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WO1994028130A1 - Gene that codes for polypeptide having ability to support pre-b cell proliferation - Google Patents

Gene that codes for polypeptide having ability to support pre-b cell proliferation Download PDF

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WO1994028130A1
WO1994028130A1 PCT/JP1994/000819 JP9400819W WO9428130A1 WO 1994028130 A1 WO1994028130 A1 WO 1994028130A1 JP 9400819 W JP9400819 W JP 9400819W WO 9428130 A1 WO9428130 A1 WO 9428130A1
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WO
WIPO (PCT)
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cells
gene
ability
cell
polypeptide
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP1994/000819
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshio Hirano
Tsuneyasu Kaisho
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Individual
Original Assignee
Individual
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Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
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Priority to EP94915279A priority patent/EP0725135B1/en
Priority to AU66584/94A priority patent/AU6658494A/en
Priority to AT94915279T priority patent/ATE214425T1/de
Priority to US08/537,942 priority patent/US5753464A/en
Publication of WO1994028130A1 publication Critical patent/WO1994028130A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a gene, and an adhesion factor encoded by the gene. More specifically, the present invention relates to a gene encoding a polypeptide having a pre-B cell growth supporting ability, a vector containing the gene, and a vector comprising the gene. And a method for producing an adhesion factor having the ability to support pre-B cell growth using the gene.
  • the gene of the present invention encodes a novel adhesion factor that enhances the ability to support pre-B cell proliferation on bone marrow cells and synovial cells of rheumatoid arthritis (RA) patients and multiple myeloma (MM) patients.
  • RA rheumatoid arthritis
  • MM multiple myeloma
  • the present invention enables identification of multiple myeloma (MM) and rheumatoid arthritis (RA) and preparation of reagents for clinical diagnosis thereof.
  • multiple myeloma is a cancer that progresses depending on the bone marrow microenvironment and is a single plasmacytoma with limited growth in the bone marrow, but is dependent on bone marrow stromal cells It is known that conversion of the oncogene of multiple myeloma (MM) occurs at the early stage of the differentiation and proliferation process of various B cells (pre-B cells) [J. Exp. Med., 1 50: 792 (19779), and Cancer Gnet. Cytoge net, 17: 1 3 (1 895)]].
  • bone marrow stromal cells promote proliferation of progenitor cells of multiple myeloma (MM) circulating in the peripheral blood of multiple myeloma (MM) patients [Blood, 7 7: 2 6 8 8 (1 9 9 1)].
  • bone marrow stromal cells may provide signals that promote the growth of multiple myeloma (MM).
  • polyclonal B cell activation may also be caused by bone marrow adjacent to the affected joint in rheumatoid arthritis (RA).
  • RA rheumatoid arthritis
  • the present inventors have been conducting research for the purpose of elucidating the pathological significance of the bone marrow microenvironment in diseases causing B cell dysfunction, and in RA and MM patients, He reports that bone marrow-derived stromal cells have enhanced ability to support pre-B cell proliferation, and that this ability requires direct contact between pre-B cells and stromal cells. Based on the insight that there should be factors that promote the proliferation of pre-B cells on bone marrow stromal cells of RA and MM patients, the stromal cells of each patient were Stromal cell lines (RASV5-5, MM SV3-3) having growth promoting factors were established.
  • SCF Stemcellfac tor
  • the present inventor produced a monoclonal antibody using a stromal cell line RASV5-5 derived from the bone marrow of an R ⁇ patient having a high ability to support pre-cell proliferation as a sensitizing antigen.
  • Monoclonal antibody that reacts with the stromal cell line and the osteoblastic cell line derived from the bone marrow of MM patients and does not react with the human bone marrow-derived stromal cell line NFSV1-1, which has no ability to support pre-B cell growth Got RF 3.
  • the monoclonal antibody SG-2 produced by immunizing the synovial cell line Syn SV 6 ⁇ -14 obtained by cell-lining synovial cells from RA patients produces: It was also found that it reacted with the stromal cell line RASV-5 and did not react with the human bone marrow-derived stromal cell line NFSV1-1, which has no ability to support pre-cell proliferation. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a gene encoding a polypeptide capable of supporting pre-B cell growth, a vector containing the gene, a transformant using the vector, and a pre-B cell growth support using the gene. It is an object of the present invention to provide a method for producing an adhesive factor having a function. Under such circumstances, the present inventors have prepared a cDNA library from mRNA prepared from cells expressing the adhesion factor, and then inserted these cDNAs into an expression vector. A transformed transformant was obtained. Next, a transformant that strongly reacts with the monoclonal antibody produced by the hybridoma is selected, and the cDNA used for the preparation is further divided and inserted into the expression vector again, and strongly reacts with the antibody.
  • the present invention provides a gene encoding a polypeptide having the ability to support human pre-B cell proliferation.
  • the present invention further provides a recombinant vector containing a gene encoding a polypeptide having the ability to support human pre-B cell proliferation.
  • the present invention also provides a prokaryotic or eukaryotic host cell transformed by a recombinant vector containing a gene encoding a polypeptide capable of supporting human pre-B cell growth.
  • the present invention further relates to a method for culturing a transformant transformed with a recombinant vector containing a gene encoding a polypeptide having the ability to support proliferation of human pre-B cells.
  • a method for producing a polypeptide having a cell growth supporting ability is provided.
  • the gene of the present invention can be obtained, for example, by preparing mRNA from a cell or the like which expresses an adhesin exhibiting the ability to support human pre-B cell proliferation, and then converting it to double-stranded cDNA by a known method.
  • Cells that supply this mRNA include RASV 5-5 and Syn SV 6-14 cell lines, which were used as immunogenic sources for Hydpridoroma RF3 and SG2. Examples thereof include, but are not limited to, these cell lines, as long as they are cells expressing an adhesion factor exhibiting the ability to support human pre-B cell proliferation.
  • various stromal cell lines disclosed in J. Immunol., 149: 408 (1992) can be mentioned.
  • Syn SV l-4 was used.
  • RNA For preparation of total RNA to obtain mRNA, guanidine thiosine treatment, and then cesium chloride density gradient centrifugation (Chir gw ineta 1., Biochemistry, 18: 5 2 9 4 (1 9 7 9)]
  • Chir gw ineta 1., Biochemistry, 18: 5 2 9 4 (1 9 7 9) A method for obtaining total RNA, or treatment with a surfactant or phenol in the presence of a ribonuclease inhibitor of vanadium complex [Berger & Birke nmeier, Biochemistry, 18: 5 14 3 (19779)], and other known means can be used.
  • Preparation of mRNA from total NA is performed by affinity column chromatography using oligo (dT) -bound carrier, 1 j, for example, cephalosporous cellulose or batch method from total RNA.
  • (A) It can be obtained by collecting + RNA. Further, poly (A) + RNA can be further purified by sucrose density gradient centrifugation or the like. In addition, there are a method of directly obtaining p01y (A) + RNA without preparing RNA, and a simple method using a commercially available kit.
  • the mRNA is made into type III, and an oligo (dT) complementary to the poly A-chain at the 3 'end is used as a primer.
  • dT oligo complementary to the poly A-chain at the 3 'end
  • the resulting single-stranded cDNA is transformed into type II, treated with reverse transcriptase or DNA polymerase (for example, K1en0w fragment, etc.), and then treated with S1.
  • Double-stranded cDNA can also be obtained by treatment with nuclease or the like, or by direct treatment with RNase H and DNA polymerase (Maniat isetal., Molecular Clonin, Old Spring Harbor Laboratory (1992), and Gubler & Hoffman, Gene, 25: 263 (1983)]).
  • RNase H and DNA polymerase Maniat isetal., Molecular Clonin, Old Spring Harbor Laboratory (1992), and Gubler & Hoffman, Gene, 25: 263 (1983)].
  • simple kits are also commercially available, and double-stranded cDNA can be obtained using these kits.
  • the cDNA thus obtained was incorporated into an appropriate vector, for example, an EK-type plasmid vector such as pBR322, pSC101, or a phage vector such as Igt10. Thereafter, E. coli (XI775, HB101, DH1, DH5, etc.) can be transformed to obtain a cDNA library (for example, see “M01 ecu” above). 1 ar C loning ").
  • prokaryotic or eukaryotic host cells can be transformed by inserting the double-stranded cDNA obtained by the above method into an appropriate expression vector.
  • the expression vector of the present invention contains an origin of replication, a selectable marker, a promoter located before the gene to be expressed, an RNA splice site, a polyadenylation signal, and the like.
  • Promoters for gene expression in mammalian cells include viral promoters such as retrovirus, poliovirus, adenovirus, simian virus (SV) 40, etc. ⁇ polypeptides.
  • 'A cell-derived promoter such as one factor (HEF-1) may be used.
  • HEF-1 one factor
  • the SV40 promoter it can be easily carried out by following the method of Mu11igan et al. [Nature, 277: 108 (1979)]. it can.
  • As the replication origin those derived from SV40 poliovirus, adenovirus, bovine papilloma virus (BPV), etc. can be used.
  • As a selection marker phosphotransferase APH is used.
  • TK thymidine kinase
  • E cogpt Escherichia coli xanthine-guanine phosphorolibosyl transferase
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • the host cell is transformed with a replicon derived from a species compatible with the host, i.e., a plasmid vector containing an origin of replication and regulatory sequences. It should be done. Further, it is desirable that the vector has a marker gene that can impart phenotypic (phenotypic) selectivity to the transformed cells. For example, in the case of Escherichia coli, it can be transformed using PBR322 which is a vector using the same as a host [B01iver et al., Gene, 2:95 (19775).
  • pBR322 contains genes for ampicillin and tetracycline resistance, and it is possible to identify transformed cells by utilizing either of these resistances.
  • the promoters required for gene expression in prokaryotic host cells include:-a lactamase gene promoter [Chang et al., Nature, 275: 615 (19778)] and lactose promoter. CG oeddel et al., Nature, 281: 5544 (19779)], and the tryptophan promoter CG oeddel et al., Nucleic Acid Res., 8: 4057 ( 198))] and a tac promoter.
  • prokaryotic host cells include, for example, Escherichiacoli, Bacillus subtilis (Baci 11 ussubti 1 is), and Nuku shirasu's thermofils (Baci 11 ⁇ ).
  • sthermophi 1 us) Equivalent, 'raised.
  • eukaryotic host cells include, for example, Saccharomyces cerevisiae.
  • examples include eukaryotic microorganisms such as Saccharomyces cerevisiae, COS cells, Chinese ham evening ovary (CH0) cells, C127 cells, 3T3 cells, He1a cells, and BHK.
  • Cells derived from mammals such as cells, Namalva cells, and human fetal kidney cells (293 cells) can also be used.
  • the transformant of the present invention may be cultured by appropriately selecting culture conditions suitable for the host cell.
  • a method using the pre-B cell growth supporting ability as an index or a direct expression cloning method using an antibody is used. Can be done.
  • the measurement of the ability to support pre-B cell proliferation can be carried out using a mouse pre-B cell line DW34CEur.J.Immunol., 18: 1767 (1988).
  • the adhesion factor is determined by flow cytometry (F10 w Cytometry) using FACScan using a monoclonal antibody RF3 or SG2 that recognizes an adhesion factor capable of supporting pre-B cell proliferation.
  • F10 w Cytometry FACScan using a monoclonal antibody RF3 or SG2 that recognizes an adhesion factor capable of supporting pre-B cell proliferation.
  • a transformant that expresses Escherichia coli is selected, the plasmid DNA used for the preparation of the transformant is subdivided to prepare a transformant again, and the transformant is screened by flow cytometry. By repeating this process, the target gene could be cloned.
  • the transduced transformant (293 T cells) is cultured and Was followed, ⁇ Gashi from plates with PBS containing 0.0 2% E DTA, 2% FCS.
  • the cells were washed with FAC S buffer solution consisting of PBS containing 0.0 2% N a N 3 React with RF3 and SG2 as primary antibodies.
  • the unreacted primary antibody is removed by washing with a FACS buffer, and further reacted with a secondary antibody FITC-labeled antibody (FITC-labeled goat anti-mouse Ig antibody). Dead cells were identified by staining with, and the viable cells were analyzed by FACS can to select transformants that strongly reacted with RF3 and SG2.
  • Escherichia coli (DH5) containing cDNA used in the preparation of the transformant reacted with the antibody was subjected to alkali treatment to select a plasmid group containing the gene of interest.
  • selection of transformants by FAC Scan analysis using the monoclonal antibodies RF3 and SG2 described above By repeating this step, a full-length cDNA (63-BOS) encoding a membrane protein polypeptide having a novel pre-B cell growth supporting ability shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing can be obtained. Came out.
