WO1994000591A1 - Monoclonal antibody, production process, antibody-producing cell, and diagnostic method - Google Patents

Description

明 細 書

モノ ク ロ ーナル抗体、 製法、 抗体産生細胞、 及び診断法 技 術 分 野

本発明は、 src フ ァ ミ リ一遺伝子産物の C末端に存在し リ ン酸化 酵素の活性を制御する機能を有する部位を特異的に認識するモノ ク 口ーナル抗体に関する。

背 景 技 術

src 遺伝子は、 はじめラ ウス肉腫ウ ィ ルス （Rous sarcoma virus ) のがん遺伝子として知られた（v-src) 。 高等生物の細胞内でこれ に対応する発ガン遺伝子前駆体を c- src 遺伝子と言った。 src 遺伝 子は、 ヒ ト染色体座 20ql3.3に存在する。 src 遺伝子には src フ ァ ミ リ 一と称する類似体が存在する。 例えば、 yes 遺伝子はヒ ト染色 体座 18q21.3 に存在し、 fgr 遺伝子は 1P36.1に、 fyn 遺伝子は 6q21 に存在して、 それぞれ発現の特徴を有する。

src フア ミ リ ーに属するチロ シ ン リ ン酸化酵素（tyrosine kinase ) は、 現在その存在が 10種類ほど知られており、 その多く は C末端 (C-terminal domain) に リ ン酸化により酵素活性が低下するチロ シ ン残基を有している。 遺伝子工学の手法によりこのチロシ ンを他の 了 ミ ノ酸に置換した c-src は、 発癌能を獲得することが判っている , src 遺伝子の研究は緒についたばかりで、 最近知られたこのもの の了ミ ノ酸配列の研究及び欠損症の研究から、 医薬品への応用及び 診断薬への応用の可能性が期待されている。

c-src の了ミ ノ酸配列はすでに知られている。 近年の研究により、 SH2( src homologous domain 2)を持つ蛋白 質が、 この領域を用いてリ ン酸化チロ シ ン （phosphotyrosine) と結 合することが明らかになった。 SH2は、 src フ ァ ミ リ ーはもちろん、 フ ォ ス フ ァチジルイ ノ シ トール一 3— リ ン酸化酵素 （PI 3- kinase) 、 フ ォ ス フ ォ ライペース C-r (PLC- r ) 、 GTPase 了タティ べ一ティ ング プロテイ ン（GAP) 等の多様な蛋白質の配列の中に発見されて おり、 src フ ァ ミ リ 一の C末端領域との相互作用が情報伝達のク 口 ス トーク （cross talk)を担う直接的な経路であることが示唆されて いる

このような機構においては、 細胞外からのシグナルは リ セプター を介して細胞膜の内側にぶら下がった状態で存在する src フ ァ ミ リ 一に伝えられ、 その情報が上記 SH2を持つ蛋白質によってィ ノ シ ト ール（IP)、 ジグリ セライ ド（DG)、 GTPase 系の情報伝達へと伝播さ れて、 多様な応答を引き起こす。

このため、 src ファ ミ リ一以降の情報伝達の解析には特異的に認 識するモノ ク ロ ーナル抗体が望ま しい。 組織、 発生段階による (spatio-temporal) リ ン酸化、 結合蛋白質の変化を追跡することが できる力、らである。

別の研究によれば、 crkと呼ばれる発癌遺伝子はチロシン リ ン酸 化酵素活性を持たずに SH2領域のみを持っている。 crkは、 SH2領 域を用いてチ π シ ン リ ン酸化酵素活性を持つ src フ ア ミ リ ーの産物 と結合することにより、 細胞の癌化を引き起こすと考えられている (Mayer et al. Nature, 332, 272 - 275 (1988) )。

csk という src フ ァ ミ リ ーの C末端のチロ シ ン残基を特異的に リ ン酸化する酵素も発見されている（Noda et al. ature, 351, 69- 71(1991)) 。

src フ ァ ミ リ一遺伝子産物のなかでは、 c- src が大腸癌、 神経芽 腫、 網膜芽腫、 小細胞肺癌、 結腸癌、 乳癌、 撗紋筋肉腫で高いこと が報告されている （S. Pahlman and U. Hammerl ing, Am. Rev.

Respir. Dis. , 142, s54-s56) 。 特に大腸癌については、 J. B.

