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WO1993015219A1 - Method of quantitative determination of substance with coumarin derivative - Google Patents

Method of quantitative determination of substance with coumarin derivative Download PDF

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Publication number
WO1993015219A1
WO1993015219A1 PCT/JP1993/000128 JP9300128W WO9315219A1 WO 1993015219 A1 WO1993015219 A1 WO 1993015219A1 JP 9300128 W JP9300128 W JP 9300128W WO 9315219 A1 WO9315219 A1 WO 9315219A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
substituted
compound
hydrogen peroxide
formula
peroxidase
Prior art date
Application number
PCT/JP1993/000128
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Norihito Aoyama
Hideki Takenaka
Akira Miike
Original Assignee
Kyowa Medex Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Medex Co., Ltd. filed Critical Kyowa Medex Co., Ltd.
Priority to JP5513100A priority Critical patent/JP2980681B2/ja
Publication of WO1993015219A1 publication Critical patent/WO1993015219A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a method for quantifying a peroxide active substance, hydrogen peroxide and a coumarin derivative represented by the following formula (I) or ( ⁇ ) by a chemiluminescence method using a coumarin derivative.
  • the antigen, antibody or DNA is labeled by labeling the antigen, antibody or DNA with peroxidase, an oxidase other than peroxidase or a luminescent compound, and quantifying peroxidase activity or hydrogen peroxide or a luminescent compound generated by the reaction of the oxidase. There is a known method for quantifying the amount.
  • the coumarin derivatives represented by the following formulas (I) and ( ⁇ ) are known as fluorescent compounds and are commercially available [Fluorescence Analytical Chemistry, pp. 159-161 (1987) published by Baifukan; Japan Chemical Society Journal, Volume 3, p. 644 (1972); Heterocycles, Volume 7, p. 933 (1977); Industry Chemical Magazine, Vol. 71, p. 1010 (1968); Eastman Kodak Co., Ltd., Wako Pure Chemical Industries' power tag, etc.].
  • the present invention relates to hydrogen peroxide and a compound of the formula (I)
  • R 1 , R 2 , R :! , R, R s and R 6 are the same or different and each represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, lower alkoxy, substituted or unsubstituted Aralkyl, substituted or unsubstituted aryl, halogen atom, cyano, nitro, sulfo, carboxy, alkoxycarbonyl, alkyl rubamoyl, substituted or unsubstituted aryl carbamoyl, carbamoyl, hydroxy, substituted Or an unsubstituted amino, lower alkanoyl, lower alkanoyloxy or heterocyclic group, or R 1 and R 2 together form an alkylene or alkenylene, or a R 5 together form connexion - CH 2 CH 2 CH 2 NH - the Kumari down derivative or a salt thereof to form), is reacted in the presence of a peroxidative substance, the reaction solution Meas
  • the principle of the present invention is based on the fact that the above reaction proceeds stoichiometrically, and the luminescence amount or light intensity of the reaction solution is proportional to the amount of the peroxide active substance, hydrogen peroxide or coumarin derivative. I have.
  • the structure of the coumarin derivative has not been changed after the light emission due to the reaction, it was not confirmed by chromatography that the presence of a substance that was distinguished from the coumarin derivative before the reaction was confirmed. It is clear that a compound that emits light is generated by the reaction.
  • the alkyl moiety in lower alkyl, lower alkoxy, lower alkanoyl, lower alkanoyloxy, alkoxyl-rubonyl and alkyl-rubamoyl is preferably a straight-chain or 1-8 carbon atom.
  • Branched alkyl for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, etc., aralkyl having 7 to 15 carbon atoms, for example, benzyl , Phenyl, etc .; aryl in aryl, aryl carbamoyl represents phenyl, naphthyl, etc .; halogen atom represents iodine, bromine, chlorine, fluorine, etc., and heterocyclic ring.
  • the group represents pyridyl, benzothiazolinyl and the like.
  • Substituents in the substituted alkyl, substituted aralkyl, substituted aryl and substituted aryl are the same or different and are substituted with 1 to 5 cyano, halogen atoms, substituted or unsubstituted amino.
  • the alkyl moiety and the halogen atom in lower alkyl, lower alkoxy and alkoxycarbonyl are as defined above.
  • the substituents in the substituted amino are the same or different and represent a substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted heterocyclic group.
  • Lower alkyl is as defined above, and the heterocyclic group is, for example, triazinyl, virazinyl Represents pyridyl, pyrimidinyl, etc.
  • Substituents in the substituted heterocyclic group may be the same or different and each represents a substituted or unsubstituted cyano, halogen atom, amino, lower alkoxy, hydroxy, dialkylamino, or the like.
  • Acceptable salts of compound (I) or (II) include acid addition salts, for example, inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, phosphate and the like, acetate, maleate, fumarate, citrate Organic acid salts.
  • inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, phosphate and the like, acetate, maleate, fumarate, citrate Organic acid salts.
  • Table 1 shows specific compounds used in the present invention.
  • peroxidase active substance used in the method of the present invention is a general term for compounds having peroxidase activity, and includes, for example, peroxidase derived from plants, animals or microorganisms [EC. 1. 11.1. 7), hemoglobin, heme, iron oxide, iron chloride, sodium iodide, ammonium iodide, molybdate and the like.
  • the reactions generally performed by the following are hydrochloric acid, acetic acid, acetate, succinate, oxalate, borate, phthalate, glycine, valpital salt, In a buffer solution ( ⁇ . ⁇ ) adjusted to pH 2 to 8 by combining a buffering agent such as GOOD.
  • the components other than the component to be measured are added to the buffer solution to make a reagent solution, and the sample containing the component to be measured is added to this solution at 110 to 90 ° C, preferably 20 to 90 ° C. React at 50 ° C.
  • the total luminescence of the reaction solution or the luminescence during a certain period of time is measured with a luminescence photometer or the like in the wavelength range of 190 to 750 nm, and the calibration curve is prepared using a known amount of the sample containing the component to be measured.
  • the components to be quantified in the sample can be quantified.
  • the luminescence amount corresponds to the amount of the component to be measured, it can be quantified from the integrated luminescence amount measured at the end of the reaction, but is generally calculated from the integrated luminescence amount for a certain period of time.
  • the object can be achieved by measuring the amount of change in the amount of luminescence per unit time.
  • a surfactant for example, Triton X-100 (manufactured by Yoneyama Pharmaceutical Co., Ltd.) having a concentration of 0. It can be added so as to be 01 to 5 wt%.
  • a protein, a polyalkyl quaternary amine, a fluorescent agent, dimethyl sulfoxide or the like can be used as necessary. If necessary, an alkaline solution can be added.
  • proteins include human serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA), human immunoglobulin, and ovalbumin.
  • polyalkyl quaternary amines include: POLYGEAR LILIM CYLAMMONIUM CHROMIDE, POLY
  • fluorescent agent examples include fluorescein, 4-fluorene 7-nitole benzofurazan, and ⁇ -fluoro-4-nitrobenzenezoxa.
  • a conjugate of diazole and amide, amino acid, peptide or protein, or a derivative thereof can be used.
  • aqueous solution for example, an aqueous solution of sodium hydroxide, aqueous hydroxide or the like can be used.
  • luminescence enhancers are used at a concentration of 0.0001 to 10 wt% of the reaction solution.
  • the hydrogen peroxide that can be quantified according to the present invention can quantify not only hydrogen peroxide dissolved in a sample but also hydrogen peroxide that is quantitatively generated by an enzymatic reaction.
