WO1993020194A1

WO1993020194A1 - Analogue d'activateur tissulaire du plasminogene

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Publication number: WO1993020194A1
Application number: PCT/JP1992/000415
Authority: WO
Inventors: Hideshi Sato; Sene Takahashi; Takaharu Negoro; Yoshiaki Sudo; Hideo Agui
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 1992-04-03
Filing date: 1992-04-03
Publication date: 1993-10-14
Anticipated expiration: 1994-10-03

Description

明 4m

細 t — P A類似体技術分野

本発明は、新規な t — P A類似体に関する。更に詳しくは、組織プラスミノーゲン活性化因子（以下、 t — P A ) のアミノ酸配列中、天然 t 一 P Aの 2 7 6 位から 3 0 6 位に相当するアミノ酸配列の少なくとも一部が、尿プラスミノ一ゲン活性化因子（以下、 U K ) の対応アミノ酸配列に置き換えられることにより、フイブリン特異性が向上した新規な t 一 P A類似体に関するものである背景技術

t — P Aは、不活性型酵素前駆体であるプラスミノ一ゲンを活性型酵素であるプラスミンに変換することにより、血管内に生じた血栓を分解することが知られている U Kゃストレブトキナ一ゼなどの既存の血栓溶解剤がフイブリン特異性を全く有していないのに対し、 t 一 P Aは比較的高いフイブリン特異性を有している。このためフイブリン、ひいては血栓を特異的に溶解する性質を有し、そして出血等の副作用の少ない血栓溶解剤として注目されてきた。しかしながら、実際 t 一 P Aを臨床に用いた場合、閉塞冠動脈の再開通には予想されていたよりも遙かに多量の投与量が必要であることが明らかとなつた。例えば冠状動脈の再開通のためには患者あたり 1 0 0 〜 1 5 O mgという多量の投与量が必要であるとも言われている（文献 1 ) 。現実には患者当たり 1 0 0 mg程度以下の量で用いられているが、それにしてもこの大量投与の結果、 t — P Aはフイブリン特異的であるとはいえ若干は血液中のフイブリノーゲンをも分解してしまうため、結局全身性の出血傾向が生じてしまうことが今もつて無視できない問題である。この様な観点から、より高い血栓特異性の付与を目的とした t 一 P A改変体の作製も行われ、多数の報告（文献 2〜 1 2 ) がなされているが、未だ目的を充分に達成したも .のは数少ない。成功例としては文献 6 において、天然 t — P Aの 2 9 6 位から 2 9 9 位までの 4個のアミノ酸をすベてァラニンに置換することにより血栓特異性が向上した t 一 P A改変体を作製しているが、その効果はフィブリン特異性がせいせい 4 . 4 倍、血漿塊特異性が 3 倍程度である。発明の開示

本発明は、フイブリン特異性が向上した新規な t — P A類似体を提供するものである。さらに詳しくは、フィプリノ一ゲン存在下ではプラスミノ一ゲン活性化活性が非常に低いが、フィブリン存在下では天然の t — P Aに近いあるいはより高いプラスミノ一ゲン活性化活性を発現し、それゆえフイブリン特異性が向上した新規な t — P A類似体を提供するものである。本発明の t — P A類似体は、血液中を循環している時はプラスミノーゲンの活性化およびそれに引き続くフィプリノーゲンの分解を引き起こし難く、フイブリンの存在する血栓局所に到達して初めて天然 t 一 P Aに近いプラスミノ一ゲン活性化活性を発現して血栓を溶解するので、天然 t — P Aに比べてはもとより、フイブリン特異性が向上した公知の改変体と比較しても、よりフィプリン特異性が高く、従って血栓特異性が-高く、全身性の出血傾向という副作用を生じ難いことが予想される。従つて本発明は、冶療用血栓溶解剤として安全性の高い新規な血栓溶解剤を提供するものである。

さらに本発明の t — P A類似体は、 t — P Aの即時性インヒビ夕一であるプラスミノーゲン活性化因子阻害因子 1 (以下、 P A I — 1 と略す）による阻害に対して抵抗性を有する。従って、 P A I — 1 による阻害を受けず活性が保持された状態を保って血栓部位まで到達することが予想される。よって、上述のフイブリン特異性に加えて本発明の血栓症治療剤としての効用をさらに高めるものと期待される。図面の簡単な説明

第 1 図は、プラスミド p T Z B— 0 0 0 の制限酵素切断地図を表す模式図である。

第 2 A図は、プラスミド p H S G Bの組立模式図および制限酵素認識部位を示している。第 2 B図は、プラスミド p H S G B作成のための合成 D N Aリンカ一とその組立模式図である。

