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WO1993020083A1 - Substituierte thiazolin-dioxetan-substrate, verfahren zur herstellung und verwendung - Google Patents

Substituierte thiazolin-dioxetan-substrate, verfahren zur herstellung und verwendung Download PDF

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Publication number
WO1993020083A1
WO1993020083A1 PCT/EP1993/000752 EP9300752W WO9320083A1 WO 1993020083 A1 WO1993020083 A1 WO 1993020083A1 EP 9300752 W EP9300752 W EP 9300752W WO 9320083 A1 WO9320083 A1 WO 9320083A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
compounds
alkyl
straight
branched
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP1993/000752
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rupert Herrmann
Hans-Peter Josel
Christian Klein
Dieter Heindl
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Boehringer Mannheim GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Boehringer Mannheim GmbH
Priority to JP5517071A priority Critical patent/JPH06102669B2/ja
Priority to US08/150,188 priority patent/US5455357A/en
Priority to EP93907842A priority patent/EP0591489A1/de
Publication of WO1993020083A1 publication Critical patent/WO1993020083A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D513/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00
    • C07D513/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D513/10—Spiro-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the invention relates to thiazoline-dioxetane substrates, processes for the production and use in enzymatic analysis processes.
  • the object of the present invention was to provide a 1,2-dioxetane based on the activated intermediate of thiazolines and preferably luciferin, which is stable and only decomposes by reaction with an activating agent with the formation of chemiluminescence.
  • This object is achieved by a compound of the general formula III,
  • R- [and R2 are in each case identical or different and represent hydrogen or lower alkyl C 1 -C 4, straight-chain or branched
  • X is a cleavable group which can be cleaved off by an activating agent and at least one of the groups R4 or R5 represents a group stabilizing the dioxetane structure and at most one of the groups R4 or R5 represents hydrogen.
  • Acids, bases, salts, enzymes, inorganic or organic catalysts and Electron donors used are Acids, bases, salts, enzymes, inorganic or organic catalysts and Electron donors used.
  • the group -O-X can be located at any position on the phenyl ring.
  • R is a benzothiazole group
  • the group -O-X is preferably arranged in the 5-position.
  • R is a phenyl group
  • the group -O-X is preferably arranged in the 3-position. The same applies to the group -OR3, from which the group -O-X arises.
  • -O-X is preferably the hydroxy salt of an oxyacid, phosphate, aryl or alkyl carboxyl ester, alkyloxy or arylsilyloxy, sulfate, oxypyranoside.
  • composition of the aryl and alkyl radicals is not critical. Any person skilled in the art can select suitable radicals X without further ado. Solubility and cleavage of X by the activating agents must only be possible.
  • R1 and R2 are preferably hydrogen, methyl or ethyl groups. If, for example, phosphate is used as -O-X, the chemiluminescence reaction can be induced by adding alkaline phosphatase. When using the galactoside, the chemiluminescence reaction can be induced by ß-galactosidase. If a silyloxy radical is used as -O-X, the addition of fluoride can induce chemiluminescence.
  • Groups which protect the dioxetane group from reactions are suitable as groups R4 and / or R5 which stabilize the dioxetane structure. This stabilization is preferably carried out by sterically shielding this group.
  • R4 and R5 can be the same or different.
  • the adamantyl residue it is preferably bound in such a way that R4 and R5 represent parts of the ring structure and are therefore bridged (formula purple):
  • the compounds of general formula III are new. A synthetic method for these compounds is not yet known.
  • the invention accordingly also relates to a process for the preparation of the compounds of the formula III, which is characterized in that a compound of the formula IV or IVa.
  • R3 alkyl straight-chain or branched with 1 - 6 C- Represents atoms, preferably methyl or ethyl, with a compound of formula V.
  • R1 and R2 have the meanings given above, with the exclusion of water and air in the presence of an alkyllithium compound with aldehydes or ketones, decarboxylated the reaction product, dealkylated the alkoxy group, there the chemically labile group according to methods familiar to the skilled worker -OX introduces and photo-oxygenates to the dioxetane.
  • reaction of the compound of the formula IV (alkoxybenzothiazole-2-carboxylic acid nitrile) or IVa with the compound of the formula V (preferably penicillamine or cysteine) is preferably carried out in a polar solvent, such as water or water / alcohol mixtures, at room temperature with the exclusion of light.