  • the E. coli DH5 strain containing pBst-1 in which this cDNA was inserted between the XbaI cleavage sites of the pUC19 vector was obtained from the international depository authority based on the Budapest Treaty. [Name: Research Institute of Life Science and Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Address: 1-3-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan] (Postal code: 3005) scherichia Coli DH 5 (p B st — 1), deposited under accession number FE RM BP—430.
  • eukaryotic genes are considered to exhibit polymorphism, as is known for the human interferon Xron gene and the like [for example, Nishi et al., J. Biochem., 97:15]. 3 (1958)], one or more amino acids may be substituted by this polymorphism, or the amino acid may not change at all even if the nucleotide sequence changes. Sometimes.
  • amino acids lacking or adding one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing are included in one or more amino acids.
  • Polypeptides substituted with amino acids may also have the ability to support pre-B cell growth.
  • the polypeptide obtained by converting the base sequence corresponding to cystine of the leucine (IL-12) gene into a sequence corresponding to serine retains IL-2 activity. It is already known that this is the case [Wang et al., Science, 224: 1443 1 (19984)) 0
  • known protein gene and the gene of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing can be ligated using an appropriate restriction enzyme or an adapter to produce a polypeptide linked to the known protein.
  • known protein genes include immunoglobulin, and the gene shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing may be used instead of the variable region to bind to the Fc portion (: (Z ett 1 meiss 1, etc., DNA AND CELLBIOLO GY, 9: 3 4 7-3 5 3 (1 990)) o
  • a gene that hybridizes with the gene represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is also included in the present invention as long as the polypeptide expressed from the gene has the ability to support pre-B cell growth.
  • Hybridization should be performed using normal hybridization conditions (see, for example, “M01ecu1arCI oning” above). Can be.
  • soluble adhesion factors can also be created by genetic engineering.
  • the portion from G2n at the 272nd position to Leu at the 290th position in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is a highly hydrophobic region, it is located at a position before the 27th position.
  • Genes with stop codons can be constructed using PCR-mutagenesis [M. Kamman et al., Nucl. Acids Res., 15: 5404 (19989)). Good.
  • two deposited primers were added to the deposited pB st — 1 AAC C TC CAG AAG GAA AA (corresponding to the 18th to 190th positions of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) and ACC CAA GCT TT C PCR-mutagenesis using TAG ATCA AT AAA GACTTGGGGC TT (corresponding to SEQ ID NO: 1 at positions 264 to 269 + termination codon + HindIII and Xbal restriction sites) Amplify.
  • the target gene is purified using low-melting point agarose or the like, and fragmented with Bg1II and HindIII.
  • the fragment After inserting the Bglll-HindIII fragment obtained into pBst-1 treated with the same restriction enzymes, the fragment is treated with EcoRI and HindiII, and blunt-ended with a Klenow fragment. After treatment of pEF-B ⁇ S with BstXI, this DNA fragment is ligated to that treated with the Klenow fragment, and a suitable host cell is transformed to obtain a soluble adhesion factor. it can.
  • FIG. 1 shows the growth ability of the novel adhesion factor obtained in Examples of the present invention in mouse pre-B cell line DW34.
  • FIG. 2 shows the results of analyzing the hydrophobic region and the hydrophilic region of the gene obtained in the examples of the present invention.
  • a method for obtaining a gene encoding an adhesion factor capable of supporting pre-B cell growth of the present invention, a recombinant vector having the gene, a transformant containing the same, and culturing and obtaining the transformant The objective protein and the respective production methods will be described in detail with reference to the following Reference Examples and Examples, but the present invention is not limited by these Examples.
  • Reference example 1
  • stromal cell lines derived from patients with rheumatoid arthritis (RA) and capable of supporting pre-B cell proliferation
  • BM bone marrow
  • RA rheumatoid arthritis
  • healthy volunteers were obtained by Ficol 1-Hypaque density gradient centrifugation, and this was used for 10% bovine fetus. serum (Ji S), 5 0 M 2-mercaptoethanol, and cultured for several weeks in 3 7 e C in RPMI one 1 6 4 0 medium containing antibiotics. The washing was repeated to remove non-adherent cells, and the remaining adherent cells were pAct-SVT plasmid containing the SV40 1arge T antigen cDNA and the nitrile / 3-actin promoter. Do! : B BR C, 1 8 6: 1 2 9-1 3 4 ( 1 9 9 2)] was electroporated with Gene P ⁇ 1 ser (BioLad).
  • Synthetic cells derived from rheumatoid arthritis contain SV40 Large T antigen cDNA and nitric acid / 3-actin promoter pAct-SVT plasmid! : BBRC, 186: 129-134 (1992)] was subjected to electoral poration using Gene Pulser (BioLad). That is, 1 ⁇ 10 7 cells / m 1 of synovial cells from RA patient in PBS were mixed with 0.8 ml of an aliquot of plasmid and 10 ⁇ g of plasmid, and incubated on ice for 10 minutes.
  • Gene Pulser BioLad
  • the stromal cell line RASV515 and synovial cell line Syn SV6-14 derived from RA patients having high pre-B cell proliferation supporting ability obtained in Reference Examples 1 and 2 above were used.
  • the cell line used was 10% fetal calf serum (FCS, Bioproducts) and RPMI-1664 (GIBC ⁇ ) containing 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol as medium.
  • the cells were treated with 0.02% EDTA and PBS, and then recovered from the culture flask of the incubator by gentle pipetting.
  • the cells of about 1 X 1 0 7 cells / ml in cell number R PM I - 1 6 4 0 medium suspension Nigoshi, suspended, BAL B / C mice (4 weeks old, half, Japan Esue Cie one Immunized.
  • the first immunization of approximately 1 X 1 0 7 m 1 cells were injected intraperitoneally into mice were boosted with 1 X 1 0 seven Zm 1 cells after 2-3 weeks. Furthermore, the cells were 2-3 times boosters 1 X 1 0 7 or Zm l at 2-3 week intervals, spleen was excised mice were sacrificed 3 days after the final immunization.
  • mice 'myeloma cell line P3X63Ag8.653 was replaced with 10% fetal bovine serum.
  • FCS FIL TR O ⁇ Co.
  • FCS FIL TR O ⁇ Co.
  • DMEM GIBC 0 companies Ltd.
  • 1 X 1 0 7 the pieces
  • the and spleen cells 1 X 1 0 8 pieces placed and mixed in a centrifuge tube
  • polyethylene Nguri call 1 5 0 0 manufactured by B Oehringer Co.
  • the obtained fused cells were dispensed into 96 plates in a DMEM medium containing 10% FCS, and cultured at 37 in a 5% CO 2 incubator.
  • the next day from the HAT selective medium (tooth 0 X 1 0- 4 M hypoxanthine, 4. 0 X 1 0 - 7 M Ami Noputeri down, two 6 X 1 0 - 5 complete RPMI containing M thymidine - 1 6 4 0 medium
  • the medium was gradually replaced with 10% FCS and 50 ZM 2-mercaptoethanol in the medium, and the culture was continued. After the start of the culture, half of the supernatant was replaced twice a week with fresh HAT medium, and the culture was continued to maintain the growth.
  • the fused cells thus obtained were cloned using the limiting dilution method.
  • the clones were formed by adjusting the amount of the above-mentioned hybridomas and BAL BZC mouse spleen cells to a predetermined amount, and seeding them on a 96-well plate so as to obtain 1 to 10 hybridisomas / well.
  • ⁇ 2 Lee down Cuvee - evening were cultured at 3 7 ° C in one.
  • the procedure of cloning the growing hybridoma in the same manner was repeated according to the usual limiting dilution method until a single clone was theoretically obtained.
  • the clone producing the desired antibody was screened using the sensitizing antigen.
  • the hybridoma producing the above monoclonal antibodies RF3 and SG2 was obtained from BAL BZC mouse spleen cells and mouse myeloid.
  • Rome P3X63Ag 8.653 is a novel fused cell produced using the parent cell as a parent cell. It is an international depositary authority based on the Budapest Treaty. : 1-3-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan (Zip code: 2005), dated April 28, 1993, Mouse—Mousehybridoma RF 3, Accession number FE RM BP-4 6 5 6 and deposited as Mouse—Mousehybridoma SG 2, accession number FE RM BP—4657.
  • RASV5-5 sensitizing antigen
  • b) stromal cell line NFSV1-1 derived from normal human bone marrow.
  • the first screening was performed using RASV5-5, a sensitizing antigen, as a reactive cell.
  • RASV5-5 a sensitizing antigen
  • the culture supernatant that reacts with the RASV5-5 was selected and subjected to primary screening.
  • cells are suspended in a reaction buffer [PBS containing 2% FCS, 0.02% Na 3] and suspended in the hybridoma culture supernatant 20 ⁇ 1 (about 5 ⁇ 10 5 cells 0 1) and reacted at 4 ° C for 20 minutes.
  • a reaction buffer [PBS containing 2% FCS, 0.02% Na 3] and suspended in the hybridoma culture supernatant 20 ⁇ 1 (about 5 ⁇ 10 5 cells 0 1) and reacted at 4 ° C for 20 minutes.
  • FITC-labeled goat anti-mouse The antibody Ig (manufactured by Cappe 1) was added and incubated for 20 minutes. After washing three times, analysis was performed using a flow cytometer (Flow Cytometer FAC Scan, manufactured by Becton Dickinson).
  • stromal cell line NF SV1-1 derived from normal human bone marrow was used as a reaction cell, and analyzed by flow cytometry (Flow Cytometer) as described above. As a result, two types of cells were obtained as hybridomas producing antibodies that reacted more strongly with RA SV5-5.
  • the fused cells prepared in 2) were cultured according to a conventional method, and the antibody produced in the culture supernatant was separated and purified by a conventional method.
  • mice monoclonal antibodies RF3 and SG2 which selectively recognize bone marrow stromal cell lines derived from RA patients with the ability to support pre-B cell growth, were confirmed to recognize the same molecule by the following method.
  • RF3 and SG2 which selectively recognize bone marrow stromal cell lines derived from RA patients with the ability to support pre-B cell growth, were confirmed to recognize the same molecule by the following method.
  • each antibody was biotinylated using N-hydroxysuccinimide Biotin [Antibodie s: AL aboratory Manual, E. Harlow, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)), and then a RA patient-derived bone marrow stromal cell line RASV5-5 The cross-inhibition experiments used were performed.
  • RA SV 5-5 Piochin the cell line RF 3 and SG 2, or Piochin of SG 2 and 2% FCS and 0.
  • RNA from Syn SV 1-4 cells from rheumatoid arthritis (RA) patients was performed using Fast Track TM mRNA ISO LATION KIT version 3.2 (I nvitrogen). That is, Syn SV1-4 cells for 20 pieces of a culture dish of 10 cm were homogenized, and then Total RNA was prepared according to the prescription attached to the kit. Furthermore, P01y (A) + RNA was purified using oligo d (T) cellulose attached to the kit according to the instructions attached to the kit. 2) Construction of the cDNA library
  • double-stranded cDNA was synthesized according to the kit's prescription, and a BstXI adapter (Invitr) was synthesized.
  • One of the prepared adapter-added double-stranded cDNAs about 100 // //, uses 2 ⁇ 1 in one ligation reaction, and uses the restriction enzyme B st XI and alkaline phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) in advance.
  • the treated pEF-BOS vector [Nuc.AcidRes., 18: 5322 (1990)] was ligated with DNA ligationkit (Takara Shuzo) to obtain cDNA.
  • a library was built.
  • C D NA library one constructed was transformed into E. coli cell line DH 5 (Toyobo Co., Ltd.), was estimated to be the total size is independent clones of approximately 2 X 1 0 5.
  • a pool consisting of the transduced E. coli 2000 to 4000 clones was prepared for use in the following experiments.
  • the above pooled Escherichia coli was cultured in an LB medium containing 50 ag / m 1 of ampicillin [MoleculalarCloing: ALaborryManual, Sambrook, ColdSpr, etc.
  • the DNA was amplified by culturing in 1 ng Harbor Laboratory Press (19989)], and the alkaline method [Molecular C 1 oing: AL aboratory Manual, Sambrook et al. old S pring Plasmid DNA was recovered from Escherichia coli by Harbor Laboratory Press (1989)].
  • the obtained plasmid DNA was purified by increasing the degree of purification by repeating ultracentrifugation twice using a cesium chloride / bromide thidium density gradient, and 293 T cells (293 cells) by the calcium phosphate method.
  • a cell line in which SV40 Large T antigen cDNA has been introduced into Transformedprimaryembryonalkidney, human ATCCCRL1573
  • the mixture was gradually mixed with a buffer consisting of 1 um phosphate, incubated at room temperature for 30 minutes, and added to 2993 T cells in a 24-well plate.
