptides immunologically related to P66 were detected, ranging from 25 to 66 kDa ( Figure 3); these polypeptides could be degradation products of P66.
  • IgG directed against denatured P66, P18 and / or P16 proteins did not neutralize the toxicity; on the other hand, antibodies against the crude fraction of the extract neutralized the toxicity. It is conceivable that IgG directed against denatured proteins were able to recognize the P66-P18-P16 complex, but did not recognize epitopes or domains involved in larvicidal activity.
  • Partial amino acid sequences of P66, P18 and PI6 were determined by microsequencing.
  • Amino acid sequences of proteins P66, P18 and PI6 These sequences were obtained by microsequencing, according to techniques commonly practiced by microsequencing laboratories. For each protein, i) the NH 2 -terminal sequences were produced and ii) one or more sequences of internal fragments obtained by tryptic hydrolysis of the protein. The sequences were determined with an Applied Biosystems 470 sequencer, from the proteins separated on SDS-PAGE and transferred to the membrane of PVDF Immobilon (Millipore).
  • the oligonucleotide probes were made from the underlined sequences
  • MNTNIFSTN 66A ATG AAT ACI AAT ATI
  • TTT TCI ACI AA (26mer) P66, internal DEWIYGEPD 66B * TC IGG TTC ICC ATA IAT CCA TTC ATC (26mer)
  • oligonucleotide probes were synthesized and used to screen a total DNA library of Cbm hydrolyzed by the enzyme Xbal, constructed in the shuttle plasmid pHT304 (Arantès & Lereclus, Gene. 1991. 108: 115-119 ).
  • a DNA library was constructed in a shuttle vector pHT304, constructed by O. Arantès and D. Lereclus, from a resident plasmid of B. thurinqiensis pHT 1030 and pUC19, capable of replicating in E. coli and in gram positive bacteria.
  • the total DNA of Cbm was hydrolyzed by Xbal, transferred to Hybond N + membrane (Amersham) after electrophoresis on agarose gel, and hybridized with each of the synthesized probes, labeled at the 3 ′ end with fluorescein ("ECL kit TM 3 * oligolabeling and detection Systems ", Amersham) according to the protocol recommended by the supplier under the following hybridization and stringency conditions:
  • Hybridization temperature 42 ° C, 15h, in a HYBAID hybridization oven (Cera-Labo) with 5-10 ng of probes / ml. Washes after hybridization: 2 times 5 minutes at room temperature in 5 x SSC, 0.1% SDS, then 2 times 15 minutes in 1 x SSC, 0.1% SDS.
  • the genomic DNA library of Cbm constructed in E. coli strain TG1 was screened by hybridization in colonies with the oligonucleotide 16A labeled at the 3 * end with fluorescein (ECL system 3 'oligolabeling Amersham). The screening made it possible to isolate a recombinant plasmid pCBM1 hybridizing with the oligonucleotide 16A but also with the oligonucleotides 66A, 66B and 18A.
  • a single 7 kb band was detected on the DNA hydrolyzed by Xbal by the probe corresponding to the NH2 terminal end of P16 (probe 16A). A weak reaction was also detected on this fragment with probes 18A and 66A.
  • the library was therefore constructed in E. coli TG1 with Xbal DNA fragments of around 7.5 kb size eluted on Prep-A-Gene (Biorad). Screening of the library (400 clones) by hybridization of the colonies on a Hybond N + filter with oligonucleotide 16A revealed 10 positive clones (same stringency conditions as described above). Analysis of the 10 recombinant plasmids by several restriction enzymes showed that they were all similar. One of the plasmids (pCBMl, 13.5 kb) was selected.
  • the plasmid pCBM1 has a size of 13.5 kb and therefore results from the insertion of an Xbal fragment of Cbm DNA of 7 kb at the Xbal cloning site of pHT304 (6.5 kb).
  • the regions with which the probes mentioned above hybridize were determined by Southern blot on the plasmid pCBM1 hydrolyzed by different restriction enzymes for the 4 probes.
  • the PCR technique using as primers the universal primer and the oligonucleotide 16A made it possible to locate the hybridization region from 16A to 2 kb from the 3 'end of the Xbal fragment (FIG. 4A).
  • the PCR was carried out using Taq polymerase and as primers, the oligonucleotide 16A and the universal primer (M13 universal sequehcing primer Pharmacia) and as template the plasmid pCBMl, with the following cycle:
  • the sequencing strategy used was that of "walking on the fragment".
  • the sequence was carried out according to the Sanger technique (Sanger, et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467) on the plasmid pCBM1 made single strand by denaturation with sodium hydroxide.
  • the extension was carried out using universal primers, reverse primers, or oligonucleotides corresponding to the sequences deduced from the amino acid sequences of the proteins P66, P18 and P16 or the nucleotide sequences read. All of the oligonucleotides used and their location on the DNA fragment are represented in FIG. 5.
  • the determination of the restriction sites contained in the sequence of the gene coding for the 66 kDa protein made it possible to precisely locate the position of the start of the 66kDa gene on the Xbal fragment; approximately 95% of the gene is present on the cloned fragment.
  • the 16 kDa protein would in fact be a protein with a calculated molecular mass of 8.9 kDa; it could result from the 11 kDa protein by cleavage of the 17 amino acids NH 2 -terminals.
  • Hybridization experiments were carried out in parallel on the plasmid DNA and the total DNA of Cbm using as probe the Xbal fragment of 7 kb; these experiments were carried out using the technique "Direct nucleic acid labeling system" ECL (Amersham) of cold probes, according to the indications of the supplier. The results obtained made it possible to locate this fragment on a resident plasmid of approximately 13 kb (FIGS. 9A and 9B).
  • the study of the expression of the cloned genes in the plasmid pCBM1 was carried out in E. coli by immunodetection using cold probes.
  • the extracts of E. coli were prepared in the following manner: the clones TG1 (pHT304) and TG1 (pCBMl) were cultured in LB medium. This experience brought evidence the synthesis in this recombinant of a unique 20 kDa protein reacting specifically with the anti-protein 18 kDa antibody ( Figure 10). No product corresponding to the expression of the 66 kDa gene could be viewed.

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Abstract

L'invention a pour objet une séquence nucléotidique caractérisée par les propriétés suivantes: elle comprend tout ou partie du fragment d'AND XbaI de 7 kb représenté à la figure 4A, tel qu'obtenu à partir du plasmide pCBM1 déposé à la CNCM le 15 juin 1993 sous le No. I-1317; elle hybride avec la sonde oligonucléotidique 18A (TGT GAA GTI AAT TGT GA) et/ou avec la sonde oligonucléotique 16A (TTT CAT ATI GAA GCI GTI AAT GAA GG) et/ou avec au moins l'une des sondes 66A (ATG AAT ACI AAT ATI TTT TCI ACI AA) ou 66B (TC IGG TTC ICC ATA IAT CCA TTC ATC) dans des conditions stringentes; elle code pour une protéine, un polypeptide ou un peptide ayant la capacité de participer à l'activité toxique des produits d'expression du fragment XbaI de 7 kb vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier de larves de Moustiques ou de Simulies. Elle vise aussi les polypeptides codés par cette séquence et leur utilisation dans des compositions larvicides.

Description

FRAGMENT D'ADN DE CLOSTRIDIUM BIFERMENTANS PORTANT LES GENES CODANT POUR DES PROTEINES ASSOCIEES A UNE ACTIVITE INSECTICIDE.
L'invention est relative à de nouvelles toxines isolées à partir d'une souche de bactérie anaérobie de l'espèce Clostridium bifermentans. La souche CH18 de Clostridium bifermentans serovar alaysia (Cbir , a été décrite par H. de Barjac et M. Sebald, dans C.R. Acad. Sci. Paris t. 310, Série III, p. 383-387, 1990.
Elle présente une activité toxique pendant la phase de sporulation par l'intermédiaire de toxines ayant un pouvoir larvicide vis-à-vis de larves d'arthropodes, en particulier d'insectes et notamment vis-à-vis de larves de Diptères, par exemple de larves de Moustiques ou de Simulies. Ces Diptères particuliers sont vecteurs de maladies ou provoquent des nuisances.