  • a polar solvent such as water or water / alcohol mixtures
  • Suitable compounds as aldehydes and ketones are those which, as radical R4 and / or R5, stabilize the dioxetane structure of the compounds of the formula III. Such stabilization can be achieved by steric shielding of the dioxetane structure.
  • Suitable ketones and aldehydes are accordingly, for example, adamantanone, benzaldehydes, cyclohexanones, secondary and tertiary aliphatic aldehydes and ketones, such as. B. Di-t-butyl ketone.
  • R3 is preferably water-free in an aprotic organic solvent such as.
  • the alkyl lithium compound is preferably added as a solution in a hydrocarbon (pentane, hexane). Butyllithium is particularly preferably used. After the reaction has taken place, the compound obtained is precipitated from the reaction mixture, preferably by adding an aqueous salt solution at room temperature.
  • decarboxylation of the resulting ⁇ -hydroxycarboxylic acid to introduce a double bond is preferably carried out under dehydrating conditions, e.g. B. with diethyl azodicarboxylate and triphenylphosphine.
  • the dealkylation at the 6 'position is expediently carried out by adding a dealkylating agent such as trimethyl iodosilane. It is preferred to work anhydrous.
  • the thiazoline carboxylic acid can preferably be converted to a thiazolin-4-one via the intermediate stage of the amine and alcohol and then to a thiazolin-4-thione by reaction with sulfide.
  • This thiazolin-4-thione is reacted with a hydrazone of the aldehyde or ketone, preferably with adamantanone-2-hydrazone or benzaldehyde hydrazone, which can contain a removable group (adamantanontosyl hydrazone or benzaldehyde tosyl hydrazone) to give the compounds of the formula III according to the invention.
  • R4 and / or R5 represents a phenyl radical, an aliphatic radical or cycloalkyl radical, a substituted 2- Phenyl-5,5-dialkyl-thiazolin-4-one in a Grignard reaction to the 4-substituted derivative with subsequent introduction of a double bond at the 4-position of the thiazoline. Then, as described below, the dioxetane group is introduced.
  • the dioxetane group is expediently introduced by reacting the alkene derivative (double bond at the 2-position of the thiazoline), which is preferably dissolved in a polar organic solvent, such as methylene chloride or chloroform, at a temperature of -100-50 ° C and irradiation with visible light using a sensitizer (for example Rose Bengal, methylene blue, cf. Tetra ⁇ hedron Letters (1988) 3137 - 3140).
  • a sensitizer for example Rose Bengal, methylene blue, cf. Tetra ⁇ hedron Letters (1988) 3137 - 3140.
  • the supernatant contains the desired compound of formula III.
  • Another object of the invention is a method for determining an acid, base of a salt, enzyme, inorganic or organic catalyst and electron donor by reacting this compound with a compound of general formula III and measuring the light emitted as a measure of the content of the connection to be determined.

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Abstract

Es werden Verbindungen der allgemeinen Formel (III), in der R (a) oder (b) darstellen und in der R1 und R2 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff oder Niederalkyl C1-C6, geradkettig oder verzweigt, darstellen und X eine abspaltbare Gruppe und mindestens eine der Gruppen R4 oder R5 eine die Dioxetanstruktur stabilisierende Gruppe und höchstens eine der Gruppen R4 oder R5 Wasserstoff darstellt, beschrieben. Diese Verbindungen sind als Substrate in immunologischen Assays und in der DNA-Diagnostik unter Verwendung von aktivierenden Agentien zur Farbbildung verwendbar.

Description

Substituierte Thiazolin-Dioxetan-Substrate, Verfahren zur Herstellung und Verwendung
Gegenstand der Erfindung sind Thiazolin-Dioxetan-Substrate, Verfahren zur Herstellung und Verwendung in enzymatischen Analyseverfahren.
Durch die Umsetzung von Luciferin (Formel I) mit Luciferase, Sauerstoff und ATP entsteht Oxiluciferin. Bei dieser Reaktion wird Licht (Wellenlängenmaximum bei 562 nm) als Chemilumi- neszenz emittiert. Dabei entsteht vermutlich das Dioxetan der Formel II als energiereiches Zwischenprodukt (F. McCapra, Che . Commun. 155 (1968)).. Aufgrund dieses Postulats wurden eine Vielzahl von chemilumineszierenden 1,2-Dioxetan-Verbin- dungen entwickelt. Zur Stabilisierung der an sich instabilen 1,2-Dioxetane wurde der Adamantyl-Rest beschrieben (EP-A 0 254 051, EP-A 0 352 713, WO 91/03479, WO 90/07511 sowie dort zitierte Publikationen) . Keiner der bekannten Verbindungen liegt jedoch als Grundkörper die aktivierte Zwischenstufe des Luciferins gem. Formel II, einem Thiazolin- Derivat, zugrunde.
