WO1993011259A1

WO1993011259A1 - Method and reagent for determination of serum iron or unsaturated iron binding capacity

Info

Publication number: WO1993011259A1
Application number: PCT/JP1992/001566
Authority: WO
Inventors: Hozumi Hamasaki; Masatsugu Nonobe; Tsuyoshi Fujita
Original assignee: Oriental Yeast Co., Ltd.
Priority date: 1991-12-02
Filing date: 1992-11-30
Publication date: 1993-06-10
Also published as: DE69226940D1; US5420008A; DE69226940T2; EP0570588B1; EP0570588A4; EP0570588A1

Description

明細書

発明の名称

血清鉄又は不飽和鉄結合能の定量法および定量試薬産業上の利用分野

本発明は血清鉄の定量方法に関し、さらに詳しくは、トランスフェリンに結合している鉄を遊離させ、鉄を加えないと活性を発現しないアポ型アコ二タ一ゼ（EC 4.2.1.3) を接触せしめて活性型としクェン酸から生じるイソクェン酸をイソクェン酸脱水素酵素（EC 1.1.1.41 , EC 1.1.1.42) の反応によって血清鉄量を定量する高感度な酵素定量方法および測定用試薬に関する。

また、本発明は不飽和鉄結合能（以降 UIBCと唣す）の酵素的定量方法に関し、さらに詳しくは、体液等の被検試料に既知濃度の過剰な鉄を添加し、トランスフェリンに鉄を飽和量結合させた後、結合しないで残余した鉄を、鉄を加えないと不活性なテポ型アコ二ターゼ（EC 4.2.1.3) に接触せしめて活性型とし、アコ二タ一ゼが触媒しクェン酸から生じるイソクェン酸をイソクェン酸脱水素酵素（EC 1.1.1.41, EC 1.1. 1.42) を検出酵素としアコ二ターゼ活性を測定することによリ UIBCを測定する UIBCの高感度な酵素的定量方法、および定量試薬に関する。.

従来の技術及びその課題

体内鉄の総量は 4 _g前後で、その 2 Z 3は赤血球へモグロビン中に、残りの 1 / 3は貯蔵鉄として肝 ' 脾 ' 骨髄その他の組織に存在する。血清鉄総量は 3〜 4 mgであり、すべて血清の ]8 -グロブリンに属する卜ランスフヱリンに結合（その 1分子は鉄 2原子を結合）して存在する。 .血清鉄濂度は、赤血球の生成と崩壊の程度によって左右され、骨髄における造血が減退すれば血清鉄の流れは停滞して、血清鉄濃度は上昇し、逆の場合は低下する。このことより血清鉄濃度は造血器の機能を反映すると考えられている。また貯蔵鉄の動態も血清鉄に関係があり、肝炎などでは肝から貯蔵鉄が動員されて他の組織に移動するため、血清鉄は上昇する。上述のように血清鉄は血液疾患（鉄欠乏性貧血、再生不良性貧血、悪性貧血、溶血性貧血、白血病、真性多血症など）のみでなく、多種の疾患（感染症、急性肝炎、肝硬変症、へモクロマトーシス、ネフローゼなど）と関係があり，その測定は臨床検査上重要視されている。

血清鉄の定量方法としては、松原法、国際標準法、オートアナライ.ザ一法、原子吸光法などがある。松原法、国際標準法の原理は、酸で鉄を遊離後、除タンパクし、還元剤で鉄を還元した後、発色剤で発色させる方法であるが、 BPT のモル吸光係数が小さく、感度が低いため多量の血清を必要とし、干渉を受けやすく、用手法であるため多検体処理は困難である。ォー卜アナライザ一法は、松原法、国際標準法の原理を単に自動化したものであるので、感度的問題はまったく解決されておらずヘモグロビン、ビリルビンなどの干渉がみられる。原子吸光法は、前処理が必要なうえ処理方法の違いによリ測定値にかなりのばらつきがみられ、感度が悪いなどの問題の他に、高価な特殊機器が必要であるなどの多くの問題点をかかえている。

発明が解決しょうとする課題

本発明は、上記した従来法の欠点を一挙に解決して、生体内の、特に血清中の鉄の量を正確に且つ熟練を要することなく簡便、迅速に測定することができ、自動化ないし多検体処理を可能とする、血清鉄の高感度分析システムを新規に開発することを、目的とするものである。

課題を解決するための丰段

本発明は、上記目的を達成するためになされたものであつて、本発明者らは、血清鉄量をすみやかに、かつ、正確に定量するために，鉄と各種酵素活性との関係を詳細に検討した結果，アコ二ターゼがその酵素活性を発現するために、鉄を要求し、血清鉄濃度の増加に応じてアコ二ターゼの活性が変化することを知り、そしてその変化を測定することによって血清鉄量が測定できることを確認し、本発明を完成するに至つた。

