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WO1993003061A1 - Hematopoietic stem cell multiplier - Google Patents

Hematopoietic stem cell multiplier Download PDF

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Publication number
WO1993003061A1
WO1993003061A1 PCT/JP1992/000949 JP9200949W WO9303061A1 WO 1993003061 A1 WO1993003061 A1 WO 1993003061A1 JP 9200949 W JP9200949 W JP 9200949W WO 9303061 A1 WO9303061 A1 WO 9303061A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hepatocyte growth
hematopoietic stem
protein
growth factor
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/JP1992/000949
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Atsushi Komiyama
Tatsutoshi Nakahata
Tetsuo Kubo
Ryuhei Tanaka
Genji Kawano
Tetsuo Sudo
Emiko Sano
Katsuaki Kojima
Original Assignee
Toray Industries, Incorporated
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toray Industries, Incorporated filed Critical Toray Industries, Incorporated
Priority to DE69230879T priority Critical patent/DE69230879T2/de
Priority to EP92916220A priority patent/EP0550769B1/en
Priority to JP50346393A priority patent/JP3395181B2/ja
Priority to US08/030,410 priority patent/US6221359B1/en
Priority to AT92916220T priority patent/ATE191501T1/de
Publication of WO1993003061A1 publication Critical patent/WO1993003061A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid

Definitions

  • the present invention relates to an agent for increasing hematopoietic stem cells.
  • the present invention relates to a hematopoietic stem cell-enhancing agent having a proliferation activity of undifferentiated pluripotent hematopoietic stem cells.
  • a therapeutic agent for restoring bone marrow suppression after use of an anticancer agent or bone marrow transplantation or a therapeutic agent for bone marrow dysfunction such as aplastic anemia and myelodysplastic syndrome.
  • hematopoietic factors having hematopoietic stem cell-enhancing activity can be useful reagents for use as peripheral blood stem cells and bone marrow stem cells in vitro, as well as reagents for analysis and antigens for antibody production. Very useful.
  • the present invention also relates to providing a protein having a novel hematopoietic stem cell increasing activity and belonging to hepatocyte growth factors.
  • hematopoietic factors are involved at various levels in the differentiation process from undifferentiated pluripotent hematopoietic stem cells to mature blood cells, forming a complex hematopoietic network.
  • Most of these hematopoietic factors have been gene cloned, and some hematopoietic factors are currently being mass-produced by genetic recombination technology, and clinical applications are being promoted.
  • undifferentiated pluripotent hematopoietic stem cells are characterized by having the ability to self-renew (proliferate). But has an effect on undifferentiated pluripotent hematopoietic stem cells in the bone marrow
  • the growth factors are not fully understood.
  • Bone marrow stromal cells play a central role in differentiation
  • P A— 6 proliferate mouse pluripotent hematopoietic stem cells
  • Hematopoietic factors having an activity such as :: are used as a therapeutic agent for restoring myelosuppression after use of anticancer drugs or bone marrow transplantation, or as a therapeutic agent for bone marrow dysfunction such as regenerative anemia and myelodysplastic syndrome. It will be a useful medicine.
  • hematopoietic factors having such activities are useful reagents for in vitro proliferation of peripheral blood stem cells and bone marrow stem cells, and also useful as reagents for analysis and antigens for producing antibodies. is there. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a hematopoietic stem cell-enhancing agent containing at least one hepatocyte growth factor as an active ingredient.
  • an object of the present invention is to provide an agent for increasing hematopoietic stem cells having a proliferative activity of undifferentiated pluripotent hematopoietic stem cells.
  • This hematopoietic stem cell-enhancing agent eventually promotes the proliferation of osteoclasts, which are progeny of hematopoietic stem cells, as well as various blood cells.
  • This hematopoietic stem cell augmentation agent promotes hepatocyte proliferation
  • interleukin 3 and / or interleukin 7 may be further contained as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a novel protein having hematopoietic stem cell increasing activity and belonging to hepatocyte growth factors.
  • such proteins can be obtained from cultures of human fibroblasts, or can be obtained by genetic recombination using human fibroblasts as a gene source.
  • a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 which is one of the hepatocyte growth factors or a recombinant human hepatocyte growth factor protein which is an equivalent thereof is used. It also aims to provide quality. It is derived from human normal fibroblasts and is considered more normal and preferred.
  • a recombinant expression vector comprising the code base sequence incorporated therein so that it can be expressed; a transformant obtained by transforming a host cell with the expression vector; and a transformant further comprising a nutrient medium.
  • the medium is cultured under conditions in which the protein can be expressed, has hematopoietic stem cell proliferation activity from the culture, is one of hepatocyte growth factors, and is a recombinant human hepatocyte growth factor.
  • the present invention also provides a method for producing a protein, which is a recombinant human liver cell growth factor characterized by collecting the protein.
  • a protein which is a recombinant human liver cell growth factor characterized by collecting the protein.
  • the invention relates to human normal fibroblasts
  • the present invention relates to a recombinant which is considered to be a preferred type and its production method and use.
  • the agent containing at least one of the hepatocyte growth factors disclosed in the present invention as an active ingredient is useful as a therapeutic agent for myelosuppression or a therapeutic agent for bone marrow dysfunction.
  • An agent containing at least one of the hepatocyte growth factors disclosed in the present invention as an active ingredient is effective for the proliferation of peripheral blood stem cells and bone marrow stem cells in vitro 0, and the present invention uses the agent. Also provided is an in vitro growth method or a culture method using these stem cell agents.
  • FIG. 1 shows a construction diagram of the expression vector pSR and BX.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of HGFcDNA derived from normal human fibroblasts.
  • FIG. 3 shows a construction diagram of a human HGF expression vector pSRFF-1 for animal cell expression.
  • Fig. 4 shows the fraction of the DEAE Sephacell eluate and HGF activity from the culture supernatant of human hepatocyte growth factor-producing monkey C0S-1 cells derived from normal fibroblasts obtained in Example 3 (6). The relationship is shown below.
  • Fig. 5 shows the treatment of heparin-Sepharose chromatogram from the culture supernatant of monkey C0S-1 cells producing human hepatocyte growth factor derived from normal fibroblasts obtained in Example 3 (6).
  • 4 shows the relationship between the heparin eluate p fraction obtained by the above and HGF activity.
  • Fig. 6 shows the results of zinc chelate affinity chromatography from culture supernatant of monkey C0S-1 cells producing normal hepatocyte growth factor derived from normal fibroblasts obtained in Example 3 (6). The relationship between the fraction of the obtained zinc eluate and the HGF activity is shown.
  • FIG. 7 shows the SDS-polyacrylamide electrophoresis pattern of the recombinant human HGF obtained by purification in Example 4 under non-reducing conditions.
  • FIG. 8 shows the growth activity of human placenta-derived HGF and purified fibroblast-derived HGF on NFS60 cell proliferation.
  • FIG. 9 shows a chromatogram of reversed-phase high-performance liquid chromatography of Example 1.
  • the present inventors have proposed a mouse-derived undifferentiated myeloblast cell line NFS60 [Kevin L. Holmeset. A1 .: Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6687-66691 (19985)] proliferates dependently on Inuichi Leukin 3 (IL-3), and IL-13 is a known hematopoiesis known so far. Focusing on the fact that among the factors, it is one of the site force factors that act on undifferentiated hematopoietic stem cells ⁇ : Hematopoietic stem cell growth factors other than IL-13 using the proliferation activity against NFS60 strain as an indicator We conducted diligent research with the aim of exploring.
  • interleukin 1 interleukin 1
  • IL-6 interleukin 6
  • IL-7 interleukin 7
  • interleukin 8 Factors having hematopoietic stem cell-enhancing activity on fibroblasts known to produce hematopoietic factors, such as (IL-18), interleukin 11 (IL-11), c-kit ligand, etc.
  • IL-18 interleukin 18
  • IL-11 interleukin 11
  • c-kit ligand a novel factor belonging to hepatocyte growth factors.
  • the present growth factor supports the proliferation of hematopoietic stem cells in an evaluation system using human bone marrow cells and mouse bone marrow cells.
  • This novel factor has an activity to support the proliferation of undifferentiated hematopoietic stem cells, and has an N-terminal amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 having a molecular weight of about 60,000. It is a new bioactive protein.
  • This new factor also has the amino acid composition shown in Table 1. Since the N-terminal amino acid sequence and amino acid composition of the bioactive protein which is a novel factor of the present invention is different from known proteins, it belongs to a novel hematopoietic factor.
  • the novel factor of the present invention is purified as a bioactive protein from a culture solution obtained by culturing human normal fibroblasts by combining several types of chromatographies. By performing the above, it can be obtained in a pure product form.
  • the factor having hematopoietic stem cell-enhancing activity belongs to hepatocyte growth factors, it has been one of the hepatocyte growth factors so far, and is a representative hepatocyte growth factor [Nakamura , T. et. A 1: Growth Factor Reported as Biochem. Biophys. Res. Commun., 122, 1450-50 (11984)] Also proceeded with the study, and thought that this had proliferative activity against the NFS60 strain. Furthermore, this growth factor supports the growth of hematopoietic stem cells in an evaluation system using human bone marrow cells and mouse bone marrow cells. It is also considered to have hematopoietic stem cell increasing activity.
  • hepatocyte growth factors a typical liver-derived hepatocyte growth factor
  • factors belonging to hepatocyte growth factors used as hematopoietic stem cell increasing agents in the present invention can also be produced by cell culture of human normal fibroblasts and the like.
  • a gene can be extracted from human normal fibroblasts or the like, and the thus obtained gene can be produced by culturing a recombinant by applying gene recombination technology.
  • a novel factor can be obtained by the gene recombination technique as described above.
  • This novel factor has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It features.
  • This novel factor can be obtained using cloned cDNA as described in detail below.
  • the above factors can be purified by, for example, using a culture solution obtained by culturing normal human fibroblasts as a raw material and performing purification by combining several types of chromatography.
  • Proliferation or culture of human normal fibroblasts and the like can be carried out using various usual cell culture media, such as carbon sources, nitrogen sources, vitamins, and the like. Contains amino acids, nucleic acid bases, inorganic salts, etc., as appropriate, juice, peptone, casamino acid, yeast extract, fish extract, potato, malt juice, milk, blood, serum, hormones, antibiotics, cell growth factors, etc.
  • a suitable medium can be used as it is, or a commercially available medium can be used as it is or after appropriately modifying it.
  • Such media include RPM I-164 medium, MEM medium, BME medium, Dulbecco's Eagle medium, DM
  • conditions such as pH, temperature, aeration, agitation, and the frequency of medium exchange that are suitable for the growth of the normal human fibroblasts are determined by experiments. It can be determined appropriately according to the above.
  • cell adhesion factors such as collagen, fibronectin, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, etc. may be added as necessary, or microcarrier beads, For example, dextran, polyacrylamide, polystyrene, gelatin, glass and the like can be used.
  • the normal human fibroblasts obtained by the above proliferation or culture are then subjected to an induction treatment, if necessary, for example, with an ordinary inducing agent such as poly IZC to have hematopoietic stem cell-enhancing activity.
  • an ordinary inducing agent such as poly IZC to have hematopoietic stem cell-enhancing activity.
  • a novel protein belonging to cell growth factors can be induced, and the thus obtained protein of the present invention can be separated and collected by a usual operation.
  • separation and collection method examples include sonication, mechanical crushing, freezing and thawing of cells, osmotic shock, and the like, as well as precipitation from the culture supernatant, for example, using a protein precipitant. Etc. for separation.
  • the protein of interest can be further purified by utilizing various physical and chemical properties thereof and applying various separation and purification methods that are generally widely used.
  • separation and purification methods include homogenization, solubilization by ultrasonic cell disruption, extraction with a buffer containing various salts, solubilization or precipitation with an acid or alkali, and organic solvent. Extraction or precipitation, precipitation using a protein precipitant such as ammonium sulfate, etc. , Dialysis, ultrafiltration using a membrane filter, adsorption chromatography, gel filtration using gel filtration chromatography, etc., ion exchange chromatography, reverse phase chromatography Chromatography, affinity chromatography, counter-current distribution chromatography, high performance liquid chromatography, isoelectric point or gel electrophoresis, etc., and these can be used alone or in appropriate combination.
  • a protein precipitant such as ammonium sulfate, etc.
  • Dialysis ultrafiltration using a membrane filter, adsorption chromatography, gel filtration using gel filtration chromatography, etc., ion exchange chromatography, reverse phase chromatography Chromatography, affinity chromatography, counter-
  • a carrier to which blue dye is bound blue carrier
  • a carrier to which zinc is chelated zinc chelate carrier
  • a carrier to which heparin is bound Affinity chromatography using an antibody-bound carrier, etc.
  • a zinc chelate carrier, a blue carrier, and a heparin carrier can be preferably used. More preferably, it is a method of using a combination of a zinc chelate carrier and a heparin carrier, and the order of use of both carriers is not particularly limited. It is particularly preferred to use.
  • an agarose, a cellulose, a polyacrylamide gel, or the like can be used as an exchange group having a chelating ability such as a biscarboxymethyl imino group (N (CH 2 COOH) 2).
  • a carrier obtained by treating a carrier to which is bound with a solution of a zinc salt such as zinc chloride is used.
  • an insoluble polysaccharide-based carrier such as “Chelating Sepharose j '(manufactured by ⁇ harmacia) is used.
  • a carrier chelated with lead is used.
  • hepatocyte growth factors using a zinc chelate carrier Purification of hepatocyte growth factors using a zinc chelate carrier is performed as follows. That is, first, a solution containing hepatocyte growth factors is contact-adsorbed to a zinc chelate carrier. Adsorption can be performed by either the Knott's method or the column method, but the column method has higher adsorption efficiency.
  • Elution is performed with an acidic buffer such as phosphoric acid, acetic acid, or citric acid, and ⁇ 5 or less is preferable.
  • an acidic buffer such as phosphoric acid, acetic acid, or citric acid
  • ⁇ 5 or less is preferable.
  • elution with higher ⁇ ⁇ is possible under high ionic strength.
  • Gradient elution with increasing concentrations of imidazole, histamine, glycine or ammonium chloride also gives good results.
  • a method of removing metal ions from the gel by using a chelating agent under £ 0,800 or less may be used.
  • the ionic strength can be increased by increasing the concentration of a buffer solution such as phosphoric acid, acetic acid, or citric acid, or by adding a neutral salt such as sodium chloride or potassium chloride (0.2 to 1.0)). Can be increased.
  • a buffer solution such as phosphoric acid, acetic acid, or citric acid
  • a neutral salt such as sodium chloride or potassium chloride (0.2 to 1.0)
  • composition and volume of the eluent are not particularly limited, and the optimal elution conditions are appropriately determined according to the amount of contaminating proteins and hepatocyte growth factors present, the dimensions of the column, and the like.
  • the heparin carrier used in the present invention may be any one in which heparin is bound to an insoluble carrier such as a polysaccharide or synthetic polymer based on cellulose or agarose as a skeleton carrier.
  • an insoluble carrier such as a polysaccharide or synthetic polymer based on cellulose or agarose as a skeleton carrier.
  • the pH is preferably adjusted to 5 to 10.
  • the ionic strength is not more than 0.3 in the range of pH 5.5 to 8.0, which can sufficiently secure affinity for heparin.
  • the hepatocyte growth factors thus adsorbed on the heparin carrier can be recovered by increasing the ionic strength.
  • it can be recovered by a solution obtained by adding an inorganic salt such as sodium chloride or ammonium sulfate to a buffer solution such as sodium phosphate buffer.
  • the recovery method may be a method of increasing the salt concentration in a gradient manner or a stepwise method of increasing the salt concentration stepwise.
  • the ionic strength specifically used is 0.3 to 3, preferably 0.5 to 2.
  • Natural proteins belonging to hepatocyte growth factors which have hematopoietic stem cell-enhancing activity obtained by purification and separation as described above, include acids such as hydrochloric acid, pepsin, chymotribsine, and lipoxyl. After hydrolysis with proteolytic enzymes such as peptidase, the obtained peptide fragments are subjected to chromatography such as ion exchange chromatography to analyze the amino acid composition and determine the amino acid sequence. can do.
  • a purified protein having hematopoietic stem cell-enhancing activity which belongs to hepatocyte growth factors, is hydrolyzed with hydrochloric acid, and then reacted with phenylethanolthioate (PITC).
  • PITC method a method in which each of the carboxylic acids is converted into the corresponding phenylethiol rubamyl derivative and then subjected to reversed-phase high-performance liquid chromatography and quantified
  • the amino acid sequence analyzed in this manner has a natural hematopoietic stem cell-increasing activity, and is used to produce proteins belonging to hepatocyte growth factors using genetic recombination technology. You can use it.
  • a method for obtaining a factor belonging to hepatocyte growth factors used as a hematopoietic stem cell increasing agent in the present invention by applying a typical gene recombination technique will be described.
  • Methods for obtaining RNA from normal human fibroblasts include ordinary methods, for example, methods using polysome separation, sucrose gradient gradient centrifugation, and electrophoresis.
  • a method for extracting RNA from human normal fibroblasts the guanidine-thiosine-to-cesium chloride method (Chir gw in, eta 1., Biochemistry, 18, 52 9 4 (19779)), a method of treating with a surfactant in the presence of a ribonuclease inhibitor using a sodium complex, followed by phenol treatment.
  • An appropriate method can be selected from methods for precipitating NA and the like.
  • MRNA is isolated from normal human fibroblasts by a conventional method, for example, the lithium chloride Z urea method, guanidine isothiosinate method, oligo dT cellulose column method, and the like.
  • a conventional method for example, the lithium chloride Z urea method, guanidine isothiosinate method, oligo dT cellulose column method, and the like.
  • the method of Gub 1er et al. Gae n. 25, 23 6-269 (1983)].
  • the method of H. O kay am a et al. [Mo 1. Cell. B Synthesize cDNA by iol., 2, 161, (1982) & 3, 280, (1983)] and the like.
  • a method using a reverse transcriptase such as avian osteoblast virus (AMV) is basically used, and a method using DNA polymerase or the like using some primers. May be combined, but it is convenient to use a commercially available synthesis or cleaning kit.
  • AMV avian osteoblast virus
  • This cDNA is expressed in a usual manner, for example, according to the method of Seed [Nature. 329, 840-842 (19887)] according to the expression vector or plasmid, phage, etc.
  • a cDNA library is prepared using E. coli or the like.
  • the cohesive end generated using the same restriction enzyme may be used, or if necessary, a part of a synthetic linker or a part of an adapter may be added, or a homopolymer may be added.
  • Vectors for integrating normal cDNA are available. Is made of plasmid. A vector or plasmid for preparing a cDNA library using E. coli or the like is preferable.
  • the vector for incorporating cDNA is a phage, ⁇ gt10, ⁇ gt11 and the like can be used, but the phage for incorporating ordinary cDNA is used without limitation.
  • the vector when the vector is a plasmid, for example, C a C 1 2 according to Hanahaneta 1. J. Mo 1. Biol. 16 6, 55 7 (1983)
  • Ma when the vector is a phage, a method of infecting a host in an appropriate growth phase with a recombinant phage vector using an in vitro packaging method or the like can be used.
  • N-terminal and C-terminal nucleotide sequences of one of the human hepatocyte growth factors belonging to hepatocyte growth factors [Nak amurae ⁇ . A 1.
  • the DNA of the recombinant plaque is immobilized on a filter such as a nylon membrane, and then reacted with a labeled probe.