Jusqu'à présent, on connaissait les toxines spécifiques de bactéries de l'espèce Bacillus thuringiensis ou de 1'espèce Bacillus sphaericus pour leur activité entomopathoqène et notamment leur activité toxique, vis-à-vis de larves de moustiques (Nicolas (1992). Pes. agropec. bras., Brasilia, abr. 1992, 27, 37-46). En dépit de l'intérêt manifeste de ces toxines de Bacillus pour lutter contre les insectes et notamment les larves d'insectes, la recherche de nouvelles toxines actives vis-à-vis de certains insectes, s'avérait importante notamment dans le but d'offrir des moyens pour lutter contre le risque de développement d'une résistance vis-à-vis de ces produits à activité larvicide. Dans ce contexte, les inventeurs ont mis en évidence chez une bactérie de 1'espèce Clostridium bifermentans, 1'existence d'une activité larvicide. A cet égard, l'invention propose pour la première fois des toxines présentes chez des bactéries anaérobies, susceptibles d'avoir une activité toxique et en particulier larvicide vis-à-vis d'arthropodes, et en particulier d'insectes de type Diptère. La souche de Clostridium bifermentans serovariété malaysia utilisée présente une inocuité vis-à-vis des mammifères et des poissons testés ainsi que vis-à-vis de tous les organismes aquatiques en dehors de la cible naturelle de l'activité larvicide de Cb (Thiery et al. (1992) J.econ.Entomol. 85(5), 1618-1623). L'existence de l'activité larvicide de Cbm a déjà été observée et associée dans l'art antérieur avec les cellules sporulantes (Charles et al. (1990) Res. Microbiol. 141, 721d-733) . Il a également été noté que cette activité diminue très fortement après la lyse cellulaire en raison de 1'inactivation par des protéases cellulaires (Nicolas et al (1990). Appl. Microbiol. Biotechnol. 34, 36-41).
L'invention a donc pour objet des séquences nucléotidiques codant pour des polypeptides susceptibles de participer à l'activité toxique vis-à- vis de larves d'arthropodes et en particulier d'insectes, notamment de Diptères tels que les Moustiques ou les Simulies.
L'invention vise également ces polypeptides ainsi que des cellules recombinantes contenant les séquences nucléotidiques et les fragments de nucléotides de l'invention, dans des conditions permettant leur expression.
Entrent également dans le cadre de la présente demande, des anticorps reconnaissant les polypeptides de l'invention, ainsi que des compositions à activité larvicide.
Une séquence nucléotidique de 1*invention est caractérisée par les propriétés suivantes :
- elle comprend tout ou partie du fragment d'ADN Xbal de 7 kb représenté à la figure 4A, tel qu'obtenu à partir du plasmide pCBMl déposé à la CNCM le 15 Juin 1993 sous le n° 1-1317 ;
- elle hybride avec la sonde oligonucléotidique 18A (TGT GAA GTI AAT TGT GA) et/ou avec la sonde oligonucléotique 16A (TTT CAT ATI GAA GCI GTI AAT GAA GG) et/ou avec au moins l'une des sondes 66A (ATG AAT ACI AAT ATI TTT TCI ACI AA) ou 66B (TC IGG TTC ICC ATA IAT CCA TTC ATC) dans- des conditions stringentes décrites dans la partie expérimentale ;
- elle code pour une protéine, un polypeptide ou un peptide ayant la capacité de participer à 1'activité toxique des produits d'expression du fragment Xbal de 7 kb vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier de larves de Moustiques ou de Simulies.
On définit l'activité toxique dans le cadre de l'invention, par rapport à la "cible" sur laquelle on veut obtenir cette activité. Cette "cible" est de façon générale un arthropode et plus particulièrement un insecte, notamment de la famille des Diptères et par exemple, une larve de Moustique ou Simulie.
On considérera dans le cadre de l'invention qu'une séquence de nucléotides code pour une protéine ou un polypeptide ayant la capacité de participer à l'activité toxique des produits d'expression du fragment Xbal de 7 kb contenu dans le plasmide pCBMl déposé à la CNCM sous le n° 1-1317, dès lors que la délétion ou 1'altération de cette séquence au sein dudit plasmide entraine une diminution ou une suppression de l'activité toxique vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier de larves de Moustiques ou de Simulies, constatée lorsque ce plasmide est introduit dans une cellule recombinante n'ayant pas naturellement d'activité larvicide, par exemple une cellule de Clostridium bifermentans. D'autres cellules recombinantes, telles que celles décrites par Delécluse A. et al (1988) Mol. Gen. Genêt. 214:42-47) peuvent être mises en oeuvre.
L'indication relative à l'activité toxique vis-à- vis des larves de Diptères ne doit en aucune façon être considérée comme restrictive s'agissant du spectre d'action, des moyens de l'invention. Elle constitue uniquement une référence pour 1•évaluation de l'activité des produits de l'invention.
L'activité toxique peut être évaluée en mesurant la LC50 (dose léthale pour 50% des insectes ou plus généralement de la "cible" sur laquelle on veut évaluer 1'activité toxique) .
Différents tests ont déjà été proposés dans l'art antérieur pour détecter 1'activité larvicide de souches de bactéries susceptibles de produire des toxines. A cet égard, on pourra se reporter à la publication de Thiery, I. et al. (1992) Journal of American Mosquito Control Association, vol. 8, nβ 3, 272-276.
Dans le cadre de la définition donnée ci-dessus, une séquence nucléotidique selon 1'invention peut coder pour une protéine, un polypeptide ou un peptide nécessaire à l'induction de l'activité larvicide ou/et peut coder pour une protéine, un polypeptide ou un peptide influençant le niveau de l'expression de la toxicité vis-à-vis d'une cible donnée. Comme on l'a dit précédemment, des tests effectués avec des cellules recombinantes naturellement dépourvues d'activité larvicide, transformées par le plasmide pCBMl dans des conditions permettant l'expression des gènes contenus dans le fragment d'ADN inséré, peuvent être utilisés comme base de comparaison pour tester l'activité larvicide de protéines ou parties de protéines exprimées par une séquence nucléotidique selon l'invention. Les termes "protéine", "polypeptide" et "peptide" désignent dans le cadre de la demande, toute séquence d'acides aminés, cette séquence pouvant en outre être modifiée par des groupements de nature non protéique. Pour faciliter la rédaction, ces protéines, polypeptides et peptides pourront être regroupés dans 1'expression "polypeptides".
Selon un mode de- réalisation avantageux de l'invention, une séquence nucléotidique particulière est caractérisée en ce qu'elle hybride avec les quatre sondes 16A, 18A, 66A et 66B, dans des conditions stringentes. Les conditions stringentes dont il est question ici, sont décrites dans le détail dans la partie expérimentale de la présente demande.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, une séquence particulière est caractérisée en ce qu'elle hybride avec les quatre sondes 16A, 18A, 66A et 66B, dans des conditions non stringentes (moins stringentes par rapport aux conditions données plus loin au titre des conditions stringentes) .
L'invention concerne en particulier la séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'il s'agit du fragment Xbal de 7 kb du plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le n° 1-1317.
Selon un mode de réalisation particulier, l'invention a pour objet une séquence de nucléotides choisie parmi les enchaînements désignés par les expressions Seql, Seq2.1, Seq2.2 ou Seq3, représentés à la figure 6.
L'invention vise également une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle hybride avec l'une des séquences précédemment décrites, en ce qu'elle est présente dans l'ADN d'une bactérie de l'espèce Clostridium bifermentans, et en ce qu'elle code pour une protéine, un polypeptide ou un peptide ayant la capacité de participer à une activité toxique vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier vis- à-vis de larves de Moustiques ou de Simulies.
Les séquences nucléotidiques de 1'invention peuvent être isolées par exemple à partir de bactéries anaérobies de 1'espèce Clostridium bifermentans et en particulier à partir de la souche Clostridium bifermentans malaysia. Elles peuvent également être synthétisées par voie chimique selon les techniques classiques.
Par ailleurs, ces séquences nucléotidiques peuvent être constituées par de l'ADN simple ou double brin, par de 1'ADNc ou encore par de l'ARN.
L'invention a également pour objet selon un mode de réalisation particulier, une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle contient des fragments codant pour les séquences d'acides aminés suivantes : M N T N I F S T N L et/ou pour N N D E I Y G E P D S S N I et/ou pour M N N (X) C E V N C E (X) T et/ou pour N A S L G K et/ou pour F E L et/ou pour Q V K et/ou pour E N T A S G T E et/ou pour I E Y H N N L R et/ou pour
A Y (R) Q V K F H I E A V N E G L K I et/OU pour D I P I S P E D I S K.
L'identification des séquences d'acides aminés est effectuée en ayant recours au code à une lettre pour la désignation des acides aminés.
