[go: up one dir, main page]

WO1994016087A1 - Plantes transgeniques resistantes aux virus vegeteaux et procede d'obtention - Google Patents

Plantes transgeniques resistantes aux virus vegeteaux et procede d'obtention

Info

Publication number
WO1994016087A1
WO1994016087A1 PCT/FR1994/000038 FR9400038W WO9416087A1 WO 1994016087 A1 WO1994016087 A1 WO 1994016087A1 FR 9400038 W FR9400038 W FR 9400038W WO 9416087 A1 WO9416087 A1 WO 9416087A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
dna
potyvirus
plants
plant according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1994/000038
Other languages
English (en)
Inventor
Thierry Lagavre
Mylène DURAND-TARDIF
Francine Casse-Delbart
Christophe Robaglia
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of WO1994016087A1 publication Critical patent/WO1994016087A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/127—RNA-directed RNA polymerase (2.7.7.48), i.e. RNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
    • C12N9/506—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses derived from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/34011—Potyviridae
    • C12N2770/34022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the subject of the present invention is transgenic plants resistant to plant viruses and a process for obtaining plants.
  • DNA, RNA and proteins that provide protection to plants against these viruses.
  • Viruses are among the major pathogens of cultivated plants. Due to the dependence of viruses on their host cells, it is difficult to destroy them without running the risk of damaging the organisms they parasitize.
  • the means of control s' therefore essentially preventive: health seed selection, use of resistant varieties, sanitation plants infected with thermotherapy or meristem culture.
  • Certain genotypes have resistance genes for certain viruses, but these characters take an extremely long time to be introduced into other lines by the conventional pathways of genetics.
  • the potyviruses form by their number and their agronomic importance the most important group of plant viruses.
  • the filamentous viral particle 60 0-900 nm in length contains a single RNA molecule of positive polarity of approximately 10 kb.
  • Each RNA molecule carries a protein covalently linked at its 5 'end (VPg) and is polyadenylated at its 3 'end.
  • VPg protein covalently linked at its 5 'end
  • these viruses induce the formation of cylindrical and sometimes nuclear cytoplasmic inclusions of characteristic shape. They are transmitted naturally by aphids in a non-persistent fashion. Most have a relatively narrow host spectrum.
  • PVY Potato virus Y
  • O, N and C main strains characterized by the differences in symptoms they induce.
  • PVY is pathogenic for many Solanaceae of agronomic interest, such as tobacco, tomatoes, peppers and various varieties of potatoes.
  • head yields can be reduced by 10 to 80% depending on the virus strain, cultivar and the time of infection.
  • Early tobacco infection can cause yield loss of around 30%; necrosis of the ribs disease, caused by the N strain on certain varieties of tobacco, can cause a total loss of the crop of this plant.
  • RNA of potyviruses like that of other associated plant-type picorna viruses (nepovirus and comovirus) is translated into a polypeptide, which is then mature by proteolytic cleavage to give the viral proteins.
  • the review by Riechmann et al. J. Gen. Virol. (1992), 73, 1-16) summarizes the results obtained recently.
  • the other known proteins are those of the helper factor necessary for the transmission by aphids, of cylindrical inclusion, of the VPg bound in 5 'of the viral RNA, and finally of the capsid. To this are added two proteins framing the assistant factor.
  • Transgenic plants for this gene " and resistant to potyviruses can be obtained.
  • Another publication mentions obtaining plants resistant to tobacco mosaic viruses by the introduction of a gene supposed to code for a non-structural protein which could be a component of the replication complex of this virus (Golemboski et al., Proc. National Acad. Sci. USA, Vol.87, pp.6311-6315, 1990).
  • the authors show that plants transformed using a vector carrying the sequence of this gene exhibit resistance to the virus.
  • the techniques described above make it possible in certain cases to obtain plants exhibiting resistance to plant viruses, they are nevertheless not applicable to all species of plants and for all plant viruses: in the case of certain potyviruses, the results could only lead to low resistance.
  • transgenic plants obtained express the entire and active protease and not a part of this protein.
  • the applicant set out to develop a process for obtaining transgenic plants resistant to potyviruses transformed by non-capsid gene sequences, which do not have the abovementioned drawbacks.
  • plants resistant to plant viruses can be selected in sufficient quantities by direct introduction of a DNA library into the cells or tissues of these plants.
  • the subject of the present invention is a plant resistant to potyviruses, characterized in that it carries in its genome one or more DNA fragments expressing transcripts corresponding to a protein or to a part of a protein of a donor virus, with the exception of a capsid protein and the protease Nia of the whole TVMV, said plant being capable of being obtained by introduction using techniques known to those skilled in the art, such as electroporation, vectors from a DNA library of the donor virus, and selection according to criteria of resistance to potyviruses.
  • donor virus is meant a virus whose genome is going to be at the origin of the DNA fragments to be inserted into the genome of the plant.
  • said plant is characterized in that that it carries a DNA fragment expressing transcripts corresponding to a protein or part of protein involved in the formation of the replicative complex of a potyvirus.
  • a DNA fragment may contain part of the sequence coding for the protein P3, in particular a part of the sequence between nucleotides 2853 and 3492 of the complementary DNA (cDNA) of the PVY potyvirus.
  • Such a DNA fragment may also contain part of the sequence coding for the central part of the protease Nia, in particular a part of the sequence between nucleotides 5999 and 6660 of the DNA sequence complementary to the PVY potyvirus.
  • a third type of DNA fragment may contain part of the sequence coding for the C-terminal end of the Nia protease and the N-terminal end of the Nlb polymerase, in which case the DNA fragment is preferably between nucleotides 6652 and 7080 of the DNA sequence complementary to the PVY potyvirus.
  • said plant can carry a DNA fragment expressing transcripts corresponding to a protein involved in the transport of a potyvirus from a cell to a other.
  • the DNA fragment can code for part of the PI protein, and in particular be between nucleotides 428 and 1044 of the DNA sequence complementary to the PVY potyvirus.
  • said plant can also be defined in that it carries a DNA fragment expressing transcripts corresponding to a protein or a part of protein having similarity with the cleavage sites. viral proteins from a potyvirus.
  • the potyvirus against which the plants are resistant is the potato virus Y.
