WO1993021225A1

WO1993021225A1 - Peptide synthetique, tensioactif pulmonaire le renfermant, et remede contre le syndrome de souffrance respiratoire

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Publication number: WO1993021225A1
Application number: PCT/JP1993/000492
Authority: WO
Inventors: Tsunetomo Takei; Toshimitsu Aiba; Kaoru Sakai; Tetsuro Fujiwara
Original assignee: Tokyo Tanabe Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1992-04-17
Filing date: 1993-04-16
Publication date: 1993-10-28
Anticipated expiration: 1994-10-17
Also published as: JP3376582B2; JPH05294996A; AU3905693A

Description

明細書合成べプチド、それを含有する肺サーファクタント及び呼吸窮迫症群治療剤技術分野

本発明は、合成ペプチドに関する。詳しくは、脂質混合物と配合することにより強力な表面活性作用を有する合成べプチド、該合成べプチドと脂質混合物からなる肺サーファクタント及び該肺サ一ファクタントを有効成分として含有する呼吸窮迫症候群治療剤に関する。背景技術、

呼吸窮迫症候群は、肺サーファクタン卜の欠乏により肺胞が虚脱する結果、重篤な呼吸障害をきたす疾病であり、未熟な新生児に多症し死亡率が高い。

近年、この呼吸窮迫症候群に対し、外部から経気道的に肺サーファクタントを投与する補充療法が開発され、顕著な治療効果を収めている。補充される肺サーファクタントとしては、哺乳動物の肺臓組織に存在するリン脂質、中性脂質、総コレステロール及び炭水化物並びに微量の蛋白質からなる物質（特公昭 6 1 - 9 9 2 5号公報）、前記成分のほかに脂肪酸を含有する物質（以下「S— T A」という。：特公昭 6 1 - 9 9 2 4 号公報）、豚肺洗浄液より分離し、これに C a を添加した物質（日本界面医学会雑誌、第 1 2巻第 1号第 1頁、 1 9 8 0年）、コリンホスホグリセリド、酸性リン脂質、脂肪酸類及び動物肺由来のリポ蛋白質をそれぞれ特定の比率で含有する物質（特公平 3 - 7 8.3 7 1号公報）、ジパルミトイルホスファチジルコリン及び脂肪アルコールからなる物質（特公平 3— 4 3 2 5 2号公報) 等が知られている。

本発明者等の一部は、先に動物由来の肺サーファクタントからリポ蛋白質を分離し、該リポ蛋白質が肺表面活性を示すため不可欠の成分であり、該リボ蛋白質を脂質混合物に配合することにより、サーファクタントの優れた表面張力低下作用の発現並びにサーファクタント気波面拡散作用の短縮及び低い平銜表面張力の発揮.により、十分な肺胞腔容量の確保等を可能にし、呼吸窮迫症候群の治療に使用できることを発見した（特公平 3— 7 8 3 7 1号公報) 。

近年、哺乳動物の肺サーファクタントに特異的なアポ蛋白質として親水性のサーファクタントアポ蛋白質 A及びサーファクタントアポ蛋白質 D並びに疎水性のサーファクタントアポ蛋白質 B (以下「S P— B」という。）及びサーファクタントアポ蛋白質 C (以下「S P— C」という。 ) の 4種が確認された〔アポ蛋白質の構造と機能についての総説（秋野豊明、黒木由夫著、呼吸と循環、第 3 8巻第 1 8号第 7 2 2頁、 1 9 9 0 年；安田寬基等編、「バイオサーファクタント _[ 、第 2章サーファクタントの生化学 —サーファクタントとアポ蛋白質第 1 3 1頁、 1 9 9 0 年、株式会社サイエンスフォーラム）〕。

ヒト肺由来の S P— Cは、アミノ酸 3 5残基からなり、 N末端アミノ酸がフヱニルァラニンでバひン等の疎水性ァミノ酸に富む疎水性が極めて強いアポ蛋白質である。またゥシ、ブタ、ラット等の肺から単離された S P— Cも、アミノ酸 3 4〜3 5残基からなり、 N末端側のアミノ酸配列が動物種により異なっているがヒ十との相同性が極めて高い。ヒト S P — cのアミノ酸配列

Phe Gly l ie Pro Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu l ie Val

1 5 10 15

Val Val Val Val Val Leu l ie Val Val Val l ie Val Gly Ala Leu Leu

20 25 30

Met Gly Leu

35

特表平 3 - 5 0 2 0 9 5号公報、特開平 3 - 9 0 0 3 3号公報には、 S P 一 B又は S P— Cが肺サーファクタン卜の気液界面への吸着、拡散を促進し、肺サーファタタントの表面活性を改善することが記載されている。

S P - Cと脂質混合物とからなる肺サーファクタントを有効成分とする呼吸窮迫症候群治療剤は、極めて有効であるにもかかわらず、 S P— Cの疎水性が極めて強く単離 ·精製が困難であること及び生体中に極めて微量しか含まれていないこと等から、実用化されるには至っていない。特表平 3— 5 0 2 0 9 5号公報には、下式に示す S P - Cの部分構造を含む合成べプチドと脂質との混合物が、呼吸窮迫症候群治療に効果的である旨記載されている。また、同公報には、高い表面活性を示す最小単位として下記の配列を有するァミノ酸残基 3 2個のぺプチドが記載されている。更に、この最小単位のペプチドとこれより短いアミノ酸残基を有する合成ペプチドとの表面活性の比較から、表面活性の喪失は、特定の残基の喪失に起因するのではなく、ポリぺプチドの長さの減少によると結論づけている。

Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu l ie Val Val Val Val Val 1 5 10 15 Val Leu l ie Val Val Val l ie Val Gly Ala Leu Leu Met Gly Leu His

20 25 30 しかしながら、一般的に合成べプチドの製造には、そのアミノ酸配列が長くなるにつれて合成時の未成熟なぺプチドの生成頻度が高くなり、単離 ·精製が困難となること、製造に長間を要すること及び大量合成が困難なこと等の欠点があるといわれてい'る。

ところで、肺サーファクタント製剤は、品質保全の点から、用時に生理食塩水懸濁波とする乾燥粉末製剤として提供されることが多い。

しかしながら、 S P— Cのアミノ酸配列を有する合成べプチドをコリンホスホグリセリド、酸性リン脂質及び脂肪酸類からなる脂質混合物に配合した肺サーファクタント（以下「S— 3 5」という。）製剤は、ぺプチド中に存在するシスティン残基がジスルフィド結合を形成するためぺプチドの凝集性が高いこと、肺サーファクタント自体の疎水性が強いこと等の要因から、生理食塩水に対する分散性が極めて悪く、製剤として使用できる程度に均一な懸濁液とすることが困難であった。