L'invention se rapporte aussi à un fragment de nucléotides contenu dans l'une des séquences ci-dessus définies, caractérisé par les propriétés suivantes :
- il comprend le fragment Xbal-EcoRV du fragment Xbal de 7 kb représenté à la figure 4A et contenu dans le plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le n° 1-1317, - il a une taille d'environ 1,8 kb et il code pour une protéine ayant un poids moléculaire de 66 kDa.
Un fragment de nucléotides préféré codant pour une protéine de 66 kDa est caractérisé en ce qu'il contient une séquence codant pour l'enchaînement d'acides aminés M N T N I F S T N L à son extrémité NH2-terminale, et une séquence codant pour l'enchaînement d'acides aminés N N D E I Y G E P D S S N I comme fragment interne.
Un autre fragment de nucléotides selon l'invention, contenu dans l'une des séquences précédemment définies, est caractérisé par les propriétés suivantes :
- il hybride dans des conditions stringentes avec la sonde 16A ;
- il est présent dans le fragment Xbal de 7 kb représenté à la figure 4A et contenu dans le plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le n° 1-1317 ;
- il a une taille d'environ 0,5 kb ;
- il code pour une protéine Pi6 ayant un poids moléculaire d'environ 16 kDa.
Un fragment préféré codant pour une protéine ayant un poids moléculaire d'environ 16 kDa (protéine P16) est en outre caractérisé en ce qu'il contient une séquence codant pour 1'enchaînement d•acides aminés A Y (R) Q V K F H I E A V N E G L K I à son extrémité NH2-terminale et une séquence codant pour 1'enchaînement d'acides aminés D I P I S P E D I S K en tant que fragment interne.
Un autre fragment de nucléotides selon 1*invention contenu dans l'une des séquences précédentes, est caractérisé en ce qu'il code pour une protéine P20 ayant un poids moléculaire d'environ 20 kDa, précurseur de la protéine P16, P20 étant synthétisée pendant la phase de sporulation de bactéries de l'espèce C. bifermentans, en particulier de Cbm. L'invention a également pour objet un fragment de nucléotides contenu dans l'une des séquences précédentes, caractérisé par les propriétés suivantes :
- il hybride dans des conditions stringentes avec la sonde 18A ;
- il est présent dans le fragment Xbal de 7 kb représenté à la figure 4A et contenu dans le plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le n° 1-1317 ;
- il a une taille d'environ 0,55 kb ;
- il code pour une protéine P18 ayant un poids moléculaire d'environ 18 kDa.
Un tel fragment peut de façon préférée être caractérisé en ce qu'il code pour une protéine ayant un poids moléculaire d'environ 18 kDa et en ce qu'il contient une séquence codant pour 1•enchaînement d'acides aminés M N N (X) C E V N C E (X) a son extrémité NH2-terminale et des séquences codant pour les enchaînements d'acides aminés N A S L T-.W G K, F E L, Q V K, E N T A S G T E, et I E Y H N N L R en tant que fragments internes.
Font également partie de 1'invention des vecteurs recombinants caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence nucléotidique ou un fragment de nucléotides répondant aux définitions précédentes, cette séquence ou ce fragment étant inséré en un site non essentiel pour la réplication du vecteur. Avantageusement ces vecteurs sont des plasmides.
Un vecteur particulier est caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pCBMl déposé à la CNCM sous le n" 1-1317.
Un autre vecteur recombinant selon l'invention, est le plasmide pHT316 résultant de l'introduction dans le plasmide pHT315 (Arantes et Lereclus, 1991, Gène, 108: 115-119), d'un fragment BamHI-EcoRI de 0,5 kb (Nicolas et al (1993) FEMS Microbiol. Letter 106, 275-280) contenant le promoteur de la cytolysine de B_^ thurinqiensis ( ard et Ellar, 1986, J. Mol. Biol., 191:1-11). Ce vecteur peut être modifié par la séquence Cbm.
Le plasmide pHT316 permet avantageusement la surproduction chez Bt, des protéines de Cbm, toxiques vis-à-vis des insectes.
L'invention a également pour objet des cellules hôtes recombinantes procaryotes ou eucaryotes, caractérisées en ce qu'elles contiennent une séquence ou un fragment répondant à l'une des définitions données ci-dessus, ou encore un vecteur de l'invention dans des conditions permettant le clonage et/ou l'expression de ladite séquence ou dudit fragment.
Un hôte particulier peut être une cellule bactérienne, par exemple une souche de Clostridium bifermentans, une souche de Bacillus thurinqiensis ou une souche de Bacillus sphaericus.
S'agissant de B. thurinqiensis, on fera référence à la publication de Lereclus D. et al (1989) , FEMS Microbiology Letters 60, 211-218, dans laquelle la technique de transformation (par introduction des gènes de toxines dans Bt) de B. thuringiensis est décrite.
S'agissant de B. sphaericus, on se reportera par exemple à la publication de Taylor L.D. et al (1990) FEMS Microbiology Letters 66, 125-128.
Une autre cellule selon 1'invention peut être une cellule eucaryote par exemple une cellule végétale.
L'invention a également pour objet un polypeptide ou une composition de polypeptides, caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique ou un fragment de nucléotides défini(e) précédemment.
Un polypeptide particulier selon l'invention est impliqué dans une activité larvicide vis-à-vis de larves de Diptères, notamment de Moustiques ou de Simulies, et est caractérisé par les propriétés suivantes : - il est caractéristique d'une bactérie anaérobie de 1'espèce Clostridium bifermentans ;
- il ne produit pas de réaction immunologique avec des sérumε dirigés contre les protéines du cristal de B. thurinqiensis israelensis ou de B. sphaericus.
Les polypeptides de 1'invention comprennent notamment une première protéine caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire d'environ 16 kDa et en ce qu'elle est le produit de l'expression dans une cellule recombinante d'un fragment de nucléotides hybridant avec 1'oligonucleotide 16A dans des conditions stringentes, ce fragment étant contenu dans la séquence Nsil-Xbal du fragment Xbal contenu dans le plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le numéro 1-1317.
Une autre protéine de 1'invention est caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire d'environ 18 kDa et en ce qu'elle est le produit de l'expression dans une cellule recombinante d'un fragment de -.nucléotides hybridant avec 1'oligonucleotide 18A dans des conditions stringentes, ce fragment étant contenu dans la séquence EcoRI-Xbal du fragment Xbal contenu dans le plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le numéro 1-1317 et décrit à la figure 4A.
Une troisième protéine selon 1'invention est caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire d'environ 66 kDa et en ce qu'elle est le produit de l'expression dans une cellule recombinante d'un fragment de nucléotides hybridant avec 1'oligonucleotide 66A et/ou 66B dans des conditions stringentes, ce fragment étant contenu dans la séquence Xbal-EcoRI du fragment Xbal contenu dans le plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le numéro 1-1317.
L'invention concerne aussi des fragments polypeptidiques des protéines P16, P18 ou P66, ou tout fragment tel qu'obtenu à partir des protéines précédemment définies dès lors qu'il est impliqué dans une activité larvicide vis-à-vis de larves de Diptères notamment de Moustiques ou de Simulies.
Entrent notamment dans le cadre de l'invention, les séquences polypeptidiques codées par les séquences de nucléotides Seql, Seq2.1, Seq2.2, Seq3 ou Seq4.
Une autre séquence d'intérêt est la séquence d'acides aminés correspondant au gène cbmll telle que représentée à la figure 6-
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, un polypeptide de 1'invention est caractérisé en ce qu'il est reconnu par des anticorps dirigés contre la protéine P16 et/ou par des anticorps dirigés contre la protéine P18 et/ou par des anticorps dirigés contre la protéine P66.
Des polypeptides particuliers de l'invention sont par exemple des polypeptides comprenant une séquence d'acides aminés codée par l'un des enchaînements Seql, Seq2.1, Seq2.2 ou Seq3 et reconnus respectivement par des anticorps anti-protéine P66 pour le polypeptide comprenant au moins l'une des séquences Seql, Seq2.1 ou seq2.2 et par des anticorps anti-protéine P16 ou anti¬ protéine P18 pour le polypeptide comprenant la séquence Seq3.
La demande concerne également un polypeptide caractérisé en ce qu'il est modifié par addition, délétioή, substitution d'acides aminés dès lors qu'il conserve la capacité du polypeptide correspondant non modifié à intervenir dans l'activité toxique vis-à-vis de larves de Diptères, notamment de Moustiques ou de Simulies.