アコ二タ一ゼがその活性発現に鉄を要求することは良く知られている〔蛋白質核酸酵素 Vol. 22 Να 12 1293- 1302 (1977)； THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 236， Na 12 , December 1961 ； THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 242, Na8, Issue of April 25, PP. 1870-1879, 1967 ； THE JO画 Aし OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 246, Na 3 , Issue of Februar 10, PP. 772-779, 1971 ； Cell, Vol. 64, 881- 883, March 8, 1991〕。しかしながらいずれの文献も、例えば、血清鉄のような低澳度な鉄（正常値；血清男性 11.6〜 3A.9 μ Μ, 女性； 7.29~29.5 A Μ) を測定できるものはなく、臨床検査で日常使用されているような直線的なスタンダードカーブも得られてはいない。本発明の方法は、上記のような低澳度な血清鉄を直線性の良好なスタンダードカーブによつて、再現性よく高感度に測定することを可能にした。

図面の説明

図 1 は実施例 1 に記載した方法で測定した鉄の測定カーブである。

図 2は実施例 4 に記載した方法で測定した鉄の測定カーブである。

図 3は実施例 5 に記載した方法による UIBCの測定カーブである。

図 4は実施例 6 に記載した方法による UIBCの測定カーブ及びこれよリ得られる血清の UIBC値を示す。

本発明は、血清鉄の定量を行うに際し、卜ランスフェリンに結合している血清鉄を遊離させ、活性型アコ二ターゼを形成せしめ、アコ二ターゼの反応よリ生じるイソクェン酸をィソクェン酸脱水素酵素によって酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以降 NAD類という）または Zおよび、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸類（以降 1 DP類という）から、還元型 NAD類（以降 NADH類という）または/および、還元型 NADP類（以降 NADPH類という）への変化量として血清鉄濃度に依存して変化するアコ二ターゼ活性を検出することによって血清鉄量を測定することを基本的測定原理とするものである。具体的には、トランスフ X リンと結合している鉄を酸性 PHの溶液で遊離させ、少なくともアポ型ァコニターゼを溶解した緩衝液に加え、アポ ¾アコ二タ一ゼをホロ型アコ二ターゼとし、クェン酸を少なくとも含む適当な緩衝液で、 NADH類または/および NADPH類の生成量あるいは生成速度を測定することによって血清鉄量を測定するものである。

松原法、国際標準法、オートアナライザ一法、原子吸光法は 1個の鉄に対して 1個の応答しか得られないのに対して、本発明の酵素的定量法は、酵素が増幅作用を示すことにより 1個の鉄に対して多数の応答が得られるという点で高感度化、精密性につながる。また鉄への特異性が高いという点で現行の測定法より倕れている。

血清中の鉄は、すべてがトランスフェリンと結合している。そこで本発明においては、血清中のトランスフエリンから鉄を遊離せしめて、アコ二ターゼに結合させた後にアコニタ一ゼ活性を測定する力、、又は血清中のトランスフヱリンから鉄を遊離させた後にアコ二ターゼに結合させながらアコ二ターゼ活性を測定することにより、鉄を測定することとした。

そこで、血清中の卜ランスフ X リンから鉄を定量的に遊離することができ、しかも該遊離処理がその後に行う鉄の測定にはいささかも悪影響を及ぼすことがなく、そのうえ処理が簡便な方法について各方面から鋭意研究した結果、酸性雰囲気にすることによりこの目的が達成できるとの新知見を得た。したがって、本発明においては遊離工程を酸性 PH域にもっていけばよく、そのためにはすべ 6ての方法が利用可能であるが、例えば酸性の緩衝液を利用することができる。

トランスフ n リンに結合している血清を遊雜させる工程に使用できる緩衝液は、酢酸バッファー'、 G TA ノッファー、シユウ酸バッファー、リン酸バッファー、グリシンノ、'ッファ一、 H C 1- KC 1 ノッファー、重フタル酸カリウムノッファー、コハク酸バッファーなどがあげられるが、緩衝液の最適 P Hが、 1〜 5、好ましくは 2 ~ 4の範囲のものであれば良く、試薬濃度は、 1〜： L， 000 mM、好ましくは 10 ~ 500mMを用い、特に規定されることはない。また、効果的な場合には、界面活性剤，還元剤などを添加しても構わない。界面活性剤としては，陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、雨性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ステロイド骨格を持つ界面活性剤などがあげられる。

本発明に使用できる還元剤としては、ァスコルビン酸、チオーダリコーノレ酸、チォ-マレート、システィン、 N-ァセチルシスティン、ヒドロキシルァミン、 2-メルカプトエタノール、還元型グルタチオン、ジチオトレイトール、ジチォエリトリオール、臭化 2 - アミノエチルイソチォゥロニゥム及びチオダリセロールなどのほかに、アコ二ターゼへの鉄の結合を促進するものであれば何を使っても構わない。試薬濃度は、 0 〜； l，000mM、好ましくは 0 . 1〜500ιαΜを用いる。