また、肺サーファクタント製剤の懸濁性の改善法として、マンニトール等の懸濁化剤を添加する方法（特開昭 6 0 - 3 4 9 0 5号公報）及び乾燥時に一時凍結温度を一 1〜一 1 ひ °Cで行う凍結法（特開昭 6 3 - 1 0 7 1 8号公報）が提案されているが、操作が煩雑であり、より簡便な製剤の製造法の開発が望まれていた発明の開示

本発明者等は、上記知見に鑑み、脂質混合物と配合することにより強力な表面活性作用を有する合成ペプチドにっき、鋭意研究した結果、下記特定配列で示されるペプチド（以下「本発明合成ペプチド」という。）を有効成分とする肺サーファタタントが、懸濁化剤無添加、一 2 0 °C以下で行う通常の凍結乾燥法により製造した場合でも、 S - 3 5、コリンホスホグリセリド、酸性リン脂質及び脂肪酸類からなる脂質混合物のみからなる合成肺サーファクタント（以下「S F— 3」という。）又は S 一 T Aに比べ、均一懸濁性が良好で、しかも S— 3 5又は S— T Aと同等の強力な表面活性作用を有することを知り本発明を完成させた。

Xaa Xbb Pro Val Xcc Xdd Lys Arg Leu Leu Xee Val Val Val Val Val 1 5 10 15

Val Leu Xff Val Val Val He Val Gly Ala Leu Xgg

20 25

(配列中、 Xaaは存在しないか又は Cys、 Ser若しくは Alaを表し、 Xbbは Cys、 Ser又は Alaを表し、 Xccは His又は Asnを表し、 Xddは Leu又は I leを表し、 Xeeは Val又は l ieを表し、 Xffは I le、 Leu又は Valを表し、 Xggは存在しないか又は Leuを表す。）

本発明によれば、製造時の未成熟なぺプチドの生成頻度が低いため単離 ·精製が容易であり、短時間で大量に製造することができる合成ぺプチドであって、脂質混合と配合することにより懸濁性が良好であり、かつ、強力な表面活性作用を有する合成ペプチド、該合成ペプチドと脂質混合物からなる肺サーファクタント及び該肺サーファクタントを有効成分として含有する呼吸窮迫症候群治療剤が提供される。

本発明合成ペプチドは、化学的又は遺伝子工学的手法により製造する、ことができるが、単離 ·精製の点から化学的製造法が好ましい。

化学的製造法としては、「ペプチド合成（泉屋信夫等著、丸善株式会社、 1 9 7 5年）」、「生化学実 —講座、第 1巻、タンパク質の化学 I V 一化学修飾とぺプチド合成 - （榊原俊平著、東京化学同人株式会社、 1 9 7 3 年）」、「続生化学実験講座、第 2卷、タンパク質の化学（下）ぺプチド合成（木村皓俊著、東京化学同人株式会社、 1 9 8 7年）」、「ソリドフェイズペプチドシンティシス（Sol id phase peptide synthesis 一 a practical approach ； ,セノレ卜ン (E. Atherton) およびシエノ一ド（R. C. Sheppard) 著、 2 5〜： I 8 9、 Oxford University Press, Oxford 、 1 9 8 9年）」及び「Kenichi， Akagi et aL ( Chem. Pharm. Bull. , 第 3 7卷、第 1 0号、第 2 6 6 1〜2 6 6 4頁、 1 9 8 9年）」又は「ザ · ペプチド（The Peptides) 〔グロス（Gross, E. ) 及びマイネンホーフ (Meinenhofe, J. ) 編、バラニー（Barany, G. ) 及びメリフィールド (Merrifierd, R) 著、第 2巻第 1〜 2 8 4頁、アカデミックプレス、二ユーヨーク、 1 9 & 0年）〕」に記載されている方法、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、 D C C法、活性ェステル法（ρ—二トロフエニルエステル法、 P —ヒドロキシコハク酸ィミドエステル法等) 、カルボイミダゾール法、酸化還元法、 D C C—活性化法等の液相合成法又は固柜合成法等により製造することができる。

このうち固相合成法が好ましく、自動合成装置により合成することが可能である。自動合成装置としては、例えば 4 3 1 Aペプチド · シンセサイザ（商標；アプライドバイオシステム社製) 又はべプチド合成装置モデル 9 9 0 E (商標；ベックマン社製）が挙げられる。

本発明合成ペプチドに脂質混合物としてコリンホスホグリセリド、酸性リン脂質及び脂肪酸類を配合することにより肺サ一ファクタント（以下「本発明サーファクタント」という。）を製造することができる。配合比は最終生成物の乾燥総重量に対するこれらの成分の重量比率が、合成ペプチドは 0 . 1〜 5 · 0 % (W/W) 、コリンホスホグリセリドは 5 0 . 6〜 8 5 . 0 % (W/W) ゝ酸性リン脂質は 4. 5〜 3 7 . 6 % (W/W) 、脂肪酸類は 4 . 6〜2 4 . 6 % (WZW) となるように設定するのが適当である。

本発明サーファクタントにおいて使用できるコリンホスホダリセリドとしては、 1 , 2—ジパルミトイルグリセ口— （3.) —ホスホコリン（別名ジパルミトイルホスファチジルコリン）、 1 ， 2—ジステアロイルグリセロー（ 3 ) —ホスホコリン、 1 -パルミトイルー 2—ステアロイルグリセロー（ 3 ) —ホスホコリン若しくは 1 ーステアロイル— 2 —パルミトィルグリセロー（3 ) —ホスホコリン等の 1 , 2 —ジァシルグリセ口— （ 3 ) —ホスホコリン、 1 一へキサデシル— 2 —パルミトイルグリセロー（3 ) —ホスホコリン若しくは 1 一才クタデシルー 2 —パルミトィルグリセロー（3 ) —ホスホコリン等の 1 一アルキル— 2 —アンルグリセロー（3 ) —ホスホコリン又は 1， 2 —ジへキサデシルグリセロー ( 3 ) —ホスホコリン等の 1 , 2 —ジアルキルグリセロー（3 ) —ホスホコリンが適当である。これらの化合物についてはグリセロール残基の 2位の炭素に基づく光学異性体が存在するが、本発明サーファクタントにおいては D体、 L体又は D L体のいずれを問わず使用することができる。このほかにコリンホスホグリセリドとしては、上述の単品からなるコリンホスホグリセリド以外に、炭素数が 1 2〜 2 4個のァシル基、好ましくは、飽和ァシル基を 2個有する 1 , 2—ジァシルグリセ口— （3 ) —ホスホコリンの 2種以上からなる混合物、更には当該混合物と上述の単品との混合物も使用することができる。