La présente demande vise aussi des compositions de polypeptides caractérisées en ce qu'elles comprennent par exemple la protéine P16 et la protéine P18 ou en ce qu'elles comprennent les protéines P16, P18 et P66.
Ces protéines sont de préférence sous forme purifiée, le cas échéant co-purifiée, soit après isolement à partir d'une souche, soit après expression dans un hôte cellulaire recombinant.
L'invention concerne aussi un extrait protéique ayant une activité larvicide vis-à-vis de larves de Diptères, notamment de Moustiques ou de Simulies tel qu'obtenu par :
- culture de Clostridium bifermentans à 34βC en anaérobiose en milieu TYG dans un courant gazeux contenant 5% H2, 5° C02 et 90% N2, récupération de la culture en fin de sporulation, environ après 16 h,
- lavage de la culture avec NaCllM,
- rinçage 2 fois avec un tampon TE,
- récupération du culot qui constitue l'extrait. Une composition particulière de polypeptides selon l'invention peut aussi être caractérisée en ce qu'elle a l'activité larvicide d'un extrait brut tel que défini ci-dessus.
La présente demande a également pour objet des anticorps monoclonaux dirigés contre une protéine selon les définitions ci-dessus données.
Elle vise également un antisérum polyclonal caractérisé en ce qu'il est dirigé contre une protéine de 1'invention ou contre une composition de ces protéines ou encore contre un extrait tel que décrit ci-dessus.
Les séquences nucléotidiques ou fragments selon 1•invention permettent également la préparation de sondes nucléotidiques, obtenues par marquage selon les techniques classiques des fragments ou séquences ci- dessus décrits.
Entrent également dans le cadre de l'invention, des compositions à activité larvicide comprenant à titre de principe actif, un ou plusieurs polypeptides selon l'une quelconque des définitions données précédemment. D'autres compositions à activité larvicide selon 1*invention peuvent également être caractérisées en ce qu'elles comprennent à titre de principe actif, des cellules recombinantes répondant aux définitions précédemment données.
De telles compositions peuvent en outre comporter des cellules recombinantes modifiées par des séquences codant pour un ou plusieurs polypeptides à activité larvicide de B. thurinqiensis et/ou de B. sphaericus.
On peut également envisager selon 1'invention de préparer des cellules recombinantes contenant à la fois des gènes ou séquences nucléotidiques ou fragments codant pour une protéine répondant aux définitions ci- dessus et contenant en outre une séquence à activité larvicide de B. thurinqiensis et/ou de B. sphaericus.
D'autres caractéristiques et avantages de 1'invention apparaissent dans les exemples et les figures qui suivent.
Figures 1 à 3: Relations immunoloqiques, distribution et cinétique de synthèse de P66, P18 et P16.
Figure 1 : SDS-PAGE de l'extrait toxique de Cbm. Les poids moléculaires de protéines standard sont indiqués dans la marge droite (en kDa) .
Figure 2 : Détection des protéines P66, P18 et P16 dans Cbm et dans des souches de C. bifermentans non toxiques. Des échantillons de 100 μl de cultures sporulées, ont été soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) , transférées sur une membrane de nitrocellulose et soumis à immunodétection avec des IgG purifiées par affinité dirigées contre P66 (A66) , P18 (A18) ou P16 (A16) . Puits a, ÇJb ; puits b, souche ATCC 638; puits c, souche 744-83; puits d, souche VPI 4407; puits e, souche VPI 4413A. Figure 3 : Cinétique de synthèse de P66, P18 et P16 au cours de la sporulation de Cbm, à 34"C (haut) ou à 42°C
(bas) , en conditions anaérobies. Des aliquots de 100 μl de culture ont été soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) , transférés sur une membrane de nitrocellulose et soumis à immunodetection avec des IgG purifiées par affinité, dirigées contre
P66 (A66) , P18 (A18) ou P16 (A16) . Temps de culture en heures : a, 4.5; b, 6 (correspondant au t0 de sporulation); c, 7.5; d, 9; e, 10.5; f, 13; g, 30. Les poids moléculaires de protéines standard sont indiqués dans la marge (en kDa) .
Figures 4A et 4B : Structure du plasmide pCBMl et carte de restriction du fragment Xbal.
Fragment Xbal : Bg : BqlII; N : Nsil; P : PvuII; R :
EcoRI; Rv : EcoRV; X : Xbal
Site de clonage :
H : HindiII; S : SphI; Ps : PstI; Sal : -.Sali; Bm :
BamHI; Sm : Smal; K : Kpnl; Sst : SstI; R : EcoRI.
Les parties hachurées à droite et à gauche du fragment
Xbal sont des fragments du plasmide vecteur pHT304
(Arantès O. et al (1991), Gène, 10 , p. 115-119).
Les fragments sur lesquels hybrident les sondes oligonucléotidiques sont représentés en traits hachurés, sous le fragment Xbal.
La flèche correspond à l'extrémité 5' du gène de P16 hybridant avec la sonde 16A.
Enzymes n'ayant pas de sites de restriction dans le fragment Xbal :
Ba HI, HindIII, PstI, SstI, Sali, Smal.
Figure 5 : Localisation des oligonucléotides utilisés pour le séquençage des séquences lues.
Séquences des oligonucléotides utilisés :
16A': complémentaire 16 A: : ace cat tgt cta tat gc
16B*: oligon 16 B non dégénéré: ggagat atc gga atg te
16B': complémentaire 16 B'*: ceg ata tet cet gaa ga 18 B*: oligo 18 B non dégénéré : tct gta ccg gaa gca gt
18 B': complémentaire 18 b*: gct tcc ggt aca gaa gg
66 C-R: aac cet aca tct gtt aa
66 D-A: tac tac cat agt ttc ca
66 E-A: tgc aaa gec aag ttg at
Légende fragment Xba inséré, issu de l'ADN de Cbm
Amorce "reverse" R-48
Amorce "universelle" - 40
Polylinker du pUC 19
Amorces nucléotidiques de synthèse (*)
Vecteur navette pHT 304
Figure 6 : Séquences de nucléotides lues.
6A: Seq.l, lue à l'aide de l'amorce réverse R-48.
6B: Seq.2.1, lue à l'aide de l'amorce 66C-R.
6C et 6D: Seq.2.2, lue avec les amorces 66B, 66D-A et
66E-A.
6E à 6G: Gène Cbm, lu avec les diverses amorces "16 et
18".
6H et 6J: SEq4, lue avec l'amorce universelle R-40.
Figure 7: Séquence d'acides aminés correspondant au gène Cbmll et localisation des séquences NH2-terminales et internes des protéines P18 et P16.
Figure 8 : Localisation des copies de cbm 11 sur le fragment Xbal.
Figure 9A et 9B : Localisation du fragment Xbal sur le plasmide résident.
Ligne 1: Marqueur de taille CCC de 16 à 2,06 Kb
Ligne 2: Préparation des plasmides de Cbm CH 18, natifs
Ligne 3: Préparation des plasmides de Cbm CH 18, hydrolyses par Xba
Sonde utilisée : pCBMl
Figure 10 : Expression des gènes introduits dans pCBMl, chez E.coli
Ligne 1 : E. coli + pHT 304 (vecteur navette utilisé)
Ligne 2 : E . coli + pCBM 1 Sonde utilisée : anticorps anti Cbm total. Figures 11A, 11B et 11C : Homologies de séquence trouvées entre la protéine Cbm 11 et les protéines décrites dans la banque de données Swissprot.
MATERIELS ET METHODES
Préparation de l'extrait
Un extrait a été préparé à partir d'une culture de Cbm réalisée à 34°C en anaérobiose en milieu TYG (à base de Biotrypcase 3%, extrait de levure 2%, glucose 0,5 à 1%, chlorydrate de cystéine 0,05%) dans un fermenteur ayant une capacité de 6 litres, en présence d'un courant gazeux contenant 5% H2, 5% C02 et 90% N2. La culture bactérienne sporulante a été récoltée après 16 h, en fin de phase de sporulation. La culture a ensuite été lavée avec 1M NaCl, rincée 2 fois avec 20 mM Tris HC1, 5mM EDTA, pH8 (tampon TE) et -conservée à -70°C jusqu'à l'utilisation. Les culots congelés ont été décongelés resuspendus dans un tampon TE traité dans un sonicateur pendant une durée totale de l minute comprenant un temps réel de sonication de 15 secondes sur la glace (Sonicateur Branson, grande sonde, échelle de sortie 40%, durée du cycle de sonication ("duty cycle": 25%) et centrifugés à 5000 g pendant 15 min. Le surnageant résultant (correspondant à l'extrait brut de protéines) a été recueilli.