本発明に使用できるアコ二ターゼとしては鉄の添加無添加によって活性が変化するものであればよく、特に規定されるこ ^はない。また、アポ型アコ二ターゼの調整法としては、キレート剤処理があげられる。キレート剤としては、ェチレンジアミン四齚酸類（EDTA類）、ヒドロキシェチルエチレンジアミン三酢酸（EDTA-0H)、シクロへキサンジァミン四酢酸 (CyDTA)、ジエチレン卜リアミン五齚酸（DTPA)、グリコールエーテルジァミン四酢酸（GEDTA)、トリエチレンテトラミン六酢酸（TTHA)、ジアミノプロパノール四酢酸（DPTA-0H) , o- フヱナント口リンなどが有効であり、鉄を加えていない状況でのバックグランドができるだけ小さなものが好ましい。また、エチレンジァミン四酢酸類（EDTA類）は、遊離酸型、アルカリ、ナトリウム、アンモニゥムなどの塩型のアルコール沈殿物でも結晶物でもよく、特に規定されることはない。添加する酵素濂度は、 0.01〜； 100 u ml、好ましくは 0.1〜30 u mlを用いる。

本発明に使用できるイソクェン酸脱水素酵素としては、ィソクェン酸への K m値が小さいものが好まれるが本反応によつて生成されるイソクェン酸と反応でき得るものであれば、特に規定されることはない。 NAD類に特異的なものでも、 NAD P類に特異的なものでも差し支えない。添加する酵素濃度は、 0.01- 200 u /ml, 好ましくは 0.：！〜 20 u / mlを用いる。また、イソクェン酸脱水素酵素およびアコ二タ一ゼが、その酵素活性を発現するために、マグネシウムイオンあるいはマンガンイオンを要求するが，その試薬濃度は、 0·5 μ Μ~100πιΜ、好ましくは 5 H-10mMを用いる。

本発明に使用できる NAD類または /および NADP類は、遊離酸型またはアルカリ金属やアンモニゥムなどの塩型のアルコール沈殿物でも結晶物でもよく、純度の髙いものほど望まれるが、一般に市販されている NAD類、 NADP類は十分に本発明に使用できる。 NAD類、 NADP類として NAD NADPは曾うまでもなく、チォー NAD、チォー NADPも本発明の方法に使用できる。他の NAD類、 NADP類もイソクェン酸脱水素酵素と反応できうるものは本発明の方法を応用できる。試薬濃度は、 0.0 100 mM、好ましくは 0.1〜： lOmMを用いる。

アコ二ターゼに鉄を結合させる工程、アコ二ターゼ活性を測定する工程に使用できる緩衝液は、特に規定されることはなく、 PIPES ノッファー、卜リスノッファー、トリエタノーメレアミンノッファー、グリシンノッファー、 GTA ノッファー、リン酸バッファー、ホウ酸バッファーなどがあげられるが、緩衝液の最適 PHが、 5 ~ 9、好ましくは 6〜 8の範囲のものであれば良く、試薬濃度としては、 1〜： l, 000infi、好ましくは 10〜500mMを用レ、る。

本発明の血清鉄測定用組成物は、 PH 1〜5、好ましくは PH 2〜4の第一試薬と、少なくとも 0.01〜300 u/ml、好ましくは 0.1〜 30 u /mlのアコ二ターゼを含む第二試薬と、少なくとも 0.01— 1, OOOmM, 好ましくは 0· 1〜： lOOmMのクェン酸を含む第三試薬からなり、還元剤、イソクェン酸脱水素酵素、 NAD類または/および NADP類、マグネシウムイオンまたはマンガンイオンは、第一〜第三試薬のいずれか、または、第一〜第三試薬の複数にまたがって添加使用される。逮元剤を第一 ' 第二試薬に、イソクェン酸脱水素酵素、 NAD類または/および NADP額、マグネシウムイオンまたはマンガンイオンを第三試薬に添加することが、推奨される。

また，本発明において、血清中のトランスフェリンから鉄を遊離させ、アコ二ターゼに結合させながら活性測定することにより、鉄を測定する場合の血清鉄測定用組成物は、 pH 1 〜5、好ましくは pH 2〜4の第一試薬と、少なくとも 0.01〜 30 0 u /ml, 好ましくは 0.1〜30 u Zmlのアコ二ターゼと 0.01 - 200 u /ml, 好ましくは 0·1〜20 u Zml のイソクェン酸脱水素酵素を含む第二試薬からなり、還元剤、 NAD類または Z および NADP類、マグネシウムイオンまたはマンガンイオンは、第一、第二試薬のいずれ力、、または、第一、第二試薬の複数にまたがって添加使用される。

次に、本発明における不飽和鉄結合能の酵素的定量方法について説明する。

一般に、血清鉄はすべてトランスフ X リンに結合して血液中に存在するが，健常人では、トランスフェリンはおよそ 1 / 3 が鉄によって飽和されており、残りの 2 / 3は鉄が結合していない不飽和の状態にある。 UIBCとはこの鉄が結合していない不飽和のトランスフエリン量を鉄の結合量で表すものである。血清鉄と UIBCの和を総鉄結合能（以降 TIBCということもある）というのは承知の通りである。血清鉄の測定が臨床検査上重要であることは前述した通りであるが、合わせて UIBCを測定することによってさらに詳しく病態を掌握できるようになる。 UIBCの測定は特に鉄欠乏性貧血の診断に有効で、この場合、血清鉄量の減少と UIBC · TIBCの増大が確認される。血清鉄が减少するその他の疾病、例えば慢性感染症、悪性腫 /o