  • any of the substances used in the above-mentioned reaction can be quantified.
  • the present invention can be applied to the measurement of hydrogen peroxide or peroxidase activity conventionally performed in the field of diagnostic agents.
  • stoichiometry is performed using enzymes from a substrate in a biological sample.
  • Substrate quantification is performed by generating hydrogen oxide and quantifying it.
  • the enzyme activity in a biological sample is measured by measuring the rate of hydrogen peroxide generated by performing an enzymatic reaction by adding an appropriate enzyme or substrate in order to measure the enzyme activity in the sample. ing.
  • Specific examples thereof include, for example, specific oxidase (eg, glucose oxidase, galactose oxidase, cholesterol oxidase, pericase, etc.). Measurement of the activities of enzymes such as oxidase and cholinesterase can be mentioned.
  • specific oxidase eg, glucose oxidase, galactose oxidase, cholesterol oxidase, pericase, etc.
  • peroxidase is used as a labeling substance, and the enzyme is produced by the peroxidase activity after the antigen-antibody reaction or by the action of this activity.
  • Hydrogen peroxide has been quantified.
  • each method described in the enzyme immunoassay (Eiji Ishikawa et al., 1987, Medical College), for example, an antigen is reacted with an immobilized antibody, and an enzyme such as peroxidase or glucose oxidase is used as the antigen.
  • a method of reacting a labeled antibody and quantifying the activity of the enzyme itself or hydrogen peroxide generated by the action of the enzyme can be mentioned.
  • drugs contained in serum, urine, etc. Hormones or carcinoembryonic antigens (CEA), ⁇ -proteins used as indicators of clinical tests It is possible to measure trace components in the body, such as protein (AFP) and prostatic acid phosphatase (PAP).
  • CEA carcinoembryonic antigens
  • AFP protein
  • PAP prostatic acid phosphatase
  • trace components can be quantified.
  • the compound (I) or (II) is used as a labeling substance, the reaction is carried out by the method of the present invention using the antigen-antibody reactant, and the amount of the antigen or the luminescence is measured by measuring the amount or intensity of luminescence. Antibody can be quantified.
  • the present invention can be applied to a polynucleotide measurement method.
  • the polynucleotide measurement method is complementary to the tested polynucleotide.
  • Labeling a polynucleotide that binds to an enzyme or a compound (I) or (H) such as peroxidase or dalcosoxidase, and labeling the enzyme or the compound that binds to the test polynucleotide complementarily Examples include a method of measuring the enzymatic activity of a polynucleotide or quantifying a labeled compound to determine the amount of a test polynucleotide. The method is described in “DNA Probe” (disc, 1988 edition), “DNA Probe II” (disc, 1990 edition) and the like.
  • the feature of the present invention using the coumarin derivative represented by the formula (I) or ( ⁇ ) is that the range of pH at which light is emitted is as wide as ⁇ 1 to 10; In the acidic to neutral range, a strong luminescence is obtained. Luminol, isolminol, lucigenin, acridinium ester, etc., which have been used in the past, cannot satisfactorily produce luminescence under strong alkaline conditions, and are optimal for enzymes such as peroxidase. When H was less than neutral, detection was difficult. By using the method of the present invention, even when the optimum pH of an enzyme is neutral or lower, it is possible to perform measurement at the optimum pH of the enzyme.
  • Figure 1 shows the changes in the emission intensity of compounds 1, 59 and luminol when using various concentrations of hydrogen peroxide.
  • X—Nore Figure 2 shows the changes in the emission intensity of compounds 10, 12, 14, 23 and luminol when various concentrations of hydrogen peroxide were used.
  • Figure 3 shows the changes in the emission intensity of Compound 1 and luminol at various pH values.
  • Figure 4 shows the changes in the emission intensity of Compound 1 and luminol when various concentrations of peroxidase were used.
  • Figure 5 shows the change in the emission intensity of Compound 1 when various concentrations of CEA were used.
  • FIG. 6 shows the change in the luminescence intensity of Compound 35 when various concentrations of AFP were used.
  • FIG. 7 shows the change in the luminescence intensity of compound 35 when various concentrations of PAP were used. Explanation of reference numerals
  • Figure 8 shows the results obtained for compounds 31 and 35 and acridinium ester (acridinium I: Dojin Chemical Laboratories) using various concentrations of BSA.
  • Example 1 chemiluminescence using a coumarin derivative by peroxidase reaction
  • the coumarin derivative used in the present example showed an emission intensity at pH 6.0 equal to or higher than that of luminol by reacting with peroxidase in the presence of hydrogen peroxide. .
  • the coumarin derivative used showed an emission intensity equal to or higher than that of luminol.
  • Example 3 Intensity of chemiluminescence using coumarin derivative by peroxidase reaction at various pH
  • FIG. 3 shows the ratio of the amount of luminescence at each pH when the luminescence at pH showing the maximum luminescence was 100%.
  • the optimal luminescence pH of Compound 1 is in the acidic region, It was shown to be extremely wide compared to
  • the G0D labeling for the anti-CEA antibody was performed according to the method of Ishikawa et al. (Oxygen immunoassay, page 82, edited by Eiji Ishikawa et al., 1987, published by The Medical College).
  • C—N-succinimidyl 4 -— (N-Maleimide methyl) was used to introduce a maleimide group into the GOD using hexane-111-carboxylate [manufactured by PIERCE].
  • the F (ab ') z fraction obtained by digesting the anti-CEA antibody with pepsin was reduced to prepare F (ab') from which the SH group was released. Both were mixed and reacted to obtain a GOD-labeled anti-CEA antibody.
  • Magnosphere (Magnosphere: trade name) manufactured by Stelogy Bioseparation Co., Ltd .; same hereafter) was used as the magnetic particles for the magnetic particles immobilized with the anti-CEA antibody.
  • An equal amount of a CEA antibody solution was added to the fine particles, sodium borohydride as a coupling reagent was added to a final concentration of 0.1 mol, and the mixture was stirred and reacted for 2 hours. After collecting the particles with a magnet and removing the supernatant by suction, 500 ⁇ l of a phosphate buffer containing 0.1% BSA and 0.1% NaN was added to obtain anti-CEA antibody-immobilized magnetic particles. And saved.
  • the particles were collected by a magnet, the supernatant was removed by suction, and glucose was dissolved at a concentration of 54 mgZml in 1 O miol citrate buffer (01115.0) as a substrate for G0D bound to CEA. After 100 1 was added and the mixture was reacted at 37 ° C. for 30 minutes, 50 mmol of glycine buffer (pH 11) was added as a stop solution. The particles were separated by a magnet, the supernatant 101 of this solution was added to the reagent solution attached to the luminescence photometer, and the integrated luminescence amount for one minute was measured. Figure 5 shows the results.
  • a labeled compound of compound 35 against the anti-AFP antibody was prepared as follows. That is, the carboxyl group of compound 35 and the amino group of the anti-AFP antibody react with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (hereinafter referred to as EDC) at pH 7.0. Then, compound 35 was recognized as anti-AFP antibody.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • Magnospher was used as the magnetic particles for the anti-AFP antibody-immobilized magnetic particles.
  • An equal volume of an anti-AFP antibody solution dissolved in 0.1 niol phosphate buffer (pH 7.0) is added to the microparticles, and sodium borohydride, a coupling reagent, is added to a final concentration of 0.1.