  • Said plant can be any plant susceptible to plant viruses and in particular to potyviruses.
  • the present invention can also be applied to the resistance of plants to other plant viruses such as nepoviruses and comoviruses.
  • the DNA fragments carried by the plants are then preferably fragments expressing transcripts corresponding to proteins or parts of protein having similarities with the central part of the Nia protease or the part of the polyprotein corresponding to the C-terminal end. of the Nia protease and the N-terminus of the Nlb polymerase.
  • This plant in the case of PVY advantageously belongs to the Solanaceae family including in particular tobacco, tomato, pepper and potato.
  • the present invention further relates to a DNA fragment as defined above and providing protection to plants against plant viruses, and in particular potyviruses.
  • the present invention further relates to RNA capable of being transcribed from one of these DNA fragments.
  • Another object of the present invention is a protein fragment or a protein as defined above and providing plants with resistance to potyviruses.
  • the present invention further relates to a process for obtaining plants resistant to a plant virus in which: - vectors are introduced into cells or tissue fragments of said plants. DNA complementary to a donor virus, - plants are regenerated from said cells or said tissue fragments, and - plants selected having resistance against the plant virus are selected.
  • such a method can be applied to the selection of plants resistant to a potyvirus, a nepovirus or a comovirus, but the method can be applied to obtaining plants resistant to any plant virus. .
  • the vectors originating from the complementary DNA library can be introduced by electroporation or by any method known to a person skilled in the art making it possible to introduce DNA into a plant cell.
  • the donor virus as defined above is a virus belonging to the same family as that for which it is sought to obtain resistant plants.
  • a DNA bank of a potyvirus will preferably be used to obtain plants resistant to a potyvirus.
  • FIG. 1 schematically represents the known structure of the polyprotein of the potato virus Y (1A) and the peptides translated from this virus (1B).
  • the curved arrows indicate the proteolytic cleavages.
  • FIG. 2 represents the general scheme for obtaining plants resistant to viruses from DNA complementary to PVY virus.
  • FIG. 3 shows more precisely the method for cloning the viral complementary DNA fragments which resulted in the manufacture of a complementary DNA library.
  • FIGS. 4 to 7 illustrate the resistances respectively of the descendants of the clones FCD3E1, FCD3B6, FCD4A2 and FCD3I1.
  • FIGS. 8 and 9 respectively illustrate the resistances of first and second generation plants homozygous for the introduced gene resulting from crosses from the clone T3A5.
  • FIGS. 10 to 13 represent the nucleotide sequence of the DNA expressed in the T3A5 clones
  • FCD3I1, FCD4A2 and FCD3B6 and their corresponding peptide sequences in the three possible reading frames denoted a, b, and c.
  • Figure 14 is a schematic genetic map of the PVY virus, in which the black arrows indicate the positions of the virus fragments corresponding to the DNA fragments integrated into the lines T3A5, FCD3I1, FCD4A2 and FCD3B6.
  • EXAMPLE 1 Construction of the expression vector of the complementary DNA bank
  • the complementary DNA (cDNA) of the viral genome (PVY RNA) is synthesized by primer at random in step (1).
  • the cDNA obtained in (2) is cloned into a Sma I site of the plasmid pRT103NPT II (-) shown schematically in (3) and gives rise to a cDNA library shown schematically in (4).
  • the cDNA library (4) is then introduced by electroporation into a preparation of tobacco protoplasts (5) then the clones are selected and regenerated (6) ' and subjected to PVY resistance tests (7).
  • Figure 3 summarizes more precisely the manufacturing of the bank.
  • pRtl03NPTII (-) is composed by the promoter of the RNA 35S of the cauliflower mosaic virus (CaMV) followed by a translation initiation codon which is not in phase with the coding region of the gene conferring resistance to kanamycin derived from the bacterial transposon Tn5, coding for the protein neomycin phosphotransferase II (NPTII).
  • This plasmid further comprises the transcription terminator of the cauliflower mosaic virus.
  • DNA complementary to the viral RNA of a strain N of the potato virus Y obtained by random priming (Sambrook et al., 1989, Cold
  • NPTII neomycin phosphotransferase II
  • Example 1 The complementary DNA library obtained in Example 1 was introduced by electroporation (Guerche et al., 1987, Biochemistry, 69: 621) in protoplasts of Nicotiana tabacu (Xanthi variety, diploid clone D8).
  • the offspring from self-fertilization of the plants thus obtained were collected and sown in vitro on a selective medium. Segregation for resistance to Kanamycin is of the dominant monogenic Mendelian type in the descendants of the clones obtained.
  • transgenic plants were obtained by self-fertilization from these primary transformants. The behavior of these plants towards a viral infection was then evaluated.
  • the two oligonucleotides synthesized which made it possible to amplify the complementary DNAs have the following sequences:
  • ** primer 1 covers the sequence of the expression vector pRtl03NPTII (-) ranging from nucleotide + 1 of the transcription to the ATG codon (Odell et al, 1985 Nature 313, 810)
  • primer 2 covers the complementary sequence of the NPTII gene of pABDl going from nucleotide 1489 to nucleotide 1508: 5 'GGCCGGAGAACCTGCGTG 3' Only one amplification product is obtained for each plant studied.
  • the amplified DNA fragments were purified and sequenced (Applied Biosystem, Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit) using these oligonucleotides in order to determine the part of the viral genome which is expressed in these plants.
  • the sequence expressed by the clone T3A5 is as follows: from base 428 to base 1044 of the viral genome. It is represented in FIG. 10 with the corresponding peptide sequences.
  • This gene codes for the terminal C part of the first protein (PI) of the viral polyprotein.
  • the descendants of the T3A5 clone are therefore resistant to the Y virus and have a fragment of the gene coding for the PI protein integrated into their genome.
  • FCD3I1, FCD4A2 and FCD3B6 range respectively from 2853 to 3492, from 5999 to 6660 and from 6552 to 7080. ( Figures 11, 12 and 13).
  • the sequence expressed by the clone FCD3I1 can code for part of the P3 protein involved in replication.
  • the sequence expressed by the clone FCD4A2 can code for a part of the Nia protein comprising the proteolytic cleavage site between the VPg part and the protease part of this protein (Dougherty and Parks (1991) - Virology. 182 449-456).
  • the sequence expressed by the clone FCDB6 can code for a protein comprising the C-terminal end of the Nia protease and the N-terminal end of the Nlb polymerase and comprises the proteolytic cleavage site separating these two proteins.
  • a diagram representing the different sequences expressed in the clones T3A5, FCD3I1, FCD4A2 and FCD3B6 is given in FIG. 14.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