  • the transduced 293 T cells were removed from a 24-well plate with PBS containing 0.02% EDTA, and contained 2% FCS and 0.02% ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ ⁇ S After washing the cells twice with a FACS buffer consisting of, the cells were suspended in 20 fi 1 of FACS buffer in the presence of a mixture of RF 3 and SG 2 at 10 gZml as the primary antibody, and were placed on ice for 20 minutes. Incubated at After washing twice with FACS buffer, FITC-labeled goat anti-mouse Ig antibody (Cappe 1) was used as a secondary antibody, and the mixture was further incubated for 15 minutes on ice. Providium iodide Pr 0 pidium 10 (5 1 (16 (?
  • Plasmid DNA recovered by the alkaline method was used as a pool of E. coli of the 200,000-400,000 clones and transfected into 293T cells according to the method described above, and the above FACS analysis was performed. Was screened. A peak strongly stained by mouse monoclonal antibodies RF3 and SG2 was observed in the 293T cells expressing the 20th pool.
  • the plasmid DNA was transduced again into E. coli DH5 (manufactured by GIBC0RL) and inoculated on LB agar plate containing 50 ⁇ g / ml ampicillin.
  • the 200 clones that formed the colonies were placed in a mesh pattern on the bottom of the plate so that the position of the inoculated clones could be identified. Were inoculated one by one to make two identical ones. One hundred pools of 100 clones were prepared, and Escherichia coli was cultured in an LB medium containing 50 g / 1 of ampicillin. After collection of plasmid DNA by the alkaline method, transfusion was performed on 2993 T cells by the calcium phosphate method, and FACS analysis was performed in the same manner as described above.
  • an Auto-Readsequencing kit manufactured by Pharmacia
  • an AutoCyclesequencingkit manufactured by Pharmacia
  • the base sequence was determined using E. TM DNA Sequencer (Pharmacia).
  • E. TM DNA Sequencer Pulsacia
  • the novel molecule was introduced into BALB3T3 cells, and the expression in animal cells was examined.
  • the culture medium was exchanged every three days.After about two weeks, the transformed cells that reacted with the mouse monoclonal antibody RF3 were detected in the wells that formed a single colony of viable neomycin-resistant adherent cells.
  • the strain BAL B3T3663S2 was obtained.
  • a transformed cell line BALB3T3663S1 which did not react with RF3 but was resistant to neomycin was obtained.
  • the biological properties of the novel molecule were analyzed using the mouse pre-B cell line DW34, which grows in a stromal cell-dependent manner, using the number of proliferating cells as an index and the method described below.
  • the transduced cell line BALB3T366S2 and the control cell line BALB3T363S1 were cultured in a 24-well plate until they became subconfluent, and irradiated with 30 Gy of radiation. Then, add 2 ⁇ 10 3 DW 34 per well and add 3% in RPMI-166 (GIBC ⁇ ) medium containing 10% FCS (Bioproducts). The cells were cultured at 7 ° C and 5% C02 for 4 days.
  • the number of viable DW34 cells in each well was calculated by trypan blue staining, and the growth supporting ability was analyzed. As a result, as shown in FIG. 1, the proliferation of DW34 was promoted in the transduced cell line BALB3T363S2 as compared with the control cell line BALB3T363S1.
  • PBS phosphatidylinositol-specific phosphorylase C
  • the plate After washing twice with the FACS buffer, the plate is further incubated with the FACS buffer containing the FITC-labeled goat anti-mouse Ig antibody (manufactured by C ⁇ pe1) for 20 minutes on ice. After washing three times with a FACS buffer, analysis was performed using FACS can'cton Dickinson).
  • the primary antibody was CD29 (VLA / SI, manufactured by Immunotech) for RASV5-5, R25CJ.Immunol., For BALB3T366S2. 148: 989-995 (1992)], and the same antibody as described above was used as the secondary antibody.
  • CD29 VLA / SI, manufactured by Immunotech
  • Soluble B st — 1 is a PCR-based mutagenesis method for genes that have a stop codon before the second amino acid! M. K amm an, etc., Nuc 1. Acids Res., 15: 5404 (11989)]. That is, SI and S2 '(SI primer: AAC CTC CAG AAG GAA AA, S2' primer: AC CCAAG CT TTC TAG ATCA AT AAA GAC TTG GGG CTT) as primers, and plasmid p as ⁇ ⁇ ⁇ -type DNA PCR-mutagenesis was performed using Bst-1.
  • PCR solution 100 ⁇ 1 is lO mM Tris — HC 1 (pH 8.3), 50 mM KC 1, 0.25 mM dNTP (d ATP, d GTP, d CTP, d TTP ), 1. 5 mM Mg C l 2, 2. manufactured by 5 units of a DNA polymerase Amp 1 i T aq (P erkin E lmer C etus Inc.), up respectively l OO pm ole primers (S 1 and S 2 ') And 0.1 g of plasmid DNA.
  • the obtained DNA fragment was inserted into pBst-1 digested with the same restriction enzymes Bgl II and Hindi II (manufactured by Takara Shuzo) using DNA liaionkit (manufactured by Takara Shuzo) according to the instructions attached to the kit. Then, after digestion with restriction enzymes Ec0RI and HindIII, the product was purified on a 1.5% low melting point agarose gel (FMC, Bioproducts) to obtain a DNA fragment of about 1.0 kb.
  • FMC 1.5% low melting point agarose gel
  • This DNA fragment was blunt-ended with the Klen0w fragment, digested with the restriction enzyme BstXI, and blunt-ended with the K1en0w fragment, and then p-EF-BOS was ligated with DNA ligationkit (Takara Shuzo Co., Ltd.). ) And inserted according to the instructions attached to the kit to construct p ⁇ 63-B0S.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ was transduced with the expression plasmid ⁇ 63-B ⁇ S for expression constructed as described above, and the resulting Escherichia coli was cultured in an LB medium containing 50 gZm1 of ampicillin [Molecular CI oing : Plasmid DNA was amplified by culturing in AL aboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), and the alkaline method [Mo lecular CI oing: Plasmid DNA was recovered from Escherichia coli by AL Aboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
  • the purity of the obtained plasmid DNA was increased by repeating ultracentrifugation twice using a cesium chloride Z bromide thidium density gradient, and 293 T cells [293 T cells (Transformed primary cells) were obtained by the calcium phosphate method. emb ryonalk idney, human an ATC CCRL 157 3)) (transformed into ISV40 Large T antigen cDNA).
  • 293 T cells were cultured in DMEM (GIBC II) medium containing 10% fetal bovine serum (FCS, Bioproducts) for 24 hours, and then DMEM containing 1% fetal bovine serum. replace the (GIBC 0 companies Ltd.) medium and cultured under the conditions of 3 7 ° C, 5% C_ ⁇ 2.
  • DMEM fetal bovine serum