  • the reaction mixture was stirred to react for 2 hours.
  • the particles were collected with a magnet, the supernatant stored after aspirated off, the-phosphate buffer containing 0. 1% BSA and 0. 1% N a N 3 as 5 0 0 1
  • anti-AFP antibody-immobilized magnetic particles did.
  • a labeled compound 35 against anti-PAP antibody was prepared as follows. That is, 50 mg of compound 35 was dissolved in 10 ml of dioxane, 75 mg of EDC and 50 mg of N-hydroxysuccinic acid imid were added, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours. Concentrated to dryness. The solid was extracted with ethyl acetate water, and the organic layer was concentrated to dryness. This was redissolved in 10 ml of dioxane, 50 mg of -alanine was added, and the mixture was reacted at room temperature for 4 hours, and concentrated to dryness to obtain a solid.
  • the solid was reacted with goat anti-human PAPP antibody at pH 7.0 using EDC and allowed to bind to obtain a compound 35-labeled anti-PAPP antibody.
  • Magnosphere was used as the magnetic particles for the anti-PAP antibody-immobilized magnetic particles.
  • An equal volume of an anti-PAP antibody solution dissolved in 0.1 mol phosphate buffer (pH 7.0) is added to the microparticles, and the final concentration of sodium borohydride, a coupling reagent, is added. 0.1 mol was added, and the mixture was stirred and reacted for 2 hours. The particles were collected with a magnet, the supernatant was removed by suction, and then the anti-PAP solid immobilized magnetic particles were added with 501 in phosphate buffer containing 0.1% BSA and 0.1% NaN. saved.
  • phosphate buffer pH 6.0
  • acridinium ester acridinium I: Dojindo Chemical
  • a slight amount of hydrogen peroxide, a peroxide active substance or a coumarin derivative, or a peroxide is used.
  • Active substances, oxidases, or substances chemically coupled with coumarin derivatives eg, CEA, AFP, PAP, etc.

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Description

明 細 書 クマリ ン誘導体を用いた物質の定量方法
技 術 分 野
本発明はクマリ ン誘導体を用いた化学発光法による過酸化活性物質、 過酸化水素および後記式 （ I ) も しく は （ Π ) で表されるク マ リ ン誘 導体の定量方法に関する。
従 来 の 技 術
ごく微量な過酸化水素やペルォキシダーゼ活性を正確に定量するこ とは分析化学および生化学において重要なことであり、 特に臨床検査 の分野では測定対象物質を最終的に過酸化水素に変換して定量する手 法が多用されている。 また抗原、 抗体または D N Aをペルォキシダー ゼ、 ペルォキシダーゼ以外の酸化酵素または発光化合物で標識し、 ぺ ルォキシダーゼ活性または該酸化酵素の反応により生じる過酸化水素 または発光化合物を定量することにより、 抗原、 抗体または D N Aを 定量する方法が知られている。
過酸化水素やペルォキシダ一ゼ活性の定量法のなかで、 高感度な定 量法と しては、 生物発光やペルォキシダ一ゼの基質となる化合物の化 学発光を利用する方法が知られている。 特に利用できる発光化合物と してル ミ ノ ール、 イ ソル ミ ノ ール、 ノレシゲニン、 ァ ク リ ジニゥムエス テル等の化合物が知られている 〔生物発光と化学発光、 今井一洋編、 P.82- 89, (1989), 廣川書店〕 力^ 反応液中にタンパク質が共存した り反応液の pHが酸性側であると、 発光強度が低下する等の問題点があ る
後記式 （ I ) および式 （ Π ) で表されるクマリ ン誘導体は蛍光化合 物と して知られており、 また市販されている 〔蛍光分析化学、 159— 161 頁 （ 1987) 培風館発行 ； 日本化学会誌、 3卷、 644 頁 （ 1972) ； ヘテロサイ ク ロルス （Heterocycles) 、 7卷、 933 頁（1977) ； 工業 化学雑誌、 71卷、 1010頁（1968) ； イース トマンコダック社、 和光純 薬工業の力タ口グ等〕 。
クマリ ン誘導体が過酸化活性物質の存在下、 過酸化水素によって発 光するという ことは知られていない。
発 明 の 開 示
本発明は過酸化水素と式 （ I )
Figure imgf000004_0001
または式 （H)
Figure imgf000004_0002
(式中、 R 1 、 R 2 、 R :! 、 R 、 R s および R 6 は同一または異な つて、 水素原子、 置換もしく は非置換の低級アルキル、 低級アルコキ シ、 置換も しく は非置換のァラルキル、 置換もしくは非置換のァリー ル、 ハロゲン原子、 シァノ、 ニ トロ、 スルホ、 カルボキシ、 アルコキ シカルボニル、 アルキル力ルバモイル、 置換もしく は非置換のァリ一 ルカルバモイル、 力ルバモイル、 ヒ ドロキシ、 置換もしく は非置換の ァミ ノ、 低級アルカノィル、 低級アルカノィルォキシまたは複素環基 を表すかまたは R 1 と R2 が一緒になってアルキレンもしく はァルケ 二レンを形成するか、 または と R 5 が一緒になつて- CH2CH2CH2NH - を形成する） で表されるクマリ ン誘導体またはその塩を、 過酸化活性 物質の存在下に反応させ、 反応液の発光量または発光強度を測定する こ とを特徴とする過酸化活性物質、 過酸化水素または式 （ I ) も しく は式 （Π ) で表されるクマリ ン誘導体を定量する方法に関する。