瘙では UIBC · T IBCも減少するので鉄欠乏性貧血と区別が容易につく様になる。再生不良性貧血では血清鉄の増大と UIB C · TIBCの减少が観察される。 U IBC単独で測定することだけでも臨床検査上意義の大きいところであるが、血清鉄と UIBCあるいは血清鉄と TIBCを合わせて測定するとさらに詳しい情報が得られるのでさらに意義深いものとなる。

本発明の方法を良好に実施するには、（1 ) トランスフェリンを完全に鉄で飽和させるための安定なアルカリ性既知濃度の過剰な鉄溶液を調製すること、（2 ) 自動分析に対応するため、検体と鉄溶液を混和後速やかにトランスフヱリンが完全に鉄で飽和する鉄溶液であること、（3 ) 鉄溶液の鉄が卜ランスフヱリン以外に非特異吸着しない鉄溶液であることが先ず第一に要望される。

これらの内、要望（1 ) は、鉄イオン元来の性質が、硝酸，塩酸水溶液などの酸性 PH下では安定にィオンとして存在するが、微酸性からアルカリ性にすると水酸化鉄を形成し沈殿や器具への吸着を起こすため、トランスフヱリンが鉄を結合するのに好都合な PH、例えば P H 7〜： 10、好ましくは PH 8 〜 9なる P Hのもとでは鉄は安定に存在しにくいため難しいが、通常は 3価鉄より幾分安定な 2価鉄（硫酸第一鉄アンモニゥムぁるいは塩化第一鉄）を用い、ァスコルビン酸などの還元剤共存下トリスヒドロキシルメチルァミノメタン（以降トリスと略す）緩衝液中で安定化をはかっている。これでも不充分な場合には、二トリ口 3酢酸を添加しさらに安定性を向上させ方法（特公昭 52- 91 60 )を本発明の方法に適応しても良い。また特開平 2- 167476とは目的は異なるがキレート剤、例えば、エチレンジァミン- N， N' -2 酢酸、ヒドロキシェチノレイミノ 2酢酸、二卜リロ 3齚酸などを添加するのも効果的である。特開平 2-167476ではこれらキレート剤の添加により検体と鉄溶液を混和後速やかに卜ランスフ X リンが完全に鉄で飽和するようになるので、この事は要望（2) をも満足するようになる。

また要望（ 2 )を満足するその他の方法としては、グリコ一ル酸、乳酸、 α -ォキシ醏酸、グリセリン酸、タルトロン酸、リンゴ酸、酒石酸、クェン酸またはマンデル酸の様なォキシ酸をトリスに代えて緩衝液とすると卜リスに較べて速くトランスフェリンが飽和する方法（特開昭 60-69557)も本発明の方法に有効となろう。そして要望（3) は、特にアルブミンへの非特異吸着を防止する方法を組み込むかたちになるが，例えば界面活性剤を加えることで回避できることは知られている (特開平 02-156160)。

本発明の方法に特開平 02- 156160 にあるように界面活性剤を加えると効果的であることは確認されている。卜リスおよびォキシ酸緩衝液の ρΗは 7〜10、好ましくは 8〜9、使用する濃度としては 1〜l， 000mM、好ましくは 10〜 500ιηΜ、キレート剤の濃度としてはトランスフヱリンへの鉄の結合を阻害しない、かつ、アコ二ターゼへの残余鉄の結合を皆無にしないような程度がよく、キレー卜剤により最適濃度は異なるが、 0.01〜： l00mM、好ましくは 0.1〜： lOmMにて使用する。界面活性剤も種類によって最適濂度は異なるが、 0·001〜10%、好ま

しくは、 0， 01〜 5 %加えるとによリ非特異吸着はかなり抑えることができる。

アコ二ターゼが鉄を結合する時、還元剤の ^存在が必要である。上記鉄の安定化を目的に鉄溶液に加えてある還元剤の還元力でアコ二ターゼへ鉄を結合させることは可能であるが、アコニターゼ溶液に更に還元剤を添加しても差しつかえない。有効な還元剤としては、ァスコルビン酸、チォ-グリコール酸、チォ-マレート、システィン、 N-ァセチルシスティン、ヒドロキシルァミン、 2-メルカプ卜エタノール、還元型グルタチオン、ジチオトレイトール、ジチォエリトリオール、臭ィ匕 2-アミノエチルイソチォゥロニゥム及びチォ -グリセロールなどのほかに、アコ二ターゼへの鉄の結合を促進するものであれば何を使っても構わない。試薬濃度は、 0 ~ l , 000mM、好ましくは 0 . 1 ~ 500mMを用いる。