  • the culture supernatant of the transduced 293 T cells was collected 48 hours later, concentrated 10-fold using a microconcentrator (Centoprep 10; Amicon), and Used for experiments. Similarly, £ -803 was transfected into 2993 T cells, and the culture supernatant was used as a control.
  • the biological properties of sBsII-1 were analyzed using the mouse stromal cell-dependent proliferating mouse cell line DW34 by the following method using the number of proliferating cells as an index.
  • bone marrow stromal cell line RASV515 and synovial cell line Syn SV6-14-derived from RA patients, which have the ability to support the growth of the pre-cell line, were added to the 24-well plate at 1X per well. 1 0 and 5 culture, 3 0 was exposed to radiation of G y after 2 4 hours. Add 2 ⁇ 10 3 pre-B cell lines DW34 per well and add 3 % in RPMI — 1640 (GIBCO) medium containing 10% FCS (Bioproducts). 7 ° C, The cells were cultured for 4 days under the condition of 5% C02. The concentrated culture supernatant of 293 T cells containing sBst-1 was added at the concentrations shown in Table 1.
  • the number of viable DW34 cells in each well was calculated by trypan blue staining, and the growth supporting ability was analyzed. As a result, as shown in Table 1, the growth of DW34 was suppressed in a concentration-dependent manner in the culture supernatant of the 2293 T cells containing sBst-1.
  • the present invention provides a gene encoding a polypeptide having a pre-B cell growth supporting ability, a vector containing the gene, a transformant using the vector, and a pre-B cell using the gene.
  • the present invention relates to a method for producing an adhesion factor having a growth-supporting ability.
  • the gene of the present invention relates to a pre-B gene on bone marrow cells and synovial cells of rheumatoid arthritis (RA) patients and multiple myeloma (MM) patients. Encodes a novel adhesion factor that enhances the ability to support cell growth.
  • the present invention enables the identification of multiple myeloma (MM) and rheumatoid arthritis (RA) and the preparation of diagnostic reagents for these.

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Description

明細書 プレ B細胞増殖支持能を有するポリべプチ ドをコー ドする遺伝子 技術分野
本発明は、 遺伝子、 及び該遺伝子によってコー ドされる接着因子 に関し、 更に詳しく は、 プレ B細胞増殖支持能を有するポリべプチ ドをコー ドする遺伝子、 該遺伝子を含有するベクター、 該ベクタ一 による形質転換体、 及び該遺伝子を用いたプレ B細胞増殖支持能を 有する接着因子の製造方法に関する。
本発明の遺伝子は、 慢性関節リ ウマチ （RA) 患者や多発性骨髄 腫 （MM) 患者の骨髄細胞や滑膜細胞上のプレ B細胞増殖支持能を 亢進する新規接着因子をコー ドする。 本発明の遺伝子を適当なべク 夕一に挿入 bた後、 常用の宿主細胞を形質転換することにより、 大 量に均一なプレ B細胞増殖支持能を有する接着因子を製造すること が可能となる。 このこ とから、 本発明により、 多発性骨髄腫 （MM ) 及び慢性関節リウマチ （RA) の同定及びこれらの臨床上の診断 用試薬の作成が可能となる。 背景技術
従来、 骨髄細胞の異常が、 B細胞悪性腫瘍や自己免疫疾患の発生 に関与していることが報告されている 〔An n u. R e v. I mm u n o l . , 9 : 2 4 3 ( 1 9 9 1 ) ) o
すなわち、 多発性骨髄腫 （MM) は、 骨髄の微小環境に依存して 進行する患癌であり骨髄中で限定された増殖を示す単一形質球癌で あるが、 骨髄ス トローマ細胞に依存的な B細胞の分化増殖過程の初 期段階 （プレ B細胞） で多発性骨髄腫 （MM) のガン遺伝子の転換 が起こることが知られている 〔J. E x p. M e d. , 1 5 0 : 7 9 2 ( 1 9 7 9 ) 、 及び C a n c e r G e n e t . C y t o g e n e t , 1 7 : 1 3 ( 1 9 8 5 ) 〕 。
また、 多発性骨髄腫 （MM) 患者の末梢血中を循環する多発性骨 髄腫 （MM) の前駆細胞の増殖を骨髄ス ト ローマ細胞が促進すると いう事実が報告されている 〔 B l o o d, 7 7 : 2 6 8 8 ( 1 9 9 1 ) 〕 。
これらのことから、 骨髄ス ト ローマ細胞が多発性骨髄腫 （MM) の増殖を促進するシグナルを提供している可能性がある。
一方、 I L一 6の異常生産が、 慢性関節リ ウマチ （RA) の発生 に関与していることが知られている 〔E u r . J . I mmu n o l . , 1 8 : 1 7 9 7 ( 1 9 8 8 ) 、 及び C l i n. I mmu n o l . I mmu n o p a t h o l . , 6 2 : S 6 0 ( 1 9 9 2 ) 〕 。 更 に、 E u r . J . I mm u n o l . , 2 0 : 7 2 3 ( 1 9 9 0 ) 、 及び E u r . J . I mmu n o l . , 2 1 : 6 3 ( 1 9 9 1 ) に報 告された自己免疫疾患のマウスモデルの結果から、 慢性リ ウマチ （ R A) の骨髄は何らかの異常が存在することが示唆される。
すなわち、 慢性関節リ ウマチ （R A) においても、 ポリ クローナ ルな B細胞活性化が羅患関節に隣接する骨髄に起因している可能性 が示唆されている。
本発明者は、 これら B細胞の機能異常をきたす疾患における骨髄 微小環境の病的意義を明らかにすることを目的として、 研究を進め ており、 RA及び MM患者では、 正常人と比較して、 骨髄由来ス ト ローマ細胞のプレ B細胞増殖支持能が亢進していること、 及びこの 支持能には、 プレ B細胞とス トローマ細胞との直接接触が必須であ るこ とを報告すると共に、 RA及び MM患者の骨髄ス ト ローマ細胞 上にプレ B細胞の増殖を促進する因子があるはずであるとの洞察に 基づいて、 各々の患者のス ト ローマ細胞をセルライ ン化し、 プレ B 細胞の増殖を促進する因子を有するス トローマ細胞株 （RASV 5 - 5 , MM S V 3 - 3 ) を樹立した。 これらス ト ローマ細胞株によ るプレ B細胞の増殖支持には、 既知の S t e m c e l l f a c t o r ( S C F) 、 I C AM- C D 4 4、 V C AM - 1、 L F A— 1 a , L F A - 1 β、 N C AM、 E L AM - 1 とは別の未知の 接着因子が関与していることが示唆された 〔 J . I mm u n o l . , 1 4 9 : 4 0 8 8 ( 1 9 9 2 ) ) ο
そこで、 本発明者は、 プレ Β細胞増殖支持能の高い R Α患者の骨 髄由来ス トローマ細胞株 R A S V 5 - 5を感作抗原としてモノ クロ ーナル抗体を作製したところ、 前記 R A患者の骨髄由来ス トローマ 細胞株、 及び MM患者の骨髄由来ス ト口一マ細胞株に反応し、 プレ B細胞増殖支持能を持たないヒ ト骨髄由来ス トローマ細胞株 N F S V 1 ― 1 には反応しないモノ クローナル抗体 R F 3を得た。
更には R A患者の滑膜細胞をセルライ ン化した滑膜細胞株 S y n S V 6 ·- 1 4を免疫して得たハイブリ ドーマ S G 2が産生するモノ ： ローナル抗体が、 R A患者の骨髄由来ス トローマ細胞株 R A S V ΰ一 5 と反応し、 プレ Β細胞増殖支持能を持たないヒ ト骨髄由来ス トローマ細胞株 N F S V 1 - 1 には反応しないこ とも見い出した。 発明の開示
これらのハイプリ ドーマが認識するプレ Β細胞増殖支持能を有す る新規な接着因子の発現は、 R Αや MM患者の病態の程度と相関し ている可能性が考えられることから、 この膜タンパクのより正確な 性状の解明と共に診断治療やその研究に利用可能な量の確保が重要 な課題となっている。 従って、 この接着因子の遺伝子の構造の解明 及び組換え D N A技術を用いた接着因子の大量生産技術の確立が望 まれていた。
すなわち、 本発明は、 プレ B細胞増殖支持能を有するポリべプチ ドをコー ドする遺伝子、 該遺伝子を含有するベクター、 該ベクタ一 による形質転換体、 及び該遺伝子を用いたプレ B細胞増殖支持能を 有する接着因子の製造方法を提供することを目的とするものである かかる状況下において、 本発明者等は、 接着因子が発現している 細胞より調製した mRNAから c DNAライブラ リーを作成した後 、 これら c D NAを発現ベクターに挿入し、 この発現ベクターによ り形質転換された形質転換体を得た。 次いで、 前記ハイプリ ドーマ が産生するモノ クローナル抗体と強く反応する形質転換体を選別し 、 その作成に用いた c DN Aを更に区分けして再び発現べクタ一に 挿入し、 前記抗体と強く反応する形質転換体を選択し、 その作成に 用いた c DNAを更に区分けして行く工程をく り返すことによって 、 プレ B細胞増殖支持能を有する新規接着因子の遺伝子をクロー二 ングすることに成功した。 また、 この遺伝子を適当なベクターに挿 入して形質転換体を得、 それを培養するこ とにより、 この新規接着 因子を大量に製造することができることも明らかにした。
従って、 本発明は、 ヒ トプレ B細胞増殖支持能を有するポリぺプ チ ドをコー ドする遺伝子を提供する。
本発明は、 更に、 ヒ トプレ B細胞増殖支持能を有するポリべプチ ドをコ一ドする遺伝子を含む組換えベクターを提供する。
本発明は、 また、 ヒ トプレ B細胞増殖支持能を有するポリべプチ ドをコー ドする遺伝子を含む組換えベクターによって形質転換され た原核もしく は真核宿主細胞を提供する。
本発明は、 更に、 ヒ トプレ B細胞増殖支持能を有するポリべプチ ドをコ一ドする遺伝子を含む組換えべクターによって形質転換され た形質転換体を培養することを特徴とするヒ トプレ B細胞増殖支持 能を有するポリベプチ ドの製造方法を提供する。
続いて、 本発明について詳細に説明する。
本発明の遺伝子は、 例えば、 ヒ トプレ B細胞増殖支持能を示す接 着因子を発現する細胞等から mRNAを調製した後、 既知の方法に より二本鎖 c DNAに変換することにより得られる。 この mRNA の供給源となる細胞としては、 ハイプリ ドーマ R F 3や S G 2の免 疫源として用いた R A S V 5 — 5や S y n S V 6 — 1 4の細胞株が あげられるが、 これら細胞株に限らず、 ヒ トプレ B細胞増殖支持能 を示す接着因子を発現している細胞であればよい。 一例としては、 J . I mmu n o l . , 1 4 9 : 4 0 8 8 ( 1 9 9 2 ) に開示され た各種ス トローマ細胞株をあげることができる。 尚、 本発明では、S y n S V l — 4を用いた。
mRNAを得るための全 RNAの調製は、 グァニジンチオシァネ 一ト処理後、 塩化セシウム密度勾配遠心を行ない 〔C h i r gw i n e t a 1. , B i o c h e m i s t r y, 1 8 : 5 2 9 4 ( 1 9 7 9 ) 〕 全 RNAを得る方法や、 バナジウム複合体のリボヌ ク レアーゼイ ンヒビ夕一存在下に界面活性剤処理、 フヱノール処理 を行う 〔B e r g e r & B i r k e nm e i e r , B i o c h e m i s t r y, 1 8 : 5 1 4 3 ( 1 9 7 9 ) 〕 方法の他、 公知の 手段を用いることができる。
全 N Aからの mRNAの調製は、 オリゴ （ d T) を結合した担 体、 1 jえば、 セファロ一スゃセルロース等を用いたァフィ二ティ ー カラムクロマ トグラフィーかバッチ法により全 RNAから p o 1 y (A) +RNAを回収することでできる。 また、 ショ糖密度勾配遠 心法等により p o l y (A) +RNAを更に精製するこ ともできる 。 その他、 いったん RNAを調製せずに、 直接 p 0 1 y (A) +R N Aを得る方法や市販のキッ トを用いた簡便な方法もある。
上記の如く して得た mRNAから二本鎖 c DN Aを得るには、 例 えば、 mRNAを铸型にして、 3 ' 末端にあるポリ A—鎖に相補的 なオリゴ （ d T) をプライマーとして逆転写酵素で処理して m R N Aに相補的な DNA ( c DN A) を合成する。
