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WO1994004701A1 - Procede de production d'un compose de 1,4-dihydropyridine optiquement actif - Google Patents

Procede de production d'un compose de 1,4-dihydropyridine optiquement actif Download PDF

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WO1994004701A1
WO1994004701A1 PCT/JP1992/001074 JP9201074W WO9404701A1 WO 1994004701 A1 WO1994004701 A1 WO 1994004701A1 JP 9201074 W JP9201074 W JP 9201074W WO 9404701 A1 WO9404701 A1 WO 9404701A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
enzyme
dimethyl
ester
nicotinoylaminoethyl
dihydropyridine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1992/001074
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takashi Adachi
Mayuma Ikeda
Takako Hadachi
Kazunori Hanada
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Taisho Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority to AU24863/92A priority Critical patent/AU2486392A/en
Publication of WO1994004701A1 publication Critical patent/WO1994004701A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
    • C12P41/005—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of carboxylic acid groups in the enantiomers or the inverse reaction

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an intermediate for producing an optically active 1,4-dihydropyridine compound, and more particularly, to an important optically active 1,4 when producing an optically active 1,4 dihydropyridine compound which is extremely useful as a pharmaceutical.
  • the present invention relates to a method for producing a dihydropyridine intermediate.
  • the two carboxylic acid esters bonded to the 3- and 5-positions of the dihydropyridine ring of the 1,4-dihydropyridine compound are different from each other, they have an asymmetric carbon at the 4-position and there are two optical isomers I do.
  • a compound having such an asymmetric carbon is used as a drug, it is generally considered that only one isomer that is preferable as a drug is given to a living body from the viewpoint that no extra load is applied to the living body. It is becoming more and more.
  • the desired optical isomer can be obtained only with a maximum yield of 50% through complicated operations.
  • Compound A is expected to be a prophylactic and therapeutic agent for ischemic heart disease, hypertension, etc., because it has a selective coronary vasodilator effect, excellent sustained drug efficacy, and a c-GMP increasing effect Has been done. Further, it is expected that Compound A has an optical isomer in its structure, and only one of the isomers is preferable as a pharmaceutical.
  • the present inventors have diligently studied a method using an enzyme in producing optically active compound A.
  • hydrolyzing enzymes produced by microorganisms belonging to the genera Aspergillus, Benicillium, Streptomyces and Bacillus, and hydrolysis prepared from animal organs using compounds that can be easily produced as raw materials The present inventors have found that the use of an enzyme and a hydrolase prepared from a plant gives a production intermediate of compound A exhibiting a preferred optical rotation in high yield and high optical purity, and completed the present invention. .
  • the present invention relates to 2,6-dimethyl-14- (3-nitrophenyl) 1-1,4-dihydropyridine-13,5-dicarboxylic acid bis (2-nicotinylaminoethyl) ester or a salt thereof.
  • the salt is a hydrochloride, a sulfate or a nitrate.
  • the enzymes used in the present invention include enzymes produced by microorganisms belonging to Aspergillus, Benicillium, Streptomyces, and Bacillus, enzymes prepared from animal organs, and enzymes prepared from plants.
  • any object can be used as long as the object of the present invention can be achieved, and there is no particular limitation.
  • Some of these microbial enzymes are commercially available and are readily available. Specific examples of commercially available enzymes include, for example, enzymes derived from the genus Aspergillus (Aspergillus oryzae); protease A “Amano”, protease M “Amano”, enzymes derived from the genus Aspergillus (Aspergillus melleus); Mano ", Seabrose” Amano ", an enzyme derived from the genus Aspergillus (Aspergillus sp.); Cellulase A” Amano ", Acylase” Amano "1500, Piozyme A (registered trademark)” Amano ", Deamisym ( (Registered trademark) "Amano", an enzyme derived from the genus Penicillium sp .; nuclease "Amano” (above, manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), an enzyme derived from the genus Aspergillus
  • Specific examples of commercially available enzymes include, for example, pig liver esterase (manufactured by Sigma) and kidney lipase (manufactured by Tokyo Chemical Industry). Some enzymes prepared from plants are commercially available and are also readily available. Specific examples of commercially available enzymes include, for example, bean nut phospholipase (Phospholipase D) (manufactured by Lucerna Chem), and pine-atre proteases (Bromelain) (manufactured by Sigma).
  • various additives can be used in the enzyme reaction, and addition of 1,10-0-phenanthroline is particularly effective. By using this additive, the reaction rate can be improved and the amount of required enzyme can be reduced.