酸性リン脂質としては、 1 , 2 —ジァシルー s n—グリセロー（3 ) 一リン酸（別名 L一 α—ホスファチジン酸）、 1 , 2—ジァシル— s η ーグリセ口— （3 ) —ホスホーしーセリン（別名ホスファチジルセリン）、 1 , 2 —ジァシルー s η—グリセ口— （ 3 ) —ホスホー s η—グリセロール（別名ホスファチジルグリセロール）又は 1 , 2—ジァシルー s η— グリセロー（ 3 ) —ホスホー（ 1 ) — L一 m y 0—イノシトール（別名ホスファチジルイノシトール）が適当である。これらの化合物において、 1位及び 2位は同一種類又は異なる種類のァシル基でそれぞれ置換されていてもよい。ここで、ァシル基の炭素数は 1 2〜2 4個が好ましい。脂肪酸類としては、遊離脂肪酸、脂肪酸のアルカリ金属塩、脂肪酸ァ & ルキルエステル、脂肪酸グリセリンエステル若しくは脂肪酸アミド又はこれらの 2種以上からなる混合物、更には脂肪アルコール又は脂肪族ァミンが適当である。

本明細書において「脂肪酸類上とは、ここでいう脂肪アルコール及び脂肪族ァミンも包含する意味である。

遊離脂肪酸としてはミリスチン酸、パルミチン酸又はステアリン酸が適当であるが、ソヽ。ルミチン酸が!？ましい。

脂肪酸のアル力リ金属塩としてはパルミチン酸ナトリゥムが、脂肪酸アルキルエステルとしてはパルミチン酸ェチルエステルが、脂肪酸グリセリンエステルとしてはモノパルミチンが、脂肪酸ァミドとしてはパルミチン酸アミドがそれぞれ好ましい。

脂肪アルコールとしてはへキサデシルアルコールが、脂肪族アミンとしてはへキサデシルァミンが好ましい。

上述のコリンホスホグリセリド、酸性リン脂質及び脂肪酸類は動植物から分離された製品、半合成品又は化学合成品のいずれでもよく、それらの市販品を使用することができる。

本発明サーファクタントは、本発明合成べプチド溶液と上記脂質混，合物溶液との混合溶液を減圧乾固し、得られた残留物を適当な懸濁溶媒を用いて懸濁し、次いで凍結乾燥する方法により製造することができる。本発明合成ペプチド溶波の調製に使用される溶媒としては、例えば、ギ酸、トリフルォロ酢酸（T F A) 、トリフルォロエタノール、ジメチルスルホキシド（D M S O ) 、クロ口ホルム/メタノール又はクロロホルムが挙げられる。

脂質混合物溶液の調製に使用される溶媒としては、例えば、クロロホルム、クロ口ホル /メタノール〔2 ： 1〜5 ：. 1 ( V / V ) 〕—が挙げられる■。懸濁溶媒としては水又は水—エタノール混合液〔4 ： 1〜20 ： 1 (V /V) 〕が挙げられるが、水一エタノール混合液が好ましい。懸濁は 3 0 〜6 0°C、好ましくは 4 0〜5 0°Cで、 5〜6 0分間、好ましくは 1 5 〜3 0分間かけて行う。

本発明サーファクタントには製法上、微量の水分の残存は避けられないが、その残存重量比率が総重量に対して 5. 0 % (W/W) 以下になるまで乾燥することが望ましい。かかる程度まで乾燥すれば、水一エタノール混合液を用いる場合、ェタノールの残存は検出不能となる。

また、本発明サーファクタント乾燥粉末製剤は、可変速度式ミクスチヤー又は超音波発生装置内で適切な生理的な濃度の 1価又は 2価金属塩、例えば 0. 9 %塩化ナトリウム若しくは 1. 5 mM塩化カルシウム又はそれらを含有する生理的な緩衝液を用いて均一に懸濁分散させて使用することができる。

次に、このようにして製造された本発明サーファクタン卜の表面活性、懸濁性及び薬理学的性質について詳述する。

[表面活性]

①表面張力低下作用

表面張力低下作用の測定を田中等の方法（日本界面医学会雑誌、第 1 3 卷、第 2号、第 8 7頁、 1 9 8 2年）に準じて行った。

本発明サーファクタント懸濁液を生理食塩水（表面積； 54. 0 cm²) 上に、 1 c m²あたり本発明サーファクタントが 1. 0〜2. 0 / gとなるように滴下し、該表面積を 54. 0〜2 1. 6 c m²の範囲内で 2〜 5 分かけて圧縮 ·拡張した際の表面張力をウイルヘルミ一表面張力測定装置（協和界面科学株式会社製）により、 37 °Cで連続的に測定した。本発明サーファクタン卜の表面張力低下作用は、.最大表面張力が 29.

7〜3 4. 5 d y n eノ c m、最小表面張力が 1. 4〜8. 9 d y n e Z cmであり、生理食塩水の表面張力を低下させることが認められた。同様にして測定した S F— 3の表面張力低下作用は、最大表面張力が 25. 8〜50. 3 dyn e/cm、最小表醒力が 1. 0〜13. 5 d y n e / c mであつ'た o

なお 37 °Cにおける生理食塩水の当初の表面張力は 70. 5 d y n e

/ c m めった o

②気液面拡散作用

生理食塩氷の液面に、表面積 l cm²あたり 0. 8〜 1. 5 gの本発明サーファクタント懸濁液を滴下し、滴下直後からの表面張力を垂直板法により経時的に測定した。測定温度は 37°Cであった。

なお、到達時間とは、試料の滴下直後から表面張力が一定値にまでに要する時間をいい、平衡表面張力とはその時の値をいう。

本発明サーファクタントは 3ひ〜 65秒という短時間で気液面に膜を形成し、表面張力を 27. 9〜34. 8 d y n eZ cmにまで低下させた。

同様にして測定した S F— 3の気液面拡散作用は、 1 2 0秒経過後の表面張力が 3 8. 1—5 2. 9 d y n eZcmであった。

③気液面吸着作用

lm lあたり 0. 2〜1. Omgの本発明サーファクタントを含有する 3 7 °Cの生理食塩水懸濁液を調製し、懸濁された本発明サ一ファクタントの生理食塩水気液面への吸着速度を測定した。

吸着速度の測定はキングらの方法（American Journal of Physiology ，第 223卷、第 7 1 5頁、 1 9 72年）に従った。

すなわち、懸濁液を生理食塩水の入っている直径 5 c mのテフ口ン水槽の底に注入後、マグネティックスターラーでゆつくり攪拌し、攪拌を停止した後の表面張力の変動値より吸着速度を求めた。本発明サーファクタントは、攪拌を停止してから 3 0〜 1 2 0秒経過後に、表面張力を 28. ：!〜 39. 5 d y n eノ c mの範囲に低下させ、その後、一定値を示した。

これは懸濁状態にある本発明サーファクタントが 3 0〜 1 2 0秒で気液面に浮上吸着し、強い表面活性をもつ膜を形成したことを示している。同様にして測定した S F— 3は、表面張力が 42. 2〜58. 3 d y n e Zc mの範囲で一定値を示し、その所要時間は 1 5 0秒以上であった。