Plante résistante aux potyvirus portant dans son génome un ou plusieurs fragments d'ADN exprimant des transcripts correspondant à une protéine ou à une partie d'une protéine d'un virus donneur telle qu'une protéine intervenant dans la formation du complexe réplicatif d'un potyvirus, une protéine intervenant dans le transport d'un potyvirus entre les cellules ou une protéine présentant une similarité avec les sites de clivage des protéines virales d'un potyvirus. Procédé d'obtention de plantes résistantes à un virus végétal dans lequel on introduit dans des cellules ou fragments de tissu desdites plantes, des vecteurs issus d'une banque d'ADN complémentaire d'un virus donneur et en ce qu'on sélectionne les plantes présentant une résistance à l'encontre du virus végétal.

Description

"Plantes transgéniques résistantes aux virus végétaux et procédé d'obtention"
La présente invention a pour objet des plantes transgéniques résistantes aux virus végétaux et un procédé d'obtention des plantes.
Elle est également relative à des fragments. d'ADN, d'ARN et à des protéines procurant une protection aux plantes à l'encontre de ces virus.
Les virus sont parmi les pathogènes majeurs des plantes cultivées . Du fait de la dépendance des virus vis-à-vis de leurs cellules hôtes, il est difficile de les détruire sans courir le risque d'endommager les organismes qu'ils parasitent. Les moyens de lutte s'ont donc essentiellement préventifs : sélection sanitaire des semences, utilisation de variétés résistantes, assainissement des plantes infectées par thermothérapie ou culture de méristèmes.
Certains génotypes possèdent des gènes de résistances pour certains virus , mais ces caractères sont extrêmement longs à être introduits dans d'autres lignées par les voies classiques de la génétique.
Le nombre des espèces végétales accessibles à la transformation génétique s'accroît régulièrement . Des stratégies d'introduction de gènes de résistance par cette voie sont donc hautement désirables . Aucun gène naturel de résistance n'a encore été isolé, aussi les méthodes actuelles font appel à la construction de gènes artificiels.
Les potyvirus forment par leur nombre et leur importance agronomique le groupe le plus important des virus végétaux . La particule virale filamenteuse de 600 à 900 nm de long contient une molécule unique d'ARN de polarité positive d'environ 10 kb. Chaque molécule d'ARN porte une protéine liée de manière covalente à son extrémité 5' (VPg) et est polyadenylee à son extrémité 3' . Dans la cellule végétale, ces virus induisent la formation d'inclusions cytoplasmiques cylindriques et parfois nucléaires de forme caractéristique. Ils sont transmis naturellement par les aphides sur le mode non-persistant. La plupart ont un spectre d'hôte relativement étroit.
Le virus Y de la pomme de terre (PVY) est le membre type de ce groupe. On distingue trois souches principales (O, N et C) caractérisées par les différences de symptômes qu'elles induisent. Le PVY est pathogène pour de nombreuses solanacées d'intérêt agronomique, comme le tabac, la tomate, le poivron et diverses variétés de pomme de terre . Chez ce'tte dernière espèce les rendements peuvent être diminués de 10 à 80% selon la souche du virus, le cultivar et le moment de l'infection. Une infection précoce du tabac peut induire une perte de rendement d'environ 30%; la maladie des nécroses des nervures, causée par la souche N sur certaines variétés de tabac, peut entraîner une perte totale de la récolte de cette plante.
L'ARN des potyvirus , comme celui des autres virus de plantes de type picorna associés (népovirus et comovirus) est traduit en un polypeptide, qui est ensuite mature par clivage proteolytique pour donner les protéines virales . La revue de Riechmann et al. (J. Gen.Virol. ( 1992) , 73, 1-16) résume les résultats obtenus récemment.
On a montré qu'il existe une grande similarité dans l'organisation génomique des protéines du complexe replicatif des potyvirus, des comovirus et népovirus .
L'analyse des séquences nucléotidiques des potyvirus a confirmé l'existence d'une seule longue phase de lecture ouverte, entre un codon AUG initiateur et un codon d'arrêt de traduction; l'ARN viral code pour une polyprotéine, qui est ultérieurement clivée par protéolyse enzymatique . Une carte génétique partielle de ces virus a été établie et est représentée pour le virus PVY sur la figure 1. Il a été montré que l'une des inclusions nucléaires (Nia) est une protéase (Carrington et Dougherty 1987, J. Virol. 61, 2540-2547), et des homologies de séquence mises en évidence avec les protéines codées par les picornavirus suggèrent que l'autre inclusion nucléaire (Nlb) pourrait être impliquée dans la réplication (Domier et al. 1987 Virology 158, 20-27) . Les autres protéines connues sont celles du facteur assistant ( "helper component") nécessaire à la transmission par les aphides , de l'inclusion cylindrique, du VPg lié en 5 ' de l'ARN viral, et enfin de la capside. S'y ajoutent deux protéines encadrant le facteur assistant.
L'une d'une masse de 31 kD , appelée PI, pourrait être impliquée dans le transport de cellule à cellule ( Domier, (1987) , Virology, 158, 20-27) tandis que l'autre d'une masse de 38 kD appelée P3 serait impliquée dans la réplication (Gamble - Klein et al, Abstracts of the third international congress of plant molecular biology, Tuckson, Arizona, 6-11 Octobre 1991) .
En 1985 , Sanford et Johnston (J. Theor. Biol. 113, 395-405) ont émis le concept de résistance dérivée du pathogène, en vertu duquel des séquences nucléotidiques issues d'un pathogène peuvent être utilisées pour modifier génétiquement l'hôte afin qu'il devienne résistant à ce pathogène.
Selon ce principe , une résistance vis-à-vis de virus végétaux a été déjà obtenue par transformation des plantes à l'aide de fragments d'ADN portant des gènes codant pour les protéines de la capside .
Une revue bibliographique a recensé les résultats obtenus sur différents virus végétaux (Beachy et al. Annual Review of Phytopathol,1990, 28: 451-74) .
