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WO1993000430A1 - Sequences de nucleotides capables de s'hybrider avec le gene nov de poule - Google Patents

Sequences de nucleotides capables de s'hybrider avec le gene nov de poule Download PDF

Info

Publication number
WO1993000430A1
WO1993000430A1 PCT/FR1992/000589 FR9200589W WO9300430A1 WO 1993000430 A1 WO1993000430 A1 WO 1993000430A1 FR 9200589 W FR9200589 W FR 9200589W WO 9300430 A1 WO9300430 A1 WO 9300430A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sequence
nucleotide sequences
nucleotide
sequences according
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1992/000589
Other languages
English (en)
Inventor
Bernard Perbal
Cécile MARTINERIE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of WO1993000430A1 publication Critical patent/WO1993000430A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes

Definitions

  • NUCLEOTIDE SEQUENCES CAPABLE OF HYBRIDIZING WITH THE NOV CHICKEN GENE
  • the invention relates to nucleotide sequences and the corresponding amino acid sequences. It also relates to obtaining these sequences and their applications.
  • nephroblastoma induced by the avian myeloblastosis helper virus is an animal model of Wilms' tumor in children. Although these two types of tumors have different ethiologies, no virus having been associated until now with the development of human nephroblastoma, it is conceivable that the study, at the molecular level of viral-induced nephroblastomas, can make it possible to characterize parameters that are difficult to access in the human system.
  • the inventors' studies concerning such avian nephroblastomas induced by MAV have enabled them to characterize in the chicken an embryonic gene called the nov gene, the expression of which proves to be stimulated at variable levels in tumors, but which is extinguished in cells. normal adult kidney.
  • the inventors established the partial nucleotide sequence of the DNAs and the complete nucleotide sequence of the cDNA. Specific molecular probes have been established based on this sequence and used to detect the presence and expression of homologous genes in various human cell types.
  • the invention therefore aims to provide new nucleotide sequences of a gene involved in particular in tumor cells.
  • the invention further relates to the corresponding coded proteins and the polyclonal and monoclonal antibodies directed against these proteins.
  • the invention further relates to the use of these sequences, proteins and antibodies in biological applications, in particular in detection tests.
  • nucleotide sequences of the invention are characterized in that they contain a sequence of nucleotides capable of hybridizing, under stringent conditions (50% of formamide 5 XSCC) f with one or more sequences of the hen nov gene of which the cDNA exhibits the nucleotide sequence (I), more particularly with the sequence (II).
  • the entire nucleotide sequence of the hen nov cDNA clone is formed by 1975 bp and includes at least 5 exons.
  • This sequence includes an open reading frame of 1.0 kb, coding for a potential protein of 32300 Da, going from nucleotide 24 to nucleotide 1076.
  • This open reading frame is followed by 899 bp of 3 'non-coding sequences which contain two potential pattern signals AATAAA polyadenylation at position 1914 and 1932.
  • This hen nov gene is overexpressed in avian nephroblastomas induced by MAV studied by the inventors.
  • Hybridization experiments carried out under stringent conditions defined above show that, unexpectedly, homologous sequences of the hen nov gene exist in the human genome.
  • the isolated homologous sequences in humans or animals, can be used for screening libraries made from m-RNA, and make it possible to isolate cDNAs and thus to identify the other exons of genes of the same family. These exons and the genes which contain them, as well as the corresponding coded proteins, also form part of the invention.
  • Nucleotide sequences of the invention are more particularly characterized in that they comprise or that they are formed by a sequence of nucleotides capable of hybridizing, under the stringent conditions mentioned above, with at least part of the second exon of the hen nov gene which comprises the nucleotide sequence (III).
  • the invention relates in particular to the nucleotide sequences comprising the genetic information for coding for a protein having a homology of approximately 70% with the protein fragment, corresponding to the second exon of the hen nov gene, corresponding to the sequence (IV) .
  • the nucleotide sequences capable of hybridizing with the sequence (III) above are also characterized in that they comprise at least part of a PstI fragment of approximately 600 bp as obtained from a plasmid subclone, derived from a recombinant clone isolated from a human placenta DNA library.
  • the enzyme restriction map of the recombinant clone, as well as that of the derived plasmid subclone containing the nucleotide sequence in question, are shown in FIG. 2A.
  • Such sequences are characterized in that they code for the chain of amino acids (V).
  • the different sequences mentioned above more particularly comprise at least part of the following nucleotide sequence (VI), corresponding to the Pst I fragment mentioned above, more particularly of the sequence (VII).
  • the sequence (VII) comprises 225 nucleotides with approximately 70% homology with exon 2 of the hen nov gene.
  • nucleotide sequences of the invention are characterized in that they are formed by or that they comprise a sequence of nucleotides capable of hybridizing, under the stringent conditions mentioned above, with at least part of the third exon of the hen nov gene, which includes the nucleotide sequence (VIII).
  • Sequences of the type defined above include the genetic information to code for a protein having at least about 73% homology with the potential protein fragment of the third exon of the hen nov gene corresponding to the sequence (I).
  • sequences are also characterized in that they comprise at least part of a PstI fragment of approximately 800 bp and of a PstI fragment of 2 kb as obtained from a plasmid subclone derived from a recombinant clone isolated from a human placenta DNA bank.
  • the enzymatic restriction map of the recombinant clone as well as of the derived plasmid subclone containing the nucleotide sequence in question is represented in FIG. 2A.
  • sequences comprising the genetic information for coding for a protein having the amino acid sequence (X). It will be observed that this amino acid sequence can be demonstrated in humans.
  • amino acid sequences more particularly comprise at least part of the nucleotide sequence (XI), more particularly of the sequence (XII).
  • nucleotide sequences of the invention are characterized in that they comprise or that they are formed by a sequence of nucleotides capable of hybridizing, under the stringent conditions mentioned above, with at least part of the fourth exon of the hen nov gene, which includes the nucleotide sequence (XIII).
  • the invention relates to the nucleotide sequences comprising the genetic information to code for a protein having a homology of approximately 85% with the protein fragment corresponding to the fourth exon of the hen nov gene corresponding to the sequence (XIV).
  • Such sequences capable of hybridizing with at least part of the above chain (XIII), are also characterized in that they comprise at least, part of a HincII fragment of approximately 400 bp, as obtained according to the methods mentioned above for the other restriction fragments (see FIG. 2B).
  • these sequences are also characterized in that they code for the chain of amino acids (XV).
  • sequences mentioned above in connection with the fourth exon of the hen nov gene more particularly comprise at least part of the nucleotide sequence (XVI), corresponding to the HincII fragment mentioned above, more particularly of sequence XVII.
  • nucleotide sequences are characterized in that they comprise or are formed by a sequence of nucleotides capable of hybridizing with at least part of the first exon of the hen nov gene which includes the nucleotide sequence XVIII.
  • sequences are characterized in that they contain the genetic information to code for a protein having a homology of approximately 30% with the protein fragment corresponding to the first exon of the hen nov gene responding to the sequence (XIX).
  • Such sequences are also characterized in that they code for the chain of amino acids (XX).
  • sequences defined above in relation to the first exon of the hen nov gene more particularly comprise at least part of the nucleotide sequence (XXI).
  • nucleotide sequences of the invention are characterized in that they are formed by, or that they comprise, a sequence of nucleotides capable of hybridizing, under the stringent conditions mentioned above, with at least part third and fourth exons of the hen nov gene which comprise the nucleotide sequence (XXII).
  • sequences are further characterized in that they encode a protein fragment responding to the sequence (XXIII) following amino acids.
  • sequences are also characterized in that they comprise at least part of a PstI fragment of approximately 700 bp as obtained according to the protocol mentioned above (see FIG. 2B).
  • Sequences of the type of those of the PstI fragment of 700 bp above are more particularly characterized in that they are formed by or that they comprise a chain of nucleotides capable of hybridizing under the stringent conditions defined above, with at least part of the third exon of the hen nov gene which comprises the sequence ( XXIV).
  • nucleotide sequences of the invention contain the genetic information to code for a protein having at least about 60% homology with the potential protein fragment of the third exon of the hen nov gene, this fragment responding to the sequence (XXV).
  • sequences comprising the genetic information for coding for a protein having the amino acid sequence (XXVI).
  • sequences more particularly comprise at least part of the nucleotide sequence (XXVII), more particularly of the sequence (XXVIII).
  • nucleotide sequences of the invention are characterized in that they comprise or that they are formed by a sequence of nucleotides capable of hybridizing, under the stringent conditions mentioned above, with at least part of the fourth exon of the hen nov gene, which includes the nucleotide sequence (XXIX).
  • the invention relates to nucleotide sequences containing the genetic information to code for a protein having a homology of approximately 80% with the protein fragment corresponding to the fourth exon of the hen nov gene, this fragment corresponding to the sequence (XXX). . They are in particular sequences comprising the genetic information for coding for a protein having the sequence (XXXI).
  • sequences are formed by or more particularly comprise the nucleotide sequence (XXXII).
  • the invention relates to a recombinant sequence comprising one of the sequences defined above, optionally associated with a promoter capable of controlling the transcription of the sequence and a DNA sequence coding for the termination signals of the transcript.
  • the invention also relates to the promoter sequences of the genes comprising the nucleotide sequences defined above.
  • This promoter sequence which corresponds to the sequence / Y IU; is located in a 2.2 kb PsTI-Hind III fragment and comprises the 283 nucleotides upstream at the start of the first exon.
  • the promoter sequence of the human nov gene is characterized in that it comprises several consensus sequences of different transcription factors, such as NF1 (TGGCCTTCTGCCAATC), API (TGACTAA) and Spl (GCCACTCCCC) •.
  • the invention also comprises a sequence of twenty repetitions of TG motifs which can constitute a polymorphism sequence, conferring an interest on this sequence as a polymorphism marker.
  • the invention also relates to the promoter sequence of the CTGF gene identified in the EcoRI - PstI ragment of approximately 700 bp, which corresponds to the sequence (XX lA-0-
  • This sequence is characterized in that it includes sites for binding transcription factors such as SRF (CCTAAAAAGG), API (TGAATCA), Spl (CCCGCCC), a potential tl protein binding site (CGCCCCGGC) and a site NF kappa B (GAGAGCCCC). It also includes a basic TATA (TATAAAA).
  • SRF CCTAAAAAGG
  • API TGAATCA
  • Spl CCCGCCC
  • CGCCCCGGC potential tl protein binding site
  • GGAGCCCC site NF kappa B
  • TATAAAA basic TATA
  • ⁇ X J is also part of the invention.
  • This sequence is contained in a Smal-Xhol fragment of approximately 1 kb which comprises consensus sequences of different transcription factors as well as a base TATA. It is characterized in particles in that it comprises the following sites for attachment of factor Spl: GGGGGCGGGG, CCCCCGCCTC, Ap2: CCGCAGGC, GGCGGGGC, GGGTCCC.
  • GGCAGGTGG NF kappa E2 factor
  • GGGAGTTTC NFKB factor
  • the bases of the nucleotide sequences under consideration may be in a different order from that found in the genes and / or that these bases may, where appropriate, be substituted.
  • the corresponding sequences fall within the scope of the invention, when a fragment of these sequences used as a probe gives a characteristic and unequivocal response with regard to the ability to recognize the presence of genes coding for proteins as defined above. above expressed in tumor cells.
