WO1993023033A1

WO1993023033A1 - Apoptosis inducer

Info

Publication number: WO1993023033A1
Application number: PCT/JP1993/000614
Authority: WO
Inventors: Masamichi Kojiro; Kazunori Fukuda; Atsushi Mizoguchi; Hidechika Okada
Original assignee: Tsumura & Co.
Priority date: 1992-05-11
Filing date: 1993-05-11
Publication date: 1993-11-25
Also published as: EP0642793A1; KR950700733A; CA2135628A1; EP0642793A4; AU4272293A

Description

明細書

アポトーシス誘起剤

技術分野

本発明は、制癌剤、抗ウィルス剤等の医薬として利用可能なアポト一シス誘起剤に関する。

近年、細胞組織の死に関し、アポトーシス（apoptosis、ァポプトーシスともいう；自爆死あるいは細胞自滅）という様式が見出され注目されている。このアポトーシスは、病理的細胞死である壊死と異なり、細胞自身の遺伝子に最初から組み込まれている死であると考えられている。

すなわち、なんらかの外部的または内部的要因が引き金となってアポトーシスをプログラムする遺伝子が活性化され、この遺伝子を元にプログラム死タンパク質が生合成され、生成したプログラム死夕ンパク質により細胞自体が分解され、死に至ると考えられている。

このようなアポ卜一シスを所望の組織、細胞で発現せしめることができれば、不要もしくは病原細胞を自然の形で生体から排除することが可能となり、極めて意義深いものである。

しかしながら、現在までアポト一シスを導く化合物として知られているものはグルココルチコィドだけであり、より優れたアポト一シス誘起作用を有する化合物の開発が求められていた。発明の開示

本発明者らは、アポトーシス誘起作用をもつ化合物を見出だすべく、特に各種生薬成分について検索していたところ、パイカリン及びパイカレインが優れたァポト一シス誘起作用を有すること、および、バイカリン及びバイカレインを多く含む小柴胡湯も同じ作用を奏することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明の目的は、パイカリンまたはパイカレインを有効成分として含有するアポトーシス誘起剤を提供することである。

また、本発明の他の目的は、有効量のパイカリンまたはバイカレインを投与し、生体内でアポトーシスを誘起させる方法を提供することである。

更に、本発明の別の他の目的は、アポト一シス誘起剤製造のためのバイカリンまたはバイカレインの使用を提供することである。

図面の fif 単な説明

第 1図はパイカレインおよびパイ力リン並びに小柴胡湯の添加により断片化した M T 4細胞株の D N Aを示す電気泳動の写真であり、第 2図は小柴胡湯の添加により変化した K I M— 1細胞株の生物形態を示す写真であり、第 3図は小柴胡湯の添加により断片化した K I M— 1細胞株の D N Aを示す電気泳動の写真である。

発明を実施するための最良の形態

本発明において有効成分として用いられるパイカリン及びパイカレインは、下式中、 Eが G l c A (パイカリン）及び Rが H (バイカレイン）で表わされる化合物である。 R〇^ 〇

OH 〇これらのバイカリン及びバイカレインは、すでに公知の化合物であり、抗炎症作用、抗アレルギー作用、降圧作用を有することが知られている。また、逆転写酵素の作用を阻害することも知られている（特開平 1— 1 6 3 1 2 0号）が、これら化合物が本発明の如くアポトーシスを惹起し、不用若しくは病原細胞を除去することに関しては全く知られていない。

有効成分のバイカリン及びバイカレインは、生薬等から抽出したものや、化学的に合成されたもの、微生物等の作用によって生産されたもののいずれであってちょい。

バイカリン及びバイカレインを多く含む生薬としては、例えば黄ごん、木蝴蝶等を挙げることができる。本発明においてはこれらの生薬や抽出物を用いることも可能であるが、さらにこれらを配合した漢方薬、例えぱ小柴胡湯、乙字湯、大柴胡湯、柴胡桂枝湯、柴胡桂枝乾姜湯、柴胡加竜骨牡蠣湯、半夏瀉心湯、黄連解毒湯、半夏厚朴湯、荊芥連翹湯、潤腸湯、五淋散、温清飲、清上防風湯、防風通聖散、女神散、柴陥湯、竜胆瀉肝湯、柴胡清肝湯、ニ朮湯、清肺湯、柴朴湯、辛夷清肺湯、小柴胡湯加桔梗石膏、清心蓮子飲、三黄瀉心湯、柴苓湯、三物黄ごん湯等を利用してもよい。