本発明の原理は上記反応が化学量論的に進行し反応液の発光量また は光の強度が過酸化活性物質、 過酸化水素またはクマリ ン誘導体の量 に比例しているこ とに基づいている。
反応によって発光した後、 クマリ ン誘導体が如何なる構造に変化し ているか確認されていないが、 反応前のクマ リ ン誘導体と区別される 物質の存在がク ロマ ト グラフ ィ ーによって確認されており、 反応によ つて発光する化合物が生成していることは明らかである。
式 （ I ) または式 （ Π ) における定義中、 低級アルキル、 低級アル コキシ、 低級アルカノ ィル、 低級アルカノ ィルォキシ、 アルコキシ力 ルボニルおよびアルキル力ルバモイルにおけるアルキル部分は、 炭素 数 1 〜 8の直鎖または分岐状のアルキル、 例えばメ チル、 ェチル、 プ 口 ピル、 イ ソプロ ピル、 ブチル、 t e r t—ブチル、 ペンチル、 へキシル、 ヘプチル、 ォクチル等を表し、 ァラルキルは炭素数 7〜 1 5 の、 例え ばベンジル、 フヱネチル等を表わし、 ァ リ ール、 ァ リ 一ルカルバモイ ルにおけるァ リ ール部分はフ ヱニル、 ナフチル等を表し、 ハロゲン原 子はヨウ素、 臭素、 塩素、 フ ッ素等を表し、 複素環基とは、 ピリ ジル、 ベンゾチアゾリ二ル等を表す。
置換アルキル、 置換ァラルキル、 置換ァ リ ールおよび置換ァ リ ール 力ルバモイルにおける置換基は、 同一または異なって置換数 1 〜 5 の シァノ、 ハロゲン原子、 置換も し く は非置換のァ ミ ノ、 低級アルキル- 低級アルコキシ、 カルボキシ、 アルコキシカルボニル、 ヒ ドロキシ等 を表す。 低級アルキル、 低級アルコキシおよびアルコキシカルボニル におけるアルキル部分およびハロゲン原子は前記と同義である。
置換ァ ミ ノ における置換基は、 同一または異なって置換数 1 〜 2 の 低級アルキル、 置換も し く は非置換の複素環基を表す。 低級アルキル は前記と同義であり、 複素環基は、 例えば ト リ ァジニル、 ビラ ジニル ピリ ジル、 ピリ ミ ジニル等を表す。 置換複素環基における置換基は、 同一または異なって置換数 1〜 2のシァノ、 ハロゲン原子、 ァミ ノ、 低級アルコキシ、 ヒ ドロキシ、 ジアルキルアミ ノ等を表す。 低級アル コキシおよびアルキルァ ミ ノ におけるアルキル部分は前記と同義であ アルキレンとしては炭素数 2〜4の基を包含し、 -（CH2)2-、 -（CH2)3 -. -(CH2)4-等が挙げられ、 アルケニレンと しては炭素数 2〜 4の基を包 含し、 -CH=CH- 、 -CH=CH-CH2- 、 - CH=CH- CH=CH- 等が挙げられる。
化合物 （ I ) または （Π) の許容される塩としては、 酸付加塩、 例 えば塩酸塩、 硫酸塩、 燐酸塩等の無機酸塩および酢酸塩、 マレイン酸 塩、 フマル酸塩、 クェン酸塩の有機酸塩があげられる。
本発明で用いられている具体的化合物を第 1表に示す。
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
—1
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
CI N
a -C00C2HS β ： VNH-
Figure imgf000010_0002
第 1 表に記載したクマリ ン誘導体は、 公知化合物であり、 例えば日 本化学会誌、 3巻、 644 頁 （ 1972) ； ヘテロサイ クルス、 7巻、 933 頁 （ 1977) ； 工業化学雑誌、 71巻、 1010頁 （ 1968) 等に記載の方法と 同様にして製造することができる。 また該化合物は、 イース トマンコ ダック社、 アルドリ ッチ社、 ダイ トーケミ ックス社等から購入するこ とも可能である。
本発明方法で用いられる過酸化活性物質とはペルォキシダーゼ活性 を有する化合物の総称であって、 例えば、 植物、 動物または微生物由 来のペルォキシダーゼ 〔EC。 1。 11.1. 7) 、 ヘモグロ ビン、 ヘム、 酸 化鉄、 塩化鉄、 ヨウ化ナ ト リ ウム、 ヨウ化アンモニゥム、 モ リ ブデン 酸塩等があげられる。
本発明方法によつて定量分析を行う際一般に下記によって行われる 反応は塩酸、 酢酸、 酢酸塩、 コハク酸塩、 シ ョ ウ酸塩、 ホウ酸塩、 フタル酸塩、 グリ シン、 バルピタール塩、 グッ ド （G O O D) 等の緩 衝剤を組合せて pH 2〜8 に調整された緩衝液（Ο. ΟΟδ ΖπιοΐΖΐ)中で行 わ レる 。
化合物 （ I ) または （ Π ) は 0.01 molZl〜100molZl 、 過酸化水 素は 10 z mol / 1 〜100mmolZl 、 過酸化活性物質は 10 〜 2 x 102 mgZml好ま しく はペルォキシダーゼが 10―9〜 102UZmlで用いられる。
これらの 3成分の中の測定すべき成分以外の成分を緩衝液に加えて 試薬液と し、 これに測定すべき成分を含有する試料を加えて一 10〜90 °C、 好ま しく は 20〜50°Cで反応させる。 反応液の全発光量あるいは一 定時間の発光量を 190〜750nm の波長領域で発光光度計等により測定 し、 予め既知量の測定すべき成分含有試料を用いて作成した検量線を 利用 して試料中の定量すべき成分を定量することができる。
発光量は測定すべき成分の量に対応しているので反応の終了に伴い 測定した積算発光量から定量できるが、 一般に一定時間の積算発光量 から計算される。 測定すべき成分が酵素活性の場合には、 発光量の単位時間当りの変 化量を測定することによって目的を達成できる。
本発明方法を実施する際、 反応液の濁りの発生防止等のため、 必要 に応じて界面活性剤 〔例えば、 ト リ ト ン X— 100 (米山薬品工業製） 〕 を、 その濃度が 0. 01〜 5 w t % になるように加えることができる。
発光化合物の発光強度を増強するため、 必要に応じてタンパク質、 ポリアルキル 4級ァミ ン、 蛍光剤、 ジメチルスルホキシ ド等を用いる ことができる。 さらに必要に応じて、 アルカ リ溶液を添加することが できる。 タンパク質としては、 例えば、 ゥシ血清アルブミ ン（B S A )、 ヒ ト血清ァルブミ ン （ H S A ) 、 ヒ ト免疫グロブリ ン、 卵白アルブミ ン等があげられ、 ポリアルキル 4級ァミ ンとしては、 例えば、 ポリ ジ ァ リールジメ チルアンモニゥムク ロライ ド、 ポリ 〔ビュルべンジル
(ベンジルジメチル一ァンモニゥムクロライ ド） 〕 等があげられ、 蛍 光剤としては、 例えば、 フルォレツセイン、 4 —フルォ口一 7—ニト 口ベンゾフラザン、 Ί —フルオロー 4 —二 トロべンゾキサジァゾール とァミ ン、 ア ミ ノ酸、 ペプチ ドまたは夕ンパク質との結合物もしく は それらの誘導体等を使用することができる。 アル力 リ溶液としては、 例えば、 水酸化ナト リゥム、 水酸化力 リゥム等の水溶液を使用するこ とができる。 これら発光増強剤は反応液の 0. 0001〜10w t %の濃度で用 いられる。