Analyse des protéines
La concentration en protéines de l'extrait a été déterminée en utilisant le test Biorad de protéine avec l'albumine sérique bovine comme standard. Une électrophorèse sur gel de polyacrylamide a été réalisée selon la technique de Laemmli, U.K. (1970) (Nature 227, 680-685) sur des gels de polyacrylamide à 13%. Les marqueurs de poids moléculaires utilisés dans cette analyse des protéines par SDS-PAGE en conditions dénaturantes sont ceux du kit Pharmacia d'électrophorèse de protéines (LMW Réf. 17-0446-01), contenant les protéines suivantes : phosphorylase B (de masse moléculaire 94000 daltons) , albumine (67000) , ovalbumine (43000) , anhydrase (30000) inhibiteur trypsique (20100) et alpha lactalbumine (14000) .
Préparation des antisera contre les protéines de Cbm
Des antisera polyclonaux contre l'extrait brut de protéine de Cbm ont été obtenus chez des lapins après deux séries de 10 à 15 microinjections intradermiques de 500 μg de protéines emulsifiées dans l'adjuvant complet de Freund, à 3 semaines d'intervalle. Les lapins ont reçu des injections sous-cutanées d'une dose de rappel sans adjuvant de Freund, 3 semaines après. Les IgG ont été purifiées à partir des sérums par précipitation au sulfate d'ammonium et chromatographie sur une colonne DEAE-52 (What ann) puis conservés à 4°C.
Des antisera polyclonaux contre les polypeptides individualisés dénaturés P66, P18 et P16 ont été produits chez les lapins selon la manière suivante : les trois protéines ont été séparées par électrophorèse préparative SDS-PAGE et détectées avec du KC1 1M. Les bandes ont été découpées sur les gels et les bandes d'acrylamide découpées ont été rincées avec de 1•eau déionisée, puis plongées dans l'eau, emulsifiées avec de l'adjuvant complet de Freund et injectées aux lapins selon la technique décrite précédemment. Après récupération des antisera, les IgG ont été purifiées par affinité sur des bandes de nitrocellulose contenant le polypeptide utilisé pour l'injection aux lapins, selon la technique de Burke et al (1982) . EMBO J. 1, 1621-1628. Hydrolyse enzymatique de l'extrait de Cbm
Pour rechercher la toxicité de l'extrait, 500 μl d'aliquots de l'extrait (400 μg) ont été chacun traités pendant deux heures à 37°C avec l'une des enzymes suivantes : protéinase K (EC 3.4.21.14, Boehringer, 40μg/ml) , ribonucléase type I-A (EC 3.1.27.5, Sigma, 100 μg/ml) et déoxyribonucléase I (EC 3.1.21.1, Boehringer, 100 μg/ml) .
L'activité larvicide a été testée sur des larves de Anophèles stephensi au troisième stade larvaire.
Fractionnement de l'extrait protéique
Les extraits bruts de protéines ont été filtrés sur un filtre HA-Millex contenant des pores de 0.45 μm (Millipore) et soumis à une chromatographie liquide à haute résolution (FPLC®, Pharmacia) . Une chromatographie par échange d'ions a été réalisée sur une colonne Mono Q HR 10/10 équilibrée avec un tampon TE. Les protéines ont été éluées avec un gradient multi-étapes contenant de 0 à 1M NaCl. Une filtration sur gel a été réalisée sur une colonne Superdex 200 HiLoad 16/60 dans un tampon TE contenant 150 mM NaCl (tampon TES) . Les fractions ont été analysées par électrophorèse (SDS-PAGE) après précipitation des protéines avec 10% d'acide trichloracétique.
Test de neutralisation et immunoprécipitation
La capacité des différents antisera d'inhiber l'activité larvicide de l'extrait a été testée selon la méthode suivante : des dilutions en série de l'extrait ont été incubées avec un volume fixe d'IgG anti-extrait dans un tampon TE à 20βC pendant 1 heure. La toxicité des échantillons et des échantillons de contrôle non- traités a été testée en utilisant des larves de A. stephensi. Des tests de neutralisation ont été également réalisés dans les mêmes conditions avec les antisera ou les anticorps purifiés par affinité, dirigés contre les protéines dénaturées P66, P18 ou P16. Les protéines ont été immunoprécipitées à partir de 1'extrait avec les antisera dirigés contre 1'extrait ou contre les protéines individuelles P66, P18 ou P16 dénaturées par la technique de Howe et al, ((1982). Mol. Gen. Genêt. 186, 525-530) , en utilisant des billes de Protéine A Sepharose (Sigma) comme porteurs.
Cinétique de la synthèse de P66, P18 et P16
Cbm a poussé dans des flacons scellés de 1 litre, contenant 800 ml de milieu liquide TYG, avec une agitation magnétique douce, soit à 34°C soit à 42βC. Des échantillons de 30 ml ont été récupérés à 90 minutes d'intervalles sans renouveler la teneur en gaz par ponction à travers un bouchon en caoutchouc. Les échantillons ont été centrifugés, rincés comme décrit précédemment et les culots de centrifugation ont été gardés à -70°C jusqu'à l'analyse de l'activité larvicide et de la teneur en protéines par électrophorèse SDS-PAGE. Les expériences d'immunodetection ont été réalisées après électrotransfert sur une membrane Hybond-C Super® (Amersham) . P66, P18 et P16 ont été détectées avec les IgG purifiées par affinité dirigées contre chaque protéine (A66, A18 et A16) et visualisées avec un système de détection en Western blot ECL® (Amersham) . Pour la comparaison, les cultures ont été réalisées à 34°C et 42°C dans des flacons dans lesquels un échange de gaz était possible.
Criblage de P66, P18 et P16 dans des souches C. bifermentans non larvicides Les souches non larvicides de C. bifermentans (souche type ATCC 638, 744-83, VPI 4407 et VPI 4413A ont été criblées par immunodetection pour rechercher la présence de P66, P18 et P16. Ces souches ainsi que la souche Cbm ont été cultivées dans des flacons scellés contenant 50 ml de milieu TYG, à 34βC et récupérées après 15h lorsque la sporulation était complètement terminée mais avant la lyse cellulaire.
Bioessais sur des larves de moustiques
Des échantillons de culture bactérienne ou des extraits de protéine ont été testés sur 20 larves de Culex pipiens au quatrième stade larvaire et/ou de A. stephensi au troisième stade larvaire dans des boites en plastique de Pétri d'une capacité de 6 ml. Les mortalités ont été enregistrées après 24 h et 48 h d'exposition.
Relations immunologiques avec les toxines de Bacillus
Un extrait brut de Cbm a été testé avec des antisera dirigés contre les cristaux de B. thurinqiensis serovar israelensis 1884, B. thurinqiensis serovar aizawai 7.29, B. thurinqiensis serovar thurinqiensis 1715 et B. thurinqiensis serovar entomocidus HD9, ainsi que des antisera contre les protéines de cristaux de 42 et 51 kDa de B. sphaericus 2362.
RESULTATS ET DISCUSSION
L'extrait de Cbm contenait trois protéines majeures de poids moléculaires apparents 66, 18 et 16 kDa, désignées par les abréviations P66, P18 et P16, ainsi que différents composants mineurs de nature protéique (Figs. 1 à 3) . 1. Caractérisation des protéines P66, P18 et P16
L'extrait obtenu est toxique envers les larves des moustiques Culex pipiens, Anophèles stephensi et Aedes aegypti.
Sa LC50 après 48h contre A. stephensi au troisième stade larvaire était de 5 μg/ml. L'activité larvicide de 1'extrait a été perdue après incubation pendant 2h à 37°C avec de la protéinase K. Au contraire, aucune inactivation n'a été obtenue avec la DNase ou la RNase. De plus, l'activité larvicide était totalement inhibée par les IgG dirigées contre l'extrait total. Ainsi l'activité larvicide est bien due à des toxines de nature protéique au moins en partie.
Des antisera dirigés contre les protéines du cristal entomopathogène de B. thurinqiensis ou B. sphaericus n'ont pas donné lieu à une réaction croisée avec les protéines de l'extrait de Cbm, indiquant que les toxines de Cbm appartiennent à une nouvelle classe de toxines insecticides.
