WO1993009869A1

WO1993009869A1 - Adsorbant pour le facteur viii de la coagulation sanguine

Info

Publication number: WO1993009869A1
Application number: PCT/JP1992/001480
Authority: WO
Inventors: Naofumi Ito; Shigeru Igarashi; Tohru Suzuki; Tsugikazu Tomono; Sadayoshi Sekiguchi
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd; Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1991-11-12
Filing date: 1992-11-12
Publication date: 1993-05-27
Anticipated expiration: 1994-05-12
Also published as: JPH05262664A; AU2932992A

Description

明細書

血液凝固第 V I I I 因子の吸着材技術分野

本発明は、血液凝固第 V I I I 因子（以後、屡々、単に "第 V I I I 因子" と称す）の吸着材に関する。更に詳しくは、第 V I I I 因子を含む種々の血漿蛋白質を含有する溶液から第 V I I I 因子を効率的に吸着、回収するのに適した、ポリカチオンを有する分子が水不溶性担体に結合 · 固定化された複合体よリなる吸着材に関する。

背景技術

血液凝固は、多種類の因子が複雑に関与する現象でぁリ、これらの因子の質的或いは量的な欠損は出血性疾患として観察される。先天的な出血性疾患の例として血友病 Aを挙げることができる。血友病 Aは、第 V I I I 因子と呼ばれる蛋白質の欠損によるもので、血友病 A患者が健常者と変わらない生活を営むためには、不足している第 V I I I 因子を補充ずる必要がある。

第 V I I I 因子を補充するために、第 V I I I 因子濃縮製剤と呼ばれる血漿分画製剤が広く用いられている。第 V Ϊ I I 因子濃縮製剤は通常、クリオプレシピテートと呼ばれる血漿からの沈澱物を原料とし、フイブリノゲンゃフイブロネクチン等の夾雑蛋白質を除去することにより調製されている

[ S . J . S l i c h t e r e t a 1 . ： T r a n s f u s i o n , V o l . 1 6 , P P . 6 1 6 - 6 2 6 ( 1 9 7 6 ) ] 。

クリ ^プレシピテ一トは、新鮮凍結血漿を低温下で融解することによリ生じる沈澱を遠心分離して得ることができる。しかし、血漿に含まれる第 V I I I 因子を 1 0 0 %とすると、クリオプレシピテートでの第 V I I I 因子の回収率は 4 0〜 5 0 %と低値である。さらに、クリオプレシピテート中には夾雜蛋白質が多く含まれているため、それらの夾雑蛋白質を除去する必要があリ、一般にジェチルァミノェチル基のような低分子リガンドを水不溶性担体に固定化した吸着材 [ C . M i c h a l s k i e t a 1 . ： V o x S a n g , V o 1 . 5 5 , p p . 2 0 2 - 2 1 0 ( 1 9 8 8 ) ] が使われることが多いが、この吸着材は、血液凝固第 I X因子（以後、屡々、単に "第 I X因子" と称す）が第 V I I I 因子と共存する場合には、第 I X因子の方をよリ多く吸着するため、第 V I I I 因子濃縮製剤を調製するまでには更に複雑な精製 X 程が必要となリ、最終的な製剤における第 V I I I 因子の回収率は約 2 0 %にまで低下するという問題点がある。

以上のような問題点を解決するため、血漿から直接、或いは、クリオプレシピテート分取後の上清から効率よく第 V I I I 因子を吸着、回収することのできる吸着材の開発が望まれていた。

第 V I I I 因子は分子量約 3 0万の蛋白質でぁリ、そのァミノ酸配列解析から、酸性アミノ酸に富む領域の存在することが知られてレヽる [ G . A . V e h a r e t a 1 . ： N a t u r' e , V o l . 3 1 2， p p . 3 3 7 - 3 4 2 ( 1 9 8 4 ) ] 。さらに、血液中では分子量 1 0 0万〜 2， 0 0 0 万のマルチマー構造を有するフォンヴィルブランド因子との複合体として存在することが知られている（ Z . M . R u g g e r i e t a 1 . ： B l o o d , V o l . 5 7， P P . 1 1 4 0 - 1 1 4 3 ( 1 9 8 1 ) ) 。

