WO1994019375A1

WO1994019375A1 - Association de fer et de lactoferrine et son procede de production

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Publication number: WO1994019375A1
Application number: PCT/JP1994/000233
Authority: WO
Inventors: Shunichi Dosako; Toshio Sakurai; Naomichi Kobayashi
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1993-02-16
Filing date: 1994-02-16
Publication date: 1994-09-01
Anticipated expiration: 1995-08-16
Also published as: DE69433296T2; JP2835902B2; EP0656366A1; EP0656366B1; US5606086A; JPH06239900A; EP0656366A4; DE69433296D1

Description

明細書鉄ラクトフユリン複合体及びその製造法技術分野

本発明は、鉄を多量に結合し、熱に対して安定な耐熱性鉄ラクトフユリン複合体及びその製造法に関する。

本発明の耐熱性ラクトフユリン複合体は、鉄含量が高く、鉄独特の収斂味を消し、鉄の持つ過酸化物生成促進作用を防止するので、貧血の予防あるいは治療、鉄強化または病原菌付着防止等を目的として食品、医薬品、飼料、化粧品等の原料として有用である。背景技術

ラクトフエリン（以下、 L f という）には鉄吸収促進、過酸化脂質生成抑制、抗菌、抗ウィルス、細胞増殖、免疫系の制御など様々な生理機能が知られている。そこで L ί を舍有する食品、医薬品、飼料、化粧品などを製造する試みが色々なされている。このような製品の多くは加熱殺菌されたり、使用時に熱湯と接触する場合がある。しかしながら、 L f は熱に不安定であり、熱変性すると沈澱したり、鉄結合能を失いその生理機能も失われてしまうという致命的な欠点があった。そこで、 L i の熱安定化に関する検討が行われ、 PH 4 にて加熱した L f は生のし f と同等に鉄を結合する能力を有することが報告された (Davidson and し onnerdal, Am. J. Physiol. 257: G930-G934, 1989) 。しかし、このようにして調製された L f は保存中に次第に変性し、その生理機能を失うという欠点があった。また、イオン強度の低い条件で L f を加熱すると生理活性を維持し得ることが知られている（特開平 4-108629号公報）。しかし、実際の製品の系ではイオン強度は必ずしも低くない。そこで PHと電気伝導度 Ωの関係が、 L f の熱安定性におよぼす影響が検討され、

log Ω ≤ (2.96/PH)十 0.64 (PH < 5)

log Ω ≤ (29.37/ρΗ) 一 4.62 ( 5 ≤ρΗ≤7.9) log Ω ≤ - 0.917 (ΡΗ>7.9)

となるように L f 舍有溶液を調整することによって L ί の熟安定化を図る方法が開発された（特開平 4- 8269号公報）。しかし、この条件を満たさない場合には、この条件に調整した L f 溶液と他の原料溶液を別々に殺菌し、無菌的に両者を混合するという手段をとる必要がある。ところが乳等省令によれば、全ての原料を混合後加熱殺菌することが定められており、別々に殺菌することは実用的ではなかった。発明の開示

本発明者らは、上述の問題を解決するベく、さらに L f の熱安定化について検討を重ねた結果、 L f の鉄結合能を維持した状態で耐熱性を賦与するためには基本的に L f そのものを改質することが必要だという結論に達した。そして、水に溶解した時の P Hが 4以下である鉄塩と、炭酸イオンあるいは重炭酸ィオンを舍むアルカリ塩と、 L f 類を溶液中で混合することにより、 L f に炭酸イオンあるいは重炭酸イオンを介して鉄が結合した鉄一 L f 結合体が生成され、この鉄一 L f 結合体が耐熱性を有することを見出し、本発明をなすに至った。したがって、本発明は、耐熱性炭酸およびノまたは重炭酸一鉄一 L f 結合体を提供することを課題とする。また、本発明は、このような耐熱性炭酸および Zまたは重炭酸一鉄一 L f 結合体を製造する方法を提供することを課題とする。

すなわち、まず本発明は、ラクトフュリン類に炭酸、重炭酸、炭酸およびノまたは重炭酸を介して鉄が結合した耐熱性鉄一 L f 結合体に関する。

また、本発明は、水に溶解した時の P Hが 4以下である鉄塩を L f 溶液に添加して溶解するか、あるいは水に溶解した時の P Hが 4以下である鉄塩と、 L f とを一緒に溶解するかして得られる溶液に、炭酸イオン、重炭酸イオンを舍む塩を添加し、溶液の P Hを 7以下に調整することによって、 L f に炭酸ィォン、重炭酸イオンを介して鉄を結合させる耐熱性鉄一 L 〖結合体の製造法に蘭する。

この発明による耐熱性鉄一 L f 結合体は、耐熱性において優れており、 P H 7以下の環境では可溶である。

しかし、この結合体は、 1 ) P H 7 . 1以上の環境下では沈澱し、さらに 2 ) L f に結合している鉄が、 L f 1 分子あたり 150 分子を超える場合には製造後、前記の P H 7以下の環境下に保存しておくと徐々に不溶化する。

そこで、本発明では、さらに広い P H範囲で長期間安定で、耐熱性も有する L f およびその製造方法を提供することをも課題としている。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討したところ、 1 ) 炭酸イオンまたは重炭酸イオンを舍有する溶液に L f 類および鉄を混合すると、炭酸または重炭酸一鉄— L f 複合体が形成されること、 2 ) この複合体は、炭酸イオンまたは重炭酸ィオンを舍有する溶液に、炭酸イオンまたは重炭酸イオンに対して特定の比率の L f 類および鉄を舍有する溶液を加えるという手段をとることによって初めて形成され、得られる鉄を高い比率で含有する複合体が広い pH範囲で長期間に亘り安定で、しかも耐熱性を有し、さらに鉄独特の収斂味を消し、鉄の持つ過酸化物生成促進作用を防止することを見出して本発明を完成するに至った。

すなわち本発明のもうひとつの鉄一 L ί複合体は、 L f 類 1 分子当り、鉄を 15乃至 1000分子、かつ炭酸および/または重炭酸を 15分子以上舍有する、炭酸およびノまたは重炭酸一鉄一 Lf 複合体に関する。

このような L f 複合体は、 P H 2.1 以上 9.0以下で常温で少なくとも 1 ヶ月間沈殺を生せず、また加熱しても沈澱を生せず、鉄独特の収斂味がないという性質を示す。

さらに本発明は、このような鉄ラクトフユリン複合体の製造法に関する。

すなわち、 i)炭酸、または ii) 重炭酸、または iii ) 炭酸および重炭酸を舍む溶液（ A溶液）に、 iv) 鉄および V)ラクトフリン類を舍有する溶液（ B溶液）を混合することによりなる、次の 1)から 4)の性質を示す炭酸および重炭酸一鉄一ラクトフエリン複合体の製造法に関する。

ただし、このとき B溶液の V i )鉄イオンモル濃度は、 vii ) A 溶液と、 B溶液の一部または全部が混合した溶液（反応溶液）に溶解している viii) 炭酸ィォンおよび重炭酸ィォンのモル濃度の高くとも 1/3 倍以下であって、 B溶液の ix)ラクトフヱリン類のモル濃度は、 B溶液の X)鉄ィォンモル濃度の 1/15〜 1/1000 であって、かつ反応溶液の xi)炭酸イオンおよび重炭酸イオンモル濃度の高くとも 1/50倍以下である。

1) ラクトフエリン類 1分子当り、鉄を 15乃至 1000分子、かつ炭酸およびノまたは重炭酸を 15分子以上舍有すること、

2) p H 2.1以上 9.0 以下で常温下で少なくとも 1 ヶ月間の間、沈澱を生じないこと、 3) 加熱しても沈殺を生じないこと、

4) 鉄独特の収斂味がないこと。

あるいは、 i)炭酸、または ii) 重炭酸、または iii ) 炭酸および重炭酸を舍有し、かつ iv) L f 類を舍む溶液（ A溶液）に、 V)鉄を舍有する溶液（ B溶液）を混合することによりなる、次の 1)から 4)の性質を示す炭酸および/または重炭酸一鉄一 L f 複合体の製造法に関する。

ただし、このとき B溶液の vi) 鉄イオンモル濃度は、 vii) A 溶液と、 B溶液の一部または全部が混合した溶液（反応溶液）に溶解している vi) 炭酸イオンおよび重炭酸イオンのモル濃度の高くとも 1/3 倍以下であって、 ix) A溶液のラクトフユリン類のモル濃度は、 B溶液の X)鉄ィォンモル濃度の 1/15〜1/1000 であって、かつ反応溶液の xi)炭酸イオンおよび重炭酸イオンモル濃度の高くとも 1/50倍以下である。

1) ラクトフユリン類 1分子当り、鉄を 15乃至 1000分子、かつ炭酸および Zまたは重炭酸 15分子以上舍有すること、

2) P H 2.1以上 9.0 以下で常温で少なくとも 1ヶ月間沈澱を生じないこと、

3) 加熱しても沈澱を生じないこと、

4) 鉄独特の収斂味がないこと。

本発明において使用する L ί類にはヒトゃゥシなどの哺乳類の乳などの分泌液から分離されるラクトフヱリン、または血液や臓器などから分離されるトランスフヱリン、卵などから分離されるオボトランスフヱリンなどがある。これらはすでに大量に分離する方法がいくつも知られているが、どのような方法で分離されたものであってもよい。また、遺伝子操作によって微生物、動物細胞あるいはトランスジュニック動物から生産されたものであってもよい。また、これら L f 显は酵素分解したものであってもよい。また、 L f 類は完全に分離されている必要はなく、他の成分が舍まれていても構わない。