  • the invention also targets, as new products, the RNAs corresponding to the different sequences defined above and the complementary sequences of the different defined nucleotide sequences.
  • the invention also relates to recombinant cloning and expression vectors capable of transforming an appropriate host cell, comprising at least part of a nucleotide sequence as defined above under the control of regulatory elements allowing its expression.
  • strains of transformed or transfected microorganisms also fall within the scope of the invention. These strains comprise one of the nucleotide sequences defined above or also a recombinant vector as defined above.
  • Amino acid sequences homologous to those encoded by exon 2, which contain the IGF growth factor binding site are of particular interest, since the IGFII gene, which is found in humans on chromosome llpl5 , is overexpressed in certain Wilms tumors and could therefore be implicated in this pathology.
  • proteins of the invention which contain such a motif.
  • the proteins of the invention are also characterized in that they are obtained by transformation of host cells using a recombinant vector as defined above, culturing, in an appropriate medium, of the transformed host cells or transfected and recovery of the protein from these cells or directly from the culture medium.
  • proteins of the invention and their fragments which can also be obtained by chemical synthesis, advantageously have a high degree of purity and are used to form, according to conventional techniques, polyclonal antibodies.
  • polyclonal antibodies as well as monoclonal antibodies capable of specifically recognizing an epitope of the above proteins, or of a fragment of these proteins, are also targeted by the invention.
  • the invention further relates to the biological applications of the nucleotide sequences, the corresponding proteins and monoclonal or polyclonal antibodies.
  • the invention therefore relates to detection probes characterized in that they comprise at least part of a nucleotide sequence defined above.
  • the DNA fragment used as probe has a sufficient number of nucleotides to obtain the required specificity and the formation of a stable hybrid.
  • Probes suitable for this type of detection are advantageously labeled with a radioactive element or any other group allowing its recognition in the hybrid state with the preparation containing the nucleotides to be studied.
  • these probes are brought into contact with the biological sample to be tested or their nucleic acids, under conditions permitting possible hybridization of the nucleotide sequence of the probe with a complementary sequence, possibly contained in the product studied.
  • the first method according to the conventional technique, depositing a quantity v aliquot of denatured DNA on nitrocellulose membranes.
  • the second method comprises the electrophoretic separation in agarose gel of the DNA fragments generated after treatment of the DNA with restriction enzymes, the transfer after alkaline denaturation on appropriate membranes and their hybridization with the probe under the usual conditions.
  • probes constitute tumor markers by allowing the early detection of the expression of the gene containing said nucleotide sequences, which normally is not or little expressed in the corresponding normal tissues.
  • the invention thus provides means for assessing " tumor development and / or di erentiation.
  • Detection for the specific identification of DNAs can also be carried out by DNA amplification techniques (PCR) as described in US patents 4683202 and 4683195 in the name of Cetus Corportation.
  • PCR DNA amplification techniques
  • nucleotide sequences defined above and spaced approximately 200 to 250 nucleotides.
  • One of the sequences is capable of binding to a nucleotide sequence of one of the strands of the DNA fragment to be amplified and located at one of the ends of this fragment, for example at the 5 'end .
  • the other sequence is capable to bind to a nucleotide sequence of the second strand of the DNA fragment to be amplified, and is located at the end of this fragment opposite to that mentioned above (at the 3 'end, when the first ends find at end 5 ').
  • the invention also relates to a method for detecting in vitro the presence in a biological sample of sequences complementary to those defined above. This process is characterized in that it comprises the following stages:
  • nucleotide probe as defined above under conditions allowing the production of a hybridization complex formed between the probe and the desired nucleotide sequence
  • a preliminary amplification of the quantity of nucleotide sequences capable of being contained in the sample is carried out, using primers, as described above, capable respectively of binding, of one hand at the 5 'end of one strand of said nucleotide sequence and the other hand, at the 3' end of the other strand of said nucleotide sequence.
  • kits or kits comprising:
  • an insulin-like growth factor (IGF) binding sequence is advantageously used according to the invention for the determination of proteins.
  • the proteins of the biological sample to be studied are brought into contact with an IGF comprising a labeled group, for example a radioactive group or cold probe, and the quantity of fixed product is assayed.
  • an IGF comprising a labeled group, for example a radioactive group or cold probe.
  • Radioactive probes prepared by nick translation in the presence of ⁇ dCTP 32p.
  • Nucleotide sequencing according to the dideoxy chain termination method in the presence of ⁇ dATP 35s, T7 polymerase or Sequenase (USB).
  • Example 1 Isolation of cDNA from the hen nov gene
  • RNA from fibroblasts from hen embryos of 13 days are ligated with 1 ⁇ g of lambda gt10 arm to prepare a cDNA library of normal hen fibroblasts using the kit Amersha.
  • Sequencing is carried out by the method of terminating dideoxy-nucleotide chains in the presence of ⁇ 35s dATP and of T7 polymerase (Pharmacia) or of Sequenase under the conditions described by the manufacturers.
  • Matrices are obtained from the recombinant clones M13mpl8 and M13mpl9.
  • the sequencing primers are from Biolabs, New England.
  • GC compressions are resolved using deoxy-inosine (USB).
  • FIG. 1 shows the entire 1975 bp nucleotide sequence of the cDNA clone of this new gene, overexpressed in the nephroblastomas studied, called gene no_3_ :.
  • a 1.0 kb open reading frame encoding a potential protein of 32300 Da has been identified from nucleotide 24 to nucleotide 1076. This open reading frame is followed by 899 bp of 3 'non-coding sequences which contain two potential motifs of polyadenylation signals (AATAAA) at positions 1914 and 1932.
  • AATAAA polyadenylation signals
  • the potentially coded amino acids have also been indicated in this figure.
  • the potential nov polypeptide contains a hydrophobic nucleus characteristic of a peptide signal at its amino terminus (with 6 leucines). This nov protein is devoid of other hydrophobic regions present in the trans-membrane proteins, it is likely that it is secreted.
  • the nov protein also contains the consensus motif GCGCCXXC of proteins binding insulin-like growth factors (IGF) and a total of 39 non-clustered cysteine residues.
  • IGF insulin-like growth factors
  • F -o lP. 2 isolation in human cells of nucleotide sequences related to the hen nov gene.
  • Example 3 Isolation of nucleotide sequences related to the hen nov gene. From a library of human placenta DNA, two groups of recombinant lambda gtll clones are isolated using the radiolabeled pClK probe.
  • the human nucleotide sequences homologous to those of the hen nov gene are located in a 7.0 kb BamHI-HindIII DNA fragment of the clone Hu92 and those belonging to the CTGF gene in a 6.6 kb Sacl DNA fragment from the clone Hu93.
  • the black blocks represent human exonic regions.
  • pBH7 and pS6 clones make it possible to more precisely locate the homologous sequences of the hen nov gene and the sequences of the CTGF gene.
  • the first are located on the one hand in a PstI DNA fragment of 600 bp (E2), on the other hand in a PstI fragment of 800 bp (E3), and in a HincII fragment of 400 bp (E4).
  • the pBH7 probe corresponds to the HindIII-BamHI fragment.
  • FIG. 2B The location of the first, second, third, fourth and fifth human exons at GTGF are shown in Figure 2B (respective designations E1, E2, E3, E4, and E5).
  • the use of the PstI fragments of purified DNA as probes in Southern hybridization experiments with the EcoRI fragments of Example 2 leads to the sole detection of the EcoRI DNA fragment of 12 kb with PB06 and of the EcoRI fragment of 15 kb with PSP07 demonstrating that the sequences of PBP06 and PSP07 correspond to a subset of the nov exons of chicken cDNA.
  • Rv-am li ⁇ A Detection of RNA of the human genome related to the hen nov gene.
  • Neuroblastoma 1 Neuroblastoma 162
  • results obtained show that the human gene homologous to the hen nov gene and the CTGF gene belonging to the same family are * expressed according to the tissues or lines in the form of different RNA species detected either by the two probes, or by a only one of them.
  • the 7.4 kb RNA species expressed by certain tissues and lines appears to be recognized only by the PSP07 probe.
  • CTGGTC C A G ACA-CAGAGTGGAGCGCCTGTTCCAAGACCTGTGGGATGGGCAT
  • CTGCAGGCAT CCCGTAAGGA CCCCACGCTT GCAGCCCTGG TTGGAACGGT CAGGGTGGAG

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Abstract

Les séquences de nucléotides de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles renferment un enchaînement de nucléotides capable de s'hybrider, dans des conditions stringentes (50 % de formamide, 5XSC) avec une ou plusieurs séquences du gène nov de poule dont l'ADNc comporte l'enchaînement de nucléotides représenté sur la figure. Ces séquences sont utilisables comme sondes de détection de séquences complémentaires pour l'évaluation du développement et/ou de la différentiation de tumeurs.

Description

SEQUENCES DE NUCLEOTIDES, CAPABLE DE S'HYBRIDER AVEC LE GENE NOV DE POULE
L'invention a pour objet des séquences de nucleotides et les séquences d'acides aminés correspondantes. Elle concerne également l'obtention de ces séquences et leurs applications.
Il est admis depuis de nombreuses années que le néphroblastome induit par le virus auxiliaire de la myéloblastose aviaire (MAV) constitue un modèle animal de la tumeur de Wilms chez l'enfant. Bien que ces deux types de tumeurs aient des éthiologies différentes, aucun virus n'ayant été associé jusqu'à présent au développement du néphroblastome humain, on conçoit que l'étude, au niveau moléculaire des néphroblastomes viro-induits, peut permettre de caractériser des paramètres difficilement accessibles dans le système humain.
Les études des inventeurs concernant de tels néphroblastomes aviaires induits par le MAV leur ont permis de caractériser chez la poule un gène embryonnaire appelé gène nov dont 1'expression s'avère stimulée à des niveaux variables dans les tumeurs, mais qui est éteint dans les cellules de rein adulte normal.
En développant leurs travaux dans ce domaine, les inventeurs ont élaboré des outils leur permettant d'étudier l'expression de gènes homologues dans les tumeurs humaines et dans certains types cellulaires.
Ainsi, en clonant les séquences désoxyribonu- cléiques et un ADN complémentaire correspondant au gène nov des cellules normales de poule, les inventeurs ont établi la séquence nucléotidique partielle des ADN et la séquence nucléotidique complète de l'ADNc. Des sondes moléculaires spécifiques ont été établies sur la base de cette séquence et utilisées pour détecter la présence et l'expression de gènes homologues dans divers types cellulaires humains.
L'invention a donc pour but de fournir de nouvelles séquences de nucleotides d'un gène impliqué notamment dans les cellules tumorales.
Elle a également pour but de fournir des moyens pour l'isolement de ces séquences.
L'invention vise en outre les protéines codées correspondantes et les anticorps polyclonaux et monoclonaux dirigés contre ces protéines.
L'invention vise de plus 1'utilisation de ces séquences, protéines et anticorps dans des applications biologiques, en particulier dans des tests de détection.
Les séquences de nucleotides de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles renferment un enchaînement de nucleotides capable de s'hybrider, dans des conditions stringentes (50 % de formamide 5 XSCC) f avec une ou plusieurs séquences du gène nov de poule dont l'ADNc présente 1'enchaînement de nucleotides (I), plus spécialement avec l'enchaînement (II).
Les enchaînements des séquences de nucleotides et de protéines auxquels il est fait référence dans la description et les revendications sont donnés en fin de description.