このうち小柴胡湯は、柴胡、半夏、黄ごん、大棗、人参、甘草および生姜などの生薬を含む漢方薬であり、抗炎症作用、細胞膜の安定化作用、抗アレルギー作用、免疫賦话作用による各種慢性肝疾患の治療に用いられているものであるが、本発明のァポトーシス誘起のために有利に利用できる。

この小柴胡湯は、若干の異同があるが、一般に次の配合範囲のものである。

柴胡 4 . 0〜 7 . 0

半夏 4 . 0〜 5 . 0 黄ごん 3 . 0

大棗 2 . 0〜 3 . 0

人参 2 . 0〜3 , 0

甘草 2 . 0

生姜 1 . 0〜 4 . 0

小柴胡湯の抽出物としては小柴胡湯の各種水系溶剤抽出物が挙げられるが、水抽出物を用いることが好ましい。

具体的な、小柴胡湯抽出物の調製例としては上記組成の小柴胡湯を 1 0倍量の熱水で抽出し、得られた抽出液を濾過する方法が挙げられる。この抽出物は必要に応じて乾燥させ、乾燥粉末とすることもできる。

本発明のアポト一シス誘起剤は、上記のパイカリンまたはバイカレインを、そのまま公知の医薬用担体と組合せ製剤化し、錠剤、粉剤、顆粒剤、液剤等の経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非経口剤、更には坐剤等とすることにより調製できる。

また、パイカリン源またはパイカレイン源として小柴胡湯を用いる場合は、上記配合の小柴胡湯をそのまま、もしくはその抽出物を公知の医薬用担体と組み合せ製剤化し、錠剤、粉剤、顆粒剤、液剤等の経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非経口剤、更には坐剤等とすれば良い。

医薬用担体は、上記投 "^形態及び剤型に応じて選択することができ、経口剤の場合は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニヅト、カルボキシメチルセル口一ス、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また、絰ロ剤の調製にあたっては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矮味剤、着色剤、香料等を配合することができる。これらの具体例としては、以下に示すものが挙げられる。

( 結合剤）

デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、ェチルセルロース、ポリビニルどロリドン、マクロゴール等。 ( 崩壊剤）

デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナ卜リゥム、カルポキシメチルセルロースカルシウム、カルポキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等。

( 界面活性剤）

ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルべ一ト 8 0等。

( 滑沢剤）

タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシゥム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等。

( 流動性促進剤）

軽質無水ケィ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケィ酸アルミニウム、ケィ酸マグネシウム等。

また、絰ロ用の液剤として、懸濁液、ェマルジヨン剤、シロップ剤、エリキシル剤とすることができ、これらの各種剤型には矮味、矯臭剤、着色剤を配合しても良い。

—方、非経口剤の場合は、常法に従い本発明の有効成分であるバイカリンもしくはバイカレインまたは小柴胡湯もしくはその抽出物を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセィ油、ダィズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし想濁させ、必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製される。

このアポトーシス誘起剤の投与量は、投与経路、疾患の程度、被投与者の年齢等によって異なるが、一般には経口投与の場合、バイカリンまたはバイカレインとして大人 1日当たり 1 0 0 m g〜 6 g程度の量を 1〜 3回に分けて投与すれば良い。

また、非経口剤の場合は、バイ力リン及びバイカレインとして 1曰 1〜 1 0 0 m g程度を投与すればよい。バイ力リン源またはバイカレイン源として小柴胡湯を用いる場合には大人 1日当たり小柴胡湯乾燥エキス量として 1〜 10 g程度となる量を 1 ~ 3回に分けて投与すれば良い。

なお、本発明で用いるバイカリン及びバイカレインは、例えば、マウスおよびラットに対し、投与限界である 1 gZkgの絰ロ投与で死亡例が認められないことから明らかなように極めて安全性の高いものであり、安心して使用することができる。 .