まず、第 1 の発明において用いられる鉄塩は、水に溶解した時の P Hが 4以下を示すものであって、例えば、塩化第 2鉄、硝酸第 2鉄、硫酸第 2鉄などがある。なお、水に溶解したときの P Hが 4以下を示すこれらの鉄塩以外の鉄塩を用いても、 L f に耐熱性を付与することはできない。また、水に溶解したときの P Hが 4 を越える鉄塩の P Hを酸で 4以下として用いても、本発明の目的を達成することはできない。本発明で用いる鉄塩の量は、 L f 1 g に対し、鉄イオンとして 20〜 500 m g、好ましくは 40〜500 m gである。鉄塩の量が、 500 m gを超えると鉄の一部が L f と共に沈澱する。

次に、本発明で用いるアルカリ塩は、炭酸イオンあるいは重炭酸イオンが舍まれているものである。この炭酸イオンを舍むアルカリ塩としては、炭酸ァンモニゥム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどを例示することができる。また、重炭酸イオンを舍むアルカリ塩としては、重炭酸ァンモニゥム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウムなどを例示することができる。なお、これらのアル力リ塩と通常用いられる水酸化ナトリウム、アンモニァ、水酸化力リゥムなどのアル力リとを併用して用いることもできる。また、 P Hを調整する際に途中から重炭酸イオンを舍むアルカリ塩を用いることもできる。ただし、ここで重要なことは、 L f に結合する鉄 1 分子当たり 1 分子、すなわち L f 1 g 当たり 22〜562 m g、好ましくは 3 5 〜400 m g の重炭酸イオンを結合させなければならず、そのためには、 L f 1 g 当たり重炭酸イオンとして 120 m g〜 5 g、好ましくは 350 m g 〜 5 gのアルカリ塩を L f /鉄塩混合溶液に添加する必要がある。重炭酸イオンの量が、 120 m g、特に 350 m g より少ないと重炭酸イオンを介して L f に結合する鉄量が少なくなるので、 L f に耐熱性を十分賦与できないし、 5 gより多いと過剰の重炭酸イオンが鉄と反応して沈澱を形成する。なお、本発明において、最終的な耐熱性 L f 一鉄塩溶液の P Hは 7以下でなければならない。耐熱性し f 一鉄塩溶液の P Hが 7 を越えると沈澱が生成する。

本発明の耐熱性が賦与された鉄一 L f 結合体は、その表面構造が天然 L f と異なる。 L f は、リジンやアルギニンなどの塩基性アミノ酸を多く含有しており、これに鉄化合物を加えて PH を酸性にすると正に帯電する。この L f の正電荷に重炭酸ィォンが結合し、さらに鉄が結合して、本発明の耐熱性鉄一 L f 結合体が生成する。この耐熱性鉄一 L ί結合体は、 9 0 'Cで加熱しても安定である。

一般に、 L f 、鉄塩及び重炭酸塩を混合すると鉄飽和型 L f が生成することは古くから知られている事実であり、 L f を構成する Nローブと呼ばれる領域と C ローブと呼ばれる類似した二つの領域に、鉄ィォンがそれぞれ 1 分子づっ結合したものである。すなわち、 Nローブでは、 A s p 60、 T y r 92、 T y r 192 及び H i s 253 (数字は N末端からのアミノ酸の順番を示す、以下同様）の 4個のアミノ酸残基に 1 分子の鉄イオンが結合しており、さらに、この鉄に重炭酸イオンが 1 個結合したものである。同様に、 C ローブでは、 A s p 395 、 T y r 435 、 T y r 528 及び H i s 597 に鉄イオンが結合している〔B. F. Anderson et al . 、 J. Mol . Biol. 、第 209巻、 711〜734 頁、 1989年〕。したがって、通常鉄飽和型 L f は、 L f l g 当たり、鉄 1.4 m g、重炭酸イオン 1.5 mgそれぞれ結合したものとなる。また、鉄飽和型 L f は、鉄が結合していない L f に比べると若干安定性は増すが、 6 5 て以上で加熱すると沈澱してしまう。さらに、 L f に多量の鉄を添加すると鉄が L f に結合して非遊離状態となり、安定化された鉄剤を得ることができることが示されている〔特開平 4- 141067号公報〕。しかし、その明細書には、鉄を多量に添加することによって L f に耐熱性が賦与されるということは何ら示されていないし、炭酸塩あるいは重炭酸塩を用いるということも何ら示されておらず、実施例においても、炭酸塩あるいは重炭酸塩は使用されていない。したがつて、本発明の重炭酸イオン、炭酸イオンを介して鉄が結合した耐熱性鉄— L ί結合体とは全く異なるものと言える。

本発明の耐熱性鉄一 L f 結合体は、鉄の結合量及び重炭酸ィオンの結合量が、いわゆる鉄飽和型 L f より遙に多く、 L i 力くまるで鉄の鎧を着ているようである。そして、この鉄の鎧のために、本発明の耐熱性鉄一し f 結合体は、抗体で認識され難くなる。

次に、本発明の耐熱性鉄一 L f 結合体の抗体認識試験について示す。

試験例 1

ゥシ L f をクェン酸緩衝液に溶解し、脱鉄し、水に透折し、 2 m g Zm l のゥシ L f 溶液を得た。これに塩化第 2鉄を所定量加え、さらに、 L f 1 g当たり 0.12〜0.5 gの重炭酸ナトリゥムを添加して、ゥシし溶液の 11を6.5 に調整した。そして、このゥシ L f 溶液と p H 6.6 の 0 , 1 モルイミダゾ一ル緩衝液ノ 0.3 モル食塩とを等量混合した。一方、 ELISA 用プレートに抗ゥシ L i抗体をコートした後、ブロックエース（大日本製薬（株）販壳）でブロッキングしておき、先に調製したゥシ Lf 溶液を添加して、室温で 1時間反応させた後、バーオキシダ一ゼを標識した抗ゥシ L f 抗体を反応させた。反応後、プレートをよく洗浄した後、 A B T S基質を加えて、 405 n mの吸光度を測定した。各鉄塩濃度における抗体認識結果について表 1 に示す。

表— 1 鉄塩添加量抗体で認識された L f

( m gズ g L f ) ( m g / m 1 )

0 1 0 2

1 1 0 2

2 0 0 9 5

4 0 0 8 2

5 0 0 5 7

6 0 0 5 0

7 0 0 3 6

8 0 0 2 0

1 0 0 0 0 9 このように、重炭酸イオンを介して L f に結合する鉄塩の量が増えるに従い、抗体で認識される L f の濃度は減少した。なお、対照として、重炭酸ナトリウムの代わりに水酸化ナトリウムを用いて P Hを 6. 5 に調整した L f /鉄溶液を作製しようと試みたが、沈澱が生じて EL I SAに供することができなかった。次に、種々の鉄塩を用いて行った L f の熱安定化試験について示す。

試験例 2

表に示される種々の鉄塩を L f 1 g 当たり鉄イオンとして 120 m g となるように L f 溶液に添加し、 1 モル重炭酸ナトリウム溶液で P Hを 6. 3 に調整した。そして、この溶液を、最終濃度が 0. 05モルイミダゾール Z0. 15モル食塩（ P H 6. 6)となるように加え， 9 0 'Cで 1 0分間加熱して L ί の沈澱生成を観察した。その結果を表 2 に示す。表一 2 鉄として 120 / g/mlを

鉄剤水に溶解した時の P H 沈澱の有無

Fe (NOs) 3 2 7 3 無し、

FeS0₄ 4 8 1 有

FeCl ₃ 2 6 9 無し、

FeCl₂ 4 5 6 有

FeCl _z 4 5 6 → 2 . 6 6 有

(塩酸で調整）

Fe(S0₄) NH₄ 4 8 3 有り

Fe₂ (S0₄) 3 2 6 0 極わずかに濁りピ口リン酸鉄 6 8 0 有りクェン酸鉄 6 5 3 有りフマル酸鉄 4 5 0 有りフマル酸鉄 4 5 0 → 2 . 7 5 有り

(塩酸で調整）この表から、先に述べたように、（ 1 ) 水に溶解したときの ρΗ が 4以下を示す鉄塩を用いると L f に耐熱性を付与することが透透りりりできるが、それ以外の鉄塩を用いても耐熱性を付与する Ηことができないこと、（ 2 ) 水に溶解したときの p Hが 4 を越える鉄塩を酸で P H 4以下としても耐熱性を付与することができないこと、及び（ 3 ) 鉄塩の使用量には一定の範囲があることが分る。

次に、本発明が特開平 4- 141067号と異なり中性付近でも耐熱性を有することを示す。

試験例 3

L f 2.7 m g m 1 の水溶液 1 5 m 1 に塩化第 2鉄を鉄ィォン濃度として最終濃度 2 0〜 1, 000 μ g / m 1 となるように添加し、重炭酸ナトリウムを 4 m g〜210 111 ^加ぇ 1 }1を6.2 に調整し本発明の鉄一 L f 結合体を作成した。特開平 4- 141067号では、硫酸第一鉄 7水和物を鉄として 2 0〜 1000 g / m 1 の水溶液 1 5 m l に L ( を2.7 m g /m l となるよう溶かし作成した。この際、重炭酸塩溶液などは使用していない。この溶液を水で 2 0 m 1 にメスアップし、次いで、この溶液 8 m 1 ずつを 0.1 モルイミダゾ一ルノ塩酸/ "0.3 モル食塩（ p H6.6 又は P H 7.3)の緩衝液各 8 m l と等量混合した。混合した後の溶液の P Hは各々 6.5 又は 7.2 に調整した。この混合溶液を 9 0 'C で 1 0分間加熱し、室温まで自然冷却した後、 3,000 r p m、 1 0分間遠心分離して、上清中の L f 含量を Bio-Rad 社製、 Protein Assa で測定した。上清中に残存している L f の割合を表 3 に示す。