第 3図は、プラスミド p H S G B— O 0 0 の組立模式図である o

第 4図は、プラスミド p H S G B— 0 0 0 NAの組立模式図である。

第 5 図は、部位特異的突然変異誘発に用いた合成オリゴヌクレォチドの配列である。

第 6図は、 t — P A配列の部分組換に用いた U K、 ΐ 一 P Aまたはそれら双方の部分配列を有する合成オリゴヌクレオチドの配列である。

第 7図は、プラスミド p H S G B— C S 1 の組立模式図である ο

第 8図は、プラスミド p C D M 8 — C S 1 の組立模式図である発明を実施するための最良の形態

本発明者らは t — Ρ Αのアミノ酸配列中、天然 t — P Aの 2 7 6位（一本鎖 Z二本鎖開裂部位直後の位置）から 3 0 6位に相当するアミノ酸配列の少なくとも一部を U Kの対応アミノ酸配列に置き換えることにより、フィブリン特異性が向上した新規な t - P A類似体が得られることを見出した。

すなわち本発明の対象は、

1) 1 ー？八のァミノ酸配列中、天然の 1: — ?八の 2 7 6位から 3 0 6位までに相当するァミノ酸配列の少なくとも一部が、 U Kの対応ァミノ酸配列で置換されていることを特徴とする t — P A類似体、

2) 形質転換された細菌、酵母または哺乳動物細胞中において、前記 1)記載の t 一 P A類似体をコードしている D NAを発現させ得る組み換え発現べクタ一、

3) 前記 2)記載の組み換え発現ベクターで形質転換された細菌、酵母または哺乳動物細胞、

4) 前記 1)記載の t — P A類似体を有効成分として含有することを特徴とする血栓症治療剤、

である。

前記 1)記載の t — P A類似体の好ましい例としては、たとえば

1) t 一 P Aのアミノ酸配列の 3 0 0位から 3 0 6位までが、 U Kの対応配列である G l y— G l y— S e r — V a 1 - T h r - T y r - V a 1 で置換されている t 一 P A類似体、

2) t 一 P Aのアミノ酸配列の 2 9 4位から 3 0 6位までが、 U Kの対応配列である T y r - A r g - A r g - H i s - A r g - G l y - G l y - S e r - V a l - T h r - T y r - V a 1 で置換されている t 一 P A類似体、

3) t 一 P Aのアミノ酸配列の 2 8 5位から 3 0 6位までが、 U Kの対応配列である G 1 u— A s n— G 1 n - P r o - T r p - P h e - A l a - A 1 a — I 1 e - T y r - A r g - A r g - H i s — A r g— G l y— G l y - S e r - V a l - T h r - T y r - V a 1 で置換されている t 一 P A類似体、

4) t — P Aのアミノ酸配列の 2 7 6位から 3 0 6位までが、 U Kの対応配列である I 1 e - I 1 e - G 1 y -

G l y - G l u - P h e - T h r - T h r - I 1 e - G l u - A s n - G l n - P r o - T r p - P h e - A l a - A l - I l e - T y r - A r g— A r g— H i s - A r g - G l y - G l y - S e r - V a l - T h r - T y r — V a l で置換されている t — P A類似体、

5) t 一 P Aのアミノ酸配列の 2 7 6位から 2 9 8位までが、 U Kの対応配列である I 1 e - I 1 e - G 1 y - G l y - G l u - P h e - T h r 一 T h r - I 1 e — G l u - A s n - G l n - P r o - T r p — P h e - A l a — A l a — l i e — T y r 一 A r g— A r g— H i s で置換されている t 一 P A類似体、

であって、このものはフイブリン特異性が高いものであ ο

ここに言う天然 t — P Aの 2 7 6位は一本鎖 Z二本鎖開裂部位直後の位置であって、天然の t — P Aの 2 7 6 位から 3 0 6位までに相当する ϋ Kのァミノ酸配列域はプロ U K (—本鎖）の U K (二本鎖）への開裂部位直後の位置である 1 5 9位から 1 8 8位までのアミノ酸配列に対応するものである。なお、本発明で言う U Kの対応アミノ酸配列は、天然の t — P Aの当該アミノ酸配列域に相当する天然の t 一 P Aのアミノ酸配列よりアミノ酸がー個少なく、対応関係から見て天然 t 一 P Aの 2 9 5 位のァミノ酸に対応する U Kのァミノ酸は存在しないものとして扱う。

本発明の t 一 P A類似体の調製は、例えば天然 t — P Aの 2 7 6位から 3 0 6位に相当するアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸残基を、 U Kの対応アミノ酸配列からなるぺプチドと置換することによって行うことができる。具体的には、例えば t — P Aの当該領域のアミノ酸配列をコードする c D N Aを、 U Kの対応アミノ酸配列をコードする c D N Aあるいは合成オリゴヌクレオチドと置換し、適当な発現ベクターと連結してこれを宿主内に導入し、本発明の最終目的物質である t — P A類似体タンパクを発現 · 生産させることにより行うことができる。以下、その詳細について述べる。