  • each is set according to the optimum conditions of the enzyme to be used.
  • the general reaction conditions will be described.
  • the reaction solution it is preferable to use a buffer such as a phosphate buffer or a Tris-HCl buffer in order to keep the pH of the reaction solution constant.
  • concentration of the buffer varies depending on the type of the buffer, but is preferably 2 M or less.
  • the reaction can be carried out without using a buffer.
  • the reaction conditions may be set according to the enzyme used.
  • various conditions when using protease P are such that the pH is 6.0 to 8.0, and most preferably, the pH is 7.0 to 7.5.
  • the reaction temperature is from 25 ° C to 50 ° C, most preferably from 30 ° C to 35 ° C.
  • the concentration of S substance in the reaction solution is 0.05 to 25% by weight based on the reaction solution.
  • the amount of enzyme used depends on the enzyme titer and the amount of substrate.
  • the reaction time may be set while confirming the progress of the reaction by TLC analysis or HPLC analysis.
  • organic solvents can be used as a substrate dissolution aid.
  • the organic solvent that can be added include acetone, methyl ethyl ketone, dimethyl sulfoxide, dioxane, N, dimethylformamide, and acetonitrile. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the power that can be added at a concentration of 1 to 15% to the reaction solution is most preferably 4 to 6%.
  • the organic solvent may be added either at the beginning of the reaction or during the reaction.
  • surfactants such as sodium lauryl sulfate, triton 100, and Tween 80, and emulsifying agents such as polyethylene glycol # 400, gum arabic, and lecithin can also be used.
  • the substrate is added all at once in the early stage of the reaction when performing this enzyme reaction, the substrate precipitates and aggregates, and the progress of the reaction is inhibited.
  • a method of dissolving a substrate (hydrochloride, sulfate, or nitrate) in water and adding the solution to the enzyme solution little by little continuously showed a great effect.
  • the continuous addition of the substrate and the addition of the organic solvent are performed at the same time, it is preferable to add the organic solvent in the middle of the reaction rather than adding the organic solvent at the beginning of the reaction in which the substrate concentration is low.
  • the use of the substrate solubilizing agent and the continuous addition of the substrate can greatly increase the final substrate charge concentration.
  • the reaction rate can be increased and the amount of the enzyme used can be reduced.
  • the enzyme used was protease II, various organic reagents and metal ions were added and examined.
  • 1.10-0-funanthroline showed a particularly excellent effect.
  • 1,10— ⁇ -phenanthroline can be dissolved in an organic solvent such as dimethylsulfoxide or acetone and added to the enzyme solution. It is effective to add at a concentration of O mM, and the optimal concentration is 1 mM to 4 mM.
  • the desired product can be isolated by extraction with an organic solvent such as, for example, and, if necessary, purification by column chromatography or the like.
  • reaction products were confirmed by the TLC method and the HPLC method shown below.
  • Optical purity was determined by optical rotation measurement or HPLC analysis using a chiral column. HPLC analysis was performed under the following conditions.
  • the optical yield measured by the HPLC method was 100%.
  • the pH of the reaction solution decreased with the addition of the substrate, the pH was maintained at 7.5 by adding a 0.5 N aqueous sodium hydroxide solution according to the pH status. After 48 hours, when the addition of the substrate was completed, the progress of the reaction was confirmed by HPLC, and the substrate was almost completely eliminated.
  • the reaction mixture was adjusted to pH 5.0 by adding 1N phosphoric acid, and extracted twice with 300 ml of ethyl acetate. After the ethyl acetate layer was concentrated to 200 ml, it was extracted twice with 200 ml of a 1N aqueous sodium hydroxide solution.
  • the present invention it is possible to provide an intermediate for the production of a compound A which is simple, has a high yield, and is optically active (levorotatory) with high optical purity.
  • the raw material (prochiral compound) used and the product have a 1: 1 balance relationship, and the yield of the desired optical isomer is at most 50% as in the conventional optical resolution method.
  • the biggest feature is that it has no shortcomings.
  • the method of the present invention has the following advantages: the reaction proceeds under mild conditions, so that no special reactor is required, an expensive resolving agent is not required, and the waste liquid after the reaction is easily treated. It has very advantageous advantages over the method.
  • an optically active compound A can be produced extremely easily and in good yield. That is, the compound can be reacted with 3-nitrooxypropyl-111-bromide or 3-nitrooxypropyl alcohol to obtain an optically active compound A.