表一 3 特開平 4- •141067号本発明

鉄塩添加量

( ^ m g /

g L f ) P H6.5 P H7.3 P H6.5 P H7.3

1 0 5 % 3 % 4 0 % 4 0 %

2 0 6 4 7 3 4 6

3 0 6 4 8 1 4 0

4 0 5 4 9 6 3 8

5 0 7 3 1 0 0 3 4

1 0 0 5 4 1 0 0 5 0

5 0 0 3 4 9 4 2 1

1 , 0 0 0 3 3 2 8 1 1 このように、本発明の耐熱性鉄一 L f 結合体は、最終的な溶液の P Hが 7以下で、 L f 1 g 当たりの鉄量が 20〜500 m gの範囲において 7 3 %以上、 40〜500 m gの範囲において 90%以上の熱安定性を示した。

本発明の耐熱性鉄一 L f 結合体を配合した製品を製造するに際し、特に制限はないが、製品の最終 P Hと電気伝導度 Ωの閔係が、

log Ω > (2.96pH) +0.64 (4≤_PH<5)

log Ω > ( 29.37/pH) -4.62 (5≤pH≤7)

であるような場合に本発明の耐熱性 L f を用いるとよい。なぜならば、 P H と電気伝導度 Ωの関係が、上記の関係を示さない場合、既に開示された L f の殺菌方法（特開平 4- 8269号公報）を用いることで十分であり、また、 P Hが 7 を越える場合、上述したように本発明の耐熱性 L f を用いることができないからである。なお、 P Hが 7 を越える場合、 P Hを 7以下とするために、若干量の酸を添加しても構わない。その後、通常実施されている工程に従い、加熱殺菌あるいは滅菌を行う。加熱処理方法としては、 6 5 て、 3 0分間の低温殺菌処理、 120 'C：、 2 〜 3秒間、あるいは 140 〜150 て、 3〜 5秒間の処理、さらにはレトルト処理を用いることも可能である。また、乾燥を行えば耐熱性 L f 一鉄結合体を舍有する粉末製品を得ることもできる。なお、乾燥方法としては、凍結乾燥法を用いてもよいが、大量に処理する場合、乾燥コス卜の安い噴霧乾燥法を用いることが好ましい。

このようにして得られる耐熱性鉄一 L f 結合体舍有製品は、鉄を舍んでいるので、貧血の予防あるいは治療を目的とした食品、飼料、医薬品などとして特に適している。また、病原菌の付着阻止効果〔特開平 3-220130号公報〕を賦与した医薬品、飼料、食品、化粧品などとしても適している。なお、本発明の耐熱性鉄一 L f 結合体は、鉄を含んでいるが殆ど鉄臭が感じられないので、鉄強化飲料の素材として利用するのにも適している。次に第 2 の発明のラクトフユリン複合体製造における炭酸あるいは重炭酸を舍有する溶液は炭酸水、重炭酸アンモニゥム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸力ルシゥム溶液およびそれらの混合溶液などを例示することが出来る。これらに P H調整剤として水酸化ナトリウム、アンモニァ、水酸化カリウム、塩酸、クェン酸、乳酸などを混合して使用することができる。また、この溶液には、それ以外の物質、例えば、糖、蛋白質、脂肪などが含まれていても構わない。使用する鉄剤は、脱イオン水に溶解した時の P Hが 4以下を示す鉄塩、例えば塩化第 2鉄、硝酸第 2鉄、硫酸第 2鉄など、主に 3価の鉄剤を例示できる。脱イオン水に溶解した時の P Hが 4 を越える鉄塩、例えば硫酸第 1 鉄などでは L f 複合体を形成することができない。また、この時に P Hを 4以下に下げても L ί 複合体を形成することはできない。

添加する鉄の量は L f 1 モルに対して鉄イオンとして 15モル以上、より好ましくは 30モル以上、さらに好ましくは 60モル以上であり、 1000モル以下、好ましくは 480モル以下である。製造に要する時間を短くするため又は、収率を落とさないためには 240モル以下が好ましい。加える鉄量が前記の上限を越えると鉄が沈澱してくる。

次に第 2 の発明のラクトフユリン複合体における鉄剤の種類による熱安定性の違いを試験例にて示す。

試験例 4

(材料）

( A溶液） 1 モルノリットルの重炭酸ナトリゥムを舍む P H 8. 3 の溶液 1 リットル

( B 1 溶液）各種鉄剤を鉄として 5 ミリモル舍む溶液 0 . 2 リツ卜ル

( B 2溶液） L f (ォレオフイナ社製） 33マイクロモルを舍む溶液 0 . 8 リットル

B 1 溶液と B 2溶液を混合後（ B溶液）、 A溶液に B溶液を加え、鉄を結合した L f 複合体を作成した。この溶液を分子量 5000力ットの限外濾過膜で脱塩 · 濃縮後、最終濃度 0.05モルノリットルのィミダゾール、 0.15モル/リットルの食塩を舍む PH 7.5 の液状食品を模倣した緩衝液（模擬緩衝液）で 3.6ミリモルノリットルの鉄濃度となるまで希釈し、 90て 10分間加熱し、 L f の沈澱の生成を観察した。その結果を表 4 に示す。

表一 4 鉄剤鉄として 120 g/ml 沈澱の有無

を脱イオン水に溶解

した時の pH

Fe(N0₃) 3 2.7 無し

FeS0₄ 4.8 有り

FeCl₃ 2.7 無し

FeCl_z 4.6 有り

Fe(S0₄)NH₄ 4.8 有り

Fe_z (S0₄) 3 2.6 無しピ口リン酸鉄 6.8 有りクェン酸鉄 6.5 有りフマル酸鉄 4.5 有り

FeS0₄ 4.8 → 2.7 有り

(塩酸で PHを下げた）このように、脱イオン水に溶解した時の PHが 4以下の鉄剤を使用しないと本発明の炭酸およびノまたは重炭酸一鉄一 L f 複合体は形成できない。また、脱イオン水に溶解した時の PHが 4 を越える場合に、その PHを 4以下に調整しても本発明の炭酸および Zまたは重炭酸一鉄一 L f 複合体は形成できない。

しかし、重要なことは反応時の鉄イオン濃度と、炭酸および重炭酸ィオン濃度の比が、炭酸および Zまたは重炭酸一鉄一 L f 複合体の熱安定性に影響を及ぼす点である。このことに関する試験例を示す。試験例 5

(材料）

( A溶液）各濃度の重炭酸ナトリゥムを舍む溶液 1 リットル ( B 1溶液）塩化第二鉄を含む溶液 0.2リットル

( B 2溶液） L f 1 ミリモルを含む溶液 0.8リットル

B 1溶液と B 2溶液を混合して溶液 Bを作成し、 A溶液に B 溶液を 1 リットル加えて鉄を結合した L f を作成した。なお、 B溶液は脱イオン水で希釈したものも用いた。ただし、最終重炭酸ィォンモル濃度を 0.6以上とする場合には A溶液と B溶液混合時に重炭酸ナトリウムを添加するか、あらかじめ A溶液に必要量の重炭酸ナトリウムを添加し、飽和の溶液とした。この溶液を分子量 5000力ットの限外濾過膜にて加水脱塩し、さらに濃縮した。そして、模倣緩衝液で 3.6ミリモル Zリツトルの鉄濃度となるまで希釈し、 90て 10分間加熱し、 L f の沈澱生成を観察した。その結果を表 5に示す。なお、表の最小重炭酸ィォン鉄イオン比とは、 A溶液と B溶液混合後の重炭酸イオンモル濃度を、 B溶液の鉄イオンモル濃度で割った値をいう。

表— 5

B 1溶液に 30ミリモルの鉄が舍まれている場合重炭酸ィォンモル濃度沈澱の最小重炭酸イオン

有無鉄イオン比

A溶液 A B混合後 (モル濃度 z

1.0 0.5 ¾E し 16.67

0.8 0.4 fff し 13.33

0.6 0.3 4fff し 10.00

0.4 0.2 やや有り 6.67

0.2 0.1 やや有り 3.33

0.1 0.05 有 1.67 表— 6

B 1溶液に 200ミリモルの鉄が含まれている場合であって、 B溶液を 10倍希釈した場合（ B溶液中に 20ミリモル/リットルの鉄が含まれる）重炭酸ィォンモル濃度最小

沈澱の重 )fe酸イオン鉄イオン比 A溶液 A B混合後有無（モル濃度/モル濃度）飽和飽和 M し-^ 1 2 0

飽和 1.2 M し 1 2 0

飽和 1.0 無し 1 0 0

飽和 0.8 わずかに有り 8 0

飽和 0.7 わずかに有り 7 0

1. 2 0.6 わずかに有り 6 0

1. 0 0.5 やや有り 5 0

0. 6 0.3 やや有り 3 0

0. 3 0.15 有り 1 5 以上のように、 B溶液の鉄濃度を高めるにつれて、 A B混合溶液の重炭酸イオン濃度を高める必要がある。このように、本発明の炭酸およびノまたは重炭酸一鉄一 L f 複合体調製にあたつては、 A溶液に B溶液を添加して行く過程において添加した鉄溶液の鉄 1分子の周囲には少なくとも 3分子、好ましくは 10 分子以上の炭酸およびノまたは重炭酸分子が存在している必要がある。さらにいえば、 L f 1分子に 200分子を越える量の鉄分子を結合させる場合には、鉄 1分子の周囲には 30分子以上、好ましくは 60分子以上、より好ましくは 100分子以上の炭酸ィオンおよびノまたは重炭酸イオン分子が存在していると良い。次に、本発明の炭酸および Zまたは重炭酸一鉄一 L f 複合体には、どのくらいの炭酸およびノまたは重炭酸が結合しているかについて次の検討を行った。試験例 6