このことは S F— 3の気液面吸着作用が本発明サーファクタントよりも弱いことを示し、本発明サーファクタン卜が強力な表面吸着促進力をもつことを示している。

[懸濁性]

肺サーファクタトの懸濁性試験を、特開昭 6 3 - 1 0 7 1 8公報の方法に準じて行った。

すなわち、懸濁開始後所定時間ごとの分散率及び懸濁開始後 2分経過時の最大分散粒子径により、懸濁性を判定した。

分散率の試験は、 2 0m l容バイアルに肺サーファクタント 6 0mg を分取し、生理食塩水 2m 1を注入し、当該バイアルをイワキ KMシエーカー V— S型振盪器（イワキ株式会社製）に装着して 2 7 0ストローク /分で振盪し、振盪開始 3 0秒後、 1分以降 ·4分まで 1分ごとに、更に 4分以降 1 0分までは 2分ごとに各試料の分散状態を容器の外からルーぺを通して肉眼で観察することにより行った。

懸濁状態の判定は、各時間ごとに各試料 1 0本ずつ 2人で行い、懸濁したか否かの判断は容器内に小塊を全く認めず、製剤が生理食塩水中に均一に分散して白色のやや粘稠性の懸濁液が形成されたか否かで行った。分散率は各人が各時間ごとに懸濁が完了した試料の全本数（ 1 0本）に対する百分率を求め、これの 2人による平均値で表示した。最大分散粒子径は各試料を 20 m I容バイアルに肺サーファクタント 6 Omgを分取し、生理食塩水 2mlを注入し、上述と同一の振盪条件で 2分間連続して振盪し、懸濁液中の最大粒子を顕微鏡を用いて探し出し、その直径をノギスで測定することにより求めた。

本発明サーファクタントは、いずれも大部分が 2分以内に懸濁し、しかもその最大粒子径は 0. 9mm以下であり、懸濁性が良好であった。

[薬理学的性質]

①急性毒性

5週令の雄性 I CR系マウス及びゥィスター系ラットを用いて本発明サーファクタントの急性毒性を試験した。マウスでの経口 LD₅。及び腹腔内 LD₅。は、 2. 5—10. 0 /¾：及び1. 5〜5. O gZkgであり、ラットでのそれらは 1. 5〜5. 0 ノ1£ 及び1. 5〜2. 5 g Z k gであった。

②亜急性毒性

毎日 3ひ 0〜600 mgZk gずつ 1月間、本発明サーファクタントをウィスター系成熟ラッ卜に腹腔内投与したが、体重の変化及び主要臓器の肉眼的、組織学的観察における異常は認められなかった。

③肺胞腔容量維持作用

在胎期間 27日の兎未熟胎仔は肺サーファクタントを殆ど産生せず、肺サーファクタント欠乏状態にあることから、新生児呼吸窮迫症候群のモデル動物とされている。

この在胎期間 27曰の兎胎仔 5匹を用いて、気道内圧の増減下における肺胞腔容量（以下、肺容量という。）を 37°Cで測定した。

測定は胎仔の頸部を切開し、気管に接続させた水マノメーターを用いて、本発明サ一ファクタントを経気道的に投与した 5分後から連続的に行われた。気管内圧を、気管に接続させた 2チャンネル独立駆動シリンジポンプ N o. 9 40 (米国ハーバード社製）を用いて 30 cm水圧まで加圧し、肺胞を拡張した。次いで、気道内圧を 0 cm水圧まで減圧し肺胞を収縮させ、各水圧における肺容量を測定した。肺容量は体重 1 k g あたりのミリリットル（m 1 Zk g) で表示した。

本発明サーファクタントの投与はその濃度が 1. 0〜6. 0 % (W/

V) になるように調製した生理食塩水懸濁液 0. 0 5〜0. 5m lを気道内に直接注入する方法で行った。

機能的残気量を示す減圧時の 5 c m水圧の肺容量が大きいほど肺サーファクタント活性が高いことを意味する。

対照として、本発明サーファクタント懸濁液に代えて生理食塩水を投した。対照群では、在胎期間 2 7曰の兎未熟胎仔の肺容量（5 c m水圧）は 1〜5m 1 /k gで、肺胞が殆ど拡張していなかった。

また、正常レベルの肺サーファクタントを有する在胎 3 0曰の瀹期胎仔は、肺容量（5 c m水圧）が 3 9〜53 m 1 / k gであり、肺胞が十分に拡張しており、正常な呼吸を営むことが可能であることを示す。一 S F - 3を投与した場合には、未熟胎仔の肺容量（ 5 c m水圧）が 1 5〜2 5m 1 /k g と肺胞の拡張が不十分であった。

本発明サーファクタントを投与した未熟胎仔の肺容量（5 c m水圧）は 3 5〜53 m 1 Zk gを示し、本発明サーファクタントが未熟胎仔の肺容量を正常レベルまで改善することが認められた。

以上のように、本合成ペプチドは、脂質混合物の表面活性を強力に賦活する作用を有し、本合成べプチドと脂質混合物からなる本発明サ一ファクタントは、表面活性、懸濁性及び薬理学的な性質から有効な呼吸窮迫症候群治療剤であるといえる。

本発明により提供される呼吸窮迫症候群治療剤.は 1回投与量として、小児用には、 5 0〜 1 0 0 0mg、成人用には 5 0 0〜5 0 0 0mgの本発明サーファクタントを含有する。この用量を水、生理食塩液又は生理的に許容される緩衝液等に懸濁し、濃度が 1. 0〜1 0. ひ％ (WZ V) になるように調整し、これを呼吸障害発現直後から 48時間に気道内に 1〜1 0回注入又は噴霧することにより使用する。そのほか、懸濁させることなく、そのまま粉末剤として直接、吸入させることもできる。用量、使用法及び回数は患者の症状及び併用療法に応じて適宜変更しても良い。

本発明治療剤には必要に応じて安定剤、保存剤、等張化剤、緩衝剤、懸濁化剤等の医薬品添加物又は気管支拡張剤、抗アレルギー剤、制癌剤、抗菌剤等の医薬品を含有させることができる。

剤型は液剤又は用時に懸濁して用いる粉末剤が適当である。本発明治療剤はバィァル瓶又はアンプル瓶等の密封容器内に充填され、無菌製剤として保存される。

以下に、本発明を実施例をもって説明する。

[ぺプチドの製造]

(実施例 1)