  • optically active compound A obtained here is a preferred isomer (Levorotary) as a pharmaceutical U
  • Levorotatory compound A is significantly more effective than racemic and dextrorotatory compound A in tests of calcium channel binding ability, coronary blood flow increasing action, heart rate inhibitory action and hypotensive action. Therefore, the compound A having an optical activity of levorotation produced by the intermediate of the present invention is extremely useful as a drug for preventing and treating angina pectoris, hypertension and the like.

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Description

明 細 書 光学活性 1 , 4ージヒドロピリジン化合物の製造法 技術分野
本発明は光学活性 1 , 4—ジヒドロピリジン化合物の製造中間体の製造法に関 し、 さらに詳しくは医薬として極めて有用な光学活性 1 , 4ージヒドロピリジン 化合物を製造する際の重要な光学活性 1 ,4ージヒドロピリジン中間体の製造法 に関するものである。 背景技術
1 , 4ージヒドロピリジン系化合物のジヒドロピリジン環の 3位と 5位に結合 した 2つのカルボン酸エステルが互いに異なるものは、 その 4位に不斉炭素を持 つており、 2種の光学異性体が存在する。 最近、 この系統の化合物の生物学的性 質が詳細に検討された結果、 それぞれの光学異性体間に薬理活性、 体内動態、 安 全性などに差のあることが報告されてきている。 このような不斉炭素を有する化 合物を医薬品として使用する場合、 生体に対して余計な負荷を与えないという意 味から、 医薬品として好ましい一方の異性体のみを生体に与えるという考え方が —般的になりつつある。
従来、 様々な光学活性 1 ,4ージヒドロピリジン化合物の製造法が報告されて いるが、 これらは次の 2種の方法に大別される。 すなわち、 光学活性な化合物と 塩を形成させたのち分別結晶化により光学分割する方法、 および不斉炭素を持つ 化合物を結合させてジァステレオマ一に誘導しこれを分離するという方法である。 しかしながら、 分別結晶化による光学分割は、 シンコニジン、 シンコニンなどの 高価な分割剤を使用しなければならず、 加えて数回の結晶化を要するなど操作が 頻雑なため、 目的物の収率低下を招くなどの欠点を有している [特開昭 63— 1 85960号公報、 特開昭 64— 52757号公報、 特開平 1一 254661号 公報、 Ch em.Ph a rm.Bu l 1.， 第 28巻， 第 2809頁 （1980年） など] 。 また、 ジァステレオマーに誘導して分離するという方法は、 高価な光学 0
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活性化合物を原料としたり、 反応行程が長く複雑であるなどの欠点を有している
[特開昭 6 1— 4 3 1 8 7号公報、 特開平 2— 1 1 5 9 2号公報など] 。
いずれの方法を採るにしても、 頻雑な操作を経て、 しかも所望の光学異性体は 最大で 5 0 %の収率でしか得られない。
2 , 6—ジメチルー 4一 （3—二トロフエニル） 一 1 , 4—ジヒ ドロピリジン一 3 . 5—ジカルボン酸 3— （2—ニコチノィルアミノエチル） エステル 5— ( 3—二トロォキシプロピル） エステル （以下、 化合物 Aと称することがある。 ） およびその塩は、 特開平 2— 2 2 3 5 8 0号公報にそのラセミ体の製造法とカル シゥム拮抗剤としての薬理作用が開示されている。 化合物 Aは、 選択的冠血管拡 張作用があり、 かつ薬効の持続性において優れ、 さらに c一 G M P増加作用を併 せ持つことから、 虚血性心疾患や高血圧症などの予防および治療薬として期待さ れている。 また、 その構造上、 化合物 Aに光学異性体が存在し、 その一方の異性 体のみが医薬品として好ましいことは予想されることである。