本発明の t 一 P A類似体の製造には、通常天然の t 一 P Aをコードする c D N Aを用いることができる。天然 t — P Aをコードする c D N Aは、たとえばポーズメラノーマ細胞からのクローニングによって、たとえば文献 1 3 に記載されているように既に取得されており、従つてその c D N A配列、アミノ酸配列も知られている。その他、天然 t - P Aを改変すべく例えば半減期を長くした改変 t — P A (文献 1 4， 1 5等）の c D N A配列、アミノ酸配列も知られており、これらも用いることがでさる。プラスミド中にクローニングされ、その配列も分かつている c D NAの特定の配列を置換する操作は、既に自由に行える状況になっている（文献 1 6 ) 。本発明においても同様の操作により、天然 t — P Aの 2 7 6位から 3 0 6位に相当するアミノ酸配列の一部を、 U Kの対応配列に容易に置換えることができる。天然 t 一 P Aの c D NAを使用する場合、本発明における置換部位周辺には置換に都合の良い適当な制限酵素認識部位がないので、まず、 t — P Aの 2 7 4位〜 2 7 6位（T T C G C A ) および 3 0 9位〜 3 1 1位（ G C ATA C) のアミノ酸の位置に、このアミノ酸を変えることなく N s p V (TT C G AA) 、 A c c I ( G TA TA C ) という'制限酵素認識部位を導入すると便利である。そのための手法としては、ゾラ一及びスミスらによる部位特異的突然変異誘発 (Site-directed mutagenesis ) (文献 1 7 ) が有効に利用される。置換されるべき U Kの配列を含む D NA断片の作製は、ホスホアミダイト法（文献 1 8 ) により合成されたオリゴヌクレオチドをァ二一リングして 2本鎖状に調製する方法が便利である。なお、必要に応じて短い合成オリゴヌクレオチドを複数本作製し、これらをつなぎ合わせる手法もとることができる。 t — P Aの配列と U Kの配列を置換する方法は、前述の如く導入された N s p Vおよび A c c I制限酵素認識部位を該制限酵素で切断して t 一 P A配列を切り出し、代わりに U Kの配列を含む D NA断片をこの部位に連結（ライゲ —シヨン）させる方法が好都合である。

このようにして作製された t — P A類似体をコードする c D N Aは、 C D M 8 ( o r i - ) 等、周知の発現べクタ一に連結された後、適当な宿主に導入されることにより、本発明の最終目的物質である t — P A類似体タンパクを発現，生産することができる。宿主としては細菌等の原核性生物及び哺乳動物細胞、酵母等の真核性生物のいずれも用いることができ、例えば動物細胞宿主としては、 C O S — 1 、 C H 0細胞が挙げられる。発現べク、ターの宿主への導入方法は、電気パルス法（文献 1 9 ) が効率的である。

培養上清中に産生された t 一 P A類似体は、亜鉛キレ一トァガロース、コンカナノくリン Aァガロース、セファデックス G— 1 5 0 ァガロース等を用いる公知の方法 (文献 2 0 ) 等によって、容易に精製することができるこのようにして得られた t 一 P A類似体は、高いフィブリン特異性を有するので、血栓溶解剤として生体内に投与された場合、天然の t 一 P Aと比較して全身性め出血傾向という副作用が減少した医薬組成物の有効成分とすることができる。また本発明の t — P A類似体は P A I 一 1 抵抗性を有するので、天然の t — P Aと比較して低投与量で効果を発揮する医薬組成物の有効成分とすることができる。また常法により容器に所定量分注し、凍結乾燥を行うことにより極めて容易に製剤化することができる。この凍結乾燥品は、製剤学的に容認されるキヤリア一物質、例えば生理食塩水に溶解し、静脈内又は冠動脈内への注射によって投与される。投与量は、現在臨床で用いられている天然 t 一 P Aの投与量程度でも良いが、本 t — P A類似体は副作用が少ないので該投与量より多く使用することもできる。投与方法は、持続静注あるいは投与予定量の一部を最初に静注し残りを持続静注する等の方法で行われる。

次に、本発明の一例として以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない一。

実施例し t — P A類似体 C S— 1 の製造

1. -t - P A c D N A領域をカセット化するためのブラスミド p H S G B— 0 0 0 の構築 · t 一 P Aの c D NAは Bowes melanoma細胞より取得された。該 c D NAをプラスミド p T Z B (後述）に組み込むことによりプラスミド p T Z B— 0 0 0 を得た。次いで p T Z B— 0 0 0から t — P A c D NA部分をプラスミド p H S G Bに移して p H S G B— 0 0 0 を得た。