P66, P18 et P16 sont les composants majoritaires des extraits toxiques de Cbm.
P66, P18 ou P16 ne sont pas immunologiquement apparentées (Figure 2, lignes a). P18 et P16 étaient seulement présentes dans Cbm alors qu'une protéine de 66 kDa immunologiquement apparentée à P66 de Cbm a été détectée dans 4 souches de C. bifermentans non- entomopathogènes testées (Figure 2, lignes b à e) .
La synthèse de P18 et de P16 dans une culture effectuée à 34°C, était concommitante avec la sporulation de Cbm (figure 3) et l'apparition de l'activité larvicide. P16 était synthétisée sous forme d'un précurseur de 20 kDa (P20) , progressivement converti en un polypeptide de 16 kDa lors de la lyse cellulaire (Fig. 3) . P18 et P20/P16 ne sont pas détectées immunologiquement dans les souches de C. bifermentans dépourvues d'activité larvicide (Fig 2).
P18 et P20/P16 sont très faiblement détectées dans Cbm cultivée à 42°C, dans les conditions où la bactérie n'est pas toxique (Fig 3).
P66 était détectée dans des cellules de Cbm pendant le stade végétatif et durant la sporulation. Dans les cellules sporulantes, d'autres polypeptides immunologiquement apparentés à P66 étaient détectés, allant de 25 à 66 kDa (figure 3) ; ces polypeptides pourraient être des produits de dégradation de P66.
La culture de Cbm a poussé à 42°C sans échange gazeux ; elle n'était pas toxique et contenait seulement des traces de P18 et P16. Dans cette culture, P66 était également synthétisée pendant la phase végétative mais aucune protéine de poids moléculaire inférieur n'a été détectée (Figure 3) .* Dans les cultures avec échange gazeux, on ne relevait pas de différence dans l'activité larvicide, la synthèse de P66, P18 et P16 et la lyse du sporange, entre les cultures effectuées à 34°C ou à 42βC.
Des essais de purification de chaque protéine ont permis les constatations suivantes : la plus grande partie de la toxicité était perdue après filtration, avant la réalisation d'une chromatographie FPLC®, bien que les extraits filtrés et non filtrés aient eu les mêmes profils protéiques. Ceci suggère que l'activité larvicide pourrait être liée à la présence d'aggrégats protéiques ou de particules. Ceci a également été observé pour les toxines de Bti ou de B. sphaericus qui sont beaucoup plus actives sous forme d'aggrégats qu'en solution (Schnell et al (1984). Science 223, 1191-1193 et Nicolas et al (1993). FEMS Lett. 106, 275-280). En outre, avec la chromatographie FPLC®, soit sur colonne d'échange d'ions, soit par filtration sur gel, les trois polypeptides P66, P18 et P16 coéluaient en différents points. Des tests d'immunoprécipitation ont montré que chacun des antisera individuels dirigés contre P66, P18 ou P16 étaient capables de précipiter les trois produits ensemble comme le faisaient des anticorps préparés contre l'extrait brut. Des tests de chromatographie et d'immunoprécipitation ont suggéré que P66, P18 et P16 sont assemblés en un complexe.
Des IgG dirigées contre les protéines P66, P18 et/ou P16 dénaturées ne neutralisaient pas la toxicité; en revanche des anticorps contre la fraction brute de l'extrait neutralisaient la toxicité. Il est concevable que des IgG dirigées contre les protéines dénaturées étaient capables de reconnaître le complexe P66-P18- P16, mais ne reconnaissaient pas des épitopes ou des domaines impliqués dans l'activité larvicide.
Ces expériences ont montré l'implication de P18 et P16 dans l'activité larvicide. En effet, dans des cultures de Cbm effectuées à 34βC, les deux protéines sont synthétisées concommitamment avec 1'apparition de l'activité larvicide. Elles sont absentes des souches non toxiques de C. bifermentans et présentes à un niveau très bas dans des cellules non toxiques de Cbm cultivées à 42°C. L'activité larvicide de Cbm à 42°C est modulée par les conditions d'échange de gaz entre la culture et le mélange de gaz anaérobique. L'absence d'activité larvicide dans des flacons scellés, sans échange gazeux est corrélée avec la faible synthèse et/ou une rapide dégradation de P18 et P20/P16.
2. Clonage des gènes codant pour P66, P18 et P16
Des séquences partielles en acides aminés de P66, P18 et PI6 ont été déterminées par microséquençage.
Séquences en acides aminés des protéines P66, P18 et PI6 Ces séquences ont été obtenues par microséquençage, selon des techniques couramment pratiquées par les laboratoires de microséquençage. Pour chaque protéine ont été réalisées i) la séquences NH2-terminale et ii) une ou plusieurs séquences de fragments internes obtenus par hydrolyse trypsique de la protéine. Les séquences ont été déterminées avec un séquenceur Applied Biosystems 470, à partir des protéines séparées sur SDS-PAGE et transférées sur membrane de PVDF Immobilon (Millipore) .
P66
- séquence NH2-terminale M N T N I F S T N L
- interne 1 N N D E W I Y G E P D S S N I
P18
- NH2-terminale M N N (X) C E V N C E (X) T
- interne 1 N A S L T W G K
- interne 2 F E L
- interne 3 Q W V K
- interne 4 E N T A S G T E
- interne 25 I E Y H N N L R
P16
- NH2-terminale A Y (R) Q W V K F H I E A V N E G L K I
- interne 1 D I P I S P E D I S K
(X) : indéterminé
Les sondes oligonucléotidiques ont été faites à partir des séquences soulignées
Protéine Acides aminés Sonde oligonucléotidique
5'-3'
P66, NH2-term. M N T N I F S T N 66A=ATG AAT ACI AAT ATI
TTT TCI ACI AA (26mer) P66, interne D E W I Y G E P D 66B*=TC IGG TTC ICC ATA IAT CCA TTC ATC (26mer)
P18, NH2-term. C E V N C E lβA≈TGT GAA GTI AAT TGT
GA (17 mer)
P16, NH2-term. F H I E A V N E G 16A≈ TTT CAT ATI GAA GCI
GTI AAT GAA GG (26mer)
I≈DMT dlnosine cyandethyl ^phosphoramidite *=séquence complémentaire
A partir de ces informations des sondes oligonucléotidiques ont été synthétisées et utilisées pour cribler une banque d'ADN total de Cbm hydrolyse par 1'enzyme Xbal, construite dans le plasmide navette pHT304 (Arantès & Lereclus, Gène. 1991. 108 : 115-119) .
Sélection du plasmide pCBMl
Une banque d'ADN a été construite dans un vecteur navette pHT304, construit par O. Arantès et D. Lereclus, à partir d'un plasmide résident de B. thurinqiensis pHT 1030 et de pUC19, capable de se répliquer dans E. coli et dans les bactéries à gram positif. L'ADN total de Cbm a été hydrolyse par Xbal, transféré sur membrane Hybond N+ (Amersham) après électrophorèse sur gel d'agarose, et hybride avec chacune des sondes synthétisées, marquées à l'extrémité 3' par la fluorescéine ("kit ECL™ 3* oligolabeling and détection Systems", Amersham) selon le protocole recommandé par le fournisseur dans les conditions d'hybridation et de stringence suivantes :
Température d'hybridation : 42°C, 15h, en four à hybridation HYBAID (Cera-Labo) avec 5-10 ng de sondes/ml. Lavages après hybridation : 2 fois 5 minutes à température ambiante dans 5 x SSC, 0,1% SDS, puis 2 fois 15 minutes en 1 x SSC, 0,1% SDS.
La banque d'ADN génomique de Cbm construite dans E. coli souche TGl a été criblée par hybridation sur colonies avec 1'oligonucleotide 16A marqué en extrémité 3* par la fluorescéine (système ECL 3' oligolabeling Amersham). Le criblage a permis d'isoler un plasmide recombinant pCBMl hybridant avec 1'oligonucleotide 16A mais aussi avec les oligonucléotides 66A, 66B et 18A.
Une seule bande de 7 kb a été détectée sur l'ADN hydrolyse par Xbal par la sonde correspondant à l'extrémité NH2 terminale de P16 (sonde 16A) . Une faible réaction a été également été détectée sur ce fragment avec les sondes 18A et 66A. La banque a donc été construite dans E. coli TGl avec les fragments Xbal d'ADN de taille voisine de 7,5 kb élues sur Prep-A-Gene (Biorad) . Le criblage de la banque (400 clones) par hybridation des colonies sur filtre Hybond N+ avec 1'oligonucleotide 16A a révélé 10 clones positifs (mêmes conditions de stringence que décrites ci- dessus) . L'analyse des 10 plasmides recombinants, par plusieurs enzymes de restriction, a montré qu'ils étaient tous similaires. Un des plasmides (pCBMl, 13,5 kb) a été sélectionné.