本発明によって定量できる過酸化水素は、 試料中に溶存する過酸化 水素のみならず酵素反応によって定量的に生成する過酸化水素も定量 できる。
定量できる過酸化活性物質と しては前述の反応に用いられる物がい ずれも定量できる。
本発明は従来診断薬の分野において行われている過酸化水素または ペルォキシダーゼ活性の測定に適用することができる。
従来、 例えば生体試料中の基質から酵素を利用して化学量論的に過 酸化水素を生成させ、 これを定量することによる基質の定量が行われ ている。
また生体試料中の酵素活性を測定するために適当な酵素や基質を加 えて酵素反応を行わせ生成する過酸化水素の生成速度を測定すること によつて試料中の酵素活性の定量が行われている。
これらの具体例と して、 例えば、 特異的ォキシダ一ゼ （例えば、 グ ルコースォキシダーゼ、 ガラ ク ト一スォキシダーゼ、 コ レステロール ォキシダ一ゼ、 ゥ リ カーゼ等） 反応の基質の定量や、 モノア ミ ンォキ シダーゼ、 コ リ ンエステラーゼ等の酵素の活性測定があげられる。
さ らに、 抗原抗体反応を酵素免疫測定法 （E IA 法） 用いて定量する 際標識物質と してペルォキシダーゼが用いられ、 抗原抗体反応後のぺ ルォキシダ一ゼ活性またはこの活性の作用によって生成させた過酸化 水素の定量が行われている。 例えば、 酵素免疫測定法 （石川榮治ら編、 1987年、 医学書院） に記載の各方法、 例えば固定化した抗体に抗原を 反応させ、 その抗原に例えば、 ペルォキシダーゼ、 グルコースォキシ ダーゼ等の酵素を標識した抗体を反応させ、 該酵素活性自身または該 酵素の作用により生成する過酸化水素を定量する方法があげられる。 本発明を該 E IA法等に用いることにより、 血清、 尿等に含まれる薬物. ホルモンまたは臨床検査の指標物質と して用いられている癌胎児性抗 原（CEA) 、 α —フ ヱ トプロテイ ン （AFP)、 前立腺酸性フ ォスフ ァタ一 ゼ（PAP) 等生体内微量成分等を測定することが可能である。
上記に例示される過酸化水素またはペルォキシダーゼ活性の測定に 本発明を適用することによつて微量の成分を定量できる。
さ らに化合物 （ I ) または （ Π ) を標識物質と して用い、 抗原抗体 反応物を用いて本発明方法による反応を行わせ、 発光量または発光強 度を測定することによつて抗原または抗体を定量できる。
また、 本発明はポリ ヌ ク レオチ ド測定法に応用することができる。 ポリ ヌ ク レオチ ド測定法と しては、 被検査ポリ ヌ ク レオチ ドと相補的 に結合するポリヌ ク レオチ ドにペルォキシダーゼ、 ダルコースォキシ ダーゼ等の酵素又は化合物 （ I ) 又は （H ) を標識し、 被検ポリ ヌク レオチ ドと相捕的に結合した該酵素標識化又は該化合物標識化ポリ ヌ ク レオチ ドの酵素活性を測定または標識化合物を定量して被検ポリ ヌ ク レオチ ド量を定量する方法があげられる。 当該方法は、 「D N Aプ ローブ」 （ジスク社、 1988年版） 、 「D N AプローブII」 （ジスク社、 1990年版） 等に記載されている。
式 （ I ) または （ Π ) で表されるクマリ ン誘導体を用いる本発明の 特徴は、 発光を生じる p H範囲が ρ Η 1〜 1 0 と広いことであり、 特 に p H 5〜 7の酸性〜中性域においては強い発光量が得られることで ある。 従来用いられていたルミ ノール、 イ ソルミ ノ一ル、 ルシゲニン 、 ァク リ ジニゥムエステル等は強アル力 リ条件下でなければ満足のい く発光量が得られず、 ペルォキシダーゼ等の酵素の至適 p Hが中性以 下の場合は検出が困難であった。 本発明方法を用いることにより、 酵 素の至適 p Hが中性以下の場合でも、 その酵素の至適 p Hでの測定を 行うことが可能である。 また、 これにより至適 p Hが酸性領域にあり 、 ルミ ノール等公知の発光物質を用いた定量法では使えなかった酸化 酵素の使用が可能になる。 従って本発明方法の場合、 上記の性質を持 つ酵素の活性を測定するとき、 酵素の最も活性の高い領域で行えるの で、 従来より微量の酵素でも検出することが可能である。
図面の簡単な説明
図 1 は、 各種濃度の過酸化水素を用いたときの化合物 1， 5 9お よびルミ ノールの発光強度の変化を示す。
符号の説明
—— O—— 化合物 1
——秦—— 化合物 5
一一□一一 化合物 9
X— ノレ ミ ノ 一ノレ 図 2は各種濃度の過酸化水素を用いたときの化合物 10， 12, 14， 23 およびルミ ノ一ルの発光強度の変化を示す。
符号の説明
—— ·—— 化合物 1 0
- -□- - 化合物 1 2
Δ—— 化合物 1 4
—— O—— 化合物 2 3
—— X—— ノレ ミ ノ ーノレ
図 3 は各種 p Hにおける化合物 1 およびルミ ノールの発光強度の変 化を示す。
符号の説明
——〇—— 化合物 1
□ ノレ ミ ノ ーノレ
図 4 は各種濃度のペルォキシダ一ゼを用いたときの化合物 1 および ルミ ノールの発光強度の変化を示す。
符号の説明
——鲁—— 化合物 1
□ ノレミ ノーノレ 図 5 は各種濃度の C E Aを用いたときの化合物 1の発光強度の変化 を示す。
符号の説明
——翁—— 化合物 1
図 6 は各種濃度の A F Pを用いたときの化合物 3 5の発光強度の変 化を示す。
符号の説明
——〇—— 化合物 3 5
図 7 は各種濃度の P A Pを用いたときの化合物 3 5の発光強度の変 化を示す。 符号の説明
—— O—— 化合物 3 5
図 8 は各種濃度の B S Aを用いたときの化合物 3 1， 3 5およびァ ク リ ジニゥムエステル （ァク リ ジニゥムー I ： 同仁化学研究所） の B
S A無添加時の発光強度に対する比率を示す。
符号の説明
——□—— 化合物 3 1
—— 化合物 3 5
〇 ァク リ ジニゥムエステル
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例を示す。
実施例 1 (ペルォキシダーゼ反応によるクマリ ン誘導体を用いる化学 発光）
2 O mmo lのリ ン酸緩衝液 （ p H 6. 0 ) 1 0 0 mlに西洋ヮサビ由来の ペルォキシダーゼ （東洋紡績製 ： 以下同じ） 1 0 0 U、 5 0 の ト リ トン X— 1 0 0および第 2表に記載のクマリ ン誘導体または比較化合 物としてのルミ ノール （東京化成製 ： 以下同じ） 各 1 0 mgを溶解し試 薬液とした。
試験管に該試薬液を 4 0 0 // 1 とり、 3 7 °Cに 1 0分間放置したの ち、 3 7 °Cの恒温状態に保たれた発光光度計 （ルミカウンター 1000 ： 日音医理科器械製作所製 ： 以下同じ） に装着し 3 mmo l 1 の過酸化水 素を 1 0 1および 1 Nの水酸化ナ ト リ ウム水溶液を 1 0 1添加し. 反応液の 1分間の積算発光量 〔発光強度 （cpm)〕 を測定した。 その結 果を第 2表に示す。 2 表
リ J ¾ Λ兀ΐ ¾ ス ィ 1卜し 口 物 "Γク J 7t ソし1 ½ ¾Κ 1 I又f