Cette technique a été plus précisément développée dans le cas des potyvirus et a abouti au dépôt de la demande PCT FR-89 00 260 ( publiée sous le n° O-89 121 00) . Dans cette demande , on décrit la construction d'un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus dans des conditions telles que sa fonction n'est pas altérée.
Des plantes transgéniques pour ce gène" et résistantes aux potyvirus peuvent être obtenues. Une autre publication mentionne l'obtention de plantes résistantes aux virus de la mosaïque du tabac par l'introduction d'un gène supposé coder pour une protéine non structurale qui pourrait être un composant du complexe de réplication de ce virus (Golemboski et al., Proc. National Acad. Sci . USA, Vol.87, pp.6311-6315, 1990 ) . Les auteurs montrent que les plantes transformées à l'aide d'un vecteur portant la séquence de ce gène présentent une résistance vis-à-vis du virus. Bien que les techniques précédemment décrites permettent l'obtention dans certains cas de plantes présentant une résistance aux virus végétaux , elles ne sont néanmoins pas applicables à toutes les espèces de plantes et pour tous les virus végétaux. En effet, dans le cas de certains potyvirus , les résultats n'ont pu conduire qu'à de faibles résistances .
De plus , des mutations pourraient intervenir dans les virus, rendant inefficace la résistance induite chez les plantes transformées par les protéines de capside.
Il serait donc souhaitable de générer d'autres types de gènes de résistance afin de pouvoir combiner plusieurs résistances dans des plantes transgéniques, et de cumuler les effets de résistances faibles.
Une telle approche a déjà été testée, sans succès par AUDY et al. (1992, Canadian Journal of Plant Pathology, 14, 240-249) qui ont transformé des tomates et des pommes de terre avec de l'ADN codant pour la protéine Nlb du virus PVY de la pomme de terre. Cependant, les auteurs ne mentionnent pas l'obtention de plantes transgéniques résistantes.
Ce court compte-rendu ne pouvait donc inciter l'homme du métier à utiliser le gène Nlb pour conférer à des plantes la résistance à des potyvirus.
Un autre compte-rendu d'un Symposium ayant eu lieu en Avril 1992 ( Maiti et Hunt, J. Cell Biochem. Suppl. Volume 16F, 1992, page 217) décrit une tentative d'obtention de plantes résistantes, en particulier au PVY par l'expression de la protéine Nia du virus TVMV (Tobacco Vein Mottling Virus) entière . Les auteurs mentionnent que les études effectuées sont préliminaires et qu'elles indiquent simplement que l'expression du gène de la protéase peut affecter la réponse des plantes à un virus homologue.
On notera que dans ce document, les plantes transgéniques obtenues expriment la protéase entière et active et non une partie de cette protéine.
Il ressort donc de l'analyse de l'état de la technique que les résultats très préliminaires obtenus sur des plantes transgéniques pour des gènes Nia et Nlb ne pouvaient en aucune manière inciter l'homme du métier à tester la résistante aux potyvirus de plantes transgéniques exprimant des fragments de ces protéines ou des protéines autres que les protéines de capside.
Le demandeur s'est attaché à développer un procédé d'obtention de plantes transgéniques résistantes aux potyvirus transformées par des séquences de gène non capsidiques, ne présentant pas les inconvénients précités.
Selon l'invention, on a montré de manière surprenante que l'introduction dans des plantes d'un fragment d'ADN exprimant des transcripts correspondant à au moins une partie d'une protéine d'un potyvirus autre qu'une protéine de capside, conférait à ces plantes une résistance efficace à l'encontre de ces virus .
Les inventeurs ont en outre montré de manière tout aussi surprenante que l'on pouvait sélectionner en quantités suffisantes des plantes résistantes à des virus végétaux par introduction directe d'une banque d'ADN dans des cellules ou des tissus de ces plantes.
La présente invention a pour objet une plante résistante aux potyvirus, caractérisée en ce qu'elle porte dans son génome un ou plusieurs fragments d'ADN exprimant des transcripts correspondant à une protéine ou à une partie d'une protéine d'un virus donneur , à l'exception d'une protéine de capside et de la protéase Nia du TVMV entière , ladite plante étant susceptible d'être obtenue par introduction à l'aide de techniques connues de l'homme du métier, telles que 1 'électroporation, de vecteurs issus d'une banque d'ADN du virus donneur , et sélection selon des critères de résistance aux potyvirus .
On entend par virus donneur, un virus dont le génome va être à l'origine des fragments d'ADN à insérer dans le génome de la plante.
Selon un premier mode de mise en oeuvre de l'invention, ladite plante est caractérisée en ce qu'elle porte un fragment d'ADN exprimant des transcripts correspondant à une protéine ou partie de protéine intervenant dans la formation du complexe replicatif d'un potyvirus. Un tel fragment d'ADN peut contenir une partie de la séquence codant pour la protéine P3, en particulier une partie de la séquence comprise entre les nucléotides 2853 et 3492 de l'ADN complémentaire (ADNc) du potyvirus PVY .
Un tel fragment d'ADN peut aussi contenir une partie de la séquence codant pour la partie centrale de la protéase Nia, en particulier une partie de la séquence comprise entre les nucléotides 5999 et 6660 de la séquence de l'ADN complémentaire du potyvirus PVY . Un troisième type de fragment d'ADN peut contenir une partie de la séquence codant pour l'extrémité C-terminale de la protéase Nia et l'extrémité N-terminale de la polymérase Nlb, auquel cas le fragment d'ADN est préférentiellement compris entre les nucléotides 6652 et 7080 de la séquence de l'ADN complémentaire du potyvirus PVY.
Les séquences d'ADN complémentaire correspondant à la séquence du potyvirus Y ainsi que les acides aminés composant la polyprotéine correspondante ont été décrits dans la demande W0-89 12 100 précitée. Il est donc fait référence à ce document en ce qui concerne la numérotation des nucléotides et acides aminés de cette polyprotéine.
Néanmoins, cette demande ne mentionne pas les séquences particulières objets de la présente invention.