Bolen et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. , 84, 2251-2255 (1987), C. A. Cart right et al. , J. Clin. Invest. , 83, 2025-2033 (1989), C. A. Cartwright et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. , 87, 558-562 ( 1990) などでも c-src が高いことが報告されている。 し かし、 技術上の制約から、 いずれも前癌状態であるアデノ ーマにお いて src フア ミ リ ーの活性化を高率よく検出するまでには到ってい ない。 また、 C- fgr がバ一キッ ト リ ンパ腫や骨髄単球性白血病で、 c-yes が頭頸部癌ゃ腎癌で発現の高いことが明らかになつている。

主と して免疫担当細胞で発現している c-fyn 、 c-lyn 、 c-lck 、 c-hck 、 c-blk 、 等は、 リ ンパ球特異的な情報伝達に深く関与して いることが示唆されている。 これらの中でも C- lck が T リ ンパ腫や —部の結腸癌で、 C- lyn が T細胞白血病でその発現が高いとされて いる o

癌以外の疾病では、 ト ラ ンスジヱニッ クマ ウ スを用いた研究から. c-src の欠損が骨化石症（osteopetrosis) を引き起こすことが報告 されている。 （Sariano et al. Cell. 64, 693-702 (1991) ) _D また、 c-fyn については頭蓋骨の形態形成で重要な役割を果たしている可 能性がある。 発 明 の 開 示

src フ ァ ミ リ 一の活性化を検出できる特異的な抗体は作製されて いない。 特に病理診断の主流であるホルマ リ ン固定、 パラ フ ィ ン包 埋切片の染色が可能な抗体は全くない。

1983年に J. Brugge らが、 v - src を免疫して得たモノ ク ローナル 抗体 327がヒ トの c - src にのみ交差することから、 この抗体によつ てヒ トの c-src を同定している。

この抗体の結合部位は src の SH2領域とされているが、 確かめら れているわけではない（Lipsiuli cL ill. J. v ii ul. 8, 352-360 ( 1983))。

v- src を由来と して c- src に交差する抗体 GD 11がパーソ ンズ（ Parsons)ら（ J. Virol. 5 , 272- (1984) )によって、 またショ ウジ (Shoji) らによって MGS-1 が得られている（B. B. . C. 170, 657- 664(1990))。

他の src フ ア ミ リ ーの蛋白質については一部にモノ ク ローナル抗 体の報告例はあるが、 C末端領域に対するものは全く ない。

ケンプリ ッ ジ社（CRB) が C- src の（4?1〜485)ぺプチ ドを用いたポ リ ク ロ ーナル抗体を市販しているが、 特異性、 結合能力に劣り、 こ れも SH2領域、 src フ ァ ミ リ ーの C末端とは関係がない。

上記に鑑み、 本発明者らは鋭意研究の結果、 src フ ア ミ リ ーの末 端に存在し酵素のリ ン酸化を制御する機能を有する部位を特異的に 認識するモノ ク ロ ーナル抗体を取得することに成功し、 本発明を完 成した。

本発明の要旨は、 ① src フ ァ ミ リ ーの末端に存在し リ ン酸化酵素 活性を制御する機能を有する部位を特異的に認識するモノ クローナ ル抗体そのもの、 ②そのモノ ク 口—ナル抗体を得るための配列番号 1 のペプチ ド、 ③そのモノ クローナル抗体を産生する抗体産生細胞、 ④そのモノ ク ロ ーナル抗体を病理診断法に用いるところにある。

本発明に係るモノ ク ロ ーナル抗体は、 下のようにして取得する ことができる。

抗原の作製

まず抗原となる上記 C- src の C末端のぺプチ ドを化学的に合成す る。

本発明においては、 上記 c-src の C末端のペプチ ドのうち、 例え ば、 後述する配列審号 1 のようなア ミ ノ酸配列を有するペプチ ドを 合成することができる。 配列番号 1のようなペプチ ドは新規な化合 物であり、 このペプチ ドを抗原として用い、 c-src 遺伝子のモノ ク ナル抗体を取得したのは本発^者らがはじめてである。

本発明においては、 抗原性を高めるために、 上記のようにして取 得したペプチ ドを、 適当なキ ヤ リ ア（carrier) 、 例えばキーホール リ 厶ぺ ッ ト へモシァニン (keyhole limpet hemocyanin) 等に結 合させて免疫することができる。

ペプチ ドとキヤ リ アの結合反応には、 適当な化学試薬、 例えば、 グルタ ール了ルデヒ ド、 カルボジィ ミ ド、 M B S (N-(m- マ レイ ミ ドペンゾィ ルォキ シ） スク シ ンイ ミ ド） 、 S M C C (スルホサク シ 二 ミ ジル 4- (N-マレイ ミ ドメ チル） シク ロへキサ ン- 1- カ ルボキ シ レー ト ） 等を用いることができる。

以下に、 このようにして得られたものを抗原と して用い、 本発明 に係るモノ ク π —ナル抗体を取得する方法について述べる。

免疫化細胞及び骨髄腫細胞の調製

まず免疫化細胞の調製について説明する。

これは動物の体内に抗原を投与し、 その動物の細胞を取得するこ とによって得ることができるものである。 当該動物としては、 例えば、 マウス等のこれまで常法と して実験 に供されてきた動物を使用することができる。 抗原は腹腔内等に投 与することが望ま しい。

投与は、 常法によりフロイ ン ドのコ ンプ リ ー トアジュバン ドに混 合して投与するのが適当であるが、 本発明においては投与後数週間 の間隔で数回投与を換り返すことが好ましい。 投与間隔は、 2週間 で充分である し、 投与回数は 2〜 4回が好ま しい。 その後、 当該動 物を屠殺し、 例えば、 脾臓等の臓器を摘出し、 常法に従って細胞を