La séquence nucléotidique entière du clone d'ADNc nov de poule est formée de 1975 pb et comprend au moins 5 exons. Cette séquence comprend un cadre ouvert de lecture de 1,0 kb, codant pour une protéine potentielle de 32300 Da, allant du nucleotide 24 au nucleotide 1076. Ce cadre ouvert de lecture est suivi de 899 pb de séquences 3' non codantes qui contiennent deux signaux de motifs potentiels de polyadénylation AATAAA en position 1914 et 1932. Ce gène nov de poule est surexprimé dans des néphroblastomes aviaires induits par MAV étudiés par les inventeurs.
Les expériences d'hybridation réalisées dans des conditions stringentes définies ci-dessus montrent que, de manière inattendue, des séquences homologues du gène nov de poule existent dans le génome humain.
Les séquences homologues isolées, chez l'homme ou l'animal, sont utilisables pour le criblage de banques réalisées à partir d'ARN-m, et permettent d'isoler des ADNc et ainsi d'identifier les autres exons des gènes de la même famille. Ces exons et les gènes qui ^es renferment, ainsi que les protéines codées correspondantes font également partie de l'invention.
On a indiqué ci-dessus que les expériences d'hybridation étaient réalisées dans des conditions stringentes, ce qui permet d'isoler des séquences présentant de fortes homologies avec celles des sondes.
Ces expériences peuvent être également réalisées dans des conditions non stringentes, en réduisant la quantité de formamide, de sel et/ou le temps de lavage, comme décrit dans "A practical guide to molecular cloning", second édition, B. Perbal, John Wiley and Sons, New York, 1988. Les séquences isolées présenteront alors une homologie moins forte que précédemment avec les séquences des sondes et conduiront à l'identification d'exons présentant moins de séquences communes.
Des séquences de nucleotides de 1'invention sont plus particulièrement caractérisées en ce qu'elles comprennent ou qu'elles sont formées par un enchaînement de nucleotides capables de s'hybrider, dans les conditions stringentes évoquées ci-dessus, avec au moins une partie du deuxième exon du gène nov de poule qui comprend la séquence nucléotidique (III).
Les lettres indiquées dans ces enchaînements présentent les significations conventionnelles figurant dans l'ouvrage de Perbal cité plus haut.
L'invention vise en particulier les séquences nucléotidiques comportant l'information génétique pour coder pour une protéine ayant une homologie d'environ 70 % avec le fragment de protéine, correspondant au deuxième exon du gène nov de poule, répondant à la séquence (IV).
Les séquences de nucleotides capables de s'hybride-r avec l'enchaînement (III) ci-dessus sont également caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une partie d'un fragment PstI d'environ 600 pb tel qu'obtenu à partir d'un sous-clone plasmidique, dérivé d'un clone recombinant isolé d'une banque d'ADN de placenta humain. La carte de restriction enzymatique du clone recombinant, ainsi que celle du sous-clone plasmidique dérivé renfermant la séquence nucléotidique en question, sont représentées sur la figure 2A.
De telles séquences sont caractérisées en ce qu'elles codent pour l'enchaînement d'acides aminés (V).
On notera la présence, dans ces séquences d'acides aminés rencontrées chez l'homme, d'une séquence consensus de liaison aux facteurs de croissance du type insuline (IGF). Cette séquence apparaît donc conservée chez l'homme.
Les différentes séquences évoquées ci-dessus comportent plus particulièrement au moins une partie de l'enchaînement nucléotidique (VI) suivant, correspondant au fragment Pst I mentionné plus haut, plus spécialement de 1'enchaînement (VII). L'enchaînement (VII) comporte 225 nucleotides avec 70 % d'homologie environ avec 1'exon 2 du gène nov de poule.
D'autres séquences nucléotidiques de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont formées par ou qu'elles comprennent un enchaînement de nucleotides capables de s'hybrider, dans les conditions stringentes évoquées ci-dessus, avec au moins une partie du troisième exon du gène nov de poule, qui comprend la séquence nucléotidique (VIII).
Des séquences du type défini ci-dessus comportent l'information génétique pour coder pour une protéine ayant une homologie d'au moins 73 % environ avec le fragment de protéine potentiel du troisième exon du gène nov de poule répondant à la séquence (I ).
Ces séquences sont également caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une partie d'un fragment PstI d'environ 800 pb et d'un fragment PstI de 2 kb tels qu'obtenus à partir d'un sous-clone plasmidique dérivé d'un clone recombinant isolé d'uhe banque d'ADN de placenta humain. La carte de restriction enzymatique du clone recombinant ainsi que du sous-clone plasmidique dérivé renfermant la séquence nucléotidique en question est représentée sur la figure 2A.
Il s'agit en particulier de séquences comportant 1'information génétique pour coder pour une protéine ayant la séquence (X) d'acides aminés. On observera que cette séquence d'acides aminés peut être mise en évidence chez 1'homme.
Ces séquences d'acides aminés comportent plus particulièrement au moins une partie de l'enchaînement nucléotidique (XI), plus particulièrement de l'enchaînement (XII). D'autres séquences de nucleotides de 1'invention sont caractérisées en ce qu'elles comprennent ou qu'elles sont formées par un enchaînement de nucleotides capables de s'hybrider, dans les conditions stringentes évoquées ci- dessus, avec au moins une partie du quatrième exon du gène nov de poule, qui comprend la séquence nucléotidique (XIII).
L'invention vise les séquences de nucleotides comportant l'information génétique pour coder pour une protéine ayant une homologie d'environ 85 % avec le fragment de protéine correspondant au quatrième exon du gène nov de poule répondant à la séquence (XIV).
De telles séquences, capables de s'hybrider avec au moins une partie de l'enchaînement (XIII) ci-dessus, sont également caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins, une partie d'un fragment HincII d'environ 400 pb, tel qu'obtenu selon les méthodes évoquées ci-dessus pour les autres fragments de restriction (voir figure 2B).
Selon un autre "aspect, ces séquences sont également caractérisées en ce qu'elles codent pour 1'enchaînement d'acides aminés (XV).
Les séquences évoquées ci-dessus en rapport avec le quatrième exon du gène nov de poule comportent plus particulièrement au moins une partie de 1'enchaînement nucléotidique (XVI), correspondant au fragment HincII mentionné plus haut, plus particulièrement de l'enchaînement XVII.
D'autres séquences de nucleotides encore, sont caractérisées en ce qu'elles comprennent ou qu'elles sont formées par un enchaînement de nucleotides capables de s'hybrider avec au moins une partie du premier exon du gène nov de poule qui comprend la séquence nucléotidique XVIII.
Selon au autre aspect, de telles séquences sont caractérisées en ce qu*elles comportent 1'information génétique pour coder pour une protéine ayant une homologie d'environ 30 % avec le fragment de protéine correspondant au premier exon du gène nov de poule répondant à la séquence (XIX).
De telles séquences sont également caractérisées en ce qu'elles codent pour l'enchaînement d'acides aminés (XX).
Les séquences définies ci-dessus en rapport avec le premier exon du gène nov de poule comportent plus particulièrement au moins une partie de 1'enchaînement nucléotidique (XXI).
D'autres séquences nucléotidiques de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont formées par, ou qu'elles comprennent, un enchaînement de nucleotides capables de s'hybrider, dans les conditions stringentes évoquées ci-dessus, avec au moins une partie des troisième et quatrième exons du gène nov de poule qui comprennent la séquence nucléotidique (XXII).
De telles séquences sont encore caractérisées en ce qu'elles codent pour un fragment de protéine répondant à l'enchaînement (XXIII) suivant d'acides aminés.
Ces séquences sont également caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une partie d'un fragment PstI d'environ 700 pb tel qu'obtenu selon le protocole évoqué plus haut (voir figure 2B).
Des séquences du type de celles du fragment PstI de 700 pb ci-dessus sont plus particulièrement caractérisées en ce qu'elles sont ormées par ou qu'elles comprennent un enchaînement de nucleotides capable de s'hybrider dans les conditions stringentes définies ci- dessus, avec au moins une partie du troisième exon du gène nov de poule qui comprend la séquence (XXIV).
D'autres séquences de nucleotides de l'invention comportent l'information génétique pour coder pour une protéine ayant une homologie d'au moins 60 % environ avec le fragment de protéine potentiel du troisième exon du gène nov de poule, ce fragment répondant à la séquence (XXV).
Il s'agit en particulier de séquences comportant l'information génétique pour coder pour une protéine ayant la séquence (XXVI) d'acides aminés.
On observera que cette séquence peut être mise en évidence chez l'homme. Ces séquences comportent plus particulièrement au moins une partie de l'enchaînement nucléotidique (XXVII), plus particulièrement de l'enchaînement (XXVIII).
D'autres séquences de nucleotides de 1'invention sont caractérisées en ce qu'elles comprennent ou qu'elles sont formées par un enchaînement de nucleotides capables de s'hybrider, dans les conditions stringentes évoquées ci- dessus, avec au moins une partie du quatrième exon du gène nov de poule, qui comprend la séquence nucléotidique (XXIX).
L'invention vise les séquences de nucleotides comportant l'information génétique pour coder pour une protéine ayant une homologie d'environ 80 % avec le fragment de protéine correspondant au quatrième exon du gène nov de poule, ce fragment répondant à la séquence (XXX). Il s'agit en particulier de séquences comportant 1'information génétique pour coder pour une protéine ayant la séquence (XXXI).
Ces séquences sont formées par ou comprennent plus particulièrement l'enchaînement nucléotidique (XXXII).
Selon un autre aspect, l'invention vise une séquence recombinante comprenant 1'une des séquences définies ci-dessus, le cas échéant associée à un promoteur capable de contrôler la transcription de la séquence et une séquence d'ADN codant pour les signaux de terminaison de la transcription.
L'invention vise également les séquences promotrices des gènes comportant les séquences nucléotidiques définies ci-dessus.
Elle vise en particulier au moins une partie de la séquence promotrice du gène nov humain dont les trois et quatre sont donnés sur la figure 2A. Cette séquence promotrice qui correspond à 1'enchaînement / Y IU ; est localisée dans un fragment PsTI-Hind III de 2,2 kb et comprend les 283 nucleotides en amont au début du premier exon.
La séquence promotrice du gène nov humain est caractérisée en ce qu'elle comporte plusieurs séquences consensus de différents facteurs de transcription tels que NF1 (TGGCCTTCTGCCAATC), API (TGACTAA) et Spl (GCCACTCCCC)• .
Elle comprend également une séquence de vingt répétitions de motifs TG qui peut constituer une séquence de polymorphisme, conférant un intérêt à cette séquence comme marqueur de polymorphisme. L'invention vise également la séquence promotrice du gène CTGF identifiée dans le ragment EcoRI - PstI de 700 pb environ, qui correspond à l'enchaînement (XX lA-0-
Cette séquence est caractérisée en ce qu'elle comporte des sites de fixation des facteurs de transcription tels que SRF (CCTAAAAAGG), API (TGAATCA), Spl (CCCGCCC), un site potentiel de fixation à la protéine tl (CGCCCCGGC) et un site NF kappa B (GAGAGCCCC). Elle comporte également une TATA base (TATAAAA).
La séquence promotrice du gène nov de poule répondant à l'enchaînement .^ X Jfait également partie de l'invention.