本発明の課題は、 化合物 Aの医薬品として好ましい光学異性体のみを製造する ための極めて重要な中間体の製造法を提供することにある。 発明の開示
本発明者らは、 光学活性な化合物 Aの製造に際し、 酵素を用いる方法を鋭意研 究した。 その結果、 その研究過程において、 容易に製造できる化合物を原料とし、 ァスペルギルス属、 ベニシリウム属、 ストレブトマイセス属およびバチルス属に 属する微生物が産生する加水分解酵素、 動物の臓器から調製された加水分解酵素 ならびに植物から調製された加水分解酵素を用いることにより、 好ましい旋光度 を示す化合物 Aの製造中間体を高収率で、 しかも高い光学純度で与えることを見 いだし本発明を完成した。 。
すなわち、 本発明は、 2， 6—ジメチル一 4一 （3—ニトロフエニル） 一 1 , 4 ージヒ ドロピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ビス （2—ニコチノィルアミノエ チル） エステルまたはその塩に、 2 . 6—ジメチル一 4一 （3—二トロフエニル） 一 1 , 4ージヒ ドロピリジン一 3， 5 -ジカルボン酸 ビス （ 2—ニコチノィルァ ミノエチル） エステルまたはその塩の 3位および 5位に結合したカルボン酸エス テルを不斉加水分解する能力を有する酵素を作用させて不斉加水分解し、 （一） 一 2 , 6—ジメチルー 4 - ( 3—二トロフェニル） 一 1 , 4—ジヒ ドロビリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 3— ( 2—ニコチノィルアミノエチル） エステルを回収 することを特徴とする光学活性 （一） 一 2 , 6—ジメチルー 4一 （3—二トロフ ェニル） 一 1 , 4ージヒ ドロピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 3— （ 2—二コチ ノィルアミノエチル） エステルの製造法である。
本発明において塩とは、 塩酸塩、 硫酸塩または硝酸塩である。 また、 本発明で 使用される酵素とは、 ァスペルギルス厲、 ベニシリウム属、 ストレブトマイセス 属、 バチルス属に属する微生物の生産する酵素、 動物の臓器から調製された酵素 および植物から調製された酵素で、 本発明の目的を達し得るものであればどのよ うなものでもよく、 特に限定されるものではない。
これらの微生物起源の酵素の中には市販のものがあり、 容易に入手することが できる。 市販の酵素の具体例としては、 たとえば、 ァスペルギルス属 （Aspergil lus oryzae) 由来の酵素；ブロテアーゼ A 「ァマノ」 、 プロテア一ゼ M 「ァマノ」 , ァスペルギルス属 （Aspergillus melleus) 由来の酵素；プロテアーゼ P 「ァ マノ」 、 セアブローゼ 「ァマノ」 ， ァスペルギルス属 （Aspergillus sp . ) 由来 の酵素；セルラ一ゼ A 「ァマノ」 、 アシラーゼ 「ァマノ」 1 5 0 0 0、 ピオザィ ム A (登録商標） 「ァマノ」 、 デアミザィム （登録商標） 「ァマノ」 ， ベニシリ ゥム属 （Penicillium sp. ) 由来の酵素； ヌクレアーゼ 「ァマノ」 （以上、 天野 製薬社製） ， ァスペルギルス属 （Aspergillus sojae) 由来の酵素；プロテア一 ゼタイプ XI X； (シグマ社製） ， ストレプトマイセス属 （Streptomyces griseus) 由来の酵素；ァクチナ一ゼ E (科研製薬社製） 、 プロテア一ゼ タイプ X I V (シ グマ社製） ， ストレブトマイセス厲 (Streptomyces caespitosus) 由来の酵素； プロテア一ゼ タイプ IV (シグマ社製） ， バチルス属 （Bacillus licheniformis) 由来の酵素；サブチリシン A (ノボ社製） 、 プロティナーゼ （フル力社製） 、 プ 口テアーゼ タイプ VI I I (シグマ社製） ， バチルス属 （Bacillus subtilis) 由 来の酵素；アルカリプロテアーゼ （ナガセ生化学工業社製） 、 プロティナ一ゼ (フル力社製） などが挙げられる。
また、 動物の臓器から調製された酵素の中には市販のものがあり、 これも容易 t
一 4 一
に入手することができる。 市販の酵素の具体例としては、 たとえば豚肝臓エステ ラーゼ （シグマ社製） 、 脬臓リパーゼ （東京化成工業社製） などが挙げられる。 植物から調製された酵素の中には市販のものがあり、 これも容易に入手すること ができる。 市販の酵素の具体例としては、 たとえば、 ビーナッツのホスホリパー ゼ （Phospholipase D ) (ルセルナ ·ケム社製） 、 パインアツブルのプロテア一 ゼ （Bromelain) (シグマ社製） などが挙げられる。