  • the recombinant DNA having a DNA sequence that selectively binds to the probe is obtained. Choose a body.
  • the probe used herein refers to a nucleic acid sequence having a sequence complementary to the target DNA sequence, and may be DNA or RNA, or may be chemically synthesized or natural. Or with the method of recombinant A Although it may be obtained, it is generally preferable to use a DNA sequence chemically synthesized by applying a known method.
  • examples of the oligonucleotide synthesis method include a phosphoric acid triester method (Tetrahedron, 34, 314 (1978)), Ad. Carbohydr. Chem. 36, 13 5 (1979), ucleic A cids Res., 10, 25 97, 6553 (1982)), phosphoamidite method (Nature, According to conventional methods such as 310, 105 (1994)), a method of chemically synthesizing a nucleic acid, a method combining these methods, and the like can be mentioned.
  • the N-terminal and C-terminal base sequences of one of the human hepatocyte growth factors belonging to the above hepatocyte growth factors [Naka mu raet. A 1. Natur, 324, 4 4-4 4 3 (19989)]
  • two types of primers are synthesized by a DNA synthesizer, and each primer is combined with cDNA with a DNA polymerase such as Taq DNA polymerase.
  • a DNA polymerase such as Taq DNA polymerase.
  • denaturation of the DNA, followed by annealing of the primer, and extension of the primer can be performed, for example, using a DNA thermal cycler from Perkin-Elmer Cetus. This is electrophoresed, and human hepatocyte growth factor cDNA belonging to the target hepatocyte growth factor (HGF) is obtained by a conventional method (MolEc ⁇ 1 arCloning.ColdSpring.
  • hepatocyte growth factor belonging to hepatocyte growth factors obtained by cell culture of human fibroblasts and the like.
  • Primers are synthesized with a DNA synthesizer, and each primer is combined with plasmid DNA in the presence of a DNA polymerase such as Taq DNA polymerase, then the primer is annealed, and then the primer is annealed to extend the primer.
  • a DNA polymerase such as Taq DNA polymerase
  • the DNA thermal cycler of Perkin-E1mer Cetus can be used. This is subjected to electrophoresis, and human hepatocyte growth factor cDNA belonging to the target hepatocyte growth factor (HGF) is prepared according to a conventional method as described above.
  • HGF target hepatocyte growth factor
  • the recombinant DNA thus obtained is treated with a restriction enzyme or the like according to a conventional method, and its cDNA base sequence is determined.
  • the methods used to determine DNA base sequences include, for example, the Maxam-Gilbert method, the Sanger dideoxy method, for example, the dideoxynucleotide chain chain method (Sanger, Science, 211). , 1 2 0 5 (1 9 8 1), Me thodsin En z ymo 1 o gy, 6 5, 5 6 0 to 5 8 0 (1 9 8 0), Me ssing, J. eta 1. ⁇ c 1 eic A cids Res., 9, 3 0 9 (1
  • the DNA strands can be cut, deleted, added and linked, and further, the replacement of the bases in the DNA strand can be carried out according to a usual method.
  • a particularly relates not only to the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing, but also to the DNA to which the above-mentioned alterations and modifications have been added without departing from the object of the present invention.
  • a typical example of such a modification / modification method is a method known as oligo-nucleotide-directed mu tagenesis (for example, M. Smith and S. Gi 11). am "Genetic Engineering (J.K.
  • modification and modification of the gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing include those that enhance the stability and biological activity of the target protein.
  • -Furthermore among the activities of the peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, there are modifications and modifications that enhance the proliferation activity of undifferentiated pluripotent hematopoietic stem cells.
  • the thus cloned cDNA having a hematopoietic stem cell-increasing activity and containing a base sequence encoding all or a part of the amino acid sequence of a protein belonging to hepatocyte growth factors or an equivalent thereof is It is a recombinant expression vector that is recombined into a vector suitable for the expression and incorporates a cDNA having the code base sequence so that the cDNA can be expressed.
  • a cDNA containing a nucleotide sequence encoding all or a part of the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing of the present invention or the equivalent thereof can be obtained by suitable expression vector.
  • the recombinant is then transformed into a suitable expression host by introducing the recombinant vector, and the obtained recombinant is cultured and appropriately induced to express the desired hematopoietic stem cell-enhancing activity. It is useful because a protein having it can be obtained.
  • CD containing a nucleotide sequence encoding all or a part of the amino acid sequence of a protein belonging to hepatocyte growth factors or an equivalent thereof, which has hematopoietic stem cell increasing activity of the present invention.
  • the protein can be produced as a mature protein, that is, in a form in which the signal peptide has been removed, or the above signal peptide can be used as it is, or a signal peptide suitable for a suitable host cell or the like can be added. And secretory production from host cells.
  • the protein having hematopoietic stem cell-increasing activity of the present invention and belonging to the hepatocellular growth factor or its equivalent is produced as a fusion protein or peptide with another recombinant protein or peptide or the like. Then, the desired product can be obtained by enzymatic or chemical digestion treatment with or without isolation.
  • a promoter, a ribosome binding site (eg, an SD sequence), a translation initiation site, and a codon for efficiently expressing a protein belonging to the hepatocyte growth factor class or its equivalent having the hematopoietic stem cell increasing activity of the present invention In the downstream region under the control of cDNA, a cDNA containing the code base sequence can be arranged, and then a stop site ⁇ codon and an evening mineral can be arranged. In other words, in such a case, a start codon and a stop codon are required in the DNA sequence of the gene used for the gene, and these are provided as necessary using a known method.
  • the expression vector used here can be used without any particular limitation as long as it can autonomously replicate in the host, but the vector of replication, selection marker, promoter, RNA splice site, polyadenyl Those having a chemical signal can be preferably used.
  • Selection markers for the recombinant expression vector include various antimicrobial resistance genes, for example, an ampicillin resistance gene, a tetracycline resistance gene, a neomycin resistance gene, and the like.
  • vectors examples include those derived from various bacteria, those derived from bacteriophages, those derived from animal viruses including insects and mammalian cells, various virus vectors, various plasmid vectors, cosmid vectors, and shuttle vectors.
  • First class is given.
  • These vectors include Escherichia coli, especially EK-type plasmid vector, Agt-type phage vector, Pseudomonas aeruginosa vector, Bacillus subtilis-derived vector, yeast-derived vector, and SV40-derived vector. And BPV-derived vectors, retrovirus-derived vectors, and the like. Specifically, pBR322, pUC18, pUB1
  • Escherichia coli expression promoters include the tryptophan (trp) promoter, the lactose (1 ac) promoter, the tryptophan lactose (tac) promoter, the T7 promoter, and lambda derived from nocteriophage. ( ⁇ ) PL promoters and others well-known to those skilled in the art.
  • Control sequences used in yeast vectors A typical example is a promoter relating to the synthesis of glycolytic enzymes, for example, a promoter for glycerin-3-phosphate kinase, a glyceraldehyde, and a glyceraldehyde.
  • SV40 early or late gene promoters such as cytomegalovirus, poliovirus, adenovirus, bovine papillomavirus, and a promoter derived from Tri sarcoma virus, Morone murine sarcoma virus LTR, Lout sarcoma virus LTR, mouse breast cancer virus LTR, promoters for metastatic thione, promoters for immunoglobulin, promoters for heat shock, promoters for dehydrofolate, and actin Promoters, promoters for erotic factors, and the like, which are compatible with mammalian cells, may be mentioned.
  • Tri sarcoma virus Morone murine sarcoma virus LTR, Lout sarcoma virus LTR, mouse breast cancer virus LTR, promoters for metastatic thione, promoters for immunoglobulin, promoters for heat shock, promoters for dehydrofolate, and actin Promoters, promoters for erotic factors, and the like, which are compatible
  • genes control sequences are appropriately combined or chemically modified to obtain an appropriate vector. 2) and containing a base sequence encoding all or part of the amino acid sequence of a protein belonging to hepatocyte growth factors or its equivalent having the hematopoietic stem cell increasing activity of the present invention. It is possible to construct a vector for DNA expression.
  • the translation initiation codon ATG and the termination codon TAA, TGA, or TAG may be included as gene control sequences for the cDNA of the present invention, and may be used in combination with one or more or other codons. It may be.
  • the vector for expression of the cDNA of the present invention may be further incorporated with a plurality of the cDNA of the present invention for expression.
  • CDNA expression having a hematopoietic stem cell increasing activity of the present invention and containing a nucleotide sequence encoding all or part of the amino acid sequence of a protein belonging to hepatocyte growth factors or its equivalent The vector is introduced into an appropriate host, particularly a host cell, according to a generally known method, the host cell is transformed, and the host cell thus transformed is propagated by a method such as culture.
  • a peptide having the hematopoietic stem cell-enhancing activity called a transformant, in a large amount and having all or a part of the amino acid sequence of a protein belonging to hepatocyte growth factors or an equivalent thereof, is obtained.
  • a cell having the function can be obtained.
  • the host used herein, particularly the host cell may be a gram shade such as Escherichia coli or Pseudomonas other than Escherichia coli.
  • Escherichia coli may be a gram shade such as Escherichia coli or Pseudomonas other than Escherichia coli.
  • Escherichia coli mammalian cells, such as COS cells, CH ⁇ cells, and any of eukaryotic cells such as gram-positive bacteria such as bacterium, Bacillus subtilis, and actinomycete, and yeast, animal cells, insect cells, and plant cells. It can be suitably used.
  • a method for introducing the gene expression vector of the present invention into the above-mentioned host a method usually used in the field of gene recombination technology can be used.
  • a mixture of a competent cell and the above-mentioned vector is used.
  • incorporate the vector by binding it to a carrier, or use calcium phosphate coprecipitation, DEAE dextran, electric pulse, in vitro packaging, viral vectors, etc.
  • One method, microinjection, etc. can be used.
  • the transformant thus obtained can also be induced to express the gene after growing in a state where the expression of the foreign gene is suppressed.
  • Proliferation or culture of the transformant can be carried out using various normal cell culture media as in the case of the above-mentioned normal human fibroblasts.
  • Other growth conditions, culture systems, and methods for separating and purifying proteins are the same as those for human normal fibroblasts.
  • the hematopoietic stem cell-increasing agent of the present invention exhibits an activity of increasing undifferentiated pluripotent hematopoietic stem cells, and is used as a hematopoietic stem cell-enhancing agent effective for the treatment of bone marrow suppression (for example, after use of anticancer agents or bone marrow transplantation) Hematopoietic stem cell augmentation agents that are effective in treating dysfunction (eg, aplastic anemia and myelodysplastic syndrome) Or as a hematopoietic stem cell-enhancing agent effective for in vitro proliferation of peripheral blood and bone marrow stem cells o
  • the agent for increasing hematopoietic stem cells of the present invention eventually promotes the proliferation of not only various blood cells but also osteoclasts, which are progeny of hematopoietic stem cells, and thus can be applied as a therapeutic agent for osteoporosis and the like. .
  • recombinant human hepatocytes which are one of hepatocyte growth factors and have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, or an equivalent thereof
  • Growth factor protein is preferably used as an agent for increasing hematopoietic stem cells, shows proliferative activity against undifferentiated pluripotent hematopoietic stem cells, and is effective in the treatment of bone marrow suppression (for example, after the use of anti-inflammatory drugs or bone marrow transplantation)
  • a hematopoietic stem cell-enhancing agent effective as a treatment for bone marrow dysfunction (for example, aplastic anemia or myelodysplastic syndrome), or as an effective in vitro expansion of peripheral blood stem cells and bone marrow stem cells It is useful as a novel hematopoietic stem cell increasing agent.
  • a natural type obtained from normal human fibroblasts is considered to be preferable as an agent for increasing hematopoietic stem cells, and is useful for the above-mentioned applications.
  • the agent for increasing hematopoietic stem cells of the present invention when used for the above-mentioned use of the present invention, it may be used as a pharmaceutical composition as it is or as a mixture with a known pharmacologically acceptable carrier, excipient or the like. It can be administered orally or parenterally.
  • amino acids such as arginine, lysine, glycine, leucine, phenylalanine, and aspartic acid, darcos, sucrose, and mannini are used.
  • Sugars or sugar alcohols such as tall and mannite, gelatin, collagen, dextran, pullulan, heno, 0- lin, chondroitin sulfate, cell hydrochloride and other polysaccharides or protein hydrolysates, hydrochloric acid, etc.
  • An organic acid such as organic acid or acetic acid, an organic base such as sodium hydroxide, or an organic base such as amine can be added as necessary.
  • Specific dosage forms for oral administration include tablets, pills, powders, capsules, granules, syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such dosage forms are produced by a method known per se, and contain carriers or excipients usually used in the field of pharmaceutical preparations.
  • carriers and excipients for tablets include lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like.
  • Dosage forms for parenteral administration include, for example, ointments, injections, compresses, liniments, inhalants, suppositories, transdermal inhalants and the like.
  • the injection is prepared by a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the hepatocyte growth factor of the present invention in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections.
  • Aqueous solutions for injection include physiological saline and glucose solution
  • oily solutions include sesame oil and soybean oil. Is also good.
  • Suppositories to be used for enteral administration are prepared by a method known per se, for example, by mixing the hematopoietic stem cell-increasing agent of the present invention with a usual suppository base and molding.
  • the effective dose and frequency of administration of the hematopoietic stem cell augmenting agent of the present invention will vary depending on the mode of administration, the age and weight of the patient, the nature or severity of the condition to be treated, but is usually 0.0 per adult. 1 to 100 fflg, preferably 0.1 to 10 mg, can be administered in one dose or in divided doses.
  • the protein of the present invention having hematopoietic stem cell-increasing activity and belonging to hepatocyte-growth factors or an equivalent thereof may be used alone or as a carrier, for example, serum albumin, egg albumin, and thioglobulin. Or hemosyanine
  • KLH benzyl-N-hydroxysuccinimide ester
  • MFS maleid benzyl-N-hydroxysuccinimide ester
  • An animal can be obtained by immunizing an animal by injecting and administering the antibody by binding, etc.
  • a spleen cell obtained from an animal immunized in this manner for example, a spleen cell obtained from a mouse, and a normal myeloma cell can be obtained.
  • Hybridoma cells that produce monoclonal antibodies can also be obtained by cell fusion using this method.
  • the antibody thus obtained can be bound to a solid phase or bound to a labeling agent, for example, a chromophore such as an enzyme, coenzyme, fluorescence, or dye, a radioactive label, or a paramagnetic metal, and used for assay.
  • a labeling agent for example, a chromophore such as an enzyme, coenzyme, fluorescence, or dye, a radioactive label, or a paramagnetic metal
  • a labeling agent for example, a chromophore such as an enzyme, coenzyme, fluorescence, or dye, a radioactive label, or a paramagnetic metal
  • a labeling agent for example, a chromophore such as an enzyme, coenzyme, fluorescence, or dye, a radioactive label, or a paramagnetic metal
  • ELISA enzyme immunoassay
  • R IA radioimmunoassay
  • Sandwich immunoassay can be performed according to D.
  • the resulting active fraction (50 ml) was desalted by gel filtration, and then purified by reversed-phase high-performance liquid chromatography. Using a "Vy dac 2 18 TP5 10 column" (1.0 x 25 cm: Separe — manufactured by Chillon Group), adjust the acetonitrile concentration from 0 based on a 0.1% aqueous solution of trifluoroacetic acid. Elution was performed with a linear increase to 50%. The results are shown in FIG. 9. For this activity peak, SDS polyacrylamide gel electrophoresis under reduction (Laemmli U.K .: Nat ⁇ re, 227,680-68,5 (1970) ) Showed a single band with a molecular weight of about 60K.
  • N-terminal amino acid sequence and amino acid composition N-terminal amino acid sequence and amino acid composition:
  • Example 1 'Purified protein obtained in Example 1' was converted from fibroblast-derived natural human hepatocyte growth factor (hereinafter referred to as natural human HGF). (Abbreviation) was applied to an amino acid sequencer (A pp 1 ied Biosterns 47 7 AP rotein Sequencer). The amino acid sequence at the N-terminal 16 amino acids is as shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. there were. This N-terminus must be the N-terminus of the chain due to homology to that disclosed by Nakamura et al. [Nature, 3442,440-443 (19989)]. I understood.
  • cDNA for human hepatocyte growth factor was cloned by Nakamura et al. [Nature, 342, 4440-443 (11989)], and its sequence was A primer can be synthesized at the same time, cDNA can be amplified by polymerase chain reaction (p01), and then cloned into an expression vector or the like.
  • RNA transfer the obtained RNA to lOmM Tris-HCl buffer containing ImM EDTA.
  • RNA solution was applied to an Oligo d T cellulose column equilibrated with TE containing 0.5 ML iC1, and washed with the same buffer. After washing with TE containing 0.3 M LiC1, the adsorbed poly (A) RNA was eluted with 2 mM EDTA (pH 7.0) containing 0.01% SDS.
  • An appropriate sequence is selected from the amino acid sequence of human hepatocyte growth factor, and two primers are synthesized by a DNA synthesizer based on, for example, the N-terminal or C-terminal base sequence.
  • the cDNA is then amplified by the polymerase chain reaction (PCR) method and cloned into an expression vector.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Two primers 5 'CTATGA CT GTG GTA CC 3', were synthesized using DNA synthesizer 2.
  • 20 pm 0 1 g of the plasmid DNA obtained in (2) above was placed in a 0.5 ml microcentrifuge tube, and 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3) was added.
  • 1.5 mM MgC12, 25 mM KC1, 100 g / 1 gelatin, 50 / zM dNTP each, 4 units Taq DNA Polymerase Let it be I 0 0 1.
  • DNA denaturation conditions were set at 94 for 1 minute, primer annealing conditions at 50 ° C for 2 minutes, primer extension conditions at 72, and 3 minutes for Perkin-Elmer Cetus.
  • the reaction was carried out for 40 cycles. This was electrophoresed on a 1% agarose gel, and about 2.2 kb of human hepatocyte growth factor cDNA derived from normal fibroblasts was purified by a conventional method (Mollecular Cloning. e York. 1982). Alternatively, an oligomer based on the N-terminal amino acid sequence (16 amino acids) of human hepatocyte growth factor derived from normal human fibroblasts purified as in Example 1 is used. Can be synthesized by a DNA synthesizer to obtain human fibroblast-derived human hepatocyte growth factor cDNA by a colony hybridization method.
  • Expression vector CDM8 [Seed. Nature. 32 9, 840-842 (19887)] was cut with the restriction enzyme HindIII and blunt-ended with T4 DNA polymerase. As an end, Eco RI linker was ligated with T4 DNA ligase. Next, it was cleaved with restriction enzyme PstI and blunt-ended with T4 DNA polymerase. In addition, the KpnI linker was ligated with T4 DNA ligase, and the restriction enzyme Ec0
  • FIG. 1 shows a construction diagram of the expression vector PSRBX.
  • This plasmid DNA was digested with a restriction enzyme BstXI according to a conventional method, and the resulting reaction mixture was electrophoresed on a 1% agarose gel. Was separated and purified.
  • This DNA fragment was ligated to the 3.4 kb DNA fragment obtained in (4) above, which had been cleaved at both ends with the restriction enzyme BstXI, using T4 ligase.
  • Escherichia coli is transformed according to a conventional method, and Smid DNA was prepared by a conventional method.
  • this plasmid DNA was digested with the restriction enzyme BamHI to confirm that the target normal fibroblast-derived human hepatocyte growth factor cDNA fragment had been incorporated (the plasmid was used).