本発明者らは、鋭意研究の結果、このような巨大な分子量を有する蛋白質を効率良く吸着するためには、陰イオン交換基を多数個有し且つ十分な長さを有していて、該複合体と複数点で相互作用することによリ強固に吸着することが可能な物質を有する吸着材が好適であることを知見した。更にこのような吸着材を開発すべく鋭意検討の結果、ポリカチオンを有する分子が水不溶性担体に結合，固定化してなる複合体よリなる吸着材が第 V I I I 因子に対して極めて特異的な吸着— 挙動を示し、第 V I I I 因子を含む種々の血漿蛋白質を含有する溶液から第 V I I I 因子を高い選択率と高い収率で吸着、回収することができることを知見した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。

発明の開示

したがって、本発明の 1 つの且つ主たる目的は、第 V I I I 因子を含む種々の血漿蛋白質を含有する溶液から第 V I I I 因子を直接、特異的且つ効率的に吸着することのでき、しかも吸着された第 V I I I 因子の脱着 · 回収が容易にできる吸着林提供することである。

本発明の上記及び他の諸目的、諸特徴、諸利益は、次に述ベる本発明の詳細な説明及び添付の請求範囲の記載から明らかになろう。

本発明によれば、ポリカチオンを有する分子が水不溶性担体に結合 · 固定化されてなる複合体よリなリ、ポリカチオンを有する分子の分子量が少くとも 1 5， 0 0 0であリ、該複合体 1 ミリリットルあたリの正電荷密度が l e q〜 2 0 0 e qであることを特徴とする血液凝固第 V I I I 因子の吸着材が提供される。

本発明の吸着材に固定化されたボリカチオンを有する分子は、 1分子の分子量が少くとも 1 5， 0 0 0であリ、分子中に陰イオン交換基を多数個持つものをいう。陰イオン交換基としては、一級ァミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、 ΕΓ 級アンモニゥム塩基等をあげることができる。これらの陰ィオン交換基の 1種類が単独でポリカチオンを有する分子の中に存在してもよく、また、 2種類以上が存在してもかまわなレゝ

このような分子の例として、側鎖に陰イオン交換基を有する塩基性ビュル単量体の単独重合体、または、該塩基性ビニル単量体と、それと共重合し得るビュル単量体との共重合体を挙げることができる。また、該塩基性ビニル単量体のかわリに、重合後に陰イオン交換基をつけることのできる側鎖を有するビニル単量体を用いることもできる。さらに、リジンやアルギニン等の塩基性アミノ酸を含むポリべプチドを挙げることができる。

側鎖に陰イオン交換基を有する塩基性ビニル単量体としては、一級ァミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、四級アンモニゥム塩基を有するビニル単量体が含まれる。このようなビエル単量体の例としては、それぞれァミノ基を有するァクリル酸誘導体、メタアクリル酸誘導体、アクリル酸アミド誘導体およびメタアクリル酸アミド誘導体、更には側鎖にピリジル基、イミダゾリル基等の含窒素芳香環基を有するビニル化合物、およびアミノ基で置換されたスチレン誘導体等が用レヽられる。具体的な例として、ジメチルアミノエチルアタリレート、ジェチルアミノエチルアタリレート、ジメチルアミノプロピルァクリレート、 3 —ジメチルァミノ一 2 — ヒドロ- キシプロピルアタリレート、 3 —ジェチルアミノー 2 — ヒドロキシプロピルァクリレート、 N —ジメチルアミノエチルァクリル酸アミド、 N —ジェチルアミノエチルァクリノレ酸アミド、ジメチルアミノエチルメタァクリレート、ジェチルアミノエチルメタアタリレート、ジェチルァミノプロピルメタァタリレート、 3 —ジメチルアミノー 2 — ヒドロキシプロピルメタアタリレート、 3 —ジェチルァミノ一 2 — ヒドロキシプ口ピルメタァクリレート、 N—ジメチルアミノエチノレメタァクリル酸アミド、 N—ジェチルアミノエチルメタアクリル酸ァミド、'および次式：