(材料）

( A溶液）各濃度の重炭酸ナトリウムを舍む溶液 1 リットル

( B 1溶液）塩化第二鉄 100ミリモルを含む溶液 0.2リットル ( B 2溶液） L f 1 ミリモルを舍む溶液 0.8リットノレ

B 1溶液と B 2溶液を混合後（ B溶液）、 A溶液に B溶液を加え、 4 'Cおよび 37 'Cにて各反応時間、ゆっくり撹拌して鉄を結合した L f を調製した。この溶液を模倣緩衝液で 3.6ミリモル /リットルの鉄濃度となるまで希釈し、 90て、 10分間加熱し、 L f の沈澱生成を観察した。さらに、 192時間反応後の溶液を分子量 5000力ットの限外濾過膜にて炭酸およびノまたは重炭酸一鉄一 L f 複合体と水溶液を分離し、膜を透過した溶液中の炭酸ィォンおよび重炭酸ィオン濃度をイオンクロマト法により分折した。その結果を表 7 に示す。

表 7 — 1

反応温度 4 0 ての場合

重炭酸ィォン濾過膜透過重炭酸沈澱の有 4ff 液中の重炭モル濃度イオン鉄酸イオン濃

イオン比反応時間度

A A B (モル濃 ( ミリモル溶液混合後度ノモル 2 24 48 96 192 リットル

濃度）

1.2 0.6 6 無し Mしし Mし無し 0.4654

0.8 0.4 4 無し ffiし ί5し Λ·し無し 0.2630

0.4 0.2 2 有り無し無し無しし 0.0988

0.2 0.1 1 有り有り有り無し無し 0.0005

0.1 0.05 0.5 有り有り有り有り有り 0.0007

0.005 0.025 0.25 有り有り有り有り有り表 7 — 2

反応温度 37'Cの場合重炭酸ィォン最小重炭酸ィォ

モル濃度ン鉄イオン比沈殺の有無

(モル濃度/

A A B モル濃度）反応時間

溶液混合後 2 24 48 96 192

1.2 0.6 6 ∑ し M し JUL し Jut し 0.8 0.4 4 IEしし 0.4 0.2 2

0.2 0.1 1

0.1 0.05 0.5

0.05 0.025 0.25 有有無無有有

以上のように、低温下で長時間反応りりりりししさせると炭酸および重炭酸ノ鉄比が 1 であっても本発明の炭酸およびノまたは重炭酸一

無有有有有

鉄一 L f 複合体を形成できる。しかし、これりりりりし以上の低濃度であると長時間反応させても製造できない。さらに無有有有有 192時間反応後の限外濾過膜透過液中の炭酸ィォンおよび重炭酸ィりりりりしォン濃度が、最小重炭酸イオン鉄イオン比が 1 以下の場合、脱イオ有有有有ン水の濃りりりり度と同じであることより、 A溶液中の重炭酸は全て鉄— L f 複合体と結合したものと考えられる。また、 37てで反応させた場有有有有りりりり合には、炭酸ィォンおよび重炭酸ィオン Z鉄比が 2以下では複合体が形成できない。

この結果から、本発明の炭酸およびノまたは重炭酸一鉄— Lf 複合体には炭酸およびノまたは重炭酸イオンが結合鉄あたり 1 分子以上含有しているものと考えられる。さらにこの炭酸およびノまたは重炭酸一鉄一 L f 複合体形成の反応速度を上げるためには炭酸イオンおよび Zまたは重炭酸イオン濃度を高めることが効果的であることも明らかとなった。

また、この例から、 B溶液の Π 鉄イオンモル濃度が、 ii ) A溶液と、 B溶液の一部または全部が混合した溶液（反応溶液）の iii ) 炭酸イオンおよび重炭酸イオンモル濃度と同等であっても鉄一 L f 複合体を形成可能であることがわかったが、この条件では、製造に極端に時間を要するため、実用的ではない。

力ワカ ¾ ら (H* Ka akam i , S . Dosako , I . Naka j i ma , B i osc i . Biotech, Biochem. , 57: 1376-1377, 1993)は、 i)86ミリモルリットルの塩化第二鉄と 1.23〜 55.56 ミリモル Zリットルし f を舍む溶液 900 マイクロリットルと ii ) 0.2モルノリットルの重炭酸ナトリウム溶液 100 マイクロリットルを混合することで鉄を可溶化できると報告している。この報告では耐熱性や、呈味性を調べていない点や、鉄イオン濃度などから、本発明の特許請求範囲から外れているものではあるが、参考までにこの事例と本発明を比較してみる。

この報告には二つの溶液をどの様に混合させたかの記述がないが、常識的には、同時に混合したか、ほぼ、同時とみなせるような方法にて混合したものと考えられる。この場合には反応溶液に舍まれる炭酸ィォンおよび重炭酸ィオンモル濃度が 0.02 モル/リットルとなり、これの塩化第二鉄モル濃度（86ミリモル/ /リツトル）に対する比が 0.23となる。これはほぼ、表 7 — 2 の最小重炭酸ィォン鉄ィォン比が 0.25の場合の反応時間 48に相当する条件にあたるため、この場合、 L f の耐熱性は得られていないことがわかる。もし、この配合条件で耐熱性のある L f を得ようとすれば、 ii ) に i) を先ず、 133 マイクロリットルを混合し、 4 てで 96時間反応させた後に、さらに残りの 767 マイクロリツトルの i) を混合したとすると、前半の段階での反応溶液に舍まれる炭酸イオンおよび重炭酸イオンモル濃度が 86ミリモルノリットルとなる。この場合であれば、これの塩化第二鉄モル濃度 86ミリモルノリットルに対する比が 1 となり、表 7 — 1 の最小重炭酸ィオン鉄イオン比が 1 の場合の反応時間 96に相当し、 14.8(133マイク口リットル /900マイクロリットル）パーセントに限って、耐熱性のある鉄 Z L f ができうる。し力、しながら残りの大部分は耐熱性がない。もちろん、力ワカミらの報告には、このような作成方法を採ったという記述はないし、反応温度も 37 'Cであるので、本事例からは耐熱性のある鉄ノ Lf は得られていないことが、本発明の本試験例を参考にすれば、明らかである。

さらに、重要なことは反応時の L f 濃度と炭酸イオンおよびノまたは重炭酸ィオン濃度の比が炭酸およびノまたは重炭酸一鉄一 L f 複合体の熱安定性に影響を及ぼす点である。このことを次の試験例で示す。

試験例 Ί

(材料）

( A溶液）各濃度の重炭酸ナトリウムを舍む溶液 1 リットル ( B 1 溶液）塩化第二鉄を 1.5ミリモル舍む溶液 0.2リットル ( B 2溶液） L f 0.5ミリモルを舍む溶液 0.8リットル

B 1 溶液と B 2溶液を混合後（ B溶液）、 A溶液に B溶液を加え、鉄を結合した L f 複合体を作成した。この溶液を分子量 5000カットの限外濾過膜にて脱塩 · 濃縮した。さらに、この溶液を模倣緩衝液で 3.6ミリモルノリットルの鉄濃度となるまで希釈し、 90 、 10分間加熱し、 L f の沈澱生成を観察した。その結果を表 8 に示す。なお、表の最小重炭酸ィオン L f 比とは、 Aと B混合後の重炭酸イオンモル濃度を、 B溶液の L f モル濃度で割った値をいう。表一 8 重炭酸ィオン濃度最小重炭酸ィ最小重炭酸ィォ ( ミリモルノリットル）沈澱のオン L f 比ン鉄イオン比门 ( モノレ濃]^/ ( セル濃度/

A溶液 A B混合後ノしレ避 J又、ノ ^ ί》又）

200 100 Mし 200 67

100 50 わずかに有り 100 33

50 25 やや有り 50 17

30 15 有り 30 10

10 5 有り 10 3.3 以上より、溶液中の L f 1分子の周囲には少なくとも 50分子、好ましくは 100分子、より好ましくは 200分子以上の炭酸（ィオン）および Zまたは重炭酸（イオン）分子が常在している必要があることが明らかとなった。

本発明による L ί複合体は前記した Anderson等のいういわゆる鉄を 2分子結合した通常鉄飽和型 L f にくらベて鉄の結合量、炭酸およびノまたは重炭酸の結合量がはるかに多い。

また、特開平 4- 141067号公報においては、前記したように鉄を多量に添加することによって L f に耐熱性が付与されることは何ら示されておらず、また炭酸ィオンまたは重炭酸イオンの必要性や炭酸 · 炭酸塩 · 重炭酸塩を用いるということも何ら示されていない。全ての実施例においても炭酸 · 炭酸塩 · 重炭酸塩が使用されていない。したがって本発明による炭酸および/ または重炭酸一鉄一 L f 複合体とは全く異なる。

本発明の炭酸および/または重炭酸一鉄一 L f 複合体は、炭酸および/または重炭酸、および鉄が L f の高次構造（ 3次、 4次）変化を起こしたり、炭酸およびノまたは重炭酸、および鉄が L f の周囲を取り囲んでいたりするものと考えられる。実際、通常鉄飽和 L f を認識する抗 L ί抗体による本発明の炭酸およびノまたは重炭酸一鉄一 L f 複合体の認識の程度は炭酸およびまたは重炭酸と鉄が L f に結合するに従って、低くなつていく。その様子を次に示す。

試験例 8

L f は、 L f 溶液を 0 . 1 %エチレンジァミン 4酢酸を含むクェン酸緩衝液に対して透折し、脱鉄した後、水に対して透析して谏結乾燥したものを用いた。 1 モルノリットルの重炭酸ナトリゥムを舍む P H 8 . 3の溶液 1 リットル（ A溶液）、塩化第二鉄を鉄イオンとして 0から 480ミリモルを舍む溶液 0 . 2リットル