Cette séquence est contenue dans un fragment Smal- Xhol d'environ 1 kb qui comporte des séquences consensus de différents facteurs de transcription ainsi qu'une TATA base. Elle est caractérisée en particules en ce qu'elle comprend les sites suivants de fixation dx facteur Spl : GGGGGCGGGG, CCCCCGCCTC, Ap2 : CCGCAGGC, GGCGGGGC, GGGTCCC.
Elle comprend également un site de fixation du facteur NF kappa E2 (GGCAGGTGG) et du facteur NFKB (GGGAGTTTC).
Il est entendu que les bases des séquences de nucleotides considérées peuvent être dans un ordre différent de celui trouvé dans les gènes et/ou que ces bases peuvent être, le cas échéant, substituées. Les séquences correspondantes entrent dans le cadre de l'invention, dès lors qu'un fragment de ces séquences utilisé comme sonde donne une réponse caractéristique et non équivoque quant à la capacité de reconnaître la présence de gènes codant pour des protéines telles que définies ci-dessus exprimées dans les cellules tumorales. L'invention vise également en tant que nouveaux produits les ARN correspondant aux différentes séquences définies ci-dessus et les séquences complémentaires des différents enchaînements nucléotidiques définis.
L'invention se rapporte également aux vecteurs recombinants de clonage et d'expression capables de transformer une cellule hôte appropriée, comportant au moins une partie d'une séquence de nucleotides telle que définie ci-dessus sous le contrôle d'éléments de régulation permettant son expression.
Les souches de microorganismes transformées ou transfectées entrent également dans le cadre de l'invention. Ces souches comportent l'une des séquences de nucleotides définies ci-dessus ou encore un vecteur recombinant tel que défini précédemment.
Elle vise également les séquences d'acides aminés correspondant, selon le code génétique universel, aux séquences de nucleotides définies plus haut, et les protéines exprimées par les gènes comportant ces séquences.
Les séquences d'acides aminés homologues à celles codées par l'exon 2, qui contiennent le site de liaison aux facteurs de croissance IGF présentent un intérêt particulier, étant donné que le gène IGFII, qui se trouve chez l'homme sur le chromosome llpl5, est surexprimé dans certaines tumeurs de Wilms et pourrait donc être impliqué dans cette pathologie.
Dès lors que -le motif consensus des protéines se liant à 1'IGF joue une rôle important dans le développement des néphroblastomes en conjonction avec la dérégulation de l'expression d'IGFII, on mesure l'intérêt de la détection d'une expression anormale des protéines de 1'invention qui renferment un tel motif. Les protéines de l'invention sont également caractérisées en ce qu'elles sont telles qu'obtenues par transformation de cellules hôtes au moyen d'un vecteur recombinant comme défini ci-dessus, mise en culture, dans un milieu approprié, des cellules hôtes transformées ou transfectées et récupération de la protéine à partir de ces cellules ou directement à partir du milieu de culture.
La production de ces protéines par un tel procédé fait également partie de l'invention.
Les protéines de l'invention et leurs fragments, qui peuvent être également obtenus par synthèse chimique, présentent avantageusement un degré de pureté élevé et sont utilisés pour former, selon les techniques classiques, des anticorps polyclonaux.
De tels anticorps polyclonaux, ainsi que les anticorps monoclonaux capables de reconnaître spécifiquement un épitope des protéines ci-dessus, ou d'un fragment de ces protéines, sont également visés par l'invention.
L'invention vise en outre les applications biologiques des séquences de nucleotides, des protéines correspondantes et des anticorps monoclonaux ou polyclonau .
Ces applications comprennent l'élaboration, à partir de fragments intragéniques purifiés, ou d'ARN correspondants, de sondes moléculaires pour rechercher la présence éventuelle de- séquences de nucleotides apparentées au gène nov dans divers types cellulaires.
L'élaboration de ces sondes comprend, notamment, la dénaturation des séquences double-brin pour obtenir une séquence monobrin. Les essais effectués pour détecter la présence de séquences complémentaires dans diverses tumeurs et tissus humains ont mis en évidence la grande spécificité de ces fragments intragéniques.
L'utilisation de ces sondes a ainsi permis de montrer que le gène renfermant les séquences nucléotidiques définies ci-dessus est exprimé dans plusieurss types de cellules humaines, y compris certaines tumeurs du rein.
L'invention vise donc des sondes de détection caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une partie d'une séquence de nucleotides définie ci-dessus.
Toute sonde ne se distinguant de la précédente, au niveau de sa séquence de nucleotides, que par des substitutions ou altérations de nucleotides n'entraînant pas de modification de ses propriétés d'hybridation avec le gène humain apparenté au gène nov de poule comme défini plus haut entre dans le cadre de 1'invention.
Le fragment d'ADN utilisé comme sonde comporte un nombre de nucleotides suffisant pour obtenir la spécificité requise et la formation d'un hybride stable.
Il est possible d'utiliser des fragments atteignant plusieurs kb, des résultats de haute spécificité étant cependant également obtenus avec des fragments plus cours d'environ 25 à 40 nucleotides.
Des sondes appropriées pour ce type de détection sont avantageusement marquées par un élément radio-actif ou tout autre groupe permettant sa reconnaissance à 1'état hybride avec la préparation renfermant les nucleotides à étudier.
Selon les techniques classiques, ces sondes sont mises en contact avec l'échantillon biologique à tester ou leurs acides nucléiques, dans des conditions autorisant 1'hybridation éventuelle de la séquence de nucleotides de la sonde avec une séquence complémentaire, éventuellement contenue dans le produit étudié.
On peut, par exemple, avoir recours à la méthode d'hybridation sur taches ou à la méthode d'hybridation sur réplique, selon la technique de Southern. Dans la première méthode, selon la technique classique, on dépose une quantité valiquote d'ADN dénaturé sur des membranes de nitrocellulose. La deuxième méthode comprend la séparation électrophorétique en gel d'agarose des fragments d'ADNs engendrés après traitement de l'ADN par des enzymes de restriction, le transfert après denaturation alcaline sur des membranes appropriées et leur hybridation avec la sonde dans les conditions usuelles.
Ces sondes constituent des marqueurs tumoraux en permettant la détection précoce de l'expression du gène renfermant lesdites séquences nucléotidiques, qui normalement n'est pas ou peu exprimé dans les tissus normaux correspondants. L'invention fournit ainsi des moyens permettant d'évaluer " le développement et/ou la di erentiation tumorale.
La détection pour l'identification spécifique des ADN peut être également réalisée par des techniques d'amplification de l'ADN (PCR) telles que décrites dans les brevets US 4683202 et 4683195 au nom de Cetus Corportation.
Dans ces techniques, on utilise deux amorces d'environ une quinzaine' de nucleotides comprises dans l'une des séquences de nucleotides définies ci-dessus et distantes d'environ 200 à 250 nucleotides. L'une des séquences est capable de se lier à une séquence de nucleotides de l'un des brins du fragment d'ADN à amplifier et située au niveau de l'une des extrémités de ce fragment, par exemple à 1'extrémité 5' . L'autre séquence est capable de se lier à une séquence de nucleotides du deuxième brin du fragment d'ADN à amplifier, et se trouve située au niveau de 1'extrémité de ce fragment opposée à celle mentionnée plus haut (à 1'extrémité 3' , lorsque la première se trouver à 1'extrémité 5' ).
L'invention vise également un procédé de détection in vitro de la présence dans un échantillon biologique de séquences complémentaires de celles définies ci-dessus. Ce procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- la mise en contact de l'échantillon biologique à étudier avec une sonde nucléotidique telle que définie plus haut dans des conditions permettant la production d'un complexe d'hybridation formé entre la sonde et la séquence de nucleotides recherchée,
- la détection du complexe d'hybridation.
Le cas échéant, on procède à une amplification préalable de la quantité de séquences de nucleotides susceptibles d'être contenues dans l'échantillon, à l'aide d'amorces, telles que décrites ci-dessus, susceptibles respectivement de se lier, d'une part à l'extrémité 5' d'un brin de ladite séquence de nucleotides et d'autre part, à 1'extrémité 3' de 1'autre brin de ladite séquence de nucleotides.
L'utilisation d'un tel procédé représente une augmentation de sensibilité et un gain de temps considérable par rapport aux techniques classiques qui nécessitent souvent une technologie ne pouvant être mise en oeuvre que dans des services spécialisés. Il permet de plus une détection rapide et de grande spécificité des ADN et des différentes espèces d'ARNm de transcription. Ce procédé constitue un moyen de détection d'un remaniement chromosomique au niveau des gènes qui codent pour les ARN nov ou CTGF sans avoir recours à des cultures cellulaires.
Pour la mise en oeuvre d'une telle méthode de dépistage in vitro, basée sur l'utilisation de sondes nucléotidiques, on a recours avantageusement à des nécessaires ou kits comprenant :
une quantité déterminée d'une sonde nucléotidique selon l'invention,
un milieu approprié à la formation d'une réaction d'hybridation entre la séquence à détecter et la sonde et, avantageusement,
des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation formés entre la séquence de nucleotides et la sonde lors de la réaction d'hybridation.
- une quantité déterminée d'un anticorps polyclonal ou monoclonal selon l'invention,
un milieu approprié à la formation d'une réaction immunologique entre au moins une partie des produits exprimés et l'anticorps et, avantageusement,
des réactifs permettant la détection des complexes immunologiques formés lors de la réaction immunologique.
La présence dans les protéines de 1'invention d'une séquence de liaison aux facteurs de croissance du type insuline (IGF) est avantageusement mise à profit selon l'invention pour le dosage des protéines. A cet effet, on met en contact les protéines de l'échantillon biologique à étudier avec un IGF comportant un groupe marqué, par exemple un groupe radioactif ou sonde froide et on effectue le dosage de la quantité de produit fixé. On rapporte ci-après à titre d'exemples non limitatifs le clonage et le sequençage du gène nov de poule, et de séquences de nucleotides répondant aux définitions données plus haut. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 et 2,
- la figure 1 représentant la séquence d'ADNc du gène nov de poule et celle de la protéine potentielle codée
- les figures 2 A et 2 B les cartes de restriction de fragments d'ADN de 1'invention
Procédés de clonage moléculaire et sequençage rapportés dans les exemples :
purification des acides nucléiques : utilisation de dichlorométhane comme décrit dans V. Maloisel et al.. Met. Mol. Cell. Biol. 1, 245-247, 1990.
Southern et Northern blots, et autres procédés de clonage : effectués selon les protocoles standards publiés par B. Perbal dans "A practical guide to molecular cloning, second édition, B. Perbal John Wiley and Sons, New York, 1988
purification des fragments d'ADN BamHI-HindIII de 7 kb et Sacl de 6,6 kb : méthode Geneclean (Bio 101).
Sondes radioactives : préparées par nick translation en présence d'α dCTP 32p.
Sequençage des nucleotides : selon la méthode de terminaison de chaîne au didéoxy en présence d'α dATP 35s, de T7 polymérase ou de Séquenase (USB).
Exemple 1 : Isolement de 1'ADNC du gène nov de poule
25 ng d'ADNc correspondant à de l'ARN poly A de fibroblastes d'embryons de poule de 13 jours sont ligaturés avec 1 μg de bras lambda gtlO pour préparer une banque d'ADNc de fibroblastes normaux de poule en utilisant le kit d'Amersha .