mRNAをアルカ リ処理により分解、 除去した後、 得られた一本 鎖 c DN Aを铸型にして逆転写酵素あるいは DN Aポリ メラーゼ （ 例えば、 K 1 e n 0 w断片等） 処理後、 S 1 ヌ ク レアーゼなどで処 理するか、 直接 RN a s e H及び DNAポリ メラーゼ等で処理する ことによつても二本鎖 c DNAを得ることができる 〔Ma n i a t i s e t a l . , Mo l e c u l a r C l o n i n , C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y ( 1 9 8 2 ) 、 及び G u b l e r & H o f f m a n, G e n e, 2 5 : 2 6 3 ( 1 9 8 3 ) 〕 。 最近、 簡便なキッ ト も市販されてお り、 これらを用いて二本鎖 c DN Aを得るこ ともできる。
このようにして得られた c D N Aを適当なベクター、 例えば、 p B R 3 2 2、 p S C 1 0 1等の E K型プラス ミ ドベクタ一や； I g t 1 0等のフ ァージベクター等に組み込んだ後、 大腸菌 （X I 7 7 6 , H B 1 0 1 , D H 1 , D H 5など） 等を形質転換して c DN Aラ ィブラ リ 一を得るこ とができる （例えば、 前出 " M 0 1 e c u 1 a r C l o n i n g" を参照） 。
一方、 前述の方法で得た二本鎖 c DNAを適当な発現ベクターに 挿入するこ とにより、 他の原核生物又は真核生物の宿主細胞を形質 転換させるこ とができる。
二本鎖 c DNAをべクタ一と連結させるには適当な化学合成 DN Aアダプターを付加し、 予じめ制限酵素を用いて開裂させたベクタ 一 DNAと ATP存在下に T 4フ ァージ DNAリ ガーゼで処理する こ とにより行う こ とができる。
本発明の発現べクタ一は、 複製起源、 選択マーカー、 発現させよ う とする遺伝子の前に位置するプロモーター、 RNAスプライス部 位、 ポリ アデニル化シグナル等を含んでいる。
哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモーターと しては、 レ ト ロウィルス、 ポリオ一マウィルス、 アデノ ウイルス、 シ ミ アンウイ ルス （SV) 4 0等のウィルスプロモーターゃヒ ト ■ ポリペプチ ド . チェーン ' ェロ ンゲーシヨ ン ' フ ァ クター 1 ひ （HE F— 1 ひ ） 等の細胞由来のプロモーターを用いればよい。 例えば、 SV 4 0の プロモーターを使用する場合は、 Mu 1 1 i g a n等の方法 〔N a t u r e , 2 7 7 ： 1 0 8 ( 1 9 7 9 ) 〕 に従えば、 容易に実施す るこ とができる。 複製起源と しては、 SV 4 0ポリオ一マウィルス、 アデノ ウィル ス、 牛パピローマウィルス （B PV) 等の由来のものを用いるこ と ができ、 選択マーカ一としては、 ホスホ トラ ンスフェラ一ゼ AP H ( 3 ' ) I Iあるいは I (n e 0 ) 遺伝子、 チ ミ ジンキナーゼ （T K) 遺伝子、 大腸菌キサンチン一グァニンホスホリ ボシル トラ ンス フェラーゼ （E c o g p t ) 遺伝子、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （D H F R) 遺伝子等を用いるこ とができる。
宿主細胞として原核細胞を用いて目的の遺伝子を形質発現させる には、 宿主と適合し得る種由来のレブリ コン、 すなわち複製起源及 び調節配列を含んでいるプラス ミ ドベクターで宿主細胞を形質転換 させればよい。 また、 ベクターは、 形質転換細胞に表現形質 （表現 型） の選択性を付与するこ とができるマーカ一遺伝子を持つものが 望ま しい。 例えば、 大腸菌の場合には、 それを宿主とするベクター である P BR 3 2 2を用いて形質転換するこ とができる 〔B 0 1 i v e r等， G e n e, 2 : 9 5 ( 1 9 7 5 ) 〕 。 p B R 3 2 2は、 アンピシリ ン及びテ トラサイ ク リ ン耐性の遺伝子を含んでおり、 ど ちらかの耐性を利用するこ とによつて形質転換細胞を同定するこ と ができる。 原核宿主細胞の遺伝子発現に必要なプロモーターと して は、 —ラ クタマーゼ遺伝子のプロモータ一 〔 C h a n g等， N a t u r e, 2 7 5 : 6 1 5 ( 1 9 7 8 ) 〕 や、 ラ ク トースプロモー 夕一 CG o e d d e l等， N a t u r e, 2 8 1 : 5 4 4 ( 1 9 7 9 ) 〕 、 及び ト リ プ トフ ァ ンプロモーター CG o e d d e l等， N u c l e i c A c i d R e s . , 8 : 4 0 5 7 ( 1 9 8 0 ) 〕 、 t a cプロモーター等があげられる。
本発明の発現系に用いる宿主のうち原核宿主細胞としては、 例え ば、 大腸菌 （E s c h e r i c h i a c o l i ) 、 枯草菌 （ B a c i 1 1 u s s u b t i 1 i s ) 、 ノく シラス ' サーモフ ィ ルス （ B a c i 1 1 υ s t h e r m o p h i 1 u s ) 等力、'あげられる。 また、 真核宿主細胞としては、 例えば、 サッカロ ミ セス · セレ ビ シェ一 (S a c c h a r omy c e s c e r e v i s i a e ) 等 の真核微生物があげられるほか、 C O S細胞、 チャイニーズハム夕 一卵巣 （CH0) 細胞、 C 1 2 7細胞、 3 T 3細胞、 H e 1 a細胞 、 B HK細胞、 ナマルバ細胞、 ヒ ト胎児腎細胞 （ 2 9 3細胞） 等の ホ乳動物由来の細胞も用いることができる。
尚、 本発明の形質転換体の培養は、 宿主細胞に適した培養条件を 適宜選択して行えばよい。
プレ B細胞増殖支持能を有する接着因子をコー ドする c DNAを 単離するには、 例えば、 プレ B細胞増殖支持能を指標とするか、 抗 体を用いた直接発現クローニング等の方法を用いて行うことができ る。 プレ B細胞増殖支持能の測定は、 マウスプレ B細胞株 DW 3 4 C E u r . J . I mmu n o l . , 1 8 : 1 7 6 7 ( 1 9 8 8 ) ] を用いて実施することができる。
すなわち、 2 4穴プレー トにプレ Β細胞増殖支持能を有する接着 因子を発現している細胞をサブコ ンフルェン ト （概ね 5 0 %密度が 望ま しい） になるまで培養し、 適量の放射線を照射した後、 1穴あ たり l〜2 x 1 03 個の DW3 4を添加し、 1 0 %F C Sを含む R PM I — 1 6 4 0培地中で 5 %C 02 の条件下、 3 7 °Cで 4〜 6 日 間程度培養する。 各穴の DW 3 4の生存細胞数を ト リパンブルー染 色で調べることによって増殖支持能の亢進の程度がわかる。
本発明では、 プレ B細胞増殖支持能を有する接着因子を認識する モノ クローナル抗体 R F 3、 S G 2を用いた FAC S c a nによる フローサイ トメ ト リー （F 1 0 w C y t om e t r y) により、 接着因子を発現している形質転換体を選別し、 その形質転換体の作 成に用いたプラスミ ド DN Aを細分化して再度形質転換体を作成し 、 その形質転換体をフローサイ トメ ト リーによりスク リーニングす ることをく り返すことによって、 目的の遺伝子をクローニングする こ とができた。
すなわち、 形質導入された形質転換体 （ 2 9 3 T細胞） を培養し た後、 0. 0 2 %の E DTAを含む P B Sでプレー トより剝がし、 2 % F C S . 0. 0 2 %N a N3 を含む P B Sからなる FAC S緩 衝液で細胞を洗浄した後、 一次抗体として R F 3及び S G 2 と反応 させる。 次いで、 F A C S緩衝液で洗浄して未反応の一次抗体を除 去し、 二次抗体の F I TC標識抗体 （F I TC標識ャギ抗マウス I g抗体） と更に反応させた後、 ヨウ化プロビジゥ厶による染色で死 亡細胞を識別し、 生存細胞を F A C S c a nで解析することによつ て、 R F 3及び S G 2 と強く反応する形質転換体を選別した。
更に、 抗体と反応した形質転換体の作成に用いた c DN Aを含む 大腸菌 （DH 5 ) をアルカ リ処理して目的遺伝子を含むプラスミ ド 群を選別し、 これらのプラスミ ド群を更に幾つかのプラスミ ド群に 小分けして、 再度、 2 9 3 T細胞に形質導入させた後、 前述のモノ クロ一ナル抗体 R F 3及び S G 2を用いた FAC S c a n解析によ る形質転換体の選択をく り返すことにより、 配列表の配列番号 2に 示される新規なプレ B細胞増殖支持能を有する膜夕ンパクポリぺプ チ ドをコー ドする完全長 c DNA ( 6 3— B O S) を得ることがで きた。
尚、 この c DNAを p UC l 9ベクターの X b a I切断部位間に 挿入した p B s t — 1 を含有する大腸菌 （E. C o l i ) DH 5 ひ 株は、 ブダペス ト条約に基づく国際寄託当局 〔名称 ： 工業技術院生 命工学工業技術研究所， あて名 ： 日本国茨城県筑波市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 ) 〕 に、 1 9 9 3年 5月 1 9 日付で、 E s c h e r i c h i a C o l i DH 5 ひ （p B s t — 1 ) , 受託番 号 F E RM B P— 4 3 0 5 として寄託されている。
一般に、 真核生物の遺伝子は、 ヒ トインターフ Xロン遺伝子等で 知られているように、 多形現象を示すと考えられ 〔例えば、 N i s h i等， J. B i o c h em. ， 9 7 : 1 5 3 ( 1 9 8 5 ) 〕 、 こ の多形現象によって 1個又はそれ以上のアミ ノ酸が置換されている 場合もあれば、 塩基配列の変化はあってもァ ミ ノ酸は全く変わらな い場合もある。
また、 配列表の配列番号 1のァ ミ ノ酸配列の中の 1個又はそれ以 上のア ミ ノ酸を欠く か又は付加したポリペプチ ドあるいはア ミ ノ酸 が 1個も しく はそれ以上のア ミ ノ酸で置換されたポリペプチ ドでも プレ B細胞増殖支持能を有するこ とがある。 例えば、 ヒ トイ ン夕一. ロイキン （ I L一 2 ) 遺伝子のシスティ ンに相当する塩基配列をセ リ ンに相当する配列に変換して得られたポリべプチ ドが I L— 2活 性を保持するこ とも既に公知となっている 〔Wa n g等， S c i e n c e, 2 2 4 : 1 4 3 1 ( 1 9 8 4 ) ) 0
更には、 既知タ ンパクの遺伝子と配列表の配列番号 2の遺伝子を 適当な制限酵素又はアダプタ一等を用いて連結させて、 既知夕 ンパ ク と結合したポリペプチ ドとして産生させるこ ともできる。 既知夕 ンパクの遺伝子としては、 例えば、 免疫グロブリ ンがあげられ、 そ の可変領域部分の代わりに配列表の配列番号 2に示される遺伝子を 用いて、 F c部分と結合させればよい （： （Z e t t 1 m e i s s 1 等， DNA AND C E L L B I O L O GY, 9 : 3 4 7 - 3 5 3 ( 1 9 9 0 ) ) o
また、 真核細胞で発現させた場合、 その多く は糖鎖が付加される 力 ア ミ ノ酸を 1ないしそれ以上変換するこ とにより糖鎖付加を調 節するこ とができるが、 この場合もプレ B細胞増殖支持能を有する こ とがある。 従って、 本発明におけるプレ B細胞増殖支持能を有す るポリペプチ ドをコー ドする遺伝子を人工的に改変したものでも、 得られたポリペプチ ドがプレ B細胞増殖支持能を有する限り、 それ らの遺伝子は全て本発明に含まれる。
更に、 配列表の配列番号 2に示される遺伝子とハイブリ ダィズす る遺伝子も、 その遺伝子から発現されるポリペプチ ドがプレ B細胞 増殖支持能を有する限り、 本発明に含まれる。 ハイブリ ダィゼーシ ョ ンは、 通常のハイプリ ダイゼ一ショ ンの条件 （例えば、 前述の " M 0 1 e c u 1 a r C I o n i n g" を参照） を用いて行う こ と ができる。
目的とするプレ B細胞増殖支持能を有するポリべプチ ドをコ一 ド する遺伝子で形質転換した形質転換体を培養し、 産生したポリぺプ チ ドを適当な可溶化剤で可溶化した後、 分離、 精製することによつ て、 均一な可溶性の接着因子を得ることができる。 尚、 可溶化剤と. しては、 N o n i d e t P— 4 0 (NP— 4 0 ) , S o d i um
D o d e c y l S u l p h a t e (S D S) , T r i t o n X— 1 0 0 , Tw e e n 2 0等があげられる。
また、 可溶性の接着因子は遺伝子工学的に作成することもできる 。 すなわち、 配列表の配列番号 1 に於ける 2 7 2番目の G 1 nから 2 9 0番目の L e uまでの部分は疎水性が高い領域であることから 、 2 7 2番目より前の位置に終止コ ドンを有する遺伝子を P CR— 変異誘発法 〔M. K amm a n等， Nu c し A c i d s R e s . , 1 5 : 5 4 0 4 ( 1 9 8 9 ) ) を用いて作成すればよい。
具体的には、 寄託した p B s t — 1 に 2つのプライマ一 AAC C TC CAG AAG GAA A A (配列表の配列番号 1の 1 8 5番目〜 1 9 0番目に相当） 及び A C C CAA G C T TT C TAG A T C A AT AAA G A C T T G G G G C TT (配列表の配列番号 1 の 2 6 4番目〜 2 6 9番目 +終止コ ド ン + H i n d I I I 及び X b a l制限部位に相当） を用いて、 P C R—変異誘発法で増幅する。 低融点ァガロースなどを用いて目的 の遺伝子を精製し、 B g 1 I I及び H i n d I I Iで断片化する。 同じ制限酵素で処理した p B s t — 1 に得られた B g l l l — H i n d I I I断片を挿入した後、 E c o R I と H i n d i I Iで処理 し、 K l e n ow断片で平滑末端とする。 B s t X Iで p E F— B 〇 Sを処理した後、 K l e n ow断片で処理したものにこの DN A 断片を連結させ、 適当な宿主細胞を形質転換させて可溶性の接着因 子を得ることができる。
分離、 精製の手段としては、 通常の蛋白質で用いられる方法を適 用すればよ く、 例えば、 前述のモノ クローナル抗体を用いたァフィ 二ティ 一クロマ トグラフィ ー等の各種クロマ トグラフィ ー、 限外ろ 過、 塩析、 透析等も適宜選択、 組合わせれば、 本発明のポリべプチ ドを分離、 精製することができる。 図面の簡単な説明