さらに、 東京化成工業社製のプロテアーゼが挙げられる。
また、 本酵素反応には種々の添加剤を用いることができ、 1 , 1 0— 0—フエ ナンスロリンの添加が特に有効である。 この添加剤の使用により、 反応速度を向 上させ、 また必要な酵素量を低減させることができる。
次に、 本発明の酵素反応を説明するが、 基本的には用いる酵素の至適条件にあ わせてそれぞれ設定するものであり、 ここでは一般的な反応条件について説明す 本発明の製造法は、 上記微生物を培養した培養液、 培養液から分離した菌体、 酵素を含有する培養濾液、 または各種酵素分離法によって菌体もしくは培養濾液 から分離した粗製酵素、 さらに精製した精製酵素と、 2 , 6—ジメチルー 4— ( 3 一二トロフエ、ニル） 一 1 , 4—ジヒ ドロピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ビス ( 2—ニコチノィルアミノエチル） エステルまたはその塩を水溶液中で、 攪拌ま たは振とうすることにより行われる。
反応液としては、 リン酸緩衝液、 トリスー塩酸緩衝液などの緩衝液の使用が、 反応液の p Hを一定に保つ上で好ましい。 緩衝液の濃度は、 緩衝液の種類によつ ても異なるが、 2 M以下が好ましい。 また、 緩衝液を使用せずに反応を行うこ ともでき、 この際は水酸化ナトリウム、 水酸化カリウムなどの水溶液を用いて、 p Hスタツ トにより反応液の p Hをコントロールするのが好ましい。
反応条件は、 使用する酵素にあわせて設定すればよい。 たとえばプロテアーゼ Pを使用したときの各種条件は、 p Hが 6 . 0 ~ 8 . 0であり、 最も好まくは p H 7 . 0〜7 . 5である。 反応温度は 2 5 °C~ 5 0 °Cで反応させる力 最も好ましく は 3 0 °C〜3 5 °Cである。 反応液中の S質の濃度は、 反応液に対し、 0 . 0 5〜 2 5重量％である。 使用する酵素の量は、 酵素の力価および基質の量に応じて適 c
一 5一
宜決定すればよい。 反応時間は、 T L C分析または H P L C分析などにより反応 の進行状況を確かめながら設定すればよい。
また、 本酵素反応では基質溶解補助剤として種々の有機溶媒を使用することが できる。 添加できる有機溶媒としては、 アセトン、 メチルェチルケトン、 ジメチ ルスルホキシド、 ジォキサン、 N , Ν—ジメチルホルムアミ ド、 ァセトニトリル などがあげられ、 これらは単独、 または 2種類以上用いてもよい。 本酵素反応に 有機溶媒を添加する場合、 酵素活性を低下させることのない範囲で添加する必要 がある。 たとえばアセトンを添加する場合、 反応液に対して 1〜 1 5 %の濃度で 添加することができる力 最も望ましくは 4〜6 %である。 有機溶媒の添加時期 としては、 反応開始時、 反応途中いずれでもよい。 また、 ラウリル硫酸ナトリウ ム、 トリ トン Χ 1 0 0、 ツイーン 8 0などの界面活性剤、 ポリエチレングリコー ル # 4 0 0、 アラビアゴム、 レシチンなどのェマルジヨン化剤などをもちいるこ ともできる。
さらに、 本酵素反応を—実施するにあたり基質を反応初期に一度に添加すると、 基質が沈澱、 凝集し、 反応の進行が阻害される。 この解決策として、 基質 （塩酸 塩、 硫酸塩または硝酸塩） を水に溶かして、 これを酵素液に少量ずつ連続的に添 加するという方法が大きな効果を示した。 この基質の連続添加と上記有機溶媒の 添加を合わせて行う場合には、 基質濃度が低い反応初期に有機溶媒を添加するよ りは、 むしろ反応途中に添加するのが望ましい。
上記、 基質溶解補助剤の使用と基質の逑続添加により、 最終的な基質の仕込濃 度を大幅に上昇させることができる。
また、 本酵素反応に種々の添加剤を使用することにより、 反応速度を上昇させ、 かつ使用酵素量を低減することができる。 使用酵素がプロテアーゼ Ρの場合、 種 々の有機試薬、 金属イオンを添加して検討したところ、 1 . 1 0— 0—フユナン スロリンが特に優れた効果を示した。 1 , 1 0— ο—フヱナンスロリンは反応開 始前、 ジメチルスルホキシド、 アセトンなどの有機溶媒に溶解して酵素液に加え ることができ、 その使用量としては、 反応液に対して l mM〜l O mMの濃度で 添加するのが有効であり、 最適な濃度は 1 m M〜 4 m Mである。
反応終了後、 反応液を 1規定リン酸の添加で p H 5 . 0に合わせ、 酢酸ェチル .