Après criblage avec une sonde cellulaire dérivée d'une tumeur, on purifie 7 clones, l'insert le plus long (1,9 kb) est purifié selon la méthode de Geneclean (BIO 101) et sous-cloné au site Kpnl de Bluescript KS+ (Stratagène) pour générer le clone pClK.
Sequençage nucléotidique :
Le sequençage est réalisé par la méthode de terminaison de chaînes didéoxy-nucleotide en présence d'α 35s dATP et de polymérase T7 (Pharmacia) ou de Séquenase dans les conditions décrites par les fabricants.
Des matrices sont obtenues à partir des clones recombinants M13mpl8 et M13mpl9. Les amorces de sequençage proviennent de Biolabs, New England. Les compressions GC sont résolues en utilisant la déoxy-inosine (USB).
Caractérisation du gène cellulaire nov :
On effectue une analyse par Northern Blot d'ARN isolés de reins normaux, de fibroblastes d'embryons de poule (FEP) et de néphroblastomes en utilisant les sondes cellulaires dérivées d'une tumeur. La sonde HX1024 permet de détecter dans les FEP normaux une espèce d'ARNm de 2,2 kb dont l'expression est altérée dans tous les autres néphroblastomes. Le criblage d'une banque d'ADNc de FEP permet d'isoler un clone d'ADNc de 1,9 kb représentant 1'ARNm de 2,2 kb exprimé dans les FEP normau . On a représenté sur la figure 1 la séquence entière nucléotidique de 1975 pb du clone d'ADNc de ce nouveau gène, surexprimé dans les néphroblastomes étudiés, appelé gène no_3_:. Ce gène apparaît constitué de 5 exons. Un cadre ouvert de lecture de 1,0 kb codant pour une protéine potentielle de 32300 Da a été identifié du nucleotide 24 au nucleotide 1076. Ce cadre ouvert de lecture est suivi de 899 pb de séquences 3' non codantes qui contiennent deux motifs potentiels de signaux de polyadénylation (AATAAA) aux positions 1914 et 1932.
On a également indiqué sur cette figure les acides aminés potentiellement codés. Le polypeptide nov potentiel contient un noyau hydrophobe caractéristique d'un signal peptidique à son extrémité amino (avec 6 leucines). Cette protéine nov étant dépourvue d'autres régions hydrophobes présentes dans les protéines trans-membranaires, il est vraisemblable qu'elle est sécrétée. La protéine nov contient également le motif consensus GCGCCXXC des protéines liant les facteurs de croissance du type insuline (IGF) et un total de 39 résidus cystéine ne formant pas de cluster.
F -o lP. 2 : isolement dans des cellules humaines de séquences de nucleotides apparentées au gène nov de poule.
On effectue un Southern blot de fragments d'ADN humain digéré par EcoRI avec le clone d'ADNc du gène nov de poule pClK. On opère dans les conditions stringentes rapportées par B. Perbal (voir référence ci-dessus).
On constate que quatre fragments EcoRI s'hybrident avec des séquences du gène nov de poule. Ces fragments comportent respectivement 15, 12, 8 et 5,6 kb.
Exemple 3 : Isolement de séquences de nucleotides apparentées au gène nov de poule. A partir d'une banque d'ADN de placenta humain, on isole à 1'aide de la sonde pClK radiomarquée deux groupes de clones lambda gtll recombinants.
La carte de restriction partielle de lambda Hu92 (qui correspond à trois clones se chevauchant) et de lambda Hu93 (qui correspond à deux clones se chevauchant) et celles des sous-clones plasmidiques pBH7 et p56 sont représentées sur les figures 2A et 2B.
Les séquences de nucleotides humaines homologues à celles du gène nov de poule sont localisées dans un fragment d'ADN de 7,0 kb BamHI-HindIII du clone Hu92 et celles appartenant au gène CTGF dans un fragment d'ADN de 6,6 kb Sacl du clone Hu93.
Sur ces cartes, les enzymes de restriction sont désignées comme suit : B ≈ BglII, P = PstI, K = Kpnl, H = HindIII, S = Sacl, E = EcoRI, X = Xba, B = BamHI et Hc = Hine II. Les blocs noirs représentent les régions exoniques humaines.
Le sous-clonage de ces fragments dans les vecteurs pUC18 et pUC19, appelés respectivement clones pBH7 et pS6 permet de localiser plus précisément les séquences homologues du gène nov de poule et les séquences du gène du CTGF. Les premières sont localisées d'une part dans un fragment d'ADN PstI de 600 pb (E2), d'autre part dans un fragment PstI de 800 pb (E3), et dans un fragment HincII de 400 pb (E4). La sonde pBH7 correspond au fragment HindlII- BamHI.
La localisation des premier, deuxième, troisième, quatrième et cinquième exons humains au GTGF sont indiquées sur la figure 2B (désignations respectives El, E2, E3, E4, et E5). L'utilisation des fragments PstI d'ADN purifiés comme sondes dans des expériences d'hybridation Southern avec les fragments EcoRI de l'exemple 2 conduit à la seule détection du fragment EcoRI d'ADN de 12 kb avec PB06 et du fragment EcoRI de 15 kb avec PSP07 démontrant que les séquences de PBP06 et PSP07 correspondent à un sous- ensemble des exons nov de 1'ADNc de poule.
Rv-am liα A : Détection d'ARN du génome humain apparentés au gène nov de poule.
On rapporte dans le tableau suivant les résultats d'expériences d'hybridation Northern avec différents tissus et lignées cellulaires en utilisant comme sondes les enchaînements de formule VIII, XV et XVI ci-dessus homologues respectivement des exons E2, du gène nov de poule et E3 et E4 du gène CTGF (ces codes étant utilisés dans le tableau pour les désigner).
TISSUS ET LIGNEES CELLULAIRES SONDES
E2 E3-E4 kb de
(nov) (CTGF) l'ARNm
Moelle osseuse + (2, ) thymus (foetal) + (2,5) Foie (foetal) ( ,5; HEL
Cerveau (foetal)
Neuroblastome 1 Neuroblastome 162
Rein (foetal) Néphroblastome Bou
Figure imgf000024_0001
Tissu mammaire Tumeur mammaire gg Tumeur mammaire se
Figure imgf000024_0002
SK-BR3 (2,5) (3,5) poumon ( foetal ) coeur ( foetal ) lignée 293
Figure imgf000025_0001
MCF7 ( 7, 4 )
Carcinome embry test. 8 nt (2,7) (7,4)
Teratocarcinome test. 10 nt
Teratocarcinome test. 11 nt
Adenocarcinome U377 nt
Figure imgf000025_0002
HL60 nt (7,4)
nt = non testé
Les résultats obtenus montrent que le gène humain homologue du gène nov de poule et le gène CTGF appartenant à la même famille sont*exprimés selon les tissus ou lignées sous la forme de différentes espèces d'ARN détectés soit par les deux sondes, soit par une seule d'entre elles. L'espèce d'ARN de 7,4 kb exprimée par certains tissus et lignées n'apparaît reconnue que par la sonde PSP07.
Ces résultats indiquent que la régulation des gènes chez l'homme dépendrait de la spécificité tissulaire.
ENCHAINEMENT I
GCGGCGGGTΛGΛCGGCCGGGΛCT ΛTG GΛG ΛCG GGC GGC GGG CΛG GGG CTG CCC GTC CTG CTG CTG CTC CTG CTC CTC CTC CGG CCG TGC GAG GTG 95
ΛGC GGG CGG GΛG GCG GCG TGC CCC CGG CCC TGC GGC GGG CGC TGC CCC GCG GAG CCG CCG CGC TGC GCC CCG GGA GTG CCC GCC GTG CTG 18
GΛC GGC TGC GGC TGC TGC CTG GTG TGC GCC CGG CΛG CGC GGC GΛG ΛGC TGC TCC CCT CTG CTG CCC TGC GAC GΛG AGC GGC GGC CTC TAC 27 TGC GΛC CGC GGC CCC GΛG GΛC GGC GGC GGC GCC GGC ATC TGC ΛTG GTG CTG GAA GGG GΛC AΛC TGC GTG TTC GAT GGG ATG ATT TAC CGC 36
AΛC GGG GΛG ΛCG TTC CΛG CCC ΛGC TGC ΛΛG TΛC CAG TGC ΛCC TGC CGG GAC GGG CΛG ATC GGG TGC CTG CCC CGC TGC AAC CTG GGC CTG 45 CTG CTC CCC GGC CCC GΛC TGC CCC TTC CCG CGG AΛG ATC GAA GTC CCC GGA GAG TGC TGC GΛG AΛG TGG GTG TGC GAC CCC AGG GAT GAA 54 GTG CTC CTG GGA GGC TTT GCT ΛTG GCT GCA TΛC AGΛ CΛG GΛG GCC ACA CTT GGG ATA GAC GTG TCT GAT TCA AGT GCC AAT TGT ATT GAA 63 CAG ΛCΛ ΛCA GΛA TGG AGT GCT TGT TCC ΛΛΛ ΛGC TGT GGΛ ΛTG GGC TTT TCT ACC CGT GTT ΛCC AΛC AGA AAT CAG CAG TGT GΛG ATG GTG 72 AAG CAG ΛCΛ CGΛ CTT TGC ΛTG ΛTG ΛGΛ CCT TGT GAA ΛΛC GAA GΛG CCA TCT GAT AAG AAA GGA ΛΛΛ AAA TGT ATC CAA ACA AAG AAA TCC 81
ATG ΛΛA GCT GTT CGT TTT GΛA TΛC AΛG AAC TGC ΛCC AGT GTG CAG ACT TΛC AAA CCT CGT TAC TGT GGC CTC TGC AAT GAT GGG CGA TGC 90 TGT ACC CCA CAC ΛΛG ΛCC ΛΛΛ ΛCG ATT CΛΛ GTT GΛG TTC CGC TGT CCT CAG GGC AAA TTC CTA AAA AΛG CCA ATG ATG TTG ATC AAT ACC 99
TGT GTC TGT CΛT GGT ΛΛC TGT CCT CΛG AGT AΛC ΛΛT GCT TTC TTC CAG CCA TTA GAT CCC ATG TCT ΛGT GAA GCA AAA ATA TGAAATGTATA 10 GTTTAGGTGGCCCAΛAΛGGTATGTAGTTTGTACAAAΛCTTGACCCACAATCΛGGTGAΛTGTAATAATTGCATATGTAAAATATCTGAGATTTTTTTCTAAACAGTCTGAGTGCCTTTTT 12 TTTCCTGTAGTTTACTAΛATACCTCATGACGTTTCΛCCCCTCCAΛATGTCTTTTATTCΛTTTGΛAGGAAATTTTGTACCTTGGACAGAGCCTTCTGTTGTTTCTTGACAGTGGCATAAC 13 GΛTTACAAΛGTCAACAGCTAGTCTTTCTCTCTGAGTTTAGAGGACCTTGCCATGATTTTCAGTAGCCATAAGACTGGGCTTTTTAATAATGGATTCCTTGGGGAATGCATGATAATATG 1 TCACAΛΛΛGCTTCCΛGΛGTTTTCACTTTGAATAATGTGTACAAACACTTACACAGCCTTCTTCTTTCTGTTCAAGTTAΛATTCTTCCGGATAACTGAAAATGTTACTGATGAGAGTCTG 15 ΛATTCTTCTGGCTTΛTΛΛΛGTΛTCTTCTΛTCTGTΛCCTCTTGΛCTTTCTCTGAGGGΛTTAGTTTGCACATAGCCTCAGAAATGACATAGCTAAGATCTCGTATCTTGAAGCATAGGAGA 16
TTGATΛGÇTGATΛΛCΛΛΛTTTCTCΛTTCGTΛGCTTTΛTTAGCAGCCTΛATCCΛΛΛΛCCTΛCTGΛAGΛAAGTGTCTTACAΛGAGCTTGGTTCTAACCAGTGTCTGTCTGTAGATAAAGTA 18
GTTGTΛTGCAAΛAΛJΛ^ΛATTTCTGTΛΛΛTTCCTTTAAΛATACTΛACTGTΛTCΛGΛTGGTGCTTCΛCTTACTAGAAAGATGTTTATGTAAATAGAAACTGTATATATTGTAATATAACT 19
TTTΛTTΛGGTΛΛATΛΛΛCTTTΛTGTGΛTCΛΛΛATGΛΛΛAAAAAΛAAΛΛAΛΛΛAΛA -ig
Figure imgf000027_0001
ENCHAINEMENT II
TGC GGC GGG CGC TGC CCC GCG GΛG CCG CCG CGC TGC GCC CCG GGA GTG CCC GCC GTG CTG 18 CΛC CCC TCC CGC TCC TGC CTG GTG TGC GCC CGG CAG CGC GGC GΛG Λ6C TGC TCC CCT CTG CTG CCC TGC GAC GΛG AGC GGC GGC CTC TAC 27
TGC CΛC CGC GGC CCC GAG GΛC GGC CGC GGC GCC GGC ATC TGC ΛTG GTG CTG GAA GGG GΛC ΛΛC TGC GTG TTC GAT GCG ATG ATT TAC CGC 36
AAC GGG CAG ACG TTC ,CΛG CCC ΛGC TGC ΛΛG TAC 'CAG TGC ΛCC TGC CGC GAC GCG CAG ATC GGG TGC CTG CCC CGC TGC AAC CTG GCC CTG 15
CTG CTC CCC GCC CCC CAC TGC CCC TTC CCG CGG AAG ATC GAA GTC CCC GGA GΛG TGC TGC GAG AAG TGG GTG TGC GAC CCC ΛGG GAT GAA 54
GTG CTC CTG GGA GGC TTT GCT ATG GCT GCA TAC AGA CAG GAG GCC ACA CTT GGG ATA GAC GTG TCT GAT TCA AGT GCC AAT TCT ATT GAA 63
CAC ACA ACA GAA TGG AGT GCT TGT TCC AAA ΛGC TGT GGA ATG GGC TTT TCT ACC CGT GTT ACC AAC AGA AAT CAG CΛG TGT GAG ATG GTG 72 AAG CλG ACA CGΛ CTT TCC ΛTG ΛTG AGA CCT TGT GAA AAC GAA GAG CCA TCT GAT AAG AAA GGA AAA AAA TGT ATC CAA ACA AAG
Figure imgf000028_0001
ENCHAINEMENT III
101 111 121 131 141 151 AGGTGAGCGG GCGGGAGGCG GCGTGCCCCC GGCCCTGCGG CGGGCGCTGC CCCGCGGAGC.