(但し、 Rは一 C H₃または一 C ₂H₅、 Xは（C H₂) n は 3の整数である）

で示されるスチレン誘導体を挙げることができる

また、例えば、 _CHz-CH

のような、重合後にァミノ化のできる側鎖を有するビニル単— 量体を用いることもできる。

上述の塩基性ビニル単量体と共重合し得るビニル単量体の例としては、 N— ビエルピロリドン、アクリル酸エステル、メタアタリル酸エステル、 N—アルキルァクリル酸ァミド、 N—アルキルメタァクリル酸アミド等を挙げることができる < このようなビニル単量体で好ましい具体的な例としては、ヒドロキシェチルァクリレート、ヒドロキシプロピノレアクリレート、ヒドロキシェチノレメタァクリレート、およびヒドロキシプロピルメタァクリレートを挙げることができる。

上に拳げた、ポリカチオンを有する分子の例のうち、塩基性ビュル単量体として、アミノ基を有するアクリル酸誘導体、メタアクリル酸誘導体、アクリル酸アミド誘導体またはメタアクリル酸アミド誘導体を用い、塩基性ビニル単量体と共重合し得るビニル単量体として、アクリル酸エステル、メタァクリル酸エステル、 N—アルキルアクリル酸アミドまたは N —アルキルメタァクリル酸アミドを用いて得られる共重合体が好ましい。 '

本発明のポリカチオンを有する分子の分子量は、少くとも 1 5， 0 0 0である。分子量がこれよリ小さレ、ときには、第 V I I I 因子が極めて巨大な蛋白質であるために、該分子と第 V I I I 因子との十分な相互作用が期待しにくい。また、本発明の吸着材は、それを構成するポリカチオンを有する分子および水不溶性担体よるなる複合体 1 ミリリットルあたリ' の正電荷密度が l e q〜 2 0 0 e qである。該複合体 1 ミリリットルあたリの正電荷密度が 1 μ e q未満の場合には、第 V I I I 因子が十分に吸着されず、また、 2 0 0 iu e q を越える場合には、第 V I I I 因子の吸着が強くなリ溶出が困難になることや他の蛋白質の吸着も多くなる等の問題が生じてくる。なお、本発明の吸着材を構成する複合体の正電荷密度は、以下に示す方法にょリ求めたものをいう。水で膨潤させた吸着材 1 ミリリットルをプラスチック製カラムに入れ 1 規定塩酸、水、 1規定水酸化ナトリウム水溶液の順で洗った後、カムからの落下液の p Hが 6 . 5程度になるまで水で洗う。その後、 5 0 ミリリツトルの試験管に吸着材を移して 0 . 0 1規定塩酸 2 0 ミリリットルを入れて 2 4時間ゆるやかに振とうする。上清 5 ミリリットルを、 2 0 ミリリットルの三角フラスコに移し、フエノールフタレイン水溶液を指示薬として入れ、 0 . 0 1規定水酸化ナトリウム水溶液で、ビュレツトを用いて滴定を行うことによリ測定し、正電荷密度を求める。

本発明で用いられる水不溶性担体は、親水性担体、疎水性 '担体いずれも使用できるが、疎水性担体では第 V I I I 因子以外の蛋白質の該担体への非特異的吸着が生じるため、親水性担体の方が好ましい結果を与える。

又、水不溶性担体はポリカチオンを有する分子を化学結合によリ固定化するのに利用できる官能基を有するものであれ一ば特に限定されない。化学結合は共有結合によるものが好ましい。該官能基を水不溶性担体自体が持たない場合でも、適当な化学的修飾によリボリカチオンを有する分子の固定化に利用し得る官能基を生じさせることができるものは、本発明に使用することができる。