Le plasmide pCBMl a une taille de 13 ,5kb et résulte donc de l'insertion d'un fragment Xbal d'ADN de Cbm de 7kb au site de clonage Xbal de pHT304 (6,5kb).
La carte de restriction de pCBMl a été déterminée (Fig 4A et 4B) .
Les régions avec lesquelles hybrident les sondes mentionnées ci-dessus ont été déterminées par Southern-blot sur le plasmide pCBMl hydrolyse par différentes enzymes de restriction pour les 4 sondes. De plus la technique de PCR en utilisant comme amorces l'amorce universelle et 1'oligonucleotide 16A a permis de localiser la région d'hybridation de 16A à 2kb de l'extrémité 3' du fragment Xbal (Fig 4A) . Ces résultats permettent de conclure que les 3 gènes codant pour P66, P20/16 et P18 sont contenus dans le fragment Xbal de 7kb.
Localisation par PCR de l'extrémité 5' du gène codant pour PI6 sur le fragment Xba'l
La PCR a été réalisée en utilisant la Taq polymérase et comme amorces, 1'oligonucleotide 16A et l'amorce universelle (M13 universal sequehcing primer Pharmacia) et comme matrice le plasmide pCBMl, avec le cycle suivant :
1 cycle Dénaturation 95βC 10 min.
Figure imgf000029_0001
La stratégie de séquençage utilisée était celle de "marche sur le fragment". La séquence a été réalisée selon la technique de Sanger (Sanger, et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) sur le plasmide pCBMl rendu simple brin par dénaturation à la soude. L'extension a été effectuée à partir des amorces universelle, réverse, ou des oligonucléotides correspondant aux séquences déduites des séquences en acides aminés des protéines P66, P18 et P16 ou des séquences nucléotidiques lues. L'ensemble des oligonucléotides utilisés et leur localisation sur le fragment d'ADN sont représentés dans la figure 5.
Un total de 1800 pb a été lu et est présenté sur la figure 6. Les séquences nucléotidiques (Seql, Seq2, Seq3 et Seq4) déterminées, ainsi que la séquence en acides aminés déduite de la séquence Seq3 sont données dans la figure 6.
La détermination des sites de restriction contenus dans la séquence du gène codant pour la protéine de 66 kDa a permis de localiser avec précision la position du début du gène 66kDa sur le fragment Xbal ; environ 95% du gène est présent sur le fragment clone.
L'analyse de la séquence Seq3 et la comparaison avec les séquences amino terminales et internes des protéines 16kDa et 18 kDa (mentionnées dans la figure 6) a montré que les gènes 16 kDa et 18 kDa ne sont pas distincts et représentent en fait le même gène. Un seul cadre de lecture capable de coder pour une protéine de 11 kDa (masse moléculaire calculée) a été trouvé ; le gène correspondant a été désigné gène CBM11. La masse moléculaire calculée de 11 kDa correspondrait à celui de la protéine de 18 kDa. D'après la séquence, la protéine de 16 kDa serait en fait une protéine ayant une masse moléculaire calculée de 8,9 kDa ; elle pourrait résulter de la protéine 11 kDa par clivage des 17 acides aminés NH2-terminaux.
La recherche d'homologies au niveau acides aminés entre la séquence Seq3 et d'autres protéines a été réalisée. Seule trois protéines (dont une produite par une autre espèce de Clostridium) présentant des homologies très restreintes ont été trouvées dans les banques de données.
L'existence d'un gène unique codant pour les deux protéines est en contradiction apparente avec un résultat précédemment trouvé concernant 1'absence de parenté immunologique entre ces protéines. On a donc recherché la présence de plusieurs copies du gène CBM 11 codant pour des protéines différentes.
4. Nombre de copies du gène CBM 11
Des expériences de PCR réalisées sur la plasmide pCBMl avec les différentes combinaisons d'amorces décrites dans la figure 5 ont montré la présence de deux copies du gène Cbm 11 sur le fragment Xbal de 7 kb clone. Ces deux copies ont des tailles similaires, sont en orientation directe et distantes d'environ 200 pb (Figure 8) .
Des expériences similaires effectuées sur l'ADN total de Cbm ont permis de montrer 1'existence d'au moins une copie supplémentaire sur cet ADN en orientation inverse.
5. Localisation des gènes codant pour les protéines de 66 kDa, 18 kDa et 16 kDa
Des expériences d'hybridation ont été réalisées en parallèle sur l'ADN plasmidique et l'ADN total de Cbm en utilisant comme sonde le fragment Xbal de 7 kb ; ces expériences ont été réalisées en utilisant la technique "Direct nucleic acid labelling system" ECL (Amersham) de sondes froides, selon les indications du fournisseur. Les résultats obtenus ont permis de localiser ce fragment sur un plasmide résident d'environ 13 kb (Figure 9A et 9B) .
6. Expression des gènes des protéines de 66 kDa, 18 kDa et 16 kDa chez E.coli
L'étude de l'expression des gènes clones dans le plasmide pCBMl a été réalisée chez E.coli par immunodetection à l'aide de sondes froides. Les extraits de E.coli ont été préparés de la façon suivante : les clones TGl (pHT304) et TGl (pCBMl) ont été cultivés en milieu LB. Cette expérience a mis en évidence la synthèse chez ce recombinant d'une protéine unique de 20 kDa réagissant spécifiquement avec l'anticorps anti protéine 18 kDa (Figure 10). Aucun produit correspondant à l'expression du gène 66 kDa n'a pu être visualisé.
Des essais biologiques menés sur Anophèles stephensi Liston montrent que ce clone recombinant, bien que synthétisant une protéine immunologiquement apparentée aux protéines de Cbm, ne présente aucune toxicité même à forte concentration. Ceci suggère que la protéine de 20 kDa exprimée chez E.coli n'est pas le seul élément responsable de la toxicité de Cbm et confirme les résultats obtenus concernant un phénomène de synergisme entre les différentes protéines produites par Cbm.

Claims

REVENDICATIONS
1. Séquence nucléotidique caractérisée par les propriétés suivantes :
- elle comprend tout ou partie du fragment d'ADN Xbal de 7 kb représenté à la figure 4A, tel qu'obtenu à partir du plasmide pCBMl déposé à la CNCM le 15 Juin 1993 sous le n° 1-1317 ;
- elle hybride avec la sonde oligonucléotidique 18A (TGT GAA GTI AAT TGT GA) et/ou avec la sonde oligonucléotique 16A (TTT CAT ATI GAA GCI GTI AAT GAA GG) et/ou avec au moins l'une des sondes 66A (ATG AAT ACI AAT ATI TTT TCI ACI AA) OU 66B (TC IGG TTC ICC ATA IAT CCA TTC ATC) dans des conditions stringentes ;
- elle code pour une protéine, un polypeptide ou un peptide ayant la capacité de participer à l'activité toxique des produits d'expression du fragment Xbal de 7 kb vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier de larves de Moustiques ou de Simulies.
2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle hybride avec les quatre sondes 16A, 18A, 66A et 66B soit dans des conditions stringentes, soit dans des conditions non stringentes.
3. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'il s'agit du fragment Xbal de 7 kb du plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le n' 1-1317.
4. Séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle hybride avec une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, en ce qu'elle est présente dans l'ADN d'une bactérie de l'espèce Clostridium bifermentans, et en ce qu'elle code pour une protéine, un polypeptide ou un peptide ayant la capacité de participer à une activité toxique vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier de larves de Moustiques ou de Simulies.
FE EUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
5. Séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle contient des fragments codant pour les séquences d'acides aminés suivantes : M N T N I F S T N L et/ou pour N N D E W I Y G E P D S S N I et/ou pour
M N N (X) C E V N C E (X) T et/ou pour
N A S L T W G K et/ou pour
F E L et/ou pour
Q W V K et/ou pour
E N T A S G T E et/ou pour
I E Y H N N L R et/ou pour
A Y (R) Q W V K F H I E A V N E G L K I et/OU pour
D I P I S P E D I S K.