  • the probe is called pSRaFDF-1) and the Diodeoxy method [Proberet. A 1. Science 2 38, 3 36-3 4] was performed using the Genesis 2000 DNA analysis system (DuPont). 1 (19987)], the nucleotide sequence of normal fibroblast-derived hepatocyte growth factor cDNA was determined (FIG. 12).
  • Figure 3 shows the construction diagram of the human HGF expression vector pSRFFD-1 for animal cell expression.
  • the cells were cultured for 4 days under the conditions of% C02 and 37, and the hepatocyte growth factor activity in the culture supernatant was measured by using the proliferation of NFS60 cells as an index. On the other hand, hepatocyte growth factor activity was observed in the culture supernatant obtained by introducing the vector into which the hepatocyte growth factor cDNA was inserted in the reverse direction into COS 11 cells in the same manner. Did not.
  • the number of CHO clone DUKXB111, a dihydrofolate reductase (DHFR) -deficient strain of Chinese hamster CHO cells (distributed by Dr. C hasin, Columbia University), will be 1 ⁇ 105 per 12-well plate. Containing I 0 fetal serum and nucleic acid or
  • the cells were cultured overnight in a MEM (Gibco) medium.
  • Hepatocyte growth factor activity during Qing Cultivated in a nucleic acid-free medium containing 50 nM meso-rexet and 10% fetal serum, to obtain a clone with high hepatocyte growth factor-producing ability.
  • CHO— 6-2 3-2 The production performance of human hepatocyte growth factor derived from normal fibroblasts of this cell was 3500 units or 12 days in a measurement system using NFS60 cell proliferation as an index.
  • Normal fibroblast-derived recombinant human hepatocyte growth factor was isolated from the culture supernatant of monkey C0S_1 cells producing normal fibroblast-derived human hepatocyte growth factor obtained in Example 3 (6). Purified.
  • the ammonium sulfate concentrate obtained in (1) above was added to 10 ml DEAE Sephacel (Pharmacia) equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer (PH 8.0). After washing the unadsorbed substances with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), add NaCl of 0.5 M, 0.3 M, and 0.5 M, respectively. Including The adsorbate was eluted by sequentially adding 100 ml of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). Fig. 4 shows the chromatographic pattern. Areas having NFS 60 cell growth stimulating activity were collected and used as DEAE Sephacell eluate.
  • the DEAE Sephacell eluate was equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.3 M NaCl, and 2 ml of heparin '' Sepharose CL-16B (Pharmacia) ). After thorough washing with 2 OmM Tris-HCl buffer containing 0.31 ⁇ , 0.5M NaC1, then 20 mM Tris-HCl buffer containing 1 M NaC1 (pH 8 0).
  • Fig. 5 shows the chromatographic pattern.
  • the NFA 60 cell growth stimulating activity was collected and used as a heparin eluate.
  • the column was filled with 0.3 ml of chelating Sepharose 6B (Pharmacia), added with a 0.5% aqueous zinc chloride solution, and washed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). Then, a zinc chelate affinity mouth mat was prepared. To this, add 12 ml of a parin eluate, and wash with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1 M NaCl. In addition, 50 mM NH 4 C 1 After washing with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0),
  • Fig. 6 shows the chromatographic pattern. Fractions having the activity of stimulating the proliferation of NFS 60 cells were collected and used as a zinc eluate. The yield of the purified recombinant hepatocyte growth factor was about 750 ⁇ g, and the activity recovery rate from the ammonium sulfate concentrate was about 44%.
  • the recombinant hepatocyte growth factor purified in the above step was subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis (412% gel) under non-reducing conditions. Recombinant hepatocyte growth factor showed a single band with a molecular weight of 661,855,000 under non-reduction. The results are shown in FIG. Example 5
  • Normal fibroblasts were obtained from the culture supernatant of the Chinese hamster CHO recombinant cell line CHO-6-3 23-2 produced by normal fibroblast-derived human hepatocyte growth factor obtained in Example 3 (7). Cell-derived recombinant human hepatocyte growth factor was purified.
  • CM-Sephadex (Pharmacia) column was added. After washing with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8), elution was carried out with 20 mM Tris-HCl buffer (PH 6.8) containing 0.5 M NaC1. Fractions having NFS 60 cell proliferation stimulating activity were collected and used as CM-Sephadex eluate.
  • the normal fibroblast-derived recombinant hepatocyte growth factor purified in the above step is subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis (420% gel) under non-reducing conditions, and the gel is stained by silver staining. Stained.
  • the recombinant hepatocyte growth factor showed a single band with a molecular weight of 66,185,000 under non-reducing conditions.
  • the cells were cultured under the above culture conditions for 45 hours.
  • the cultured petri dishes were washed six times with 0.9% NaCl. After dissolving the cells in 1.5 ml of 0.333 N NaOH, the whole amount was transferred to a test tube in ice water.
  • Example 8 The natural hepatocyte growth factor derived from human normal fibroblasts (natural human HGF) purified in Example 1 showed activity.
  • Example 8 The natural hepatocyte growth factor derived from human normal fibroblasts (natural human HGF) purified in Example 1 showed activity.
  • Example 8 The natural hepatocyte growth factor derived from human normal fibroblasts (natural human HGF) purified in Example 1 showed activity.
  • Example 8 The natural hepatocyte growth factor derived from human normal fibroblasts (natural human HGF) purified in Example 1 showed activity.
  • NNAMNC non-phagocytic non-adherent mononuclear cells
  • the culture was performed according to the method of Isc0Ve et al. [Isc0Ve, N.N.et.al .: J.CelPhysiol.,
  • NPN AMNCs described above were added to a serum-free medium having the following composition to give 1 m1. ⁇ -methyl, 0.8% methylcellulose (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.), 0.1% recrystallized deionized bovine serum albumin (crystallizeddeionized bovineseruma 1b ⁇ min, Sima Co., Ltd.), 300 ⁇ g / m 1 Fe mono-saturated human transferrin (F e — saturatedhumantransferrin, manufactured by Sigma),
  • Table 2 shows the results. Table 2 Native human bone marrow cells
  • HGF Hematopoietic stem cell proliferative activity of HGF Native human colony formation / 4 x 10 4 NP NAMNC
  • BDF1 female mice were injected intravenously with 15 O mg / Kg of 5—Fluorouracil, and bone marrow cells were collected from the femur 48 hours later.
  • Culture was performed by a methylcellose method modified from the method of IscoVe et al. 5 ⁇ 10 4 bone marrow cells were added to a serum-free medium of the following composition to give 1 ml.
  • rmu IL-3 (Cosmo Bio): 200 u / m1
  • rmu IL-7 (Cosmo Bio): 20 u / m 1.
  • Culture 37 The cells were cultured in an incubator of C, 5% C02 and 100% humidity. The colonies after 17 days of culture were observed under an inverted microscope, and the number of each colony was calculated.
  • Table 3 shows the results of natural hepatocyte growth factor derived from human normal fibroblasts. ' Table 3 Hematopoietic stem cell proliferation activity of native human HGF on 5FU-treated mouse bone marrow cells
  • Liver parenchymal cells were separated from 4-week-old Wistar rat by collagenase perfusion. The obtained hepatocytes 5% ⁇ shea calf serum, 1 X 1 0 Insuri down, and 1 X 1 0 one 9 Uiria ⁇ Su E medium containing M dexamethasone 2 X 1 0 5 or Zm 1 become as Suspended in water. In 24-well multi-plates were co over preparative collagen, seeded the cell suspension by 0. 5 m l, at 37 in the presence of 5 0 2, and cultured for 2 0 hours.
  • Table 4 shows the results. Table 4.Human normal fibroblast-derived recombinant
  • Hepatocyte proliferation activity of native HGF DNA synthesis in hepatocytes Hepatocyte DNA synthesis (cDNA synthesis (coo 1 pm / ⁇ g cell p / ug cell nnn protein 7 hours)
  • HGF a native form derived from normal human fibroblasts purified in Example 1 and a recombinant form derived from C0S cells purified in Example 4, exhibit DNA synthesis activity at 10 ng Zm1. As shown, in the presence of insulin and / or epidermal growth factor, DNA synthesizing activity of hepatocytes was enhanced.
  • Example 1 1
  • Bone marrow cells were collected from the femurs of BD F1 mice, and 2 ⁇ 104 bone marrow cells were 0.9% according to a standard method (M etca 1 f Clonalcultureofh emopoieticcells: techniquesandapplicat ions.E 1 sevier Amsterd am). Suspend in 1 ml of 1% MEM medium containing methylcellulose, 1 X 10-4 M2-mercaptoethanol, 20% fetal serum, and various concentrations of HGF, and add 5% C0 2 Cultivate at 37 ° C for 7 days in the presence, observe colonies under an inverted microscope, and determine the number of colonies.
  • Table 5 shows the results. 5 Colony assay using untreated bone marrow cells Normal human normal fibroblasts Number of GM clusters Cell-derived HGF
  • Example 2 Stimulation of NFS 60 cell growth by human placenta-derived hepatocyte growth factor (Bect0n Diekinson Labware) and natural hepatocyte growth factor derived from human normal fibroblasts purified in Example 1 The activity was measured by the method described in Example 6. The results are shown in FIG.
  • hepatocyte growth factor derived from normal human hepatocytes (Nature, Vol. 34, 2, pp. 44, 44, 43, Novembler 23, (19989)
  • a recombinant hepatocyte-enhancing factor derived from human embryonic lung fibroblast M426 (Proc. Atl. Acad. Sci. USA. Vol. 88, p. P.
  • the NFS 60 cell growth stimulating activity of 4 15-4 19 (January, (1991)) can also be measured by the method described in Example 6.
  • Hepatocyte growth factor has an activity to support the proliferation of mouse-derived undifferentiated myeloblast cells.
  • bone marrow suppression for example, use of anticancer agents
  • For bone marrow dysfunction eg, aplastic anemia, etc.
  • the hematopoietic stem cell expansion of the present invention also promotes the proliferation of not only various blood cells but also osteoclasts, which are progeny of hematopoietic stem cells, and thus can be applied as a therapeutic agent for osteoporosis and the like.
  • Organism name human normal fibroblast
  • AAA AGA AGA AAT ACA ⁇ CAT GAA TTC AAA AAA TCA GCA AAG ACT Mik Arg Lys Arg Arg Asn Thr lie His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
  • AGT GGC ATC AAA TGT CAG CCC TGG AGT TCC ATG ATA CCA CAC GAA CAC 80 Ser Gly He Lys Cys Gin Pro T ⁇ p Ser Ser Met lie Pro His Glu His
  • TCT TGT GCC AAA ACG AM CAA CTG CGA GTT GTA AAT GGG ATT CCA ACA 1 88 Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gin Leu Arg Val Val Asn Glylie Pro Thr

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Description

购 鄘 害
造血幹細胞増加剤 技術分野
本発明は造血幹細胞増加剤に関するものである。 特に 本発明は未分化の多能性造血幹細胞の増殖活性を有する 造血幹細胞増加剤に関する。 本発明によれば抗癌剤使用 後や骨髄移植後の骨髄抑制を回復するための治療剤又は 再生不良性貧血や骨髄異形成症候群等の骨髄機能不全に 対する治療剤が提供される。 さらに、 この造血幹細胞増 加活性を有する造血因子は、 末梢血幹細胞及び骨髄幹細 胞の i n v i t r oでの増殖剤等として使用して有用 な試薬となるほか、 分析用の試薬や抗体作製用の抗原と しても有用である。
本発明は、 さらに新規な造血幹細胞増加活性を有し、 肝細胞増殖因子類に属するタンパク質を提供することに も関する。 背景技術
最近、 未分化の多能性造血幹細胞から成熟血球に至る 分化の過程には、 数多く の造血因子が種々のレベルで相 互に関与し、 複雑な造血系ネッ トワークを形成している ことが分かってきた。 また、 これら造血因子の殆どのも のは遺伝子クローニングされ、 現在、 いくつかの造血因 子については遺伝子組換え技術により大量生産され、 臨 床応用が進められている。 一方、 未分化の多能性造血幹 細胞は自己複製能 （増殖） を有するこ とを特徴としてい るが、 骨髄において未分化の多能性造血幹細胞に働く増
殖因子については十分に解明されていない。
骨髄における多能性造血幹細胞の増殖や成熟細胞への
分化には骨髄ストローマ細胞が中心的な働きを果たして
いることが知られており、 ス トローマ細胞が分泌する何
等かの液性因子あるいは細胞間相互作用等が骨髄におけ
る造血に関与していると考えられる。
例えば、 C 5 7 B 1 /6新生児マウスの頭蓋冠から樹
立された骨髄ストローマ細胞 MC 3 T 3— G 2ZPA—
6 (P A— 6 ) 細胞がマウスの多能性造血幹細胞の増殖
を支持する事が知られている [K 0 d a m a H. e
t . a 1. ： J. C e l l . P h y s i o l . , 1 1 2
, 8 9 ( 1 9 8 2) ] 。
近年、 多能性幹細胞に発現しているチロシンキナーゼ
レセプ夕一である c—k i t夕ンパク質に対する リガン
ドが未分化の幹細胞の増殖に関与する因子として注目さ
れ、 その実体解明の研究が精力的に行われてきたが、 1
9 9 0年に 3つのグループがその遺伝子クローニングに
成功し、 S CF [s t em c e l l f a c t o r ;
K. M. Z s e b o e t . a l . ： C e l l , 6 3,
1 9 5 - 2 0 1 ( 1 9 9 0 ) ] 、 MGF [m a s t c
e l l g r ow t h f a c t o r ; D. E. W i 1
l i am s e t . a 1. ： C e l l , 6 3, 1 6 7 - 、) 1 7 4 ( 1 9 9 0 ) ] 、 および KL [ c一 k i t 1 i