161 171 181 191 201 211 CGCCGCGCTG CGCCCCGGGA GTGCCCGCCG TGCTGGACGG CTGCGGCTGC TGCCTGGTGT
221 231 241 251 261 271 GCGCCCGGCA GCGCGGCGAG AGCTGCTCCC CTCTGCTGCC CTGCGACGAG AGCGGCGGCC
281 291 301 311 321 TCTACTGCGA CCGCGGCCCC GAGGACGGCG GCGGCGCCGG CATCTGCATG
ENCHAINEMENT IV
Figure imgf000029_0001
VSGREAACPR PCGGRCPAEP PRCAPGVPAV LDGCGCCLVC ARQRGESCSP LLPCDESGGL
93 YCDRGPEDGG GAGICM
ENCHAINEMENT V
V A A T Q R C P P Q C P G R C 756 771 786
P A T P P T C A P G V R A V L 801 816 831
D G C S C C L V C A R Q R G E 846 861 876 S C S D L E P C D E S S G L Y 891 906 921
C D R S A D P S N Q T G I C T
355 365 375 385 395 405 CTGCAGCCAA CCGGCTTGTG CGCGTCCCAG GAGCGCGCTA TAAAACCTGT GCTGGGCGTG
Figure imgf000031_0001
415 425 435 445 455 465 ATCGGCAAGC ACCGGACCAG GGGGAAGGCG AGCAGTGCCA ATCTACAGCG AAGAAAGTCT
Figure imgf000031_0002
M
535 545 555 565 575 585 -2. TGTCTCGCGA AAGCAGTGCC TTTGCCTGAC CTTCCTGCTT CTCCATCTCC TGGGACAGTA x > r-\
595 605 615 625 635 645 M 3 3. AGTGGCACAC CCTTAAGATG CCCCCAAAGT TACTTTGCCC GCCTTGGTGG CCCCCATTTG M : 655 665 675 685 695 705 l-l GTCACCGGGC TCACTGCGTC TTCTGTCCCA GCTGAGTGGT TTCTCCTTGT CTCGCCTGCC
715 725 735 745 755 765 TTCAGGTCGC TGCGACTCAG CGCTGCCCTC CCCAGTGCCC GGGCCGGTGC CCTGCGACGC
775 785 795 805 815 825 CGCCGACCTG CGCCCCCGGG GTGCGCGCGG TGCTGGACGG CTGCTCATGC TGTCTGGTGT
835 845 855 865 875 885 GTGCCCGCCA GCGTGGCGAG AGCTGCTCAG ATCTGGAGCC ATGCGACGAG AGCAGTGGCC
895 905 915 925 935 945 TCTACTGTGA TCGCAGCGCG GACCCCAGCA ACCAGACTGG CATCTGCACG GGTAATCCTG
Figure imgf000031_0003
CTCCCTCTGC TGTTTGACCT CTTCTCCTGC AG
ENCHAINEMENT VII
720 730 740 750 760 '770 GTCGCTGCGA CTCAGCGCTG CCCTCCCCAG TGCCCGGGCC GGTGCCCTGC GACGCCGCCG
780 790 800 810 820 830 ACCTGCGCCC CCGGGGTGCG CGCGGTGCTG GACGGCTGCT CATGCTGTCT GGTGTGTGCC
840 850 860 870 880 890 CGCCAGCGTG GCGAGAGCTG CTCAGATCTG GAGCCATGCG ACGAGAGCAG TGGCCTCTAC
900 910 920 930 TGTGATCGCA GCGCGGACCC CAGCAACCAG ACTGGCATCT GCACGG o
ENCHAINEMENT VIII
331 341 351 361 371 381 GTGCTGGAAG GGGACAACTG CGTGTTCGAT GGGATGATTT ACCGCAACGG GGAGACGTTC
391 401 411 421 431 441
CAGCCCAGCT GCAAGTACCA GTGCACCTGC CGGGACGGGC AGATCGGGTG CCTGCCCCGC
451 461 471 481 491 501
TGCAACCTGG GCCTGCTGCT CCCCGGCCCC GACTGCCCCT TCCCGCGGAA GATCGAAGTC
511 . 521 531 541 551 561 CCCGGAGAGT GCTGCGAGAA GTGGGTGTGC GACCCCAGGG ATGAAGTGCT CCTGGGAGGC
571 TTTGCTATGG CT
ENCHAINEMENT IX
109 119 129 139 149 159
VLEGDNCVFD GMIYRNGETF QPSCKYQCTC RDGQIGCLPR CNLGLLLPGP DCPFPRKIEV
169 179 PGECCEKWVC DPRDEVLLGG FAMA
ENCHAINEMENT X
116 131 146 GCG GTA GAG GGA GAT AAC TGT GTG TTC GAT GGG GTC ATC TAC CGC A V E G D N C V F D G V I Y R 161 176 191 AGT GGA GAG AAA TTT CAG CCA AGC TGC AAA TTC CAG TGC ACC TGC S G E K F Q P S C K F Q C T C
206 221 236
AGA GAT GGG CAG ATT GGC TGT GTG CCC CGC TGT CAG CTG GAT GTG R D G Q I G C V P R C Q L D V 251 266 281 CTA CTG CCT GAG CCT AAC TGC CCA GCT CCA AGA AAA GTT GAG GTG
L L P E P N C P A P R K V E V 296 311 326
CCT GGA GAG TGC TGT GAA AAG TGG ATC TGT GGC CCA GAT GAG GAG P .G E C C E K W I C G P D E E 341
GAT TCA CTG GGA GGC CTT ACC CTT GCA G
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
ENCHAINEMENT XI
10 20 30 40 50 60 AAAAGGACTT GGGTTTTGGA ACATGCCCTC CAAATCTTAC ATAGCTTCTT CACTGTATTG
70 80 90 100 110 120 TGTTCTTGTT TTTCCTCTTC CTCTTTGCTT TTCACTTTGC TTCCCCAATA TTCTAGCGGT
130 140 150 160 170 180 AGAGGGAGAT AACTGTGTGT TCGATGGGGT CATCTACCGC AGTGGAGAGA AATTTCAGCC
190 200 210 220 230 240 co AAGCTGCAAA TTCCAGTGCA CCTGCAGAGA TGGGCAGATT GGCTGTGTGC CCCGCTGTCA 1-0
250 260 270 280 290 300 GCTGGATGTG CTACTGCCTG AGCCTAACTG CCCAGCTCCA AGAAAAGTTG AGGTGCCTGG
310 320 330 340 350 360 AGAGTGCTGT GAAAAGTGGA TCTGTGGCCC AGATGAGGAG GATTCACTGG GAGGCCTTAC
370 380 390 400 410 420 CCTTGCAGGT GAGAAACTCA ATATACCTAG GGCTGGTCAT AGTAGAGGGT AAATACAAAC
430 440 450 ATGAAGAATT TGCAATCTCT TGGATTTGAA AA
ENCHAINEMENT XII
125 135 145 155 165 . 175 GCGGTAGAGG GAGATAACTG TGTGTTCGAT GGGGTCATCT ACCGCAGTGG AGAGAAATTT
185 195 205 215 225 235 CAGCCAAGCT GCAAATTCCA GTGCACCTGC AGAGATGGGC AGATTGGCTG TGTGCCCCGC
245 255 265 275 285 295 TGTCAGCTGG ATGTGCTACT GCCTGAGCCT AACTGCCCAG CTCCAAGAAA AGTTGAGGTG
305 315 325 335 345 355 CCTGGAGAGT GCTGTGAAAA GTGGATCTGT GGCCCAGATG AGGAGGATTC ACTGGGAGGC J 365 CTTACCCTTG CAG
ENCHAINEMENT XIII
583 593 603 613 623 633 GCATACAGAC AGGAGGCCAC ACTTGGGATA GACGTGTCTG ATTCAAGTGC CAATTGTATT
643 653 663 673 683 693 GAACAGACAA CAGAATGGAG TGCTTGTTCC AAAAGCTGTG GAATGGGCTT TTCTACCCGT
703 . 713 723 733 743 753 GTTACCAACA GAAATCAGCA GTGTGAGATG GTGAAGCAGA CACGACTTTG CATGATGAGA
763 773 CCTTGTGAAA ACGAAGAGCC ATCTGATAA
ENCHAINEMENT XIV
193 203 213 223 233 243
AYRQEATLGI DVSDSSANCI EQTTEWSACS KSCGMGFSTR VTNRNQQCEM VKQTRLCMMR
253 PCENEEPSDK
ENCHAINEMENT XV
104 119 134 GCT TAC AGG CCA GAA GCC ACC CTA GGA GTA GAA GTC TCT GAC TCA A Y R P E A T L G V E V S D S 149 164 179
Figure imgf000036_0001
K S C G M G F S T R V T N R N
239 254 269
CGT CAA TGT GAG ATG CTG AAA CAG ACT CGG CTC TGC ATG GTG CGG R Q C E M L K Q T R L C M V R
284 .