一 6一
などの有機溶媒で抽出し、 必要に応じてカラムクロマトグラフィーなどで精製し 目的物を単離することができる。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例および参考例によって説明するが、 本発明は実施例のみ によって限定されるものではない。
なお、 反応生成物の確認は、 以下に示す TL C法および HPL C法により行つ た。
TLC ; TLCブレート RP— 18 (メルク社製）
展開溶媒： Me OHZH20 = 8Z2
HPLC ;カラム ODS Cie (4.60X15 Omm)
溶離液 Me OHZH20=lZl
i 1 m 1 /m i n
温度 50 C
検出 UV 240 nm
また、 光学純度は、 旋光度の測定またはキラルカラムを使用する HPLC分析 により決定した。 HPLC分析は以下の条件で行った。
分析条件；カラム ULTRON E S-OVM
(4.60X15 Omm) (信和化工社製）
溶離液 i 一 P r 0HZ2 OmMリン酸緩衝液 （pH 3.0)
= 1/9
'Ο^,τΒ 1 m 1 Zm i n
温度 25
検出 UV 240 nm
実施例 1
プロテアーゼ P 20 gおよび 2 , 6—ジメチルー 4一 （3—二トロフエニル） 一 1.4ージヒ ドロピリジン一 3 ,5—ジカルボン酸 ビス （2—ニコチノィルァ ミノェチル） エステル . 2塩酸塩 1 gを水 1 Lに溶解し、 この溶液を 1規定水酸 化ナトリウム溶液の添加で pH 7.5に調製し、 30。Cにて撹拌した。 pHス夕 ットにて pHを 7.5に保ちながら 24時間撹拌した後、 1規定燐酸を添加して pHを 5.0に調製し、 酢酸ェチル 1 Lで 2回抽出した。 有機層を無水硫酸マグ ネシゥムで乾燥した後、 濾過、 濃縮して得られた残渣を逆相クロマトグラフィー [カラム： LiChroprep RP— 18 (40-63 ^m) (メルク社製） 、 溶出液 ： Me OH/H20 = 6/4] で精製し、 （一） 一 2, 6—ジメチルー 4一 （3— ニトロフェニル） 一 1 , 4ージヒドロピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 3— （ 2 一ニコチノィルアミノエチル） エステル 574mg (収率： 85%) を淡黄色泡 状物質として得た。
m.p. 116〜： L 19。C
[a] D30 — 77.9° (c = l.l 3, MeOH)
HPL C法により測定した光学収率は 100 %であつた。
NMR (DMSO— d6， 20 ΟΜζ) δ (ppm) ；
2.28 (6H, s) , 3.51 (2H, q， J =6H z) ,
4.13 (2H， t, J=6Hz) , 4.99 (1 H, s) ，
7.42 (1 H， t , J = 8H z) ,
7.50 (1 H， d d, J =5H z， 8H z) ,
7.60 (1 H， d， J = 8H z) ,
7.93 (1 H, d, J =8H z) , 7.98 (1 H, s) ,
8.13 (1 H, d, J = 8 H z) ,
8.71 (1H, d, J =5H z) , 8.57〜8.78 (1H， m) , 8.94 (1H, s) , 8.96 (1H， s) ，
11.83 (1 H, b r s)
実施例 2〜14
表 1に示す酵素 20m gを 2m 1の燐酸緩衝液 （20mM， pH7.5) に溶 解し、 20 1の水に溶解した 2, 6—ジメチルー 4一 （3—二トロフエニル） 一 1 ,4ージヒ ドロピリジン一 3 ,5—ジカルボン酸 ビス （2—ニコチノィルァ ミノェチル） エステル， 2塩酸塩 lmgを加えた。 この反応液を 30°Cにて 24 時間振とうし、 得られた反応混合物を 1規定燐酸で p Hを 5.0に調製した後、 酢酸ェチル 2m 1で抽出した。 有機層を濃縮して得られた残渣を HP L C分析し、 収率を算出した。 さらに目的物のモノ力ルポン酸に相当する部分を H P L Cで分 取し、 光学活性カラムを用いる HPLC法で光学収率を算出した。
結果を表 1に示した。
実施例 酵素 Z起源 化学収率 （％) 光学収率 （％)
2 ブロテアーゼ P 「ァマノ」 86.7 100
/Aspergillus me Ileus
3 セアブローゼ 「ァマノ」 97.6 100
/Aspergillus me Ileus
4 アシラーゼ 「ァマノ」 15000 10.2 100
/^Aspergillus sp.
5 デアミザィム 「ァマノ」 34.3 100
. Aspergillus sp.