本発明に使用できるアコ二ターゼとしては、鉄の添加無添加によって活性が変化するものであれば良く、特に規定されることはない。また、アポ型アコ二ターゼの調整法としては、キレート剤処理があげられる。キレー卜剤としては、ェチレンジアミン四齚酸、' ヒドロキシェチルエチレンジァミン三酢酸、シクロへキサンジァミン四酢酸、ジエチレン卜リアミン五酢酸、グリコールエーテルジァミン四酢酸、トリエチレンテ卜ラミン六醉酸、ジァミノプロパノール四酢酸、 0 -フエナントロリンなどが有効であり、鉄を加えていない状況でのバックグランドができるだけ小さなものが好ましい。また、ェチレンジァミン四酢酸類は、遊雜酸型、アルカリ金属やアンモニゥムなどの塩型のアルコール沈殿物でも結晶物でもよく、特に規定されることはない。キレート剤処理をしてもノックグランドが小さくならない場合には CM-セ？ァロースなどで再精製をする。添加する酵素濃度は、 0.01〜100 u /ml, 好ましくは 0.1〜30 u /mlを用いる。

アコ二ターゼ活性を検出するイソクェン酸脱水素酵素としては、イソクェン酸への K m値が小さいものが好適であるが、本反応によって生成されるイソクェン酸と反応でき得るものであれば、特に規定されることはない。 NAD類に特異的なものでも、 NADP類に特異的なものでも差し支えない。添加する酵素濃度は、 0·01〜 200 u ml、好ましく 0 · 1〜 20 u mlを用いる。また、イソクェン酸脱水素酵素およびアコ二ターゼが、その酵素活性を発現するために、マグネシウムイオンあるいはマンガンイオンを要求するが、その試薬濃度は， 0.5 μ Μ〜 lOOmH, 好ましくは 5 μ M〜： !OmMを用いる。

NAD類または Zおよび NADP類としては，遊離酸型またはァノレカリ金属やアンモニゥムなどの塩型のアルコール沈殿物でも結晶物でもよく、純度の高いものほど好適であるが、一般に市販されている NAD類、 NADP類は十分に本発明に使用できる。 NAD類、 NADP類として NAD, NADPは雷うまでもなく、チォ -NAD, チォー NADPも本発明の方法に使用できる。他の NAD類、 NADP類もイソクェン酸脱水素酵素と反応できうるものは本発明の方法を応用できる。試薬濃度は、 0.01~100mM、好ましくは 0.1〜 lOmHを用いる。

本発明の UIBC測定用組成物は、 PH 7〜10、好ましくは PH 8 /

~9で、少なくとも鉄を含む第一試薬と、少なくとも 0·01〜 300 u /ml, 好まし.くは 0.1 ~30 u / mlのアコ二ターゼを含む第二試薬と、少なくとも 0.01〜； l， 000mM、 '好ましくは 0.1〜 lOOmM のクェン酸を含む第三試薬からなり、還元剤、イソクェン酸脱水素酵素、 NAD類または/および NADP頮、マグネシゥムイオンまたはマンガンイオンは、第一〜第三試薬のいずれか、または、第第三試薬の複数にまたがって添加使用される。還元剤を第一 ' 第二試薬に、イソクェン酸脱水素酵素、 NAD類または /および 1 DP類、マグネシウムイオンまたはマンガンイオンを第三試薬に添加することが、推奨される。以上のように、本発明は，反応系に酵素を用いることを特徴とする UIBCの定量方法である。また，本発明は、それに用いるための試薬ないし測定キットにも関するものである。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 1

下記表 1 に示す組成にしたがって、試薬 R 試薬 R— 2を調製した。

〔表 1〕

く試薬 R— 1 >

50 mM 酢酸ナトリウム、 PH 3.0

50 mff ァスコルビン酸

2 mM クェン酸ナ卜リウム

く試薬 R - 2>

100 ιΜ PIPESノ Sッファー、 pH 7.4

1.5 u/ml アコ二ターゼ 2. 5 u/ml イソクェ /sン酸脱水素酵素

0. 6 mM NADP +

0. 6 mM 硫酸マグネシウム

〔測定方法〕

鉄標準液は、 0 ~ 60 M硫酸第一鉄アンモニゥム液を用いたサンプル（血清検体および鉄標準液） 20 に、試薬 R— 1 60 βを加え撹拌し、 37 にて 5分間インキュベーション後、試薬 R— 2 200 μ βを加え同温度にて撹拌し、 4分間放置後 1 分間の吸光度変化量を日立 7150型自動分析機で測定した。 0 A M硫酸第一鉄アンモニゥム液の吸光度変化量を差し引きして、作図した。その結果を図 1 に示す。図 1 を見て分かるように本発明の方法を用いると、原点を通る良好な直線性が得られた。

実施例 2

試薬 R— 1 試薬 R— 2 は実施例 1 の〔表 1 〕と同様である。

〔測定方法〕

測定方法は実施例 1 と同様で、血清検体について測定した。 n数は 10 また、血清検体の変動係数を表 2 に示す。表

2 にあるように、血清検体の C V値は、 3 %以下と良好であつた。 /

表 2

血清鉄値（ # M)