( B 1 溶液）、 L f 1 ミリモルを舍む溶液 0. 8リットル（ B 2 溶液）を調製した。 B 1 溶液と B 2溶液を混合後、 1 〜 100倍に脱イオン水で希釈した（ B溶液）。 A溶液に B 1 溶液リットルを加え、鉄を結合した L f を調製した。この溶液を模擬緩衝液で倍々に希釈した。

一方、 EL I SA用プレー卜に抗ゥシ L f 抗体をコートした後に、ブロックエース（大日本製薬（株）販売）でブロッキングした。先に調製した L f 溶液を添加し、室温にて 1 時間反応させた後、バーオキシダ一ゼを標識した抗ゥシ L f 抗体を反応させた。よく洗浄した後に A BTS基質を加え、 405 n mの吸光度を測定した。このように、鉄が L f に対して 2分子結合しているときは、鉄がない場合と同様に認識されるのに対して、鉄量が増えるにしたがって、抗体で認識されなくなった。その結果を表 9 に示す。なお、表の認識率とは、鉄し f 溶液に舍有される L f 量に対する、本測定法で定量される L f 量の比率をいう。表一 9

(モルノモル L f ) 抗体での認識率）

0 0 0

2 0 0

5 9 0

0 8 6

0 8 2

9 0 6

2 0 3

5 0 1

4 0 1

8 0 1 さらに本発明のこのような L f 複合体（以下、第 2発明の Lf 複合体という）は、本発明の最初に述べた L f 結合体（以下、第 1発明の L f 結合体という）とは PH安定性の面で異なつている。さらに特開平 4- 141067号の L f とも相違する。このことを次の試験例で示す。

試験例 9

第 2発明の L f 複合体の作製は試験例 8 と同様に行った。第 1 発明の L f 結合体は、 L f 33.75マイクロモル/ ^リットルの水溶液に塩化第 2鉄を鉄として 0.5〜 16.2ミリモルノリットルとなるよう添加し、重炭酸ナトリウムで pHを 6.2に調整して作製した。さらに、特開平 4- 141067号の L f 溶液は、硫酸第 1鉄 7水和物を鉄として 187〜6000マイクロモルノデシリットル溶かした水溶液に 12.5マイクロモル/デシリットルとなるよう L f を溶解して作製した。この際、炭酸イオンおよび Zまたは重炭酸イオンを発生する炭酸 · 炭酸塩 · 重炭酸塩などは使用していない。このように 3つの方法で作成した各種鉄ノ L f 混合溶液を分子量 5000力ットの限外濾過膜にて脱塩 · 濃縮し、模擬緩衝液（PH 6.4あるいは 7.2) にて、 L f として 12.5マイクロモルノリットルとなるよう希釈した。 PHを 6.5と 7.3にそれぞれ調整し、ネジ口付き試験管に密封した後、 90て、 10分間加熱し室温まで自然冷却した後に、 3,000rpm、 10分間遠心分離し、上清中の L f 含量を測定した。なお、この測定には Bio-Rad 社製 Protein Assay Kit を使用した。上清に残存している L f の割合を表 1 0 に示す。

表一 1 0 特開平 4-141067 第 1発明第 2発明

Fe/Lf L f 結合体 L f 結合体 L f 複合体モル比

PH6.5 PH7.3 PH6.5 PH7.3 PH6.5 PH7.3

15 5¾ 6¾ 90¾ 43¾ 100% 100%

30 7 6 84 40 100 100

60 4 3 97 54 100 100

120 6 1 98 38 100 100

150 5 4 81 27 100 100

240 9 2 79 21 100 100

480 2 6 80 13 98 89 このように、第 2発明の L f 複合体では PH 6.5あるいは 7.3 のいずれにおいても耐熱性を示したが、第 1発明の L f 結合体では PH 6.5では耐熱性を示したものの、 PH 7.3では耐熱性を示さなかった。また、特開平 4- 141607号では PH 6.5および 7.3のいずれにおいても耐熱性を示さなかった。

さらに、第 2発明の L f 複合体の耐熱性の PH範囲の広さを次に示す。

試験例 1 0

試験例 8 と同様にして L f 複合体は調製した。ただし、 B 1 液の鉄舍量は 1000ミリモルまでとした。

この鉄ノ L f 混合溶液を分子量 5000力ットの限外濾過膜で脱塩 · 濃縮した後、模擬緩衝液で L f 舍量として 62.5マイクロモル /リットルとなるよう希釈した。この場合の模擬緩衝液は、

pH 2.0〜3.5 はグリシン—塩酸、 PH 3.5〜 6, 0は酢酸、 pH 6.0 〜 7.8はィミダゾール—塩酸、 PH 7.8〜9.3 はホウ酸—塩化力リウムー水酸化ナトリウムを緩衝剤とした。また、伝導度の調整は塩化ナトリウムを用いた。これをネジ口付き試験管に密封した後、 90て、 10分間加熱し、室温まで自然冷却した後に、

3, 000rp_m、 1 0分間遠心分離、上清中の L f 舍量を測定した。

なお、この測定には Bio- Bad 社製、 Protein Assay Ki t を使用した。上清に残存している L f の割合を表 1 1 及び 1 2 に示す。

表— 1 1

電気伝導度が 5ミリジーメンス / センチメートルの場合

Fe/Lf P H

モノレ

比 2.0 2.1 2.5 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.8 9.0 9.2

10 59 58 57 52 50 46 33 38 31 32 34%

15 50 73 74 72 71 75 76 80 77 72 45

30 46 82 91 95 96 97 99 100 100 100 36

60 51 95 93 97 98 100 100 100 100 100 • 43

120 54 97 100 100 100 100 100 100 100 100 39

240 32 99 100 100 100 100 100 99 99 97 40

480 21 92 93 96 100 100 100 98 96 93 47

1000 20 76 77 78 79 78 95 94 92 92 39

1200 19 32 28 31 33 27 29 30 24 33 32

表— 1 2

電気伝導度が 150ミリジーメンス/ センチメートルの場合

Fe/Lf P H

ノレ

比 2.0 2.1 2.5 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.8 9.0 9.2

10· 51 50 52 53 49 46 37 34 31 32 31%

15 44 70 71 72 70 73 72 73 72 64 40

30 41 73 82 85 85 85 87 88 89 87 34

60 45 84 82 84 85 87 89 88 90 89 36

120 47 87 89 90 90 90 90 92 91 88 34

240 28 88 89 90 90 90 90 89 90 87 35

480 20 79 82 83 81 83 86 85 82 80 41

1000 18 66 68 68 70 69 84 83 80 79 34

1200 19 26 26 28 30 27 26 27 25 29 26 このように L f 1分子に対して、鉄が 15分子以上 1000分子以下でないと耐熱性が得られず、この範囲内であれば、 PH 2.1〜

9.0 の範囲で耐熱性が確認された。さらに言えば、 L f 1分子に対し、鉄が 15分子よりも 30分子の方が耐熱性が高く、 30分子よりも 60分子、 60分子よりも 120 分子の方がさらに耐熱性が高い。また、 L f 1 分子に対して、鉄が 1000分子よりも 480 分子、

480 分子よりも 240 分子の方が耐熱性が高い。 L f 1分子に対して、鉄が 1000分子結合している場合は、 PH 5以下より pH 5を超える場合の方が耐熱性が高い。

第 1 の発明の方法にて製造された L f は鉄が 720 分子以上 Lf に結合することができず沈澱するが、本発明では 1000分子の鉄を結合することができるので、この点からも本発明の複合体と第 1 の発明の方法にて製造された複合体は異なつているといえる。

また、特開平 4- 8269では L f の配合された飲料を殺菌する場合、製品の最終 P Hと電気伝導度 Ωの関係が、 log Ω (ミリジ一メンス/ センチメートル） >

(2.96pH) + 0.64 (_PH<5)

1ο₈Ω > (29.37ρΗ) -4.62 (5 ≤_ΡΗ≤7.9)

1ο₈ Ω > — 0.917 (ΡΗ > 7.9)

であるような場合でないと沈澱を生じたり、 L f が鉄を結合できなくなるような変性を受けるとしている。本発明によつて得られた L f を配合した製品を製造する場合、 150 ミリジーメンスセンチメートルであって、 PHが 2.1〜9.0 の範囲であっても耐熱性を有する極めて安定な鉄 L f 複合体であるため、と pHの関係が上に記した関係以外の場合であつても製造上、全く問題を生じない。さらにいえば、特開平 4- 8289は L ί の殺菌方法を示したものであって、鉄と L f の複合体を形成させることを意図した発明ではない。特開平 4-8269記載の実施例において、 L f と重炭酸ナトリウムと塩化第 2鉄をただ単に溶解する例が示されているのに対して、本発明では、 i) 炭酸、または ii ) 重炭酸、または iii ) 炭酸および重炭酸を舍む溶液（ A溶液）に、 iv ) 鉄及び V ) ラクトフリン類を舍有する溶液（ B溶液）を混合するか、 i) 炭酸、または ii ) 重炭酸、または iii ) 炭酸及び重炭酸、かつ iv ) ラクトフエリン類を舍む溶液（ A溶液）に、 V ) 鉄を舍有する溶液（ B溶液）を混合するかの方法が採られている。さらに添加する B溶液の鉄イオンモル濃度も規定している。これらの条件を満たして初めて、鉄と L f は強固な複合体を形成し、広い PH範囲で長期間安定で、耐熱性も有し、鉄独特の収斂味を消す L f の特徴が賦与される。このようなことから、特開平 4-8269の実施例では、鉄と L f が複合体を生じていないか、生じていたとしても本発明とは異なる複合体を生じたものと推定される。実際、特開平 4-8269記載の方法で鉄を含有する飲料を作成した場合、鉄舍量が 12ミリグラム/ 100ミリリットルを超えると鉄特有の苦みが発現すると記載されている力く、本発明では鉄舍量が 29ミリグラム / 100 ミリリットルとしても全く鉄特有の苦みを発現しない（後述）。また、仮に、特開平 4-8269の実施例において、鉄と L f が複合体を生じていたとしても、 L f 1分子に対する鉄舍量が最大でも 5であるので、本発明の請求の範囲外の鉄一 L f 複合体ということになる。