また、小柴胡湯はすでに漢方薬として長い歴史を有し、安全性が確認されたものであるので安心して使用することができる。例えば、マウスおよびラヅ卜に対し、投与限界である 15 gZkgの経口投与で死亡例が認められないことから明らかなように極めて安全性の高いものである。実施例

次に試験例および実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等になんら制約されるものではない。試験例 1

ゥィルス感染細胞に対する細胞 D N A断片化作甩の検討：

( 試験方法）

以下の如くして、バイカリン、バイカレインおよび小柴胡湯の D N A断片化作用を調べた。

ファルコン 3084フラスコ（75 cm²) に、 10%FCS— RPMI 16 40培地で l x 10^s個 /mlに調整したウィルス感染細胞、 MT4を 2 Oml 取った。これに、バイカリンおよびパイカレインはそれぞれ 4mg;/nil、 00 ^> 1111ぉょび40^ ： 1111の濃度で含む0¾130溶液を、小柴胡湯ェキスについては、これをそれぞれ 200 m g/m 1、 100 m gZm 1および 4 Omg/m 1の濃度でを含む DMS◦溶液を各 100 1ず^)添加した。

炭酸ガス培養器中、 37 °Cで培養を行い、 1時間後に 10 mlを回収して遠心チュープに移し-. 1000 r pmで 6分間遠心した。遠心後、上清を捨てて沈澱した細胞を回収した。残りの 10 m 1については更に 2時間培養を続け、上記と同様遠心して細胞を同様に回収した（培養時間 3時間）。

沈澱した細胞は、それぞれ直ちに凍結し、一 80°Cで DN A抽出時まで保存した。

DNAの抽出は、イソクイヅク（ I s oQu i c k^TM;販売元夕ネハシ）を用い以下の通り行った。

すなわち、凍結保存してあった沈澱細胞を、 100 1のリージェント— Aに懸濁した後、 100 1のリージェント一 1 (ライシス'ソリューション）を加えて細胞を溶解した。これに 700 1のリージェン卜一 2 (ェクストラクシヨン-マトリヅクス）と 400 1のリージェント一 3 (ェクストラクシヨン'バヅファ）を加え、ボルテックスで攪拌した。

この混合液を 15,000 r pmで 5分間遠心後、水相を回収し、 1Z4量のリージェン卜一 4 (酢酸ナトリウム溶液）を加え、これに更に同容量のイソプロピルアルコールを加えて軽く攪拌し、 DNAを析出させた。 DNAを析出させた混合液を 15，000 r pmで 10分間遠心し、上清を除去した後、沈渣の D N Aを更に 70 %エタノールで遠心洗浄した。

得られた DN Aをドライアップした後、 20 1の TEバッファに溶解し、ァガロースゲル電気泳動にかけた。電気泳動は、 Nu S i v e ァガロースの 3 %ゲルを用い、 100 Vで 50分間行った。マ一力一は、 φ X 174/H a e I I I消化物を用いた。

( 結果）

電気泳動の結果を第 1図（写真）に示す。図中、上側のコード 1〜6が小柴胡湯を作用させた場合の D N A断片化を示し（コード 1 ： 200〃gZm l , l 時間作用、コード 2 : 500 g/m 1 , 1時間作用、コード 3 ： 1000

8/'1111 , 1時間作用、コ一ド4： 200 gZm 1，3時間作用、コード 5

： 50 Oy gZm 1，3時間作用、コード 6 ： 1000 g /'m 1 , 3時間作用）、同じくコード 7〜12はバイカレインを作用させた場合の DN A断片化を示す (コード 7 : 0.2 g/m 1， 1時間作用、コ一ド 8 ： 2 gZm 1 , 1時間作用、コード 9 : 20 g/m 1 , 1時間作用、コード 10 ： 0.2 / g/m 1 ,3時間作用、コード 1 1 : 2 gZm l，3時間作用、コード 1 2 ： 20 fig Zm l，3時間作用）。