次に免疫化細胞に増殖機能を付与するための骨髄腫細胞との細胞 融合について述べる。

ここに用いる骨髄腫細胞は、 例えば、 SP 2/0- Ag l 4株等を、 例えば 、 PCS (牛胎仔血清） を含む培地で培養し、 望ましく は対数増殖期に ある細胞を用いる。

細胞融合、 抗体価の測定、 及び抗体産生細胞の選別

細胞融合の方法は、 免疫化細胞と骨髄腫細胞を細胞数の比で 1 : 1

〜 10 : 1の範囲で混合し、 ポ リ エチ レングリ コ ール等の融合剤又は電 気剌激等の方法を用いることができる。

融合後の細胞は、 直ちに又は通常培地での前培養後、 ヒポキサ ン チ ン、 了 ミ ノ プテ リ ン、 チ ミ ジンを加えたいわゆる H A T培地で培 養することにより、 免疫化細胞と骨髄腫細胞の組み合わせで融合し た細胞のみを選択することができる。

本発明においては、 例えば、 酵素免疫測定法（EL I SA法） 等によつ て抗体価を確認しつつ抗体産生細胞の選別を行う ことができる。

抗体価を確認することができた細胞は、 限外希釈法、 軟寒天法等 の常法に従って、 ゥ ヱル（Wel l)プレー ト及びシャ ー レによる培養を 繰り返し、 このあいだに抗体産生能、 産生抗体の免疫化学的試験、 抗原特異性試験等を行うことによって選別することができる。 また、 マイ ク ロマ二ュ ピュレーター又はセルソータ一を用いて選別するこ ともできる。

抗体の取得

本発明に係る抗体産生細胞は、 通常の状態において継続的に本発 明に係るモノ クローナル抗体を産生することができる。 従って、 本 発明に係るモノ ク ロ ーナル抗体を利用するときは、 本発明に係る細 胞の培養液の上清液を直接そのまま本発明に係るモノ クローナル抗 体溶液と して利用することができる。

また、 本発明に係るモノ ク ロ ーナル抗体は、 例えばマ ウ ス等の通 常実験に供される動物体内 （例えば腹腔内） に、 抗体産生細胞を投 与し、 例えば腹水等の動物体液を採取することによっても生産する ことができる。

本発明に係る細胞の培養液又は腹水より本発明に係るモノ ク D — ナル抗体を精製取得するためには、 例えば、 硫安沈澱、 イ オ ン交換 クロマ トグラフィ 一等の方法によって取得することができる。 こ う して取得したモノ ク ロ ーナル抗体は、 例えば各種の緩衝液、 必要に応じて塩、 更にはアジ ド等を添加することにより、 又は凍結 乾燥等の方法により安定した物質と して保存することができる。 ィ ミ ュ ノ グロ プ リ ン各ク ラスの同定

これらの抗体のィ ミ ュノ グ nプリ ン各ク ラスの同定は、 ク ラス特 異性抗体を用いた BLISA法により行う こ とができる。

このよ う に して得られたモノ ク ロ ーナル抗体は、 以下の免疫生化 学的手法により、 各蛋白質に特異的に結合することを確認すること ができる。

本発明に係るモノ ク ロ ーナル抗体を用い、 ゥエスタ ン · プロ ッテ ィ ングの手法を適用する同定方法について説明する。

この手法は、 生物由来検体中の当該ペプチ ドの同定及び定量に応 用することができる。 即ち、 当該べプチ下又は当該ペプチ ドを含む 生物由来の検体を、 常法に従って、 SDS-ポ リ アク リ ルァ ミ ドゲル電 気泳動で分画した後、 ナイ ロ ンメ ンブラ ン又はニ ト ロセルロ ースメ ンブラ ンにプロ ッティ ングする。 メ ンブラ ン上に移行したペプチ ド とモノ ク ロ ーナル抗体とを結合させ、 ついで、 ³⁵S又は '²⁵1で標 識したプロティ ン A (protein A) と結合させる。 このとき、 過剰 のモノ ク ローナル抗体とプロティ ン Aは、 そのつど充分に洗浄によ り除去しておく。

これにより、 用いたモノ ク ローナル抗体の特異性に応じて当該べ プチ ドの位置に、 その量に応じた^{3 S}S又は ¹²⁵ Iが存在することに なり、 メ ンブラ ン上の³⁵ S又は ¹²⁵1を R Iスキ ャ ナー又はオー ト ラ ジオグラフ ィ 一で検出することでペプチ ドの同定と定量を行う こ とができる。

次に、 R I P (ラ ジオイ ミ ュ ノ プレシ ピテイ シ ヨ ン） の手法を適 用することを特徴とする当該べプチ ドの同定方法について述べる。

R I Pにおいては、 例えば、 ^{3 5} S又は^{3 2} Pォルッ フ ォ スフヱイ ト 等で標識したメチォニン等を含む培養液中で、 検体となる細胞を培 養することによって検体となる細胞に取り込ませる。 その後、 可溶 化のための緩衝液を加えた後、 可溶化物（l ysate)を取得する。 そし て、 本発明に係るモノ クローナル抗体を加えて混合することにより 抗原抗体反応を完結させる。