水不溶性担体の形状は、粒子状、繊維状、中空糸状、膜状等いずれの公知の形状も用い得るが、吸着材としての取扱い等の点から、粒子状、繊維状のものが好ましい。

このような水不溶性担体のうち粒子状担体としては、ァガロース ^、デキストラン系、セルロース系等の天然高分子系担体、ポリアクリルアミド系、ポリアミド系、ポリエステル系、ポリウレタン系、ビニル化合物の重合体等の合成高分子系担体を挙げることができる。多孔性構造を有する担体を用いると、担体の表面積が増大するため、固定化されたポリ力チオンを有する分子と、第 V I I I 因子との接触が容易になリ、吸着される第 V I I I 因子の量が増すという良好な結果を与える。特に、親水性モノマ一単位によリ親水化されたビニル化合物の重合体が、多孔性構造の担体を作リやすく、また、物理的強度の大きい担体が得やすいため、第 V I I I 因子の精製工程に組入れる時に、好ましい結果を与える。なかでも、ビュルアルコール単位を有する架橋共重合体が蛋白質の担体への非特異的吸着が少なくなり、好ましい結果を与えることが多い。また、繊維状担体としては、セルロース系、一ポリエステル系等公知の繊維を用いることができる。繊維状担体を用いる場合には、その繊維径が 0 . 0 2デニールないし 1 0デニールの範囲にあるものが良い。 ' 多孔性構造を有する粒子状担体は、排除限界分子量が 1 , 0 0 0ないし 1 0 0， 0 0 0， 0 0 0の範囲であり、平均粒子径が 5ないし 1， 0 0 0 μ πιであるものが好ましい。

ポリカチオンを有する分子の水不溶性担体への結合 · 固定化には、化学結合、特に共有結合による方法を用いるのがよレ、。そのためには、通常、固定化酵素やァフィ二テイクロマトグラ ^ィ一で用いられる公知の水不溶性担体の活性化方法およびポリカチオンを有する分子の固定化方法を用いることができる [笠井献一ら：「ァフィニティーク口マトグラフィ一」日本囯、（株）東京化学同人発行（ 1 9 9 1 ) ：] 。また、必要に応じて水不溶性担体とボリカチオンを有する分子との間に任意の長さの分子（スぺーサ一）を導入して使用することもできる。

水不溶性担体を活性化して生じる活性基は、ポリカチオンを有する分子のアミノ基、カルボキシル基、水酸基、チォール基等の活性水素を有する求核反応基と反応し得る基であリ、具体的には、エポキシ基、トレシル基（ t r e s y 1 g r

0 u p ) (— O— S 0 ₂— C H ₂— C F ₃ ) 、イミダゾリルカルバメート基、イミドカーボネート基、カーボネート基、ホルミル基、ブロモアセチル基、ハロゲン化トリアジン基などを挙げることができる。

本発明の吸着材は、第 V I I I 因子を含む種々の血漿蛋白質を含有する溶液と接触させることによリ、該溶液中の第 V

1 I I 因子を吸着する。この時の第 V I I I 因子を含む種々の血漿蛋白質を含有する溶液としては、血漿、あるいは血漿からの生成物を挙げることができる。血漿からの生成物としては、前述のクリオプレシピテート、血漿からクリオプレシピテートを分離除去した後の上清、イオン交換樹脂等による適当な処理を施して夾雑成分の一部または全部を除去した血漿などを挙げることができる。

本発明の吸着材は種々の条件下で、血漿中の第 V I I I 因子を吸着することが可能であるが、通常は、常温、常圧での吸着を行うのが、第 V I I I 因子の安定性の点から好ましい。温度は、第 V I I I 因子の安定な範囲でおこなわれるが、通常、 0〜 5 0 °Cで行う。吸着時間も特に限定はされないが、通常は、 1 0分〜 2時間の範囲で行うが、温度、吸着の方法によリ、適当な時間を選択することができる。

吸着の方法については、回分式またはカラム式のどちらでも実施し得るが、多量の血漿を処理する場合には回分式の方が短時間で処理できるため好ましいことが多い。

使用する吸着材の量については、吸着材/血漿の比の値が低いほど、コストの点から有利であるが、本発明の吸着材では、吸着材/ 血漿の容量比の値が 1 Z 2 0 〜 1 1 0 0 の囲で用いることができる。

発明を実施するための最良の形態

以下の実施例において、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明ほ実施例に何ら限定されるものではない。