第 1発明の L f 結合体では L f 1分子に対して鉄が 720分子しか付かないのでこの点でも第 2発明の L f 複合体と第 1発明のし f 結合体との性質が異なっている。

次に、第 1発明の L f 結合体と第 2発明の L f 複合体との保存安定性の違いを示す。

試験例 1 1

試験例 9および試験例 1 0 と同様に鉄一 L f 複合体を作成し，遠心処理した L f 舍有溶液を密封して 90'C 10分間加熱した後、室温（37'C ) で一力月保存した。その後の沈澱量を目視にて判定した。沈澱の認められないものを 0、沈澱がやや認められるものを 1、沈澱が多いものを 2 とした。

試験例 9の鉄一 L f 複合体の結果を表 1 3に、試験例 1 0 の鉄一 L f 複合体の結果を表 1 4 に、それぞれ示す。

表一 1 3 特開平 4-141067 1発明 2発明

Fe/Lf L f 結合体 L f 結合体し f 複合体モル比

PH6.5 pH7.3 pH6.5 pH7.3 pH6.5 pH7.3

30 2 2 0 1 0 0 60 2 2 0 2 0 0 120 2 2 0 2 0 0 150 2 2 2 2 0 0 240 2 2 2 2 0 0 480 2 2 2 2 0 0 表一 1 4

Fe/Lf P H

モル

比 2.0 2.1 2.5 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.8 9.0 9.2

10 2 2 2 2 2 1 1 1 2 2 2 15 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 30 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 60 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 120 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 240 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 480 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1000 2 1 1 1 1 0 0 0 0 0 2 1200 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 このように、第 2発明の鉄— L f 複合体は pH 2.1から 9.0の範囲において、 90て、 10分の熱ストレスを与えた後であっても. 常温で高い保存安定性を有していたが、第 1発明の鉄一 L f 結合体は pH 6.5において、 L f 1分子に対し鉄が 150分子以上結合させたものに限ってではあるが、保存安定性を欠いていた。

また、特開平 4- 141067号の鉄一 L f 鉄篮合体は PH 6.5および

7.3において、すでに耐熱性がないため、当然のことながら保存安定性を欠いていた。

本発明によって得られた L ί を配合した製品を製造する場合. 特に制限はない。

殺菌は、通常実施されている工程に従い処理し、加熱殺菌あるいは滅菌する。加熱処理は 65'C、 30分間の低温殺菌、 120て

2〜 3秒間、 140〜 150て、 3〜 5秒間、あるいはレトルト処理も可能である。

また、乾燥すれば L ί舍有粉末製品を得ることが出来る。凍結乾燥でもよいが、大量に処理する場合には乾燥コストの安い噴霧乾燥が適している。再溶解させることを目的とした場合には、脱脂乳、乳清、カゼイン、ゼラチン、ショ糖、澱粉などに混合させる方が溶解性が向上する。

このようにして得られた L f 舍有製品は鉄が含まれているので、貧血予防あるいは治療を目的とした食品、飼料、医薬品に特に適している。特に、鉄の収斂味を完全に抑えるので、鉄強化食品や経口投与の医薬品への鉄材として優れている。さらに鉄の過酸化物生成促進作用を防止する性質もあるため、脂肪など酸化され易い食品などへの鉄材として利用価値が高い。

つぎに呈味性の成績を示す。

試験例 1 2

試験例 9 と同様に、 3 つの方法で作成した各種鉄 Z L f 混合溶液を分子量 5000力ットの限外濾過膜にて脱塩 · 濃縮し、模擬緩衝液（P H 6. 8 ) にて鉄イオンとして 13mg/ 100m lおよび 26mg/ 100m l となるよう蒸留水で希釈した。このようにして得られた試料について、以下のような官能評価試験を行った。

男 5女 5名のパネラーに模擬緩衝液を対照として各試料の収斂味を感じるかどうかを判定させた。パネラーには目隠しをし、外見による判断要因を与えないよう配慮した。一試料のための試験は、対照、試料の順に試飲させ、一試料評価後、最低一日の間隔をあけて、次の試料を評価するための試験を実施した。また、試料評価の日間偏差をなくすため、各パネラー毎に試料評価の順番をランダム化した。その結果、パネラー 10人のうちで収斂味を感じた人数を表 1 5 に示す。表一 1 5 特開平 4- 141067 第 2発明

L f 結合体 L f 複合体

Fe/Lf

碑

モノレ (¾ is?. ( ミリグラム /100ミ Ί リ 'ン卜ノレ J

13 26 13 26 13 26

15 10人 10人 0人 0人 0人 0人

30 10 10 0 0 0 0

60 10 10 0 0 0 0

150 10 10 0 3 0 0

240 10 10 1 4 0 0

480 10 10 1 6 0 0 以上のように、特に第 2発明における L f 複合体は鉄の収斂味を全く感じさせない優れたマスキング効果を有することが明らかとなつた。また、第 1発明における L f 結合体では鉄濃度力く 26ミリダラム /100ミリリットルであって Fe/Lfモル比が 150 を超える場合に収斂味を感じるパネラーが認められ、特開平 4- 141067では全ての場合においてパネラー 10人全員が収斂昧を認めた。

試験例 1 3

試験例 1 0 と同様に鉄ノ L f 混合溶液を分子量 5000力ットの限外濾過膜にて脱塩 · 濃縮し、模擬緩衝液にて、鉄として 26mg /100mlとなるよう希釈し、 90て 10分間の殺菌を施した。このようにして得た試料を試験例 1 2 と同様の方法にて官能評価試験した。表一 1 6

Fe/Lf P H

モル

比 2.0 2.1 2.5 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.8 9.0 9.2

10 10 9 8 8 7 8 8 5 6 8 10 15 10 3 2 2 1 0 0 0 0 1 10 30 10 1 0 0 0 0 0 0 0 0 10 60 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 120 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 240 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 480 10 2 1 1 1 1 0 0 0 0 10 1000 10 3 2 2 2 1 0 0 0 0 2 以上のように、本第 2発明の鉄一 L f 複合体は、 L f 1分子に対して鉄が 15分子以上 1000分子以下結合したものであれば、それを取り巻く環境が PH 2.1〜PH9.0 の範囲であれば、鉄の収斂味を抑制する効果を持っていた。この時、 L f l分子に対して鉄が 480 分子以上結合し、 PH 2.：!〜 PH5.0 の範囲で若干の収斂味を感じるものが数名観察されたが、鉄舍量を 13ミリグラム /100ミリリットルとすると 10名のバネラーの内、収斂味を感じるものは観察されなくなった。発明を実施するための最良の形態

次に本発明を実施例を挙げて具体的に説明する。

実施例 1

L f 100 g と硝酸鉄（ 9水和物） 72.4 g とを水 8 1 に溶解し- 攪拌機で激しく欖拌しながら重炭酸ナトリウム 5 gを添加して

11を6.4 に調整した。そして、全体の容積が 1 0 1 となるまで加水し、 L f 1 O gノ 1 、鉄イオン 100 m g / g L f 及び重炭酸イオン 107 m g / g L f を舍む耐熱性鉄一 L f 結合体溶液を調製した。

本溶液の半量 5 1 を凍結乾燥した結果、 5.3 gの粉末を得た。次に Sephadex G— 2 5 (フアルマシア社製）を水で平衡化したもの 100 m l を内径 2 c m、高さ 5 0 c mのカラムに充塡し、得られた溶液のうち 1 m 1 を負荷した。水で溶出し、ボイドボリューム画分を集め、 Bio-Rad 社の Protein Assay kitで L f を定量し、さらに I C Pによって鉄舍量を測定した。その結果、 L f 9.7m g、鉄イオン 1.03m gであった。すなわち L f 1 g 当り 106m gの鉄が結合していることが確かめられた。尚、当然のことながら他の画分には L f も鉄も溶出されていなかった。

実施例 2

L f 0.5 g と塩化第 2鉄（ 6水和物） 0.4 g とを水 100 m l に溶解し、スターラーでよく攪拌しながら 1 モル重炭酸ナトリゥム溶液を添加して、 ^1を3.5 に調整し、さらに、 1 N水酸化ナトリウムを添加して P Hを 6.2 に調整して耐熱性鉄一 L f 結合体溶液を得た。

次に、脱脂粉乳 2 k gを水 2 0 1 に還元し、乳酸をごく少量加えて P Hを 6.5 に調整した。このようにして調製した還元脱脂乳と先に調製した耐熱性鉄一 L f 結合体溶液 100 m 1 とを混合した後、均質化を行った。そして、プレート型殺菌機で 120 て、 2秒間殺菌した後、直ちに 5 ΐに冷却した。このようにして得られた耐熱性鉄一 L f 結合体を舍む製品は、電気伝導度が 6.5 m s / c m、 p Hが6.5 で、耐熱性鉄— L f 結合体舍量 25 m g / 1 . 鉄舍量 164 m g / g . L f であった。この耐熱性鉄一 L f 結合体を含む製品を 2週間冷蔵庫に保存した後、その一部を 1,200 X g、 1 0分間遠心分離したが、沈澱は認められず、鉄臭も殆ど感じられなかったので、耐熱性鉄— L f 結合体が安定して存在していると判断された。実施例 3