プラスミド p T Z B (文献 2 1 ) は市販プラスミド P T Z 1 8 R (東洋紡績（株）（T0Y0B0) 社製）の B a mH I以外のマルチクローニングサイト部分を全て除去して調製したものであり、プラスミド p T Z B— 0 0 0 (文献 2 1 ) は p T Z Bの B a mH Iサイトに t — P A翻訳領域を完全に含む B a m H I フラグメント ( B a mH I カセット）を挿入して調製した（文献 2 1 ) 。第 1 図に p T Z B— 0 0 0 の制限酵素的模式図を示す。

プラスミド p H S G Bは、クロラ厶フヱニコール耐性遺伝子をマーカ一としてもつ市販プラスミド p H S G 3 9 8 (宝酒造（株）社製）（第 2 - A図 ) のマルチクロ一二ングサイト全体を合成 D NA リンカ一（第 2 — B 図）で置き換えて調製した。 p H S G Bの B a m H I サィトに p T Z B— 0 0 0力、ら得た B a m H I カセットを挿入することにより p H S G B— O 0 0を構築した（第 3図）。

合成 D NA リンカ一は以下のようにして作製した。まず、第 2 — B図に示した自己相補的である配列 aのオリゴヌクレオチドを合成した。合成にはァプライドバィォシステムズ ( Applied Biosystems) 社製 3 8 1 A型 D N A合成装置を用い、その精製は同社の 0 P Cカートリツジを用いて行った。この合成オリゴヌクレオチドをァ二 —ルさせ 2本鎖とし（第 2 — B図、配列 b ) 、これを F o k l及び H i n d lEで消化し、合成 D N A リンカ一 (第 2 — B図、配列 c ) をポリアクリルアミドゲルから標準的手法により単離精製した。

この合成 D NAリンカ一と p H S G 3 9 8を H i n d Π及び E c o R Iで消化し 5 ' 末端を脱リン酸化したものとをライゲートさせ、これで大腸菌 H B 1 0 1 株を形質転換して、プラスミド p H S G Bを得た（第 2 — A 図）。

この p H S G Bを B a m H I で消化し 5 ' 末端を脱リン酸化したものと、 p T Z B— 0 ひ 0を B a mH Iで消化しポリアクリルアミドゲルから単離して得たフラグメント（B a mH I カセット）とをライゲートさせ、大腸菌 H B 1 0 1株（宝酒造（株）社製）を形質転換して、プラスミド p H S G B— 0 0 0を得た（第 3図）。

2. U K配列挿入のためのプラ—スミド p H S G B— 0 0 0 N Aの組み立て—

t 一 P A配列の一部を U K配列に置換するために、 p H S G B - 0 0 0の t — P A翻訳領域中に N s p V及び A c c I認識配列を含む p H S G B— 0 0 0 NAを作製した。作製には合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異誘発の手法を用いた。その組み立て模式図を第 4図に示した。

部位特異的突然変異誘発のための铸型として、一本鎖形 M 1 3 t v l 9 E E (文献 2 1 ) を得た。この M 1 3 t V 1 9 E Eは天然の t — P Aのアミノ酸 2 0 5から 3 6 2番目に対する c D NAを含んでいる。

M l 3 m p 1 9 E ENAは一本鎖形 M l 3 t v 1 9 E Eを鎊型として、第 5図に示した合成オリゴヌクレオチド P— N s p V及び P— A c c I とァニールさせ、

M u t a n ^TM— Gシステム（宝酒造（株）社製）を用いて得られた。これらの合成オリゴヌクレオチドは先に記載した方法と同様の方法により合成 · 精製して得た。

この M l 3 m 1 9 E E NAを E c o R Iで消化して生ずる 4 7 2塩基対フラグメント（フラグメント E E N A ) をポリアクリルアミドゲルより標準的手法により単離した。このフラグメント E E N Aと p H S G B — 0 0 0 を E c o R I で消化し 5 ' 末端を脱リン酸化したものとをライゲートさせ、大腸菌 H B 1 0 1 株を形質転換して p H S G B— 0 0 0 N Aを得た（第 4 図）。

3. U Kハイプリッド型 t 一 P Aを有するプラスミド p H

S G B — C S 1 ( C S 1 は、 C S T U と称していナ: ±の- の名称を変更したもの）の構築

U Kの部分配列を含む 4種のォリゴヌクレオチド ( C S 1 M. C S 1 R、 C S 2 Mおよび C S 2 R ) を合成した。その配列は第 6 図に示す。これらの 4種の合成オリゴヌクレオチドをァニールさせ、これと p H S G B — 0 0 0 N Aを N s p V及び A c c I で消化したものとをライゲ.一トさせた。これで大腸菌 H B 1 0 1 株を形質転換させ、 U Kハイプリッド型 t — P Aを有するプラスミド p H S G B — C S 1 (第 7図）を得た。