( c p m) ( c p m) レ « rJ; R < QJ 丄 1 A: 丄 し ? 0) ^ 2 7 2 3 U
1 7 fi Q fi 7 C Q O
丄 丄 / わ ΰ D ΰ y 丄 （3 D ζ 9 ^ 0 4 A Π U ft 0
A 1 O Λ C 0 厶 1 4 5 5 8 0 1 4 1 1 U b o o ό 1 8 4 9 6 7 1 D 4 0 b 7 5 4
η ΐ 八 v n
4 4 1 2 7 0 9 1 6 1 1 6 o 6 b
n
0 丄 8 d d 1 Ζ 1 1 ϋ ύ U n 9 0 n 0 c c Ο Q Q Ο o O O Q Q β D 1 o 4 o o 丄 0 Z 9 0 b 0 9 9 q
丄 丄 y 丄 1 y Q
丄 y ύ q o i
4 O Q 丄 1 < Q3 丄 1 Π U li: 4 Λ 1
丄 i QD t 0 Q 1
丄 乙
Ό 丄 O »J O 丄 1 O O ^ \J 0 7 7 0 3 9 9 2 2 1 5 0 8 0 9 1 5 0 2 9 0 0 2 3 7 6 9 1 9 8 発 光 強 度 化 合 物 発 光 強 度 ( c p m) c p m)
1 3 2 5 4 0 5 2 5 9 2 5 3 1 9 1 5 2 3 5 3 6 3 5 2 0 2 2 6 3 5 8 1 5 4 8 6 2 9 7 3 1 4 3 0 0 3 5 5 6 6 5 3 4 5 1 1 1 3 1 2 5 6 5 7 2 3 5 7 7 9 4 5 1 2 8 8 0 2 1 6 2 8 0 5 9 0 7 6 2 5 3 8 9 5 8 3 2 1 0 9 1 7 2 0 1 1 3 2 9 5 1 第 2表によれば、 本実施例に用いたクマリ ン誘導体は、 過酸化水素 の存在下ペルォキシダーゼと反応させることにより、 p H6. 0 におい てルミ ノールと同等かそれ以上の発光強度を示した。
実施例 2 (過酸化水素の定量）
2 0 mmolのリ ン酸緩衝液 （ p H6. 0 ) 1 0 0 mlにペルォキシダーゼ 1 0 0 U、 5 O mgの ト リ ト ン X— 1 0 0、 および化合物 1、 5、 9、 1 0、 1 2、 1 4、 2 3、 比較化合物と してルミ ノ ールをそれぞれ 1 0 mg溶解し試薬液と した。
試験管に該試薬液を 4 0 0 i 1 とり、 3 7 °Cに 1 0分間放置したの ち、 3 7 °Cの恒温状態に保たれた発光光度計に装着し各種濃度 （ 5 X 1 0 1 1 〜 2 X 1 0 ·" gZ反応液） の過酸化水素を 1 0 1 および 1 Nの水酸化ナ ト リウム水溶液を 1 添加し、 反応液の 1分間の積 算発光量を測定した。 その結果を図 1 および図 2 に示す。
図 1 および図 2 によれば、 用いられたクマリ ン誘導体はルミ ノール と同等かそれ以上の発光強度を示した。
実施例 3 (各種 p Hにおけるペルォキシダーゼ反応によるクマリ ン誘 導体を用いた化学発光の強度）
2 0 mmolフタル酸緩衝液 （ p H 2. 5〜5. 5 ) 、 2 0 mmolリ ン酸緩衝 液 （ p H5. 5〜8. 0 ) または 2 0 mmolホウ酸緩衝液 （ p H8. 0〜10) 各 1 0 0 mlにペルォキシダ一ゼ 1 0 0 U、 ト リ ト ン X— 1 0 0を 5 0 mgおよび化合物 1 または比較化合物としてルミ ノールをそれぞれ 1 0 mg溶解し試薬液とした。
試験管に試薬液を 4 0 0 1 とり、 3 7 °Cに 1 0分間放置したのち. 3 7 °Cの恒温状態に保たれた発光光度計に装着し 3 mmol/1 の過酸化 水素を 1 0 // 1添加し、 反応液の 1 分間の積算発光量を測定した。 最 大発光量を示した p Hにおける発光量を 1 0 0 %と したときの各 p H における発光量の比を図 3 に示す。
図 3 によれば、 化合物 1 の至適発光 p Hは酸性領域にあり、 ルミ ノ ールと比較して極めて広いことが示された。
実施例 4 (ペルォキシダ一ゼ活性の測定）
2 0 mmolのリ ン酸緩衝液 （ p H6. 0 ) 1 0 0 mlに、 5 0 mgの トリ ト ン X— 1 0 0、 および化合物 1 または比較化合物と してのルミ ノール 各 1 0 mg溶解し試薬液 1 とした。 対照として 1 0 0 mmolのホウ酸緩衝 液 （ P H9. 5 ) 1 0 0 mlに、 5 0 mgの ト リ トン X— 1 0 0およびルミ ノールを 1 0 mg溶解し試薬液 2 とした。 試験管に試薬液 1 または試薬 液 2を 4 0 0 1 とり、 3 7 °Cに 1 0分間放置したのち、 3 7 °Cの恒 温状態に保たれた発光光度計に装着し 3 0 0 mmol/1 の過酸化水素を 1 0 1および各濃度のペルォキシダ一ゼ溶液を 1 0 1添加し、 反 応液の 1分間の積算発光量を測定した。 その結果を図 4に示す。
図 4 によれば、 化合物 1 を用いた場合、 ルミ ノールを用いた場合よ り低濃度でペルォキシダーゼ活性の検量線が得られた。
実施例 5 〔癌胎児性抗原 （C E A) の定量〕
(1) ゥサギ抗ヒ ト C E A抗体のグルコースォキシダーゼ （G O D) に よ 5Bイし
抗 C E A抗体に対する G 0 Dの標識は石川らの方法 （酸素免疫測定 法、 8 2頁、 石川榮治ら編、 1987年、 医学書院刊） に従って作成した c すなわち、 N—サク シ二ミ ジル一 4— (N—マレイ ミ ドメチル） シク 口へキサン一 1 一カルボキシレー ト 〔ピアス （P I E R C E) 社製〕 を用いて G O Dにマレイ ミ ド基を導入した。 一方抗 C E A抗体をぺプ シン消化して得られた F ( a b ' ) z 画分を還元し、 S H基を遊離さ せた F ( a b ' ) を調製した。 両者を混合し反応させ、 G O D標識抗 C E A抗体を得た。
(2) 抗 C E A抗体固定化磁性粒子の調製
磁性粒子としてマグノスフヱァ 〔（Magnosphere ：商品名） ステロジ エンバイォセパレーショ ン社製、 以下同じ〕 を抗 C E A抗体固定化磁 性粒子に使用した。 0. 1 mo 1 リ ン酸緩衝液 （ p H7. 0 ) に溶解した抗 C E A抗体溶液を該微粒子に等量添加し、 カ ップリ ング試薬である水 素化ホウ素ナ ト リ ウムを終濃度 0. 1 mol になるように添加し、 2時間 攪拌し反応させた。 磁石で粒子を集め、 上清を吸引除去後、 0. 1 % B S Aおよび 0. 1 % N a N , を含むリ ン酸緩衝液を 5 0 0 u 1 加え抗 C E A抗体固定化磁性粒子と して保存した。
(3) C E Aの定量 '