実施例 1 で調製した耐熱性 L f 一鉄結合体溶液 1.3 1 を脱脂乳 100 1 に溶解し、均質化した後、 150 'Cで 4秒間滅菌を行つた。滅菌後、直ちに 4 'Cまで冷却して、 250 m 1 ずつ紙容器に無菌充塡した。この耐熱性鉄一 L f 結合体を舍む製品を 3 7 ΐ で 3 ヶ月保存した後、 1,200 X g 1 0分間遠心分離して沈澱物の有無を調べたが、沈殺は全く認められなかった。また、製品中の大腸菌数及び一般細菌数は、共に 0であった。さらに、製品中に鉄が存在しているので、保存中に褐変が進行する恐れがあったが、極わずかに茶褐色を帯びているだけで、実用的には殆ど問題にはならない程度の変化であった。重炭酸ナトリウム 1.2 モルと L f (DMV社製） 10マイクロモルを舍む溶液 1 リットル（ A溶液）。硫酸第二鉄を鉄イオンとして 1.5 ミリモルを舍む溶液 1 リットル（ B溶液）を作成した。 A溶液に B溶液を加え、鉄を結合した L f を作成した。鉄ノ L f 混合溶液を分子量 5000力ットの限外濾過膜にて脱塩 · 濃縮し、模擬緩衝液（PH 8.9) にて、鉄濃度が 26ミリグラム/ 100ミリリットルとなるよう希釈した。これをネジ口付き試験管に密封した後、 90'C 10分間加熱し、室温まで自然冷却した後、室温にて 1 か月保存した。沈殺を肉眼にて判定したところ、全く認められなかった。さらに試験例 11と同様の方法にて官能評価試験を実施したところ、バネラー 10名のうちで収斂味を感じたものは一名も認められなかった。

実施例 5

炭酸カルシウム 0.05モル、重炭酸アンモニゥム 1.2モルを舍む溶液 1 リットルを塩酸にて PH 7.8に調製した（ A溶液）。硫酸第二鉄を鉄イオンとして 1.5ミリモルを舍む溶液 0.2リットル ( B 1 溶液）、トランスフリン（アポ型、高純度、牛血漿製、和光純薬工業） 10マイクロモルを舍む溶液 0.8リットル

( B 2溶液）を作成した。 B 1溶液と B 2溶液を混合後、 A溶液に B 1 / B 2混合液を加え、鉄を結合したトランスフェリンを作成した。鉄/ トランスフユリン混合溶液を分子量 5000力ットの限外濾過膜にて脱塩 · 濃縮し、模擬緩衝液（PH 6.8) にて、鉄濃度が 26ミリグラム /200ミリリットルとなるよう希釈した。これをネジ口付き試験管に密封した後、 90' (：、 10分間加熱し、室温まで自然冷却した後、 37てにて 1 か月保存した。沈殿を肉眼にて判定したところ、全く認められなかった。さらに試験例

1 2 と同様の方法にて官能評価試験を実施したところ、パネラ —10名 0うちで収斂味を感じたものは 1名も認められなかった。

実施例 6

炭酸ナトリウム 0.5モル、重炭酸カリウム 0.7モルを舍む溶液 1 リツトルを酢酸にて PH 8.3に調製した（ A溶液）。硝酸鉄 ( I ) を鉄イオンとして 1.5ミリモルを舍む溶液 0.2リットル ( B 1溶液）、オボトランスフェリン（タイプ I V、粗、卵白製、無鉄、シグマ社） 10マイクロモルを舍む溶液 0.8リットル ( B 2溶液）を作成した。 B 1 溶液と B 2溶液を混合後、 A溶液に B 1 B 2混合液を加え、鉄を結合したオボトランスフリンを作成した。鉄ノオボトランスフユリン混合溶液を分子量 5000力ットの限外濾過膜にて脱塩 · 濃縮した。これを模擬緩衝液（pH 6.2) にて、鉄濃度が 26ミリグラム/ 200ミリリットルとなるよう希釈した。これをネジ口付き試験管に密封した後、 90 て、 10分間加熱し、室温まで自然冷却した後、 37'Cにて 1か月保存した。沈殿を肉眼にて判定したところ、全く認められなかつた。さらに試験例 1 2 と同様の方法にて官能評価試験を実施したところ、パネラー 10名のうちで収斂味を感じたものは 1名も認められなかった。

実施例 Ί

重炭酸ナトリゥム 24モル舍む溶液 8 リットル（溶けきらない塩が沈殿している）を調製した（ A溶液）。塩化第二鉄を鉄ィオンとして 20ミリモルを舍む溶液 2 リットル（ B 1溶液）、ラクトフヱリン（タツアバイロジックス社製） 1 00マイクロモルを舍む溶液 8 リットル（ B 2溶液）を作成した。 B 1溶液と B 2 溶液を混合後、 A溶液を良く撹拌しながら、 A溶液に B 1 Z B2 混合液を加え、鉄を結合したラクトフエリンを作成した。鉄/ ラクトフユリン混合溶液を分子量 5000力ットの限外濾過膜にて加水脱塩後、同様の膜で 1 リットルにまで濃縮した。これを 20 リットルの還元脱脂乳（脱脂粉乳 100グラムを水 1 リットルの比率で還元）に、鉄濃度が 26ミリグラム/ 200ミリリットルとなるよう添加した。これを撹拌混合後、プレート型殺菌機を用いて 120 °Cにて 2秒間殺菌し直ちに 5 'Cに冷却した後、低温（10 'C ) にて 2週間保存した。一部を 3 , 000r pm、 10分間遠心分離し沈殿を肉眼にて判定したところ、全く認められなかった。さらに試験例 1 2 と同様の方法にて官能評価試験を実施した。ただし、対照は還元脱脂乳を同様の条件にて殺菌 · 保存したものを用いた。パネラー 10名のうちで収斂味や味 ♦ 香りなどに異常を感じたものは 1名も認められなかった。

実施例 8

実施例 7で作成 · 濃縮した鉄ラクトフユリン混合溶液を 20 リットルの生乳に、鉄濃度が 26ミリグラム /200ミリリットルとなるよう添加した。これを均質化した後に 150 'C 4秒間滅菌し直ちに 4 てに冷却し 250m lづっ紙容器に無菌的に充塡した。 37 てにて 3 ヶ月保存後、遠心分離し沈澱物の有無を調べたが、沈澱は全く認められなかった。また、大腸菌数および一般細菌数共に 0であった。また、鉄が存在しているために保存中に褐変が進行する恐れがあつたが、全く褐変は認められなかった。さらに試験例 1 2 と同様の方法にて官能評価試験を実施した。ただし、対照は生乳を同様の条件にて殺菌 · 保存したものを用いた。パネラー 1 0名のうちで収敛味や味 ♦ 香りなどに異常を感じたものは 1名も認められなかった。

実施例 9

実施例 7で作成 · 濃縮した鉄ノラクトフユリン混合溶液（試験群）または硫酸第 1鉄溶液（対照群 1 ) を、鉄濃度が 20ミリグラム/ 1 00ミリリットルとなるよう、ァスコルビン酸およびァスコルビン酸ナトリウムをビタミン C として 6 . 2ミリグラム/ 1 00 グラム舍む生理的リン酸緩衝液（P H 7 . 2 ) に溶解し、 90 、 1 0分間の殺菌をしたものを試験試料とした。対照群 2 として、ビタミン Cを添加した生理的リン酸緩衝液を殺菌したものも作成した。

離乳直後、 2 1日齢のウィスター系雌ラット（日本チヤ一ルスリバ一）の中、体重が 45から 50グラムのものを選び、除鉄食 (オリエンタル酵母，鉄含量 0 . 25ミリグラム / 1 00グラム飼料）を 2週間与え、血中ヘモグロビン値が 7 グラム/ 1 00ミリリットル以下の貧血ラットを作成した。ラットは 1群 4匹として、その後も除鉄食を与え続けながら、試験試料を 1 ミリリットル日、 6週間、強制経口（ゾンデ）投与した。試験試料投与後 6 週間目に、尾静脈より採血し、自動血球計測装置（東亜医用電子）でヘモグロビン値を測定した。その結果を表 1 7 に示す。表一 1 7 へモグロビン値（平均値土標準偏差）試験群 15.2±1.1 (グラム八 00ミリリットル）対照群 1 12.9±0.9

対照群 2 4.8±0.3 以上のように、本発明の鉄一 L f 複合体は貧血治療効果を示し、さらに、その効果は無機鉄である硫酸第一鉄よりも優れていたことが明らかとなつた。

実施例 1 0

実施例 7 で作成 · 濃縮した鉄 Zラクトフユリン混合溶液を、ァスコルビン酸およびァスコルビン酸ナトリゥムをビタミン C として 30ミリグラム/ 200ミリリットル添加した生乳に、鉄濃度力く 15ミリグラム /200ミリリツトルとなるよう添加し、約 200ミリリットル容量の耐熱ガラス瓶にへッドスペース 10ミリリットル以下となるよう充塡した（試験群）。対照として、鉄ノラクトフユリンの替わりにクェン酸鉄ナトリウムを添加したビタミン C強化乳を用いた（対照群）。これを F値 4 でレトルト滅菌し、 37てで 2週間保存し、残存するビタミン C舍量をビタミン C測定器（ T O A電子社製）にて定量した。ビタミン C残存率は測定値を初期値で割った百分率とした。その結果を表 1 8 に示す。

表一 1 8 残存率試験群 89%

対照群 62 以上のように、鉄—ラクトフヱリン複合体は無機鉄に比べてビタミン cの破壊の程度が低く、酸化および過酸化物生成能の低い鉄材としても有効であることが明らかとなった。