図 1 は、 本発明の実施例で得られた新規接着因子のマウスプレ B 細胞株 DW 3 4の増殖能を示す。
図 2は、 本発明の実施例で得られた遺伝子の疎水性領域と親水性 領域を解析した結果を示す。 本発明のプレ B細胞増殖支持能を有する接着因子をコー ドする遺 伝子を得る方法、 該遺伝子を有する組換えベクター、 及びこれを含 有する形質転換体、 並びにこの形質転換体を培養し取得した目的の 蛋白質、 並びに夫々の製造法について、 以下の参考例及び実施例に よつて詳細に説明するが、 この実施例によって本発明が限定される ものではない。 参考例 1
プレ B細胞増殖支持能を有する慢性関節リ ウマチ （RA) 患者由 来及び健常人由来ス トローマ細胞株の樹立
慢性関節リウマチ （RA) 患者、 健常人の骨髄 （BM) の単核細 胞 （m o n o n u c l e a r ) 分画を、 F i c o l 1 - H y p a q u e密度勾配遠心分離で得た後、 これを、 1 0 %牛胎児血清 （ じ S) 、 5 0 M 2—メルカプトエタノール、 抗生物質を含む R P M I 一 1 6 4 0培養液中で 3 7 eCで数週間培養した。 洗浄をく り返し 、 非付着性細胞を除去し、 残った付着細胞に、 S V 4 0の 1 a r g e T抗原 c DNAとニヮ ト リ /3—ァクチンプロモーターを含む p A c t — SVTプラス ミ ド ！： B BR C, 1 8 6 : 1 2 9 - 1 3 4 ( 1 9 9 2 ) 〕 を、 G e n e P υ 1 s e r (B i o L a d社製） で エレク トロポレーショ ンした。
前記細胞とプラスミ ドを 1 5分間水中でインキュベー ト した後、 2 5 0 V、 2 5 0 F静電容量でエレク ト口ポレーシヨ ンを行い、 更に氷上で 1 0分間イ ンキュベー ト した後、 1 0 c mデイ シュ中で 培養した。 付着細胞が多く成育しているコロニーを、 小片のろ紙で 取り出し、 慢性関節リウマチ （RA) 患者及び健常人の骨髄由来ス トローマ細胞株 （RASV 5— 5、 及び NF SV 1 — 1 ) を得た。 C J . I mmu n o l . , 1 4 9 : 4 0 8 8 ( 1 9 9 2 ) 〕 。 参考例 2
プレ Β細胞増殖支持能を有する慢性関節リウマチ （RA) 患者由 来滑膜細胞株の樹立
慢性関節リ ウマチ （R Α) 由来の滑膜細胞に S V 4 0の L a r g e T抗原 c DNAとニヮ ト リ /3—ァクチンプロモータ一を含む p A c t — S VTプラスミ ド ！： B BR C, 1 8 6 : 1 2 9— 1 3 4 ( 1 9 9 2 ) 〕 を、 G e n e P u l s e r (B i o L a d社製） を 用いてエレク ト口ポレーシヨ ンした。 すなわち、 P B S中の RA患 者由来の滑膜細胞 1 X 1 07 細胞/ m 1の 0. 8 m l ァリ コー トと 1 0 〃 gのプラスミ ドを混合し、 1 0分間氷中でイ ンキュベー ト し た後、 2 5 0 V、 2 5 0 F静電容量の条件でエレク ト口ポレーシ ヨ ンを行い、 更に、 1 0分間氷中でインキュベー ト した後、 1 0 % F C S (B i o p r o d u c t s社製） を含む R PM I — 1 6 4 0 培地 （G I B C 0社製） に懸濁し 1 0 c m培養皿にて培養した。 培 養液の交換は 3日おきに行い、 約 2週間後に生育のよい付着細胞の コロニーをト リブシンを染み込ませた小片のろ紙にて取りだし、 R A由来滑膜細胞株 （S y n SV l - 4及び S y n SV 6— 1 4 ) を 得た。 参考例 3
モノ クロ一ナル抗体の作製
1 ) 感作抗原と免疫法
感作抗原として、 上記参考例 1及び 2で得たプレ B細胞増殖支持 能の高い R A患者由来ス トローマ細胞株 R AS V 5一 5及び滑膜細 胞株 S y n S V 6 - 1 4を用いて抗原感作を行った。 細胞株は、 1 0 %牛胎児血清 （F C S, B i o p r o d u c t s社製） 、 及び 5 0〃M 2— メルカプトェタノ一ル含有 R P M I - 1 6 4 0 (G I B C〇社製） を培地として使用し、 5 %C〇 2 イ ンキュベータ一中で 3 7での温度条件下で継代培養を行った。
細胞は、 0. 0 2 %EDTA、 P B S処理後、 軽いピベッティ ン グによってイ ンキュベーターの培養フラスコより回収した。 この細 胞を約 1 X 1 07 個/ m l の細胞数で R PM I - 1 6 4 0培地に懸 濁し、 浮遊させ、 BAL B/C系マウス （ 4週令、 半、 日本エスェ ルシ一社製） に免疫した。 初回免疫には、 約 1 X 1 07 個 m 1 の 細胞をマウス腹腔内に注射し、 2〜 3週後に 1 X 1 07 個 Zm 1 の 細胞を追加免疫した。 更に、 2〜 3週間隔にて 1 X 1 07 個 Zm l の細胞を 2〜 3回追加免疫し、 最終免疫 3 日後にマウスを屠殺して 脾臓を摘出した。
2 ) 細胞融合
1匹のマウスから摘出した脾臓を細切後、 遊離した脾細胞を遠沈 した後、 R P M I — 1 6 4 0培地 （ G I B C O社製） 中に懸濁し、 浮遊させ、 充分に洗浄を行った。 一方、 マウス ' ミエローマ細胞株 P 3 X 6 3 A g 8. 6 5 3 〔 J. I mmu n o l . , 1 2 3 : 1 5 4 8 ( 1 9 7 9 ) 〕 を、 1 0 %牛胎児血清 （F C S, F I L TR O Ν社製） を含有する DMEM (G I B C 0社製） 培地にて培養して 得た細胞を、 同様に前記 DMEM培地で洗浄後、 その 1 X 1 07 個 と、 前記脾細胞 1 X 1 08 個とを遠心管に入れ混合し、 ポリエチレ ングリ コール 1 5 0 0 (B o e h r i n g e r社製） によって常法 C C 1 i n. E x p. I mmu n o l . , 4 2 : 4 5 8 - 4 6 2 ( 1 9 8 0 ) ) に従い細胞融合させた。
得られた融合細胞を、 1 0 %F C Sを含む DM EM培地にて 9 6 個のゥヱルプレー トに分注し、 5 %C 02 イ ンキュベータ一中で 3 7 で培養した。 翌日より HAT選択培地 （ し 0 X 1 0—4Mヒポ キサンチン、 4. 0 X 1 0 — 7Mアミ ノプテリ ン、 に 6 X 1 0 — 5M チミ ジンを含む完全 R P M I — 1 6 4 0培地に、 1 0 % F C S及び 5 0 Z M 2—メルカプトエタノールを加えた培地） に徐々に置換さ せて培養を続けた。 培養開始後、 上清の半分を週 2回の頻度に、 そ れぞれ新しい HAT培地に代え、 培養を継続し、 増殖維持させた。
このようにして得られた融合細胞を限界希釈法を用いてクロー二 ングした。
すなわち、 前記融合細胞の培養上清中の抗体を利用して、 感作抗 原との結合性を調べ、 感作抗原と強い結合性を有するクローンだけ を常法により限界希釈法を用いてクローンを形成させた。
クローンの形成は、 前記ハイプリ ドーマ及び B A L BZC系マウ ス脾細胞を所定量含むように調整し、 ハイプリ ドーマ 1 〜 1 0個/ ゥエルとなるように 9 6ゥエルのプレー トに播いて 5 %C〇 2 イ ン キュベ—夕一中で 3 7 °Cにて培養した。 増殖してく るハイプリ ド一 マを同様にクローニングする操作を、 通常の限界希釈法に従って、 理論上単一のクローンとなるまで繰り返した。 目的の抗体を産生す るクローンは、 前記感作抗原を用いてスク リーニングを行った。
このようにして、 R AS V 5— 5 とは反応するが、 プレ B細胞増 殖支持能を持たない正常ヒ ト骨髄由来ス ト ローマ細胞株 NF S V 1 一 1 とはほとんど反応しない抗体を産生する 2種のハイプリ ドーマ (R F 3， S G 2 ) を分離した。 これらのハイプリ ドーマが産生す る抗体は、 それぞれ、 1 〇 2 3及び 1 〇 2 3でぁった。
尚、 上記のモノ ク ローナル抗体 R F 3、 及び S G 2を産生する当 該ハイプリ ドーマは、 B AL BZC系マウス脾細胞とマウス · ミェ ローマ P 3 X 6 3 A g 8. 6 5 3を親細胞として作製された新規な 融合細胞であり、 ブダペス ト条約に基づく国際寄託当局 〔名称 ： ェ 業技術院生命工学工業技術研究所， あて名 ： 日本国茨城県筑波市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 ) 〕 に、 1 9 9 3年 4月 2 8 日付 で、 M o u s e— M o u s e h y b r i d o m a R F 3， 受託 番号 F E RM B P - 4 6 5 6、 及び M o u s e —M o u s e h y b r i d o m a S G 2 , 受託番号 F E RM B P— 4 6 5 7 と して寄託されている。
3 ) スク リーニング
融合細胞 （ハイプリ ドーマ） のスク リーニングは、 フローサイ ト メーター （ F l o w C y t o m e t e r ) を使った間接蛍光抗体 法により行った。
目的の抗体を産生するクローンのスク リーニングは、 ターゲッ ト 細胞として、 a ) R A S V 5 - 5 (感作抗原） 、 b ) 正常ヒ ト骨髄 由来ス トローマ細胞株 N F S V 1 — 1、 等を用いて行った。 すなわ ち、 プレ B細胞増殖支持能の高い R A患者の骨髄由来ス トロ一マ細 胞株 （R A S V 5 — 5 ) を B A L BZCマウスに免疫することによ り、 R A S V 5 — 5 と反応するがプレ B細胞増殖支持能を持たない 正常ヒ ト骨髄由来ス トローマ細胞株 （N F S V 1 — 1 ) とは反応し ない事を指標にモノ クローナル抗体のスク リーニングを行った。 最 初のスク リーニングは、 反応細胞として感作抗原である R A S V 5 — 5を用いて行った。 先ず、 R A S V 5 — 5に反応する融合紬胞ク ローンを選ぶために、 当該 R A S V 5 — 5に反応する培養上清を選 別し、 1 次スク リーニングを行った。
すなわち、 細胞を反応バッファー 〔 2 % F C S, 0. 0 2 %N a 3 を含む P B S〕 に懸濁し、 ハイプリ ドーマ培養上清 2 0 〃 1 中 に浮遊させ （約 5 X 1 05 個 Z 2 0 1 ) 、 4 °Cにて 2 0分間反応 させた。
前記バッフ ァーにより 2回洗浄した後、 F I T C標識ャギ抗マウ ス I g抗体 （ C a p p e 1社製） を加えて 2 0分間ィンキュベーシ ヨ ンした。 3回洗浄した後、 フローサイ トメーター （F l ow C y t om e t e r FAC S c a n, B e c t o n D i c k i n s o n社製） にて解析した。
次に、 反応細胞として正常ヒ ト骨髄由来ス トローマ細胞株 NF S V 1 — 1を用い、 前記の如く フローサイ トメ一夕一 （F l ow C y t om e t e r ) により解析した。 これによつて、 RA SV 5— 5により強く反応する抗体を産生しているハイプリ ドーマとして 2 種の細胞を得た。
4 ) 抗体の精製
前記 2 ) で作製した融合細胞を常法に従って培養し、 培養上清中 に産生される抗体を常法により分離し、 精製した。
すなわち、 各ゥエルのうち前記感作抗原に対する抗体価の最も高 かったゥエルからハイプリ ドーマを採取し、 細胞の増殖が認められ たゥエルのうち 1つを取り、 得られた培養細胞を 5 %C 02 組織培 養フラスコに広げて 3 7でにて継代培養を行い、 増殖させた。 得ら れた細胞をプリスタ ン投与を施行した BAL BZC系マウス （ 6週 , 罕， 日本エスエルシー社製） に腹腔内注入した。 1 0〜 1 4 日 後、 産生された腹水を採取し、 5 0 %硫酸アンモニゥムで塩折し P B Sで透析後、 QAEカラムにて精製を行った。 抗体は、 更に塩析 し、 充分に透析を行い、 約 6 m gZm 1 の精製品を得た。 参考例 4
プレ B細胞増殖支持能を有する R A患者由来骨髄ス トローマ細胞 株を選択的に認識するマウスモノ クローナル抗体 R F 3及び S G 2 は、 以下に示す方法により同一の分子を認識していることが確認さ れた。
すなわち、 それぞれの抗体を N— h y d r o x y s u c c i n i m i d e B i o t i nを用いてピオチン化 〔An t i b o d i e s ： A L a b o r a t o r y Ma n u a l , E . H a r l ow 等， C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s ( 1 9 8 8 ) 〕 した後、 RA患者由来骨髄ス トロー マ細胞株 R AS V 5― 5を用いた交差阻害実験を行った。 RA S V 5— 5細胞株をピオチン化 R F 3及び S G 2、 又はピオチン化 S G 2及び R F 3の組み合わせで 2 % F C S及び 0. 0 2 %N a N3 を 含むリ ン酸緩衝生理食塩水 （ P B S ) からなる F A C S緩衝液 2 0 〃 1 中に懸濁し 2 0分間氷中でインキュベー ト し、 FAC S緩衝液 にて 2回洗浄後 F I TC標識ス ト レプトアビジンを加え、 更に 2 0 分間氷中でイ ンキュベー ト した。 FA C S緩衝液にて 3回洗浄後、 FAC S c a n (B e c t o n D i c k i n s o n社製） にて解 折し、 いずれの組み合わせでも交差阻害が認められた。 このことよ り、 マウスモノ クローナル抗体 R F 3及び S G 2は、 同一の分子の 同じェピトープ、 もしく は極近傍のェピトープを認識しているもの と考えられた。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例について具体的に記載する。
実施例 1
1. c DN Aライブラ リーの作製
1 ) o l y (A) +RNAの調製
慢性関節リ ウマチ （RA) 患者由来滑膜細胞株 S y n S V 1 - 4 細胞からの P o l y (A) + RNAの調製は、 F a s t T r a c k™ mRNA I S O LAT I ON K I T v e r s i o n 3. 2 ( I n v i t r o g e n社製） を用いて実施した。 すなわち , 1 0 c m培養皿 2 0枚分の S y n S V 1 - 4細胞をホモジネー ト し、 キッ ト添付の処方に従って T o t a 1 RNAを調製した。 更 に、 キッ ト付属のオリゴ d (T) セルロースを用いて、 キッ ト添付 の処方に従って P 0 1 y (A) +RNAを精製した。 2 ) c D NAライブラ リ 一の構築