配列番号 1記載のペプチド（以下、「ペプチド A」という。）をァセルトン（E. Atherton) 及びシヱパード（R. C. Sheppard) 著「ソリドフェイスぺプナ卜シン "インス. (Solid phase peptide synthesis - a practical approach ) 」て p. 25〜 189， 1989， Oxford University Press, Oxford] 及び KenicM, Akagi et al. [Chem. Pharm. Bull. , 37 ( 1 0) ， p. 2 66 1〜 2664 (1 9 89) ] に記載の方法を参考に、マルチべプチド固相合成システム「コックさん」（商品名；国産化 - 学株式会社製）により固相合成した。

初発の樹脂として、 N— α— 9一フルォレニルメチルォキシカルボ二ルーロイシン（Fmo c - L e u ) を [4一（ヒドロォキシメチル）フエノキシメチルーコポリ（スチレン 1 %ジビニルベンゼン） ] 樹脂に結合させた N— «— 9一フルォレニルメチルォキシカルボ二ルー口イシン— 0—樹脂（Fmo c— L e u— 0—樹脂） 0. 2 0mmo lノ 0. 5 gを使用した。その樹脂を N， N—ジメチルホルムアミド（DMF) で 2 0分間膨潤させた後、 DMFで 4回樹脂を洗浄した。 2 0 %ピペリジン一 DMF溶液を加え振盪し脱保護を行った。この脱保護を完全に行うためにこの操作を 3回繰り返した。次いで、樹脂中の過剰のピベリジンを除去するため DMFで 3回、 N—メチルー 2—ピロリドンで 3回、更に、 DMFで 3回洗浄した。この際、ピぺリジンの有無の確認を p H 試験紙で行った。 ―

その後、 DMF 6m l、 Fmo c— L e u O. 5 mm o 1、 N—ヒドロキシベンゾトリアゾール 0. 5 mm 0 1及び N， N ' —ジイソプロピルカルポジイミド 0. 5 mm 0 1を加え 9 0分間振盪し縮合反応を行つた。次いで、 DMFで 4回樹脂を洗浄し、過剰の試薬を除去した。この縮合反応の確認は、ニンヒドリン法によるカイザーテストで行った。

このようにして合成計画に従い、順次ァミノ酸を樹脂上で N末端方向に延長し、 N末端及び官能基を完全に保護したぺプチドー 0—樹脂を合成した。、なお、 A r g、 L y s、 H i s . P r o、 C y sの導入時の縮合反応は、 1 2 0分で 2回行った。その後、保護したペプチド一 0—樹脂に 2 0 %ピペリジン一 DM F溶液加え N末端の Fmo c保護基の脱保護を行い、このペプチド一 0—樹脂を DMFで 6回、メタノールで 6回洗浄し、減圧乾燥した。その乾燥したぺプチドー 0—樹脂（ 1 0 Omg) に氷冷下で攪拌しながら、 m—クレゾール（ 0. 2m l ) 、 1 , 2—ェタンジチオール（0. 5m 1 ) 、チオア二ソール（ 1. 2m l ) 、 T FA (7. 5 m 1 ) 及びトリメチルシリルブロマイド（ 1. 4m l ) を加えた後、 12ひ分間氷冷下で攪拌し、官能性側鎖の脱保護とともにべプチドを樹脂から切り出し、グラスフィルター（G3) で濾過した。この濾過波をエバポレイタ一により約 5 m 1にまで減圧濃縮し、ジェチルェ一テルを加えてぺプチドを沈殿させた。このペプチド沈殿物をグラスフィルター（G3) で濾取し、ジェチルエーテルで 5回洗浄した後、減圧乾燥して粗製のペプチド Aを 55 mg取得した。

なお、すべてのアミノ酸の N末端のアミノ基は、 Fmo c基で保護し、官能性側鎖を以下の基により保護した。

A r g--M t r ； (4ーメトキシー 2、 3、 6—トリメチルベンゼンスルホニル） .

L y s - B o c ； ( t—ブチルォキシカルボ二ル） .

C y s -T r t ； (トリチル） .

H I s -T r t ； (トリチル） .

この粗製ペプチド約 7 mgを 0. 6m 1の TF Aに溶解した。さらに、同溶液にクロ口ホルム—メタノール（CZM) [2 ： 1, (VXV) ] を添加し、最終的に 3. 0 mlとした。同試料を CZM混合溶媒 [2 ： 1, (VZV) ] で平衡化したセフアデクス LH— 60カラム（ø 2. 5 cmX 90 cm) により精製し、ぺプチド Aを採取した。

溶出液 Φのべプチドの存在は、 245 nm (分光光度計；日本分光株式会社モデル 870 -UV) 及び示差屈折計（島津製作所株式会社；モデル R I D— 6 A) でモニターした。

(実施例 2)

配列番号 2記載のペプチド（ペプチド B) を「ザ ·ペプチド（The Peptides) 〔グロス（Gross, E.) 及びマイネンホーフ（Meinenhofe, J.) 編、バラニー（Barany, G. ) 及びメリフィールド (Merrif ierd, R) 著、第 2卷第 1〜 284頁、アカデミックプレス、ニューヨーク、 1980年）〕」に記載の方法に従い、固相合成法によりフユニルァセトアミドメチル（PAM) 樹脂上で合成した。

C末端ァミノ酸残基のロイシンを t一ブチルォキシカルボ二ルー口ィシン（B o c— L e u) とし、ォキシメチルフヱニルァセトアミド結合を介して P AM樹脂に結合させた。 C末端結合後 B 0 c— L e u— P AM 樹脂（0. 7 0mo l /g、 0. 3 5 g) をべプチド合成装置（モデル 9 9 0 E、べックマン社製）の反応容器に移した。保護処理を施したァミノ酸を予め形成した対称無水物法により樹脂上で N末端方向に延長し、完全に保護したペプチド一 0—樹脂を合成した。但し、アルギニンの縮合に際しては、 N, N—ジシクロへキシルカルポジイミド（DC C) /ヒドロキシベンゾトリアゾール [コニー等、 Chem. Ber.， 1 03, 788 - 7 9 8 ( 1 9 7 0) ] を用いてダブル力ップリングした。、なお、すべてのアミノ酸の N末端のアミノ基は、 B o c 基で保護し、官能性側鎖を以下の基により保護した。

A r g - T o s ； (トシル） .

L y s— 2 C L Z ; ( 2—クロ口べンジルォキシカルボ二ル） .

C y s - 4M e B z l ； (4ーメチルベンジル） .

H i s - T 0 s ； (トシル） .