6 ァクチナーゼ E (ブロナーゼ E) 23.1 100
ZStreptomyces griseus
7 プロテアーゼ タイプ X I V 11.7 100
ZStreptomyces griseus
8 サブチリシン A 25.7 100
//Bacillus licheniformis
9 プロティナ一ゼ 34.1 100
/"Bacillus licheniformis
0 プロテアーゼ タイプ V I I I 40.4 100
//Bacillus licheniformis
1 アルカリプロテアーゼ 36.2 100
ZBasillus subtilis
2 プロティナーゼ 12.6 100
ZBasillus subtilis
3 リパーゼ 21.8 100
/Pancreas
4 プロテアーゼ 17.3 100
実施例 15
プロテア一ゼ P 6.0 gを水 500m 1に溶解し、 この溶液に 10m 1のジメ 一 3 —
チルスルホキシドに溶解した 1 ,10— 0—フエナンスロリン 0.3 gを加えた。 この溶液を 0.5規定水酸化ナ卜リウム水溶液の添加により p H 7.5にした。 上 記酵素液を 30eCにて攪拌しながら、 これを水 5 Om 1に溶解した 2 ,6—ジメ チルー 4一 （3—二トロフエニル） 一1 ,4ージヒ ドロビリジン一 3 ,5—ジカル ボン酸 ビス （2—ニコチノィルアミノエチル） エステル ' 2塩酸塩 6.0 gを 基質が析出しない様に少しずつ連続的に加えた。 基質の添加に伴い反応液の pH が低下するが、 p Hスタツ トにより 0.5規定水酸化ナトリウム水溶液を添加し て pHを 7.5に保持した。 48時間後、 基質の添加が終了した時点で、 HPL Cにより反応の進行を確かめたところ、 ほぼ完全に基質が消失していた。 反応液 に 1規定燐酸を添加して pHを 5.0に調製し、 酢酸ェチル 300m lで 2回抽 出した。 酢酸ェチル層を 200 m 1まで濃縮した後、 1規定水酸化ナトリゥム水 溶液 200m 1で 2回抽出した。 得られた水酸化ナトリゥム溶液を一度酢酸ェチ ル 10 Om 1で洗浄した後、 再び 1規定燐酸の添加により pH5.0とし、 酢酸 ェチル 100m 1で 2回抽出した。 酢酸ェチル層を合わせて飽和食塩水で洗浄 した後、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濾過、 濃縮して、 （一） 一 2, 6—ジ メチルー 4一 （3—二トロフエニル） 一 1 ,4ージヒ ドロピリジンー3，5—ジカ ルボン酸 3— （2—ニコチノィルアミノエチル） エステル 3.74g (収率： 92%) を得た。 ·
参考例 1
(一） 一 2, 6—ジメチルー 4一 （3—ニトロフエニル） 一1 ,4ージヒ ドロピ リジン一 3 , 5—ジカルボン酸 3_ (2—ニコチノィルアミノエチル） エステ ル 25 Omgのジメチルホルムァミ ド 1 Om 1溶液に 3—二卜口ォキシプロピル 一 1一ブロミ ド 12 Omgと炭酸カリウム 9 Omgを加え、 室温で 10時間撹拌 した。 反応溶液を水にあけ、 酢酸ェチルで抽出した。 有機層を水、 炭酸水素ナト リウム水溶液で洗浄した後、 乾燥し、 溶媒を留去した。 残留物を酢酸ェチル 10 m 1に溶解したのち、 4規定塩酸酢酸ェチル溶液 0.2m 1を加え、 1時間撹拌 した。 生成した不溶物を濾過し、 減圧乾燥して目的とする （一） 一 2, 6—ジメ チルー 4一 （3—二トロフエニル） 一 1 , 4ージヒ ドロピリジン一 3 , 5—ジカル ボン酸 3— （2—ニコチノィルアミノエチル） エステル 5— (3—二トロォ キシプロピル） エステル塩酸塩 24 Om gを得た。
m.P. 126-128°C
[a] D 25 一 25.2° (c = l .12, MeOH)
参考例 2