上記 p o l y (A) + R NA 5 〃 gを材料として c D NA合成キ ッ ト T i m e S a v e r™ c D NA S y n t h e s i s K
1 t ( P h a r m a c i a社製） を用いてキッ ト添付の処方に従つ て二本鎖 c D NAを合成し、 B s t X I アダプター （ I n v i t r
0 g e n社製） を DNA l i g a t i o n k i t (宝酒造社製 ) を用いてキッ ト添付の処方に従って連結した。 遊離の B s t X I アダプタ一の除去はキッ ト付属の S i z e S e p 4 0 0 S p i n C o l u m nを用いてキッ ト添付の処方に従って行い、 了ダ プタ一付加 2本鎖 c D N A約 1 0 0 1 を得た。
作製したアダプター付加 2本鎖 c D NA約 1 0 0 // 1 のうち 1 回 の i g a t i o n反応には 2 〃 1 を使用し、 予じめ制限酵素 B s t X I 及びアルカ リ フ ォスファターゼ （宝酒造社製） 処理した p E F— B O Sベクター 〔N u c . A c i d R e s . ， 1 8 ： 5 3 2 2 ( 1 9 9 0 ) 〕 と D NA l i g a t i o n k i t (宝酒造社 製） を用いて連結し、 c D NAライブラ リ ーを構築した。 構築した c D NAライブラ リ 一は大腸菌細胞株 D H 5 ( トーョーボー社製） に形質導入され、 全体のサイズは約 2 X 1 0 5 の独立したクローン である と推定された。 形質導入した大腸菌 2 0 0 0〜 4 0 0 0 クロ —ンからなるプールを 5 0 プール作成し以下の実験に用いた。
2. 直接発現法によるクローニング
1 ) 2 9 3 T細胞への トラ ンスフエ ク シヨ ン
上記のプールした大腸菌を 5 0 a g/m 1 のァンピシリ ンを含む L B培地 [M o l e c u l a r C l o i n g : A L a b o r a t o r y M a n u a l , S a m b r o o k ら， C o l d S p r
1 n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s ( 1 9 8 9 ) 〕 にて培養するこ とにより c D NAの増幅を行い、 アルカ リ 法 [M o l e c u l a r C 1 o i n g ： A L a b o r a t o r y M a n u a l , S a m b r o o k ら、 C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s ( 1 9 8 9 ) 〕 により大腸菌からプラスミ ド DNAを回収した。 得られたプラス ミ ド D NAは、 塩化セシウム/臭化工チジゥム密度勾配による超遠 心を 2回繰り返すことにより精製度を高め、 リ ン酸カルシウム法に より 2 9 3 T細胞 〔 2 9 3細胞 （T r a n s f o r m e d p r i m a r y e m b r y o n a l k i d n e y , h u m a n A T C C C R L 1 5 7 3 ) に S V 4 0 L a r g e T抗原 c D N Aを導入した細胞株〕 に トランスフエクシヨ ンした。
すなわち、 精製したプラスミ ド DNA 2 /z gを I mM T r i s - H C 1 , 0. I mM E D T Aを含む 1 0 0 ;z 1 の緩衝液に溶解 し、 1 4 〃 1 © 2 M C a C l 2 を添加した後、 5 0 m M H E P E S ( p H 7. 1 ) , 2 8 0 mM N a C l , 1 . 5 mM S o d
1 u m P h o s p h a t eからなる緩衝液に徐々に混合し、 室温 にて 3 0分間インキュベー トし、 2 4穴プレー ト中の 2 9 3 T細胞 に添加した。 2 9 3 T細胞は、 1 0 %牛胎児血清 （ P C S , B i o p r o d u c t s社製） を含む DM E M ( G I B C O社製） 培地に て、 3 7て、 5 % C 02 の条件下で 2 日間培養した。
2 ) F A C Sによる解析
形質導入した 2 9 3 T細胞は、 0. 0 2 %の E D T Aを含む P B Sにて 2 4穴プレー トより剝がし、 2 % F C S、 0. 0 2 % Ν Λ Ν 3 を含む Ρ Β Sからなる F A C S緩衝液にて 2回細胞を洗浄した後 、 1 次抗体として 1 0 gZm l の R F 3及び S G 2の混合物存在 下で 2 0 fi 1 の F A C S緩衝液に懸濁し 2 0分間氷中でイ ンキュべ ー ト した。 F A C S緩衝液にて 2回洗浄後、 2次抗体として F I T C標識ャギ抗マウス I g抗体 （ C a p p e 1 社製） を使用し、 更に 1 5分間氷中でインキュベー トした。 ヨウ化プロビジゥム P r 0 p i d i u m 1 0 (5 1 (1 6 ( ? 1 ) を最終濃度 1 〃 /01 1 となる ように加え、 更に 5分間氷中でインキュベー ト した後、 F A C S緩 衝液にて 3回洗浄後、 前方散乱光にて細胞の生死を識別した後、 生 細胞のみを F A C S c a n ( B e c t o n D i c k i n s o n社 製） にて解析した。
3 ) c D N Aライブラ リ 一のクロ一ニング
2 0 0 0 - 4 0 0 0 クローンの大腸菌をひとつのプールとしてァ ルカ リ法にて回収されたプラス ミ ド D N Aを前述の方法に従って 2 9 3 T細胞に トラ ンスフエク シヨ ンし、 上記 F A C S解析によるス ク リ ーニングを行った。 2 0番目のプールを発現させた 2 9 3 T細 胞に、 マウスモノ クローナル抗体 R F 3及び S G 2 により強く染色 される ピークを認めた。 本プラス ミ ド DNAを再び大腸菌 D H 5 ( G I B C 0 B R L社製） に形質導入し、 5 0 〃 g/m l のアン ピシリ ンを含む L Bァガープレー トに接種した。
コロニ一を形成した 2 0 0 0個のクローンをプレー ト底面に網目 状に区分を入れ、 接種したクローンの位置がわかるようにしたァガ 一プレー トに 1 0 0 クローン Zプレー ト となるように一つずつ接種 し、 同じものを 2つ作製した。 1 0 0個のクローンを一つのプール と して 2 0 プール作製し、 5 0 g/ 1 のアンピシリ ンを含む L B培地で大腸菌を培養した。 アルカ リ法にてプラス ミ ド D NAを回 収後、 2 9 3 T細胞に リ ン酸カルシウム法により トラ ンスフヱ ク シ ヨ ンして前述と同様に F A C S解析を行った。 F A C S解析の結果 、 陽性と認められた一つのプールから大腸菌 1 0 0 クローンを一つ ずつ単離してそれぞれのクローンを培養し、 アルカ リ法にてプラス ミ ド D NAを回収した。 各プラス ミ ド DNAを 2 9 3 T細胞にリ ン 酸カルシウム法により トラ ンスフヱ クシヨ ンして前述と同様に F A C S解析を行い、 単一の陽性クローンを得て、 6 3 — 803 と命名 した。
本クローンにつレ、て、 A u t o R e a d s e q u e n c i n g k i t ( P h a r m a c i a社製） 及び A u t o C y c l e s e q u e n c i n g k i t ( P h a r m a c i a社製) を用 いて、 キッ ト添付の処方に従いシークェンス反応を行い、 A. L . E . ™ DNAシークェンサ一 （P h a r m a c i a社製） にて塩 基配列の決定を行った。 その結果、 最長の O p e n R e a d i n g F r a m eより 3 1 8ァミ ノ酸残基をコー ドすると推定される 全長 1 4 1 1 b p (配列表の配列番号 2 ) の新規の遺伝子であった
3. B A L B 3 T 3細胞による発現
新規分子を B A L B 3 T 3細胞に導入し動物細胞での発現を検討 した。
すなわち、 2 O ^ gの 6 3— B O Sと 2 U gのネオマイシン耐性 遺伝子を含む p SV 2 n e o 〔P. J. S o u e t h e m a n d
P — B e r g, J. M o 1. A p p 1. G e n e t . , 1 : 3 2 7 ( 1 9 8 2 ) 〕 を l x l 07 細胞/ m l の 0. 8 m l のァリ コー トに加え 1 0分間氷中でイ ンキュベー トした後、 G e n e P υ 1 s e r (B i o L a d社製） を用いて、 2 5 0 V、 2 5 0 〃 Fの静 電容量の条件にて トランスフヱクシヨ ンを行い、 同時形質導入した 更に 1 0分間氷中でイ ンキュベー ト した後、 細胞を 2 m gZm l の G 4 1 8及び 1 0 %F C S (B i o p r o d u c t s社製） を含 む DMEM培地 （G I B C O社製） に懸濁し、 2 4穴プレー トにて 培養した。 培養液の交換は 3 日おきに行い、 約 2週間後に生育のよ いネオマイシン耐性付着細胞の単一のコロニーを形成している穴よ り、 前記マウスモノ クローナル抗体 R F 3 と反応する形質転換細胞 株 BAL B 3 T 3 6 3 S 2を得た。 また、 対照細胞として、 R F 3 と反応しないがネオマイシン耐性である形質転換細胞株 B A L B 3 T 3 6 3 S 1を得た。
4. 新規分子の生物学的性質
新規分子の生物学的性質は、 ス トローマ細胞依存性に増殖するマ ウスプレ B細胞株 DW 3 4を用いて、 増殖細胞数を指標として以下 に示す方法にて解析した。 まず、 2 4穴プレー トに形質導入細胞株 B A L B 3 T 3 6 3 S 2 及び対照細胞株 B A L B 3 T 3 6 3 S 1 をサブコンフルェン トにな るまで培養し、 3 0 G yの放射線を照射後、 1穴あたり 2 X 1 03 個の DW 3 4を添加し、 1 0 % F C S ( B i o p r o d u c t s社 製） を含む R PM I - 1 6 4 0 ( G I B C〇社製） 培地中で、 3 7 °C、 5 % C 02 の条件で 4 日間培養した。 各穴の DW 3 4の生細胞 数を ト リパンブルー染色にて算定し、 増殖支持能を解析した。 その 結果、 図 1 に示すごとく、 形質導入細胞株 B A L B 3 T 3 6 3 S 2 において、 対照細胞株 B A L B 3 T 3 6 3 S 1 と比べて、 DW 3 4 の増殖が促進された。
5. 新規分子の物理化学的性質
1 ) グリ コシルフ ォスファチジルイ ノ シ トール （ G P I ) 結合型蛋 白の確認
R A由来骨髄ス トローマ細胞株 R A S V 5 — 5あるいは形質転換 細胞株 B A L B 3 T 3 6 3 S 2を 3 7 °Cにて 2 UZm l のホスフ ァ チジルイノ シ トール特異的ホスホリバーゼ C ( P I P L C , フナコ シ社製） 存在下あるいは非存在下、 1 % F C Sを含む P B S中にて 3 7 °C 1 〜 2時間インキュベー ト した後、 前述 F A C S緩衝液にて 2回洗浄後、 R F 3存在下で 2 0分間氷中でイ ンキュベー ト した。
F A C S緩衝液にて 2回洗浄後、 F I T C標識ャギ抗マウス I g抗 体 （ C ε p e 1社製） を含む F A C S緩衝液で、 更に 2 0分間氷 中でィ ： へュべ一 卜 し、 F A C S緩衝液にて 3回洗浄後 F A C S c a n ' c t o n D i c k i n s o n社製） にて解析した。 対 ^ -験として、 1 次抗体は、 R A S V 5 — 5では C D 2 9 ( V L A /S I , I mm u n o t e c h社製） 、 B A L B 3 T 3 6 3 S 2 では R 2 5 CJ . I mm u n o l . , 1 4 8 : 9 8 9 - 9 9 5 ( 1 9 9 2 ) 〕 を用い、 2次抗体として前述と同じ抗体を使用した。 そ の結果、 C D 2 9及び R 2 5では蛍光強度の変化が見られなかった が、 R F 3抗体を用いたものでは蛍光強度の低下が認められた。 こ のことより新規分子は G P Iを介して細胞膜に結合しているものと 推定される。
2 ) N末端の解析
DN A解析ソフ ト G e n e W o r k sを用いて得られた遺伝子 の、 疎水性領域と親水性領域の解析を行った （図 2 ) 。 その結果、 配列表の配列番号 2の 1〜2 8番目に示される 2 8個のア ミ ノ酸残 基部分に疎水性領域が認められ、 2 9番目のアミ ノ酸グリ シンが成 熟蛋白質の N末端であると推定された。 実施例 2
1. 可溶性接着因子 （ s B s t - 1 ) の構築
可溶性 B s t — 1 は、 2 7 2番目のアミ ノ酸の前に終止コ ドンを 有する遺伝子を P C R—変異誘発法 ！; M. K amm a n等， Nu c 1. A c i d s R e s . , 1 5 : 5 4 0 4 ( 1 9 8 9 ) 〕 により 構築した。 すなわち、 プライマーとして S I及び S 2 ' (S I ブラ イマ一 ： AAC C T C CAG AAG G A A AA、 S 2 ' プライマー ： AC C C A A G CT TTC TAG A T C A AT AAA G A C TTG G G G CTT) を、 また铸型 DNAとしてプラスミ ド p B s t — 1を用い P C R—変異誘発法を 行った。
P C R溶液 1 0 0〃 1 は、 l O mM T r i s — HC 1 ( p H 8 . 3 ) 、 5 0 mM K C 1、 0. 2 5 mM dNTP ( d AT P, d G T P, d CTP, d TTP) 、 1. 5 mM Mg C l 2 、 2. 5ユニッ トの DNAポリ メラーゼ Amp 1 i T a q (P e r k i n E l m e r C e t u s社製） 、 それぞれ l O O pm o l eのプ ライマー （S 1及び S 2 ' ) 及び 0. 1 gのプラスミ ド DNAを 含有する。 これを 5 0〃 1 の鉱油で覆った後、 9 4 °Cの初期温度に て し 5分間加熱し、 次に 9 4 °Cにて 1分間、 5 0 °Cにて 1分間、 7 2てにて 1分間の順で加熱するサイクルを 2 5回反復した後、 Ί 2 °Cにて 1 0分間インキュベー ト した。 P C R法により増幅した 2 7 4 b pの DNA断片をし 5 %の低融点ァガロースゲル （FM C, B i o p r o d u c t s社製） にて精製し、 制限酵素 B g 1 I I及び H i n d I I I (宝酒造社製） にて消化した。 得られた DN A断片を、 同じ制限酵素 B g l I I及び H i n d i I I (宝酒造社 製） にて消化した p B s t— 1 に DNA l i a i o n k i t (宝酒造社製） を用いてキッ ト添付の処方に従って挿入し、 制限 酵素 E c 0 R I及び H i n d I I Iにて消化後、 1. 5 %の低融点 ァガロースゲル （FMC, B i o p r o d u c t s社製） にて精製 し約 1. O k bの DNA断片を得た。 この DNA断片を、 K l e n 0 w断片により平滑末端とした後、 制限酵素 B s t X Iで消化後、 K 1 e n 0 w断片を用いて平滑末端とした p E F— B O Sに DNA l i g a t i o n k i t (宝酒造社製） を用いてキッ ト添付の 処方に従って挿入し、 p Δ 6 3— B 0 Sを構築した。