g a n d ： ； Hu a n g e t . a 1. ： C e l l , 6
3, 2 2 5 - 2 3 3 ( 1 9 9 0 ) ] として報告された。 現在、 遺伝子組換え技術により大量生産された c一 k i t リガン ドを使い、 その作用の解析が進められている が、 これまでの研究ではこの因子はある程度分化した幹 細胞に作用する事がわかりつつある [H a y a s h i e t . a 1. ： I n t . J . H em a t o l o g y, S u p 1. N o . 1 , p 1 9 8 ( 1 9 9 1 ) ] 。
従って、 このタンパク質の他に骨髄において、 もっと 未分化の多能性造血幹細胞に働く因子が存在すると考え られている。
：：の様な活性を有する造血因子は、 抗癌剤使用後や骨 髄移植後の骨髄抑制を回復するための治療剤又は再生不 良性貧血や骨髄異形成症候群等の骨髄機能不全に対する 治療剤として、 有用な医薬品となる。
さらに、 この様な活性を有する造血因子は、 末梢血幹 細胞及び骨髄幹細胞の i n V i t r 0での増殖剤とし て有用な試薬となるほか、 分析用の試薬や抗体作製用の 抗原としても有用である。 発明の開示
本発明は肝細胞増殖因子類の少なく とも一つを有効成 分として含有する造血幹細胞増加剤を提供することを目 的とする。 特には、 本発明は未分化の多能性造血幹細胞 の増殖活性を有する造血幹細胞増加剤を提供することを 目的とする。 この造血幹細胞増加剤は結果的には種々の 血液細胞ばかりでなく造血幹細胞の子孫である破骨細胞 の増殖も促進する。 この造血幹細胞増加剤は肝細胞増殖 因子類の少なく とも一つに加えて、 有効成分として更に インターロイキン 3及び /またはインターロイキン 7を 含有するものであってよい。
本発明は更に、 造血幹細胞増加活性を有し、 肝細胞増 殖因子類に属する新規夕ンパク質を提供することをも目 的とする。 特に、 このようなタンパク質はヒ ト線維芽細 胞の培養液から得られるし、 あるいはヒ ト線維芽細胞を 遺伝子供給源として遺伝子組換え法よつて得ることもで きる。 本発明では特に、 肝細胞増殖因子類の一つであつ て、 配列表の配列番号 2に示したアミ ノ酸配列を有する タンパク質あるいはその同効物である組換えヒ ト肝細胞 増殖因子夕ンパク質を提供することをも目的とする。 それはヒ ト正常線維芽細胞由来であって、 より正常型で あって好ましいと考えられる。 本発明に従えば、 造血幹 細胞増加活性を有し、 肝細胞増殖因子類に属するタンパ ク質あるいはその同効物のアミ ノ酸配列をコー ドする塩 基配列を含むことを特徴とする D N A、 そのコー ド塩基 配列を発現可能に組み込んでなる組換え発現ベクター、 その発現ベクターにより宿主細胞を形質転換することに より得られた，質転換体、 更にはその形質転換体を、 栄 養培地中該夕ンパク質が発現可能な条件下に培養して、 該培養物から造血幹細胞増殖活性を持ち、 肝細胞増殖因 子類の一つであって、 組換えヒ ト肝細胞増殖因子である タンパク質を採取することを特徴とする組換えヒ ト肝紬 胞増殖因子.であるタンパク質の '製法をも提供する。 特に 本発明は、 ヒ ト正常線維芽細胞由来であって、 より正常 型であって好ま しいと考えられる組換え体及びその製法 、 用途に関する。
本発明で開示される肝細胞増殖因子類の少なく とも一 つを有効成分として含有する剤は、 骨髄抑制の治療剤や 骨髄機能不全の治療剤として使用して有用である。
本発明で開示される肝細胞増殖因子類の少なく とも一 つを有効成分として含有する剤は、 末梢血幹細胞および 骨髄幹細胞の i n V i t r 0における増殖に有効で、 本発明はその剤を用いたこれらの幹細胞の剤を用いた i n v i t r o増殖法あるいは培養法をも提供する。 図面の簡単な説明
第 1 図は発現べクタ一 p S R ひ B Xの構築図を示す。 第 2図はヒ ト正常線維芽細胞由来 H G F c D N Aの塩 基配列およびァミ ノ酸配列を示す。
第 3図は動物細胞発現用ヒ ト H G F発現ベクター p S R F D F— 1 の構築図を示す。
第 4図は実施例 3 ( 6 ) で得られた正常線維芽細胞由 来ヒ ト肝細胞増殖因子産生サル C 0 S - 1 細胞の培養上 清よりの D E A Eセファセル溶出液の画分と H G F活性 との関係を示す。
第 5図は実施例 3 ( 6 ) で得られた正常線維芽細胞由 来ヒ ト肝細胞増殖因子産生サル C 0 S - 1細胞の培養上 清よりのへパリ ン · セファロースクロマ トグラフィ ー処 理して得られたへパリ ン溶出液 p画分と H G F活性との 関係を示す。 第 6図は実施例 3 ( 6 ) で得られた正常線維芽細胞由 来ヒ ト肝細胞増殖因子産生サル C 0 S - 1細胞の培養上 清よりの亜鉛キレー トァフィニティ一クロマ トグラフィ 一処理して得られた亜鉛溶出液の画分と HG F活性との 関係を示す。
第 7図は実施例 4で精製して得られた組換え型ヒ ト H G Fの非還元下での S D S—ポリアク リルアミ ド電気泳 動パターンを示す。
第 8図はヒ ト胎盤由来 HG Fと精製線維芽細胞由来 H GFの NFS 6 0細胞増殖刺激活性を示す。
第 9図は実施例 1の逆相高速液体クロマ トグラフィー のクロマ 卜グラムを示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明者等は、 マウス由来の未分化骨髄芽球細胞株 N F S 6 0 [K e v i n L . Ho l m e s e t . a 1 . ： P r o. Na t l . A c a d. S c i . USA, 8 2, 6 6 8 7〜 6 6 9 1 ( 1 9 8 5) ] がイン夕一ロイ キン 3 ( I L— 3 ) に依存して増殖すること、 及び I L 一 3がこれまで知られている既知の造血因子のなかでは 、 未分化の造血幹細胞に作用するサイ ト力インの一つで あるこ ^:に着目し、 NF S 6 0株に対する増殖活性を指 標にして I L一 3以外の造血幹細胞増殖因子の探索を目 的として鋭意研究を重ねた。 その結果、 インタ一ロイキ ン 1 ( I L一 1 ) 、 イ ンターロイキン 6 ( I L— 6) 、 インターロイキン 7 ( I L— 7) 、 インタ一ロイキン 8 ( I L 一 8 ) 、 インターロイキン 1 1 ( I L 一 1 1 ) 、 c 一 k i t リガン ド等の造血因子を産生しているこ とが 知られている線維芽細胞に造血幹細胞増加活性を有する 因子を発見し、 それが肝細胞増殖因子類に属する新規な 因子であることを見出した。 そして、 本増殖因子がヒ ト 骨髄細胞及びマウス骨髄細胞を使用した評価系において 造血幹細胞の増殖を支持することをも見出した。
この新規な因子は、 未分化の造血幹細胞の増殖を支持 する活性を有し、 分子量が約 6 0 , 0 0 0である配列表 の配列番号 1 に示した N末端ァミ ノ酸配列を有する新規 生理活性夕ンパク質である。
またこの新規な因子は、 表 1 のア ミ ノ酸組成を有する 。 本発明のこの新規な因子である生理活性タンパク質の N末端アミ ノ酸配列及びア ミ ノ酸組成は、 既知のタンパ ク質とは異なるので、 これは新規の造血因子に属するも のである。
この本発明の新規な因子は、 下記で詳しく説明するよ うに生理活性タンパク質として、 ヒ ト正常線維芽細胞の 培養で得られた培養液を原料にして、 数種のクロマ トグ ラフィーを組み合わせて精製を行なう ことにより純品形 態で得ることができる。
こう して得られる本発明のこの生理活性夕ンパク質の 物理化学的性質及び生物学的性質の詳細を以下に記載す る
( 1 ) 分子量 ： ·
6 0 , 0 0 0 [ S D S —ポリアク リルア ミ ドゲル 電気泳動法 （L a emm l i U. K. ： N a t u r e, 2 27, 6 8 0 - 6 8 5 ( 1 9 7 0 ) ] ( 2 ) N末端ァミ ノ酸配列 （ 1 6残基）
配列表の配列番号 1に示す。
( 3〉 アミ ノ酸組成
表 1に示す。
( 4 ) 生物活性
A. マウス由来の未分化骨髄芽球細胞 （NF S 6 0 ) に対し、 増殖活性を示す。
B. 5—フルォロウラシル （5— FU) 処理マウス の骨髄細胞に対し、 I L一 3との併用、 又は I L一 3とインターロイキン一 7 ( I L - 7 ) と の併用により、 増殖活性を示す。
C. ヒ ト正常骨髄由来の造血幹細胞に対し増殖活性 を示す。 一方、 その造血幹細胞増加活性を有する因子が肝細胞 増殖因子類に属する因子であることから、 これまで肝細 胞増殖因子類の一つであって、 代表的肝細胞増殖因子 [ Na k amu r a, T . e t . a 1 ： B i o c h em. B i o p h y s . R e s . C ommu n. , 1 2 2, 1 4 5 0〜 1 4 5 9 ( 1 9 84) ] として報告されている 増殖因子についても研究を進め、 これが NF S 6 0株に 対する増殖活性を有するものであると考えた。 さらに， 本増殖因子がヒ ト骨髄細胞及びマウス骨髄細胞を使用し た評価系において造血幹細胞の増殖を支持するものであ るとも考えられ、 造血幹細胞増加活性を有するとも考え られる。
なお、 肝細胞増殖因子類のうちには、 肝実質細胞に対 する増殖活性の他に、 上皮細胞の運動促進活性 [G h e r a r d i , E . , e t . a 1. ： N a t u r e, 3 4
6 , 2 2 8 ( 1 9 9 0 ) ] 及び腫瘍細胞障害活性 [H i g a s h i o, K . e t . a 1. ： B i o c h em. B i o p h y s . R e s . C ommu n. , 1 7 0, 3 9
7 - 4 0 4 ( 1 9 9 0 ) ] などの生理作用が報告されて いるが、 これまで骨髄造血幹細胞に対する作用は知られ ていなかつた。
さらに、 肝細胞増殖因子類の一つであって、 肝臓由来 の代表的肝細胞増殖因子は、 すでに遺伝子クローニング が行なわれその全塩基配列が決定されている [N a k a m u r a e t . a 1. N a t u r e, 3 4 2, 4 4 0 - 4 4 3 ( 1 9 8 9.) ] ので、 それを本発明において造 血幹細胞増加剤として使用することもできょう。 また、 本発明において造血幹細胞増加剤として使用する肝細胞 増殖因子類に属する因子は、 ヒ ト正常線維芽細胞等の細 胞培養によっても生産することができる。 さらには、 ヒ ト正常線維芽細胞等から遺伝子を取り出し、 そう して得 られた遺伝子に遺伝子組換え技術を応用して組換え体の 培養により生産することもできる。
本発明に従えば、 このように遺伝子組換え技術によつ ても新規な因子を得ることができる。 この新規な因子は 配列表の配列番号 2に示したア ミ ノ酸配列を有するこ と を特徵としている。 この新規な因子は、 下記で具体的に 説明するようにクローニングされた c D N Aを用いて得 ることができる。 上記因子は、 例えばヒ ト正常線維芽細胞の培養で得ら れた培養液を原料にして、 数種のクロマトグラフィーを 組み合わせて精製を行なう ことにより純品を得ることが できる。
ヒ ト正常線維芽細胞等の細胞増殖あるいは培養は、 通 常の各種の細胞培養用培地を用いて行うことができ、 そ のようなものとしては、 例えば炭素源、 窒素源、 ビタ ミ ン、 アミ ノ酸、 核酸塩基、 無機塩などを含有し、 適宜肉 汁、 ペプトン、 カザミノ酸、 酵母エキス、 魚肉エキス、 バレイショ、 麦芽汁、 牛乳、 血液、 血清、 ホルモン、 抗 生物質、 細胞増殖因子などから選ばれたものを加えたも のがあげられるが、 好適な培地は一般に広く市販されて いるものを使用してそれをそのままあるいは適当に改変 して用いることができる。
そのような培地としては R P M I— 1 6 4 0培地、 M E M培地、 B M E培地、 ダルベッコイーグル培地、 D M
E M培地、 マッコイ 5 A培地、 イスコフ培地、 ハム F 1 2培地等が挙げられる。
上記ヒ ト正常線維芽細胞等の細胞の増殖又は培養にあ たっては、 該ヒ ト正常線維芽細胞の生育に適した pH、 温 度、 通気、 攪拌、 培地交換の頻度等の条件は、 実験等に より適宜決定することができる。 ヒ ト正常線維芽細胞を培養する場合、 必要に応じて細 胞付着因子、 例えばコラーゲン、 フイブロネクチン、 ゼ ラチン、 ポリ 一 L一 リ ジン、 ポリ 一 D— リ ジン等を加え たり、 マイクロキャ リアビーズ、 例えばデキス トラン、 ポリアク リルア ミ ド、 ポリスチレン、 ゼラチン、 ガラス 等を用いることができる。
上記増殖又は培養することにより得られたヒ ト正常線 維芽細胞は次に必要に応じて誘導処理、 例えば通常のポ リ I Z C等の誘導剤で処理して造血幹細胞増加活性を有 し、 肝細胞増殖因子類に属する新規タンパク質を誘導す ることができ、 こう して得られた本発明のタ ンパク質は 、 通常の操作により分離採取することができる。
この分離採取法としては、 例えば細胞の超音波破砕、 機械的破砕、 凍結及び融解による方法、 浸透圧ショ ッ ク 等による方法のほか、 培養上清から、 例えばタンパク質 沈澱剤を用いて沈澱処理する等して分離する方法などが あげられる。
上記の分離方法に加えて、 更に目的とするタンパク質 は、 その物理学的性質や化学的性質を利用して、 一般に 広く採用されている各種分離精製方法を適用して精製を することができる。
このような分離精製方法としては、 ホモジュナイザー 、 超音波細胞破砕等による可溶化処理、 各種塩類を含ん だ緩衝液による抽出処理、 酸またはアルカ リ による可溶 化あるいは沈澱処理、 さらには有機溶媒による抽出ある いは沈澱処理、 硫安等の蛋白沈澱剤を用 る沈澱処理等 による塩析、 透析、 メンブレンフィ ル夕一などを用いた 限外濾過処理、 吸着クロマ トグラフィー、 ゲル濾過クロ マトグラフィ一などを用いたゲル濾過処理、 、 イオン交 換クロマ トグラフィー、.逆相クロマ トグラフィー、 ァフ ィニティ クロマトグラフィー、 向流分配クロマトグラフ ィー、 高速液体クロマ トグラフィー、 等電点あるいはゲ ル電気泳動などがあげられ、 それらは単独あるいは適宜 組み合わせて用いられる。
ヒ ト正常線維芽細胞由来のものの場合、 ブル一色素を 結合させた担体 （ブルー担体） 、 亜鉛をキレー ト結合さ せた担体 （亜鉛キレー ト担体） 、 へパリ ンを結合させた 担体 （へパリ ン担体） 、 抗体を結合させた担体等を用い るァフィ二テイ クロマ トグラフィ一が有利に使用できる
。 特に、 亜鉛キレート担体、 ブルー担体、 へパリ ン担体 が好ましく用いることが出来る。 さらに好ましく は、 亜 鉛キレー ト担体とへパリ ン担体を組合わせて使用する方 法であり、 両担体の使用順序は特に限定されないが、 へ パリ ン担体を使用した後に、 亜鉛キレー ト担体を用いる のが特に好ましい。
本発明で使用する亜鉛キレー ト担体としては、 ァガロ ース、 セルロース、 ポリアク リルアミ ドゲルなどに、 ビ スカルボキシメチルイ ミ ノ基 〔N ( C H 2 C O O H ) 2 〕 などのキレー ト能を有する交換基が結合した担体を、 塩化亜鉛などの亜鉛塩の溶液で処理した担体が挙げられ る。 好ましくは、 「キレーティ ングセファロース j ' ( ρ h a r m a c i a社製） などの不溶性多糖類系担体に亜 鉛をキレー トさせた担体が用いられる。
亜鉛キレー ト担体による肝細胞増殖因子類の精製操作 は次のように行う。 すなはち、 まず肝細胞増殖因子類を 含む溶液を亜鉛キレー 卜担体に接触吸着させる。 吸着は 、 ノくツチ法、 カラム法どちらでも可能であるが、 カラム 法のほうが吸着効率が高い。
溶離は、 リ ン酸、 酢酸、 クェン酸などの酸性緩衝液で 行い、 ρ Η 5以下が好ま しい。 しかし、 高イオン強度下 では、 さらに高い ρ Ηでの溶離が可能となる。 また、 ィ ミ ダゾール、 ヒスタ ミ ン、 グリ シンあるいは塩化アン乇 二ゥムの濃度を高めながらの勾配溶出も好結果が得られ る。 £ 0丁八ゃ£ 0下 のょぅなキレー ト剤を用ぃてゲ ルから金属イオンを剥ぎ取ってしまう方法を用いてもよ い。
イオン強度は、 リ ン酸、 酢酸、 クェン酸などの緩衝液 の濃度を上げたり、 塩化ナ ト リ ウム、 塩化カ リ ウムのよ うな中性塩の添加 （ 0 . 2 〜 1 . 0 Μ ) により増加させ ることができる。
溶出剤の組成、 液量は特に限定されるものではなく、 最適な溶離条件は存在する夾雑タンパク質、 および肝細 胞増殖因子類の量、 カラムの寸法などに応じて適宜決定 される。
本発明で使用するへパリ ン担体としては、 骨格担体と してセルロース、 ァガロースなどを材料とする多糖類系 および合成高分子系などの不溶性担体にへパリ ンを結合 させたものならばいずれでもよい。 「へパリ ン . セファ ロース C L— 6 B J ( P h a r m a c i a社製） 、 「へ ノヽ'リ ン トヨパール」 （東ソ一社製） や 「へノ、。リ ンセル口 ファイン」 （チッソ社製） が挙げられる。
肝細胞増殖因子類を含む溶液をへパリ ン担体に接触さ せる場合、 p Hを 5〜 1 0に調節することが望ましい。 特に好ましく は、 へパリ ンに対する親和性を充分に確保 できる p H 5 . 5〜 8 . 0の範囲でイオン強度 0 . 3以 下がよい。 このようにへパリ ン担体に吸着させた肝細胞 増殖因子類は、 イオン強度を高くするこ とで回収するこ とができる。 例えば、 リ ン酸ナトリゥム緩衝液などの緩 衝液に塩化ナトリウム、 硫酸アンモニゥムなどの無機塩 を添加した液により回収することができる。 回収方法は 、 塩濃度をグラジェン ト式に増加させる方法でも、 段階 的に増加させるステップワイズ式でもよい。 具体的に用 いられるイオン強度は 0 . 3〜 3で、 好ましくは 0 . 5 ~ 2である。
上記のようにして精製分離して得られた造血幹細胞増 加活性を有し、 肝細胞増殖因子類に属する天然型のタン パク質は、 塩酸等の酸、 ペプシン、 キモ ト リブシン、 力 ルポキシぺプチダーゼ等のタンパク質分解酵素等で加水 分解した後、 得られたペプチ ド断片をイオン交換クロマ トグラフィ一等のクロマ トグラフィ一にかけて、 その了 ミ ノ酸組成を分析すると共にそのァミ ノ酸配列を決定す ることができる。
本発明の天然型の造血幹細胞増加活性を有し、 肝細胞 増殖因子類に属する夕ンパク質のアミ ノ酸組成の分析法 をより詳しく説明すると、 まず精製された該造血幹細胞 増加活性を有し、 肝細胞増殖因子類に属するタンパク質 を塩酸で加水分解した後、 フエ二ルイ ツチオシァネー ト (P I TC) を反応させてア ミ ノ酸をそれぞれ対応する フエ二ルチオ力ルバミル誘導体に変換し、 それを逆相高 速液体ク口マ トグラフィ 一にかけて定量する方法 （P I TC法） があげられる。
こう して分析せしめられたア ミ ノ酸配列は、 天然型の 造血幹細胞増加活性を有し、 肝細胞増殖因子類に属する 夕ンパク質を遺伝子組換え技術を利用して製造するに当 たり、 それを利用することが出来る。 つぎに、 代表的な遺伝子組換え技術を応用しての、 本 発明において造血幹細胞増加剤として使用する肝細胞増 殖因子類に属する因子の取得法を記載する。
ヒ ト正常線維芽細胞より RN Aを得る方法としては、 通常の方法、 例えば、 ポリ ゾームの分離、 ショ糖密度勾 配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられる。 上 記ヒ ト正常線維芽細胞より RNAを抽出する法としては 、 グァニジン ' チオシァネー ト処理後 C s C 1密度勾配 遠心を行うグァニジン · チオシァネ一 トー塩化セシウム 法 （C h i r gw i n, e t a 1. ， B i o c h e m i s t r y, 1 8 , 5 2 9 4 ( 1 9 7 9 ) ) 、 ノ《ナジゥ ム複合体を用いてリボヌ ク レア一ゼイ ンヒビター存在下 に界面活性剤で処理したのちフェノール処理を行う方法 B e r g e r , e t a 1. ， B i o c h e m i s t r y, 1 8 , 5 1 4 3 ( 1 9 7 9 ) ) 、 グァニジン ' チ オシァネ一トーホッ ト · フエノール法、 グ了ニジン · チ オシァネ一 トーグァニジン塩酸法、 グァニジン · チオシ ァネー ト一フエノール ' クロ口ホルム法、 グァニジン · チオシァネ一トで処理した後塩化リチウムで処理して R
N Aを沈澱させる方法などの中から適当な方法を選んで 行うことができる。
ヒ ト正常線維芽細胞より通常の方法、 例えば、 塩化リ チウム Z尿素法、 グァニジン · イソチオシァネー ト法、 オリゴ d Tセルロースカラム法等により m R N Aを単離 し、 得られた mRNAから通常の方法、 例えば、 G u b 1 e r らの方法 [G e e n. 2 5 , 2 3 6 - 2 6 9 ( 1 9 8 3 ) ] . H. O k a y am a らの方法 [M o 1 . C e l l . B i o l . ， 2， 1 6 1 , ( 1 9 8 2 ) & 3 , 2 8 0 , ( 1 9 8 3 ) ] 等により c DN Aを合成す る。 得られた mRNAから c DNAを合成するには、 基 本的にはトリ骨芽球ウィルス （AMV) などの逆転写酵 素などを用いるほか一部プライマーを用いて DN Aポリ メラーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、 市販 の合成あるいはクロ一ニング用キッ トを用いるのが便利 である。
この c DN Aを通常の方法、 例えば、 S e e dの方法 [N a t u r e . 3 2 9 , 8 4 0 - 8 4 2 ( 1 9 8 7 ) ] に準じ、 発現べクタ一あるいはプラスミ ド、 ファージ などに組み込み、 この組換え DNAを用い、 大腸菌など を用いて c DNAライブラ リ一を作製する。 上記 c D N Aをベクターに揷入するにあたっては、 同 一制限酵素を用いて生ずるところの接着末端を利用する か、 必要に応じて合成のリ ンカ一部あるいはアダプタ一 部を付加したり、 ホモポリマーを加えたりする等の通常 の方法を用いて行う ことができる。
常法 （Mo l e c u l a r C l o n i n g. C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y . N e w Y o r k. 1 9 8 2) に従ってこれら操作 は行う ことができる。 c DN Aを組み込むためのベクタ 一あるいはプラスミ ドとしては C DM 8、 p c D L - S
R « 2 9 6、 p B R 3 2 2. p UC 1 8、 p UC 1 9、 pUB 1 1 0などが挙げられるが、 これらに限定される ことなく通常の c DNAを組み込むためのベクターある いはプラスミ ドが用いられる。 大腸菌などを用いて c D N Aライブラ リ一を作製するためのべク夕一あるいはプ ラスミ ドが好ま しい。 c DN Aを組み込むためのベクタ 一がファージの場合は、 λ g t 1 0、 λ g t 1 1などが 挙げられるが、 これらに限定されることなく通常の c D N Aを組み込むためのファージが用いられる。
こう して得られた組換えべクタ一を宿主に導入するに は、 通常使用せられる各種の方法が使用できる。
このような方法として、 ベクタ一がプラスミ ドの場合 は、 例えば H a n a h a n e t a 1. J . M o 1. B i o l . 1 6 6, 5 5 7 ( 1 9 8 3) に従った C a C 12 又は R b C 1を共存させて調製されたコンピテン ト 細胞に、 これらべクタ一を取り込ませる方法がある。 ま たベクターがファージの場合インビトロパッケージング 法などを用いて適当な増殖期にある宿主に、 組換えファ 一ジベクターを感染させる方法等があげられる。
こう して得られた c D-NAライブラ リ一を保持する宿 主細胞としては、 具体的には大腸菌 MC 1 0 6 1 /P 3
、 NM5 1 4、 NM5 2 2、 JM 1 0 1 C 6 0 0など が挙げられるが、 これらに限定されることなく通常の c DNAライブラ リ一を保持する宿主細胞が用いられる。 次に、 肝細胞増殖因子類に属するヒ ト肝細胞増殖因子 の一つの N末端及び C末端の塩基配列 [Na k amu r a e ΐ . a 1. Na t u r e, 3 4 2, 4 4 0 - 4 4 3 ( I 9 8 9 ) ] をもとに、 プローブ用オリゴヌクレオ チドを合成し、 このオリゴヌク レオチドを P 32で標識し たプローブを用いて、 コロニーハイブリダイゼ一シヨ ン 法、 プラークハイブリダィゼ一シヨ ン法、 ハイブリダィ ゼーシヨ ン ' トラ ンスレーショ ンアツセィ法、 プラス ' マイナス法などによって目的の c D N Aを得ることがで きる。
より詳しくは、 組換え体のプラークの DNAを、 ナイ ロンメンブレン等のフィルター上に固定し、 次にこれを 標識したプローブと反応させ、 このプローブと選択的に 結合する DN A配列を有する組換え体を選択する。
上記ここで使用されるプローブとしては、 目的の DN A配列に対して相捕的な配列を有する核酸配列のことを 指し、 DNAでも RNAでもよく、 また化学合成したも のでも天然のものでも、 あるいは組換え Aの手法で 得られたものでもよいが、 公知の方法を適用して化学的 に合成された D N A配列を用いるのが一般的であり好ま しい。
こ こでオリゴヌク レオチ ド合成法としては、 例えばリ ン酸ト リエステル法 （T e t r a h e d r o n, 3 4 , 3 1 4 3 ( 1 9 7 8 ) , A d v. C a r b o h y d r . C h em. B i o c h em. 3 6 , 1 3 5 ( 1 9 7 9 ) , u c l e i c A c i d s R e s . , 1 0 , 2 5 9 7, 6 5 5 3 ( 1 9 8 2) ) 、 ホスホア ミ ダイ ト法 （ N a t u r e, 3 1 0 , 1 0 5 ( 1 9 8 4 ) ) 等の常法 に従って、 核酸の化学合成を行う方法、 これらの方法を 組合せた方法等があげられる。
次に別の方法として、 上記肝細胞増殖因子類に属する ヒ ト肝細胞増殖因子の一つの N末端及び C末端の塩基配 列 [N a k a mu r a e t . a 1. N a t u r , 3 4 2, 4 4 0 - 4 4 3 ( 1 9 8 9 ) ] をもとに、 2種類の プライマ一を DNAシンセサイザ一にて合成し、 各プラ イマ一を c DNAとともに T a q DNAポリ メラーゼ等 の D N Aポリ メラーゼ存在下、 DNAの変性、 次いでプ ライマーのアニー リ ングをなし、 プライマーの伸長反応 を、 例えば P e r k i n— E l m e r C e t u s 社 の DNAサーマルサイクラ—を用い行なう こ とができる 。 これを電気泳動し、 目的肝細胞増殖因子 （HG F) 類 に属するヒ ト肝細胞増殖因子 c DNAを常法 （M o 1 e c υ 1 a r C l o n i n g. C o l d S p r i n g.