CCC TGT G
Figure imgf000036_0002
Figure imgf000037_0001
ENCHAINEMENT XVI
10 20 30 40 50 60
ATCAGAGTCG AATGAGACCC AGTTTCTAAT AATGGCTGAA AAGGACCACT TTCCAATCCT
70 80 90 100 110 120
CACATTGATC CTAATATGGC TGTCTTTATT TATACATCCC ATAGCTTACA GGCCAGAAGC
130 140 150 160 170 180 CACCCTAGGA GTAGAAGTCT CTGACTCAAG TGTCAACTGC ATTGAACAGA CCACAGAGTG
190 200 210 220 230 240 GACAGCATGC TCCAAGAGCT GTGGTATGGG GTTCTCCACC CGGGTCACCA ATAGGAACCG
250 260 270 280 290 300 TCAATGTGAG ATGCTGAAAC AGACTCGGCT CTGCATGGTG CGGCCCTGTG AACAAGAGCC
310 320 330 340 350 360 AGAGCAGCCA ACAGATAAGG TAGGAGCCTG GAGGAAACCT CCCATCCTGA AGGTAATGGC
370 380 390 400 410 420 CTTGTGTCCT TGGAGCCTGG GCTTCAGAAA GTCACTGTTG CACTCTGTGA CGGAGAGAGC
430 AGCTATAGCG GGGAG
ENCHAINEMENT XVII
Figure imgf000038_0001
GCTTACAGGC CAGAAGCCAC CCTAGGAGTA GAAGTCTCTG ACTCAAGTGT CAACTGCATT
173 183 193 203 213 223 GAACAGACCA CAGAGTGGAC AGCATGCTCC AAGAGCTGTG GTATGGGGTT CTCCACCCGG
233 243 253 263 273 283 GTCACCAATA GGAACCGTCA ATGTGAGATG CTGAAACAGA CTCGGCTCTG CATGGTGCGG
293 303 313 CCCTGTGAAC AAGAGCCAGA GCAGCCAACA GATAAG
ENCHAINEMENT XVIII
33 43 53 63 73 83 TATGGAGACG GGCGGCGGGC AGGGGCTGCC CGTCCTGCTG CTGCTCCTGC TCCTCCTCCG
GCCGTGCGA
ENCHAINEMENT XIX
10 20
METGGGQGLP VLLLLLLLLR PCE
ENCHAINEMENT XX
285 300 315 ATG GCA ACC CCG GGG TTC GTT CCA CTT CCC CAC CCA GCC GAT CTC M A T P G F V P L P H P A D L ω 330 345 " CCC CCT CCT CCC TGC ACT GCA GCC AAC CGG CTT P P P P C T A A N R L
ENCHAINEMENT XXI
294 304 314 324 334 344 ATGGCAACCC CGGGGTTCGT TCCACTTCCC CACCCAGCCG ATCTCCCCCC TCCTCCCTGC
354 ACTGCAGCCA ACCGGCTT
Figure imgf000040_0001
ENCHAINEMENT XXII
TG CTG GΛA GGG GΛC ΛΛC TGC GTG TTC GAT GGG ΛTG ATT TAC CGC
ΛΛC GGG GΛG ΛCG TTC CΛG CCC AGC TGC AAG TAC CΛG TGC ACC TGC CGG GAC GGG CΛG ATC GGG TGC CTG CCC CGC TGC AΛC CTG GGC CTG CTG CTC CCC GGC CCC GΛC TGC CCC TTC CCG CGG AΛG ATC GAA GTC CCC GGA GΛG TGC TGC GΛG AΛG TGG GTG TGC GAC CCC AGG GAT GAA GTG CTC CTG GGA GGC TTT GCT ΛTG GCT GCA TAC AGA CAG GΛG GCC ACA CTT GGG ΛTA GΛC GTG TCT GAT TCA AGT GCC AAT TGT ATT GAA
CAG ΛCΛ ACΛ GΛΛ TGG ΛGT GCT TGT TCC AAA AGC TGT GGA ATG GGC TTT TCT ACC CGT GTT ACC AAC AGA AAT CAG CAG TGT GAG ATG GTG
AΛG CΛG ACA CGΛ CTT TGC ΛTG ΛTG AGA CCT TGT GΛA AΛC GAA GAG CCA TCT GAT AAG
Figure imgf000040_0002
Figure imgf000040_0003
ENCHAINEMENT XXIII
Q I P T R I P D A L D V R V P 63 78
Q C L T S A S P T P L F P S S 108 123
S P A K D G A P C I F G G T V 153 168
Y R S G Ξ S F Q S S C K Y Q C 198 213
T C L D G A V G C M P L C S M 243 258
D V R L P S P D C P F P R R V 288 303
K L P G K C C E E W V C D E P 333 346
K D Q T V G P A S R V S R V 378 393
F L * V R V V I L S Q G G S P 423 438
N C A D R T G E I P Y P G V D
468 483
H G V C V L C S R S P T G R 513 528
H V W P R P N Y D * S Q L P G 558 573
P D T E W S A C S K T C G M G
603
Y S T R V T N D N A ENCHAINEMENT XXIV
CTGCGTGTTCGATGGGATGATTTACCGCAACGGGGAGACGTTCCAGCCCAGCTGCAAGTACCAGTGCACC
350 360 370 380 390 400
190 200 210 220 230 240 250 TGCCGGGACGGGCAGATCGGGTGCCTGCCCCGCTGCAACCTGGGCCTGCTGCTCCCCGGCCCCGACTGCC 420 430 440 450 460 470
CCTTCCCGCGGAAGATCGAAG-TCCCCGGAGAGTGCTGCGAGAAGTGGGTGTGCGAC 490 500 510 520 530
ENCHAINEMENT XXV
GECCEK
Figure imgf000042_0001
ENCHAINEMENT XXVI
40 5° 60 70 80 90 100
DGAPCIFGG VYRSGESFQSSCKYQCTCLDGAVGCMPLCSMDVRLPSPDCPFPRRVK PGKCCEEWVCDE
* -*V
ENCHAINEMENT XXVII
1 ce
3 • 18 33
CAG ATC CCA ACT CGC ATC CCT GAC GCT CTG GAT GTG AGA GTG CCC
48 63 78
CAA TGC CTG ACC TCT GCA TCC CCC ACC CCT CTC TTC CCT TCC TCT 93 108 123
TCT CCA GCC AAA GAT GGT GCT CCC TGC ATC TTC GGT GGT ACG GTG
138 153 168
TAC CGC AGC GGA GAG TCC TTC CAG AGC AGC TGC AAG TAC CAC TGC
183 198 213
ACG TGC CTG GAC GGG GCG GTG GGC TGC ATG CCC CTG TGC AGC ATG 228 243 258
GAC GTT CGT CTG CCC AGC CCT GAC TGC CCC TTC CCG AGG AGG GTC
273 288 303
AAG CTG CCC GGG AAA TGC TGC GAG GAG TGG GTG TGT GAC GAG CCC
318 333 348
AAG GAC CAA ACC GTC CTT GGG CCT GCC TCG CGG GTG AGT CGA GTC
363 378 393 ττc cτc TAA GTC AGG GTC GTG ATT cτc τcc CAG GGA GGG AGT ccτ
408 423 438
AAC TGT GCC GAC CGA ACG GGG GAA ATA CCT TAT CCA GGC GTT TTA
453 468 483
CAT GGT GTT TGT GTG CTC TGC TCT CGC AGC TTA CCG ACT GGA AGA 498 513 528
CAC GTT TGG CCC AGA CCC AAC TAT GAT TAG AGC CAA CTG CCT GGT
543 558 573
CCA GAC ACA GAG TGG AGC GCC TGT TCC AAG ACC TGT GGG ATG GGC
588 603
ATC TCC ACC CGG GTT ACC AAT GAC AAC GCC TC ENCHAINEMENT XXVIII
-. r 190 200 210 220 230 240
TGCCTGGTCCAGACA-CAGAGTGGAGCGCCTGTTCCAAGACCTGTGGGATGGGCATC
260 CCAA
ENCHAINEMENT XXIX
GCTTTGCTATGGCTGCATACAGACAGGAGGCCACACTTGGGATAGACGTGTCT--G 570 580 590 600 610
TGTATTGAACAGACAACAGAATGGAGTGCTTGTTCCAAAAGCTGTGGAATGGGCTT
630 640 650 660 670 680
CCAA
ENCHAINEMENT XXX ENCHAINEMEN
TEWSACSKSCGMGFSTRVTNRN 70 80 210 220 TEWSACSKTCGMGI
ENCHAINEMENT XXXII
130 140 150 160 170 CTGCTCTCGCAGCTTACCGACTGGAAGACACGTTTGGCCCAGACCCAACTATG
0 200 210 220 230 240
CTGGTCCAGACA-CAGAGTGGAGCGCCTGTTCCAAGACCTGTGGGATGGGCAT
ENCHAINEMENT XXXIII : fragment 1
Figure imgf000045_0001
10 20 30 40 50 60
GCTTTCTTTT TAAGGAACAG TCCTTTCTTC CCAAGAGAAC TGCTCTTTCT CTCCATTCCA
70 80 90 100 110 120 l ACCATGAGGT TCTAACTAAT CCCCATACTT CACCTTCCTT GTCCCCATTG ATTAGTCCAG
130 140 150 160 170 180 GGTGAACCCA TCCAATTTAA TTCCTGGAAC TTTTAAAGTT GGGCCTAAGA GACAGGGACA
190 200 210 220 230 240 TTCCTTCTGT GGTGATAAGG TCATAAAGTA AGAAGATTGG AAGGATCATT TTTCCCTTAT
250 260 270 280 290 300 GTGGAAGTAA TCCTGTTGGC CCTCCTCTCT CTAGATCCCA ATTGCCTCTG AGGACTCCCT
310 320 330 340 350 360 GTACCATTCC TGTGCTGTCA CTATGTGAAA CATCACAGCA TCCTTCCAGT AAAGTCCTCT
370 380 390 400 410 420 TTTCGCAAAA ACTAGTTCAA GTTTGGTTTC CATCTCTTGC AATCAAAACT GAATAGCAAT
430 440 450 460 470 480 TTTACACTTG CAGTGACTTC TTGACATGTT AATCCTTGTC TTAAAGTTAC ATTTTCCCTG
490 500 510 520 530 540 TCACCACTCC CACCCCACTC TTTCCAAGAA GAGCTAGCCC AATCTCCATG TTGCCAATTT
550 560 570 580 590 600 CTCCTTGTTC TATCTGAGTC TATTCATGCT TGGAACACTT GGCCGATGCT CTTTGCCTCC
ENCHAINEMENT XXXIII fragment 1 (sui e)
Figure imgf000046_0001
610 620 630 640 650 660 CCATTAGCAG TGCTTCTAGT TGCTCCATTT CAAAGTACAT TAAAATGCTG TCTACCAAGA
670 680 690 700 710 720
GCCACCΛCCA GAGAATCCTA CTGAGTGGGT CAAGACTGGG GCTCAGGAAT CTGTATTTTT
•
4*
730 740 750 760 770 780 AACAAAATAC ATGCTGGTTG ATTCGATCTG CAGCCAGATG GAGGCATCAT TAGGCCAAAT
Figure imgf000046_0002
GGCTTACAΛA ACCTATCAGT TTTTTTGTTT TTTGTTTTAT CTTTTTCTTA AACTTTTATT
Figure imgf000046_0003
850 860 870 880 890 900 TCAAGTTCAG GGGAAATGTG CAGGTTTGTT TACACAGGAA ATGTGTCATG GACATTTGTT
910 920 930 940 GTGCAGΛTTA TTTCATCGCC CAGGTATTAA GCCTGGTACC GAGGTACC
Figure imgf000046_0004
10 20 30 40 50 60
CΛTTAGTTAT TTTTCCCGAT CTTCTCCCTG CTCCCACCCT CCACCCTCCA AAGCCTATCA
70 80 90 100 110 120
ATTTGAΛGAG TAGGTAAATG TCCTACTCAA GAGTGCAAAT GAACTGTTTC ATCTCTAGTT
Figure imgf000047_0001
370 380 390 400 410 420 0* ACATCACAGG CCTGTATAAT TTTCCTTAAA AAGTGTTTTT TGTTTTTTTC CAAAGCAACT 00