4.哺乳類細胞内で U Kハイプリッド型 t 一 P Aを発現させるプラスミド p C DM 8 — C S 1 の構築

哺乳動物細胞内で C S 1 を発現させるために必要なプ口モータ一等の配列を、プラスミド p C D M 8 — 0 0 0 が提供した。

P C D M 8 - 0 0 0 は、発現ベクター C D M 8

( o r i — ) に天然 t 一 P A c D N A部分を組み込んだものである（文献 2 1 ) 。

P C D M 8 — 0 0 0 を B g l E及び B a l I で消化して天然 t — P A c D NAの関連部分を除去し、 5 ' 末端を脱リン酸化したものと、既述のプラスミド p H S G B - C S 1 を B g I I及び B a 1 I で消化したものとをラィゲートさせた。これで大腸菌 MC 1 0 6 1 / 3 (フナコシ薬品（株）社製）を形質転換させ、目的とする U Kハイブリッド型 t — P Aを発現させるためのプラスミド p C D M 8 — C S 1 を得た（第 8図）。

5. P C D M 8 - C S 1 の C O S - 1細胞内での発現

既述の U Kハイプリッド型 t — P Aをコードする発現プラスミド、 p C D M 8 — C S 1 を用いて既述の電気パルス法により C O S— 1 細胞を形質転換した。リジンセファロ一スクロマト処理した牛胎児血清 1 0 %及びアブロチニン 1 0 /I g Zmlを含有する DME M培地で 2 4時間培養後、培地を無血清かつァプロチニン無含有の D M EM培地に交換し、更に 9 6 時間培養を継続した。培養液を遠心後その上清を回収して t — P A類似体 C S - 1 を得た。このようにして得られた塔養上清中に含まれる C S - 1 は、その 9 0 %以上が一本鎖の状態で存在していた。この培養上清を、以後の評価系に用いた。

実施例 2. t — P A類似体 C S — 2の製造

実施例 1 における C S 1 M， C S 1 R， C S 2 Mおよび C S 2 Rの代わりに、第 6図記載の C S 3 M, C S 3 R, C S 2 M, C S 2 Rを用いたこと、及び発現プラスミドの構築を下記のようにしたことの他は実施例 1 と同様にして、 t — P A類似体 C S— 2を製造した。哺乳動物細胞内で U Kハイプリッド型 t _ P Aを発現させるプラスミド ρ C D M 8 — C S 2 は、 C D M 8 ( o r i — ) に B g 1 Iサイトを導入したプラスミド p C D M 8 ( B g 1 I ) (文献 2 1 ) を B g 1 Iで消化後、 5 ' 末端を脱リン酸化したものと、実施例 1 における p H S G B — C S 1 に相当するプラスミド p H S G B — C S 2 を B a m H I で消化したものとをライゲ一トさせ、大腸菌 M C 1 0 6 1 / P 3 を形質転換させることにより得た。

実施例 3. t - P A類似体 C S 一 3 の製造

実施例 2 における C S 3 M, C S 3 R , C S 2 Mおよび C S 2 Rの代わりに、第 6 図記載の C S 4 M, C S 4 R， C S 2 M , C S 2 Rを用いたことの他は実施例 2 と同様にして、 t 一 P A類似体 C S — 3 を製造した。

実施例 4 . t - P A類似体 C S - 4 の製造

実施例 2 における C S 3 M, C S 3 R, C S 2 Mおよび C S 2 Rの代わりに、第 6 図記載の C S 4 M, C S 4 R， C S 5 M, C S 5 Rを用いたことの他は実施例 2 と同様にして、 t — P A類似体 C S— 4 を製造した。

実施例 5 . t - P A類似体 C S 一 5 の製造

実施例 2 における C S 3 M, C S 3 R , C S 2 Mおよび C S 2 Rの代わりに、第 6 図記載の C S 1 M, C S 1 R， C S 6 M , C S 6 Rを用いたことの他は実施例 2 と同様にして、 t — P A類似体 C S — 5 を製造した。

参考例天然の t — P Aをコードする既述の発現プラスミド P C D M 8 - 0 0 0 を用いて C O S — 1細胞を形質転換し、培養上清を回収して天然の t 一 P Aを得た。方法は実施例 1 の 5. に従った。

5 〔評価実施例〕

C S - 1 ， C S - 2， C S - 3 , C S— 4， C S - 5 および天然 t — P Aについて、以後の評価を行った。評価実施例 1 . フイブリン特異性の評価

発色性合成基質 S— 2 2 5 1 を用いる t 一 P Aのブラ l( スミノ一ゲン活性化活性測定系に種々のフイブリンコフアクターを添加し、フイブリン特異性の評価を行った。方法は文献 6 に示されている方法に準じて行った。