検体検体 2

14.30 32.54

2 14.89 32.64

3 15.04 32.35

4 14.91 32.10

5 14.72 32.51

6 14.09 33.32

7 14.76 31.95

8 14.81 31.40

9 14.33 32.34

10 14.01 31.90

平均 14.59 32.31

S.D. 0.35 0.49

C.V(% ) 2.40 1.52

実施例 3

本測定法と和光鈍薬製キッ卜（Nitroso-PSAP直接法 Fe-TR) の雨測定法を用いて検体の血清鉄測定を行った。

本測定法の試薬 R— 1、試薬 R— 2は実施例 1 の〔表 1〕と同様である。

〔測定方法〕

測定方法は、実施例 1 と同様で、血清検体について測定した。検体数は、 10。その結果を表 3に示す。表 3 を見て分かるように本発明は血清鉄を正確に測定できる

表 3

血清検体血清鉄値（ M )

本測定法 Fe-TR法

5.38 5.24

2 7.28 7.36

3 15.29 14.86

4 19.37 20.14

5 24.79 24.45

6 32.37 32.56

7 36.17 36.73

8 42.35 41.28

9 46.35 46.50

10 53.94 54.18 実施例 4

下記表 4 に示す組成にしたがって、試薬 R 、試薬 R - 2 、試薬 R — 3 を調製した。

〔表 4〕

く試薬 R — 1 >

200 mH 酢酸ナトリウム、 PH 3.0 200 mM ァスコルビン酸

く試薬 R — 2 >

150 mM PIPESノッファー PH 6.3 50 mM ァスコルビン酸 /8

1 u/ml アコ二ターゼ

く試薬 R— 3 >

100 mM PIPESノヽ'ッファー、 PH 7.4

1 mM クェン酸ナトリウム

4 u/ml ィソクェン酸脱水素酵素

1 mM NADP⁺

1 mM 硫酸マグネシウム

〔測定方法〕

鉄標準液は、 0~ 50 琉酸第一鉄アンモニゥム液を用いた。血清検体および鉄標準液に等量の試薬 R— 1 を加え、撹拌し、サンプルカップに入れた。この混合液 20 ρβに、試薬 R 2

100 βを加え撹拌し、 37 にて 5分間インキュベーション後、試薬 R— 3 90 βを加え同温度にて撹拌し、 2分間放置後 1分間の吸光度変化量を日立 7150型自動分析機で測定した。 η数は 15.0#Μの琉酸第一鉄アンモニゥム液の吸光度変化量を差し引きして、作図した。

その結果を図 2 に示す。図 2 を見て分かるように本発明の方法を用いると、原点を通る良好な直線性が得られた。また、血清検体及び各鉄標準液の変動係数を下記の表 5に示す。表 5 にあるように、血清検体および鉄標準液の C V値は、 3 % 以下と良好であつた。 /9

表 5

C V (%)

鉄標準液

10 μ Μ 2.28

20 μ Μ 1.29

30 μ Η 1.85

40 μ Μ 1.79

50 μ Μ 1.24 血清検体

検体 1 (18 μ Μ) 1.17

検体 2 (34 μ Μ) 1.27

実施例 5

下記表 6 に示す組成にしたがって各試薬を調製し、下記する操作により自動分析機での測定を行った。

表 6

試薬一： Tb 160 mM 卜リス一塩酸緩衝液、 PH 9 試薬一 l 's 160 mM 卜リス-塩酸緩衝液、 PH 9

19 μΆ 硫酸第一鉄アンモニゥム試薬一 2 150 mM パイぺス -NaOH、 pH 6.5

50 mM ァスコノレビン酸 1 u/ml アコ二ターゼ試薬一 3 100 mM パイぺス -NaOH、 pH 7.7

(NAD系）

1 mM クェン酸ナトリウム

1 mn NAD 1 mM 琉酸マグネシウム

0.5 mM AMP

4 u/ml イソクェン酸脱水素酵素（NAD) 試薬一 3 100 mM パイぺス -NaOH、 pH7.7

(NADP¾)

1 mM クェン酸ナトリウム 1 mM NADP

1 mM 硫酸マグネシウム

4 u/ml イソクェン酸脱水素酵素

(操作）

試薬一 b：試薬一 l'sを 5 0、 4 : 1, 3 : 2, 2： 3, 1 ： 4,

0： 5に混合したもの 1:1/10量の純水を加え自動分析機（日立 7 150)のサンプルとした。試薬一 2 (100 fl) にのサンプルを加え、 37。Cで 5分間インキュベーションした。試薬一 3 (1 D系または NADP系、 90 β)を添加し同温度にて 2分間インキュベーションしたのちの 1分間の 340nmにおける吸光度の増加速度を測定した。試薬一 l'b : 試薬一 sを 5 ： 0である吸光度の変化量をブランク値とし差し引きプロットした。その結果を図 3 に示す。