また、図中、下側のコード 13~ 18は、バイカリンを作用させた場合の DN A断片化を（コード 13 : 0.2 Atg/m l， l時間作用、コード 14 _: 2 jx s ノ m l， 1時間作用、コード 15 ： 20 Ci gZml， 1時間作用、コード 16 ： 0.2 ig/m l , 3時間作用、コード 1 7 ： 2 g/m 1， 3時間作用、コード 18 ： 20 ^gZm l，3時間作用）、コード 19および 2ひは対照の D N A断片化の結果を示す。

この結果から明らかなように、ウィルス感染細胞である MT 4 (T細胞由来 H TLV—感染細胞株）の D NAは、バイカレインおよびバイカリンにより 200 b pの整数倍で断片化が生じており、アポトーシスが惹起されたことが明かとなつた。特に、バイカリンは、 0.2 1Zの低港度においてさえアポトーシスを惹起した。また、小柴胡湯によっても 200 b pの整数倍で断片化が生じており、同様アポトーシスが惹起ざれたことが明かとなった。試験例 2

小柴胡湯のアポトーシス誘起作用の検討：

下記方法により、小柴胡湯のアポトーシス誘起作用を調べた。

( 1 ) 小柴胡湯添加培地の調製：

細胞培養の基礎培地としては、ダルべヅコ一変法イーグル培地に 5 %の牛胎児血清、ペニシリン（ 1 O O U/m l ) 及びストレブトマイシ（ 100 /igZm l ) を加えたものを用いた。同培地に、小柴胡湯（T J— 9、株式会社ツムラ製）のエキス原末を 1ひ mgZm lの濃度になるように加え、エキス溶液から難溶成分を除いた遠心上清をとり実験に供した。

この濃縮培地を、同上の基礎培地で各濃度に希釈して実験に供した。希釈された小柴胡湯添加培地および非添加培地の浸透圧および P Hはヒトの生理的範囲であった。

( 2 ) 細胞の形態学的変化の検討：

K I M - 1細胞株（肝細胞癌）および KMC— 1細胞株（肝内胆管癌株）をそれぞれ T一 75フラスコに 5 X 10⁵個ずつ接種し、 24時藺基礎培地で培養後、 400 AigZm 1の濃度に調製した小柴胡湯添加培地と交換し、 48時間後の細胞の形態学的変化を検討した。すなわち、浮遊してきた細胞を採取し、サイトスピンにてスライドに付着させた後、 70 %アルコールにて固定し、 HE染色を行い、光学顕微鏡下に細胞の形態像を観察した。

このうち、 K I M— 1細胞株についての形態像を第 2図（写真）に示す。

この図から明らかなように、小柴胡湯の存在により、 K IM— 1細胞株の細胞縮小、核濃縮等が認められた。

(3) DN Aフラグメンテーションの検討：

上記（2 ) と同様にして浮遊してきた細胞とスクラッパ一にて剥いだ固着細胞をまとめて冷 PB Sで 2回洗浄後、これに、 10mM 卜リス（pH 8 ) 、 0. 1 M EDTA、 0.5% SD Sおよび 20 zgZm 1 RNas e (シグマ社）の溶液を 0.5 m 1ノ 10^β細胞となるように加えて 37°Cで 1時間ィンキュベー卜し、更に、最終港度 100; g/mlとなるようプロテナーゼ K (シグマ社）を加えた後、 50°Cで 3時間インキュベートし、細胞ホモジュネートを得た。これより、フエノールークロロホルムにて蛋白を除去し、エタノール沈澱にて D NAを回収した。この DNAを T10E1 ( 1 OmM Tr i s -HC l/lmM ED TA) 溶液に溶解後、 10 gの DNAを 0.5 g/m 1のェチジゥムブ口マイドを加えた 1.6 %ァガロースゲルによる電気泳動にて解析した。

この結果を第 3図（写真）に示す。図中、 Bは、小柴胡湯を作用させた KI M - 1細胞株から抽出した DN Aを用いた電気泳動の結果を、 Aは小柴胡湯を作用させないときの電気泳動の結果を示す（対照）。