H a r b o r L a b o r a t o r y. N e w Y o r k. 1 9 8 2 ) に従って調製する。
またヒ ト線維芽細胞等の細胞培養によって得られた肝 細胞増殖因子類に属するヒ ト肝細胞増殖因子の一つの N 末端塩基配列にある 1 6個のアミ ノ酸配列に基づいて同 様にプライマーを DNAシンセサイザ一にて合成し、 各 プライマーをプラスミ ド DNAとともに T a qDNAポ リ メラーゼ等の DNAポリ メラーゼ存在下、 DNAの変 性、 次いでプライマーのアニー リ ングをなし、 プライマ 一の伸長反応を、 例えば P e r k i n— E 1 m e r C e t u s 社の DNAサーマルサイクラ一を用い行なう こともできる。 これを電気泳動し、 目的肝細胞増殖因子 (HGF) 類に属するヒ ト肝細胞増殖因子 c DNAを上 記したような常法に従って調製する。 なお、 このように 異なる遺伝子源やプライマー源、 さらにはプローブ源を 用いるとそれにしたがって様々な異なる塩基配列をもつ 肝細胞増殖因子類に属するヒ ト肝細胞増殖因子 c DNA を得ることが認められる。
こう して得られた組換え DN Aは通常の方法に従って 制限酵素等で処理され、 その c DNA塩基配列が決定さ れる。 c DNA塩基配列を決定するために用いられる方 法としては、 例えばマクサム · ギルバー ト法、 サンガー のダイデォキシ法、 例えばダイデォキシヌク レオチ ド · チェインタ一ミネ一シヨ ン法 （S a n g e r, S c i e n c e , 2 1 4, 1 2 0 5 ( 1 9 8 1 ) , Me t h o d s i n En z ymo 1 o gy, 6 5, 5 6 0〜 5 8 0 ( 1 9 8 0) , Me s s i n g, J. e t a 1. υ c 1 e i c A c i d s R e s . , 9， 3 0 9 ( 1
9 8 1 ) などがあげられる。 さらに、 上記した単離 m R N Aと配列決定された c D N Aの一部を用いてプライマ —イクステンショ ン法を行い c DNAを合成し、 上記の ように組換え DNAして得ることも可能である。
これらの方法は適宜それを組み合わせて行う ことがで きる。
ところで、 遺伝子組換え技術によれば、 DNA鎖の切 断、 削除、 付加及び結合、 更には DN A鎖中の塩基の置 換は、 通常の手法にしたがって行う ことができるので、 本発明の DN Aは、 特に配列表の配列番号 2に示された 塩基配列を有する DNAに関するのみでなく、 本発明の 目的を逸脱しない範囲で上記したような改変 · 修飾を加 えたものにも関する。
このような改変 · 修飾手法の代表的なものとしては、 ォリゴヌ ク レオチ ド指定変異法 （ o 1 i g o n u c 1 e o t i d e d i r e c t e d mu t a g e n e s i s ) として知られた方法、 例えば M. Sm i t h 及 び S. G i 1 1 a m 「 G e n e t i c E n g i n e e r i n g (J. K . S e t l ow 及び
A. H o l l a e n d e r e d s . ) ， V o l ,
3 , p. 1 ( 1 9 8 1 ) 、 Me t h o d s i n E n'z ym o 1 o g y, V o l . 1 5 3 - 1 5 5 ( 1 9 8 7年） ， A c a d e m i c P r e s s , C A に記載のものあるいはそのうちに引用された文献に 記載のものなどがあげられる。 配列表の配列番号 2に示された塩基配列を有する遺伝 子の改変 ·修飾として特に好ましいのは、 目的とする夕 ンパク質の安定性、 生物学的活性を高めるようなものが 挙げられる。 - さらにまた、 配列表の配列番号 2に示されたァミ ノ酸 配列を有するペプチドの有する活性のうち、 未分化の多 能性造血幹細胞の増殖活性を高めるような改変 ·修飾が あげられる。
こう してクローン化された造血幹細胞増加活性を有し 、 肝細胞増殖因子類に属するタンパク質あるいはその同 効物のアミ ノ酸配列の全部あるいは一部をコー ドする塩 基配列を含む c D N Aはその発現に適したべクターに組 み換えられてそのコー ド塩基配列をもつ c D N Aを発現 可能に組み込んでなる組換え発現ベクターとされる。 特に、 本発明の配列表の配列番号 2のアミ ノ酸配列の タンパク質あるいはその同効物の配列の全部あるいは一 部をコードする塩基配列を含む c D N Aは、 適当な発現 用べク夕一に組換えられ、 次に適当な発現用宿主にその 組換えベクターを導入して形質転換し、 得られた組換え 体を培養し、 適当に発現誘導することにより、 目的の造 血幹細胞増加活性を有するタンパク質を取得することが でき有用である。
本発明の造血幹細胞増加活性を有し、 肝細胞増殖因子 類に属するタンパク質あるいはその同効物のアミ ノ酸配 列の全部あるいは一部をコー ド.する塩基配列を含む c D
N Aを用いて目的の夕ンパク質を宿主中で産生させるに あたっては、 成熟タンパク質として、 即ちシグナルぺプ チ ドを取り去った形で生産させるこ ともできるし、 上記 シグナルペプチ ドをそのまま利用したりあるいは適当な 宿主細胞等に適合したシグナルべプチ ドを付加して宿主 細胞等から分泌産生させるこ ともできる。
さらにまた本発明の造血幹細胞増加活性を有し、 肝細 胞増殖因子類に属するタンパク質あるいはその同効物は 他の組換え夕ンパク質あるいはペプチ ド等との融合タン パク質あるいはペプチ ドとして産生させて、 単離しある いは単離せずに酵素あるいは化学的に消化処理して目的 のものとすることもできる。
本発明の造血幹細胞増加活性を有し、 肝細胞増殖因子 類に属するタンパク質あるいはその同効物を効率よく発 現させるために、 プロモーター、 リボソーム結合部位 （ 例えば S D配列） 、 翻訳開始部位ゃコ ドンの制御下にあ る下流域に、 そのコー ド塩基配列を含む c D N Aを配置 し、 次いで終止部位ゃコ ドン、 夕一 ミ ネ一夕一を配置す るようにすることができる。 つまりこのような場合にお いて、 それに用いる遺伝子の D N A配列中には、 開始コ ドン及び終止コ ドンが必要で、 必要に応じてそれらは公 知の方法を用いて付与される。
またここで利用される発現用ベクターとしては、 宿主 中で自律複製できるものであれば特に制限なく使用でき るが、 そのべクタ一中に複製起源、 選択マーカー、 プロ モーター、 R N Aスプライス部位、 ポリアデニル化シグ ナルなどを有するものが好ま しく使用できる。 組換え発現べクタ一の選択マーカーとしては、 各種抗 生物質耐性遺伝子、 例えばアンピシリ ン耐性遺伝子、 テ トラサイク リ ン耐性遣伝子、 ネオマイシン耐性遺伝子等 が挙げられる。
またこれらベクターとしては、 各種バクテリア由来の もの、 バクテリオファージ由来のもの、 昆虫や哺乳動物 細胞をふくむ動物ウィルス由来のものがあげられ、 各種 ウィルスベクター、 各種ブラスミ ドベクタ一、 コスミ ド ベクタ一、 シャ トルベクタ一等があげられる。
またこれらべクタ一としては、 大腸菌、 特に EK型プ ラスミ ドベクター、 A g tタイプファージベクタ一、 綠 膿菌由来のベクター、 枯草菌由来のベクター、 酵母由来 のべクタ一、 SV4 0由来のベクター、 B PV由来のベ クタ一、 レ トロウイルス由来のベクター等があげられる 。 具体的には、 p BR 3 22、 pUC l 8、 p U B 1
1 0、 pRB 1 5、 λ g t 1 0. λ g t 1 K S V 4 0 、 B P V等が挙げられる。
上記ベクターで利用できるプロモータ一としては、 宿 主中で発現できるように働く ものであれば特に制限はな レ、。 大腸菌での発現用プロモータ一としては、 ト リブト ファン （t r p) プロモーター、 ラク トース （ 1 a c) プロモータ一、 トリブトファ ン · ラク ト一ス （ t a c) プロモーター、 T 7プロモーター、 ノ クテリオファージ 由来のラムダ （λ) PLプロモータ一等の各種の当業者 に良く ^られたものが挙げられる。
酵母用のベクターにおいて用いられており、 制御配列 として代表的なものと しては、 解糖系酵素の合成に関す るプロモー夕一、 例えばグリ セ リ ン酸一3——リ ン酸キナ ーゼに関するプロモーター、 グリセルアルデヒ ド—— 3—— リ ン酸デヒ ドロゲナーゼに関するプロモーター、 へキソ キナーゼ、 ピルビン酸デカルボキシラーゼ、 フルク トー スリ ン酸キナーゼ、 グルコース一6—リ ン酸イ ソ メラー ゼ、 3—ホスホリ ン酸イ ソメ ラ一ゼ、 ホスホグルコース イ ソメラ一ゼおよびグルコースキナーゼに関するプロモ 一夕一等のほか、 アルコールデヒ ドロゲナ一ゼ、 チ ト ク ローム C、 酸ホスフ ァターゼ等に関するプロモーター力 挙げられる。
また S V 4 0の初期遺伝子あるいは後期遺伝子プロ乇 一夕一、 サイ トメガロウィルス、 ポリ オ一マウィルス、 アデノ ウイルス、 牛パヒロ一マウィルスあるレ、は ト リ 肉 腫ウィルス由来のプロモーター、 モロネイネズミ 肉腫ゥ ィルスの L T R、 ラウス肉腫ウィルスの L T R、 マウス 乳癌ウィルスの L T R、 メ タ口チォネイ ンに関するプロ モータ一、 免疫グロブリ ンに関するプロモーター、 ヒー トショ ッ クに関するプロモーター、 デヒ ドロ葉酸に関す るプロモータ—、 ァクチンに関するプロモーター、 エロ ンゲ一ショ ンフ ァ クタ一に関するプロモーターなどの哺 乳動物細胞に適合できるものが挙げられる。
昆虫細胞などにあっては、 核多角体病ウィルス由来の ポリ ヒ ドリ ンに関するプロモーターが挙げられる。
これらの遺伝子制御配列は、 適宜それらを組み合わせ たり、 あるいは化学的に修飾したり して適当なベクタ一 2 & に組み込んで、 本発明の造血幹細胞増加活性を有し、 肝 細胞増殖因子類に属するタンパク質あるいはその同効物 のァミノ酸配列の全部あるいは一部をコ一 ドする塩基配 列を含む c D N A発現用-のベクターを構築することがで さ 。
例えば、 翻訳開始コ ドン A T G及び終止コ ドン T A A 、 T G A、 あるいは T A Gを本発明の c D N Aの遺伝子 制御配列として含んでいてよく、 それらは一つ以上組み 合わせたり、 他のコ ドンと組み合わせて配列されていて よい。
本発明の c D N A発現用のベクターには、 さらに複数 個の本発明の c D N Aを組み込んでその発現を行う こと もできる。
本発明の造血幹細胞増加活性を有し、 肝細胞増殖因子 類に属する夕ンパク質あるいはその同効物のァミ ノ酸配 列の全部あるいは一部をコ一 ドする塩基配列を含む c D N A発現ベクターは、 これを適当な宿主、 特に宿主細胞 に通常知られた方法に従って導入して、 その宿主細胞を 形質転換させ、 次にそのようにして形質転換された宿主 細胞を培養等の方法により増殖させること等により、 大 量に形質転換体と呼ばれる該造血幹細胞増加活性を有し 、 肝細胞増殖因子類に属するタンパク質あるいはその同 効物のァミノ酸配列の全部あるいは一部を有するぺプチ ド産生能を有する細胞を得ることができる。
ここで使用される宿主、 特に宿主細胞としては、 大腸 菌あるいは大腸菌以外のシユ ー ドモナス菌等のグラム陰 性細菌、 枯草菌、 放線菌、 等のグラム陽性細菌、 酵母、 動細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等の真核細胞のいずれでも よいが、 大腸菌、 哺乳動物細胞、 例えば C O S細胞、 C H〇細胞が好適に使用できる。
上記宿主への本発明の遺伝子発現べクターの導入法と しては、 通常遺伝子組換え技術の分野で使用せられてい る方法を用いることができ、 例えばコンビテン ト細胞と 上記ベクターとを混合したり、 細胞をプロ トプラス ト化 したのち、 上記ベクターを担体に結合させて取り込ませ るか、 あるいはリ ン酸カルシウム共沈法、 D E A Eデキ ス トラン法、 電気パルス法、 インビトロパッケージング 法、 ウィルスベクタ一法、 マイ クロインジェクショ ン法 等を用いて行う ことができる。
このようにして得られた形質転換体は、 その外来遺伝 子の発現を抑制した状態で増殖したのち、 該遺伝子の発 現を誘導することもできる。
この形質転換体の増殖あるいは培養は、 前述したヒ ト 正常線維芽細胞の場合と同様に通常の各種の細胞培養用 培地を用いて行う ことがでる。 またその他の生育条件、 培養システム、 更にはタンパク質の分離精製方法もヒ ト 正常線維芽細胞の場合と同様である。 本発明の造血幹 細胞増加剤は、 未分化の多能性造血幹細胞に対する増镟 活性を示し、 骨髄抑制 （例えば抗癌剤使用後や骨髄移植 等） に対する治療に有効な造血幹細胞増加剤として、 骨 髄機能不全 （例えば再生不良性貧血や骨髄異形成症候群 等） に対する治療に有効な造血幹細胞増加剤として、 ま たは末梢血幹細胞および骨髄幹細胞の i n v i t r o における増殖に有効な造血幹細胞増加剤として有用であ る o
さらに本発明の造血幹細胞増加剤は、 結果的には種々 の血液細胞ばかりでなく造血幹細胞の子孫である破骨細 胞の増殖も促進するため、 骨粗鬆症等の治療剤としての 適用も可能である。
本発明では特に、 肝細胞増殖因子類の一つであって、 配列表の配列番号 2に示したァミ ノ酸配列を有する夕ン パク質あるいはその同効物である組換えヒ ト肝細胞増殖 因子夕ンパク質が造血幹細胞増加剤として好ましく用い られ、 未分化の多能性造血幹細胞に対する増殖活性を示 し、 骨髄抑制 （例えば抗瘙剤使用後や骨髄移植等） に対 する治療に有効な造血幹細胞増加剤として、 骨髄機能不 全 （例えば再生不良性貧血や骨髄異形成症候群等） に対 する治療に有効な造血幹細胞増加剤として、 または末梢 血幹細胞および骨髄幹細胞の i n v i t r oにおける 増殖に有効な造血幹細胞増加剤として有用である。
それはヒ ト正常線維芽細胞由来であって、 より正常型で あって好ましいと考えられる。
また、 ヒ ト正常線維芽細胞から得られる天然型ものも 造血幹細胞増加剤として好ましいと考えられ、 上記用途 に有用である。
- 本発明の造血幹細胞増加剤を前記の本発明の用途に用 いる場合、 そのままもしく は自体公知の薬理学的に許容 される担体、 賦形剤等と混合した医薬組减物として、 経 口的または非経口的に投与することができる。
本発明の造血幹細胞増加剤中の活性成分を安定に'保つ ために、 アルギニン、 リ ジン、 グリ シン、 ロイ シン、 フ ェニルァラニン、 ァスパラギン酸等のア ミ ノ酸、 ダルコ —ス、 ショ糖、 マンニ トール、 マンニッ ト等の糖あるい は糖アルコール、 ゼラチン、 コラーゲン、 デキス トラ ン 、 プルラ ン、 へノ、0リ ン、 コン ドロイチン硫酸、 セル口一 ス等の多糖あるいはタンパク質加水分解物、 塩酸等の無 機酸あるいは酢酸等の有機酸、 水酸化ナト リ ウム等の無 機塩基あるいはァ ミ ン等の有機塩基等を必要に応じて加 えることが出来る。
経口投与のための剤形としては、 具体的には錠剤、 丸 剤、 散剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 シロップ剤、 乳剤、 懸 濁剤などが挙げられる。 かかる剤形は自体公知の方法に よって製造され、 製剤分野において通常用いられる担体 も しく は賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用 の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 澱粉、 ショ糖、 ステア リ ン酸マグネシゥムなどが挙げられる。
非経口投与のための剤形としては、 例えば、 軟膏剤、 注射剤、 湿布剤、 塗布剤、 吸入剤、 坐剤、 経皮吸入剤な どが挙げられる。 注射剤は自体公知の方法、 例えば、 本発明の肝細胞増殖因子を通常注射剤に用いられる無菌 の水性もしく は油性液に溶解、 懸濁または乳化すること によって調製される。 注射用の水溶液としては生理食塩 水、 ブドウ糖溶液が挙げられ、 油性液としてはゴマ油、 大豆油などが挙げられ、 それぞれ溶解補助剤を併用して も良い。 腸内投与に用いられる坐剤は自体公知の方法、 例えば本発明の造血幹細胞増加剤を通常の坐薬用基剤に 混合し、 成型することによって調製される。
本発明の造血幹細胞増加剤の有効投与量および投与回 数は、 投与形態、 患者の年齢、 体重、 治療すべき症状の 性質もしく は重篤度によっても異なるが、 通常成人一人 当たり 0 . 0 1 〜 1 0 0 fflgを、 好ましくは 0 . 1 〜 1 0 mgを一面または数回に分けて投与することができる。
本発明の新規な造血幹細胞増加活性を有し、 肝細胞増 殖因子類に属するタンパク質あるいはその同効物は、 そ れを単独であるいは担体、 例えば、 ゥシ血清アルブミ ン 、 卵アルブミ ン、 チォグロブリ ンあるいはへモシァニン
( K L H ) 等に結合、 例えば、 カルポジイ ミ ド、 グルタ —ルアルデヒ ド、 混合酸無水物、 ホモ二官能性あるいは ヘテロ二官能性試薬 （例えば、 マレイ ミ ドベンジルー N ーヒ ドロキシスクシンイ ミ ドエステル （M B S ) などに より結合せしめて注射投与し動物を免疫し、 こう して抗 体を得ることが出来る。 またこの様に免役した動物、 例 えばマウスから得た脾臓細胞と、 ミエローマ細胞とを通 常の方法で細胞融合せしめて、 モノ クロナール抗体を産 生するハイプリ ドーマ細胞を得ることもできる。
こう して得られた抗体は、 それを固相に結合せしめた り、 標識剤、 例えば酵素、 補酵素、 蛍光、 染料などの発 色団、 放射性標識、 常磁性金属と結合せしめて測定用試 薬とすることが出来る。 標準的免疫測定法の例は、 酵素 免疫測定法 （E L I S A：) 、 ラジオィムノアッセィ （R I A) 、 サン ドィ ツチ免疫測定法などが挙げられる。 これらは、 D. C a t t y 「A n t i b o d i e s — V o l . I , & V o l . I I， a p r a c t i c a 1 a p p r o a c hJ l R L P r e s sに従って行 う ことが出来る。 実施例
以下、 本発明の実施例を示すが本発明はこれらに限定 されるものではない。 実施例 1
正常線維芽細胞由来ヒ ト肝細胞増殖因子の調製 ： 3 0 L培養槽を用い、 ヒ ト正常線維芽細胞、 D I P 2 (K o b a y a s h i , S . e t a 1. i n Th e c l i n i c a l o t e n t i a l o f i n t e r f e r o n s , e d . K o n o, R . a n d V i l c e k, J. , U n i v e r s i t y o f T o k y o P r e s s , T o k y o 1 9 8 2 ) を 1 0 % F B S— MEM培地一 0. 3 %ビーズ （C y t o d e x 一 1 ： フアルマシァ社製） で、 3 7 °C、 5 日間、 攪拌培 養を行った。 増殖がコ ンフルェン トに到達した後、 ME M培地に切り替え、 ポリ I 1 0 g/m 1 を添加し 、 インダクショ ンをかけ、 タンパク質産生を誘導した。 3 7で、 4 日間培養を継続し、 2 0 Lの培養液を回収し た。