図 3 にあるように本発明の方法は 0 ~190 Mの UIBC値に対し良好な直線性を示した。

実施例 6

下記表 7に示す組成にしたがって各試薬を調製し，下記する操作により自動分析機での測定を行った。

表 7

試薬一 lb : 160 mM トリス-塩酸緩衝液、 PH9 ZI

0.1 % N-ラウ口イノレサノレコシネ一ト 0.1 mM ヒドロキシェチルイミノ 2酔酸試薬 160 mM トリス-塩酸緩衝液、 PH9

0.1 % N-ラウロイルサルコシネー卜 0.1 mM ヒドロキシェチルイミノ 2醉酸 50 #M 硫酸第一鉄アンモニゥム

試薬一 2 150 mM パイぺス -NaOH、 PH6.5

50 mM ァスコルビン酸

0.5 u/ml アコニターゼ

試薬一 3 100 mM パイぺス -NaOH、 _PH7.7

(NADP系）

1 mM クェン酸ナトリウム

1 mM NADP 1 mM 硫酸マグネシウム

4 u/ml イソクェン酸脱水素酵素

(操作）

3種の血清に等量の試薬一 1 b及び試薬一 1 s を混合したものを自動分析機（日立 7150)の検体サンプルとした。 0.9% の NaClに等量の試薬一 1 b及び試薬一 1 s を混合したものを自動分析機（日立 7150)の盲検及び標準サンプルとした。試薬 - 2 (100 μ β) に 5 のサンプルを加え 37 °Cで 5分間インキュベーシヨンした。試薬一 3 (90 A £) を添加し同温度にて 2 分間インキュベーションした後の 1分間の 340nmにおける吸光度の増加速度を測定した。 0·9%の NaClに等量の試薬一 1 b を混合したものから得られる吸光度の増加速度をブランク値として 0.9%の NaClに等量の試薬一 1 s を混合したものから得られる吸光度の増加速度から差し引き UIBCのスタンダードカーブを作図した。検体サンプルは，血清に試薬一 I s を加えて得られる吸光度の増加速度から血清.に試薬一 1 b を加えて得られる吸光度の増加速度をブラング値とし差し引きスタンダードカーブにあてはめた。その結果を図 4 に示す。図中、血清の位置を矢印で示した。

S4にあるように、本発明の方法によって 3種の血清 UIBC が求められ、それぞれ、 4·5 /ίΜ、 13.4 Μ、 18.3# Μであることがわかった。

Claims

請求の範囲

. 鉄の定量を行うに際し、鉄を活性化因子とするアコニターゼを用いて鉄量を測定することを特徴'とする鉄の酵素的定量方法。

. 血清鉄の定量を行うに際し、鉄を活性化因子とするアコ二ターゼを用いて血清鉄量を測定することを特徴とする血清鉄の酵素的定量方法。

. 血清中のトランスフェリンから鉄を遊離させる工程と、遊離した鉄をアコ二ターゼに結合させる工程と、アコニターゼ活性を測定する工程とからなることを特徴とする血清鉄の酵素的定量方法。

. 血清中の鉄と.結合している卜ランスフェリンから鉄を遊離させる工程と、遊離した鉄をアコ二ターゼに結合させながら、アコ二ターゼ活性を測定する工程からなることを特徴とする血清鉄の酵素的定量方法。

. 酸性 P H下で、血清中の鉄と結合しているトランスフヱリンから鉄を遊離させることを特徴とする請求項 3 〜 4 に記載の血清鉄の酵素的定量方法。

. 還元剤を用い、アコ二ターゼにトランスフェリンから遊離した鉄を結合させることを特徴とする請求項 3 〜 4 に記載の血清鉄の酵素的定量方法。

. 還元剤が、ァスコノレビン酸、チ才-グリコール酸、チォ- マレ— 卜、システィン， N-ァセチルシスチイン、ヒド tl キシルァミン、 2-メルカプ卜エタノール、還元型ダルタチォン、ジチオトレイトール、ジチォエリ卜リオ一ル、臭化 2- %

アミノエチルイソチォゥロニゥム及びチォ - グリセロールからなる群から選ばれたものであることを特徴とする請求項 5 に記載の血清鉄の薛素的定量方法。

8 . アコ二ターゼ活性をイソクェン酸脱水素酵素によって検出することにより血清鉄量を測定することを特徴とする請求項 3 4に記載の血清鉄の酵素的定量方法。

9 . イソクェン酸脱水素酵素の補酵素として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類またはノおよび、ニコチンァミドアデニンジヌクレオチドリン酸類、を用いることを特徴とする請求項 3 4 に記載の血清鉄の酵素的定量方法。

10 . アコ二ターゼ、還元剤、クェン酸、イソクェン酸脱水素酵素、及び、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類

(若しくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸類）を少なくとも使用することを特徴とする鉄の測定用試薬。