Selon un second mode de mise en oeuvre , ladite plante peut porter un fragment d'ADN exprimant des transcripts correspondant à une protéine intervenant dans le transport d'un potyvirus d'une cellule à une autre . Dans ce cas, le fragment d'ADN peut coder pour une partie de la protéine PI, et en particulier être compris entre les nucléotides 428 et 1044 de la séquence de l'ADN complémentaire du potyvirus PVY. Selon un troisième mode de mise en oeuvre de l'invention, ladite plante peut aussi être définie en ce qu'elle porte un fragment d'ADN exprimant des transcripts correspondant à une protéine ou une partie de protéine présentant une similarité avec les sites de clivage des protéines virales d'un potyvirus .
Préférentiellement , le potyvirus à l'encontre duquel les plantes sont résistantes est le virus Y de la pomme de terre .
Ladite plante peut être toute plante sensible à des virus végétaux et notamment aux potyvirus .
La présente invention peut d'autre part s'appliquer à la résistance de plantes à d'autres virus végétaux tels que les népovirus et les comovirus. Les fragments d'ADN portés par les plantes sont alors préférentiellement des fragments exprimant des transcripts correspondant à des protéines ou parties de protéine ayant des similarités avec la partie centrale de la protéase Nia ou la partie de la polyprotéine correspondant à l'extrémité C-terminale de la protéase Nia et l'extrémité N-terminale de la polymérase Nlb.
Cette plante dans le cas du PVY appartient avantageusement à la famille des Solanacées incluant notamment le tabac , la tomate , le poivron et la pomme de terre .
La présente invention est en outre relative à un fragment d'ADN tel que défini ci-dessus et procurant une protection aux plantes à 1 ' encontre de virus végétaux , et en particulier des potyvirus . La présente invention a de plus pour objet des ARN susceptibles d'être transcrits à partir d'un de ces fragments d'ADN .
Un autre objet de la présente invention est un fragment de protéine ou une protéine telle que définie ci-dessus et procurant aux plantes une résistance aux potyvirus .
De manière plus générale , la présente invention a en outre pour objet un procédé d'obtention de plantes résistantes à un virus végétal dans lequel: - on introduit dans des cellules ou des fragments de tissu desdites plantes des vecteurs issus d'une banque d'ADN complémentaire d'un virus donneur , - on régénère des plantes à partir desdites cellules ou desdits fragments de tissu , et - on sélectionne les plantes présentant une résistance à l'encontre du virus végétal.
Avantageusement , un tel procédé peut être appliqué à la sélection de plantes résistantes à l'encontre d'un potyvirus , d'un népovirus ou d'un comovirus , mais le procédé peut être appliqué à l'obtention de plantes résistantes à tout virus végétal .
Les vecteurs issus de la banque d'ADN complémentaire peuvent être introduits par électroporation ou par toute méthode connue de l'homme du métier permettant d'introduire un ADN dans une cellule végétale.
Préférentiellement, le virus donneur tel que défini ci-dessus , est un virus appartenant à la même famille que celui pour lequel on cherche à obtenir des plantes résistantes . Ainsi, on utilisera préférentiellement une banque d'ADN d'un potyvirus pour obtenir des plantes résistantes à un potyvirus.
La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent . La figure 1 représente de manière schématique la structure connue de la polyprotéine du virus Y de la pomme de terre(1A) et les peptides traduits à partir de ce virus (1B). Les flèches courbes indiquent les clivages protéolytiques .
La figure 2 représente le schéma général d'obtention de plantes résistantes aux virus à partir d'ADN complémentaire de virus PVY.
La figure 3 représente de manière plus précise le procédé de clonage des fragments d'ADN complémentaires viraux ayant abouti à la fabrication d'une banque d'ADN complémentaire .
Les figures 4 à 7 illustrent les résistances respectivement des descendants des clones FCD3E1, FCD3B6, FCD4A2 et FCD3I1.
Le pourcentage de plantes infectées est exprimé en ordonnée tandis que le nombre de jours suivant l'inoculation du virus à la plante est indiqué en abscisse . Les figures 8 et 9 illustrent respectivement les résistances des plantes de première et seconde générations homozygotes pour le gène introduit issues de croisements à partir du clone T3A5.
Les figures 10 à 13 représentent la séquence nucléotidique de l'ADN exprimé dans les clones T3A5,
FCD3I1 , FCD4A2 et FCD3B6 et leurs séquences peptidiques correspondantes dans les trois cadres de lecture possibles notés a, b, et c .
La figure 14 est une carte génétique schématique du virus PVY, sur laquelle les flèches noires indiquent les positions des fragments de virus correspondant aux fragments d'ADN intégrés dans les lignes T3A5, FCD3I1, FCD4A2 et FCD3B6. EXEMPLE 1; Construction du vecteur d'expression de la banque d'ADN complémentaires
Le procédé de construction de ce vecteur est schématisé sur les figures 2 et 3 .
Sur la figure 2 de l'ADN complémentaire (ADNc) du génome viral (ARN PVY) est synthétisé par amorce au hasard dans l'étape (1) .
L'ADNc obtenu en (2) est clone dans un site Sma I du plasmide pRT103NPT II (-) représenté schématiquement en (3) et donne naissance à une banque d'ADNc représentée schématiquement en (4). La banque d'ADNc(4) est alors introduite par électroporation dans une préparation de protoplastes de tabac (5) puis les clones sont sélectionnés et régénérés (6)' et soumis à des tests de résistance au PVY(7). La figure 3 résume de manière plus précise la fabrication de la banque.
Un fragment de 800 paires de base issu de la digestion par Hind-III du plasmide pABDl ( Paskowski et al., 1984, EMBO,3,2717-2722) a été purifié et rempli par la polymérase de Klenow. Ce fragment correspond à la partie codante du gène conférant la résistance à la kanamycine.
Il est ensuite clone au site BamHl du plasmide pRtl03 rempli par la polymérase de Klenow ( Topfer et al. , 1987, N.A.R., Vol.15, n°14).