H
Figure imgf000003_0001
Figure imgf000003_0002
(π) Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein 1,2-Dioxetan auf Basis der aktivierten Zwischenstufe von Thiazolinen und vorzugsweise Luciferin zur Verfügung zu stellen, welches stabil ist und erst durch Umsetzung mit einem aktivierenden Agens unter Bildung von Chemilumineszenz zerfällt. Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Verbindung der allgemeinen Formel III,
Figure imgf000004_0001
in der R entweder
-ÖD- ox
oder
o
Figure imgf000004_0002
und R-[ und R2 jeweils gleich oder verschieden sind und Was¬ serstoff oder Niederalkyl C^ - Cζ, geradkettig oder ver¬ zweigt, darstellen, X eine abspaltbare Gruppe, die durch ein aktivierendes Agens abgespalten werden kann und mindestens eine der Gruppen R4 oder R5 eine die Dioxetanstruktur stabi¬ lisierende Gruppe und höchstens eine der Gruppen R4 oder R5 Wasserstoff darstellt.
Als aktivierende Agentien werden vorzugsweise Säuren, Basen, Salze, Enzyme, anorganische oder organische Katalysatoren und Elektronendonoren verwendet.
Die Gruppe -O-X kann an jeder Position des Phenylrings loka¬ lisiert sein. Wenn R eine Benzthiazolgruppe ist, ist die Gruppe -O-X vorzugsweise jedoch in 5-Stellung angeordnet. Wenn R eine Phenylgruppe ist, ist die Gruppe -O-X vorzugswei¬ se in 3-Stellung angeordnet. Analoges gilt für die Gruppe -OR3, aus der die Gruppe -O-X entsteht.
-O-X ist vorzugsweise das Hydroxysalz einer Oxysäure, Phosp¬ hat, Aryl- oder Alkylcarboxylester, Alkyloxy oder Arylsilylo- xy, Sulfat, Oxypyranosid.
Die Zusammensetzung der Aryl- und Alkylreste ist unkritisch. Die Auswahl geeigneter Reste X ist jedem Fachmann ohne wei¬ teres möglich. Es muß lediglich Löslichkeit und Abspaltbar- keit von X durch die aktivierenden Agenzien möglich sein.
Rl und R2 sind bevorzugt Wasserstoff, Methyl oder Ethylgrup- pen. Wird beispielsweise Phosphat als -O-X verwendet, so kann die Chemilumineszenzreaktion durch Zusatz von alkali¬ scher Phosphatase induziert werden. Bei Einsatz des Galakto- sids kann die Chemilumineszenzreaktion durch ß-Galaktosidase induziert werden. Wird ein Silyloxyrest als -O-X verwendet, so kann die Zugabe von Fluorid die Chemilumineszenz induzie¬ ren.
Als Dioxetanstruktur-stabilisierende Gruppen R4 und/oder R5 geeignet sind Gruppen, welche die Dioxetangruppe vor Umsetzungen schützen. Diese Stabilisierung erfolgt vorzugs¬ weise durch sterische Abschirmung dieser Gruppe. Geeignet sind beispielsweise Adamantanyl-, Phenyl-, Cyclohexyl-, sekundäre und tertiäre aliphatische Alkylgruppen (wie __ . B. die t-Butylgruppe) in substituierter und unsubstituierter Form. Dabei können R4 und R5 gleich oder verschieden sein. Im Falle des Adamantylrests ist dieser vorzugsweise so gebunden, daß R4 und R5 Teile der Ringstruktur bedeuten und demnach überbrückt sind (Formel lila):
Figure imgf000006_0001
Die Verbindungen der allgemeinen Formel III sind neu. Ein Syntheseverfahren für diese Verbindungen ist bisher nicht bekannt.
Gegenstand der Erfindung ist demnach auch ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel III, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der Formel IV oder IVa.