その後常法に従い、 プロテイ ン A—セファ ロース等を加えた後、 遠心分離と緩衝液による洗浄を繰り返して、 本発明に係るぺプチ ド £1外の混在物を取り除く。 その後、 常法に従って電気泳動を行い、 ラジオァイ ソ トープの検出を行う。 検体細胞に当該べプチ ドが存在 すれば、 用いたモノ ク ロ ーナル抗体の特異性に応じたバン ドが現れ る こと となる。

次にィ ミ ュ ノサイ トケ ミ ス ト リ ーの手法を適用することを特徴と する生物中の当該ペプチ ドの検出方法について説明する。

培養細胞の場合は、 ホルムアルデヒ ド一 リ ン酸緩衝液 （P BS)溶液 等の適切な固定液で固定し、 必要に応じて ト リ ト ン処理を行い、 試 料とすることができる。 これらの試料に、 本発明に係るモノ ク ロ一 ナル抗体を加えて抗原抗体反応を完結させた後、 リ ン酸緩衝液で充 分に洗浄する。 二次抗体としてピオチ ン結合ー抗ィ ミ ュノ グロプリ ンを反応させた後、 充分に洗浄する。 こ こに生じたペプチ ド一モノ ク ϋ ーナル抗体一ピオチ ン結合二次抗体の複合物に蛍光標識した了 ビジンを反応させ、 その蛍光を蛍光顕微鏡で観察するこ と によ り細 胞中のぺプチ ドを検出することができる。

病理組織の場合には、 ホルマ リ ンその他の適切な固定液で固定し 切片としたもの、 又は凍結は切片をホルムアルデヒ ド固定したもの 等を、 必要に応じて界面活性剤等の処理を行った標本を試料として 同様の操作によりィ ミ ュノサイ トケ ミス ト リ ーを行うことができる。 病理診断法

本発明に係るモノ クローナル抗体を用いることによって、 ヒ ト又 はその他の哺乳動物の src ファ ミ リ一遺伝子産物を感度よく同定す ることができる。 従って、 本発明に係るモノ クローナル抗体は、 ヒ ト又はその他の哺乳動物の src フア ミ リ一遺伝子由来の疾患の病理 診断に使用することができる。

src 遺伝子由来の疾患としては、 例えば、 大腸癌、 肺癌、 乳癌、 神経芽腫、 横紋筋肉腫、 網膜芽腫などの癌、 骨化石症等を挙げるこ とができる。

本発明に係るモノ ク ロ ーナル抗体を用いた病理診断法と しては、 一般的なモノ ク D —ナル抗体を用いる病理診断法をそのまま応用す ることができ、 具体的には、 例えば、 ウェスタ ン · ブロ ッテイ ング

(Western blotting) 法、 イ ミ ュ ノ プレ シ ピテーシ ヨ ン （

Immunopreci.pitation)法、 イ ミ ュ ノ サイ ト ケ ミ ス ト リ ー (

Immunocytochemistry)法等の手法を挙げることができる。 これらの 手法は、 単独で又は組み合わせて用いることができる。

より具体的には、 例えば生検又は手術により得られた大腸、 肺等 の組織をホルマ リ ン固定し、 パラフィ ン包埋した切片を本発明に係 るモノ ク ロ ーナル抗体と反応させ、 常法により染色し、 c- src フ ァ ミ リ 一の活性化を検出することによって病理診断することができる。 また、 肺癌については、 喀痰検査を行うことによって診断するこ とができる。 具体的には、 被検者より痰を採取し、 これをス ミ ア塗 布によりスライ ドガラ ス上に伸展し、 その後、 例えば - 20 :のァセ ト ン又はメ タ ノ ールに浸して固定し、 本発明に係るモノ ク ロ ーナル 抗体と反応させ、 常法により染色し、 c-src ファ ミ リ 一の活性化を 検出することによって診断することができる。 形態観察とともに活 性化 c - src の検出が認められると確定診断が容易となる。

発明を実施するための最良の形態

以下に、 本発明に闋する実施例等を掲げて本発明を更に詳しく説 明するが、 これらの実施例等は本発明の一例を示すものであって、 本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例 1 c - src の C末端に対するモノ ク ロ ーナル抗体の作製 (1) 抗原の作製

19個の了 ミ ノ酸からなる配列を有するぺプチ ドを、 常法に従って 化学合成した。 このペプチ ドのァミ ノ酸配列は、 配列番号 1 の通り である。

このべプチ ド 10mgを精製蒸留水 2 mlに溶解したものを、 5 mgZml の K L H溶液 （カルビオケム社製） と混合し、 カ ップリ ング剤とし て sulfo-SMCC (ピアス （Pierce)社製） を最終濃度 0.2M となるよう に力 Bえた。