これを 2 0 mMト リス塩酸緩衝液 （ p H 8. 0 ) で平 衡化した "ブルー ' セファロース力ラム" （担体 1 L ： フアルマシア社製） に吸着させ、 次いで平衡化に使用し た緩衝液で洗浄した。 その後、 0Mから 3 Mへの Na C 1の直線濃度勾配で夕ンパク質を溶出させた。
得られた活性面分 1 Lをゲル濾過で脱塩し、 2 0mM トリス塩酸緩衝液 （P H 8. 0 ) で平衡化したへパリ ン ■ セファロ一スカラム （担体 1 0 O m l : フアルマシア 社製） に吸着させ、 平衡化の緩衝液で洗浄した。 次ぎに 、 0 Mから 3 Mへの N a C 1の直線濃度勾配でタンパク 質を溶出させた。
得られた活性画分 5 0 m lをゲル濾過で脱塩後、 逆相 高速液体クロマ トグラフィ一で精製した。 "Vy d a c 2 1 8 TP 5 1 0カラム" （ 1. 0 x 2 5 cm :セパレ —シヨングループ社製） を用い、 0. 1 %トリ フルォロ 酢酸水溶液をベースにァセ トニト リル濃度を 0から 5 0 %に直線的に増加させて溶出させた。 結果を図 9に示す この活性ピークについて還元下 S D Sボリアク リルァ ミ ド電気泳動 （L a emm l i U . K . ： N a t υ r e、 22 7, 6 8 0 - 6 8 5 ( 1 9 7 0) ) をおこなつ た処、 分子量約 6 0 Kの単一バン ドを示した。 実施例 2
N末端ァミノ酸配列およびァミ ノ酸組成：
'実施例 1.で得られた精製夕ン'パク質を線維芽細胞由来 天然型ヒ ト肝細胞増殖因子 （以下、 天然型ヒ ト HGFと 略す） をア ミ ノ酸シーケンサ一 （A p p 1 i e d B i o s y s t e rn s 4 7 7 A P r o t e i n S e q u e n c e r ) にかけた結果、 N末端 1 6個のアミ ノ酸 配列は配列表の配列番号 1の通りであった。 この N末端 は、 N a k amu r a ら [N a t u r e, 3 4 2, 4 4 0 - 4 4 3 ( 1 9 8 9 ) ] に開示のものとの相同性によ り 鎖の N末端であることがわかった。
この天然型ヒ ト HG F 4 〃 gZ2 5 /z l に 0. 4 % チォグリ コール酸を含む濃塩酸 2 5 1 を添加し、 真空 封管下 1 1 0 °Cで 2 2時間加水分解後、 塩酸を減圧乾固 し、 ついでこれを蒸留水に溶解後、 ァ ミ ノ酸分析計 （日 立 8 3 5型ア ミ ノ酸分析計 9で分析を行った。 結果を表 1 に示す。 表 1 ア ミ ノ酸 モル％ ア ミ ノ酸 モル％
Asp+Asn 12.85 Met 2.00
Thr 5.76 lie 5.27
Ser 6.31 Leu 5.87
Glu+Gln 9.67 T r ".73
Pro 5.95 Phe 2.72
Gly 9.91 Lys 6
Ala 3-86 His 3. 5
1/2Cys 3.31 rp 1.21
Val . il.83 Arg 5.86 実施例 3
正常線維芽細胞由来ヒ ト肝細胞増殖因子 c DNAクロ 一二ング
ヒ ト肝細胞増殖因子の c D N Aは、 Na k amu r a ら [Na t u r e, 3 4 2， 4 4 0 - 4 4 3 ( 1 9 8 9 ) ] によりクローン化されているので、 その配列をもと にプライマーを合成し、 ポリ メラーゼ連鎖反応 （p 0 1 yme r a s e c h a i n r e a c t i o n : P C R) 法にて c DNAを増幅後、 発現ベクターなどにクロ ーン化することができる。
( 1 ) ヒ ト正常線維芽細胞 mRNAの単離：
実施例 1のようにして培養されたヒ ト正常線維芽細胞 MR C 5 (理研細胞銀行より入手， R C B 2 1 1 ) より 塩化リチウム Z尿素法 [Au f f r a y e t a 1 ： Eu r. J. B i o c h em. 1 0 7、 3 0 3 - 3 1 4
( 1 9 8 0 ) ] にて RNAを調製した。 得られた RNA を I mM EDTAを含む l O mM ト リス塩酸緩衝液
(p H 7. 5 ) (以下 TEと略する。 ） に溶解し、 7 0 で、 5分加熱処理した後、 1 M 1 〇 1を含む丁£を 同量加えた。 0. 5 M L i C 1を含む TEで平衡化し たォリゴ d Tセルロースカラムに R N A溶液をアプライ し、 同緩衝液にて洗浄した。 さらに 0. 3M L i C 1 を含む TEにて洗浄後、 0. 0 1 % SD Sを含む 2m M EDTA (pH 7. .0) で吸着したポリ （A) RN Aを溶出した。 ( 2 ) ヒ ト正常線維芽細胞由来の c DN Aライブラ リ — の作製。
上記 （ 1 ) で得られた 4 gのポリ （A) RNAを用 いて G u b 1 e rらの方法 [ G e e n： 2 5, 2 3 6 - 2 6 9 ( 1 9 8 3 ) ] に準じて c DNAを合成した。 この c D N Aを S e e dの方法 [N a t u r e . 3 2 9, 8 4 0 - 8 4 2 ( 1 9 8 7 ) ] に準じ、 発現べクタ — C DM 8に T 4 DNAリガーゼを用いて挿入した。 こ の組換え DN Aを用い、 大腸菌 MC 1 0 6 1 ZP 3を形 質転換し、 c DNAライブラ リ一を得た。 タイ ト レーシ ヨ ンにより、 この c DNAライブラ リ 一は独立した 2 0 万個の形質転換体からなっていた。 これらの形質転換体 から常法 （Mo l e c u l a r C l o n i n g. C o I d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y . N ew Y o r k. 1 9 8 2 ) に従ってプラス ミ ド DNAを単離した。
( 3 ) 正常線維芽細胞由来ヒ ト肝細胞増殖因子 c DN A の単離。
ヒ ト肝細胞増殖因子のうちのア ミ ノ酸配列から適当な 配列を選択して、 例えば N末端あるいは C末端の塩基配 列をもとに、 2種類のプライマ一を D N Aシンセサイザ 一にて合成し、 次いでポリ メラーゼ連鎖反応 （p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n : P C R ) 法にて c DNAを増幅後、 発現べクタ—などにクロー ン化する。 ヒ ト肝細胞増殖因子として知られている肝臓由来ヒ ト 肝細胞増殖因子の N末端及び C末端の塩基配列 [N a k a m u r a e t . a 1 . N a t u r e, 3 4 2 , 4 4 0 - 4 4 3 ( 1 9 8 9 ) ] をもとに、
5 ' ATGTG G GTGA C CAAA C 3 '
と
5 ' CTATGA C T GTG GTA C C 3 ' の 2種類のプライマーを DNAシンセサイザ二にて合成 した。 各プライマーを 2 0 p m 0 上記 （ 2 ) で得ら れたプラスミ ド DNA 1 gを 0. 5 m l のミ クロ遠 心チューブに取り、 2 0 mMト リス塩酸緩衝液 （p H 8 . 3 ) 、 1. 5 mM Mg C 1 2、 2 5 mM K C 1、 1 0 0 g/ 1 ゼラチン、 5 0 /zM 各 d NT P、 4単位 T a q DNAポリ メラーゼとなるように各試薬 を加え、 全量 I 0 0 1 とする。 DNAの変性条件を 9 4で、 1分、 プライマーのアニーリ ング条件を 5 0 °C、 2分、 プライマーの伸長条件を 7 2で、 3分の各条件で P e r k i n - E l m e r C e t u s 社の DNAサ 一マルサイクラ一を用い、 4 0サイクル反応させた。 こ れを 1 % ァガロースゲルにて電気泳動し、 約 2. 2 k bの正常線維芽細胞由来ヒ ト肝細胞増殖因子 c DNAを 常法 （Mo l e c u l a r C l o n i n g. C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y N e Y o r k. 1 9 8 2 ) に従って調製した。 別の方法として、 実施例 1 のようにして精製されたヒ ト正常線維芽細胞由来ヒ ト肝細胞増殖因子の N末端のァ ミ ノ酸配列 （ 1 6個のアミ ノ酸） に基づいてオリゴマー を DN Aシンセサイザ一にて合成し正常線維芽細胞由来 ヒ ト肝細胞増殖因子 c DN Aをコロニーハイブリ ダィゼ ーショ ン法で得ることもできょう。
( 4 ) 発現べク夕一の調製。
発現ベクター C DM 8 [S e e d . N a t u r e . 3 2 9， 8 4 0 - 8 4 2 ( 1 9 8 7 ).] を制限酵素 H i n d I I Iで切断し、 T 4 DNAポリ メラーゼにて平滑末 端とし、 T 4 DNAリガーゼにて E c o R I リ ンカ一を 連結した。 次に制限酵素 P s t Iで切断し、 T 4 DNA ポリ メラーゼにて平滑末端とした。 さらに、 T 4 DNA リガーゼで K p n I リ ンカーを連結し、 制限酵素 E c 0
R I と K p n Iで切断した。 これを 1 % ァガロースゲ ル電気泳動し、 約 0. 3 6 k bのDNA断片を常法に従 い調製した。 一方、 p c D L— S R « 2 9 6 [T a k e b e e t . a 1 . M o 1 . C e l l . B i o l .
8 , 4 4 6 - 4 7 2 ( 1 9 8 8 ) ] を制限酵素 E c o R I及び K p n lで切断してァガロースゲル電気泳 動にて約 3. 4 k bの DNA断片を精製しておき、 この ベクターに上記の操作で得た約 0. 3 6 k bの D NA断 片を T 4 DNAリガーゼを用いて連結した。 これを用い て常法に従い大腸菌を形質転換し、 得られた形質転換体 よりプラスミ ド DNAを常法 （M o l e c u l a r C 1 o n i n g . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y. New Yo r k. 1 9 8 2 ) により調製し、 目的の発現ベクター p S Rひ B Xを得 た。
第 1図に発現ベクター P SR B Xの構築図を示す。 このプラスミ ド DN Aを常法に従い制限酵素 B s t X Iで切断し、 この反応液を 1 %ァガロースゲルで電気泳 動することにより両末端が制限酵素 B s t X I切断され た 3. 4 k bの DNA断片を分離精製した。
(5) 正常線維芽細胞由来ヒ ト肝細胞増殖因子 c DNA の発現べクターへのクローニングと塩基配列の決定。 上記 （ 3) で得られた 2. 2 k bの正常線維芽細胞由 来肝細胞増殖因子 c DNA断片を常法 （Mo l e c u l a r C l o n i n g. C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y. N ew Yo r k. 1 9 8 2 ) に従って、 T 4 DNAキナーゼでリ ン酸化し 、 B s t X I リ ンカ一 （ I n v i t r o g e n社 N 4 0 8 - 1 8) を T 4 リガーゼで連結した。 さらにこの反 応液を 1 %ァガロースゲルで電気泳動することにより B s t X I リ ンカ一が連結された 2. 2 k bの DNA断片 を分離精製した。 この DNA断片を上記 （4 ) で得た両 末端が制限酵素 B s t X I切断された 3. 4 kbの DN A断片に T 4 リガーゼで連結した。 これを用いて常法に 従い大腸菌を形質転換し、 得られた形質転換体よりブラ スミ ド DNAを常法により調製した。 次にこのプラス ミ ド DNAを制限酵素 B a mH Iで切断するこ とにより目 的の正常線維芽細胞由来ヒ ト肝細胞増殖因子 c DNA断 片が組み込まれていることを確認し （該プラスミ ドを p S R a FD F— 1 と呼ぶ） 、 G e n e s i s 2 0 0 0 DNA a n a l y s i s s y s t e m (デュポン社 ) を用いて、 ダイデォキシ法 [P r o b e r e t . a 1. S c i e n c e 2 3 8 , 3 3 6 - 3 4 1 ( 1 9 8 7 ) ] で正常線維芽細胞由来肝細胞増殖因子 c D NAの塩基配列を決定した （図一 2 ) 。
第 3図に動物細胞発現用ヒ ト HG F発現べクタ一 p S R F D F— 1の構築図を示す。
( 6 ) サル C 0 S細胞での正常線維芽細胞由来ヒ ト肝細 胞増殖因子遺伝子の発現。
上記 （ 5 ) で得られた 1 O 〃 g0p S R a F D F— l を 5 0 m!V [ ト リス塩酸緩衝液 （ p H 7. 5 ) 、 4 0 0 〃 g/m 1の D E A Eデキス トラン （フアルマシア社） 及 び 1 0 0 Mのクロ口キン （シグマ社） を含む 4 m l の R P M I 1 6 4 0培地に加えておく。 一方、 直径 1 0 c mのデイ シュを用いて 1 0 %ゥシ胎児血清 （ギブコ社 ) を含む R PM I 1 6 4 0培地 （ギブコ社） で 5 0 %コ ンフルェン トになるまで増殖させた C 0 S— 1細胞 （ A TC C CR L— 1 6 5 0 ) を P B Sで一回洗浄した後 、 上記で得た 4 m 1の DN A混合液を加え、 5 %C〇 2 の条件下で 3 7でで培養した。 4時間 l、 細胞を P B S で洗浄した後、 20 m lの R PM I 1 6 4 0培地にて 5
%C02、 3 7での条件で 4日間培養し、 培養上清中の 肝細胞増殖因子活性を NF S 6 0細胞の増殖を指標に测 定したところ、 3 4 0単位 Zm 1であった。 一方該肝細 胞増殖因子 c DN Aが逆向きに揷入されたべクターを同 じ方法で C 0 S一 1細胞に導入して得た培養上清中には 、 肝細胞増殖因子活性を認めなかった。
( 7) チャイニーズハムスター CHO細胞での正常線維 芽細胞由来ヒ ト肝細胞増殖因子遺伝子の発現。
チャイニーズハムスター CHO細胞のジヒ ドロ葉酸還 元酵素 （DHFR) 欠損株である CHO c l o n e DUKXB 1 1 (コロンビア大学 C h a s i n博士より 分与） を 1 2ゥエルプレー トのゥエル当たり 1 X 1 0 5 個となるように I 0 ゥシ胎児血清と核酸を含んだ or—
MEM (ギブコ社） 培地にて一夜培養した。
上記 （5) で得られた l〃 gの p SRaFDF— 1 と 0. 1 の 302 63¥ ( ） ー 3 [ { (3じ 3 h i l l , P r o c. Na t l . A c a d. S c i . U SA. 80, 4 6 5 4 - 4 6 5 8 ( 1 9 8 3) ] を混合 しファルマシ.ァ社の トランスフエクシヨンキッ トにて上 記 CH0細胞に導入し、 1 8時間培養した。 細胞を 2 0 倍希釈して 1 0 %ゥシ胎児血清を含む核酸不含 MEM (ギブコ社） にて 1 0日間培養をして形質転換細胞を得 た。 ■ 得られた細胞株から培養上清中の肝細胞増殖因子活性 の高い細胞株を選び、 5 0 n Mメ ソ ト レキセ— ト及び 1 0 %ゥシ胎児血清を含む核酸不含《ΜΕ Μにて培養し、 肝細胞増殖因子産生能の高いクローンを得、 C H O— 6 - 2 3 - 2 と名付けた。 この細胞の正常線維芽細胞由来 ヒ ト肝細胞増殖因子の産性能は N F S 6 0細胞の増殖を 指標とした測定系で 3 5 0 0単位 1 2 日であった
実施例 4
実施例 3 ( 6 ) で得られた正常線維芽細胞由来ヒ ト肝 細胞増殖因子産生サル C 0 S _ 1細胞の培養上清より正 常線維芽細胞由来組換え型ヒ ト肝細胞増殖因子を精製し た。
( 1 ) 硫安塩析
C 0 S - 1細胞の培養上清 1 3. 5 Lに 5 2 6 5 gの 硫酸アンモニゥムを徐々に加え溶解した後、 4 °Cに一夜 置いた。 6 5 0 0回転で 2 0分間遠心するこ とにより沈 殿を集め、 2 0 mMト リス塩酸緩衝液 （ p H 8. 0 ) で 溶解し、 同緩衝液にて十分透析し、 硫安濃縮液とした。
( 2 ) 陰イオン交換クロマ トグラフィ ー
上記 （ 1 ) で得られた硫安濃縮液を 2 0 mM ト リス塩酸 緩衝液 （ P H 8. 0 ) で平衡化した 1 0 m 1 の D E A E セファセル （フアルマシ社） に添加した。 2 0 mM ト リ ス塩酸緩衝液 （p H 8. 0 ) で未吸着物質を洗浄後、' そ れぞれ 0， 0 5 M, 0. 3 M, 0. 5 Mの N a C l を含 む 2 0 mMトリス塩酸緩衝液 （ p H 8. 0 ) 1 0 0m l を順次添加することによる吸着物を溶出した。 クロマ ト パターンを第 4図に示す。 NF S 6 0細胞増殖刺激活性 をもつ面分を集め、 DEAEセファセル溶出液とした。
( 3 ) へパリ ン ' セファロ一ス CL— 6 Bクロマ トグラ フィ ー
DEAEセファセル溶出液を 0. 3 MNa C lを含む 2 0 mMト リス塩酸緩衝液 （p H 8. 0) で平衡化した 2m lのへパリ ン ' セファロ一ス CL一 6 B (フアルマ シァ社） に添加した。 0. 31^、 ぉょび0. 5MNa C 1を含む 2 OmMト リス塩酸緩衝液にて順次十分洗浄し た後、 1 MN a C 1を含む 2 0 mMト リス塩酸緩衝液 （ p H 8. 0) により溶出した。 そのクロマ トパターンを 第 5図に示す。 NF A 6 0細胞増殖刺激活性面分を集め 、 へパリ ン溶出液とした。
( 4 ) 亜鉛キレー トァフィ二ティークロマ トグラフィ ー
0. 3m lのキレーティ ング セファロ一ス 6 B ( フアルマシア社） をカラムに充塡し、 0. 5 %塩化亜鉛 水溶液を添加後、 20 mMト リス塩酸緩衝液 （p H 8. 0 ) で洗净し、 亜鉛キレー トァフィ二ティ ーク口マ トを 調製した。 これにへパリ ン溶出液 1 2m 1を添加し、 1 M N a C 1含む 2 0 mMト リス塩酸緩衝液 （ p H 8. 0 ) にて洗浄する。 さらに、 5 0mM NH 4 C 1を含 む 2 0 mMト リス塩酸緩衝液 （ p H 8. 0 ) で洗浄後、
5 0 mMイ ミ ダゾ—ル及び 0. 5 M N a C l を含む 2 O mlV [ト リス塩酸緩衝液にて溶出した。 そのクロマ トパ ターンを第 6図に示す。. N F S 6 0細胞増殖刺激活性の ある画分を集め、 亜鉛溶出液とした。 精製された組換え 型の肝細胞増殖因子の収量は約 7 5 0 μ. gであり、 硫安 濃縮液からの活性回収率は約 4 4 %であつた。
( 5 ) S D Sボリアク リルア ミ ド電気泳動
上記の工程にて精製された組換え型肝細胞増殖因子を 非還元下で S D S—ポリアク リルアミ ド電気泳動 （ 4 一 2 0 %ゲル） にかけた。 組換え型肝細胞増殖因子は非還 元下では分子量 6. 6万一 8. 5万の単一バン ドを示し た。 結果を第 7図に示す。 実施例 5
実施例 3 ( 7 ) で得られた正常線維芽細胞由来ヒ ト肝 細胞増殖因子産生チヤィニーズハムスター C H O組換え 細胞株 C H O - 6 - 2 3 - 2の培養上清液より、 正常線 維芽細胞由来組換え型ヒ ト肝細胞増殖因子を精製した。
( 1 ) 陽イオン交換クロマ トグラフィ ー
C H O - 6 - 2 3 - 2細胞の培養液 2 5 m 1 を 2 0 m M ト リ ス塩酸緩衝液 （ p H 6. 8 ) で十分透析し、 2 0 mMト リス塩酸緩衝液 （ p H 6'.. 8 ) で平衡化した 0.