1 ) フイブリン添加系

先ず、 9 6穴プレートのゥニル中に 6 0 国際単位 Zml

15 のトロンビン（ 0. 0 1 %Tween 8 0含有 P B S ) 1 0

1 を添加した。次に 0. 0 1 % Tween 8 0含有 P B S で 2 0 0 ng/ml (ただし C S— 3 は 1 5 0 ng/ml) に希釈された各 t — P A試料（調製に必要なタンパク濃度は天然 t — P Aに対するポリクローナル抗体を用いた周知

20 の E L I S A法により測定した。） 2 0 〃 1 を添加し、更に反応混合液〔プラスミノ一ゲン 1 3 5 nM、フイブリノーゲン 0. 8 ; Μ、 S - 2 2 5 1 3 7 8 /z M ( 0. 0 9 % ( V / V ) Tween 8 0および 4. 4 mg/ mlゼラチン含有 0. 1 3 Mトリス塩酸 pH7. 8溶液）〕 2 0 0

25 1 を添加した。 3 7 °Cでインキュベートを開始後、プレートリーダーを用いて 4 0 5 nmにおける吸光

(◦ D ₄。 ₅ ) を経時的に測定した。同時にフイブリンによる濁度の影響を補正するために 4 9 O nmにおける吸光 ( 0 D 4 9 0 ) を測定し、各時間でその 0 D ₄₉。値を〇 D ₄。₅ から差し引いた。

スタンダードとして種々の濃度に希釈した天然型 t — P Aを同様の方法で測定し、濃度に対する一定時間後の吸光度（ O D ₄₀₅ - 0 D 4 9 0 ) 値をプロットした検量線を作製し、この検量線をもとに天然型の t 一 P Aに対する各 t — P A類似体の相対活性を決定した。

2) フィブリノ一ゲン添加系

フイブリン添加系と同様に行った。但し、トロンビンの代わりに 0 . 0 1 % Tween 8 0 含有 P B S を用いた。

第 1 表に各 t 一 P A試料の天然 t — P Aに対する相対活性を示す。フイブリン添加系においては反応 3 0 分後フイブリノ一ゲン添加系においては 2 時間後の吸光度 ( O D ₄。₅ — 〇 D ₄₉。）に相当する天然 t — P Aの濃度を前記検量線から求めた。フイブリン特異性は（フィブリン添加系における活性 Zフィブリノ一ゲン添加系における活性）比で表した。第 1 表フィプリン特異性フイブリンコフ了ク夕ー試料名 F g 1 ) F n 1 ) F n / ' F g 天然 1 . 0 0 1 . 0 0 1 . 0 0 c s - 1 0 . 1 3 1 . 0 4 8 . 0 0 c s - 2 0 . 0 7 0 . 8 2 1 1 . 7

C S - 3 0 . 2 2 1 . 2 8 5 . 8 2

( c s - 4 0 . 0 8 0 . 9 1 1 1 . 4 ) ^{2 )} c s - 5 0 . 0 1 0 . 3 0 3 0 . 0

° F g ：フイブリノ一ゲン、 F n ：フイブリン

F g添加系、 F n添加系共に両対数でプロットした検量線より求めた。（但し、 C S — 4 は常数プロット） ^{2 3} C S — 4 に関しては、添加時の濃度が 5 0 ngZ mlのものを使用して得た値であるため信頼性が劣る。 ' 第 1 表より本発明の t — P A類似体は、天然の t 一 P Aと比較してフイブリノ一ゲン添加系ではプラスミノ一ゲン活性化活性が非常に低いが、フィプリン添加系では天然の t 一 P Aに近いあるいはより高い活性を有していることが明らかとなった。

評価実施例 2 . 血漿塊特異性の評価

ヒト血漿を用いて血漿中および血漿塊中における各 t — P Aのプラスミノ一ゲン活性化活性を、発色性合成基質 S — 2 2 5 1 を用いた反応系で測定した。方法は文献 6 に示されている方法に準じて行った。

1 )血漿塊中プラスミノ一ゲン活性化活性

9 6 穴プレートのゥヱル中に 6 0 国際単位 Zmlのトロンビン（ 0 . 0 1 % Tween 8 0 含有 P B S ) 1 0 1 を添加した。次に 0 . 0 1 % Tween 8 0 含有 P B Sで 2 0 0 ng/ml (ただし C S — 3 は 1 5 0 ng/ml) に希釈された各 t — P A試料 4 0 a 1 を添加し、更に、反応混合液〔血漿 9 0 1 、 9 . 1 m S — 2 2 5 1 ( 0 . 0 1 % Tween 8 0 含有 P B S ) 1 0 〃 1 〕 .1 0 0 〃 1 を添加した。 3 7 °Cでインキュベートを開始後、プレートリーダ一を用いて 4 0 5 nmにおける吸光（ O D ₄。₅ ) を経時的に測定した。同時にフイブリンによる濁度の影響を補正するために 4 9 O nmにおける吸光（ O D _{4 9}。）を測定し各時間でその〇 D _{4 S} Q 値を O D ₄。₅ から差し引いた。