Figure imgf000006_0002
Figure imgf000006_0003
in der R3 Alkyl, geradkettig oder verzweigt mit 1 - 6 C- Atomen, vorzugsweise Methyl oder Ethyl darstellt, mit einer Verbindung der Formel V
ß1 COOH l / ( ΪL )
2 "*-
umsetzt, in der Rl und R2 die oben genannten Bedeutungen haben, unter Wasser- und Luftausschluß in Gegenwart einer Alkyllithium-Verbindung mit Aldehyden oder Ketonen umsetzt, das Reaktionsprodukt decarboxyliert, die Alkoxygruppe dealky- liert, dort nach dem Fachmann geläufigen Methoden die chemisch labile Gruppe -O-X einführt und zum Dioxetan photo- oxygeniert.
Die Umsetzung der Verbindung der Formel IV (Alkoxybenzthiazol-2-carbonsäurehitril) oder IVa mit der Verbindung der Formel V (vorzugsweise Penicillamin oder Cystein) erfolgt vorzugsweise in einem polaren Lösungsmittel, wie Wasser oder Wasser-Alkoholgemischen, bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß.
Als Aldehyde und Ketone sind solche Verbindungen geeignet, die als Rest R4 und/oder R5 die Dioxetanstruktur der Verbin¬ dungen der Formel III stabilisieren. Eine solche Stabilisie¬ rung kann durch sterische Abschirmung der Dioxetanstruktur erreicht werden. Geeignete Ketone und Aldehyde sind demnach beispielsweise Adamantanon, Benzaldehyde, Cyclohexanone, sekundäre und tertiäre aliphatische Aldehyde und Ketone, wie z. B. Di-t-Butylketon.
Die Einführung von R3 erfolgt vorzugsweise wasserfrei in einem aprotischen organischen Lösungsmittel wie z. B. THF unter Luftabschluß und Kühlung durch Umsetzung der so erhaltenen Thiazolincarbonsäure mit einem Aldehyd oder Keton. Besonders bevorzugt wird bei Temperaturen von -50 - -100°C gearbeitet. Die Alkyllithium-Verbindung wird vorzugsweise als Lösung in einem Kohlenwasserstoff (Pentan, Hexan) zugesetzt. Besonders bevorzugt wird Butyllithium verwendet. Nach erfolgter Umsetzung wird die erhaltene Verbindung aus dem Reaktionsgemisch, vorzugsweise durch Zugabe einer wäßrigen Salzlösung bei Raumtemperatur, ausgefällt.
Die Decarboxylierung der so entstandenen ß-Hydroxycarbonsäure zur Einführung einer Doppelbindung erfolgt vorzugsweise unter dehydratisierenden Bedingungen, z. B. mit Azodicarbonsäure- diethylester und Triphenylphosphin.
Die Dealkylierung an der 6'-Position erfolgt zweckmäßig durch Zugabe eines Dealkylierungsmittels wie beispielsweise Trime- thyljodsilan. Vorzugsweise wird wasserfrei gearbeitet.
Ebenso kann die Thiazolincarbonsäure vorzugsweise über die Zwischenstufe des Amins und Alkohols zu einem Thiazolin-4-on und anschließend durch Umsetzung mit Sulfid in ein Thiazolin- 4-thion umgewandelt werden. Dieses Thiazolin-4-thion wird mit einem Hydrazon des Aldehyds oder Ketons, vorzugsweise mit Adamantanon-2-hydrazon oder Benzaldehydhydrazon, welches eine abspaltbare Gruppe enthalten kann (Adamantanontosylhydrazon oder Benzaldehydtosylhydrazon) zu den erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel III umgesetzt.
Zur Herstellung von Verbindungen der Formel III, in denen R4 und/oder R5 einen Phenylrest, einen aliphatischen Rest oder Cylcloalkylrest darstellt, kann auch ein substituiertes 2- Phenyl-5,5-dialkyl-thiazolin-4-on in einer Grignard-Reaktion zum 4-substituierten Derivat mit anschließender Einführung einer Doppelbindung an der 4-Position des Thiazolins umgesetzt werden. Anschließend erfolgt, wie nachstehend beschrieben, die Einführung der Dioxetangruppe.
Die Einführung der chemisch-labilen Gruppe X erfolgt nach dem Fachmann geläufigen Methoden. Derartige Verfahren sind bei¬ spielsweise beschrieben in Houben-Weyl XII/2.
Die Einführung der Dioxetangruppe erfolgt zweckmäßig durch Umsetzung des Alken-Derivates (Doppelbindung an der 2-Posi- tion des Thiazolins), welches vorzugsweise in einem polaren organischen Lösungsmittel, wie Methylenchlorid oder Chloro¬ form gelöst wird bei einer Temperatur von -100 - 50°C und Bestrahlung mit sichtbarem Licht unter Verwendung eines Sensitizers (z. B. Rose Bengal, Methylenblau, vgl. Tetra¬ hedron Letters (1988) 3137 - 3140).