この結果から明らかなように、小柴胡湯を作用させた場合は約 180 bpの整数倍で DN Aが切断された断片が検出された。

( 4 ) 結果 ,

アポトーシスに特徴的なものとして、細胞縮小、クロマチン濃縮、核 S縮、細胞断片化等が知られている。また、この断片化により、 DNAは180 bpの整数倍のオリゴヌクレオゾームに切断されることも知られている。

上記（ 2 ) および（ 3 ) の結果は、全てアポトーシスが惹起されたことを示しており、小柴胡湯がアポ卜一シスを誘起することがこれらの結果から明かとなつた。実施例 1

小柴胡湯の抽出物の製造例（ 1 ) ：

柴胡 7g、黄ごん 3 g、甘草 2g、人参 3g、生姜 lg、大棗 3 gおよび半夏 5 gの混合生案（小柴胡湯； 2 g) に 240 gの精製水を加え、 100 で1 時間加熱抽出した。得られた抽出液を濾過後、スプレードライして 2.3 gの乾燥エキス粉末を得た。実施例 2

小柴胡湯の抽出物の製造例（2) ：

柴胡 7g、黄ごん 3 g：、甘草 2g：、人参 3g、生姜 lg、大棗 3gおよび半夏 5 g"の混合生案（小柴胡湯； 24g) に 300 gの精製水を加え、 100°Cで 6 0分間抽出した。得られた抽出液を遠心分雜により固液分離し、得られた分離液を 50°C以下でスプレードライして 4.5 gの乾燥エキス粉末を得た。

この乾燥エキス中に含まれる主な成分は、グリチルリチン 42.5mg、バイカリン 16 Omgr、サイコサポニン b 4.5nigであった。実施例 3

小柴胡湯の抽出物の製造例（ 3 ) ：

柴胡 700 、黄ごん 300 g、甘草 200 g、人参 300g、生姜 100g：，大棗 300 gおよび半夏 500gの混合生薬（小柴胡湯； 2.4kg) に 241 の精製水を加え、加熱し、 100^SCになってから 1時間抽出した。得られた抽出液を遠心分離にかけ、残渣を分離して溶液 201を得る。

この溶液を 0.3 mのメンプランフィル夕一（東洋濾紙社製）により無菌清澄濾過する。得られた瀘液をダイァフィル夕一 G— 10 T (バイオエンジニアリング社製；分画分子量 10000) をほいて限外瀘逼する。この限外濾過は、内容積 2 ,01の容器の下面に直径 152 mmの膜をセットし、圧力 3 kgZ cm ²で行ない、容器内の液が濃縮されるにつれ精製水約 21を添加するというように実施した。

この結果、限外濾過液 201を得た。実施例 4

顆粒剤の調製（ 1 ) ：

バイカリン 10 gを乳糖 89 gおよびステアリン酸マグネシウム 1 gと混合し、この混合物を単発式打錠機にて打錠し、直径 20mm、重量約 2.3 gのスラッグ錠を作った。このスラッグ錠をオシレー夕一で粉砕し、整粒後篩別し、粒径 20〜 50メッシュの顆粒剤を得た。（この顆粒剤 1 g中には、バイカリン

100 ragが含有されており、成人 1日あたり 1〜2.5 gを数回に分けて服用する。）実施例 5

顆粒剤の調製（ 2 ) ··

実施例 1により調製した小柴胡湯の乾燥エキス粉末 200 gを乳糖 89 gおよびステアリン酸マグネシウム 1 gと混合し、この混合物を単発式打錠機にて打錠し、直径 20mm、重量約 2.3 gのスラッグ錠を作った。このスラヅグ錠をォシレ一ターで粉砕し、整粒後篩別し、粒径 20〜50メッシュの顆粒剤を得た。実施例 6

錠剤の調製（ 1 ) ：

バイカリン 2.5 gを微結晶セルロース 20 gおよびステアリン酸マグネシゥム 5 gと混合し、この混合物を単発式打錠機にて打錠して直径 7 mm、重量 22 5 mgの錠剤を製造した。本錠剤 1錠中には、バイカリンを 20mg含有する。 (この錠剤は、成人 1日あたり 5〜7錠を数回に分けて服用する。）実施例 7