2 0 mmo 1のリ ン酸緩衝液 （ p H 6. 0 ) 1 0 0 mlにペルォキシダーゼ 1 0 0 U、 5 0 mgの ト リ ト ン X— 1 0 0および化合物 1 を 1 0 mg溶解 し試薬液と した。 試験管に試薬液を 4 0 0 〃 1 とり、 3 7 °Cに 1 0分 間放置したのち、 3 7 °Cの恒温状態に保たれた発光光度計に装着した c 別に、 各濃度の標準 C E Aを 5 0 1 、 抗 C E A抗体固定化磁性粒子 を 1 0 0 1 、 G O D標識抗 C E A抗体を 1 0 0 / 1 混合し、 3 7 °C にて 1 時間反応させ、 C E Aを G O D標識抗 C E A抗体および抗 C E A抗体固体化磁性粒子に結合させた。 磁石で粒子を集め、 上清を吸引 除去後、 C E Aと結合した G 0 Dの基質と して 1 O miolのクェン酸緩 衝液 （ 0115. 0 ) に 5 4 mgZmlの濃度でグルコースを溶解した液 100 1 を加え 3 7 °Cにて 3 0分反応させた後、 停止液と して 5 0 mmolグ リ シン緩衝液 （ p H l l. 0 ) を 1 0 1 添加した。 磁石で粒子を分 離し、 この液の上清 1 0 1 を発光光度計に装着しておいた試薬液に 添加し 1分間の積算発光量を測定した。 その結果を図 5 に示す。
実施例 6 (ペルォキシダーゼ反応によるクマリ ン誘導体を用いる化学 発光）
2 0 mmolの酢酸緩衝液 （ p Η4· 0 ) 1 0 0 mlにペルォキシダーゼ 1 0 0 U、 5 0 mgの ト リ ト ン X— 1 0 0および第 3表に記載のクマリ ン誘導体または比較化合物と してのルミ ノ ール各 1 O mgを溶解し試薬 液と した。
試験管に該試薬液を 4 0 0 〃 1 とり、 3 7 °Cに 1 0分間放置したの ち、 3 7 °Cの恒温状態に保たれた発光光度計に装着し 3 mmolZl の過 酸化水素を 1 0 ^ 1および 1 Nの水酸化ナ トリゥム水溶液を 1 0 1 添加し、 反応液の 1分間の積算発光量を測定した。 その結果を第 3表 に示す。
第 3 表 化 合 物 発 光 強 度 化 合 物 発 光 強 度
c m ρ ) c m p ) ルミ ノ ール 4 7 2 1 3 2 7 8 1 5 2 0
1 1 7 3 4 5 3 0 3 3 1 3 4 9 2 1 5
2 6 2 3 0 5 3 4 1 2 6 1 8
7 3 3 4 1 4 3 5 3 6 2 5 8 7
8 2 8 2 3 1 3 8 1 1 3 5 3
2 3 3 8 0 6 7 1 3 4 0 2 4 8 3 1
2 4 9 2 5 1 8 4 1 3 1 5 2 2
2 6 5 8 0 5 7 4 2 1 3 5 0 9 0
2 9 3 4 0 0 4 4 3 2 4 4 4 2
3 0 3 4 9 5 6 6 4 4 1 2 4 1 8
3 1 1 5 5 2 1 9 9 5 6 9 7 5 1 6 第 3表によれば、 本実施例に用いたクマリ ン誘導体は、 ペルォキシ ダーゼの存在下、 過酸化水素と反応させることにより、 p H4. 0の酸 性条件においてもルミ ノールをはかるに上回る発光強度を示した。 実施例 7 (クマリ ン誘導体を用いる化学発光によるクマリ ン誘導体の 定量）
2 0 mmolの酢酸緩衝液 （ p H4. 0 ) または 2 0 mmolのリ ン酸緩衝液 ( H 6. 0 ) 1 0 0 mlにペルォキシダーゼ 1 0 0 U、 5 0 mgの ト リ ト ン X— 1 0 0および第 4表に記載のクマリ ン誘導体を所定の濃度に溶 解し試薬液と した。
試験管に該試薬液を 4 0 0 β 1 とり、 3 7 °Cに 1 0分間放置したの ち、 3 7 °Cの恒温状態に保たれた発光光度計に装着し、 3 mmolZl の 過酸化水素を 1 0 1 添加し、 反応液の 1 分間の積算発光量を測定し た。 その結果を第 4表に示す。
Figure imgf000024_0001
化 難夜中のクマリン^ ίΦ»離 (mg/ml) 口 H
物 102 ιυ 丄 υ 丄 U 100 107 108
31 4 1.13X10" 1.10X10" 9.00X10 3.80X10 37X10:' 1.02X10:' 8.20X102
32 4 6.93Χ10Γ' 5.11X10" 462X10'' 1.90X10 ―
33 4 1.10X10" 9.00Χ10' 8.32X10^ 1.20X10 ―
34 4 1.21 104 8.30Χ10:ι 418X10:'
35 4 3.60X105 Ζ50Χ10Γ' 9.00X101 9.30X103 2.30X103 1.11X103 7.00X102
37 6 8.05X10' Z43X10 8.87X10:'
38 4 1.36X10' 7.28X10'1 1.00Χ10:1
40 4 a ooxio' 6.71X10:' 440X10:'
41 4 3.59ΧΚΤ 5.00 10:ι 1.92Χ10;ι
42 4 1.51X10r' 8.11X10' 6.50X10:' 1.00Χ10:' 一
43 4 2.10X104 6.18X103 2.00X103
44 4 1.06X104 7.60X10'' 1.03X10''
46 6 2.74 X 10s 9.18X10" 1.27X101 6.59X10:' ―
47 6 6.25X104 1.68X10" 7.36X10:' 2.50X103 一
49 6 5.11XKT 2.41X10^ 1.81X10' 5.63Χ10η
50 6 1.18X10r' 7.33X101 5.40X10:' 1.00X10:'
l. yxiハu「》 6.10X101 418X10:'
52 6 6.11 101 1.32X10' 5.91X10:'
53 6 7.00X101 δ,θδχιο11 a 16X10:'
54 6 a i5xio4 了.00X10:' 1.13X103
55 6 5.90X104 3.21X10" 1.00X103
56 4 1.21X10r' 6.48X104 469X10:' 1) - ：舰していない
2 )
Figure imgf000025_0001
( c p m)を^ 。 第 4表によれば、 化合物 3 1および化合物 3 5を筆頭に、 化合物 4， 5， 8， 9， 1 2， 2 3， 3 2， 3 3， 4 2 , 4 6， 4 7， 4 9およ び 5 0 自体は極めて低い濃度まで化学発光法によつて定量することが できることが判る。
実施例 8 〔 —フ ヱ トプロテイ ン （A F P) の定量〕
(1) ャギ抗ヒ ト A F P抗体の化合物 3 5 による標識化
抗 A F P抗体に対する化合物 3 5の標識体は次のようにして作製し た。 すなわち、 化合物 3 5の有するカルボキシル基と抗 A F P抗体の 有するァ ミ ノ基とを 1 —ェチルー 3 — ( 3 —ジメチルァ ミノプロピル） カルボジイ ミ ド （以下 E D C) を用いて p H 7. 0 にて反応、 結合させ、 化合物 3 5檫識抗 A F P抗体を得た。
(2) 抗 A F P抗体固定化磁性粒子の調製
磁性粒子としてマグノスフ 二ァを抗 A F P抗体固定化磁性粒子に使 用した。 0. 1 niol リ ン酸緩衝液 （ p H7. 0 ) に溶解した抗 A F P抗体 溶液を該微粒子に等量添加し、 カ ップリ ング試薬である水素化ホウ素 ナ ト リ ウムを終濃度 0. 1 mol になるように添加し、 2時間攪拌し反応 させた。 磁石で粒子を集め、 上清を吸引除去後、 0. 1 %B S Aおよび 0. 1 %N a N3 を含むリ ン酸緩衝液を 5 0 0 1加え抗 A F P抗体固 定化磁性粒子として保存した。
(3) A F Pの定量