Zur Aufreinigung wird beispielsweise filtriert. Der Überstand enthält die gewünschte Verbindung der Formel III.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung einer Säure, Base eines Salzes, Enzyms, anorgani¬ schen oder organischen Katalysators und Elektronendonors durch Umsetzung dieser Verbindung mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III und Messung des emittierten Lichts als Maß für den Gehalt an der zu bestimmenden Verbindung.
Besonders bevorzugt wird dieses Verfahren verwendet zur Be¬ stimmung von Enzymen, speziell von Markerenzymen in immuno¬ logischen Systemen oder zur DNA-Diagnostik mit markierten DNA-Sonden. Bevorzugt wird alkalische Phosphatase bestimmt, wobei die chemisch labile Gruppe X Phosphat ist oder ß-Galak¬ tosidase, wobei X = Galaktosid ist.
Die Erfindung wird durch folgende Beispiele erläutert:
Beispiel 1
Synthese von 2-(6'-Methoxy-2'-benzthiazolyl)-5,5-dimethyl - A2 thiazolin-4-carbonsäure (1):
2 g 6-Methoxybenzthiazol-2-carbonsäurenitril werden in ca. 100 ml Methanol gelöst und mit einer Lösung von 1,62 g Penicillamin in 50 ml H20 versetzt. Man läßt unter Lichtaus¬ schluß 3 h bei Raumtemperatur rühren, stellt die Lösung anschließend sauer und filtriert ab.
Ausbeute: 1,3 g DC: Rf(Chloroform:Methanol:Eisessig
9:1:0,1) 0,74
Beispiel 2
Synthese von 2-(6'-Methoxy-2'-benzthiazolyl)-5,5-dimethyl-4- (2'-hydroxy-2'-adamantylA -thiazolin-4-carbonsäure (2) :
Zu 1 g der Verbindung (1), gelöst in in ca. 100 ml trockenem THF, wird unter N2 bei -78°C ein zweifacher molarer Überschuß an Butyllithium-Hexan Lösung zugetropft und 1 h gerührt. Anschließend gibt man bei -78°C die entsprechende Menge an 2-Adamantanon gelöst in THF hinzu, rührt 3 h bei - 78°C und gibt das Reaktionsgemisch danach auf 100 ml einer gesättigten wässrigen Natriumchlorid-Lösung, die 20mmol HCl enthält. Der Rückstand wird aus Chloroform/Ether umkristallisiert.
Ausbeute : 0,5 g
Beispiel 3
Synthese von 2-(6'-Methoxy-2'-benzthiazolyl)-5,5-dimethyl-4-
(2'-adamantanyliden)Δ -thiazolin (3) :
Die Decarboxylierung der beta-Hydroxy-carbonsäure mit Einfüh¬ rung der Doppelbindung gelingt durch Umsetzung mit equimola- ren Mengen P(CC6Hs)3 und Azodicarbonsäure-diethylester in THF bei Raumtemperatur (s. z. B. Mulzer, Angev. Chemie 1977).
Synthese von 2-(6'-Hydroxy-2'-benzthiazolyl)-5,5-dimethyl-4- (2'-adamantanyliden)Δ2-thiazolin (4) :
1 g der Verbindung (3) werden in 10 ml trockenem CHCL3 gelöst und mit 50 % Überschuß Trimethyl-iodsilan versetzt. Man erwärmt 48 h auf ca. 70°C, versetzt das Reaktionsgemisch mit Methanol und rotiert die Lösung ein.
Der Rückstand wird in Essigester aufgenommen und mit 5% NaHC03-Lösung ausgeschüttelt, getrocknet und im Vak. einge¬ dampft.
Ausbeute: 0,25 g Beispiel 4
Synthese von 2-(6'-Phosphoryl-2'-benzthiazolyl)-5,5-dimethyl- 4-(2'-adamantanyliden)A2-thiazolin (5) :
Unter Anwendung der üblichen Literaturverfahren gelingt die Phosphorylierung von (4). S.z.B. Houben-Weyl XII/2.