ぺプチ ドとキヤ リ 了の conjugate は、 デイ スポーザブルのゲル 濾過カ ラ ム （バイオラ ッ ド社製） を用いて精製した。 このように して 12mgのべプチ ド一 K LH結合体を得た。

(2) 免疫化細胞の調製

10週令の BALB/C雌性マウスの腹腔内に、 （1)で得られた物質 100 M g を舍む溶液 0.1mlと、 フ ロイ ン ドのコ ンプリ ー ト アジュバン ド (DIFC0社製） D. lmlとの混合液を投与した。 その後 2週間間隔で 2 回、 上記溶液とィ ンコ ンプリ ー トアジュバン ド（DIPC0社製） との混 合溶液を腹腔内に投与した。 その後、 そのマウスを頸椎脱臼により 致死させ、 無菌的に脾臓を探取した。

セレクタ一（BBLC0社製） に上記脾臓約 1 g を乗せ、 ダルべッ コ変 法 MBM(D-MBM) 培地を供給しながら約 10 のメ ッ シュを通過させて

D-MBMに懸濁状態の脾臓細胞を得た。 これを 100G、 5分間の遠心分 離にかけて、 脾臓細胞を採取した。

0.84 %の塩化了ンモニゥム溶液に 20mMのへぺス（HBPES) 緩衝液（ PH 7.4) を加えた溶液 1 ml中に上記細胞を入れて溶血させた。 1,000 G 、 5分閒の遠心分雛にかけて細胞を取得した。 再び D-MBM培地に 懸濁させた。

(3) 骨髄腫細胞の調製

マウス骨髄腫細胞株 SP2/0株を、 20%のゥ シ胎児血清（FCS) を含 む D - MBM培地で、 10%C〇₂ · 37tイ ンキュベータ一内で培養し、 対数増殖期にある細胞を集め、 次の操作に用いた。

1, 000G. 5分間の遠心分離にかけて細胞のみを取得し、 更に D- EM 培地に懸濁して、 血球計算盤で細胞数を力ゥ ン ト した。 再び 1, 000G、 5分間の遠心分離にかけて後、 D- MBM培地に懸濁させた。

(4) 細胞の融合 (2)で得た免疫化細胞 1 0 ^β 〜 3 X 1 0⁸ 個を含む D-MBM培地と、

(3)で得た骨髄腫細胞 1 0 ^β 個を含む D-MBM培地とを混合し一様に した後、 1，000G、 5分間の遠心分離にかけた。 上清を除き沈渣を取 得し、 これに 25% ( /v) のポ リ エチ レングリ コール 1500 (PBG 1500 。 ベー リ ンガ一社製） とへぺス緩衝液 37.5m を含む溶液 1 ralを 1分 間にわたって滴下した。 その後、 D - MBM培地でゆつ く り希釈して全 体を lOralとした。

これに 20% PCSを含む D- MBM培地 10mlを加えて、 1, 000G、 5分間 の遠心分離にかけた。 得られた細胞に 20% PCSを含む D- MEMを加え て 1 0⁶ cell/mlになるようにし、 コ一二ング社製の 24穴培養プレ ー トに 1 ml/well の割合となるようにのせた。 10%C 0₂ ' 37tィ ンキュベータ一中で 24時間培養した。

その後、 HAT 溶液を添加して融合細胞以外の細¾を除き、 更に 2 週間培養を続けた。

(5) Bい SA法による抗体価の測定

フ ァ ルコ ン社製 BLISA 用プレー トの各 wellを、 （1)で得たぺプチ ド 10 ug Zmlでコ一ティ ングした。 測定対象となる抗体を含む上清 液 100 1 を wellに採り、 371:イ ンキュベータ一内で 2時間放置し- その後 PBS (リ ン酸緩衝液） で洗诤した。 これにペルォキシダ一ゼ結 合ヒッジ抗マウス全抗体を加え、 371：ィ ンキュベータ一で 1時間放 置し、 PBS で洗浄後発色剤（ABTS)を加えて 15分間発色させ、 停止液 ( 0.1Mクェン酸一 0.02 %ナ ト リ ウム了ジド） を加えて反応を停止 させた後、 タイ ターテッ ク社製マルチスキ ャ ンで wellの吸光度を測 定して、 抗体価を算出した。 (6) 抗体産生細胞の選別

BLISA法で確認された well内の細胞を、 60mm のシャーレ内の軟 寒天培地上に撒いた。 10%C 0₂ · 37tイ ンキュベーター内で 2週 間培養し、 コロニーを形成させた。

できたコ ロニーを採り、 24穴培養プレー トにのせた。 再び BLISA 法によって抗体活性を確認した。 抗体活性の確認された well内の細 胞を、 6Omm0のシャ ーレ内の軟寒天培地上に撒いた。 10%C〇 ₂ · 37でィ ンキュベータ一内で 2週間培養し、 コ ロニーを形成させた。 できたコ ロニーを採り、 24穴培養プレー トにのせた。 再び BLISA法 によって抗体活性を確認し、 有用な細胞を選別した。