Le plasmide ainsi obtenu , dénommé pRtl03NPTII (-) , est composé par le promoteur de l'ARN 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur ( CaMV) suivi d'un codon d'initiation de la traduction qui n'est pas en phase avec la région codante du gène conférant la résistance à la kanamycine issu du transposon bactérien Tn5, codant pour la protéine néomycine phosphotransférase II (NPTII) . Ce plasmide comprend en outre le terminateur de transcription du virus de la mosaïque du chou-fleur. De l'ADN complémentaire de l'ARN viral d'une souche N du virus Y de la pomme de terre obtenu par amorçage au hasard (Sambrook et al. , 1989, Cold
Spring Harbor Laboratory press) a été clone dans le plasmide pRtl03NPTII(-) au site Smal.
Le gène NPTII n'étant pas placé en phase avec le codon d'initiation de la traduction, l'insertion d'un fragment d'ADN complémentaire codant pour une fraction de la polyprotéine virale peut restaurer la continuité de la phase de lecture entre le codon d'initiation et la région codante du gène NPTII. Un tel événement conduit à l'assemblage d'une unité transcriptionnelle pouvant résulter en la synthèse d'une protéine de fusion comportant une extrémité N- terminale issue de la polyprotéine virale et une extrémité C-terminale correspondant à la néomycine phosphotransférase II ( NPTII).
Il est à noter que la protéine NPTII est connue pour supporter des extensions N-terminales n'affectant pas son activité . EXEMPLE 2:
Obtention de plantes transgéniques .
La banque d'ADN complémentaire obtenue à l'exemple 1 a été introduite par électroporation (Guerche et al., 1987 , Biochimie, 69:621) dans des protoplastes de Nicotiana tabacu (variété Xanthi , clone diploïde D8).
Des cals résistants à la kanamycine ont été sélectionnés , et des plantes ont été régénérées à partir de ces cals par les techniques connues de l'homme du métier.
La descendance issue d'une autofécondation des plantes ainsi obtenues , a été récoltée et semée in vitro sur un milieu sélectif . La ségrégation pour la résistance à la kanamycine est du type Mendélien monogénique dominant chez les descendants des clones obtenus .
EXEMPLE 3 :
Résistance des plantes transgéniques au virus.
Les descendants de plantes transgéniques ont été obtenus par autofécondation à partir de ces transformants primaires . Le comportement de ces plantes vis-à-vis d'une infection virale a été alors évalué.
Vingt plantes de la descendance ont été inoculées mécaniquement par une dilution au 1/2000 d'un extrait de plantes infectées par le virus Yn, ainsi que vingt plantes témoins non transgéniques .
Cinq clones dont la descendance présente un phénotype de résistance au virus PVYn ont été obtenus ( sur 53 clones testés) .
Les résultats obtenus sont présentés sur les courbes des figures 4 à 7 ( respectivement descendants des clones FCD3E1, FCD3B6, FCD4A2 et FCD3I1) et 8 (descendants du clone T3A5) .
Pour ces cinq clones les résultats obtenus ont mis en évidence de manière claire une résistance accrue à l'infection par des potyvirus par comparaison à une plante témoin.
La résistance des plantes a été confirmée par un test ELISA ( SANOFI, Phyto Diagnostic ) qui permet de doser la protéine capsidiale du virus représentant ainsi le niveau d'infection des plantes . EXEMPLE 4 :
Résistance des plantes de première génération et de seconde génération issues du clone T3A5.
Une autofécondation de la plante issue du clone T3A5 a été effectuée . La résistance des plantes obtenues, dite de première génération a été testée . Les résultats figurent sur la courbe de la figure 8, comme indiqué précédemment . Parmi ces plantes, on a recherché celles qui étaient homozygotes pour le marqueur de résistance à la kanamycine associé au fragment d'ADNc viral.
La descendance d'une autofécondation d'une plante homozygote a été étudiée. Les résultats sont représentés sur la figure 9.
Ces résultats montrent clairement que la résistance au virus Y est transmise de manière sexuée et est conservée à un niveau équivalent d'une génération à l'autre. EXEMPLE 5:
Détermination des séguences exprimées dans les plantes transgénigues .
Des ADN complémentaires correspondant aux transcripts des gènes chimériques exprimant un morceau de protéine virale, des plantes résistantes , ont été obtenus par la technique de retrotranscription PCR (Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) .
Les deux oligonucléotides synthétisés qui ont permis d'amplifier les ADN complémentaires ont les séquences suivantes:
** l'amorce 1 couvre la séquence du vecteur d'expression pRtl03NPTII (-) allant du nucleotide + 1 de la transcription jusqu'au codon ATG (Odell et al, 1985 Nature 313, 810)
5 'ACCTCGAGTGGCCACCATG 3 '
** l'amorce 2 couvre la séquence complémentaire du gène NPTII de pABDl allant du nucleotide 1489 au nucleotide 1508: 5 'GGCCGGAGAACCTGCGTG 3 ' Un seul produit d'amplification est obtenu pour chaque plante étudiée .
Les fragments d'ADN amplifiés ont été purifiés et séquences ( Applied Biosystem, Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit) à l'aide de ces oligonucléotides afin de déterminer la partie du génome viral qui est exprimé dans ces plantes .
La séquence exprimée par le clone T3A5 est la suivante: de la base 428 jusqu'à la base 1044 du génome viral. Elle est représentée sur la figure 10 avec les séquences peptidiques correspondantes.
Ce gène code pour la partie C terminale de la première protéine (PI) de la polyprotéine virale.
Les plantes descendantes du clone T3A5 sont donc résistantes au virus Y et possèdent un fragment du gène codant pour la protéine PI intégrée dans leur génome.
Les séquences exprimées par les clones FCD3I1, FCD4A2 et FCD3B6 s'étendent respectivement de 2853 à 3492, de 5999 à 6660 et de 6552 à 7080. ( figures 11, 12 et 13) .
La séquence exprimée par le clone FCD3I1 peut coder pour une partie de la protéine P3 impliquée dans la réplication. La séquence exprimée par le clone FCD4A2 peut coder pour une partie de la protéine Nia comprenant le site de clivage proteolytique entre la partie VPg et la partie protéase de cette protéine ( Dougherty et Parks (1991) - Virology .182 449-456) . La séquence exprimée par le clone FCDB6 peut coder pour une protéine comprenant l'extrémité C- terminale de la protéase Nia et l'extrémité N- terminale de la polymérase Nlb et comprend le site de clivage proteolytique séparant ces deux protéines. Un schéma représentant les différentes séquences exprimées dans les clones T3A5, FCD3I1, FCD4A2 et FCD3B6 est donné figure 14.