Beispiel 5
Synthese von 1 [2'-(6"-Phosphoryl-2"-benzthiazolyl)-5',5'- dimethyl-A2-thiazolinyl-]-2-(2"-spiroadamantyl)-dioxetan (6):
Zur Photooxygenierung von (5) werden 10 mg des Alkens, gelöst in 10 ml Methylenchlorid, unter Zugabe von immobilisiertem Rose Bengal (Polysσience) 1 h bei - 78°C mit einer 1000 Watt Lampe bestrahlt. Die Umsetzung verläuft quantitativ. Der Sensitizer Rose Bengal läßt sich durch Filtration leicht entfernen.
Beispiel 6
2-Alkoxyphenyl-5,5-dimethyl-thiazolin-4-carbonsäure
Die Herstellung erfolgt analog Chem. Ztg. 1987, 111, 357.
33.5 mmol Penicillamin, 33.5 mmol Alkoxynitril und 16.7 mmol Kaliumkarbonat wurden in einer Mischung von 50 ml Methanol mit 25 ml Wasser 12 Std. unter Rückfluß zum Sieden erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde im Vakuum auf die Hälfte eingeengt. Die Mischung wurde einmal mit 50 ml Ether gewaschen. Mit konz. Salzsäure wurde die abgetrennte wäßrige Phase auf pH 4 eingestellt. Dabei schied sich ein schwach gelber Nieder¬ schlag ab, der abgesaugt, einmal mit wenig Wasser gewaschen und bei 60°C im Vakuum getrocknet wurde.
Ausb. 50 - 60 %
Beispiel 7
2 Alkoxyphenyl-5,5-dimethyl-thiazolin-4-carbonsäureamid
Zu einer Suspension von 4 mmol Alkoxyphenyl-thiazolincarbon- säure in 10 ml Methylenchlorid wurden bei 0°C 4 mmol Oxa- lylchlorid zugegeben. Nach 30 minütigem Rühren bei dieser Temp. wurde 5 min lang bei -20°C ein schwacher Strom Ammoniak eingeleitet. Nach Erwärmung auf Raumtemp. wurde die Suspensi¬ on mit 20 ml Methylenchlorid verdünnt. Die Mischung wurde einmal mit 10 ml lN-Natronlauge und anschließend zweimal mit 20 ml Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet. Nach Abdestillieren des Lösungsmit¬ tels blieb ein Öl zurück, das aus wenig Essigester umkristal¬ lisiert wurde (Ausbeute: 60 - 80 %).
Beispiel 8
4-Amino-2-Alkoxyphenyl-5,5-dimethyl-thiazolin
4,8 mmol Brom wurden bei 0°C in 8 ml 3N-Natronlauge gelöst. Zu dieser Mischung wurden bei 0°C 4,4 mmol 2-Alkoxyphenyl- 5,5-dimethyl-thiazolin-carbonsäureamid gegeben und 30 min bei dieser Temp. und 20 min bei 70°C gerührt. Nach Verdünnen mit 20 ml Wasser wird mit 40 ml Essigester ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde zweimal mit je 15 ml Wasser gewaschen und über Natriumsulf t getrocknet. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels blieb ein Öl zurück, das aus Ethanol/Wasser
I : 1 umkristallisiert wurde (Ausbeute 70 - 85 %).
Beispiel 9
4-Hydroxy-2-alkoxyphenyl-5,5-dimethyl-thiazolin
Zu einer Lösung von 14.5 mmol Amino-2-Alkoxyphenyl-5,5- dimethyl-thiazolin in 32 ml halbkonz. Salzsäure wurden bei 0°C 15 mmol Natriumnitrit gegeben und 20 min bei dieser Temp. gerührt. Nach Neutralisation mit 3N-Natronlauge wurde zweimal mit je 30 ml Essigester ausgeschüttelt. Die organi¬ sche Phase wurde einmal mit 20 ml Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Abdestillieren des Lösungsmit¬ tels blieb ein Öl zurück, das säulenchromatographisch (Kie¬ selgel, Essigester/Petroläther 1 : 1) getrennt wurde (Ausbeute 75 - 80 %) .