2. 2 9 3 T細胞による発現
上記のようにして構築した発現用プラスミ ド ρ Δ 6 3— B〇 Sを 大腸菌 DH 5 αに形質導入し、 得られた大腸菌を 5 0 gZm 1の アンピシリ ンを含む L B培地 〔Mo l e c u l a r C I o i n g ： A L a b o r a t o r y Ma n u a l , S amb r o o kら ， C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s ( 1 9 8 9 ) 〕 にて培養することによりプラスミ ド D NAの増幅を行い、 アルカ リ法 〔Mo l e c u l a r C I o i n g ： A L a b o r a t o r y Ma n u a l , S amb r o o k ら， C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s ( 1 9 8 9 ) 〕 により大腸菌からプラスミ ド DNA を回収した。 得られたプラスミ ド DNAは、 塩化セシウム Z臭化工 チジゥム密度勾配による超遠心を 2回繰り返すことにより精製度を 高め、 リ ン酸カルシウム法により 2 9 3 T細胞 〔 2 9 3 T細胞 （T r a n s f o r m e d p r i m a r y emb r y o n a l k i d n e y, h um a n ATC C C R L 1 5 7 3 ) ) (I S V 4 0 L a r g e T抗原 c D N Aを導入した細胞株〕 に ト ラ ンス フ エ ク シ ヨ ン した。
すなわち、 精製したプラスミ ド DN A 1 0 〃 gを I mM T r i s - HC 1、 0. I mM E D T Aを含む 1 0 0 〃 1 の緩衝液に 溶解し、 1 4 1 の 21^ C a C l 2 を添加した後、 5 0 mM H E P E S ( p H 7. 1 ) , 2 8 0 mM N a C 1. 5 mM S o d i u m P h o s p h a t eからなる緩衝液に徐々に混合し、 室温にて 3 0分間イ ンキュベー ト し、 1 0 c m培養皿中の 2 9 3 T 細胞に添加した。 2 9 3 T細胞は、 1 0 %牛胎児血清 （F C S， B i o p r o d u c t s社製） を含む DMEM (G I B C〇社製） 培 地にて 2 4時間培養した後、 1 %牛胎児血清を含む DM EM ( G I B C 0社製） 培地に交換し、 3 7 °C、 5 % C〇 2 の条件下で培養し た。
形質導入した 2 9 3 T細胞の培養上清は、 4 8時間後に回収し、 マイ クロコ ンセ ン ト レーター （C e n t o p r e p 1 0 , Am i c o n社製） を用いて 1 0倍に濃縮し、 以下の実験に使用した。 ま た、 £ ー 803を同様にして 2 9 3 T細胞に ト ラ ンスフ エ ク シ ヨ ンして、 その培養上清をコン トロールとして用いた。
3. s B s t — 1 によるプレ B細胞 DW 3 4の増殖阻害
s B s ΐ - 1 の生物学的性質は、 ス トローマ細胞依存性に増殖す るマウスプレ Β細胞株 DW3 4を用いて、 増殖細胞数を指標として 以下に示す方法にて解析した。
まず、 2 4穴プレー トにプレ Β細胞株の増殖支持能を有する R A 患者由来骨髄ス トローマ細胞株 R AS V 5一 5及び滑膜細胞株 S y n S V 6— 1 4を 1穴あたり 1 X 1 0 5 個培養し、 2 4時間後に 3 0 G yの放射線を照射した。 プレ B細胞株 DW 3 4を 1 穴あたり 2 X 1 0 3 個添加し、 1 0 %F C S (B i o p r o d u c t s社製） を含む R PM I — 1 6 4 0 (G I B C O社製） の培地中で 3 7 °C、 5 % C 02 の条件で 4 日間培養した。 s B s t — 1 を含む 2 9 3 T 細胞の濃縮培養上清は、 表 1 に示す濃度で添加した。 各穴の DW 3 4 の生細胞数は、 ト リパンブルー染色にて算定し、 増殖支持能を解 折した。 その結果、 表 1 に示すごとく、 s B s t — 1 を含む 2 9 3 T細胞の培養上清にて濃度依存的に DW 3 4の増殖が抑制された。
表 1 細胞株 R A S V 5 - - 5 S y n S V 6 - 1 4 sBst-1を含む
293T細胞 (10
倍濃縮培養上 sBst - 1添加 コン卜ロール sBst-1添加 コントロール 清） ％ V/V
0 10. 2土 1.4 6.9±0.1
0.2 10. 7土 1.6 10. 4±0. 8 6.2土 0· 2 7.2土 0. 8
0.4 10. 5± 1.6 11. 1± 1. 0 6.4±0.9 6.4±0· 4
0.8 9. 0±2.2 12. 1± 1. 3 3.6±0.2 8.7±0. 3
1.6 9. 6±0.2 11. 6土 1. 6 3.4±0.7 6.6土 1. 4
3.2 7. 3±0.8 11. 2±0· 7 1.7士 0.3 4.3±0· 3
1 穴あたりの DW 3 4細胞数
( R A S V 5 - 5 ： x i O -4, S y n S V 6 - 1 4 x
1 0— 5) 士 S . E . 産業上の利用可能性
以上詳述したように、 本発明は、 プレ B細胞増殖支持能を有する ポリペプチ ドをコー ドする遺伝子、 該遺伝子を含有するベクター、 該ベクターによる形質転換体、 及び該遺伝子を用いたプレ B細胞増 殖支持能を有する接着因子の製造方法に関するものであり、 本発明 の遺伝子は、 慢性関節リ ウマチ （R A) 患者や多発性骨髄腫 （MM ) 患者の骨髄細胞や滑膜細胞上のプレ B細胞増殖支持能を亢進する 新規接着因子をコー ドする。 本発明の遺伝子を適当なベクターに挿入した後、 常用の宿主細胞 を形質転換することにより、 大量に均一なプレ B細胞増殖支持能を 有する接着因子を製造することが可能であり、 このことから、 本発 明により多発性骨髄腫 （M M ) 及び慢性関節リウマチ （R A ) の同 定及びこれらの臨床上の診断用試薬の作成が可能である。
以上、 前記したように、 本発明について実施例等の具体的記載に 基づいて詳細に説明したが、 本発明は、 その請求の範囲の記載の範 囲において一定の変更もしく は修飾を適宜行ない得るものである。
【配列表】 配列番号： 1
配列の長さ ： 3 1 8
配列の型： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： ぺプチド
配列
Met Ala Ala Gin Gly Cys Ala Ala Ser Arg Leu Leu Gin Leu Leu Leu
-25 -20 -15
Gin Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gly Gly Ala Arg Ala
-10 -5 1
Arg Trp Arg Ala Glu Gly Thr Ser Ala His Leu Arg Asp lie Phe Leu 5 10 15 20
Gly Arg Cys Ala Glu Tyr Arg Ala Leu Leu Ser Pro Glu Gin Arg Asn
25 30 35
Lys Asn Cys Thr Ala lie Trp Glu Ala Phe Lys Val Ala Leu Asp Lys
40 45 50
Asp Pro Cys Ser Val Leu Pro Ser Asp Tyr Asp Leu Phe lie Asn Leu
55 60 65
Ser Arg His Ser lie Pro Arg Asp Lys Ser Leu Phe Trp Glu Asn Ser
70 75 80
His Leu Leu Val Asn Ser Phe Ala Asp Asn Thr Arg Arg Phe Met Pro 85 90 95 100
Leu Ser Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Phe Leu Ser Trp Cys
105 110 115
Arg Gin Lys Asn Asp Ser Gly Leu Asp Tyr Gin Ser Cys Pro Thr Ser
120 125 130 3 Ρ ϊ cl a d S i : 2§4拏¾凝 ¾
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S OH 9SI
J3s B I V 3JV sAq d_i丄 9qj J9S dsy Λ OJJ usy usv " 10 SAQ dsy n|g
OS
T800/fr6df/XDd[ 0£T8Z/f6 OM 存在位置 ： 1 . . 8 4
特徴を決定した方法： E
配列
CGGGAAACGG CAAACAGCGA GATATCCGAG CGAGAGTCCC GCCCTGCATC AGTTTGCGGA 60 ACCGCCTTGG TAGAAGGAGA GAAGGGGAGT GGAGGAAGCA CGGGACTGGA GGGACCAAAG 120 TTCCCCG ATG GCG GCC CAG GGG TGC GCG GCA TCG CGG CTG CTC CAG CTG 169
CTG CTG CAG CTT CTG CTT CTA CTG TTG CTG CTG GCG GCG GGC GGG GCG 217
CGC GCG CGG TGG CGC GCG GAG GGC ACC AGC GCA CAC TTG CGG GAC ATC 265
TTC CTG GGC CGC TGC GCC GAG TAC CGC GCA CTG CTG AGT CCC GAG CAG 313
CGG AAC AAG AAC TGC ACA GCC ATC TGG GAA GCC TTT AAA GTG GCG CTG 361
GAC AAG GAT CCC TGC TCC GTG CTG CCC TCA GAC TAT GAC CTT TTT ATT 409
AAC TTG TCC AGG CAC TCT ATT CCC AGA GAT AAG TCC CTG TTC TGG GAA 457
AAT AGC CAC CTC CTT GTT AAC AGC TTT GCA GAC AAC ACC CGT CGT TTT 505
ATG CCC CTG AGC GAT GTT CTG TAT GGC AGG GTT GCA GAT TTC TTG AGC 553
TGG TGT CGA CAG AAA AAT GAC TCT GGA CTC GAT TAC CAA TCC TGC CCT 601
ACA TCA GAA GAC TGT GAA AAT AAT CCT GTG GAT TCC TTT TGG AAA AGG 649
GCA TCC ATC CAG TAT TCC AAG GAT AGT TCT GGG GTG ATC CAC GTC ATG 697
CTG AAT GGT TCA GAG CCA ACA GGA GCC TAT CCC ATC AAA GGT TTT TTT 745
GCA GAT TAT GAA ATT CCA AAC CTC CAG AAG GAA AAA ATT ACA CGA ATC 793
GAG ATC TGG GTT ATG CAT GAA ATT GGG GGA CCC AAT GTG GAA TCC TGC 841
GGG GAA GGC AGC ATG AAA GTC CTG GAA AAG AGG CTG AAG GAC ATG GGG 889
TTC CAG TAC AGC TGT ATT AAT GAT TAC CGA CCA GTG AAG CTC TTA CAG 937
TGC GTG GAC CAC AGC ACC CAT CCT GAC TGT GCC TTA AAG TCG GCA GCA 985
GCC GCT ACT CAA AGA AAA GCC CCA AGT CTT TAT ACA GAA CAA AGG GCG 1033
GGT CTT ATC ATT CCC CTC TTT CTG GTG CTG GCT TCC CGG ACT CAA CTG 1081
TAACTGGAAA CTGTGTTGCT CTAACCCTCC TCCAGCCCTG CAGCCTCCCC TTGCAGTCAT 1141
CATTCGTGTT CTGTGTATAC CAAATGATTC TGTTATCTAA AGAAGCTTTT TGCTGGGAAA 1201
ACGATGTCCT GAAAATGGTA TTTCAATGAG GCATATGTTC AGGATTTCAG AAACAAGAAG 1261
TTAGTTCTAT TTAGCAGGTT AAAAAATGCT GCATTAGAAT TAAAGCAAGT TATTTTCTTA 1321
Figure imgf000034_0001
-9
Figure imgf000034_0002

Claims

請求の範囲
1 . プレ B細胞増殖支持能を有するポリべプチ ドをコー ドする D N A c
2 . ポリぺプチ ドが、 配列表の配列番号 1 に示すァミ ノ酸配列又は その一部を有するポリペプチ ドであることを特徴とする請求項 1 に 記載の D N A。
3 . 配列表の配列番号 2に示す塩基配列、 又はこれを一部置換、 欠 除もしく は付加した塩基配列にハイブリダイズする塩基配列を有す る請求項 1 に記載の D N A。
4 . 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の D N Aを含有する組換え ベクター。
5 . 請求項 4 に記載の組換えベクターにより形質転換された原核又 は真核宿主細胞。
6 . 請求項 5に記載の宿主細胞を培養することを特徴とするプレ B 細胞増殖支持能を有するポリぺプチ ドの製造方法。
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