実施例 1

水不溶性担体として、ビニルアルコール単位を有する架橋共重合体を下に示すようにして合成した。酢酸ビニル 1 0 0 g、トリァリルイソシァヌレート 6 4. 3 g、酢酸ェチル 1 0 0 g、ヘプタン 1 0 0 g、ポリ酢酸ビニル（重合度 5 0 0 ) 7. 5 gおよぴ 2 , 2 ' —ァゾビスイソブチロニトリル 3. 8 gょリなる均一混合液と、ポリビニルアルコール 1重量⁰ /₀、 V ン酸 2水素ナトリウム 2水和物 0. 0 5重量。 /₀およびリン '酸水素 2ナトリウム 1 2水和物 1 . 5重量％を溶解した水 4 0 0 ミリリットルとを混合し、 +分撹拌したのち、 6 5でで 1 8時間、さらに 7 5 °Cで 5時間加熱撹拌して、懸濁重合を行い、粒状架橋共重合体を得た。この架橋共重合体を洗浄後、水酸化ナトリウム 4 6 . 5 gを含むメタノール 2 リットルど共に 4 0 °Cで 1 8時間撹拌して、架橋共重合体のケン化反応を行い、ビニルアルコール単位を有する架橋共重合体よリなる水不溶性担体を得た。この水不溶性担体の平均粒子径は、 1 0 0 m、排除限界分子量は、 2 , 0 0 0， 0 0 0であつた。

次に、ポリカチオンを有する分子として、次に示すような共重合体を合成した。 X 3

2 — ヒドロキシェチルメタアタリレート 0 . 8 モルとジェチルアミノエチルメタァクリレート 0 . 2 モルを含むエタノール溶液 1 リットルに、重合開始剤として 2 ， 2 ' 一ァゾビスイソプチロニトリノレ 0 . 0 0 5 モルを力 Qえて、 6 0 °Cで 8 時間、ラジカル共重合反応を行った。このようにして得たポリカチオンを有する分子の分子量を、ジメチルホルムアミドを溶離液としたゲル浸透クロマトグラフィー（カラム：ショゥデックス A D - 8 0 M Z S , 日本国、昭和電工（株）製）により求めたところ、 1 8 万（ポリエチレングリコール換算）であった。

上記で得た水不溶性担体としての架橘共重合体（アセトンで膨潤したもの） 3 ミリリットルをアセトン 2 . 1 ミリリツトル中に懸濁して、この懸濁液に、トレシルク口ライド 4 5 マイクロリツトル、ピリジン 1 3 5 マイクロリットノレを加えて、室温で 1 0分間振とうして、活性基としてトレシル基を有する活性化担体を得た。一上記の、 2 — ヒドロキシェチルメタァクリレートとジェチルアミノエチルメタァクリレートの共重合体 3 0 O m g を 5

0 %ジメチルホルムアミド水溶液 6 ミリリットルに溶解'した溶液に、上記の活性化担体 3 ミリリツトルを加え、水酸化ナトリウム水溶液で P Hを 8 に調整した後、室温で 2 4 時間振とうして、上記のポリカチオンを有する分子が上記水不溶性担体に結合 · 固定化されてなる複合体である吸着材を得た。水酸化ナトリゥム水溶液による滴定から求めた該吸着材 1 ミリリツトルあたリの正電荷密度は、 4 0 /^ e qであった。このようにして得られた吸着材 0 . 2 ミリリットルと健常者血漿 4 ミリリットルをプラスチック製試験管に入れ、室温で 1時間緩やかに回転しながら撹拌して吸着実験を行つた。血液凝固第 V I I I 因子活性測定用の市販キット（テストチーム F V I I I 、日本国、第一化学薬品（株）製）を用いて、吸着実験前後の血漿中の血液凝固第 V I I I 因子活性を測定したところ、吸着実験後の血漿中の第 V I I I 因子活性は、吸着実験前の 7。/。であつた。

この第 V I I I 因子活性測定の結果が、第 V I I I 因子の '失活によるものではなく、本発明の吸着材に第 V I I I 因子が吸着された結果であることを確認するために、血液凝固第 V I I I 因子抗原測定用の市販キット（アセラクロム F V I I I R ： A g 日本国、ベーリンガーマンハイム山之内（株）製）を用いて、上記の吸着実験前後の血漿中の血液凝固第 V I I I 因子抗原量を測定したところ、吸着実験後の第 V I I I 因子抗原量は吸着実験前の 1 0 %であった。

吸着実験後の第 V I I I 因子活性及び第 V I I I 因子抗原量の減少が対応することから、血漿中の第 V I I I 因子は、本発明の吸着材に吸着されたことが確認された。なお、この活性と抗原量との対応は、以後の実施例においても同等であつた。次に、第 V I I I 因子を取得するために本発明の吸着材を用いる時の有用性を確認するために、上記の吸着実験後の吸着材からの第 V I I I 因子の溶出実験を行なった。

吸着実験後の吸着材をプラスチック製カラムに移し、 1 0 mMクェン酸ナトリウム水溶液（ P H 7 . 4 ) 2 ミリリットルで 3回洗浄した。その後で、 2 O mMリン酸ナトリウム、 1 %リジン、 1 M塩化ナトリウム、 2 0 %エチレングリコール、 1 % トリトン X 1 0 0 を含む水溶液（ P H 6 . 0 ) 2 ミリリットルを 2回用いて、第 V I I I 因子を溶出させた。溶出液中に含まれる第 V I I I 因子活性を測定したところ、吸着実験に用いた血漿中の 6 9 %の第 V I I I 因子が回収されていた。

以上のように、高い回収率で第 V I I I 因子が回収されることが確認された。なお、以後の実施例においても、同様に高い回収率が得られた。

実施例 2 一実施例 1 で得た水不溶性担体 1 0 ミリリットルを 1 2 ミリリットルのジメチルスルフォキシド中に懸濁させ、この懸濁液に、 8 ミリリットルのェピクロロヒドリンと 1 ミリリクトルの 5 0 %水酸化ナトリゥム水溶液を加え、 3 0 °Cで 5時間振とうして、活性基としてエポキシ基を有する活性化担体を得た。

実施例 1 で合成したポリカチオンを有する分子 1 3 5 m g を 5 0 %ジメチルホルムアミド水溶液 1 3 . 5 ミリリットノレに溶解した溶液に、上記のようにして得た活性化担体 9 ミリリットルを加え、水酸化ナトリウム水溶液で p Hを 1 2 に調整した後、 4 5 °Cで 2 0時間振とうして、 2 — ヒドロキシェチルメタァクリレートとジェチルアミノエチルメタアタリレートとの共重合体を固定化した吸着材を得た。水酸化ナトリゥム水溶液による滴定から求めた該吸着材 1 ミリリットルあたリの正電荷密度は、 1 1 0 / e qであった。

実施例 1 と同様に、健常者血漿を用いて吸着実験を行ったところ、吸着実験後の血漿中の第 V I I I 因子活性は吸着実験前の 1 6 %であった。

実施例 3

水不溶性担体としてァガロース系担体であるセファロース (フアルマシア社、スウェーデン）を用いた。実施例 1 で合成した 2—ヒドロキシェチルメタァクリレートとジェチルァミノェチルメタァクリレートの共重合体 6 O m g を 5 0 %ジメチルホルムアミド水溶液 6 ミリリットルに溶解した溶液に、トレシル基を活性基として有する活性化担体として、市販のトレシル活性化セファロース 4 B (フアルマシア社、スゥェ一デン） 3 ミリリットルを加えて、水酸化ナトリウム水溶液で p Hを 8 に調整した後、室温で 2 4時間振とうして、吸着材を得た。水酸化ナトリウム水溶液による滴定から求めた該吸着材 1 ミリリットルあたリの正電荷密度は 1 2 μ e qであつた。

実施例 1 と同様に、健常者血漿を用いて吸着実験を行ったところ、' 吸着実験後の血漿中の第 V I I I 因子活性は吸着実験前の 1 0 %であった。

実施例 4

水不溶性担体として親水性ビュルポリマー系担体であるトョパール（日本国、東ソ一. （株）製）を用いた。トレシル基を活性基として有する活性化担体として、市販の A F— トレシルトヨパール 6 5 0 ( B本国、東ソー（株）製） 3 ミリリットルを、実施例 1 で合成した 2 —ヒドロキシェチルメタァタリレートとジェチルアミノエチルメタァクリレートとの共重合体 3 0 O m g を 5 0 %ジメチルホルムアミド水溶液 6 ミリリットルに溶解した溶液に加えて、水酸化ナトリゥム水溶液で P Hを 8 に調整した後、室温で 2 0時間振とうして、吸着材を得た。水酸化ナトリウム水溶液による滴定から求めた該吸着材 1 ミリリットルあたりの正電荷密度は 2 0 μ e qであつ 7こ ₀

実施例 1 と同様に、健常者血漿を用いて吸着実験を行ったところ、吸着実験後の血漿中の第 V I I I 因子活性は、吸着実験前の 2 8 %であった。

実施例 5

水不溶性担体として実施例 1 で合成したビュルアルコール単位を有する架橋共重合体を用い、実施例 1 と同様にして、ェピクロロヒドリンを用いてエポキシ基を活性基として有する活性化担体を得た。ポリカチオンを有する分子として、ポリー L一リジン（分子量 2万、 I C Nィムノバイオロジカル社、アメリカ）を l O O m g Zミリリットルの濃度になるように 0. 2 Mリン酸ナトリゥム水溶液（ P H 1 0 ) に溶解した溶液 6 ミリリツトルに、上記の活性化担体 3 ミリリットルを加え、 4 5 °Cで 2 0時間振とうして、吸着材を得た。水酸化ナトリゥム水溶液による滴定から求めた該吸着材ジ y ットルあたリの正電荷密度は 9 2 μ e qであった。

実施例 1 と同様に、健常者血漿を用いて吸着実験を行ったところ、吸着実験後の血漿中の第 V I I I 因子活性は吸着実験前の 2 8 %であった。

実施例 6

実施例 1で用いた吸着材を用いて健常者血漿 3 ミリリットルに対して、吸着材の量を 0. l gから 0. 6 gまで変えて第 V I I I 因子と第 I X因子の吸着挙動を調べた。 - 第 V 因子と第 I X因子の吸着率は、それぞれ下【；: すようになった

吸着材 0 gの時 3 % 6 % (第 V I 因子第 I X因子の順。以下同じ）

吸着材 0. 2 gの時 3 2 %、 2 9 %

吸着材 0. 3 gの時 6 8 %、 4 5 %

吸着材 0. 4 gの時 9 0 %、 5 2 % 吸着材 0 . 5 gの時 9 2 %、 6 0 %

吸着材 0 . 6 gの時 9 5。/。、 6 5 %

なお、'第 V I I I 因子と第 I X因子の吸着率は吸着実験後の血漿中に残存するそれぞれの活性を測定することによリ求めた。第 V I I I 因子の活性測定は、実施例 1 と同様の方法によリ行った。また、第 I X因子の活性は、 H a r d i s t y—段法 [ R . M. H a d i s t y e a 1 . ： T h r o m b o s D a h e s . H a e m o h . , V o

1 . 7 , p p . 2 1 5 ( 1 9 6 2 ) ] により測定した。

比較例 1

巿販の D E A E—セファローズ（ファノレマシア社、スゥェ一デン）を用いて実施例 6 と同様にして第 V I I I 因子と第 I X因子の吸着挙動を調べたところ、第 V I I I 因子と第 I X因子の吸着率は、それぞれ下に記すようになった。

吸着材 0 gの時 3 %、 6 3 % (第 V I I I 因子、第

I X因子の順。以下同じ）一吸着材 0. 2 gの時 9 %、 8 9 %

吸着材 0 . 3 gの時 2 9 %、 9 0 %

吸着材 0. 4 gの時 5 9 %、 9 0 % ' 吸着材 0 . 5 gの時 8 2 %、 9 0 %

吸着材 0. 6 gの時 9 5 %、 9 0 %

なお、第 V I I I 因子と第 I X因子の吸着率は、実施例 6 と同様に、吸着実験後の血漿中に残存するそれぞれの活性を測定することによリ求めた。

実施例 7

実施 1で合成したビュルアルコール単位を有する架橋共重合体を、実施例 2 と同様にしてエポキシ活性化して得られた活性化担体を用いた。

ポリカチオンを有する分子として、実施例 1 で合成した共重合体 1 5 0 m gを 7 5 %ジメチルスルフォキシド水溶液 6 ミリリツトルに溶解した溶液に、上記の活性化担体 3 ミリリットルを加え、水酸化ナトリゥム水溶液で p Hを 8に調整した後、室温で 2 4時間振とうして、吸着材を得た。水酸化ナトリゥム水溶液による滴定から求めた該吸着材 1 ミリリットルあたリの正電荷密度は、 4 3 μ e qであった。

実施例 1 と同様に、健常者血漿を用いて吸着実験を行ったところ、吸着実験後の血漿中の第 V I I I 因子活性は吸着実験前の 2 6 %であった。また、実施例 1 と同様の溶出液を用いて第 V I I I 因子を溶出させ、溶出液中に含まれる第 V 厂 I I 因子活性を測定したところ、吸着実験に用いた血漿中の 7 3 %の第 V I I I 因子が回収されていた。

実施例 8 ' 実施例 1での溶出液中のフォンヴィルブランド因子のマルチマ一構造を調べるために、 2 %ァガロースゲルを用いた S D S電気泳動を行ったところ、吸着実験前の血漿中のものと同程度の高分子領域までマルチマーの存在が認められた。産業上の利用可能性

本発明の血液凝固第 V I I I 因子の吸着材は、ポリカチォンを有する分子を有しているため、低分子化合物をリガンドとして用いた従来の吸着材と比べると、第 V I I I 因子との相互作用がよリ特異的になり、クリオプレシピテートを経由する従来の方法によることなく、血漿をそのまま用いても第

V I I I 因子を高率に吸着することができる。このように、本発明の血液凝固第 V I I I 因子の吸着材は、血液凝固第 V I I I 因子製剤の製造における寄与が著しく大きい。

Claims

請求の範囲

1 . ポリカチオンを有する分子が水不溶性担体に結合 · 固定化されてなる複合体よりなリ、ポリカチオンを有する分子の分子量が少くとも 1 5 ， 0 0 0であリ、該複合体 1 ミリリツトルあたリの正電荷密度が 1 μ e (！〜 2 0 0 μ e qであることを特徴とする血液凝固第 V I I I 因子の吸着材。

2 . ポリカチオンを有する分子が、側鎖に陰イオン交換基を有する塩基性ビニル単量体の単独重合体または該塩基性ビニル単量体とそれと共重合し得るビニル単量体との共重合体であることを特徴とする請求項 1に記載の吸着材。

3 . 塩基性ビニル単量体が、それぞれアミノ基を有するァク 'リル酸誘導体、メタアクリル酸誘導体、アクリル酸アミド锈導体おょぴメタァクリル酸アミド誘導体から選ばれることを特徴とする請求項 2に記載の吸着材。

4 . 塩基性ビニル単量体と共重合し得るビニル単量体が、 N 一ビニノレピロリドン、アタリノレ酸エステノレ、メタァクリルエステル、 N—ァノレキクレアクリル酸アミドおよび N—アルキルメタアタリル酸ァミドから選ばれることを特徴とする請求項 2に記載の吸着材。 -

5 . 水不溶性担体が、多孔性構造を有する天然高分子または合成高分子よリなる粒子状担体であることを特徴とする請求項 1に記載の吸着材。

6 . 水不溶性担体が、多孔性構造を有する粒子状担体であリ、排除限界分子量が 1， 0 0 0〜 1 0 0， 0 0 0， 0 0 0であリ、平均粒子径が 5〜 1， Ο Ο Ο μ πιであることを特徴とする請求項 1 に記載の吸着材。

7. 粒子状担体が、ビュルアルコール単位を有する架橋共重合体よリなることを特徴とする請求項 5 または 6 に記載の吸着材。