(一） 一 2, 6—ジメチル一4一 （3—二トロフエニル） 一 1,4ージヒ ドロピ リジン一 3, 5—ジカルボン酸 3— （2—ニコチノィルアミノエチル） エステ ル 25 Omgの塩化メチレン 10m 1溶液に無水酢酸 160mgとモレキュラー シーブス 3 A25 Omgを加え、 1時間撹拌した。 不溶物を濾過したのち、 濾液 に 3—二トロォキシプロビルアルコール 10 Omgと塩化ァセチル 1滴を加えて、 3時間撹拌した。 反応溶液を水にあけ、 塩化メチレンで抽出し、 有機層を炭酸水 素ナトリウム水溶液で洗浄したのち、 乾燥した。 溶媒を留去したのち、 上記参考 例 1と同様の方法により処理して、 目的とする （一） 一2, 6—ジメチルー 4— ( 3—二トロフエニル） 一 1.4—ジヒドロピリジン一 3 , 5—ジカルボン酸 3 一 （2—ニコチノィルアミノエチル） エステル 5— （3—ニトロォキシブロビ ル） エステル塩酸塩 23 Omgを得た。 産業上の利用可能性
本発明により、 簡便で高収率、 しかも高い光学純度で光学活性 （左旋性） な化 合物 Aの製造中間体を供給することができる。 特に、 本発明方法では使用する原 料 （プロキラルな化合物） と生成物が 1 ： 1の収支関係にあり、 従来の光学分割 法のように所望の光学異性体の収率が最大で 50 %という欠点を有しないことが 最大の特長である。 さらに、 本発明方法は、 穏和な条件で反応が進行することか ら特別な反応装置を要しないこと、 高価な分割剤を必要としないこと、 反応後の 廃液の処理が容易なことなど、 従来法に較べて極めて有利な利点を有する。
この光学活性な製造中間体を用いることにより、 極めて容易かつ収率よく光学 活性な化合物 Aを製造することができる。 すなわち、 3—ニトロォキシプロピル 一 1一ブロミ ドまたは 3—二トロォキシプロピルアルコールと反応させて、 光学 活性な化合物 Aに導くことができる。
ここで得られる光学活性な化合物 Aは、 医薬品として好ましい異性体 （左旋性） U
である。 左旋性の化合物 Aはラセミ体および右旋性の化合物 Aに比べ、 カルシゥ ムチャンネル結合能、 冠血流量増加作用、 心拍数抑制作用および降圧作用の試験 などにおいて格段にその作用が優れている。 従って、 本発明の中間体により製造 される左旋性の光学活性を有する化合物 Aは、 狭心症、 高血圧等の予防および治 療薬として極めて有用である。

Claims

丄 請 求 の 範 囲
1. 2,6—ジメチルー 4— (3—二トロフエニル） 一 1 ,4—ジヒ ドロピリ ジン一 3 , 5—ジカルボン酸 ビス （2—ニコチノィルアミノエチル） エステル またはその塩に、 2, 6—ジメチルー 4— (3—二トロフエニル） 一 1 ,4ージヒ ドロピリジン一 3 ,5—ジカルボン酸 ビス （2—ニコチノィルアミノエチル） エステルまたはその塩の 3位および 5位に結合したカルボン酸エステルを不斉加 水分解する能力を有する酵素を作用させて不斉加水分解し、 （一） 一 2, 6—ジ メチルー 4- (3—二トロフエニル） 一 1，4ージヒ ドロビリジンー3 ,5—ジカ ルボン酸 3— （2—ニコチノィルアミノエチル） エステルを回収することを特 徴とする光学活性 （一） 一 2, 6—ジメチルー 4— (3—二トロフエニル） 一 1, 4ージヒ ドロビリジン一 3，5—ジカルボン酸 3— （2—ニコチノィルァミノ ェチル） エステルの製造法。
2. 2.6—ジメチルー 4一 （3—二トロフエニル） 一 1 ,4ージヒ ドロピリ ジン一 3 ,5—ジカルボン酸 ビス （2—ニコチノィルアミノエチル） エステル の塩が塩酸塩、 硫酸塩または硝酸塩であることを特徴とする請求の範囲第 1項記 載の製造法。
3. 酵素がァスペルギルス属、 ぺニシリウム属、 ストレブトマイセス厲およ びバチルス属からなる群から選ばれる微生物から得られる酵素である請求の範囲 第 1項記載の製造法。
4. 酵素がァスペルギルス オリザェ、 ァスペルギルス メレウス、 ァスぺ ルギルス ソジヤエ、 ストレブトマイセス グリセウス、 ストレブトマイセス カスビトサス、 バチルス リケニホルミスまたはバチルス サブチリスから得ら れる酵素である請求の範囲第 1項記載の製造法。
5. 酵素が動物の臓器から調製された酵素である請求の範囲第 1項記載の製 造法。
6. 酵素が植物から調製された酵素である請求の範囲第 1項記載の製造法。
7. 1 ,10— o—フエナンスロリンを添加することを特徴とする請求の範 囲第 1項記載の製造法。
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