ス夕ンダードとして種々の濃度に希釈された天然型 t - P Aを同様の方法で測定し、濃度に対する一定時間後の吸光度（ O D ₄。₅ — 〇 D _{4 9}。）値をプロットした検量線を作製し、その検量線をもとに天然型の t 一 P Aに対する各 t 一 P A類似体の相対活性を決定した。

2)血漿中プラスミノ一ゲン活性化活性

血漿塊中プラスミノ一ゲン活性化活性の測定と同様に行った。但し、トロンビンの代わりに 0 . 0 1 % Tween 8 0 含有 P B S を用いた。第 2表に天然 t — P Aに対する各 t 一 P A試料の相対活性を示す。血漿塊系においては反応 2 時間後の、また血漿系においては 4 時間後における吸光度（ 0 D ₄ Q ₅ — 0 D 4 9 0 ) に相当する天然 t 一 P Aの濃度を前記検量線から求めた。血漿塊特異性は（血漿塊中における活性 Z 血漿中における活性）比で表した。

第 2表血漿塊特異性

u血漿塊系の値は両对数でプロットした検量線より求めた。

²⁾ < 0 . 0 6 及び < 0 . 0 8 は、検出限界以下を表す。

³⁾試料が低濃度であつたため測定できず。

第 2表より本発明の t 一 P A類似体は、天然の t — P Aと比較して血漿中ではプラスミノーゲン活性化活性が非常に低いが、血漿塊中では天然の t 一 P Aに近い活性を有していることが明らかとなつた。

評価実施例 3. P A I - 1 抵抗性の評価

t 一 P Aの一本鎖或いは二本鎖での P A I - 1 抵抗性は前記文献 2 2 ) に示される方法に準じて測定された。プラスミンによる 2本鎖化処理或いは未処理の 4 5 ng/ ml t - P A試料 l mlに 7 6 . 7 〃 Mァプロチニンを 6 . 6 pi 1 添加後、その 2 0 〃 1 を 2 nMの P A I — 1 あるいは水 1 0 1 と混合し、室温で 2 0分間反応させたその後、 6 0 国際単位 Zmlのトロンビン 1 0 1 を添加し、更にフイブリン特異性の評価に際し、用いた反応混合液 2 0 0 1 を添加し、 3 7 °Cで.ィンキュベートを開始した。 2 0 分後に 4 0 5 nmにおける吸光（ O D ₄。₅ ) を測定した。同時にフイブリンによる濁度の影響を補正するために 4 9 0 nmにおける吸光（ 0 D ₄₉。）を測定し〇 D ₄。 ₅ からその値を差し引いた。

各 t — P Aの P A I — 1 無添加時の（ O D ₄。₅ -

0 D 4 9 0 ) 値を 1 0 0 %とした時の P A I 一 1 添加時の ( 0 D 4Ό 5 - 0 D 4 9 0 ) 値の割合を、残存活性（）として第 3表に示す。

第 3表 P A I - 1 抵抗性（残存活性％ )

¹⁵ 測定不能。

第 3表より本発明の t — P A類似体は、天然の P

Aと比較して P A I 一 1 に対する抵抗性が極めて高いことが明らかとなった。引用文献

1) The TIMI study group, N. Engl. J. Med. 3 2 0 6 1 8 - 6 2 7 ( 1 9 8 9 )

2) 欧州特許出願公開 No. 0 3 5 1 2 4 6 A 2

3) 欧州特許出願公開 No. 3 6 6 0 9 1

4) 国際公開 No. 8 9 0 9 2 6 6

5) 国際公開 No. 9 0 0 0 6 0 0

6) 国際公開 No. 9 0 0 2 7 9 8

7) 国際公開 No. 9 0 0 4 6 3 5 8) 特開昭 6 0 — 2 5 2 4 2 2号公報

9) 特開昭 6 2 - 2 5 3 3 8 0号公報

10) L. C. Petersen et al. , Biochemistry 2 9 3 4 5 1 - 3 4 5 7 ( 1 9 9 0 )

11) J， Monge et al. , J. B. C. 2 6 4 1 0 9 2 2 - 1 0 9 2 5 ( 1 9 8 9 )

12) E.し. Madison et al. , Pro Nat 1. Acad. Sci.