5 m l の C M—セフアデクス （フ アルマシア社） カラム に添加した。 2 0 mMト リ ス塩酸緩衝液 （p H 6. 8 ) で洗浄後、 0. 5 Mの N a C 1を含む 2 0 mMト リス塩 酸緩衝液 （P H 6. 8 ) で溶出した。 NF S 6 0細胞増 殖刺激活性のある画分を集め、 CM—セフアデクス溶出 液とした。
( 2 ) へパリ ン ' セファロース CL— 6 Bクロマ トグラ フィ ー
" 0. 5 Mの N a C 1を含む 2 0 mMト リス塩酸緩衝 液 （ p H 8. 0 ) で平衡化した 1 m 1のへパリ ン - セファロ一ス CL一 6 Bに CM—セフアデクス溶出液を 添加し、 0. 5 Mの N a C 1を含む 2 0 mMト リス塩酸 緩衝液 （pH 8. 0 ) で洗浄後、 l MのNa C lを含む 2 0 mMトリス塩酸緩衝液 （p H 8. 0) で溶出した。 NF S 6 0細胞増殖刺激活性のある画分を集め、 へパリ ン溶出面分とした。
( 3 ) 亜鉛キレー トァフィ二ティーク口マ トグラフィ 一 0. 1 m lのキレーティ ング セファロース 6 B ( フアルマシア社） をカラムに充填し、 0. 5 %塩化亜鉛 水溶液を添加後、 2 0 mMトリス塩酸緩衝液 （p H 8. 0 ) で洗浄し、 亜鉛キレー トァフィ二ティ 一クロマ トを 調製した。 これにへパリ ン溶出液を添加し、 1 M N a C 1含む 2 0 mMト リス塩酸緩衝液 （p H 8. 0 ) にて 洗浄する。 さらに、 5 0mM NH 4 C 1を含む 2 0m Mト リス塩酸緩衝液 （p H 8. 0) で洗浄後、 5 0mM イ ミ ダゾール及び 0. 5 M N a C 1 を含む 2 0 m Mト リス塩酸緩衝液にて溶出した。 N F S 6 0細胞増殖刺激 活性のある画分を集め、 亜鉛溶出液とした。 ( 4 ) S D Sポリアク リルア ミ ド電気泳動
上記の工程にて精製された正常線維芽細胞由来組換え 型肝細胞増殖因子を非還元下で S D S一ポリアク リルァ ミ ド電気泳動 （ 4一 2 0 %ゲル） にかけ、 銀染色法にて ゲルを染色した。 その結果、 組換え型肝細胞増殖因子は 非還元下では分子量 6. 6万一 8. 5万の単一バン ドを 示した。 実施例 6
未分化のマウス骨髄芽球細胞 （NF S 6 0 ) に対する 増殖活性の測定 ：
T T A s s a y法 [T. Mo s m a n : J. I m mu n o l o g i c a l M e t h o d s , 6 5， 5 5 -
6 3 ( 1 9 8 3 ) ] に従い、 以下の操作により細胞の増 殖を測定した。
9 6穴マイクロプレー トに 5 0〃 1 の培養液 （ 1 0 %
F B S -R P 1 6 4 0 ) を入れ、 実施例 1で精製され たヒ ト正常線維芽細胞由来天然型肝細胞.増殖因子 （天然 型ヒ ト HGF) を含む溶液 5 を加えて 2段階希釈 した後、 NF S 6 0株を 2 x 1 05 個/ m l に調整し、 各ゥエルに 5 0 1入れ、 炭酸ガスィ ンキュベータで 3
7。C、 2日間培養した。 次いで、 MTT試薬 [ 3— (4 5—ジメチルチアゾ —ルー 2—ィル） 一 2, 5—ジフエニル テトラゾニゥ ム ブロマイ ド） を P B Sに溶解して、 S mgZm lに 調製] を 1 0 1各ゥエルに加え、 3 7で、 炭酸ガスィ ンキュベータで 5時間培養した。 これに 0. 0 4 N塩酸 添加ィソプロパノ一ル 1 5 0 / 1を加え色素を抽出し、 5 9 0 nmの吸光度をィムノ リ一ダを用いて測定した。
0 D590nmの値がコンフルェントに対し、 5 0 %を示 す希釈率で実施例 1で精製されたヒ ト正常線維芽細胞由 来天然型肝細胞増殖因子 （天然型ヒ ト HGF) は、 活性 を示した。 実施例 7
成熟ラッ ト初代培養肝細胞に対する DNA合成促進活 性の測定：
成熟ラッ ト肝細胞は S e 1 e nの方法 [S e g l e n, P. 0 ; Me t h o d s i n C e l l B i o l o g y, 1 3, 2 9— 8 3 ( 1 9 7 6) ] に従って、 分離 ·調製した。
新鮮な 1 X 1 05 個の肝細胞を以下の組成の培地に加 え、 lmlとした。 MEM (ギブコ社製） 、 1 0 OmMィ ンシュ リ ン （S i gma社製） 、 5 0 ^ g /mlゲン夕 マイシン （S i gm a社製） 、 5 子牛血清 （ギブコ社 製） および HGFを含む溶液を加えたものを各々培地と して、 コラーゲンコー トの 3 5 mmプラスチッ クシャーレ (ファルコン社製） に分注した。 3 7で、 7 % C 02 、 湿度 9 0 の培養器内で 4時間 培養した後、 血清無添加の 5 C i /ml [ 3H] t h i m i d i n eを含む MEMメディ ムで培地交換した。 さ らに、 4 5時間、 上記の培養条件で培養した。 培養した シャーレを 0. 9 %N a C lで 6回洗浄した。 細胞を 1 . 5mlの 0. 3 3 N N a OHに溶解後、 全量を氷水中 で試験管に移した。
これに 0. 5 mlの 4 0 %ト リ クロ口酢酸の 1. 2 N塩 酸溶液を添加し、 生じた沈殿を、 2, 0 0 0 r pm、 1 0分間の遠心分離で分離した。 この沈殿を 0. 5 mlの 0 . 3 3 N N a OHに溶解し、 このうちの 0. 3 mlをシ ンチレーシヨ ンバイアルにとり、 0. 5 mlの A q u a s 0 1 (N ew E n g l a n d Nu c l e a r社製） と 0. 1 mlの 4 0 % ト リ クロル酢酸の 1. 2 N塩酸溶液 を加えた。 [ 3H] チミヂン （ t h i m i d i n e ) の取り込みをシンチレ一ショ ンカウンターで測定した。 実施例 1で精製されたヒ ト正常線維芽細胞由来天然型肝 細胞増殖因子 （天然型ヒ ト HGF) は、 活性を示した。 実施例 8
ヒ ト正常骨髄細胞を用いる造血幹細胞に対する増殖活 性の測定 ：
へパリ ン加正常ヒ ト骨髄血 2〜 3 m 1を採取し、 シリ 力存在下で 3 7 ° (：、 3 0分間浮置後、 F i c 0 1 1 — P a q u e (フ ァルマシア社製） 比重遠心法にて非貪食性 単核細胞を分離した。 洗浄後、 1 0 c mプラスチッ ク培 養シャーレを甩いて付着性細胞を除去し、 非貪食性非付 着性単核細胞 （NPNAMNC) とし、 ーメディウム (F l o L a b s社製） に浮遊させた。
培養は、 I s c 0 V e らの方法 [ I s c 0 V e , N. N. e t . a l . ： J. C e l l P h y s i o l . ,
8 3 , 3 0 9〜 3 2 0 ( 1 9 7 4 ) ] を改変したメチル セルロース法にて行った。 上記の N P N AMN C 4 x 1 0 個を以下の組成の無血清培地に加え、 1 m 1 とし た。 α—メティ ゥ厶、 0. 8 %メチルセルロース （信越 化学社製） 、 0. 1 % 再結晶処理された脱イオン化牛 血清アルブミ ン （ c r y s t a l l i z e d d e i o n i z e d b o v i n e s e r u m a 1 b υ m i n、 S i m a社製） 、 3 0 0 〃 g/m 1 F e一飽和ヒ ト トランスフェ リ ン （F e — s a t u r a t e d h u m a n t r a n s f e r r i n、 S i gm a社製) 、
4 0 fi s m 1 大豆レクチン （ s o y b e a n 1 e c i t h i n、 S i m a社製） 、 2 A u g / 1 コレステロール （ナカライ社製） 、 5 x 1 0— 5M 2— メルカプトエタノール （ 2— M e r c a p t o e t h a n 0 1 ) 、 及び試料を加えたものを各々の培地として、
3 5 mm L u アイ シュ ( c u l t u r e d i s h、 M i l e s L a b s社製） に分注した。 培養は 3 7'で、 5 C 02 、 湿度 1 0 0 %の培養器内で培養し た。 1 8 日間培養後のコロニーを倒立顕微鏡下にて観察 し、 各コロニー数を算定した。
結果を表 2に示す。 表 2 ヒ ト正常骨髄細胞に対する天然型ヒ ト
H G Fの造血幹細胞増殖活性 天然型ヒ ト コロニー形成/ / 4 x 1 0 4 個 N P NAMN C
H G Fの
添加量 B l a s t C F U - GM C F U - G マクロフ ァージ ム口 =4- ΒΊ 無添加 1 0 1 9 5 6 4 0
1 n g /m 1 6 2 6 7 1 4 0
1 0 n g /m 1 1 7 3 8 9 1 6 5
1 0 2 n g /m 1 1 3 3 8 9 4 6 4
1 0 3 n g/m 1 1 5 3 0 4 5 5 4
実施例 9
マウス骨髄細胞を用いる造血幹細胞に対する増殖活性 の測定：
B D F 1 雌性マウスに 1 5 O m g/K gの 5 —フルォ ロウラシルを静注し、 4 8時間後に大腿骨から骨髄細胞 を採取した。
培養は I s c 0 V e らの方法を改変したメチルセル口 ース法にて行った。 5 X 1 04 個の骨髄細胞を以下の組 成の無血清培地に加え、 1 m 1 とした。
一メディ ウム、 0. 9 %メチルセルロース、 1 %再 結晶処理された脱イオン化牛血清アルブミ ン、 3 0.0 g/m 1 F e—飽和ヒ ト トランスフェ リ ン、 1 6 0 z gZm l 大豆レクチン （S i g m a社製） 、 9 6 〃 g /m l コ レステロール （ナカライ社製） 、 1 0 -4M 2—メルカプトエタノール、 及び試料或いは各種造血因 子を加えたものを各々培地として、 3 5 mm L u x 培 養デイ シュに分注した。 各造血因子は以下の濃度で添加 した ： r m u I L— 3 (コスモバイオ） ： 2 0 0 u/m 1、 r m u I L - 7 (コスモバイオ） ： 2 0 u/m 1 。 培養は、 3 7。C、 5 % C 02 、 湿度 1 0 0 %の培養器 内で培養した。 培養 1 7 日間後のコロニーを倒立顕微鏡 下にて観察し、 各コロニー数を算定した。
ヒ ト正常線維芽細胞由来の天然型肝細胞増殖因子につ いての結果を表 3に示す。 ' 表 3 5 F U処理マウス骨髄細胞に対する天然型 ヒ ト H G Fの造血幹細胞増殖活性
Figure imgf000053_0002
Figure imgf000053_0001
実施例 1 0
ヒ ト正常線維芽細胞由来組換え型及び天然型 HGFの 肝細胞増殖活性の測定
4週齢のウイスターラッ トからコラゲナーゼ還流法に て肝実質細胞を分離した。 得られた肝実質細胞を 5 %の ゥシ胎児血清、 1 X 1 0 ィンスリ ン、 および 1 X 1 0一9 Mデキサメサゾンを含むウイリァ厶ス E培地に 2 X 1 05 個 Zm 1 となるように懸濁した。 コラーゲンでコ ー トした 24ウェルマルチプレー トに、 上記細胞懸濁液 を 0. 5m lずつ播き、 5 02 の存在下で 3 7で、 2 0時間培養した。 次に、 1 X 1 0 -9Mインスリ ン、 お よび 1 X 1 0 -SMデキサメサゾンを含むウイ リアムス E 培地に交換すると同時に所定量のサンプルを添加した。 さらに 2 3時間培養し、 ゥエル当たり 0. 5 /z C iの 125 Iデォキシゥ リ ジンを添加して 7時間培養を続けた 。 細胞を P B Sで 2回洗浄後、 冷 1 0 % ト リ クロロ酢酸 水溶液で固定した。 細胞を 1ゥエル当たり 0. 5m lの I N Na OHで可溶化し、 その放射能をガンマカウン 夕一にて測定した。 また放射能測定後の試料の一部をと り、 ローリー法にて蛋白量を測定した。 種々のサンプル を添加したとき肝実質細胞に取り込まれた放射能の量を 求め、 これを肝実質細胞蛋白質 1 g当たりに換算して 、 DNA合成活性 （c pmZ/ g蛋白質） とした。
その結果を表 4に示した。 表 4 ヒト正常線維芽細胞由来組換え型及び
天然型 H G Fの肝細胞増殖活性 肝実質細胞におけ 肝実質細胞におけ る DNA合成 （c る DNA合成 （c o o 1 pm/ ζ g細胞 p / u g細胞 n n n 蛋白質 7時間）
MM M 蛋白質 Z 7時間） 天然型 0 0 n g/m 1 6 インスリ ン 1 0 0 nM
ヒ ト HGF 1 0 n g/m 1 5 + 1 0 0 ± 3. 5
1 n g/m 1 0 上皮細胞 20 n g/m 1
O O g/ 1 0 成長因子
1 0 p g/m 1 42432 o 22 654 5 3736 0
44 44 o 282 o o 66 o 83 1 天然型 5 0 n g/ m 1
組換え型 0 0 n g/m 1 土土士士土土士土土土土土土土土土 6 ヒト HGF
ヒト HGF 1 0 n /m 1 446 o 35 3 324 361111 1 + 1 3 7 ± 4. 4
1 n g/m 1 6 インスリ ン 1 0 0 nM
O O p g/m 1 5
1 0 p /m 1 2 組換え型 5 0 n g/ m 1
ヒ ト HGF
上皮細胞 5 0 n g/ 1 0 + 1 1 8 ± 3. 5 成長因子 1 0 n g/m 1 9 インスリ ン 1 0 0 nM
2 n g/m 1
天然型 5 0 n g/m 1
インスリ ン 0 ヒ卜 HGF
5 + 1 4 0 ± 8. 9 0 上皮細胞 20 n g/m 1
表 4 ヒト正常線維芽細胞由来組換え型及び
(続き） 天然型 H G Fの肝細胞増殖活性 肝実質細胞におけ 肝実質細胞におけ 濃度 る DNA合成 （c 濃度 る DNA合成 （c
m z g細胞 pm U g細胞 蛋白質/ "7時間） 蛋白質 7時間） 組換え型 50 n g/m 1 組換え型 50 n g/m 1
ヒ ト HGF ヒ ト HGF
+ 1 1 0 ± 5. 1 +
ェ反細 AS 20 n m 1 ィンスリ ン 1 00 nM 1 38 ± 1 0. 7 成長因子 +
上皮細胞 20 n g/m 1
天然型 50 n g/m 1 成長因子
ヒト HGF
+
インスリ ン 1 00 nM 1 53 ± 7. 5
+
上皮細胞 20 n g/m 1
成長因子
実施例 1で精製されたヒ ト正常線維芽細胞由来の天然 型、 実施例 4で精製された C 0 S細胞由来の組換え型、 いずれの HGFも 1 0 n gZm 1で DN A合成活性を示 し、 イ ンスリ ンおよび/または上皮細胞成長因子の存在 下で肝実質細胞の DN A合成活性が増強された。 実施例 1 1
ヒ ト正常線維芽細胞由来組換え型および天然型 HG F の正常マウス骨髄細胞を用いたコロニー形成刺激活性
BD F 1マウスの大腿骨から骨髄細胞を採取し常法 （ M e t c a 1 f C l o n a l c u l t u r e o f h em o p o i e t i c c e l l s : t e c h n i q u e s a n d a p p l i c a t i o n s . E 1 s e v i e r A m s t e r d am) に従って 2 X 1 0 4個の骨髄細胞を 0. 9 %メチルセルロース、 1 X 1 0— 4 M2—メルカプトエタノ ール、 2 0 %ゥシ胎児血 清、 および種々の濃度の HG F試料を含む 1 m 1のひ M EM培地に懸濁し、 5 % C 02 存在下で 3 7 °C 7日間培 養し、 コロニーを倒立顕微鏡下にて観察しコロニー数を しに。
その結果を表 5に示した。 5 無処理骨髄細胞を用いたコロニーァッセィ 天然型ヒ ト正常線維芽 G Mクラスターの数 細胞由来 H G F
(単位 Zm 1 )
0 0
2 5 6. 3 ± 2 . 9
1 0 0 9. 8 ± 4 . 3
4 0 0 7. 0 ± 1 ， 8
1 6 0 0 0. 8 ± 1 . 0 組換え型ヒ ト正常線維芽 GMクラスターの数 細胞由来 HG F
(単位 Zm 1 )
0 2. 3 ± 3 . 3
2 5 9. 8 ± 5 . 5
1 0 0 2 0. 0 ± 5 . 5
4 0 0 1 5. 0 ± 3 . 6
1 6 0 0 1 5. 8 ± 1 • 3
実施例 1 2
ヒ ト胎盤由来肝細胞増殖因子の N F S 6 0細胞増殖刺 激活性の測定
ヒ ト胎盤由来肝細胞増殖因子 （B e c t 0 n D i e k i n s o n L a bwa r e社） と実施例 1で精製し たヒ ト正常線維芽細胞由来の天然型肝細胞増殖因子の N F S 6 0細胞増殖刺激活性を実施例 6に示した方法で測 定した。 その結果を第 8図に示した。
同様にヒ ト正常肝細胞由来の組換え型肝細胞増殖因子 (N a t u r e, V o l . 3 4 2, p p. 4 4 0 - 4 4 3, N o v emb e r 2 3, ( 1 9 8 9 ) 及びヒ ト胎 児肺の線維芽細胞 M 4 2 6由来の組換え型肝細胞増 ¾因 子 （P r o c . a t l . A c a d. S c i . USA. V o l . 8 8， p p. 4 1 5 - 4 1 9, J a n u a r y , ( 1 9 9 1 ) ) の NF S 6 0細胞増殖刺激活性も実施 例 6に示した方法で測定できる。 産業上の利用可能性
肝細胞増殖因子は、 マウス由来の未分化骨髄芽球細胞 の増殖を支持する活性を有する。 また、 ヒ ト骨髄細胞及 びマウス骨髄細胞を用いた評価系において造血幹細胞の 増殖を支持するこ とから、 該肝細胞増殖因子を有効成分 とする幹細胞増加剤として、 骨髄抑制 （例えば抗癌剤使 用後や骨髄移植後等） に対する治療、 骨髄機能不全 （例 えば再生不良性貧血等） に対する治療、 あるいは末梢血 幹細胞及び骨髄幹細胞の i n V i ΐ 1-0増殖の用途に 利用することができる。 また本発明の造血幹細胞増加剂 は、 結果的には種々の血液細胞ばかりでなく造血幹細胞 の子孫である破骨細胞の増殖も促進するため、 骨粗鬆症 等の治療剤としての適用も可能である。
配列表 配列番号 ： 1
配列の長さ ： 16
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Val Val Asn Gly. Ile Pro Thr Xaa Thr Asn lie Gly 1 5 10
Xaa Met Val Lys
15
配列番号： 2
配列の長さ ： 2 1 7 2
配列の型 ：核酸
鎮の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
起源
生物名 ： ヒ ト正常線維芽細胞（human normal fibroblast)
E列
A G GG GTG ACC MA CTC CTG CCA GCC CTG CTG CTG CAG CAT GTC CTC U8 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gin His Val Leu
1 5 10 15
CTG CAT CTC CTC CTG CTC CCC ATC GCC ATC CCC TAT GCA GAG GGA CAA 96 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro lie Ala lie Pro Tyr Ala Glu Gly Gin
20 25 30
AGG AAA AGA AGA AAT ACA ΑΊΤ CAT GAA TTC AAA AAA TCA GCA AAG ACT Mik Arg Lys Arg Arg Asn Thr lie His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35 no 5