このようにして選別した抗体産生細胞 （抗体蕃号 28) は、 工業技 術院生命工学工業技術研究所 （日本国茨城県つく ば巿東一丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 ) ) に国際寄託 （受託番号 ： PBRM BP-4253. 寄託日 ： 1993年 3月 30日） した。

(7) 抗体の取得

① （6)で得た抗体産生細胞は、 本発明抗体を常時産生するので、 こ の抗体産生細胞を培養した培養液の上清液は、 直接、 本発明抗体溶 液と して使用することができた。

② （6)で得た抗体産生細胞の培養液に硫酸了ンモニゥムを最終濃度 30%となるように加えた。 遠心分離し、 沈渣をとり、 これに pH 7.4 のリ ン酸緩衝液 20πιΜを加え、 同じ リ ン酸緩衝液（0.02 サナ ト リ ウム アジドを含む） を用いて透析して硫酸アンモニゥムを除いた。 透析 後の液体を凍結乾燥して、 白色粉末を得た。

③ BALB/C雄性マウス腹腔内に、 プリ スタ ン 0.5tnlを注射し、 2週 閱飼育した。 （6)で得た抗体産生細胞を 1 0⁶ 〜 3 x 1 0 ⁶ cell/ マウスとなるように注射し、 10日間飼育した。 腹腔内にたまった腹 水約 10mlを注射筒を用いて採取した。

腹氷を Tris 50mM (pH 8.2) 食塩 150mM NaN₃ 0.02%を含む水溶 液で 10倍程度に希釈した。 この溶液をモノ ク D —ナル抗体のサブク ラスが I gG のものは抗マウスイ ミ ュ ノ グロ ブ リ ン一了ガロ ース力 ラ ム （了メ リ カ ン コ 一レ ツ クス社製） でサブク ラ スが IgG₂のもの はブロティ ン A—セフ ァ ロ ース CL-4Bカ ラ ム （フ ア ルマ シ了社製） で精製した。 溶出は、 IgGJ^グ リ シン一塩酸 0.1M ( pH2.8)で、

I gG₃はイ ミ ュ ノ ビュ 了一エ リ ユ ージ ョ ンバッ フ ァ （ ピアス社製） で 行った。

(8) イ ミ ュ ノ グ αブ リ ン各ク ラスの同定

イ ミ ュ ノ グロブ リ ン各ク ラスの同定は、 ク ラス特異性抗体（IgA, IgG,, IgG_2a IgG_2b, IgG₃, IgM は、 バイオライ ド社製のものを用 いた） を加え、 37で、 2時間反応させた後、 PBS で充分に洗浄した , これにペルォキシダーゼ結合ヒ ッジ抗マウス全抗体を加え、 371ィ ンキ ュベータ一で 1時閱放置し、 PBS で洗浄後、 発色剤（ABTS)を加 えて 15分閒発色させ、 各ク ラスの判定を行った。 この結果の一部を 表 1 に示す。 表 1

試験例 1 R I P (免疫沈降法）

本発明に係るモノ ク ロ ーナル抗体は、 チ口 シ ン残基に リ ン酸化を 受ける部位であるため、 蛋白質を細胞内で標識するのに³² Ρ—オル ソフ ォ スフヱイ ト又は³⁵ S—メチォニンを用いた。

細胞をコ ンフルーェ ン ト （confluent)な状態まで培養した後、 リ ン酸又はメチォニンを舍まない培地で 2〜 3時間培養した（starvat ion) 。 この後、 再度培地を交換し³² P—オルソ フ ォ ス フ ェ イ ト （ NB 社製 NBX- 053 370MBq/ml)又は³⁵ S—メ チォニン （Amersham社 製、 SJ1015 370MBq/ral)を加えて、 更に 2〜 4時間培養した。 培養 後、 培地を取り除き、 PBS (-) で洗浄し、 RIPA緩衝液で可溶化した _c 得られた lysateの放射能を液体シ ンチ レーシ ヨ ンカ ウ ンタ ーで計測 し、 免疫沈降 1検体あたり、 3〜 5 xl05 cpm を使用する。 この lysateに本発明の抗体を加え、 4 tで 2時閒ゆったり攪拌して、 抗 原抗体反応を完成させた。

protein A -了ガロース （ザィ メ ッ ド社製） を RI PA緩衝液で 10%に 懸濁させた溶液を 200 1 加えて、 4 :で 1時間反応させた。 反応 後、 15， 000 rptnで 1分間遠心分離し上清と分離した。 沈澱した抗原 —抗体一 protein A ーセフ ァ ロ ース複合体を洗浄するために RIPA緩 衝液を 0.75ml 加え、 よく擤拌した後、 15, OOOrpmで 1分間遠心分 雜し、 再度上清と分離した。 この操作を 5回繰り返した。 これに