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13) Pennica et al. , Nature 3 0 1 2 1 4 - 2 2 1 ( 1 9 8 3 )

14) 特表昭 6 3 - 5 0 1 3 3 5

15) Yoshi take, S.， et a 1 Thromb. Haemos tas i s

6 2 5 4 2 - 5 4 3 ( 1 9 8 9 )

16) T. Maniat i s et al. , Molecular Cloning, A

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17) M.J. Zoller et al.， Methods in Enzymo 1 ogy

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18) S,し. Beaucage et al . , Tetrahedron Letters

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19) 高山慎一郎、細胞工学 7 7 1 ( 1 9 8 7 )

20) D. C. Ri jken et al. , Bi ochemi ca Biophysica Acta 5 8 Q 1 4 0 - 1 5 3 ( 1 9 7 9 )

21 ) 特願平 2 - 8 7 0 0 5号

22) E丄 Madison et al. , ature 3 3 9 7 2 1 - 7 2 4 ( 1 9 8 9 ) 産業上の利用可能性本発明の t — P A類似体は、血液中を循環している時はプラスミノ一ゲンの活性化およびそれに引き続くフィブリノ一ゲンの分解を引き起こし難く、フイブリンの存在する血栓局所に到達して初めて天然の t 一 P Aに近いプラスミノ一ゲン活性化活性を発現して血栓を溶解するので、天然の t 一 P Aに比べてはもとより、フイブリン特異性が向上した公知の改変体と比較しても、よ.りフィブリン特異性が高く、従って血栓特異性が高く、全身性の出血傾向という副作用を生じ難いことが予想される。従って本発明の t 一 P A類似体は新規な血栓溶解剤として極めて意義の深いものである。

Claims

1. 組織プラスミノ一ゲン活性化因子のァミノ酸配列中、天然の組織プラスミノーゲン活性化因子の 2 7 6位カヽら 3 0 6位までに相当するアミノ酸配列の少なくとも一部が、尿プラスミノ一ゲン活性化因子の対応ァミノ酸配列で置換されていることを特徴とする、 t — P A類似体。

2. 尿プラスミノーゲン活性化因子の対応ァミノ酸配の

列が、天然の組織ブラスミノーゲン活性化因子の 3 0 0 位から 3 0 6位までに対応する 1 8 2位から 1 8 8位までのアミノ酸配列； G 1 y - G 1 y匿- S e r - V a l - T h r — ι' y r - V a 1 を含むァミノ酸配列であることを特徴とする、請求の範囲 1 記載の t — P A類似体。

3. 尿プラスミノ一ゲン活性化因子の対応ァミノ酸配列が、天然の組織ブラスミノーゲン活性化因子の 2 9 4 位から 3 0 6位までに対応する 1 7 7位から 1 8 8位までのアミノ酸配列； T y r - A r g - A r g - H i s - A r g - G l y - G l y - S e r - V a 1 一 T h r - T y r — V a l を含むァミノ酸配列であることを特徴とする、請求の範囲 1 または 2記載の t 一 P A類似体。

4. 尿プラスミノーゲン活性化因子の対応ァミノ酸配列が、天然の組織ブラスミノーゲン活性化因子の 2 8 5 位から 3 0 6位までに対応する 1 6 8位から 1 8 8位までのアミノ酸配列； G 1 υ - A s n — G i n — P r o — T r p - P h e - A l a - A 1 a — I 1 e - T y r - A r g - A r g - H i s — A r g— G l y - G 1 y - S e r - V a 1 - T h r - T y r - V a 1 を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求の範囲 1、 2 または 3 記載の t — P A類似体。

5. 尿プラスミノ一ゲン活性化因子の対応ァミノ酸配列が、天然の組織ブラスミノーゲン活性化因子の 2 7 6 位から 3 0 6位までに対応する 1 5 9位から 1 8 8位までのアミノ酸配列； I 1 e — I 1 e - G l y - G l y - G l u - P h e - T h r - T h r - I 1 e - G l u - A s n - G 1 n - P r o— T r p— P h e— A l a.— A l a— I 1 e - T y r - A r g - A r g - H i s - A r g - G l y - G l y - S e r - V a 1 - T h r - T y r - V a l を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求の範囲 1、 2、 3 または 4記載の t — P A類似体。

6. 尿プラスミノーゲン活性化因子の対応アミノ酸配列が、天然の組織プラスミノーゲン活性化因子の 2 7 6 位から 2 9 8位までに対応する 1 5 9位から 1 8 0位までのアミノ酸配列； I I e — I 1 e - G 1 - G 1 y - G l u - P h e - T h r - T h r - I 1 e - G l u - A s n - G l n - P r o - T r p - P h e - A l a - A 1 a— I I e - T y r - A r g - A r g - H i sを含むァミノ酸配列であることを特徴とする、請求の範囲 1記載の t 一 P A類似体。

7. 形質転換された細菌、酵母または哺乳動物細胞中において、請求の範囲 1 から 6 のいずれかに記載の t ― P A類似体をコードしている D N Aを発現させ得る組み換え発現ベクター。

8. 請求の範囲 7記載の組み換え発現ベクターで形質転換された細菌、酵母または哺乳動物細胞。

9. 請求の範囲 1 から 6 のいずれかに記載の t 一 P A 類似体を有効成分として含有することを特徴とする血栓症治療剤。