ACC CTA ATC AAA ATA GAT CCA GCA CTG AAG ATA AAA ACC AAA AAA GTG 192 Thr Leu lie Lys He Asp Pro Ala Leu Lys lie Lys Thr Lys Lys Val
50 55 60 AAT ACT GCA GAC CAA TGT GCT AAT AGA TGT ACT AGG AAT AAA GGA CTT 2U0 Asn Thr Ala Asp Gin Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65 70 75 80
CCA TTC ACT TGC AAG GCT TTT GTT TTT GAT AAA GCA AGA AAA CAA TGC 288 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gin Cys
85 90 95
CTC TGG TTC CCC TTC AAT AGC ATG TCA AGT GGA GTG AAA AAA GAA TTT 336 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
100 105 110
GGC CAT GAA TTT GAC CTC TAT GAA AAC AAA GAC TAC ATT AGA AAC TGC 3 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr lie Arg Asn Cys
115 120 125
ATC ATT GGT AAA GGA CGC AGC TAC AAG GGA ACA GTA TCT ATC ACT AAG 32 lie lie Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser lie Thr Lys
130 135 1U0
AGT GGC ATC AAA TGT CAG CCC TGG AGT TCC ATG ATA CCA CAC GAA CAC 80 Ser Gly He Lys Cys Gin Pro T^p Ser Ser Met lie Pro His Glu His
1 5 150 155 160
AGC TAT CGG GGT AAA GAC CTA CAG GAA AAC TAC TGT CGA AAT CCT CGA 528 Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gin Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg
165 170 175 GGG GAA GAA GGG GGA CTC TGG TGT TTC ACA AGC AAT CCA GAG GTA CGC 576 Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp fS Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg
180 185 190
TAC GAA GTC TGT GAC ATT CCT CAG TGT TCA GAA GTT GAA TGC ATG ACC 62 Tyr Glu Val (¾^s Asp lie Pro Gin Qys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr
195 200 205
TGC MT GGG GAG AGT TAT CGA GGT CTC ATG GAT CAT ACA GAA TCA GGC 672 Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly
210 215 220
AGG ATT TGT CAG CGC TOG GAT CAT CAG ACA CCA CAC CGG CAC AAA TTC 720 Arg lie Cys Gin Arg Trp Asp His Gin Thr Pro His Arg His Lys Phe
225 230 235 2U0
TTG (XT GM AGA TAT CCC GAC AAG GGC TTT GAT GAT AAT TAT TGC CGC 768 Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg
2U5 250 255
MT CCC GAT GGC CAG CCG AGG CCA TGG TGC TAT ACT CTT GAC CCT CAC 816 Asn Pro Asp Gly Gin Pro Arg Pro Trp C¾rs Tyr Thr Leu Asp Pro His
260 265 270
ACC CGC TGG GAG TAC TGT GCA ATT AAA ACA TGC GCT GAC AAT ACT ATG 86 Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala lie Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met
275 280 285 ' AAT GAC ACT GAT GTT CCT TTG GAA ACA ACT GAA TGC ATC CAA GGT CAA 912 Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys lie Gin Gly Gin
290 295 300
GGA GAA GGC TAC AGG GGC ACT GTC AAT ACC ΑΠ TGG AAT GGA ΑΠ CCA 960 Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr lie Trp Asn Gly lie Pro
305 310 315 320
TGT CAG CGT TGG GAT TCT CAG TAT CCT CAC GAG CAT GAC ATG ACT CCT 1008 Cys Gin Arg Trp Asp Ser Gin Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro
325 330 335
GAA AAT TTC AAG TGC AAG GAC CTA CGA GAA AAT TAC TGC CGA AAT CCA 1056 Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro
3U0 3 5 350
GAT GGG TCT GAA TCA CCC TGG TGT TTT ACC ACT GAT CCA AAC ATC CGA
Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn lie Arg
355 360 365
GTT GGC TAC TGC TCC CAA ATT CCA AAC TGT GAT ATG TCA CAT GGA CAA 1 152 Val Gly Tyr Cys Ser Gin lie Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gin
370 375 380
GAT TGT TAT CGT GGG AAT GGC AAA AAT TAT ATG GGC AAC TTA TCC CAA 1200 Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gin
385 390 395 400 ACA AGA TCT GGA CTA ACG TGT TCA ATG TGG GAC AAG AAC ATG GAA GAC 12H8 Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp
H05 UIO 1115
TTA CAC CGT CAT ATC TTC TGG GAA CCA GAT GCA AGT AAG CTG AAT GAG 1296 Leu His Arg His lie Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu
U20 U25 30
MT TAC TGC CGA AAT CCA GAT GAT GAT GCT CAT GGA CCC TGG TGC TAC a Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr
H35 HUQ H5
ACG GGA MT CCA CTC ΑΊΤ CCT TGG GAT TAT TGC CCT ATT TCT CGT TGT 1392 Thr Gly Asn Pro Leu He Pro Trp Asp Tyr C¾^s Pro lie Ser Arg Cys
50 U55 il60
GM GGT GAT ACC ACA CCT ACA ATA GTC MT TTA GAC CAT CCC GTA ATA 1UU0 Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr lie Val Asn Leu Asp His Pro Val He
U65 H70 "75 H80
TCT TGT GCC AAA ACG AM CAA CTG CGA GTT GTA AAT GGG ATT CCA ACA 1 88 Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gin Leu Arg Val Val Asn Gly lie Pro Thr
1185 i\90 H95
CGA ACA AAC GTA GGA TGG ATG GTT AGT TTG AGA TAC AGA AAT AAA CAT 1536 Arg Thr Asn Val Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His
500 505 510 ATC TGC GGA GGA TCA TTG ATA AAG GAG AGT TGG GTT CTT ACT GCA CGA ^58k lie Cys Gly Gly Ser Leu lie Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg
515 520 525
CAG TGT TTC CCT TCT CGA GAC TTG AAA GAT TAT GAA GCT TGG CTT GGA 1632 Gin Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly
530 535 5U0
ATT CAT GAT GTC CAT GGA AGA GGA GAT GAG AAA TGC AAA CAG GTT CTC 1680 lie His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gin Val Leu
5H5 ' 550 555 560
AAT GTT TCC CAG CTG GTA TAT GGC CCT GAA GGA TCA GAT CTG GTT TTA 1728 Asn Val Ser Gin Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu
565 570 575
ΑΊΏ AAG CTT GCC AGG CCT C3CT GTC CTG GAT GAT TTT GTT AGT ACG ATT 1776 Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr lie
580 585 590
GAT TTA CCT AAT TAT GGA TGC ACA ATT CCT GAA AAG ACC AGT TGC AGT 182ね Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr lie Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser
595 600 605
GTT TAT GGC TGG GGC TAC ACT GGA TTG ATC AAC TAT GAT GGC CCA TTA 1872 Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu lie Asn Tyr Asp Gly Pro Leu
610 615 620 CGA GTG GCA CAT CTC TAT ATA ATG GGA AAT GAG AAA TGC AGC CAG CAT 1920 Arg Val Ala His Leu Tyr lie Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gin His
625 630 635 6U0
CAT CGA GGG MG GTG ACT CTG AAT GAG TCT GAA ATA TGT GCT GGG GCT 1968 His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu lie Cys Ala Gly Ala
6U5 650 655
GAA AAG ATT GGA TCA GGA CCA TGT GAG GGG GAT TAT GGT GGC CCA CTT 2016 Glu Lys He Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu 672
660 665 670
GTT TGT GAG CM CAT AM ATG AGA ATG GTT CTT GGT GTC ATT GTT CCT 206 Val Cys Glu Gin His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val lie Val Pro
675 680 685
GGT ΟΠ1 GGA TGT G ATT CCA AAT CGT (XT GGT AIT m GTC CGA GTA 2112 Gly Arg Gly Cys Ala lie Pro Asn Arg Pro Gly lie Phe Val Arg Val
690 695 700
GCA TAT TAT GCA AAA TGG ATA CAC AAA ATT ATT TTA ACA TAT AAG GTA 2160 Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp lie His Lys lie lie Leu Thr Tyr Lys Val
705 710 715 720
CCA CAG TCA TAG 2172 Pro Gin Ser

Claims

1 請 求 の 範 囲
( 1 ) 肝細胞増殖因子類の少なく とも一つを有効成分 として含有する造血幹細胞増加剤。
5
( 2 ) 有効成分として更にイ ンターロイキン 3及び Z またはインターロイキン 7を含有する請求の範囲第 1 項 記載の造血幹細胞増加剤。
( 3 ) 骨髄抑制の治療剤としての請求の範囲第 1項記 載の造血幹細胞増加剤。
10
( 4 ) 骨髄機能不全の治療剤としての請求の範囲第 1 項記載の造血幹細胞増加剤。
( 5 ) 肝細胞増殖因子が、 分子量約 6 0 , 0 0 0であ る下記 N末端アミ ノ酸配列を有するタンパク質である請 求の範囲第 1項記載の造血幹細胞増加剤。
Val Val Asn Gly lie Pro Thr Xaa Thr Asn lie
Gly Xaa Met Val Lys
(式中、 aa は任意のァミ ノ酸である）
( 6 ) 肝細胞増殖因子が、 表 1 のァ ミ ノ酸組成を有す るタンパク質である請求の範囲第 5項記載の造血幹細胞 0 増加剤。
( 7 ) 肝細胞増殖因子が、 ヒ ト肝細胞由来の組換え肝 細胞増殖因子、 線維芽細胞由来の組換え肝細胞増殖因子 またはヒ ト胎盤由来肝細胞増殖因子あるいはその同効物
- である請求の範囲第 1 項記載の造血幹細胞増加剤。
5
( 8 ) 肝細胞増殖因子が、 亜鉛をキレー ト結合させた 担体を用いたクロマ トグラフィ ーにより精製して得られ るものである請求の範囲第 1項記載の造血幹細胞増加剤
(9) 担体として更にへパリ ンを結合した担体を用い ることを特徴とする請求の範囲第 8項記載の造血幹細胞 増加剤。
( 1 0 ) 肝細胞増殖因子が、 配列表の配列番号 2に示 したアミ ノ酸配列を有するタンパク質あるいはその同効 物である請求の範囲第 1項記載の造血幹細胞増加剤。
( 1 1 ) 肝細胞増殖因子類の少なく とも一つの存在下 に未分化の骨髄細胞を分化増殖させることを特徴とする 造血幹細胞増加法。
( 1 2) 多能性造血幹細胞を分化増殖させることを特 徵とする請求の範囲第 1 1項記載の方法。
( 1 3) 末梢血幹細胞または骨髄液より得られたヒ ト 骨髄細胞を分化増殖させることを特徴とする請求の範囲 第 1 1項記載の方法。
( 1 4) 造血幹細胞増加活性を有し、 肝細胞増殖因子 類に属するタンパク質。
( 1 5 ) 分子量約 6 0, 0 0 0である下記 N末端ア ミ ノ酸配列を有するタンパク質である請求の範囲第 1 4項 記載の夕ンパク質。
Val Val Asn Gly He Pro Thr Xaa Thr Asn He Gly Xaa Met Val Lys
(式中、 aaは任意のァミノ酸である）
( 1 6 ) 表 1のアミ ノ酸組成を有するタンパク質 tあ る請求の範囲第 1 5項記載のタンパク質。
( 1 7 ) 亜鉛キレー ト基を結合した担体を用いたクロ マ トグラフィ 一により精製して得られるものである請求 の範囲第 1 4項記載のタンパク質。
( 1 8 ) 担体として更'にへパリ ンを結合した担体を用 いることを特徴とする請求の範囲第 1 7項記載のタンパ ク質。
( 1 9 ) 未分化の骨髄細胞増殖因子であり、 肝細胞増 殖因子類の一^ 3である請求の範囲第 1 4項記載のタンパ ク質。
( 2 0 ) ヒ ト正常線維芽細胞由来の多能性造血幹細胞 増殖活性を有し、 肝細胞増殖因子類の一つ.であって、 組 換えヒ ト肝細胞増殖因子である請求の範囲第 1 4項記載 のタンノ、0ク質。
( 2 1 ) 配列表の配列番号 2に示したァミ ノ酸配列を 有するタンパク質あるいはその同効物である請求の範囲 第 1 4項記載の夕ンパク質。
( 2 2) 該組換えヒ ト肝細胞増殖因子が、 チヤィニー ズハムスター由来 CHO細胞またはサル由来 C O S細胞 中で発現されたものである請求の範囲第 2 1項記載の夕 ンパク質。
( 2 3 ) 造血幹細胞増加活性を有し、 肝細胞増殖因子 類に属するタンパク質あるいはその同効物のア ミ ノ酸配 列をコ一 ドする塩基配列を含むことを特徴とする DNA
( 2 4 ) 該ァ ミ ノ酸配列が配列表の配列番号 2に示し たァミ ノ酸配列を有するものである請求の範囲第 2 3項 記載の DNA。
(25) 造血幹細胞増加活性を有し、 肝細胞増殖因子 類に属する夕ンパク質あるいはその同効物のァミ ノ酸配 列をコー ドする塩基配列を発現可能に組み込んでなる組 換え発現べクタ一。
(2 6) 造血幹細胞増加活性を有し、 肝細胞増殖因子 類に属するタンパク質あるいはその同効物のアミ ノ酸配 列をコードする塩基配列を発現可能に組み込んでなる組 換え発現べクタ一により宿主細胞を形質転換することに より得られた形質転換体。
(2 7) 該形質転換体が、 大腸菌または哺乳類由来細 胞である請求の範囲第 2 6項記載の形質転換体。
(2 8) 造血幹細胞増加活性を有し、 肝細胞増殖因子 類に属するタンパク質あるいはその同効物のァミ ノ酸配 列をコードする塩基配列を発現可能に組み込んでなる組 換え発現べクタ一にって宿主細胞を形質転換することに より得られた形質転換体を、 栄養培地中該タンパク質が 発現可能な条件下に培養して、 該培養物から造血幹細胞 増殖活性を持ち、 肝細胞増殖因子類の一つであって、 組 換えヒ ト肝細胞増殖因子である夕ンパク質を採取するこ とを特徽とする組換えヒ ト肝細胞増殖因子であるタンパ ク質の製法。
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