この縮合反応の確認はニン七ドリン法によるカイザーテス卜で行つた。

完全に保護したぺプチドー 0—樹脂（ 1 5 5mg) を塩化メチレン中で 5分間膨潤させた。 N— a— B 0 c保護基を 1 % (v/v) インドール及び 0. 1 % (v/v) エタンジチオールを含有する T F Aを用いて脱保護した。次いで、この脱保護したペプチド— 0—樹脂を、 p—クレゾール（1ml) 、 p、ーチォクレゾール（0. 2 g) 及び DM SO ( Lm 1 ) を添加した無水フッ化水素（H F) ( 1 1 m 1 ) で、 0°Cにて 6 0分間処理し、ペプチドを樹脂から切り出した。

HF及び DMS 0を真空下、 0°Cにて留去した。この切り出したぺプチド及び樹脂を 1 5m lの冷ジェチルエーテルで 3回洗浄し、次いで遊離のぺプチドを冷 T F Aの 1 0 m 1洗浄液で 3回洗浄することにより抽出した。この抽出液を直ちに濾過し、氷冷水（ 12 Om 1〜 150 m 1 ) に加えて粗製のペプチド Bを沈澱させた。次いで、この粗製のペプチド Bを 1 000 X g, 0°Cにて 30分間遠心分離し沈澱物として回収した。この沈澱物をジェチルエーテル（1 5ml ) で洗浄した。この洗浄工程を、更にジェチルエーテル、酢酸ェチル、蒸留水を用いて繰り返し行いペプチド Bを 83 mg得た。

得られたぺプチド Bを 50 %DMSひ水溶液に溶解し、 //—ボンダスフェアー、 C 8— 300カラムにょる逆栢系高速液体クロマトグラフィーで精製した。

溶離液としては、ひ. 1 %T F Aを含む 5 0 %ァセトニトリル水溶液を用い 5分間溶出した。次いで、同溶離液と 0. 1 %TFAを含む 8 0 %ァセトニトリル水溶液による直線的な濃度勾配により 3 0分間溶出し溶出液中のぺプチドの存在は、 245 nm (分光光度計；日本分光株式会社モデル 87 0— UV) および示差屈折計（島津製作所株式会社モデル R I D— 6 A) でモニターした。

(実施例 3)

配列番号 3のペプチド（ペプチド C) を（実施例 1 ) と同様の方法で調製した。

- (実施例 4)

配列番号 4のペプチド（ペプチド D) を（実施例 1) と同様の方法で調製した。 (実施例 5 )

配列番号 5のペプチド（ペプチド E) を（実施例 1) と同様の方法で調製した。

(実施例 6)

配列番号 6のペプチド（ペプチド F) を（実施例 1) と同様の方法で調製した。

(実施例 7)

配列番号 7のペプチド（ペプチド G) を（実施例 1 ) と同様の方法で調製した。

(実施例 8)

配列番号 8のペプチド（ペプチド H) を（実施例 1) と同様の方法で調製した。

(実施例 9)

配列番号 9のペプチド（ペプチド I) を（実施例 1) と同様の方法で調製した。

(実施例 1 0)

配列番号 1 0のべプチド（ぺプチド J ) を（実施例 1 ) と同様の方法で調製した。

[ぺプチドのァミノ酸組成]

本発明合成べプチドを 5% ( v/v) フニノールを含む 1 2規定塩酸 ZT F A 〔2 ： 1 (V/V) 〕で、真空下、 1 50 °Cにて 2、 4、 6、 1 2、 24、 48及び 72時間酸加水分解し、酸を除いた後に、加水分解生成物を島津アミノ酸自動分析システム（LC一 9A) により分析した。 2〜72時間加水分解において、より高い回収率を示したアミノ酸値を採用し、アミノ酸組成値を算出した。

[ぺプチドの分子量] 本発明合成ペプチドの分子量を高速原子衝撃法（FABMS) により測定した。質量分析計には、 JMS— S 1 0 2 A型（日本電子株式会社' 製）を使用し、イオン源はセシウムガン（1 0 K e V) を用いた。

得られたペプチドのアミノ酸組成及び質量分折の結果を〔表 1〕に示す。

表 1 本発明合成べプチドのァミノ酸組成値及び分子量

(表中の値は、 Gly を 1. 0とした時の各アミノ酸組成値を示す。）〔本発明サーファクタントの製造〕

本発明サーファクタントを、本合成ペプチドと脂質成分として 1 , 2 —ジパルミトイルグリセロー（3) —ホスホコリン、 1， 2—ジァシル一 s n—グリセ口— （ 3 ) —ホスホー s n—グリセロ一ル及びパルミチン酸の 3成分とを、混合して調製した。

(実施例 1 1)

無菌処理したし 2—ジバルミトイルグリセロー（ 3 ) —ホスホコリン 6 6 0 m g、 I , 2—ジァシル一 s II—グリセロー（ 3 ) —ホスホー s n—グリセロール（ァシル基の炭素数 14〜 24個：シグマ社製） 22 Orag 及びバルミチン酸 l O Omgを常温でク口口ホルム一メタノール混合液、〔2 : 1 (VZV) 〕 1 0 00 Hi Iに溶解し、ペプチド Aの 1 2mgを TFAO. 5mlに溶解した。これらの溶液を混合し、減圧乾固した。得られた残留物を 40°Cで I 5分間かけて水一エタノール混合液〔9 ： 1 (V V) ] 1 0 0m lに懸濁した。この懸濁液を一 5 0。Cで凍結させて真空度 8 5〜1 0 0 iH gで 3 6時間乾燥し、サーファクタント ¾ 22 m gを白色粉末として得た。

この粉末中にエタノールの残存は認められず、サーファクタン卜の総重量に対する各成分の含量は、 1， 2—ジパルミトイルグリセロー（3) 一ホスホコリンは 6 4. 6 % (w/w) . 1， 2—ジァシルー s n—グリセロー（3) —ホスホー s n—グリセロールは 2 1. 5% (w/w) 、及びパルミチン酸は 9. 8 % ( /w) 、ペプチド Aは 1. 2 % (w/ w) 及び水 2. 9 % ( /w) であった。

得られたサーファクタントの各作用は次のとおりであった。

表面張力低下作用：

最大表面張力； 3 2. 8 dyn e/cm

最小表面張力； 2. 2 d y n e/cm 気液界面拡散作用：

到達時間； 40秒、平衡表面張力； 29. 8 d y n e/ c m 気液面吸着作用：

到達時間； 6 0秒、平衡表面張力； 3 1. 9 d y n eZc m 肺胞腔容量維持作用：

肺容量（ 5 c m水圧）； 5 1 m 1 /k g

(実施例 1 2)

1 , 2—ジパルミトイルグリセ口— （ 3 ) —ホスホコリン 204 m g、 1 , 2—ジァシルー s η—グリセロー（ 3 ) —ホスホー s η—グリセロール（ァシル基の炭素数 1 4〜 2 4個：シグマ社製） 6 3. Omg及びパルミチン酸 27. Omgをクロ口ホルム—メタノール混合液〔2 ： 1 (V /V) ) 30 Om 1に溶解し、ペプチド Bの 2. 8mgを TFAO. 3m l に溶解した。これらの溶液を混合し、減圧乾固した。得られた残留物を 45 °Cで 20分間かけて水一エタノール混合液〔9 ： 1 (V/V) 〕 100ml に懸濁した。この懸濁液を— 6 0 °Cで凍結させて真空度 6 0〜 1 1 0〃 H gで 4 0時間乾燥し、白色粉末のサーファクタントを 3 0 1. 9 m g 得た。