Claims

REVENDICATIONS
1. Plante résistante aux potyvirus , caractérisée en ce qu'elle porte dans son génome un ou plusieurs fragments d'ADN exprimant des transcripts correspondant à une protéine ou à une partie d'une protéine d'un virus donneur , à l'exception d'une, protéine de capside et de la protéase Nia du TVMV entière, ladite plante étant susceptible d'être obtenue par introduction de vecteurs issus d'une banque d'ADN du virus donneur , et sélection selon des critères de résistance au potyvirus.
2. Plante selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle porte un fragment d'ΑDN exprimant des transcripts correspondant à une protéine ou une partie de protéine intervenant dans la formation du complexe replicatif d'un potyvirus .
3. Plante selon la revendication 2, caractérisée en ce que le fragment d'ADN contient une partie de la séquence codant pour la protéine P3.
4. Plante selon la revendication 3 , caractérisée en ce que le fragment d'ADN est compris entre les nucléotides 2853 et 3492 de l'ADN complémentaire du potyvirus Y .
5. Plante selon la revendication 2, caractérisée en ce que le fragment d'ADN contient une partie de la séquence codant pour la partie centrale de la protéase Nia
6. Plante selon la revendication 5 , caractérisée en ce que le fragment d'ADN est compris entre les nucléotides 5999 et 6660 de la séquence de l'ADN complémentaire du potyvirus Y.
7. Plante selon la revendication 2, caractérisée en ce que le fragment d'ADN contient une partie de la séquence codant pour l'extrémité C- terminale de la protéase Nia et l'extrémité N- terminale de la polymérase Nlb.
8. Plante selon la revendication 7, caractérisée en ce que le fragment d'ADN est compris entre les nucléotides 6652 et 7080 de la séquence de l'ADN complémentaire du potyvirus Y.
9. Plante selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle porte un fragment d'ADN exprimant des transcripts correspondant à une protéine ou un fragment d'une protéine intervenant dans le transport d'un potyvirus entre les cellules.
10. Plante selon la revendication 9 , caractérisée en ce que le fragment d'ADN code au moins pour une partie de la protéine PI.
11. Plante selon la revendication 10 , caractérisée en ce que le fragment d'ADN est compris entre les nucléotides 428 et 1044 de la séquence de l'ADN complémentaire du potyvirus Y.
12. Plante selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle porte un fragment d'ADN exprimant des transcripts correspondant à une protéine ou une partie de protéine présentant une similarité avec les sites de clivage des protéines virales d'un potyvirus .
13. Plante selon l'une des revendications 1 à 12 , caractérisée en ce qu'elle est résistante au virus de la pomme de terre .
14. Plante selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'elle appartient à la famille des Solanacées .
15. ADN ou fragment d'ADN tel que défini dans l'une des revendications 1 à 12 et procurant aux plantes une résistance à un potyvirus .
16. ARN susceptible d'être transcrit à partir d'un fragment d'ADN selon la revendication 15.
17. Fragment de protéine ou protéine tel que défini dans l'une des revendications 1 à 12 et procurant aux plantes une résistance à un potyvirus .
18. Procédé d'obtention de plantes selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 dans lequel : - on introduit dans des cellules ou des fragments de tissu desdites plantes des vecteurs issus d'une banque d'ADN complémentaire d'un virus donneur , - on régénère des plantes à partir desdites cellules ou desdits fragments de tissu et - on sélectionne les plantes présentant une résistance à l'encontre des potyvirus .
19. Procédé selon la revendication 18 , caractérisé en ce que les vecteurs issus de la banque d'ADN complémentaire sont introduits par électroporation.
PCT/FR1994/000038 1993-01-14 1994-01-12 Plantes transgeniques resistantes aux virus vegeteaux et procede d'obtention Ceased WO1994016087A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9300307A FR2700235B1 (fr) 1993-01-14 1993-01-14 Plantes transgéniques résistantes aux virus végétaux et procédé d'obtention.
FR93/00307 1993-01-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1994016087A1 true WO1994016087A1 (fr) 1994-07-21

Family

ID=9443029

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1994/000038 Ceased WO1994016087A1 (fr) 1993-01-14 1994-01-12 Plantes transgeniques resistantes aux virus vegeteaux et procede d'obtention

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2700235B1 (fr)
WO (1) WO1994016087A1 (fr)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995004825A1 (fr) * 1993-08-06 1995-02-16 Unilever Plc Ameliorations concernant la resistance de plantes a des maladies
WO1996021024A1 (fr) * 1994-12-30 1996-07-11 Asgrow Seed Company Gene de replicase du virus de la decoloration foliaire de la papaye
US5968828A (en) * 1994-05-19 1999-10-19 Helsinki University Licensing Ltd. Oy Virus-resistant transgenic plants comprising cells transformed with a polynucleotide encoding a potyviridae P1 protein or P1 protein fragment

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989012100A1 (fr) * 1988-05-30 1989-12-14 Institut National De La Recherche Agronomique (Inr Sequence nucleotidique complete de l'adn complementaire de l'arn genomique de potyvirus, genes codant pour la proteine de capside de potyvirus et applications de ces genes a la creation de plantes transgeniques resistantes aux potyvirus
WO1991013542A1 (fr) * 1990-03-12 1991-09-19 Cornell Research Foundation, Inc. Transformation de plantes a l'aide de sequences de genes de virus de plantes non structurelles
US5162601A (en) * 1989-11-22 1992-11-10 The Upjohn Company Plant potyvirus expression vector with a gene for protease
EP0578627A1 (fr) * 1992-07-09 1994-01-12 Monsanto Company Plantes résistantes aux virus