2 0 mmoiの酢酸緩衝液 （ p H 4. 0 ) 1 0 0 mlにペルォキシダーゼ 1 0 0 Uおよび 5 0 mgの ト リ トン X— 1 0 0を溶解し試薬液とした。 別に、 各濃度の標準 A F Pを 5 0 1、 抗 A F P抗体固定化磁性粒子 を 1 0 0 1、 化合物 3 5標識抗 A F P抗体を 1 0 0 1混合し、 3 7 °Cにて 1時間反応させ、 A F Pを化合物 3 5標識抗 A F P抗体お よび抗 A F P抗体固定化磁性粒子に結合させた。 磁石で粒子を集め、 上清を吸引除去後、 3 7 °Cの恒温状態に保たれた発光光度計に装着し、 予め 3 7 °Cに保温した試薬液 4 0 0 1 および 3 mmol/1 の過酸化水 素を 2 0 1添加し、 反応液の 1 分間の積算発光量を測定した。 その 結果を図 6 に示す。
実施例 9 〔前立腺酸性フ ォスフ ァ タ一ゼ （ P A P ) の定量〕
(1) ャギ抗ヒ ト P A P抗体の化合物 3 5 による標識化
抗 P A P抗体に対する化合物 3 5の標識体は次のようにして作製し た。 すなわち、 5 0 mgの化合物 3 5 をジォキサン 1 0 mlに溶解し、 E D C 7 5 mgおよび N —ヒ ドロキシコハク酸ィ ミ ド 5 0 mgを添加後、 室温にて 2 4時間攪拌し、 反応液を濃縮乾固した。 固形分を酢酸ェチ ル 水にて抽出し、 有機層を濃縮乾固した。 これをジォキサン 1 0 ml に再溶解し、 —ァラニン 5 0 mgを添加して室温にて 4時間反応後、 濃縮乾固し、 固形分を得た。
上記固形分とャギ抗ヒ ト P A P抗体とを E D Cを用いて p H 7. 0 に て反応、 結合させ、 化合物 3 5標識抗 P A P抗体を得た。
(2) 抗 P A P抗体固定化磁性粒子の調製
磁性粒子としてマグノ スフエアを抗 P A P抗体固定化磁性粒子に使 用した。 0. 1 mo l リ ン酸緩衝液 （ p H 7. 0 ) に溶解した抗 P A P抗体 溶液を該微粒子に等量添加し、 カ ップリ ング試薬である水素化ホウ素 ナ ト リ ゥムを終濃度 0. 1 mo l になるように添加し、 2時間攪拌し反応 させた。 磁石で粒子を集め、 上清を吸引除去後、 0. 1 % B S Aおよび 0. 1 % N a N を含むリ ン酸緩衝液を 5 0 0 1加えた抗 P A P固体 固定化磁性粒子と して保存した。
(3) P A Pの定量
2 0 mmo lの酢酸緩衝液 （ p H 4. 0 ) 1 0 0 mlにペルォキシダーゼ 1 0 0 Uおよび 5 0 mgの ト リ ト ン X— 1 0 0を溶解し試薬液と した。 別に、 各濃度の標準 P A Pを 5 0 μ. 1 、 抗 P A Ρ抗体固定化磁性粒子 を 1 0 0 /Z 1 、 化合物 3 5標識抗 P A P抗体を 1 0 0 〃 1混合し、 3 7 °Cにて 1 時間反応させ、 P A Pを化合物 3 5標識抗？八？抗体ぉ よび抗 P A P抗体固定化磁性粒子に結合させた。 磁石で粒子を集め、 上清を吸引除去後 3 7 °Cの恒温状態に保たれた発光光度計に装着し、 予め 3 7 °Cに保温した試薬液 4 0 0 1および 3 mmol/1 の過酸化水 素を 2 0 / 1添加し、 反応液の 1分間の積算発光量を測定した。 その 結果を図 7 に示す。
実施例 1 0 (タンパク質の影響）
2 0 mmolの酢酸緩衝液 （ p H 4. 0 ) 1 0 0 mlにペルォキシダーゼ 1 0 0 U、 5 0 mgの ト リ ト ン X— 1 0 0および化合物 3 1 または化合 物 3 5を 1 0 mg溶解し、 それぞれ試薬液と した。
対照化合物として、 2 0 mmolのリ ン酸緩衝液 （ p H6. 0 ) 1 0 0 ml に 5 0 mgの ト リ トン X _ 1 0 0およびァク リ ジニゥムエステル （ァク リ ジニゥムー I ： 同仁化学研究所） 0. l mgを溶解し試薬液とした。 各試薬液に所定の濃度の B S Aを添加し、 この試薬液を試験管に 4 0 0 1 とり、 3 7 °Cに 1 0分間放置したのち、 3 7 °Cの恒温状態 に保たれた発光光度計に装着した。 化合物 3 1 または化合物 3 5の場 合は、 3 mmol/1 の過酸化水素を 1 0 1 、 ァク リ ジニゥムエステル の場合は 3 mmol/1 の過酸化水素を 1 0 z 1 および 1 Nの水酸化ナ ト リゥム水溶液を 1 0 1添加し、 反応液の 1分間の積算発光量を測定 した。 その結果を図 8 に示す。
図 8 によりば、 ァク リ ジニゥムエステルに比較して、 化合物 3 1お よび化合物 3 5 は共存する B S Aの影響を極めてうけにくいことが判 る
発 明 の 効 果
本発明のクマリ ン誘導体を用いる化学発光方法によれば、 反応液の •P Hが中性から酸性側であっても微量の過酸化水素、 過酸化活性物質 もしく はクマリ ン誘導体、 または過酸化活性物質、 酸化酵素も しく は クマリ ン誘導体を化学結合させた物質 （例えば、 C E A， A F P, P A P等） をタンパク質の影響をほとんど受けることなく定量できる

Claims

1. 過酸化水素と式 （ I )
請
Figure imgf000029_0001
または式 （ Π )
の 範
( Π囲 )
Figure imgf000029_0002
(式中、 R 1 、 R2 、 R3 、 R4 、 R 5 および は同一または異な つて、 水素原子、 置換も しく は非置換の低級アルキル、 低級アルコキ シ、 置換も し く は非置換のァラルキル、 置換も しく は非置換のァ リ ー ル、 ハロゲン原子、 シァノ、 ニ トロ、 スルホ、 カルボキシ、 アルコキ シカルボニル、 アルキル力ルバモイル、 置換も しく は非置換のァ リ ー ルカルバモイル、 力ルバモイル、 ヒ ドロキシ、 置換も しく は非置換の ァ ミ ノ、 低級アルカノ ィル、 低級アルカ ノ ィルォキシまたは複素環基 を表すかまたは R ' と R 2 が一緒になってアルキレンも し く はァルケ 二レ ンを形成する力、、 または R4 と R5 がー緒になって- CH2CH2CH2NH- を形成する） で表されるクマリ ン誘導体またはその塩を、 過酸化活性 物質の存在下に反応させ、 反応液の発光量または発光強度を測定する ことを特徴とする過酸化活性物質、 過酸化水素または式 （I ) も し く は式 （Π) で表される クマリ ン誘導体の定量方法。
2. 式 （ I ) において、 R 1 が置換もしく は非置換のァリールまたは シァノであり、 R 2 、 R 3 、 R 4 及び が水素原子または置換も し く は非置換の低級アルキルであり、 R 5 が置換もく しは非置換のア ミ ノ、 二 トロまたは低級アルコキシである請求項 1記載の定量方法。
3. 式 （Π ) において、 R ' がシァノ、 アルコキシカルボニルまたは カルボキシであり、 R 2 及び R 3 が水素原子である請求項 1記載の定 量方法。
4. 定量される成分が過酸化活性物質である請求項 1記載の定量方法 <
5. 過酸化活性物質がペルォキシダーゼである請求項 4記載の定量方
6. ペルォキシダーゼが抗原または抗体に標識されている請求項 5記 載の定量方法。
7. 定量される成分が過酸化水素である請求項 1記載の定量方法。
8. 過酸化水素が酵素反応に由来する請求項 7記載の定量方法。
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