さらに、試験群について試験例 1 2 と同様の方法にて官能評価試験を実施した。ただし、対照は鉄を添加していないビタミン C強化乳を同様の条件にてレトルトしたものを用いた。パネラー 10名のうちで収斂味などに異常を感じたものは 1名も認められな力、つた。

荬施例 1 1

1 グラムの L f ( D M V社製）を 0.2モル_ リットルの酢酸緩衝液（PH 4 ) に溶解し、ペプシン（シグマ社） 26000ュニット添加し、 37 、 2時間反応後、水酸化ナトリウムで P H 7.5 とした。これにトリプシン（シグマ社） 200000ユニットを添加して、 37て、 2時間反応させた。このようにして得た分解 L f は電気泳動により、主に分子量 50kDa、 40kDa、 30kDaの分解物となっていることを確認した。

重炭酸ナトリウム 1.3モル舍む溶液 1 リットル（溶けきらない塩が沈殿している）を調製した（ A溶液）。塩化第二鉄を鉄イオンとして 1.2ミリモルを舍む溶液 0.2リットル（ B 1溶液）ラクトフヱリン分解物を分解前のラクトフヱリンとして 10マイクロモルを舍む溶液 0, 8リットル（ B 2溶液）を作成した。 B 1溶液と B 2溶液を混合後、 A溶液を良く撹拌しながら、 A溶液に B 1 /B 2混合液を加え、鉄を結合したラクトフユリン分解物を作成した。これをネジ口付き試験管に密封した後、 90て、 10分間加熱し、室温まで自然冷却した後、 37てにて 1 か月保存した。沈殿を肉眼にて判定したところ、全く認められなかった。さらに試験例 1 2 と同様の方法にて官能評価試験を実施したところ、パネラー 10名のうち、収斂味を感じたものは 1名も認められなかった。産業上の利用可能性

本発明の鉄ラクトフユリン結合体（複合体）は鉄含量が高く熱安定性があるので加熱加工される飲食品等にもラクトフユリン及び鉄の生理活性作用を付与することができる。

さらに、鉄独特の収斂味を消し、鉄のもつ過酸化物生成促進作用を防止することができるので、貧血の予防あるいは治療、鉄強化または病原菌付着防止等を目的とした食品、医薬品、飼料、化粧品等の原料として有用である。

Claims

請求の範囲

1 . ラクトフヱリン類に炭酸および/または重炭酸を介して鉄がラクトフユリン 1 分子に対して 15分子以上結合した耐熱性炭酸および/または重炭酸—鉄ーラクトフユリン結合体。

2. ラクトフヱリン類 1 分子あたり、鉄が 15分子以上 1000分子以下、かつ炭酸およびノまたは重炭酸が 15分子以上結合した耐熱性炭酸およびノまたは重炭酸一鉄ーラクトフュリン結合体。

3. 次の性質を示す炭酸および/または重炭酸一鉄一ラクトフユリン複合体。

1 ) ラクトフユリン類 1 分子当り、鉄を 15乃至 1000分子および炭酸およびノまたは重炭酸 15分子以上を舍有すること、

2 ) PH 2.1以上 9.0以下で常温で少なくとも 1 ヶ月間沈澱を生じないこと、

3 ) 加熱しても沈澱を生じないこと、

4 ) 鉄独特の収斂味がないこと。

4. 炭酸およびノまたは重炭酸を結合鉄あたり 1 分子以上舍有するものである請求の範囲 3記載の耐熱性炭酸および/または重炭酸—鉄—ラクトフリン複合体。

5 . i)炭酸、または ii) 重炭酸、または iii) 炭酸および重炭酸を含む溶液（ A溶液）に、 iv ) 鉄および V ) ラクトフユリン類を舍有する溶液（ B溶液）を混合することによって得られ、次の 1)から 4)の性質を示す炭酸および/または重炭酸—鉄一ラクトフヱリン複合体。ただし、このとき B溶液の vi ) 鉄ィオンモル濃度は、 vii) A溶液と、 B溶液の一部または全部が混合した溶液（反応溶液）に溶解している viii) 炭酸イオンおよび重炭酸イオンのモル濃度の高くとも 1 / 3倍以下であつて、 B溶液の ix ) ラクトフユリン類のモル濃度は、 B溶液の x) 鉄イオンモル濃度の 1/15〜： L/1000であって、かつ反応溶液の xi) 炭酸イオンおよび重炭酸イオンモル濃度の高くとも 1/50倍以下である。

1 ) ラクトフリン類 1 分子当り、鉄を 15乃至 1000分子、かつ炭酸および/または重炭酸 15分子以上舍有すること、

3 ) 加熱しても沈殺を生じないこと、

4 ) 鉄独特の収敛味がないこと。

6. i)炭酸、または ii) 重炭酸、または iii ) 炭酸および重炭酸、かつ iv) ラクトフユリン類を舍む溶液（ A溶液）に、 V ) 鉄を舍有する溶液（ B溶液）を混合することによって得られ、次の 1)から 4)の性質を示す炭酸およびノまたは重炭酸一鉄一ラクトフヱリン複合体。ただし、このとき B溶液の vi)鉄ィオンモル濃度は vii) A溶液と、 B溶液の一部または全部が混合した溶液（反応溶液）に溶解している vi) 炭酸イオンおよび重炭酸イオンのモル濃度の高くとも 1/3倍以下であって、 ix ) A溶液のラクトフユリン類のモル濃度は、 B溶液の X)鉄イオンモル濃度の 1/15〜1/1000であって、かつ反応溶液の X i)炭酸ィォンおよび重炭酸ィォンモル濃度の高くとも 1/50倍以下である。

1 ) ラクトフリン類 1 分子当り、鉄 15乃至 1000分子、かつ炭酸および Zまたは重炭酸 15分子以上を含有すること、

2 ) PH 2.1以上 9.0以下で常温で少なくとも 1 ヶ月間沈澱が生じないこと、

3 ) 加熱しても沈澱を生じないこと、

4 ) 鉄独特の収斂味がないこと。

7. i)炭酸、または ii) 重炭酸、または iii) 炭酸および重炭酸を舍む溶液（ A溶液）に、 iv ) 鉄および V ) ラクトフユリン類を舍有する溶液（ B溶液）を混合することによって得られ、次の 1)から 4)の性質を示す炭酸および/または重炭酸一鉄一ラクトフヱリン複合体の製造法。ただし、このとき B溶液の vi ) 鉄イオンモル濃度は、 vS) A溶液と、 B溶液の一部または全部が混合した溶液（反応溶液）に溶解している viii) 炭酸イオンおよび重炭酸イオンのモル濃度の高くとも 1 ノ 3倍以下であって、 B溶液の ix ) ラクトフヱリン類のモル濃度は、 B溶液の X) 鉄イオンモル濃度の 1/15〜： 1/1000であって、力、つ反応溶液の xi) 炭酸イオンおよび重炭酸イオンモル濃度の高くとも 1/50倍以下である。

1 ) ラクトフユリン類 1 分子当り、鉄 15乃至 1000分子、かつ炭酸および/または重炭酸 15分子以上を舍有すること、

2 ) PH 2.1以上 9.0以下で常温で少なくとも 1 ヶ月間沈殺が生じないこと、

3 ) 加熱しても沈澱を生じないこと、

4 ) 鉄独特の収斂味がないこと。

. i)炭酸、または ii) 重炭酸、または iii) 炭酸および重炭酸、かつ iv)ラクトフエリン類を舍む溶液（ A溶液）に、 V ) 鉄を舍有する溶液（ B溶液）を混合することによって得られ、次の 1)から 4)の性質を示す炭酸および重炭酸一鉄—ラクトフヱリン複合体の製造法。ただし、このとき B溶液の vi) 鉄ィオンモル濃度は、 vii) A溶液と、 B溶液の一部または全部が混合した溶液（反応溶液）に溶解している viii) 炭酸イオンおよび重炭酸ィォンのモル濃度の高くとも 1 ノ 3倍以下であつて、 A溶液の ix ) ラクトフヱリン類のモル濃度は、 B溶液の X)鉄ィォンモル濃度の 1/15〜 1/1000であって、かつ反応溶液の xi) 炭酸イオンおよび重炭酸イオンモル濃度の高くとも 1/ 50倍以下である。

1 ) ラクトフリン類 1 分子当り、鉄 15乃至 1000分子、かつ炭酸および/または重炭酸 15分子以上を含有すること、

3 ) 加熱しても沈澱を生じないこと、

4 ) 鉄独特の収斂味がないこと。

9 . 鉄として水に溶解したときの P Hが 4以下を示す鉄塩を用いる請求の範囲 5 または 6記載の耐熱性炭酸およびノまたは重炭酸一鉄一ラクトフユリン複合体。

10. 鉄として、水に溶解したときの P Hが 4以下を示す鉄塩を用いる請求の範囲 7 または 8記載の製造法。

11. ラクトフヱリン類 1 g 当り、炭酸、炭酸イオン、重炭酸および Zまたは重炭酸ィオン 2 2 〜562 m g、鉄が 2 0 〜500 m g結合した請求の範囲 1 記載の耐熱性炭酸およびまたは重炭酸一鉄ーラクトフユリン結合体。

12. 水に溶解したときの P Hが 4以下である鉄塩をラクトフユリン類当り 2 0〜500 m gの割合でラクトフヱリン類溶液に添加し、炭酸イオンまたは重炭酸イオンを舍むアルカリ塩をラクトフヱリン 1 g 当り炭酸イオンまたは重炭酸ィオン濃度にして 0.12〜 5 g加えて P H 7以下に調整することを特徴とする耐熱性炭酸およびノまたは重炭酸一鉄—ラクトフユリン結合体の製造法。