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989012100A1 (fr) * 1988-05-30 1989-12-14 Institut National De La Recherche Agronomique (Inr Sequence nucleotidique complete de l'adn complementaire de l'arn genomique de potyvirus, genes codant pour la proteine de capside de potyvirus et applications de ces genes a la creation de plantes transgeniques resistantes aux potyvirus
US5162601A (en) * 1989-11-22 1992-11-10 The Upjohn Company Plant potyvirus expression vector with a gene for protease
WO1991013542A1 (fr) * 1990-03-12 1991-09-19 Cornell Research Foundation, Inc. Transformation de plantes a l'aide de sequences de genes de virus de plantes non structurelles
EP0578627A1 (fr) * 1992-07-09 1994-01-12 Monsanto Company Plantes résistantes aux virus

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDERSON, J.M., ET AL.: "A defective replicase gene induces resistance to cucumber mosaic virus in transgenic tobacco plants", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 89, September 1992 (1992-09-01), WASHINGTON US, pages 8759 - 8763 *
AUDY, P., ET AL.: "Transformation of potato and tobacco with modified replicase genes of potato viruses Y and leafroll", CAN. J. PLANT PATHOL., vol. 14, no. 3, 1992, pages 240 *
BERGER, P.H., ET AL.: "Expression in transgenic plants of a viral gene product that mediates insect transmission of potyviruses", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 86, no. 21, November 1989 (1989-11-01), WASHINGTON US, pages 8402 - 8406 *
DURAND-TARDIF, M., ET AL.: "A shotgun strategy for expression of fragments of viral genome in transgenic plants: perspectives for studying viral functions responsible for pathogenesis and for obtaining novel tolerance genes", J. CELL. BIOCHEM. SUPPL., vol. 13D, 1989, pages 334 *
GRAYBOSCH, R., ET AL.: "Expression of a potyvirus non-structural protein in transgenic tobacco", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 160, no. 2, 28 April 1989 (1989-04-28), DULUTH, MINNESOTA US, pages 425 - 432 *
MAITI, I.B., ET AL.: "Expression of the tobacco vein mottling virus nuclear inclusion protein (NIa) gene in tobacco", J. CELL. BIOCHEM. SUPPL., SYMPOSIUM AVRIL 10-16, 1992., vol. 16F, 1992, pages 217 *
VARDI, E., ET AL.: "Plants transformed with a cistron of potato virus Y protease (NIa) are resistant to virus infection", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 90, August 1993 (1993-08-01), WASHINGTON US, pages 7513 - 7517 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995004825A1 (fr) * 1993-08-06 1995-02-16 Unilever Plc Ameliorations concernant la resistance de plantes a des maladies
US5968828A (en) * 1994-05-19 1999-10-19 Helsinki University Licensing Ltd. Oy Virus-resistant transgenic plants comprising cells transformed with a polynucleotide encoding a potyviridae P1 protein or P1 protein fragment
WO1996021024A1 (fr) * 1994-12-30 1996-07-11 Asgrow Seed Company Gene de replicase du virus de la decoloration foliaire de la papaye

Also Published As

Publication number Publication date
FR2700235B1 (fr) 1995-03-31
FR2700235A1 (fr) 1994-07-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3281512B2 (ja) ウイルス耐性の植物の生産方法
JP2759135B2 (ja) 除草剤抵抗性植物のアセトラクテートシンターゼを暗号化する核酸断片
US5773700A (en) Constructs containing impatiens necrotic spot tospovirus RNA and methods of use thereof
Haan et al. Characterization of RNA–mediated resistance to tomato spotted wilt virus in transgenic tobacco plants
KR100228326B1 (ko) 토스포바이러스 rna를 암호화 하는 dna 서열을 포함하는 재조합 dna 구조체, 이 구조체로 형질전환된 식물 및 그 식물의 제조방법
CN109705202B (zh) 一种培育抗灰斑病植物的方法
EP0517833B2 (fr) Transformation genetique et regeneration de la betterave sucriere
PT99161A (pt) Processo para a preparacao de genes, para a transformacao de celulas por meio desses genes e para a preparacao de plantas resistentes a virus a partir dessas celulas
EP0412912B1 (fr) Plantes transgéniques appartenant à l'espèce Cucumis melo
RU2136757C1 (ru) Конструкция днк, конструкция рекомбинантной днк и способ получения растений
Hillman et al. Satellite and defective RNAs of Cryphonectria hypovirus 3-grand haven 2, a virus species in the family Hypoviridae with a single open reading frame
CA2512644A1 (fr) Gene de resistance a aphis gossypii
HU219059B (hu) Vírus/herbicid-rezisztencia gének, előállításuk és felhasználásuk
FR2766207A1 (fr) Gene chimere codant pour la drosomycine, vecteur le contenant pour la transformation des cellules vegetales et plantes transformees obtenues resistantes aux maladies
Spiegel et al. The complete nucleotide sequence of Passiflora latent virus and its phylogenetic relationship to other carlaviruses
WO1994016087A1 (fr) Plantes transgeniques resistantes aux virus vegeteaux et procede d'obtention
BOARI et al. Detection and partial characterization of an isolate of Groundnut ringspot virus in Solanum sessiliflorum
HUP0003697A2 (hu) A nepovírus-rezisztencia szőlőben
HUE035070T2 (en) P0 gene silencing constructions and applications
WO2002039808A1 (fr) Procede pour renforcer la resistance aux virus chez des plantes et produire des plantes a immunite aux virus
AU733982B2 (en) Bacterial resistance in grapevine
WO1997042315A1 (fr) Plantes transgeniques resistantes a l'infection par un virus jumeau
WO1989012100A1 (fr) Sequence nucleotidique complete de l'adn complementaire de l'arn genomique de potyvirus, genes codant pour la proteine de capside de potyvirus et applications de ces genes a la creation de plantes transgeniques resistantes aux potyvirus
US5428144A (en) Maize dwarf mosaic virus cDNA
US20040014032A1 (en) Nucleic acids encoding lettuce big-vein virus proteins and utilization thereof

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA