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WO1993003139A1 - Cell culture support, production thereof, and production of cell cluster using same - Google Patents

Cell culture support, production thereof, and production of cell cluster using same Download PDF

Info

Publication number
WO1993003139A1
WO1993003139A1 PCT/JP1992/000998 JP9200998W WO9303139A1 WO 1993003139 A1 WO1993003139 A1 WO 1993003139A1 JP 9200998 W JP9200998 W JP 9200998W WO 9303139 A1 WO9303139 A1 WO 9303139A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
poly
cell culture
substrate
cells
acrylamide
Prior art date
Application number
PCT/JP1992/000998
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hideaki Sakai
Tomoko Yoshino
Koichi Nakamura
Teruo Okano
Noriko Yamada
Yasuhisa Sakurai
Original Assignee
Kao Corporation
Tokyo Women's Medical College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kao Corporation, Tokyo Women's Medical College filed Critical Kao Corporation
Publication of WO1993003139A1 publication Critical patent/WO1993003139A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2539/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by properties
    • C12N2539/10—Coating allowing for selective detachment of cells, e.g. thermoreactive coating

Definitions

  • the present invention relates to a support for culturing cells in biochemistry, medicine, immunology and the like, a method for producing the same, and a method for producing a cell aggregate using the same.
  • cell culture has been performed on a glass surface or on a surface of a synthetic polymer material that has been subjected to various treatments.
  • it is widely used as a support for various containers and cell cultures that have been subjected to surface treatment (for example, irradiation with radiation, silicon coating, etc.) using polystyrene as a material.
  • Cells cultured and proliferated using such a cell culture support have conventionally been detached and recovered from the support surface by treatment with a protease or a chemical such as trypsin.
  • a protease or a chemical such as trypsin.
  • the treatment process becomes complicated, and the possibility of impurity contamination increases.
  • the inventors of the present invention have proposed that cells cultured and grown only by changing the environmental temperature without being treated with a protease or a chemical such as trypsin or EDTA are used.
  • a support material used for cell culture which can be peeled off and recovered from the support surface, has been previously proposed (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-218185).
  • the present invention is a further development of the method described in the above publication, in which the surface of the polymer coating on the base material is smooth without any convexity, and the cell culture condition by a microscope or the like is clearly observed. It is an object of the present invention to provide a cell culture support capable of easily and effectively removing and recovering cells, a method for producing the same, and a method S for producing a cell aggregate using the same.
  • the amount of the homopolymer or copolymer to be coated is limited to a specific range, so that the polymer-coated surface can be observed under an optical microscope that is generally used when observing cultured cells. It was found that the surface became smooth with almost no irregularities. Therefore, unlike the case of using the previously proposed cell culture support, the cell culture state can be clearly observed without overlapping of the uneven image and the cell culture image. Can uniformly adhere to the surface of the support and proliferate.
  • the inventors have found effects such as improved exfoliating ability and recovery of cultured cells, as well as obtaining an exfoliated cell in an aggregated state as in the case of using the above-mentioned microculture support.
  • cell culture critical ⁇ temperature cell adhesion substrate and the substrate surface to water coated at a coverage 2 ⁇ 8 O ig / m 2 is composed of a polymer layer of 0 to 8 0 e C Provide a support.
  • the present invention also provides a monomer solution containing a monomer and a solvent that gives a polymer having a critical lysis temperature of water of 0 to 8 CTC, and a coating amount of a solvent component of the monomer solution of 3 to:
  • the present invention also provides a method for producing a cell culture support, which is applied to the surface of a substrate so as to be / n: 2 and then irradiated with an electron beam.
  • Honki Akira further supports the cell culture support ⁇ ( And a method for producing a cell aggregate.
  • the cell culture support of the present invention has a surface coated with a specific polymer.
  • the polymer has a critical solution temperature of 0 to 80 ° C, preferably 10 to 50 ° C, and more preferably 15 to 37 ° C (hereinafter sometimes simply referred to as “T”). Things. If a polymer whose ⁇ exceeds 80 ° C is used as the coating polymer, the medium must be at a temperature higher than the T of the polymer in the production of the cell aggregate of the present invention described later. However, at this temperature, the activity of the cells is extremely reduced or the cells are killed, and when the polymer is used at a temperature lower than 0 ° C., the temperature of the medium must be reduced to 0 and the temperature must be lowered. Then, the cell activity is extremely reduced. In addition,
  • Critical dissolution temperature refers to the temperature at which two substances separated into two layers completely dissolve at a certain temperature to form a uniform layer.
  • the temperature at which complete melting is performed by increasing the temperature is referred to as the “upper critical melting temperature”
  • the temperature at which complete melting is performed at a lower temperature is referred to as the “lower critical melting temperature”.
  • the polymer of the polymer layer of the present invention is from the group consisting of (meth) acrylamide, N-substituted or N, N-disubstituted (meth) acrylamide, alkyl vinyl ether, and mixtures thereof :! A homopolymer or copolymer obtained from the selected monomer.
  • Specific examples of the substituent of the nitrogen atom of the (meth) acrylamide include an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an alkoxyalkyl group having 2 to 8 carbon atoms, a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, and a nitrogen atom.
  • a heterocyclic group containing an oxygen atom (the nitrogen atom of the heterocyclic ring may be the nitrogen atom constituting the amide group of (meth) acrylamide).
  • the critical dissolution temperature it is necessary to increase the interaction between the coating material and the cell culture support.
  • copolymerization may be carried out by further adding another monomer other than the above.
  • a graft or block copolymer of the polymer and the other polymer used in the present invention, or a mixture of the polymer of the present invention and another polymer may be used. It is also possible to crosslink the polymer within the range where the original properties are not impaired.
  • T 21 ° C
  • Poly (N) Tetrahydrofurfuryl acrylamide (T about 28 V)
  • poly-N, N-Jetyl acrylamide (T 32 ° C).
  • polymers include, for example, poly (N-ethyl acrylamide), poly (N-isopropylmethacrylamide), poly (N-cyclopropylacrylamide), poly (N-cyclopropylmethacrylamide), poly (N-cyclopropylmethacrylamide) one N- ⁇ methacryloyl pyrrolidine, poly one N- Akuriro Irupiperijin include Porimechirubi two ether etc. c
  • the cell culture support used in the present invention can be obtained by coating a substrate with a polymer.
  • the coating amount of the polymer is 2 to 8 Offig / ni 2 , preferably 4 to 50 mg / in 2 , more preferably 6 to 3 Omg / m 2 .
  • Exceeding the polymer coating amount is 8 OmgZni 2, cells becomes difficult to adhere to the cell culture support surface, the coating amount conversely 2 MgZni but less than 2 becomes the Hoso ⁇ is culturable attached, Peeling ⁇ It becomes difficult to collect.
  • the amount of polymer coating can be determined by, for example, Fourier transform infrared spectroscopy total reflection method (FT-IR-ATR method), staining of coated or uncoated parts or labeling of fluorescent substances. Analysis or surface analysis by contact angle measurement or the like alone or in combination.
  • FT-IR-AT R method using a polystyrene petri dish [Falcon 3002)] as a base material and poly-N-isopropylacrylamide as the coating polymer Is as follows.
  • the absorption intensity ratio is the ratio of the amount of coated polymer to the amount of polystyrene
  • Abs 1640 is the amide I (1640 cn-li absorption intensity, Abs 16t) 0 derived from the coated poly N-isopropylacrylamide. Means benzene ring stretching (1600 cm- 1 ) absorption intensity derived from the polystyrene as the base material.
  • a known amount of poly N-isopropyl acrylamide is applied on the surface of Falcon 300'2 in advance, and a calibration curve for the applied amount and the absorption intensity ratio is prepared from equation (1).
  • the amount of polymer coated on the culture support can be determined from the above-mentioned calibration curve by measuring the absorption intensity ratio.
  • the cell-adhesive substrate to be coated may be any material to which cells can be attached, such as glass, modified glass, polystyrene, polymethyl methacrylate, or other high-molecular compounds that are usually used for cell culture. Or ceramics, metals and the like.
  • the surface of the base material may be subjected to hydrophilic treatment using a treatment technique such as ozone treatment, plasma treatment, or sputtering.
  • the shape is not confined to a dish, but is a plate, fiber, (porous) particles, or a container generally used for cell culture, etc.
  • a homopolymer or a copolymer having a critical melting temperature of 0 to 80 ° C is coated on the surface of such a fine adhesive substrate, and the surface of the substrate is observed from above.
  • the total area of the coated portion is 40 to 100% of the total surface area of the cell-adhesive substrate, and is preferably 60 to 100% in view of the fine peelability, and is preferably 70 to 100%. ⁇ 100% is more preferable to observe the c- coated portion from above, the form is not limited at all, for example, a pattern consisting of lines and spaces, a polka dot pattern, a grid pattern, Other specially shaped patterns, or fine patterns such as a state in which these are mixed are childish.
  • the size of the covering portion and the shape as viewed from the side are not limited at all. Further, the arrangement of the covered portion and the uncoated portion may be regular or irregular, but the two are preferably finely dispersed.
  • the coverage can be determined by elemental analysis by X-ray electron spectroscopy (XPS), analysis by staining of coated or uncoated parts or labeling of fluorescent substances, and surface analysis by contact angle measurement alone or in combination. it can.
  • XPS X-ray electron spectroscopy
  • polystyrene petridium, Riche Falcon 3002
  • the polymer to be coated is poly-isopropyl acrylamide
  • poly-isopropyl acrylamide is not present in polystyrene but poly-isopropyl acrylamide.
  • the ⁇ atom present in acrylamide (derived from amide consolidation) was measured by XPS, and the following formula (2):
  • the coverage can be calculated not only for N but also for other atoms (for example, oxygen atoms) present in the polymer to be coated. And it is possible.
  • the method of coating the base material with the polymer can be performed by a chemical method or a physical method as described below, alone or in combination.
  • the monomer When the monomer is used at the time of coating, the monomer may be in a gaseous, liquid or solid state at room temperature.
  • the polymer When a polymer is used, the polymer may be in a liquid or solid state at room temperature.
  • EB electron beam irradiation
  • a-beam irradiation ultraviolet irradiation
  • plasma treatment corona treatment
  • corona treatment corona treatment
  • a commonly used organic reaction such as a radical and ionic reaction can be used.
  • the method can be carried out by applying a solution containing a monomer and an appropriate solvent on a substrate, and then irradiating the polymer with the electron beam to polymerize the monomer.
  • the solvent which goes around is not particularly limited as long as it dissolves the mosomer, but a solvent having a ⁇ point of 120 ° C. or less under normal pressure, particularly 40 to 110 is preferable. If the boiling point is too high, the efficiency of electron beam energy polymerization decreases.
  • Preferred solvents include, for example, methanol, ethanol, n (or i) -propanol, 2 (or ri) -butanol, water and the like, and one or more of them may be used.
  • One or more other solvents for example, 1-pentanol, 2-ethyl-1-butanol, 2-butoxyethanol, ethylene (or diethylene) glycol or its monoethyl ether may be used.
  • the solution may further contain sulfuric acid, sodium hydroxide, sodium chloride, and the like as additives.
  • concentration of the monomer in the solution is not particularly limited, the final cell culture support Considering the performance of the body and the applicability of the solution to the substrate, it is preferably, for example, 10 to 70% by weight, more preferably 20 to 60% by weight, and most preferably 3 to 60% by weight. 0 to 55% by weight.
  • the amount of the solution applied to the substrate is such that the amount of the solvent component in the solution is 3 to 10 OlZn! 2 , preferably 5 to 5 O mlZn 2 .
  • the solvent component coating amount is 3 mlZm 2 Not ⁇ , undesirable not poor solution coatability onto substrates, exceeds 100e1 / E 2 Conversely, a cell culture support surface obtained is smooth .
  • the monomer solution coating amount e.g., 1 0 ⁇ 1 5 0 mlZiE 2, in particular 1 5 ⁇ 7 0 ml 3 ⁇ 4 2 is preferred.
  • the solution may be applied to the substrate by any known method, for example, a coating method using a spin coater, a bar coater, or the like, a spray coating method, or the like.
  • the substrate on which the solution has been applied is irradiated with an electron beam to polymerize the monomers in the solution.
  • the amount of electron beam irradiation is 5 to 40 Mrad, preferably 10 to 35 Mrad, and more preferably 15 to 30 Mrad. If the irradiation dose is less than 5 Mrad, sufficient detachment of cells cannot be obtained. Conversely, if it exceeds 4 O Mrad, the base material will be discolored and cracked.
  • the amount of electron beam irradiation is given by
  • ⁇ means a scalar value specific to the electron beam irradiation device.
  • the electron beam irradiation may be performed at once, or may be performed stepwise in a plurality of times.
  • the total electron beam irradiation dose is preferably 5 to 40 Mrad
  • the initial electron beam irradiation dose is from the viewpoint of the surface of the cell culture support finally obtained and the smoothness of the support surface. 1 to 10 Mrad. Particularly, 2 to 6 Mrad is preferable.
  • Other electron beam irradiation conditions include a vacuum degree of 5 ⁇ 10 Torr or less at the electron beam generating section, an electron beam acceleration voltage of 150 to 600 kV, and an oxygen concentration of the irradiated section of (dry
  • One S one Drying It is preferable to set the concentration to not more than 2000 ppm by introducing nitrogen gas or other inert gas.
  • the polymer is coated on the substrate by electron beam irradiation.
  • a usual post-treatment ie, washing, drying, sterilization, etc.
  • the washing may be performed, for example, using deionized water at a temperature sufficient to cause the polymer coated on the substrate to swell, or may be performed while applying ultrasonic waves.
  • the method for producing the cell aggregate of the present invention is performed on the cell culture support thus obtained.
  • Cells to be applied to the cell culture support of the present invention are not particularly limited.
  • vascular endothelial cells hepatic parenchymal cells, rat hepatocytes, rat glandular fibroblasts, human vascular cells
  • Examples include endothelial cells and human keratinocytes.
  • Such cells can be obtained by methods well known to those skilled in the art.
  • Cell culture is usually performed at 0 to 50 ° C.
  • the cultivation using the cell culture support of the present invention may be carried out in the usual temperature range, but if the polymer to be coated has an upper critical temperature, the cultivation is carried out at a temperature lower than the upper critical temperature.
  • the medium may be a medium supplemented with serum such as fetal bovine serum (FCS) or a serum-free medium.
  • FCS fetal bovine serum
  • the ambient temperature should be higher than the upper critical melting temperature of the above polymer, preferably 10 ° C higher than the upper critical melting temperature, or the lower critical melting temperature. It is only necessary to change the temperature below the temperature, preferably below the temperature lower than the lower critical solution temperature by 10 ° C, and it is possible in the culture medium in which the cells were cultured or in other isotonic solutions. Can be selected according to In this case, the cultured cells are effectively and easily
  • the cell culture support may be lightly tapped or peeled, or the medium may be agitated using a pipe or the like in order to detach the substrate.
  • the cell culture support of the present invention has a more uniform coating of the polymer on the substrate surface than the cell culture support proposed here. Therefore, the cells in the culture can uniformly and uniformly adhere to the support surface and proliferate. Therefore, the individual cells on the supporter were cultured under more uniform conditions, and the individual cells recovered from the exfoliation were relatively consistent in function. Further, when the cells are peeled and collected in the form of a sheet or an aggregate by the above-mentioned means, for example, the cells according to the present invention can be uniformly and uniformly cultured. In comparison with the above, a sheet-like or boundary-like cell aggregate having no defective portion (portion without cells) can be obtained.
  • N-isopropylacrylamide is used as a monomer for preparing a coating polymer
  • polystyrene which is generally used as a petri dish material for cell culture, is used as a support substrate. This will be specifically described.
  • the cell culture support of the present invention is coated with a polymer of N-isopropylacrylamide at a specific range of coverage and a specific range of coverage. (Ie, the surface of the coated polymer on the substrate) has almost no irregularities.
  • the solvent in which N-isopropylacrylamide is dissolved is applied on the base material in a specific range of application amount, the solvent is prevented from evaporating or jumping during electron beam irradiation. As a result, the thickness of the solution layer on the substrate becomes uniform, and the occurrence of uneven coating of the solution can be prevented.
  • the cell culture support of the present invention has almost no irregularities on the surface of the support, and the cells cultured on the support can adhere and grow evenly and uniformly on the entire surface of the support. At this time, the cultured cells are hidden by unevenness on the surface, making it difficult to observe Not at all.
  • poly-N-isopropyl acrylamide coated on a support substrate has a lower critical solution temperature of about 32 in aqueous solution. Above the lower critical melting temperature of 32 ° C, the polymer occupies a small volume, excluding water molecules in the polymer, and the support surface becomes hydrophobic. However, conversely, below 32, the volume occupied by the polymer increases, the volume fraction occupied by water molecules in the polymer increases, and the support surface becomes hydrophilic. Therefore, simply controlling the temperature adjusts the hydrophilicity and water-repellency of the surface of the cell culture support, and changes the adhesion of the cells to the support. Therefore, it is possible to easily detach and collect the cells from the cell culture support without destroying the cells after culturing and growing, only by changing the temperature.
  • a Falcon 302 Petri dish manufactured by Becton Dickinson Labware (Becton Dickinson Labware) was used as a base material, and an aortic vascular endothelial cell was used as a culture cell.
  • Petri dishes surface washed with isopropyl alcohol ⁇ stomach, on dry c Petri dish under a nitrogen gas stream, using a solvent amount shown in the following Table 1, predetermined After adding a predetermined amount of N-isopropyl acrylamide in isopropyl alcohol prepared to a concentration, leave it on a horizontal plate, apply and develop the monomer solution, and then 251 ⁇ (The electron beam of (3) was irradiated once.
  • the degree of vacuum in the electron beam generating space was 1 X 10 s Torr or less, the electron beam acceleration voltage was 20 OkV, and the oxygen concentration in the irradiated area was 100 Oppm or less.
  • the Petri dishes were cleaned with ion exchanged water at 5 ° C to remove residual monomers and homobolimers not bound to the surface of the Vitri dishes. Excluded After drying in an oven, ethylene oxide (E 0) gas sterilization was performed, and degassing was further performed to obtain a final product, a cell culture support material.
  • E 0 ethylene oxide
  • the amount of the obtained coating on the surface of the cell culture support was determined by the FT-IR-ATR method (Utilizer: JIR-RFX3002, manufactured by JEOL Ltd.)
  • the absorption intensity ratio was calculated according to the equation (1) described above, and further obtained from a calibration curve prepared in advance. The equation of the calibration curve used at that time is shown below.
  • the coverage of the polymer on the surface of the obtained cultured cell support was determined by XPS (Equipment: ES CA1000, manufactured by Shimadzu Corporation) from the analysis value at an incident angle of 90 °, using the formula ( the c resulting Tsume ⁇ determined I 2) shown in Table 2.
  • ⁇ Culture of aortic vascular endothelial cells was performed on the obtained cell culture support material using Dulbecco's modified Eagle's medium (D MEM) containing 10% of fetal calf serum (FCS) as a medium. Medium, at 37 ° C. After confirming that the cells had proliferated sufficiently, the culture was cooled to 5 ° C. and left for 30 minutes to detach the adhered Z proliferating cells, and the proliferating cell detachment recovery rate was determined according to the following formula. Table 2 shows the results.
  • D MEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FCS fetal calf serum
  • the cells must be in an individual state in order to count the total number of cells that have been detached and collected and the number of cells that have proliferated.
  • yield cells total stripping times are cooled to 5 e C, allowed to stand, with respect to the recovered cells ⁇ was performed by the Hoso ⁇ subjected to preparative Ribushin one EDT A process individual condition.
  • the total number of grown cells is the same as the total number of cells detached and collected by the method described above, but at 5 ° C. Cells that did not detach even after standing were detached into individual states by trypsin-EDTA treatment. It was determined by adding the total number of cells subjected to the addition.
  • Example II A cell culture support material was obtained in the same manner as in Example 2 except that (Example II) was used. Table 2 below shows the results obtained by examining the coating amount, the coating ratio and the smoothness of the coated surface in the same manner as in Example 2. An aortic vascular endothelium and a vagina were cultured on the support in the same manner as in Example 2, and this was detached and collected to obtain the proliferation cell detachment recovery rate. Table 2 shows the results.
  • Example 8 Except that electron beam irradiation was set to 10 Mrad once (Example 8) and 15 Mrad once (Example 9) using a Falcon 3002 Petri dish manufactured by Becton, Dickinson and Lab Puna. In the same manner as in Example 3, a cell culture support material was obtained. The results of the examination of the coating amount, the coating ratio and the smoothness of the coated surface in the same manner as in Example 3 are shown in Table 2 below. On the supporting pruritus, the aortic vascular endothelial cells were cultured in the same manner as in Example 3, and the endothelial cells were detached and collected to determine the rate of proliferating cell detachment and recovery.
  • Example 10 Except that the solvent for dissolving N-isopropylacrylamide was ethanol (Example 10) and water (Example 11) using a Falcon 3002 dish manufactured by Becton's Dickinson Labudinia. In the same manner as in Example 2, a cell culture support material was obtained. Table 2 below shows the results of the examination of the coating amount, the coating ratio and the smoothness of the coated surface in the same manner as in Example 2. On the support, the aortic vascular endothelial cells were cultured in the same manner as in Example 2, and the cells were detached and collected to determine the proliferation cell detachment recovery rate. The results are shown in Table 2c
  • Example 12 N-isopropylacrylamide (Example 12), Xn-propylmethacrylamide (Example 13)
  • a cell culture support material was obtained in the same manner as in Example 3.
  • Table 2 shows the results of an examination of the coating amount, the coating ratio and the smoothness of the coated surface in the same manner as in Jeongseon example 3.
  • the aortic vascular endothelial cells were cultured on the support in the same manner as in Example 3, and the vascular endothelial cells were separated and recovered, and the recovery rate of proliferating cells was determined. The result is shown in Table 2c.
  • Example 7 I 18 j 1 ⁇ ⁇ ;! > 90:
  • Example 8 1 4 smoothing> 90 j
  • Example 9 5 66 j smoothing> 90
  • Example 2 The same experiment as in Example 1 was performed except that Falcon 3002 Petri dish manufactured by Becton * Dickinson Labu ⁇ ia was used as a cell culture support material without any surface treatment. Table 3 below shows the results. Comparative Example 2
  • Example 3 Same as Example 1 except that the base material used was a Falcon 300 Petri dish manufactured by Becton Dickinson Lab-Your Co. and a monomer solution prepared to a predetermined concentration using the solvent amount shown in Table 4. Experiments were performed. The results are shown in Table 3 below.
  • Example 3 The details were the same as in Example 3 except that the Falcon 3002 manufactured by Becton, Dickinson and Labu ⁇ ia was divided into St and the electron beam irradiation was divided into several times as shown in Table 5. ⁇ A culture support material was obtained. Table 7 shows the results of the examination of the coating amount, the coating ratio and the smoothness of the coated surface in the same manner as in Example 3. An aortic vascular endothelial cell was cultured on the support in the same manner as in Example 3, and this was detached and collected, and the proliferation cell detachment and recovery rate was determined. Table 7 shows the results. 33 ⁇ ⁇
  • Example 22 3 0 4 7 3 4; Examples 23 and 24 Using Becton-Dickinson's Lab-Your Falcon 302 Petri dish, except that the solvent for dissolving N-isopropylacrylamide is ethanol (Example 23) and water (Example 24).
  • a cell culture support material was obtained. Table 7 shows the results obtained by examining the coating amount, the coating ratio and the smoothness of the coated surface in the same manner as in Example 3. An aortic vascular endothelial cell was cultured on the support in the same manner as in Example 3, and this was detached and collected to obtain a proliferation cell detachment recovery rate. Table 7 shows the results.
  • Example 25 Becton Dickinson's Falcon 3002 Petri dish manufactured by Lab ⁇ nia Co., Ltd., and instead of N- ⁇ f sodium propylacrylamide,! ⁇ -Ethoxyethylacrylamide (Example 25) ), And a cell culture support material was obtained in the same manner as in Example 17 except that Nn-propyl methacrylamide (Example 26) was used. Table 7 below shows the results obtained by examining the coating amount, the coating ratio and the smoothness of the coated surface in the same manner as in Jeongseon example 3. On the support, vascular endothelial cells were cultured in the same manner as in Example 3.
  • Embodiment 16 10 86! Smooth 1> 90!
  • Example 20 11! 9 ⁇ 1 smoothing> 90!
  • Example 21 9 74 Smooth ⁇ 90
  • the coating amount was 2 to 8 O ⁇ gK, the coating rate was 40 to 100%, and the solvent in the N-isopropyl acrylamide solution developed on the substrate surface was
  • the amount of isopropyl alcohol is in the range of 3 to 1 ⁇ 10 2 ml / m 2
  • the surface of the obtained cell culture support material is smooth at the microscope level as shown in Table 2, and A value of 90% or more is obtained as the recovery rate of proliferating cells.
  • a method for realizing this phenomenon is possible by any of the methods of Examples 1 to 5, and is more preferable than the cell culture support previously proposed as a cell culture support material.
  • the irradiation dose of the electron beam was changed as shown in Examples 6 to 9, the type of the lysate was changed as shown in Examples 10 and 11, and further, Examples 12 and 13 were used.
  • Comparative Example 1 in the untreated Falcon 302, the grown cells could not be separated and recovered only by lowering the temperature.
  • Comparative Examples 2 and 5 the same was true for a material that was only irradiated with an electron beam without developing a monomer solution.
  • Comparative Examples 3 and 6 when the coating amount, the coating ratio, and the solvent amount were all within the predetermined ranges, the cells proliferated, but could not be separated and recovered only by lowering the temperature. .
  • the material obtained by the solvent amount is prepared in 1 X 1 0 1 ⁇ 2l / m 2 or more, although proliferating cells peeled recovery obtained a value of more than 90%, Under the microscope, unevenness was observed on the coated surface, and the image of the cells during culture overlapped with the image of the unevenness, and the material had insufficient performance in terms of ease of cell observation.
  • Example 10 In order to confirm the degree of damage to the detached cells obtained in Example 3, the cells were collected by centrifugation (600 G, 5 minutes), mixed well, and converted into individual cells. 0 5 cells were proliferated and cultured on a Falcon 300 2 dish manufactured by Becton Dickinson Lab-Your Company. The same method as in Example 3 was employed for culturing the cells. The results are shown in Table 10 below.
  • Example 10 In order to confirm the degree of damage of the detached cells obtained in Example 5, the cells were collected by eccentric separation (600 G, 5 minutes), mixed thoroughly, and converted into individual cells. was again cultured in a 1 0 5 cells a Becton 'Dickinson Rabuunia Inc. S file Rukon 3 0 0 2 on a Petri dish. Cultivation of cells 1st 9 :: — The same method as in Example 3 was employed. The result is shown in Table 10 below.
  • the adherent cells cultured in Comparative Example 1 were treated with 0.05% trypsin and 0.02% EDTA, and centrifuged to confirm the degree of damage of the detached cells (600 G, 5 minutes). It recovered by, were lips beauty culture obtained in 2 xl 0 5 ⁇ made of cells Becton Dickinson Rabuuwea Co. Fuarukon 3 0 0 2 Petorideitsu on shoe. Table 10 shows the results obtained by culturing using the same method as in Example 1.
  • Example 2 In order to confirm the uniformity of the ability of the detached cells obtained in Example 2, the obtained sheet-like cell aggregate was divided into four parts, each of which was sufficiently stirred to obtain individual cells. 0 in six made of cells Becton 'Dickinson' Rabuuyua company files Rukon 3 0 0 2 on the petri dish was again culture. The cells were cultured in the same manner as in Example 2. The function of the cell is a safe metabolite of prostacitalin using the conventional radioimmunoassay method after the culture 1. Table 11 below shows the activity of each of the four divided cell aggregates determined by determining the amount of ⁇ -keto-FIa.
  • Example 9 In order to confirm the uniformity of the function of the detached cells obtained in Example 16, the obtained sheet-shaped cell aggregate was divided into four parts. For the subsequent operation, the same method as in Example 29 was adopted. The activity of each of the cell assemblies divided into four is shown in Table 11 below. Comparative Example 9
  • the adherent cells cultured in Comparative Example 1 [because the sheet-like cell aggregate cannot be obtained at low temperature, the activity can be measured at only one point (early average) in the entire Petri dish] by 0.05% Trypsin mono-centrifuged (600 G, 5 minutes) to collect the cells to confirm the degree of damage to the detached cells treated with 0. 2% EDTA.
  • Six cells were cultured again on a Falcon 302 Petri dish manufactured by Becton, Dickinson and Love @ Your. Cell culture and activity measurement were carried out in the same manner as in Example 29. Table 11 shows the results.
  • the cell culture support of the present invention can be obtained by removing the culture cells from the cell culture support only by changing the ambient temperature without treatment with a proteolytic enzyme such as trypsin or EDT or a chemical agent. Because it can be recovered, 1 the processing process is simplified, 2 the possibility of contamination is completely eliminated, and 3 cells that have grown are not damaged by chemical treatment on the cell membrane. It has the following advantages: the original function is not impaired; the exfoliated cells keep the aggregated state; and the cells can be repeatedly cultured and collected. In addition, since the cell culture support of the present invention is smooth and has no irregularities, the irregularity image does not overlap with the cell image under a microscope, making it easy to observe the cultured cells with a microscope. And clearly done.
  • a proteolytic enzyme such as trypsin or EDT or a chemical agent.
  • conventional cell culture supports generally depend on the state of the surface of the support for cell culture and recovery, but according to the present invention, their functions are independent of the surface state of the support. As a result, the quality of the product is stable, the yield is good, and it is possible to select the optimal amount of one kind of monomer according to the type of cell.

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Description

明 細 書
細胞培養支持体、 その製造法
およびそれを用いる細胞集合体の製造法
癸明の分野
本発明は、 生化学、 医学および免疫学等における細胞類の培養用支持体、 その製造法およびそれを用いる細胞集合体の製造法に関するものである。
従来の技術
従来、 細胞培養は、 ガラス表面上あるいは種々の処理を行った合成高分 子材料の表面上にて行われていた。 例えば、 ポリスチレンを材料とする表 面処理 (例えば、 ァ線照射、 シリコンコーティング等）を行った種々の容器 力、 細胞培養用支持体として普及している。 このような細胞培養用支持体 を用いて培養 ·増殖した細胞は、 従来、 トリプシンのような蛋白分解酵素 や化学薬品により処理することで支持体表面から剥離 ·回収されていた。 しかしながら、 前述のような処理を施して増殖した細胞を回収する場合、 処理工程が煩雑になり、 不純物混入の可能性が多くなつたり、 増殖した細 胞が前記処理により変性し、 細胞本来の機能が損なわれる等の欠点が指摘 されている。
そこで本発明者等は、 前記欠点を解消するために、 トリプシンや E D T Aのような蛋白分解酵素や化学薬品等による処理を施さずに環境温度を変 化させるだけで、 培養 ·増殖させた細胞を支持体表面から剥離 ·回収する ことが可能な細胞培養に使用する支持体材料を以前に提案した（特開平 2 - 2 1 1 8 6 5号公報)。
しかしながら、 この発明による細胞集合体では、 温度を変えることによ り剥離 ·回収が可能になるものの、 基材上のポリマー被覆表面上に凹凸が 認められる場合があり、 例えば、 培養中の細胞を顕微鏡観察する際に表面 の凹凸像が培養細胞像に重なり、 観察に支障をきたすことがあった c 発明の目的
本発明は、 前記公報の癸明をさらに発展させ、 基材上のポリマー被覆表 面が 03凸の無い平滑なものであり、 顕微鏡等による細胞の培養状況が明確 に観察され、 しかも、 細胞の剥離'回収がより容易にかつ効杲的に行える 細跑培養支持侔、 その製造法およびそれを^ 、る細胞集合体の製造 Sを提 供することを目的とする。
本癸明者らの充に提案した細胞培養支持体において、 被覆するホモポリ マーまたはコポリマーを特定範固の量とすることにより、 ポリマー被覆表 面が、 培養細胞観察時に一般に用いられる光学顕微鏡下で凹凸のほとんど 認められない平滑なものとなることがわかった。 したがって、 先に提案し た細跑培養支持体を使用した場合のように、 凹凸像と培養細跑像が重なる ことなしに細胞の培養状況が明確に観察でき、 また、 細胞培養時には、 細 胞が支持体表面に均一に付着し、増殖することが可能になる。 さらに、 培 養細胞の剥能 ·回収時により効率が良くなる、 先の細跑培養支持侔を使用 した場合と同様に集合状態の剥離雜跑が得られる等の効杲を見い出した。
癸明の概要
本発明は、 細胞付着性基材および該基材表面上に被覆量 2〜 8 O i g/m2 で被覆された水に対する臨界溶薛温度が 0〜 8 0 eCのポリマー層からなる 細胞培養支持体を提供する。
本癸明はまた、 水に対する臨界溶蘚温度が 0〜 8 CTCのポリマーを与え るモノマーおよび溶媒を含有するモノマー溶液を、 該モノマー溶液 の溶 媒成分の塗布量が 3〜： L 0 0 ml/n:2となるように基材表面上に塗右した後、 電子線照射する細胞培養支持体の製造 ¾を提俟する。
本癸明はさらに前記細胞培養支持^を^ (、て細胞を培養し、 剥離処理す る細胞集合体の製造法を提供する。
発明の詳細な説明
本発明の細胞培養支持体は、 基材表面上が特定のポリマーで被覆された ものである。 該ポリマーは、 0〜8 0 °C、 好ましくは 1 0〜5 0 °C、 さら に好ましくは 1 5〜 3 7 °Cの臨界溶解温度 （以下、 単に 「T」 ということ がある） を有するものである。 Τが 8 0 °Cを越えるようなポリマーを被覆 ポリマーとして使用した場合、 後で述べる本発明の細胞集合体の製造に当 り、 培地はポリマーの Tより高い温度におかれなければならないことから、 該温度では細胞の活性の極度の低下または細胞の死滅が起こり、 また丁が 0 °Cより低いポリマーを使用した場合、 培地を 0てより低い温度におかな ければならず、 前記と同様に細胞活性の極度の低下などが起こる。 なお、
「臨界溶解温度」 とは、 2層分離している 2種の物質が、 ある温度になる と互いに完全溶解して均一層となる温度をいう。 特に、 温度を上げて完全 溶解する場合の温度を 「上限臨界溶解温度」 、 温度を下げて完全溶解する 場合の温度を 「下限臨界溶解温度」 という。
本発明のポリマー層のポリマーは （メタ） アクリルアミ ド、 N—置換ま たは N, N—ジ置換 （メタ） ァクリルァミ ド、 アルキルビニルエーテルお よびそれらの混合物よりなる群から:！択されるモノマーから得られるホモ ポリマーまたはコポリマーである。 （メタ） アクリルアミ ドの窒素原子の 置換基は、 具体的には、 炭素数 1〜8のアルキル基、 炭素数 2〜8のアル コキシアルキル基、 炭素数 3〜6のシクロアルキル基、 窒素原子または酸 素原子を含む複素璟基 （複素環の窒素原子が （メタ） アクリルアミ ドのァ ミ ド基を構成する窒素原子であってもよい） 等が挙げられる- また、 増殖 細胞の種類によって臨界溶解温度を調節する必要がある場合、 被覆物質と 細胞培養支持体との梠互作闱を高める必要が生じた場台、 細跬支持体の親 一 . 水 ·琼水性のバランスを調整する必要がある場合等は、 前記以外の他のモ ノマ一類をさらに加えて共重合してよい。 本発明に使用する前記ボリマー とその他のポリマーとのグラフトまたはブロック共重合体、 あるいは本発 明のポリマーと他のポリマーとの混合物を用いてもよい。 また、 ポリマー 本来の性質が損なわれない範囲で架橋することも可能である。 本癸明に いる好適なポリマーとしては、 例えば、 特開平 2— 211865号公報に 開示されたポリ一 N—イソプロピルアクリルアミ ド （T=32。C) 、 ポリ 一 N—n—プロピルアクリルアミ ド （T=21°C) 、 ポリ一 N— n—プロ ピルメタクリルアミ ド （T= 32 °C) 、 ポリー N—ェトキシェチルァクリ ルァミ ド （T=約 35°C) 、 ポリ一 N—テトラヒドロフルフリルァクリノレ アミ ド （T=約 28 V) 、 ポリ一 Ν—テトラヒドロフルフリルメタクリル アミ ド （Τ=約 35°C) 、 ポリ一 N，N—ジェチルァクリルアミ ド （T = 32°C) 等が挙げられる。 その他のポリマーとしては、 例えば、 ポリ一 N 一ェチルアクリルアミ ド、 ポリ一 N—イソプロピルメタクリルアミ ド、 ポ リー N—シクロプロピルアクリルアミ ド、 ポリ一 N—シクロプロピルメタ ク-リルアミ ド、 ポリ一 N—ァクリロイルピロリジン、 ポリ一 N—ァクリロ ィルピペリジン、 ポリメチルビ二ルエーテル等が挙げられる c
本癸明に使用する細胞培養支持体は、 基材上にポリマーを被覆して得ら れる。 ボリマーの被覆量は 2〜8 Offig/ni2、 好ましくは 4〜50mg/in2、 さらに好ましくは 6〜3 Omg/m2である。 ポリマー被覆量が 8 OmgZni2を 越えると、 細胞が細胞培養支持体表面上に付着することが困難となり、 逆 に被覆量が 2 mgZni2未満になると細跑が付着して培養可能になるが、 剥離 · 回収することが困難になる。
ポリマーの被覆量は、 例えば、 フーリエ変換赤外分光計全反射法 (FT 一 I R— ATR法） 、 被覆部または非被覆部の染色や蛍光物質の標識によ る分析、 さらに接触角測定等による表面分析を単独あるいは併用して求め ることができる。 その中で、 例えば、 基材としてポリスチレン製ペトリディ ッシュ [ファルコン （Falcon) 3002) ] を使用し、 被覆するポリマー をポリ一 N—イソプロピルァクリルアミ ドとした場合の FT— I R-AT R法による被覆量の定量法は以下のとおりである。
ポリマーの被覆量が I R光の侵入深さより十分に薄いと仮定し、 基材で あるポリスチレンを内部標準 （常に一定量になるものとする） とすると、 ポリスチレン量に対する被覆されたポリマー量の比率を以下の式 （1) ： 吸収強度比 = Abs16<QZAbs1600
[式中、 吸収強度比はポリスチレン量に対する被覆されたポリマー量の比 率、 Abs1640は被覆されたポリ一 N—イソプロピルアクリルアミ ド由来の アミ ド I (1640cn-リ 吸収強度、 Abs16t)0は基材であるボリスチレン 由来のベンゼン環伸縮 (1600cm-1) 吸収強度を意味する] から求める ことができる。
予め既知量のポリー N—ィソプロピルァクリルァミ ドをファルコン 30 0'2表面上に塗布し、 式 （1) より塗布量と吸収強度比に関する検量線を 作成すれば、 本発明の細胞培養支持体の被覆ポリマー量は、 吸収強度比を 測定すれば、 前述の検量線から求めることが可能となる。
被覆を施される細胞付着性基材は細胞が付着する材質ならばいずれでも よく、 その材質としては、 通常細跑培養に用いられるガラス、 改質ガラス、 ポリスチレン、 ポリメチルメタクリレート等の高分子化合物、 あるいはセ ラミ ックス、 金属等が挙げられる。 その際、 基材表面はオゾン処理、 ブラ ズマ処理、 スパッタリング等の処理技術を用いて親水化を施されたもので も良い。 形状はべトリディ ッシュに隈定されることはなく、 プレート、 ファ ィバー、 （多孔質） 粒子、 あるいは、 一般に細胞培養等に用いられる容器
- D- の形状 （フラスコ等） であってもよい。
本癸明においては、 このような細跑付着性基材表面上に、 0〜8 0 °Cの 臨界溶蘚温度を有するホモポリマーまたはコポリマーを被覆するが、 基材 表面を上部から観察して、 被覆されている部分の総面積は、 細胞付着性基 材表面総面積の 4 0〜1 0 0 %であり、 細跑の剥離性を考えると 6 0〜1 0 0 %が好ましく、 7 0〜1 0 0 %がさらに好ましい c 被覆部分を上部か ら観察して、 その形態は何ら限定されるものではないが、 例えば、 ライン とスペースからなるパターン、 水玉模様のパターン、 格子状のパターン、 その他特殊な形のパターン、 ある 6いはこれらが混ざっている状態等の微細 なパターンが子ましい。 また、 その被覆部の大きさ、 さらに横から見た形 は何ら限定されるものではない。 さらに、 その被覆部分と非被覆部分の配 置は規則的であっても、 不規則的であってもよいが、 その 2者は微細に分 散されていることが好ましい。
被覆率は、 X線電子分光法 （X P S ) による元素分析、 被覆部または非 被覆部の染色や蛍光物質の標識による分析、 さらに接触角測定等による表 面分析を単独あるいは併用して求めることができる。 例えば、 基材として ポリスチレン製ペトリディ、リ シュ (ファルコン 3 0 0 2 ) を使用し、 被覆 するポリマーをポリ一 Ν—イソプロピルアクリルアミ ドとした場合、 ポリ スチレンには存在せずボリ一 Ν—イソプロピルァクリルァミ ドに存在する Ν原子 （アミ ド詰合由来） を X P Sにより測定し、 以下の式 （2 ) ：
被覆後の Ν%
被覆率 X 1 0 0
ポリ - Ν -ィブァ Dビル了ミドの Ν % (12. 5 % )
から被覆率を求めることができる c
前記方法によれば、 着巨可能な原子は Nだけでなく、 被覆するポリマー 中に存在する他の原子 （例えば酸素原子） でも同様に被覆率を算岀するこ とが可能である。
基材へのポリマーの被覆方法は、 後述するような化学的方法、 物理的方 法を単独であるいは併用して行うことができる。 被覆時に前記モノマーを 使用する場合、 そのモノマーは常温において気体、 液体、 固体のいずれの 状態のものでもよい。 また、 ポリマーを使用する場合においても、 そのポ リマーは常温において液体、 固体状態のいずれの状態のものでもよい。 こ れらのものを化学的な反応によって結合させる場合、 電子線照射 （E B ) 、 ァ線照射、 紫外線照射、 プラズマ処理、 コロナ処理、 さらに基材と被覆材 料が適当な反応性官能基を有する場合は、 ラジカルおよびイオン反応等の 一般に用いられる有機反応を用いることができる。 物理的な相互作用によ る方法としては、 被覆材料自身または基材との相溶性が良いマトリックス を媒体とし、 塗布、 混練等の物理的吸着を用いる方法等があるが、 これら に限定されるわけではない。
例えば、 モノマーと適当な溶媒を含む溶液を基材上に塗布した後、 霉子 線照射してモノマーを重合させることによつても行える。 周いる溶媒は、 モソマーを溶解するものであれば特に限定されないが、 常圧下で漭点が 1 2 0 °C以下、 特に 4 0〜1 1 0てのものが好ましい。 沸点が高すぎると、 電子線エネルギー重合効率が低下する。 好ましい溶媒としては、 例えば、 メタノール、 エタノール、 n (または i )一プロパノール、 2 (または ri )一 ブタノール、 水等が挙げられ、 それらの 1種以上使用してよい。 その他の 溶媒、 例えば、 1一ペンタノール、 2—ェチルー 1ーブタノール、 2—ブ トキシエタノール、 エチレン（またはジエチレン）グリコールまたはそのモ ノエチルエーテル等も 1種以上使用してよい。 溶液には、 その他に添加剤 として、 硫酸、 水酸化ナトリウム、 塩化ナトリウム等を配合してよい。 溶 液のモノマー濃度は特に限定されないが、 最終的に得られる細胞培養支持 一 I ' 体の性能面と、 基材上への前記溶液の塗布性を考慮すると、 例えば、 1 0 ~ 7 0重量％が好ましく、 さらに耔ましくは 2 0〜6 0重量％、最も好ま しくは 3 0〜5 5重量％である。
この溶液の基材への塗布量は、 溶液中の溶媒成分塗布量として、 3〜1 0 O lZn!2、好ましくは 5〜5 O mlZn2となる量である。 溶媒成分塗布量 が 3 mlZm2未漓であると、 基材上への溶液の塗布性が悪く、 逆に 100E1/E 2 を越えると、 得られる細胞培養支持体表面が平滑とならず好ましくない。 また、 モノマー溶液塗布量としては、 例えば、 1 0〜1 5 0 mlZiE2、 特に 1 5〜 7 0 ml ¾2が好ましい。
溶液の基材への塗布法は公知のいずれの方法でもよく、 例えば、 スピン コーター、 バーコ一ター等による塗布法、 噴霧塗布法等が挙げられる。 塗布後、溶液が塗布された基材に対して電子線を照射し溶液内のモノマ 一の重合を行う。 電子線照射量は 5〜4 0 Mrad、 好ましくは 1 0〜3 5 Mr ad、 さらに好ましくは 1 5〜 3 0 Mradである。 照射量が 5 Mrad未満であ ると、細胞の剥離性が十分得られない。 逆に 4 O Mradを越えると、基材が 変色や亀裂等の劣化を起こす。 なお、 電子線照射量は次式：
f X霉子流 （mA)
電子線照射量 (Mrad) =
ラインスピート nt miiu
[式中、 ίは電子線照射装置に固有のスカラー値を意味する]
によって求められる。 電子線照射は一度に行ってもよいが、複数回に分け て段階的に行ってもよい。 後者の場合、 最終的に得られる細跑培養支持体 の控能面および支持体表面の平滑性の点から、 電子線総照射量は 5〜4 0 Mradが耔ましく、初回電子線照射量は 1 ~ 1 0 Mrad. 特に 2〜 6 Mradが好 ましい。 その他の電子線照射条伴としては、 電子線発生部の真空度 5 X 1 0 Torr以下、 電子線加速電圧 1 5 0〜6 0 0 kV、 照射部の酸素濃度は （乾
一 S一 燥） 窒素ガスあるいはその他の不活性ガスの導入等により 2 , 0 0 O ppm以 下とすることが好ましい。
電子線照射により基材上にポリマーが被覆される。 電子線照射後、 通常 の後処理、 すなわち、 洗淨、 乾燥、 滅菌等を行って本発明の細胞培養支持 体を得る。 洗浄は、 例えば基材上に被覆されたポリマーを膨灑させるに十 分な温度の脱イオン水を用いて行ってよく、 また、 超音波をかけながら行つ てもよい。
本発明の細胞集合体の製造法は、 かく して得られた細胞培養支持体上に て行われる。 本発明の細胞培養支持体に適用される細胞は特に限定されな いが、 例えば、 ゥシ大動脈血管内皮細胞、 ゥシ肝実質細胞、 ラッ ト肝実質 細胞、 ラッ ト腺維芽細胞、 ヒト血管内皮細胞、 ヒ トケラチノサイト等が挙 げられる。 このような細胞は当業者に周知の方法で入手し得る。 細胞の培 養は、 通常、 0〜5 0 °Cで行われる。 本発明の細胞培養支持体による培養 においても、 この通常行われる温度域で良いが、 被覆されるポリマーが上 限臨界温度を有していれば、 それ以下の温度で行い、 ポリマーが下限臨界 温度を有していれば、 それ以上の温度で行う必要がある。 その他の培養条 件は特に隈定されず、 当分野において通常行われる条件下で培養を行って もよい。 例えば、 培地としては、 ゥシ胎児血清 （F C S ) 等の血清が添加 されているものでもよいし、 無血清培地でもよい。
培養後、 培養細胞を細胞培養支持侔から剥離 ·回収するには、 周囲温度 を上記ポリマーの上限臨界溶解温度以上、 好ましくは上隈臨界溶解温度よ り 1 0 °C高い温度、 あるいは下限臨界溶解温度以下、 好ましくは下限臨界 溶解温度より 1 0 °C低い温度以下に変化させるだけでよく、 細胞を培養し ていた培養液中においても、 その他の等張液中においても可能であり、 目 的に応じて選択することができる。 その際、 培養細胞を効果的にかつ容易
- Q - に剥離させるため、 細胞培養支持体を軽くたたいたり、 摇らしたり、更に はピぺッ ト等を使用して培地を撹拌するなどしてもよい。
本癸明の細胞培養支持体は、 免に提案した細胞培養支持体に比べて、 基 材表面上のポリマーの被覆が均一になされたものである。 そのため、培養 中の細胞は、 支持体表面にむらなく均一に付着し、 増殖することができる。 したがって、 支持倖上の個々の細跑は、 より均一な条件で培養されたこと になり、 剥離 '回収した個々の細跑は比較的に機能にばらつきのないもの である。 また、 前記手段により、 例えば、 シート状、 集合体の状態で細跑 を剥離 ·回収した場合、 本発明によるものは均一にむらなく培養できるた め、 芫に提案した細胞培養支持体からのものに比べて、欠損部 （細胞のな い部分） のないシート状あるいは境状細胞集合体が得られる。
以下、 被覆ポリマー調製用モノマーとして、 N—イソプロピルアクリル アミ ドを用い、 支持钵基材として、 一般に細胞培養用ペトリディッシュ材 料として用いられるポリスチレンを Sいた場合を例にとって、 本発明の作 用を具体的に説明する。
前述のように、 本癸明の細胞培養支持体は、 特定範囲の被覆量、 特定範 囲の被覆率で N—イソプロピルァクリルァミ ドの重合体が被覆されたもの であり、 支持体表面 （すなわち、 基 ¾上の被覆ポリマー表面） に凹凸がほ とんど生じない。 また、 N—イソプロピルアクリルアミ ドを溶^している 溶媒が基材上に特定範囲の塗布量で塗布されるため、 電子線照射の際の溶 媒の薛間的な蒸発または突涛を避けることができ、 その結杲、 基材上の溶 液層の厚さが均一となり、 溶液の被覆むらの発生が防止できる。 したがつ て、 本発明の細跑培養支持体は、 支持体表面に凹凸がほとんどなく、 支持 体上で培養される細胞は支持体表面全体にむらなく均一に付着、 増殖する ことが可能となり、 その際、 培養細胞が表面の凹凸に隠れて観察しにくい ということもない。
このように、 支持体基材上に被覆されたポリー N—ィソブロピルァクリ ルアミ ドは水溶液中で約 3 2ての下限臨界溶解温度を有する。 下限臨界溶 解温度である 3 2 °C以上では、 このポリマーはその占有体積が小さくなり、 ポリマー中の水分子を排除して、 支持体表面は疎水性を示す。 しかし、 逆 に 3 2て以下では、 ポリマーの占有体積が大きくなり、 ポリマー中の水分 子が占める体積分率が上昇し、 支持体表面は親水性を示すようになる。 し たがって、 温度を制御するだけで細胞培養支持体表面の親水 ·踩水性は調 整され、 細胞の支持体への接着性が変化する。 そのため、 温度を変化させ るだけで、 培養 ·増殖後の細胞を破壊することなく、 細胞培養支持体から 容易に剥離 ·回収することが可能となる。
このようにして得られた本発明における細胞およびその集合体は、 以下 に示すような利点を有する。
①増殖した細跑は化学的処理により障害を受けることがなく、 細胞本来 'の機能が損なわれていない。 ②剥離した細胞は欠損部がなく集合体を保持 で.きている。 ③倔々の細胞機能にばらつきのな 、一様な培養細胞が得られ る。 ④剥離した細胞およびその集合体は、 培地以外の不純物が含まれてい ない。
実旌例
以下、 本発明を実施例により、 より具体的に説明するカ^ 本癸明はこれ ら実施例に限定されるものではない。
実施例；！〜 5
基材としてべク トン 'ディキンソン ' ラブゥニァ （Becton Dickinson L abware) 社製ファルコン 3 0 0 2ペトリディ ッシュを用い、 培養細跑とし てゥシ大動脈血管内皮細胞を採用した。 ペトリディッシュ基材表面を被覆するために、 まず、 ペトリディッシュ 表面をイソプロピルアルコールを ^いて洗 し、 窒素気流下で乾燥した c このペトリディッシュ上に、 後記表 1に示す溶媒量を用い、 所定の濃度に 調製した N—ィソプロピルァクリルァミ ドのィソプロピルアルコール溶液 を所定量添加後、 水平な合の上に静置し、 モノマー溶液を塗^ ·展開させ た後、 251^^(3の電子線を1回照射した。 その際の電子線発生都の真空 度は 1 X 10 _sTorr以下、 電子線加速電圧は 20 OkV、 照射部の酸素濃 度は 100 Oppm以下とした（以下の実施例、比較例においても同様)。 電 子線照射後、 5°Cのイオン交換水によりペトリディッシュを浼淨し、 残存 モノマーおよびべトリディッシュ表面に結合していないホモボリマーを取 り除いた。 クリーンベンチ内で乾燥させ、 さらにエチレンォキサイ ド （E 0) ガス滅菌を行ない、 さらに十分に脱気を行なうことにより、 最終的な 製品である細胞培養支持体材料を得た。
得られた細胞培養支持体表面上の被覆量は、 FT— IR— ATR法 （使 用檨器： J I R-RFX3002. 日本電子製） を用い、 128回積算し た詰杲から明細書中に記載の式 （1) に徒って吸収強度比を算出し、 さら に、予め作成しておいた検量線より求めた。 その際に使用した検量線の式 を以下に示す。
被覆量 OngZm2) =37.6 x吸収強度比
得られた結杲を後記表 2に示す。
また、 得られた培養細胞支持体表面上のボリマー被覆率は、 XPS (使 用機器： ES CA1000. 島津製作所製） を用い、 入射角 90度の分析 値より、 明細書中に記載の式 （2) に って求めた c 得られた詰杲を表 2 に示す。
さらに、 このものの被覆面の平滑性を先学顕微鏡下で、 表面に凹凸の有
— 1 一 無を調べることにより検討した。 結杲を表 2に示す。
ゥシ大動脈血管内皮細胞の培養は、 得られた細胞培養支持体材料上にて- ゥシ胎児血清 （FCS) を 10%含むダルベッコ一改変イーグル培地 （D MEM) を培地として、 5%二酸化炭素中、 37°Cで行なった。 十分に細 胞が増殖したのを確認した後、 培養液を 5°Cに冷却し、 30分間放置して、 付着 Z増殖細胞を剥離させ、 増殖細胞剥離回収率を下式に従って求めた。 結果を表 2に示す。
剥離回収した細胞総数
増殖細胞剥離回収率 (％) = X 100
増殖させた細胞総数
その際、 剥離回収した細胞総数および、 増殖させた細胞総数を計測する ためには、 細胞を個々の状態にしなければならない。 したがって、 剥離回 収した細胞総数は、 5eCに冷却、 放置した後、 回収した細胞瑰に対し、 ト リブシン一 EDT A処理を行ない細跑を個々の状態にして行なった。 また、 増殖させた細胞総数は、 前記方法で剥離回収した細胞総数に、 5°Cに?令却、 放置しても剥離しなかった細胞をトリブシン一 EDT A処理にて、 個々の 状態に剥離させた細胞総数を加え合わせることにより求めた。
表 1
Figure imgf000015_0001
実施例 6および 7 べク トン 'ディキンソン ' ラブゥ-ァ钍製ファルコン 3 0 0 2ペトリデイ ツ シュを用 t、、 電子線照射量を 2 0 Mrad 1回 （実施例 6 ) 、 3 5 Mrad 1回
(実施例 Ί ) とする以外は実施例 2と同様にして細胞培養支持体材料を得 た。 被覆量、 被覆率および被覆面の平滑性を、 実施例 2と同様に検討した 結杲を後記表 2に示す。 その支持体上で、 実施例 2と同様にゥシ大動脈血 管内皮钿膣を培養し、 これを剥離回収して増殖細跑剥離回収率を求めた。 結杲を表 2に示す。
実施例 8および 9
べク トン ·ディキンソン ·ラブゥ二ァ社製フアルコン 3 0 0 2ペトリディ ッシュを用い、 電子線照射を 1 0 Mrad 1回 （実施例 8 ) 、 1 5 Mrad 1回 (実施例 9 ) とする以外は実施例 3と同様にして細胞培養支持体材料を得 た。 被覆量、 被覆率および被覆面の平滑性を、 実施例 3と同様に検討した 結果を後記表 2に示す。 その支持痒上で、 実施例 3と同様にゥシ大動脈血 管内皮細胞を培養し、 これを剥離回収して増殖細胞剥離回収率を求めた。
ΪΞ杲 2に刁、 1 c
-実施例 1 0および 1 1
べクトン 'ディキンソン ·ラブゥニァ社製ファルコン 3 0 0 2ぺトリディ ッシュを用い、 N—イソプロピルアクリルアミ ドを溶解する溶媒をェタノ ール （実施例 1 0 ) 、 水 （実施例 1 1 ) とする以外は実施例 2と同様にし て細胞培養支持体材料を得た。 被覆量、 被覆率および被覆面の平滑性を、 実施例 2と同様に検討した詰杲を後記表 2に示す。 その支持侔上で、 実旌 例 2と同様にゥシ大動脈血管内皮細胞を培養し、 これを剥離回収して増殖 細跑剥離回収率を求めた。 結果を表 2に示す c
実施例 1 2および 1 3
べク トン 'ディキンソン · ラブゥニァ社製ファルコン 3 0 0 2ぺトリディ ッシュを用い、 N—イソプロピルアクリルアミ ドの代わりに :—エトキン ェチルァクリルァミ ド （実施例 12) 、 X— n—プロピルメタクリルァミ ド （実施例 13) を使 Sする以外は実施例 3と同様にして細跬培養支持体 材料を得た。 被覆量、 被覆率および被覆面の平滑性を、 実旌例 3と同様に 検討した結果を後記表 2に示す。 その支持体上で、 実施例 3と同様にゥシ 大動脈血管内皮細胞を培養し、 これを剥離回収して増殖細胞剥離回収率を 求めた。 結杲を表 2に示す c
10- 表 2
1 1被覆率 I 覆 in ； 増殖細胸剥離
I I (mg/mつ 1 (%) ！ の平滑拦 ！ 回収率（％)
\実施例 1 ： 28 j 100； 平滑 j 〉90 i
1実施例 2 ！ 12 ！ 991 平滑 1 〉90 I 実施例 3 1 9 j 75； 早滑 j > 90 ！
1実施例 4 ； 7 1 δ δ i -Tin ！ >90 j
1実施例 5 ； 6 1 44 j 平滑 ！ > 90 j 実施例 6 I 10 ！ 8δ j 早滑 ！ >90 ； 実施例 7 I 18 j 1 ο ο； ！ >90 ： 実施例 8 1 4 平滑 >90 j 実施例 9 5 66 j 平滑 >90
実施例 10 15 ' 100 j 平滑 >90
実施例 11 9 791 平滑 >90
実施例 12 ！ 1 δΐ | 平滑 >90
実施例 13 ； 9 741 平滑 >90
比較例 1
べク トン *ディキンソン ·ラブゥニァ社製ファルコン 3002ペトリディ ッシュを、 表面処理を全く行なわずにそのまま細跑培養支持^材料として いた以外は実施例 1と同様な実験を行なった。 詰杲を後記表 3に示す。 比較例 2
基衬としてべク トン *ディキンソン ·ラブゥニァネ土製ファルコン 300 2ペトリディ ッシュを ffiい、 ！\'一イソプロピルアクリルアミ ドを使 Sせず に実施例 2と同じ条俘で電子線を照射し、 そのものを細跑培養支持体材料 として用いた以外は実施例 2と同様な実験を行なつた。 結果を後記表 3に 示す。
比較例 3および 4
基材としてべク トン ·ディキンソン · ラブゥユア社製ファルコン 3 0 0 2ペトリディ ッシュを用い、 表 4に示す溶媒量を用いて所定の濃度に調製 したモノマー溶液を使用する以外は、 実施例 1と同様な実験を行なった。 結果を後記表 3に示す。
表 3
Figure imgf000020_0001
実施例 1 4〜 1 8
べク トン ·ディキンソン ·ラブゥニァ社製ファルコン 3 0 0 2ぺトリディ ッシュを S t、、 電子線照射を表 5に示すように複数回に分割して実施する 以外は実施例 3と同様にして細跑培養支持体材料を得た。 被覆量、 被覆率 および被覆面の平滑性を、 実施例 3と同様に検討した結果を後記表 7に示 す。 その支持体上で、 実施例 3と同様にゥシ大動脈血管内皮細跑を培養し、 これを剥離回収して、 増殖細胞剥離回収率を求めた。 結果を表 7に示す。 33ζ Ο
； 電子線照射線量 (Mrad) | 初回照射時 ！ 2段目照射時 3段目照射時 i 実施例 14 1 1 1 δ 0 '
実施例 15 3 2 0 0 ：
Ϊ
実施例 16 6 2 0 0 i
実施例 17 1 0 2 5 0 ！
実施例 18 6 6 1 δ ！
実施例 1 9〜 2 2
べク トン ·ディキンソン · ラブゥニァ社製ファルコン 3 0 0 2ペトリディ ッシュ上に、 Ν イソプロピルアクリルアミ ドを表 6に示す溶媒量を用い て所定の濃度に調製したイソプロピルアルコール溶液を、 表 6に示す量で 添加し、 水平な台の上に静置させる以外は実施例 1 5と同様にして細胞培 養支持体材料を得た。 被覆量、 被覆率および被覆面の平滑性を、 実施例 1 と同様に検討した詰果を後記表 7に示す。 その支持体上で、 実施例 1と同 様にゥシ大動脈血管内皮細胞を培養し、 これを剥離回収して増殖細胞剥離 回収率を求めた。 結果を表 7に示す =
表 6
モノマー溶液 展開したモノマー 使用した溶媒量 濃度 (重量％) 溶液量（ffilZm2)
実施例 19 6 0 4 7 1 9
実施例 20 δ 0 4 7 2 4
実施例 21 4 δ 4 7 2 7
実施例 22 3 0 4 7 3 4 ； 実施例 2 3および 2 4 べク トン -ディキンソン 'ラブゥユア社製ファルコン 3 0 0 2ペトリディ ッシュを用い、 N—イソプロピルアクリルアミ ドを溶解する溶媒をェタノ ール （実施例 2 3 ) 、水 （実施例 2 4 ) とする以外は実施例 1 6と同様に して細胞培養支持体材料を得た。被覆量、被覆率および被覆面の平滑性を、 実施例 3と同様に検討した結杲を後記表 7に示す。 その支持体上で、 実施 例 3と同様にゥシ大動脈血管内皮細跑を培養し、 これを剥離回収して増殖 細胞剥離回収率を求めた。 結果を表 7に示す。
実施例 2 5および 2 6
べク トン ·ディキンソン 'ラブゥニァ社製フアルコン 3 0 0 2ペトリディ ッシュを^い、 N— ^ f ソプロピルァクリルァミ ドの代わりに !\-ーェトキシ ェチルァクリルァミ ド （実施例 2 5 ) 、 N— n—プロピルメタクリルァミ ド （実施例 2 6 ) を使用する以外は実施例 1 7と同様にして細跑培養支持 体 料を得た。 被覆量、 被覆率および被覆面の平滑性を、 実旌例 3と同様 に検討した結杲を後記表 7に示す。 その支持体上で、 実施例 3と同様にゥ シ大勖脈血管内皮細胞を培養し、 これを剥離回収して増殖細跑剥離回収率
¾：求め Γ: ο SB'果 : ¾ (に不 S o
I被覆量 被覆率 材料被覆面 増殖細胞剥離
I (mg/m2) (% の平滑性 回収率（％) 実施例 14 1 δ ί 6 δ ! 平滑 > 90
実施例 15 7 73 平滑 > 90
実施例 16 ！ 10 86 ！ 平滑 1 〉 90 ！ 実施例 17 ： 12 98 ί 平滑 > 90 1 実施例 18 ； 15 100 平滑 〉 90 ！ 実施例 19 29 1001 平滑 1 〉 90
実施例 20 ; 11 ! 9 δ 1 平滑 〉 90 ！ 実施例 21 ！ 9 74 平滑 〉 90
実施例 22 8 80 平滑 > 90
実施例 23 11 8 δ 平滑 > 90
実施例 24 6 69 军滑 > 90
実施例 25 12 99 平滑 > 90 1 実施例 26 11 ! 98 平滑 > 90
比較例 5
基材としてべク トン 'ディキンソン ' ラブゥユア社製フアルコン 300 2ペトリディッシュを用い、 Ν—イソプロピルアクリルアミ ドを使 せず に実施例 15と同じ条件で電子線を照射し、 そのものを細胞培養支持体材 料として用いた以外は実施例 3と同様な実験を行なった。 結杲を後記表 8 に:^ 0
比較例 6および 7
基材としてべク トン ·ディキンソン · ラブゥ-ァ社製フアルコン 300 2ペトリディッシュを ¾い、 表 9に示す溶媒量を用いて所定の濃度に調製
一ゥ-, - したモノマー溶液を使用する以外は実施例 15と同じ条件で電子線を照射 し、 そのものを細胞培養支持体として用いた以外は、 実施例 3と同様な実 験を行なった。 結杲を後記表 8に示す。
2 8
Figure imgf000024_0001
表 9
Figure imgf000024_0002
実施例 1~5の結杲から明らかなように、被覆量が 2〜8 O^g K 被覆 率が 40〜100%であり、 基材表面上に展開する N—ィソプロピルァク リルァミ ド溶液中の溶媒であるイソプロピルアルコール量が 3〜1 X 102 ml/m2の範囲であれば、 得られた細跑培養支持体材料の表面は、 表 2に示 す通り顕微鏡レベルでは平滑であり、 しかも、 増殖細胞剥能回収率は、 9 0%以上の値が得られる。 この現象を実現するための方法は、 実施例 1〜 5のいずれの方法によっても可能であり、 細跑培養支持体材料として先に 提案した細脗培養支持体より好ましいものである。 その際、 実施例 6〜9 に示すように電子線照射線量を変化させること、 実施例 10および 11に 示すように溶鎮の種類を変化させること、 さらに、 実施例 12および 13
-99- に示すようにモノマー種類を変化させること等の方法を実施しても、 この 現象を実現することが可能である。 実施例 1 4〜2 6に示されるように、 電子線照射を複数回に分割しても同様に可能である。
—方、 比較例 1に示すように、 無処理のファルコン 3 0 0 2では増殖し た細胞を温度を低下させるだけで剥離回収することはできなかった。 また、 比較例 2および 5で示すように、 モノマー溶液を展開せずに電子線を照射 しただけの材料でも同様であった。 比較例 3および 6のように、 被覆量、 被覆率および溶媒量がいずれも所定の範囲以下の材料では、 細胞が増殖す るものの、 温度を低下させるだけで剥離 ·回収することはできなかった。 比較例 4および 7のように、 溶媒量が 1 X 1 0 ½l/m2以上で調製すること により得られた材料では、 増殖細胞剥離回収率は 9 0 %以上の値が得られ たものの、 顕微鏡下では被覆表面に凹凸が認められ、 培養中の細胞像がそ の凹凸の像と重なつて細胞観察の行ない易さという点で不十分な性能の材 料であった。
実施例 2 7
実施例 3で得られた剥離細胞の損傷度合を確認するため、 これを遠心分 離 （6 0 0 G、 5分） により回収し、 十分に撹拌し、 個々の細胞とした後、 2 x 1 0 5個の細胞をべク トン ·ディキンソン ·ラブゥユア社製フアルコ ン 3 0 0 2ぺトリディッシュ上で苒び培養させた。 細胞の培養は実施例 3 と同様の方法を採用した。 結杲を後記表 1 0に示す。
実施例 2 8
実旌例 1 5で得られた剥離細胞の損傷度合を確認するため、 これを違心 分離 （6 0 0 G、 5分） により回収し、 十分に撹拌し、 個々の細胞とした 後、 2 x 1 0 5個の細胞をべク トン 'ディキンソン · ラブゥニァ社 Sファ ルコン 3 0 0 2ペトリディッシュ上で再び培養させた。 細胞の培養 実施 一 9::— 例 3と同様の方法を採用した。 結杲を後記表 1 0に示す 比較例 8
比較例 1で培養した付着細胞を 0. 0 5 %トリプシン一 0. 0 2 %E D T A処理し、 剥離させた細胞の損傷度合を確認するため、 これを遠心分離 （6 0 0 G、 5分） することにより回収し、 得られた 2 x l 0 5傰の細胞をべ クトン ·ディキンソン ·ラブゥヱァ社製フアルコン 3 0 0 2ペトリデイツ シュ上で唇び培養させた。 培養は実施例 1と同様の方法を探用した c 結果 を表 1 0に示す。
表 1 0
Figure imgf000026_0001
剥離回収細胞の損傷度合については、 表 1 0に示すように、 実施例 2 7 お.よび 2 8では培養開始時の 1 0倍まで再増殖させることが可能であるが、 比較例 8では 5倍までしか再増殖させることができなかつ こ。 このことは、 本発明の剥離回収細胞は従来のそれよりも損傷度が小さいことを意味する。 実旌例 2 9
実施例 2で得られた剥離細胞の接能の均一性を確認するため、 得られた シート状細跑集合体を 4分割し、 それぞれ十分に撹拌し、 個々の細胞とし た後、 2 x 1 0 6個の細胞をべク トン 'ディキンソン 'ラブゥユア社製ファ ルコン 3 0 0 2ぺトリディッシュ上で再び培養させた。 細胞の培養は実施 例 2と同様の方法を採 Sした。 細胞の機能は、培養 1曰後、 常法であるラ ジオイ厶ノアツセィ法を用いてプロスタサイタリンの安全代謝産物である α -keto - F I a量を求めることにより判断した、 4分割した細胞集合体 のそれぞれの活性を後記表 1 1に示す。
実施例 3 0
実施例 1 6で得られた剥離細胞の機能の均一性を確認するため、 得られ たシート状細胞集合体を 4分割した。 後の操作は実施例 2 9と同様の方法 を採用した。 4分割した細胞集合体のそれぞれの活性を後記表 1 1に示す。 比較例 9
比較例 1で培養した付着細胞 [低温にしてシート状細胞集合体を得るこ とができないため、 活性はペトリディッシュ全体で 1点 （早均値） しか測 定できない] を、 0. 0 5 % ト リプシン一 0.◦ 2 % E D T A処理し、 剥離 させた細胞の損傷度合を確認するため、 これを遠心分離 （6 0 0 G、 5分） することにより回収し、 得られた 2 X 1 0 6個の細胞をべク トン ·ディキ ンソン ·ラブゥユア社製ファルコン 3 0 0 2ペトリディッシュ上で再び培 養させた。 細胞の培養および活性測定は実施例 2 9と同様の方法を採用し た。 結果を表 1 1に示す。
Figure imgf000027_0001
表 1 1から明らかなように、 剥離回収細胞の活性は、 実施例 2 9および 3 0では、 いずれも比較例 9に比べて 6〜7倍であった。 また、 実施例 2 9および 3 0において、 分割 1〜4の各活性も略同様であった。 このこと は、 本発明の剥離回収細胞が、 従来のものよりも損傷度が小さく、 しかも、 ポリマーが被覆された支持体表面上においての均一に培養できることを意 味- 9 Ό ο
本発明の細胞培養支持体は、 トリプシンや E D T Αのような蛋白分解醇 素や化学薬品等による処理を经ずに、 周囲温度を変化させるだけで細胞培 養支持体から培養細跑を剥離♦回収することができるため、 ①処理工程が 簡略化される、 ②不純物等の混入の可能性が完全になくなる、 ③増殖した 細胞が化学的処理により細胞膜が障害されるということがなく、 ④細胞本 来の機能が損なわれない、 ⑤剥離した細跑が集合状態を保持している、 ⑥ 細胞の培養 ·回収を繰返し行なうことができる等の有利な点を持つ。 また、 本癸明の細跑培養支持体は支持体表面が平滑であり凹凸がないため、 顕微 鏡下での細胞像に凹凸像が重なることがなく、培養細胞の顕微鏡による観 察が容易にかつ明確に行われる。 さらに、 従来の細胞培養支持体は一般に その支持体表面の状態に細胞の培養 ·回収锼能が大きく依存するが、 本癸 明によれば支持体の表面状態に左右されることなく機能が一様に発現する ため、製品の品質が安定し、 歩留りも良好となる上に細胞の種類に応じて 最適なモノマ一種ノ配合量を選択することも可能となる。
一 —

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 細胞付着性基材および該基材表面上に被覆量 2〜 8 O mgZffi2で被覆 された水に対する臨界溶解温度が 0〜 8 0 Cのポリマー層からなる細胞培 養又持体。
2. 基材上に被覆されたポリマー層の水に対する臨界溶 温度が 1 0〜 δ 0 °Cである請求項 1記載の細跑培養支持祐。
3 . 基材上に被覆されたポリマー層の水に対する臨界溶解温度が 1 5 ~ 3 7 °Cである請求項 1記載の細胞培養支持体。
4 . 基材上に培養されたポリマー層が （メタ） アクリルアミ ド、 N—置 換または N, N—ジ置換 （メタ） アクリルアミ ド、 アルキルビニルエーテ ルおよびそれらの混合物よりなる群から選択されるモノマーのホモポリマ 一またはコポリマーを主として含有する請求項 1記載の細胞培養支持体。
5. ポリマー被覆量が 4〜 5 O mg/iE 2である請求項 1記載の細胞培養支 持体。
6 . 細胞付着性基材がガラス、 ポリスチレン、 ポリメチルメタクリレー ト セラミ ックスまたは金属である請求項 1記載の細胞培養支持体。
7 . 細胞付着性基材の表面が親水化処理されてし、る請求項 1記載の細胞 培養支持体。
8 . 基材表面を上部から観察して、 ポリマー層で被覆されている部分の 面積が基材の 4 0〜 1 0 0 %である請求項 1記載の細跑培養支持体。
9 . 基材上の被覆されたポリマー層がポリ一 N— ^ (ソプロピルァクリル Ύミ ド、 ポリ一 N— n—プロピルァクリルァミ ド、 ポリ一 N— n—プロピ ルメタクリルァミ ド、 ポリ一 N—ェトキシェチルァクリルァミ ド、 ポリ一 N—テトラヒ ドロフルフリルァクリルァミ ド、 ポリ一 N—テトラヒ ド口フ ルフリルメタクリルァミ ド、 ポリ一 -\:, 一ジェチルァクリルァミ ド、 ポ ーヮ 7一 リ一 N—ェチルァクリルァミ ド、 ポリ一 N—イソプロピルメタクリルアミ ド、 ポリ一 N-シクロプロビルアクリルアミ ド、 ポリ一 N—シクロプロピ ルメタクリルァミ ド、 ポリ一 N—ァクリロイルピロリジン、 ボリ一 N—ァ クリロイルビペリジン、 ポリメチルビニルエーテルよりなる群から選択さ れる請求項 4記載の細胞培養支持侓。
1 0. 水に射する臨界溶-解温度が 0〜 8 CTCのポリマーを与えるモノマ 一および溶媒を含有するモノマー溶液を、 該モノマー溶液中の溶媒成分の 塗布量が 3〜1 0 O mlZin2となるように基材表面上に塗布した後、 電子線 照射することを待徵とする細胞培養支持体の製造法。
1 1. 溶媒が常圧下で 1 2 0て以下の 点を有する請求項 1 0記載の製
2. 電子線の総照射量が 5〜4 O Mradである請求項 1 0記載の製造法 c
3. 電子線照射が複数回に分けて段階的に行われる請求項 1 0記載の
1 4. モノマーが （メタ） アクリルアミ ド、 N—置換または N, N—ジ 置換 （メタ） アクリルアミ ド、 アルキルビニルエーテルおよびそれらの混 合物よりなる群から選択される請求項 1 0記載の製造法。
1 5 · 基材上の被覆されたポリマー層がポリー N—イソプロピルァクリ ルアミ ド、 ポリ一 N— n—プロピルアクリルアミ ド、 ポリ一 N— n—プロ ピルメタクリルァミ ド、 ポリ一 N—ェトキシェチルァクリルァミ ド、 ポリ 一 N-テトラヒドロフルフリルァクリルアミ ド、 ポリ一 N-テトラヒ ドロ フルフリルメタクリルァミ ド、 ポリ一！\τ, 一ジェチルァクリルァミ ド、 ポリ一 Ν—ェチルァクリルァミ ド、 ボリー Ν—ィソプロピルメタクリルァ ミ ド、 ボリ一 シクロプロピルアクリルアミ ド、 ポリ一； —シクロプロ ピルメタクリルァミ ド、 ポリ一 Ν—ァクリロイルピロリジン、 ポリ一 Ν—
- C - アタリロイルビペリジン、 ポリメチルビニルエーテルよりなる群から選択 される請求項 10記載の製造法。
16. 基材上に形成されたポリマー層の被覆量が 2~8 Omg/m2である 請求項 10記载の製造法。
17. 請求項 1記載の細胞培養支持体を用いて細胞を培養し、 剥離処理 することを特徵とする細胞集合体の製造法。
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