Beispiel 10
2-Alkoxyphenyl-5,5-dimethyl-thiazolin-4-on
II mmol 4-Hydroxy-2-alkoxyphenyl-5,5-dimethyl-thiazolin und 34 mmol Cycloheptanon wurden in 160 ml Toluol gelöst. Nach Abdestillieren von 40 ml Toluol wurden 9 mmol Aluminiumtrii- sopropylat zugegeben und die Mischung 3 h unter Rückfluß zum Sieden erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemp. wurden 100 ml Essigester zugegeben und die Mischung zweimal mit je 50 ml Wasser gewaschen. Die vereinigten wäßrigen Phasen wurden einmal mit 50 ml Essigester extrahiert. Nach dem Trocknen der vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat wurden die Lösemittel abdestilliert. Aus dem zurückgebliebenen Öl wurde das Thiazolinon mit Säulenchromatographie (Kieselgel, Essige¬ ster/Petroläther 1 : 4) abgetrennt.
Beispiel 11
2-Alkoxyphenyl-5,5-dimethyl-thiazolin-4-thion
5 mmol 2-Alkoxyphenyl-5,5-dimethyl-thiazolin-4-on und 11 mmol 2,4-(4-Bis-methoxyphenyl)-1,3-dithia-2,4-diphosphetan-2,4- disulfid wurden in 10 ml Toluol 8 h unter Rückfluß zum Sieden erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch säulen- chromatographisch (Kieselgel, Essigester/Petroläther 1 : 6) getrennt (Ausbeute: 30 - 40 %).
Beispiel 12
Adamantan-2-tosylhydrazon
3.4 iruTtol Tosylhydrazid und 3.3 mmol Adamantanon und ein Tropfen konz. Schwefelsäure wurden in 10 ml Ethanol 4 h unter Rückfluß zum Sieden erhitzt. Nach Abkühlen auf RT wird im Vakuum bis auf ein Volumen von 1 ml eingeengt. Es wurde mit 20 ml Wasser verdünnt und mit 2N-Natronlauge neutralisiert. Die Mischung wurde zweimal mit je 20 ml Essigester ausge¬ schüttelt. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit 20 ml Wasser gewaschen und anschließend über Natriumsul¬ fat getrocknet. Die Lösung wurde bis auf ein Volumen von 4 ml eingeengt und 15 h bei 4°C stehengelassen. Es fielen farblose Nadeln aus (Ausbeute: 40 %). Beispiel 13
4-(2'-Adamantanyliden)-alkoxypheny1-5,5-dimethyl-thiazolin
Zu 10 ml einer methanolischen 0.2 M-Natriummethylatlösung wurden 2 mmol Adamantantosylhydrazon gegeben und dann wurde mit 20 ml Diglyme verdünnt. Nach Abdestillieren des Methanols wurde solange auf 120°C erwärmt bis im DC kein Tosylhydrazon mehr zu erkennen ist. Bei dieser Temp. wurden 2 mmol des 2- Alkoxyphenyl-5,5-dimethyl-thiazolin-4-thions gegeben und 15 min gerührt. Dann wurde 1 g Kupferpulver zugegeben und die Mischung weitere 20 min bei 150PC gerührt. Nach dem Abkühlen wurden 100 ml Wasser zugegeben und die Mischung dreimal mit je 50 ml Essigester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit- 30 ml Wasser gewaschen und an¬ schließend über Natriumsulfat getrocknet. Nach Abdest. des Lösungsmittels blieb ein Öl zurück, das säulenchromatogra- phisch (Kieselgel, Essigester/Petroläther 1 : 6) getrennt wurde (Ausbeute 20 %).
Beispiel 14
4-Benzyl-4-hydroxy-alkoxyphenyl-5,5-dimethyl-thiazolin
5 mmol 2-Alkoxyphenyl-5,5-dimethyl-thiazolin-4-on (Beispiel 10) wurden zu 50 ml einer etherischen 0.2 M Benzylmagnesi- umchloridlösung gegeben und die Mischung 8 h unter Rückfluß zum Sieden erhitzt. Nach Zugabe von 20 ml Wasser wurde die organische Phase abgetrennt, einmal mit 20 ml Wasser gewa¬ schen und anschließend über Natriumsulfat getrocknet. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels blieb ein Öl zurück, das säulenchromatographisch (Kieselgel? Essigester/Petroläther 1 : 5) getrennt wird (Ausbeute 30 %). Beispiel 15
4-Benzyliden-alkoxyphenyl-5,5-dimethyl-thiazolin
Eine Lösung von 2 mmol 4-Benzyl-4-hydroxy-alkoxyphenyl-5,5- dimethyl-thiazolin (Beispiel 14) in 20 ml Essigester wurde mit 20 ml halbkonz. Salzsäure 5 min lang geschüttelt. Nach Neutralisation mit 2N Natronlauge wurde die organische Phase abgetrennt, einmal mit 20 ml Wasser gewaschen und an¬ schließend über Natriumsulfat getrocknet. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels blieb ein Öl zurück, das säulenchromato- graphisch (Kieselgel, Essigester, Petroläther 1 : 4) getrennt wurde (Ausbeute 60 %).