11 . 酸性 PH下で、血清中の鉄と結合しているトランスフエリンから鉄を遊離させることを特徴とする血清鉄の酵素的測定用試薬。

12 . 酸性 PHとしては、 P H 1 5、好ましくは 2 4 を用いる請求項 11に記載の血清鉄の酵素的測定用試薬。

13 . 還元剤を用い、アコニタ一ゼに卜ランスフヱリンから遊離した鉄を結合させることを特徴とする血清鉄の酵素的測定用試薬。

14. 還元剤が、ァスコルビン酸、チォ-グリコール酸、チオ- レ— k、システィン、 N -ァセチルシスティン、ヒドロキ %

シルァミン、 2-メルカプトエタノール、還元型グルタチ才ン、ジチオトレイトール、ジチォエリトリオール、臭化 2- アミノエチルイソチォゥロニゥム及びチォ - グリセロールからなる群から選ばれたものであることを特徴とする請求項 13に記載の血清鉄の酵素的測定用試薬。

15. 還元剤の試薬濂度は、 0〜l， 000mM、好ましくは 0〜 500mM を用いる血清鉄の酵素的測定用試薬。

16. アコ二ターゼの酵素濂度は、 0,01〜 300u/ml、好ましくは 0.1~30u/inlを用いる血清鉄の酵素的測定用試薬。

17. イソクェン酸脱水素酵素の酵素濂度は、 0.01〜 200u/ml、好ましくは 0.1〜20u/mlを用いる血清鉄の酵素的測定用試薬。

18. イソクェン酸脱水素酵素の補酵素として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類または Zおよび、ニコチンァミドアデニンジヌクレオチドリン酸類、を用いることを特徴とする血清鉄の酵素的測定用試薬。

19. 補酵素の試薬濂度は、 0.01〜： l00mM、好ましくは 0.1〜10 mMを用いる請求項 18に記載の血清鉄の酵素的測定用試薬。 20. PH 1〜5、好ましくは PH 2〜4の第一試薬、少なくとも 0.01~ 300u/ml, 好ましくは 0. l〜30u/mlのアコ二ターゼを含む第二試薬と、少なくとも、 0.01〜l， 000mM、好ましくは 0.1〜100mMのクェン酸を含む第三試薬からなる酵素的測定用試薬。

21. pH 1〜5、好ましくは PH 2〜4の第一試薬と、少なくとも 0.01〜 300u/ml、好ましくは Ο·1〜 3 0 u/mlのアコ二タ一ゼと 0. 01〜 200u/ml、好ましくは 0.：!〜 20u/mlのイソクェン酸脱水素酵素を含む第二試薬からなる血清鉄の酵素的測定用試薬。

2 . 被検試料に過剰な鉄を添加し、被検試料中の卜ランスフエリンに鉄を結合させる工程と、結合しない余った鉄をァコニターゼに結合させる工程と、アコ二ターゼ活性を測定する工程からなることを特徵とする不飽和鉄結合能の酵素的定量方法。

3 . トランスフェリンに鉄を結合させる工程にキレート剤を添加することを特徴とする請求項 22に記載の不飽和鉄結合能の酵素的定量方法。

. トランスフエ.リンに鉄を結合させる工程に界面活性剤を添加することを特徴とする請求項 22に記載の不飽和鉄結合能の酵素的定量方法。

. アコ二ターゼ活性をイソクェン酸脱水素酵素によって検出することにより不飽和鉄結合能を測定することを特徵とする請求項 22〜請求項 24のいずれか 1項に記載の不飽和鉄結合能の酵素的定量方法。

. イソクェン酸脱水素薛素の補酵素として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類または/および、ニコチンァミドアデニンジヌクレオチドリン酸類、を用いることを特徴とする請求項 25に記載の不飽和鉄結合能の酵素的定量方法。

. 鉄を活性化因子とするアコ二ターゼを用いて不飽和鉄結合能を測定することを特徵とする不飽和鉄結合能の酵素的 Z7

定量試薬。

. 被検試料に過剰な鉄を添加し、トランスフヱリンに鉄を結合させる工程と、結合しないで余った鉄をアコ二ターゼに結合させる工程と、アコ二タ一ゼ活性を測定する工程からなることを特徴とする不飽和鉄結合能の酵素的定量試薬。

. トランスフヱリンに鉄を結合させる試薬にキレ一ト剤を添加することを特徴とする請求項 27または請求項 28に記戟の不飽和鉄結合能の酵素的定量試薬。

. トランスフヱリンに鉄を結合させる試薬に界面活性剤を添加することを特徴とする請求項 27または請求項 28に記載の不飽和鉄結合能の酵素的定量試薬。

. アコ二ターゼ活性をイソクェン酸脱水素酵素によって検出することにより不飽和鉄結合能を測定することを特徴とする請求項 27〜請求項 30のいずれか 1 項に記載の不飽和鉄結合能の酵素的定量試薬。

. イソクェン酸脱水素酵素の補酵素として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類またはノおよび、ニコチンァミドアデニンジヌクレオチドリン酸類、を用いることを特徴とする請求項 31に記載の不飽和鉄結合能の酵素的定量試