この粉末中にエタノールの残存は認められず、サーファクタン卜の総重量に対する各成分の含量は、 1 , 2—ジパルミトイルグリセ口— （3) —ホスホコリンは 6 7. 6 % (w/w) 、 1 , 2—ジァシルー s n—グリセロー（3) -ホスホー s n—グリセロールは 20. 9 % (w/w) 、及びパルミチン酸は 8. 9 % (w/w) 、ペプチド Bは 0. 9 % (w/ w) 及び水 1. 7 % (w/w) であった。

得られたサーファクタン卜の各作用は次のとおりであった。

表面張力低下作用：

最大表面張力； 3 4. 5 d y n e/cm 最小表面張力； 6. 7 d y n e / cm

気液界面拡散作用：

到達時間； 6 0秒平衡表面張力； 3 1. 2 d yn e/cm 気液面吸着作用：

到達時間； 1 20秒平衡表面張力； 34. 7 d y n e / c m 肺胞腔容量維持作用：

肺容量（5 cm水圧） 49 m 1 / k g- (実施例 1 3)

ペプチド Bの代わりにペプチド Cを用いた以外は（実施例 1 2) と同様にしてサーファクタントを製造した。

この粉末中にエタノールの残存は認められず、サーファタタントの総重量に対する各成分の含量は、 l_r 2—ジパルミトイルグリセロー（3) 一ホスホコリンは 6 7. 0 % (w/w) , 1， 2—ジァシルー s n—グリセロー（3) —ホスホ— s n—グリセロールは 20. 7 % (w/w) 、及びパルミチン酸は 8. 9 % (wZw) 、ペプチド Cは 0. 9 % (w/ w) 及び水 2. 5 % iw/w) であった。

表面張力低下作用：

最大表面張力； 29. 7 d yn e/cm

最小表面張力； 2. 3 d yn e/ cm

気液界面拡散作用：

到達時間； 3 0秒平衡表面張力； 27. 9 d yn e/cm 気波面吸着作用：

到達時間； 3 0秒平銜表面張力； 2 &. l dyn eZcm 肺胞腔容量維持作用：

肺容量（ 5 c m水圧) 5 3 m 1 /k g- (実施例 1 4 )

ペプチド Bの代わりにペプチド Dを用いた以外は（実施例 1 2 ) と同様にしてサーファクタントを製造した。

この粉末中にエタノールの残存は認められず、サーファクタントの総重量に対する各成分の含量は、 1 , 2—ジパルミトイルグリセロー（3 ) —ホスホコリンは 6 8. 5 % (w/w) 、 1 , 2 —ジァシルー s n—グリセロー（3) —ホスホー s n—グリセロールは 2 1. 2 % (w/w) 、及びパルミチン酸は 9. 1 % (w/w) 、ペプチド Dは 0. 9 % (w/ w) 及び水 0 · 3 % (w/w) であった。

表面張力低下作用：

最大表面張力； 3 0. 8 d y n e / c m

最小表面張力； 5. 4 d y n e / c m

気液界面拡散作用：

到達時間： 4 5秒平衡表面張力； 2 8. 3 d v n e / c m 気液面吸着作用：

到達時間； 4 0秒平衡表面張力； 3 0. 7 d y n e / c m 肺胞腔容量維持作用：

肺容量（5 c m水圧） 4 9 m 1 / k g

(実施例 1 5 )

ペプチド Bの代わりにペプチド Eを用いた以外は（実施例 1 2 ) と同様にしてサーファクタントを製造した。

この粉末中にエタノールの残存は認められず、サーファクタントの総重量に対する各成分の含量は、 1 , 2—ジパルミトイルグリセロー（3) —ホスホコリンは 6 7. 8 % (w/w) , 1 , 2 —ジァシルー s n—グリセ口— （3 ) —ホスホー s n—グリセロールは 2 0. 9 % (w/w) 、及びパルミチン酸は 9. 0 % (w/w) 、ペプチド Eは 0. 9 % ( / ) 及び水 1. 4 % (w/w) であった。

表面張力低下作用：

最大表面張力； 3 0. 3 d y n e / c m

最小表面張力； 1. d yn eX c m

気液界面拡散作用：

到達時間； 6 0秒平衡表面張力； 2 9. 8 d y n e / c m 気液面吸着作甩：

到達時間； 9 0秒平衡表面張力； 3 2 d y n e / c m 肺胞腔容量維持作用：

肺容量（5 cm水圧） 4 7 m 1 /k g

(実施例 1 6 )

ペプチド Bの代わりにペプチド Fを用いた以外は（実施例 1 2) と同様にしてサーファクタントを製造した。

この粉末中にエタノールの残存は認められず、サーファクタン卜の総重量に対する各成分の含量は、 1， 2—ジパルミトイルグリセロー（3) —ホスホコリンは 6 8. 5 % (w w) . 1 , 2 —ジァシル一 s n—グリセロー（3) —ホスホー s n—グリセロールは 2 1 · 1 % (w/w) 、及びバルミチン酸は 9. 1 % (w/w) 、ペプチド Fは 0. 9 % ( / w) 及び水 0. 4 % (wZw) であった。

表面張力低下作用：

最大表面張力； 3 4. 1 d yn e / cm

最小表面張ガ； 8. 9 d y n e / c m 一気液界面拡散作用：到達時間； 6 5秒、平衡表面張力； 3 4. 8 d y n e / c m 気液面吸着作用：

到達時間； 1 1 5秒、平衡表面張力； 3 9. 5 d y n e /c m 肺胞腔容量維持作用：

肺容量（5 cm水圧）； 3 9 m l /k g

(実施例 1 7)

1 , 2—ジパルミトイルグリセ口— （ 3 ) —ホスホコリン 2 1 0 m g、 1 , 2—ジァシルー s η—グリセロー（ 3 ) —ホスホー s η—グリセ口一ル（ァシル基の炭素数 1 4〜 2 4個：シグマ社製） 9 0. Omg及びパルミチン酸 33. Omgをクロ口ホルム—メタノール混合液〔3 ： 1 (V /V) ] 40 Om 1に溶解し、ペプチド Dの 3. Omgを TFAO. 5m l に溶解した。これらの溶液を混合し、減圧乾固した。得られた残留物を 50°Cで 15分間かけて水一エタノール混合液〔9 : 1 (V/V) 〕 120ml に懸濁した。この懸濁液を一 6 O^eCで凍結させて真空度 5 0〜 1 0 0 H gで 2 8時間乾燥し、白色粉末のサーファクタントを 3 3 7. 9 m g た。