Claims

Patentansprüche
1. Verbindungen der allgemeinen Formel III,
Figure imgf000018_0001
in der R
Figure imgf000018_0002
oder
Figure imgf000018_0003
darstellt und in der ^ und R2 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff oder Niederalkyl Ci - C , geradket¬ tig oder verzweigt, darstellen, X eine abspaltbare Gruppe und mindestens eine der Gruppen R4 oder R5 eine die Dioxetanstruktur stabilisierende Gruppe und höchstens eine der Gruppen R4 oder R5 Wasserstoff darstellt.
2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dioxetanstruktur stabilisierende Gruppe ein Adamantyl-, Phenyl-, Cylohexyl- sekundärer oder tertiärer Alkylrest ist.
3. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß -O-X das Hydroxysalz, eine Oxysäure, Phosphat, Aryl- oder Alkylcarboxylester, Alkyloxy, Trialkyloxy oder Arylsilyloxy, Sulfat, Oxypyranosid darstellt.
4. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemei¬ nen Formel III, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel IV oder IVa
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000019_0002
in der R3 Alkyl, geradkettig oder verzweigt mit 1 - 6 C-Atomen darstellt, mit einer Verbindung der Formel V
ß< C OH
umsetzt, in der R^ und R2 jeweils gleich oder verschieden sind und Wasserstoffe oder Niederalkyl C - Cg, geradket¬ tig oder verzweigt, darstellen, in Gegenwart einer Alkyllithium-Verbindung mit Aldehyden oder Ketonen umsetzt, das Reaktionsprodukt decarboxyliert, den Alkoxy- Rest dealkyliert und dort eine abspaltbare Gruppe -O-X einführt und photooxygeniert. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der Formel IV oder IVa verwendet wird, in der 3 Methyl oder Ethyl darstellt.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Einführung des Aldehyd- oder Keton-Restes in einem aprotischen organischen Lösungsmittel unter Luftab¬ schluß und Kühlung bei Temperaturen zwischen -50 und - 100°C durchgeführt wird.
6. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemei¬ nen Formel III, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel IV oder IVa, in der R3 Alkyl gerad¬ kettig oder verzweigt mit 1 - 6 C-Atomen darstellt, mit einer Verbindung der Formel V umsetzt, in der Rl und R2 jeweils gleich oder verschieden sind und Wasserstoff oder Alkyl Cl - C6 geradkettig oder verzweigt darstellen, die erhaltene Thiazolincarbonsäure zu einem Thiazolin-4-on reduziert, mit Sulfid in ein Thiazolin-4-thion umwandelt und dieses mit einem R4 und/oder R5 -substituierten Hydrazon zu den er indungsgemäßen Verbindungen der Formel III umsetzt, den Alkoxyrest alkyliert, dort eine abspaltbare Gruppe -O-X einführt und photooxygeniert.
7. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel III, in denen R4 und/oder R5 Phenyl darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel IV oder IVa, in der R3 Alkyl geradkettig oder verzweigt mit 1 - 6 C-Atomen darstellt, mit einer Verbindung der Formel V umsetzt, in der Rl und R2 jeweils gleich oder verschie¬ den sind und Wasserstoff oder Alkyl Cl - C6 geradkettig oder verzweigt darstellen, die erhaltene Thiazolincarbon¬ säure zu einem Thiazolin-4-on reduziert, in einer Grignard-Reaktion den Rest R4 und/oder R5 einführt, an der 4-Position des Thiazolinrings eine Doppelbindung einführt, den Alkoxyrest dealkyliert, dort eine abspalt¬ bare Gruppe in 0-X einführt und photooxygeniert und so die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel III erhält.
8. Verfahren zur Bestimmung einer Säure, Base, eines Salzes, Enzyms, anorganischen oder organischen Katalysators oder Elektronendonors durch Umsetzung dieses Analyten mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III, Abspaltung der Gruppe X und Messung des emittierten Lichts als Maß für den Gehalt an der zu bestimmenden Verbindung.
9. Verwendung der Verbindungen nach den Ansprüchen 1 und 2 in immunologischen Assays oder zur DNA-Diagnostik.
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