錠剤の調製（ 2 ) ：実施例 2により調製した乾燥エキス粉末 20 Omgを微結晶セルロース 20 g およびステアリン酸マグネシウム 5 gと混合し、この混合物を単発式打錠機にて打錠して直径 7mm、重量 225m gの錠剤を製造した。本錠剤 1錠中には、小柴胡湯の乾燥エキス粉末を 2ひ Omg含有する。実施例 8

カプセル剤の調製（ 1 ) ：

バイカレイン 1 Ogをコーンスターチ 89.5 gおよび軽質無水ケィ酸 0.5 g と均一に混合し、その 20 Omgを 2号カブセルに充填し、カプセル剤を調製した。（このカプセル剤 1カプセルには、パイカレイン 20 nigが含有されており、成人 1曰あたり 5〜 7カプセルを数回に分けて服用する）実施例 9

カプセル剤の調製（2 ) ：

実施例 2により調製した乾燥エキス粉末 50 Omgを硬カブセルに充填し、力プセル剤を調製した。実施例 10

注射剤の譌製（ 1 ) ：

適量の注射用蒸留水にブドウ糖 10 Omgおよびバイカリン 10 nigを溶解させ、更に注射甩蒸留水を »いて全量を 15 mlとした後、 5 mlのアンプルに注入し、 121°Cで 15分藺加熱滅菌を行って注射剤を得た。実施例 11

注射剤の調製（2) ：

実施例 3で得た限外濾過液 201にァラニン（発熱物質不含） 300 gを添加. 溶解し、凍結乾燥する。この凍結乾燥物を 900本のバイアル瓶に分注して注射剤を得た。この注射剤 1パイアルには、凍結乾燥物 406 mgが含まれており、 1 Omlの精製水に容易に溶解した。また、溶解後の注射液は、 92% ( 5 5 0 n m ) の透過度を有しており、日本薬局方の発熱性物質試験法に適合していた。

産業上の利用可能性

本発明の、バイカリンまたはバイカレインを有効成分とするアポトーシス誘起剤は、生体内で有効にアポトーシスを引き起こすことが可能となる。

このアポトーシスは壊死に基づく細胞の死と異なり、細胞自身に本来組み込まれている死であるため、自然な形で不要もしくは病源細胞を取り除くことができるものである。

従来、例えば癌に対する制癌剤ゃ抗痛剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤, 抗生物質、 D N A合成阻害剤、免疫強化剤等の薬剤が利用されているが、これらのうちアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、 D N A合成阻害剤等の薬剤では、癌細胞のみならず正常細胞に対しても影響を及ぼし、副作用が強すぎるという問題があり、また、免疫強化剤では作用が弱いという問題があった。

しかし、本発明のアポトーシス誘起剤を用いれば、癌細胞にもプログラムされているアポト一シスを引き起こし、不死とされている癌細胞を死滅させることができるので、新しい夕イブの安全な制癌 ·抗癌剤として有利に使用することがでぎる。

また、従来排除が困難とされていた種々のウィルスが感染した組織や細胞についてもアポトーシスを引き起こし、これらの組織、細胞を除去することができるので、ウィルス感染が原因である多くの病気の治療等にも有用なものである。

Claims

請求の範囲

1 . バイカリンまたはバイカレインを有効成分として含有するアポトーシス誘起剤。

2 . バイ力リン源またはパイカレイン源として小柴胡湯を用いる請求の範囲第 1項記載のァポト一シス誘起剤。

3 . 有効量のバイカリンまたはパイカレインと、薬学的に許容された担体を含有するアポトーシス誘起剤組成物。

. パイカリン源またはバイカレイン源として小柴胡湯を用いる請求の範囲第 3項記載のアポトーシス誘起剤組成物。

5 . 有効暈のパイカリンまたはパイカレインを投与し、生体内でアポト一シスを誘起させる方法。

6 . バイカリン源またはパイカレイン源として小柴胡湯を用いる請求の範囲第 5項記載のアポトーシス誘起方法。

7 . アポ卜一シス誘起剤製造のためのパイカリンまたはパイカレインの使用 ₍

8 . バイ力リン源またはパイカレイン源が小柴胡湯である請求の範囲第 7項記載の使用。