6. Fragment de nucléotides contenu dans une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à
5, caractérisé par les propriétés suivantes :
- il comprend le fragment Xbal - EcoRV"du fragment Xbal de 7 kb représenté à la figure 4A et contenu dans le plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le n° 1-1317 ;
- il a une taille d'environ 1,8 kb et il code pour une protéine ayant un poids moléculaire de 66 kDa.
7. Fragment de nucléotides selon la revendication
6, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine P66 ayant un poids moléculaire d'environ 66 kDa et en ce qu'il contient une séquence codant pour l'enchaînement d'acides aminés M N T N I F S T N L à son extrémité NH2-terminale, et une séquence codant pour l'enchaînement d'acides aminés N N D E W I Y G E P D S S N I comme fragment interne.
8. Fragment de nucléotides contenu dans une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à
7, caractérisé en ce qu'il répond à l'un des enchaînements Seql, Seq2.1 ou Seq2.2 représentés à la figure 6, ou en ce qu'il comprend l'un au moins de ces enchaînements.
9. Fragment de nucléotides contenu dans une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par les propriétés suivantes :
- il hybride dans des conditions stringentes avec la sonde 16A ;
- il est présent dans le fragment Xbal de 7 kb représenté à la figure 4A et contenu dans le plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le n° 1-1317 ;
- il a une taille d'environ 0,5 kb ;
- il code pour une protéine PI6 ayant un poids moléculaire d'environ 16 kDa.
10. Fragment de nucléotides selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine P16 ayant un poids moléculaire d'environ 16 kDa et en ce qu'il contient une séquence codant pour l'enchaînement d'acides aminés A Y (R) Q W V K F H I E A V N E G L K I à son extrémité NH-terminale et une séquence codant pour 1'enchaînement d'acides aminés D I P I^S P E D I S K en tant que fragment interne.
11. Fragment de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 9 et 10, caractérisé en ce qu'il répond à 1'enchaînement Seq3 représenté à la figure 6 ou comprenant l'enchaînement Seq3.
12. Fragment de nucléotides contenu dans une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il code pour une protéine P20 ayant un poids moléculaire d'environ 20 kDa, précurseur de la protéine P16, P20 étant synthétisée pendant la phase de sporulation de bactéries de l'espèce C. bifermentans.
13. Fragment de nucléotides contenu dans une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par les propriétés suivantes :
- il hybride dans des conditions stringentes avec la sonde 18A ; - il est présent dans le fragment Xbal de 7 kb représenté à la figure 4A et contenu dans le plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le n°1-1317 ;
- il a une taille d'environ 0,55 kb ;
- il code pour une protéine P18 ayant un poids moléculaire d'environ 18 kDa.
14. Fragment de nucléotides selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine ayant un poids moléculaire d'environ 18 kDa et en ce qu'il contient une séquence codant pour 1'enchaînement d'acides aminés M N N (X) C E V N C E (X) T a son extrémité NH2-terminale et des séquences codant pour les enchaînements d'acides aminés N A S L T W G K, F E L, Q W V K, E N T A S G T E, et I E Y H N N L R en tant que fragments internes.
15. Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il contient une séquence ou un fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, en un site non essentiel pour sa réplication.
16. Vecteur selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pCBMl déposé à la CNCM sous le numéro 1-1317.
17. Vecteur selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pHT816 modifié par une séquence nucléotidique ou un fragment de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
18. Hôte cellulaire recombinant procaryote ou eucaryote, caractérisé en ce qu'il contient une séquence ou un fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 ou un vecteur selon l'une quelconque des revendications 15 ou 17, dans des conditions permettant son clonage et/ou son expression.
19. Hôte cellulaire selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie, par exemple d•une souche C. bifermentans d'une souche B. thurinqiensis ou d'une souche B. sphaericus.
20. Hôte cellulaire selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une cellule eucaryote par exemple une cellule végétale.
21. Polypeptide ou composition de polypeptides, caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique ou un fragment de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
22. Polypeptide impliqué dans une activité larvicide vis-à-vis de larves de Diptères, notamment de Moustiques ou de Simulies, caractérisé par les propriétés suivantes :
- il est caractéristique d'une bactérie anaérobie de 1'espèce Clostridium bifermentans ;
- il ne produit pas de réaction i munologique avec des sérums dirigés contre les protéines du cristal de B. thurinqiensis israelensis ou de B. sphaericus.
23. Polypeptide selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il a un poids moléculaire d'environ 16 kDa et en ce qu'il est le produit de l'expression dans une cellule recombinante d'un fragment de nucléotides hybridant avec l'oligonucleotide 16A dans des conditions stringentes, ce fragment étant contenu dans la séquence Nsil-Xbal du fragment Xbal contenu dans le plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le numéro 1-1317.
24. Polypeptide selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il a un poids moléculaire d'environ 18 kDa et en ce qu'il est le produit de l'expression dans une cellule recombinante, d'un fragment de nucléotides hybridant avec 1'oligonucleotide 18A dans des conditions stringentes, ce fragment étant contenu dans la séquence EcoRI-Xbal du fragment Xbal contenu dans le plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le numéro 1-1317.
25. Polypeptide selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il a un poids moléculaire d'environ 66 kDa et en ce qu'il est le produit de l'expression dans une cellule recombinante d'un fragment de nucléotides hybridant avec 1'oligonucleotide 66A et/ou 66B dans des conditions stringentes, ce fragment étant contenu dans la séquence Xbal-EcoRI du fragment Xbal contenu dans le plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le numéro 1-1317.
26. Fragment polypeptidique d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 22 à 25, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans une activité larvicide vis-à-vis de larves de Diptères, notamment de Moustiques ou de Simulies.
27. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 22 ou 26, caractérisé en ce qu'il est reconnu par des anticorps dirigés contre la protéine P16 selon la revendication 23, et/ou par des anticorps dirigés contre la protéine P18 selon la revendication 24, et/ou par des anticorps dirigés contre la protéine P66 selon la revendication 25.
28. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 21 à 27, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés codée par l'une au moins des enchaînements Seql, Seq2.1, Seq2.2 et reconnue par des anticorps anti-protéine P66 ou codée par l'enchaînement Seq3 et reconnue par des anticorps anti-protéine P16 ou des anticorps anti-protéine P18.
29. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 22 à 27 caractérisé en ce qu'il est modifié par addition, délétion, substitution d'acides aminés dès lors qu'il conserve la capacité du polypeptide correspondant non modifié à intervenir dans l'activité toxique vis-à-vis de larves de Diptères, notamment de Moustiques ou de Simulies.
30. Composition de polypeptides caractérisée en ce qu'elle comprend la protéine P16 selon la revendication 23 et la protéine P18 selon la revendication 24.
31. Composition de polypeptides selon la revendication 30 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre la protéine P66 selon la revendication 25.
32. Extrait protéique ayant une activité larvicide vis-à-vis de larves de Diptères, notamment de Moustiques ou de Simulies tel qu'obtenu par :
- culture de Clostridium bifermentans à 34βC en anaérobiose en milieu TYG dans un courant gazeux contenant 5% H2, 5° C02 et 90% N2, récupération de la culture en fin de sporulation, environ après 16 h,
- lavage de la culture avec NaCllM,
- rinçage 2 fois avec un tampon TE,
- récupération du culot qui constitue l'extrait.
33. Composition de polypeptides selon l'une quelconque des revendications 30 ou 31, caractérisée en ce qu'elle a l'activité larvicide d'un extrait brut selon la revendication 32.
34. Anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il est dirigé contre un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 21 à 29.
35. Antiserum polyclonal caractérisé en ce qu'il est dirigé contre un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 21 à 29 ou une composition selon l'une quelconque des revendications 30, 31 ou 33 ou un extrait selon la revendication 32.
36. Sonde nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou un fragment de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 7 à 14.
37. Composition à activité larvicide, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, un ou plusieurs polypeptides selon l'une quelconque des revendications 31 à 33.
38. Composition à activité larvicide, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif des cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 18 à 20.
39. Composition à activité larvicide selon la revendication 38, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre des cellules recombinantes contenant une séquence codant pour un polypeptide à activité larvicide de B. thurinqiensis et/ou de B. sphaericus.-
40. Composition à activité larvicide, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif des cellules recombinantes modifiées par une séquence ou un fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 ou par un vecteur selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16 lesdites cellules étant en outre modifiées par une séquence à activité larvicide de B. thurinqiensis et/ou de B. sphaericus.
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