SDS- PAGB電気泳動用のサンプル緩衝液 30/ 1 を加え、 lOOtで 2分 聞加熱し、 蛋白質を変性させた。 電気泳動は 10%のポ リ 了ク リ ル了 ミ ドゲルで行った。 泳動終了後、 ゲル中の蛋白質を 5 %メ タ ノ ール, 7.5%酢酸を含む溶液で固定した後、 ³⁵Sラベルの場合は増感剤 （ NBN 社製、 ENLIGHTIUNG ) を用いて増感した。 ゲルを乾燥させ、 X 線フィ ルム又はイ メ ージングプレー ト （Fuji，BAS 2000 用） で感光 させ、 抗体が特異的に認識するバンドを検出した。

図 1 にこれらの抗体を用いて検出した蛋白質のバン ドを示す。

用いた細胞は、 レーン番号 1〜 3、 7〜 9が神経芽腫 NB- 1、 4 〜 6、 1 0〜 1 2が急性リ ンパ芽球性白血病細胞 SKW 3である。 モ ノ ク ローナル抗体は、 1、 4、 7、 1 0が抗体番号 28、 2、 5、 8. 1 1が抗体番号 29、 そして 3、 6、 9、 1 2が抗体番号 40を用いた, 本発明のうち、 抗体蕃号 28及び 29は、 免疫沈降法での検出感度が 特に良かった。

抗体番号 28は、 ³²Pラペルでは検出されないバン ドが、 ³⁵Sラベ ルで現れており、 リ ン酸化サイ トであるチ αシン残基の近傍を認識 していることが判った。

また、 抗体番号 29は、 ³²Ρでも^{3 s} Sでも同様のパター ンを示し、 リ ン酸化サイ ト以外を認識する抗体であることが証明された。

その他、 抗体番号 40は、 上記 2抗体とは違ったバン ドを検出した これらにより、 リ ン酸化の有無による情報伝達の差異を解析するこ とができた。 ゥ エスタ ンブロ ッティ ング法による例

結果を図 2 ·に示す。 抗体は抗体番号 29を用いた。 l ysateを作った 細胞株は、 レー ン番号 1が急性リ ンパ芽球性白血球病細胞 ΜΰίΤ 3 、 レー ン番号 2が同じく S 3、 レー ン番号 3が単球性白血病細胞

J111 、 レー ン蕃号 4が同 U937 、 レー ン番号 5がグリ ア腫瘍

U251 、 レー ン番号 6が神経芽腫 SC-N - RT、 レー ン番号 7が同 NB - 1 である。

各細胞より感度よ くバン ドを検出することができた。

了フ イ エティカラ ムによる分雜の例

結果を図 3に示す。 抗体は抗体蕃号 28、 29を用いた。 レー ン番号 1 はラ ッ ト脳を可溶化した蛋白質全体を示す。 レーン番号 2 は、 28 番の了フィニティ カラム、 レー ン蕃号 3は、 29蕃のァフィニティ カ ラムから 3M KSCNで溶出された蛋白質を示す。

診断例 1 大腸癌の病理診断 '

76人の被検者から生検又は手術により得た大腸の切片の各々をパ ラフィ ン包埋病理切片と し、 これをキシレンに浸してパラフィ ンを 除いた。 その後これらを 0. l%NaN ₃ナ ト リ ゥ ム、 0. 3%過酸化水素 メ タノ ールで 30分間、 次いで 5%の正常ャギ血清、 1%牛血清アルブミ ン (BSA) Z PBS (-）で 20分間ブロ ッキングし、 1500倍に希釈した本発明 に係るモノ ク ロ ーナル抗体 （抗体番号 28) と保湿器 （mo i st chamber) 中において 4 でで一晩反応させた。 その後、 これらを PBS (-)で 3回 洗浄し、 500倍に希釈したピオチン化抗マウスィ 厶ノ グロプリ ン抗 体と室温で 1時間反応させ、 発色した。 発色は、 ペルォキシダーゼ 結合アビジン一ピオチ ン法 （ABC comp l ex 法） に 3， 3' - ジァ ミ ノ べ ンジジン テ ト ラ ヒ ドロ ク ロ ラ イ ド （0. 1%溶液、 0. 02¾ の過酸化水 素水と 50mMの ト リス塩酸緩衝液を含む） を組み合わせて行った。 対 比染色にはへマ トキシ リ ンを用いた。 発色した部位の観察は、 光学 顕微鏡で行い、 ク リ ァ一な茶色の染色のみを腸性とした。 その結果 を表 2に示す。

表 2

(陽性者数 Z被検者数） 表 2から明らかなように、 アデノ ー マ （前癌状態） で髙ぃ src フ ァ ミ リ一遺伝子産物の活性化 （染色陽性） が観察され、 癌化するこ とで陽性例は減少した。 進行癌においては、 腸性例が少なく、 モザ ィ ク様の染色は皆無であった。

従って、 本発明に係るモノ ク ローナル抗体は、 特に前癌状態の病 理診断に用いることができる。 また、 アデノ ーマの染色腸性例の多 く は、 モザィ ク様の染色であり、 モザィ ク様の有無は、 前癌状態の 指標として用いることができる。