この粉末中にエタノールの残存は認められず、サーファクタントの総 ― 重量に対する各成分の含量は、 1， 2—ジパルミトイルグリセロー（3) —ホスホコリンは 6 2. 1 % (w/w) 、 1， 2—ジァシル— s n—グリセロー（3) —ホスホー s n—グリセロールは 26. 6 % (w/w) 、及びパルミチン酸は 9. 8 % (w/w) 、ペプチド Gは 0. 9 % (w/ w) 及び水 0. 6 % (w/w) であった。

表面張力低下作用：

最大表面張力； 2 9. 6 d y n eZcm ― 最小表面張力； 1. 8 d y n e /c m 気液界面拡散作用：

到達時間； 45秒平衡表面張力； 29. 1 d y n e/cm 気液面吸着作用：

到達時間； 80秒平街表面張力； 3 2. 3 d y n e c m 肺胞腔容量維持作用：

肺容量（5 cm水圧） 48 m I / k g

(実施例 1 8)

ペプチド Gの代わりにペプチド Hを用いた以外は（実施例 1 7) と同様にしてサーファクタントを製造した。

この粉末中にエタノールの残存は認められず、サーファタタントの総重量に対する各成分の含量は、 1， 2—ジパルミトイルグリセ口— （3) 一ホスホコリンは 6 1. 9 % ( /w) 、 1 , 2—ジァシルー s n—グリセロー（ 3 ) —ホスホ— s n—グリセ口ールは 26. 5 % (w/w) 、及びパルミチン酸は 9. 7 % Cw/w) 、ペプチド Hは 0. 9 % (w/ w) 及び水 0. 9 % (w/w) であった。

表面張力低下作用：

最大表 ¾張力 3 2. 4 d yn e/ cm

最小表面張力 1. 3 d y n e / cm

気液界面拡散作甩

到達時間： 6 秒平衡表面張力； 33. 1 d yn e/ cm 気液面吸着作用：

到達時間； 9 0秒平衡表面張力； 34. 6 d y n e X c m 肺胞腔容量維持作用：

肺容量（ 5 c m水圧） 4 1 ni 1 / k g

(実施例 1 9 ) ぺプチド Gの代わりにべプチド I を用いた以外は（実施例 1 7 ) と同様にしてサーファクタントを製造した。

この粉末中にエタノールの残存は認められず、サーファクタントの総重量に対する各成分の含量は、 1， 2—ジパルミトイルグリセロー（3 ) —ホスホコリンは 6 1 . 6 % (w/w) . 1 , 2 —ジァシルー s n—グリセロー（3) —ホスホ— s n—グリセロールは 2 6. 4 % (w/w) 、及びパルミチン酸は 9. 7 %ズ w/w) 、ペプチド I は 0. 9 % (wZ w) 及び水 1. 4 % (w/w) であった。

表面張力低下作用：

最大表張力； 3 2. 3 d y n e / c m

最小表面張力； 5. e d y n e / c m

気液界面拡散作用：

到達時間； 5 5秒平衡表面張力； 2 9. Q d y n e / c m 気液面吸着作用：

到達時間； 7 0秒平衡表面張力； 3 1 . 7 d y n e / c m 肺胞腔容量維持作用：

肺容量（5 c m水圧） 4 3 m 1 / k g

(実施例 2 0 )

ぺプチド Gの代わりにべプチド Jを用いた以外は（実施例 1 7 ) と同様にしてサーファクタントを製造した。

この粉末中にエタノールの残存は認められず、サーファクタントの総重量に対する各成分の含量は、 1 , 2 -ジパルミトイルグリセロー（3 ) 一ホスホコリンは 6 1. 5 % (w/w) , 1， 2 —ジァシルー s n—グリセロー（3) —ホスホー s n—グリセロールは 2 6. 4 % (w/w) 、及びパルミチン酸は 9. 7 % (w/w) 、ペプチド Jは 0. 9 % (w/ ) 及び水 1. 6 % ( / ) であった。

得られたサーファクタン卜の各作用は次のとおりであった < 表面張力低下作用

最大表 ¾力 3 3 9 d y n eノ c m

最小表面張力 4 / d yn e/ c m

気液界面拡散作用

到達時間； 6 5秒平衡表面張力； 3 2. 9 d yn e/ c m 気液面吸着作用：

到達時間； 1 1 5秒平衡表面張力； 3 4. 2 d yn e/cm 肺胞腔容量維持作用：

肺容量（5 cm水圧） 40 m 1 / k g

本発明サーファクタントの懸濁性試験の結果を〔表 2〕に示す ₍

表 2 本発明サーファクタン卜の懸濁性

Claims

配列表配列番号： 1

配列の長さ： 27

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu lie Val Val Val Yal Val Val 1 5 10 15

Leu lie Val Val Val He Val Gl Ala Leu Leu

20 25

配列番号： 2

配列の長さ： 27

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu lie Val Val Val Val Val

1 5 10 15

Val Leu He Yal Val Val He Val Gly Ala Leu

20 25 配列番号： 3

配列の長さ： 2 7

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列

Cys Pro Val Asn lie Lys Arg Leu Leu lie Val Val Val Val Val Val

1 5 10 15

Leu Leu Val Val Val lie Val Gly Ala Leu Leu

20 25 配列番号： 4

配列の長さ： 2 7 - 配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Cys Cys Pro Val Asn lie Lys Arg Leu Leu lie Val Val Val Val Val 1 5 10 15 Val Leu Leu Val Val Val lie Val Gly Ala Leu

20 一 25 配列番号： 5

配列の長さ： 2 7

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

配列

Cys Pro Val Asn Leu Lys Arg Le Leu Val Val Val Val Val Val Val ,

1 5 10 15

Leu Val Val Val Val lie Val Gly Ala Leu Leu

20 25

配列番号： 6

配列の長さ： 2 7

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列

Cys Cys Pro Yal Asn Leu Lys Arg Leu Leu Val Val Val Val Yal Val

1 5 10 15

Val Leu Yal Val Val Val lie Val Gly Ala Leu

20 25

配列番号 r 7

配列の長さ： 2 7

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列 Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu lie Val Val Val Val Val Val

1 5 10 15

Leu lie Val Val Val lie Val Gly Ala Leu Leu

20 25 配列番号： 8

配列の長さ： 2 7

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu lie Val Val Val Val Val

1 5 10 15

Val Leu lie Val Val Val lie Val Gly Ala Leu

20 25 配列番号： 9

配列の長さ： 27

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Ala Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu lie Val Val Val Val Val Val 1 5 10 15 Leu lie Val Val Val lie Val Gly Ala Leu Leu

20 25 配列番号： 1 0

配列の長さ： 27 < 配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Ala Ala Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu He Val Val Val Val Val

1 5 10 15

Val Leu lie Val Val Val lie Val Gly Ala Leu

20 25