診断例 2 肺癌の病理診断

9人の被検者から生検又は手術により得た肺の切片の各々をパラ フィ ン包埋病理切片と し、 これをキシレンに浸してパラ フ ィ ンを除 いた。 その後これらを 0. 1%NaN ₃ナ ト リ ウ ム、 0. 3%過酸化水素 Zメ タ ノ ールで 30分間、 次いで 5%の正常ャギ血清、 ^牛血清アルブ ミ ン

(BSA) / PBS (-)で 20分間ブロ ッキングし、 1500倍に希釈した本発明 に係るモノ ク ロ ーナル抗体 （抗体審号 28) と保湿器 （mo i st chamber) 中において 4 で一晩反応させた。 その後、 これらを PBS (-）で 3回 洗浄し、 500倍に希釈したビォチ ン化抗マウスィ ムノ グロ ブ リ ン抗 体と室温で 1時間反応させ、 発色した。 発色は、 ペルォキシダーゼ 結合アビジンー ピオチ ン法 （ABC comp l ex 法） に 3, 3'一 ジ了 ミ ノ べ ンジジン テ ト ラ ヒ ドロ ク ロ ラ イ ド （0. 1%溶液、 0. 02% の過酸化水 素水と 50mMの ト リ ス塩酸緩衝液を含む） を組み合わせて行った。 対 比染色にはへマ トキシリ ンを用いた。 発色した部位の観察は、 光学 顕微鏡で行い、 神経繊維の染色強度と同等 £1上のものを腸性と判定 し/ 0

その結果、 9人の被検者のうち、 5人が明らかな陽性 （腺癌 3名、 類上皮癌 1名、 小細胞癌 1名） を示し、 3人が疑腸性 （腺癌 1名、 類上皮癌 2名） を示した。

従って、 本発明に係るモノ ク ロ ーナル抗体は、 肺癌の診断に充分 に用い得ることが明らかである。 一

配 列

配列番号 ： 1

配列の長さ ： 19

配列の型 ： アミ ノ酸

トポロジ一 ： 直鎖状

配列の種類 ： ぺプチ ド

配列

Leu Gin Aap Tyr Phe Thr Ser Thr Glu Pro Gin Tyr Gin Pro Gly 1 5 10 15

Glu Asn Leu Cys

図面の簡単な説明

図 1 は、 免疫沈降法による検出バン ドを示す。 横軸は、 レー ン番 号を表し、 レー ン蕃号 1 〜 6 は³² Pによるラペルを、 レー ン審号 7 - 1 2 は³⁵ Sによるラベルを、 それぞれ表す。 縦軸は、 電気泳動方 向を表し、 上部は分子量が大を、 下部は分子量が小を、 それぞれ表 す。 レー ン番号 1 ₃は、 分子量マ—カー （^c) の位置を表す。 図 2 は、 ゥ ュスタ ンプロ ッテイ ング法での使用例を示す。 攢軸は. レー ン番号を表し、 縦軸は、 電気泳動方向を表す。 レー ン番号 8は 分子量マーカー （¹⁴C ) の位置を表す。

図 3は、 ァフィ二ティカラムによる分離の例を示す。 横軸は、 レ ー ン番号を表し、 縦軸は、 電気咏動方向を表す。 レー ン番号 4 は分 子量マーカー （ '⁴C) の位置を表す。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . src ファ ミ リ ー遺伝子産物の C末端に存在し リ ン酸化酵素の 活性を制御する機能を有する部位を特異的に認識するモノ ク ローナ ル抗体。

2 . src ファ ミ リ一遺伝子産物が c - src 、 c-yes 、 c-f yn ヽ 及び c-fgr からなる群より選ばれた一つである請求項 1記載のモノ ク □ ーナル抗体。

3 . src フア ミ リ一遺伝子産物が c-src である請求項 1記載のモ ノ ク 。 ーナル抗体。

4 . 工業技術院生命工学工業技術研究所 （日本国茨城県つく ば市 東一丁目 1蕃 3号 （郵便審号 3 0 5 ) ) に受託番号 FBRM BP-4253で 1993年 3月 30日に国際寄託した抗体産生細胞が産生するモノ ク ロー ナル抗体。

5 . 配列番号 1 のアミ ノ酸配列を有するペプチ ド。

6 . 請求項 5記載のペプチ ドを抗原とすることを特徴とする請求 項 1乃至 3記載のモノ ク ロ ーナル抗体の製法。

7. 請求項 1乃至 3記載のモノ ク ロ ーナル抗体を産生する抗体産 生細胞。

8 . 工業技術院生命工学工業技術研究所 （日本国茨城県つく ば巿 東一丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 ) ) に受託番号 PBRM BP- 4253で 1993年 3月 30日に国際寄託した抗体産生細胞。

9. 請求項 1乃至 4記載のモノ ク ロ ーナル抗体を用いることを特 徴とする癌又は前癌状態の病理診断法。

10. 癌が大腸癌である請求項 9記載の病理診断法。

11. 癌が肺癌である請求項 9記載の病理診断法。

12. 請求項 2乃至 4記載のモノ ク ロ ーナル抗体を用いるこ とを特 徵とする骨化石症の病理診断法。