3 π> a
430 440 450 460 470 480 rt ATCCTCAAAA GAGCTGGGCA TAGTTCTCCT AGGGGCAGCA CCAGTGTTGA AGTGTGGGGG ι-o
490 500 510 520 530 540 GAΛACTGTTC TAAATCCTTC AAACAATGTC ACCTTTGGAG CAGTAAAACT GCTCCCTTTT
550 560 570 580 590 600 TCCCATGAGA GΛTGACAAGC ATGCCCCAGC AATCATTTCT TGAAAGCGGA TGCÇCGGTGA
610 620 630 640 650 660 GΛGΛAGGATT TGATTTGCTG AAGGGTCAGC CAAGTTAAGC CAGTTTCTTC CTCATTTCTT
Figure imgf000048_0001
CCCTGGCTGG AGGTTTTGAT GGTGGTGATG GTGGTTGAAC TGAACCCACT TAGAAAACTG
730 740 750 760 770 780 t*. TCΛAAGGTTT CTGGACTCTC AGGTGTGCCG TCTCACATTT GGTCTGCTAC AGCAGGTGCT s**. o
X
790 800 810 820 830 840 H ss TCΛΛGGCTTT CTTCTGCCAA GATTTCTTTG TTTTATTTTA TGATGTTTTC TTTATGTGTG w
3
W
-_;
850 860 870 880 890 900 X TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG TGTGTTTTAC TTTTATTTCT AACAAACCTG X X
910 920 930 940 950 960 TGΛCCTTGGG GTTTAAGACT GAGTGAAGCT AGAAGGATTA GAGTCAAAAG AATTTTGCCA l-h 1
970 980 990 1000 1010 1020 P* OQ TTTGGCCAAT AGCATTCCCC CACCTCCTGA CATATCGATT TTTTTTCTAG ATTCCCTTCC 3 π> x- tt
1030 1040 1050 1060 1070 1080 t-o CCCTGCCACT CCCCTCCCCC CAACACACAC ACACTTTTCT CTTTCTCCTC TTTCTCTCCT
1090 1100 1110 1120 1130 1140 TTCCTCCCTT GCTTCTCTCC CCTCCCTCTC AACACATTCA ATGAGTGCCC TAAACGGTGA H* r-t (0
1150 1160 1170 1180 1190 CΛΛΛCTTGCA TGTGCTTCCC TCATGACTAA ACCCCTGGCC TTCTGCCAAT CCCCTGCAG
ENCHAINEMENT XXXIII : fragment 3
Figure imgf000049_0001
10 20 30 40 50 60
CTGCAGGCAT CCCGTAAGGA CCCCACGCTT GCAGCCCTGG TTGGAACGGT CAGGGTGGAG
70 80 90 100 110 120 GAGGATGGTG GGGAGTGGTG GTGTCTTCGT CCTGGGAGAA GGCGAAGCAA CTTCCAGGAG
130 140 150 160 170 180 GAAACGGGCG TTTCCTTCCC ACGCGCTCGA GCGAGCCCTG GGTCCTGGCC TCGGAACTCC
4>
190 200 210 220 230 240 ACCCAGCCCC TCCCCACCCT CTGGGAAAAG CCAGTCGCCA CACACAGGCA CACGCAGGCC
250 260 270 280 CCGGCGCCGC GCCCTAAGGA GAGCAGCACC CACAGCCAAT TGCC
Figure imgf000049_0002
ENCHAINEMENT XXXIV
Figure imgf000050_0001
CGAATTTTTT AGGAATTCCT GCTGTTTGCC TCTTCAGCTA CCTACTTCCT AAAAAGGATG
70 80 90 100 110 120
TATGTCAGTG GACAGAACAG GGCAAACTTA TTCGAAAAAG AAATAAGAAA TAATTGCCAG
130 140 150 160 170 180 TGTGTTTATA AATGATATGA ATCAGGAGTG GTGCGAAGAG GATAGGGAAA AAAAAATTCT
190 200 210 220 230 240 4*- ATTTGGTGCT GGAAATACTG CGCTTTTTTT TTTCCTTTTT TTTTTTTTCT GCGAGCTGGA 00
250 260 270 280 290 300
Figure imgf000050_0002
TCCATTCAGC TCATTGGCGA GCGCCGCCGC CCGGAGCGTA TAAAAGCCTC GGCCGCCCGC
430 440 450 460 470 480 CCCAAACTCA CACAACAACT CTTCCGCTGA GAGGAGACAG CCAGTGCGAC TCCACCCTCC
Figure imgf000050_0003
AGCTCGACGG CAGCCGCCCC GGCCGAGAGC CCCGA
ENCHAINEMENT XXXV
l 10 20 30 40 50 60
GTCGAGTGCT GTGTTCAGTT TTGGGCCCCT CACTACAAGA CATCGAGGCC ATGGAGTGTG
70 80 90 100 110 120
TCCAGAGAAG GGCACGAGGT GGTGAGGAGT CTGGAGCACA TGTTTTATTG GAAGCAGCTG
130 140 150 160 170 180 4*- J AGGAAGTTGG GATTGTTCAG TCCGGAGAGG CTCAGGGAAA ACATTATTGC TCTTTAAAAA vO
190 200 210 220 230 240 J TCCCTGGAAG GAGGTTGTGG TGAGGTGGAG GTCGGCCTCT GCTCCCAGGT ATCAGTGATA
250 260 270 280 290 300 GGATGAGAGG GAACTGTCTT AAATTATGCC AGGGGAGTTT CAGTTTGGAT ATCAGGAACA
310 320 330 340 350 360 ATTTTTTTTC TCCAAAAAAT TGGTGAGGTA CTGCCACAGT CTGCCCAGCG AGGTGGAATC
370 380 390 400 410 420 ACCATCCCTG GAGATGTTCA GGAAACGTGT AGATGTGGCA CTGAGGGATG TGGTTTAGTG
ENCHAINEMENT XXXV (suite)
Figure imgf000052_0001
430 440 450 460 470 480 AGΛATGGTAG GGATGGGTTG ATGGTTGGAC TAGATTAGCT TAGCGATCTT TCCAGTCATA
490 500 510 520 530 540 ACGΛTCCTGT GATCCTACGA TCCTAAGGCG CCGGCCCCAG CGGAGCAGAC CCGCAGGCTT
550 560 570 580 590 600 CΛGCCCCGGA GCCCCGGCCG CGCGTCGGGA CGCGGGCAGG GCCGGGCACC GCCGGGCAGG
610 620 630 640 650 660 TGGCGGAGCA CAACGGGGAG CGGAGCGTAG GGCCCTGCCC GGCTCCAGCT CCCCGCCTCC
Figure imgf000052_0002
790 ACGGCCGGGA CT
Figure imgf000052_0003

Claims

REVENDICATIONS
1/ Séquences de nucleotides, caractérisées en ce qu'elles renferment un enchaînement de nucleotides capable de s'hybrider, dans des conditions stringentes (50 % de formamide, 5XSCC) avec une ou plusieurs séquences du gène nov de poule dont 1'ADNc présente 1'enchaînement de nucleotides (I) et plus spécialement avec 1'enchaînement (II).
2/ Séquences de nucleotides selon la revendication
1, caractérisées en ce qu'elles sont formées par, ou qu'elles comprennent, un enchaînement de nucleotides capable de s'hybrider, dans les conditions stringentes de la revendication 1, avec au moins une partie du deuxième exon du gène nov de poule qui comprend la séquence nucléotidique (III).
3/ Séquences de nucleotides selon la revendication
2, caractérisées en ce qu'elles comportent l'information génétique pour coder pour une protéine renfermant une séquence ayant une homologie d'au moins 70 % avec le fragment de protéine correspondant au deuxième exon du gène nov de poule, ce fragment présentant la séquence d'acides aminés (IV).
4/ Séquences de nucleotides selon 1'une des revendications précédentes, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une partie d'un fragment PstI d'environ 600 pb tel qu'obtenu à partir d'un sous-clone plasmidique dérivé d'un clone recombinant isolé d'une banque d'ADN de placenta humain, la carte de restriction enzymatique du clone recombinant ainsi que du sous-clone plasmidique dérivé renfermant la séquence nucléotidique étant représentée sur la figure 2A. 5/ Séquences de nucleotides selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisées en ce qu'elles comportent 1'information génétique pour coder pour une séquence d'acides aminés présentant l'enchaînement V.
6/ Séquences de nucleotides selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisées en ce qu'elles comportent au moins une partie du l'enchaînement nucléotidique (VI), plus spécialement de l'enchaînement (VII).
7/ Séquences de nucleotides selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sont capables de s'hybrider, dans les conditions stringentes définies dans la revendication 1, avec au moins une partie du troisième exon du gène nov de poule qui comprend la séquence nucléotidique (VIII).
8/ Séquences de nucleotides selon la revendication 7, caractérisées en ce qu'elles comportent l'information génétique pour coder pour une protéine ayant une homologie d'au moins 70 % environ avec le fragment de protéine potentiel correspondant au troisième exon du gène nov de poule répondant à la séquence (IX).
9/ Séquences de nucleotides selon la revendication 7 ou 8, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une partie d'un fragment PstI d'environ 700 pb, tel qu'obtenu à partir d'un sous clone plasmidique dérivé d'un clone recombinant isolé d'une banque d'ADN de placenta humain, la carte de restriction enzymatique du clone recombinant ainsi que celle du sous-clone plasmidique dérivé renfermant la séquence nucléotidique en question étant représentées sur la figure 2A.
10/ Séquences de nucleotides selon 1'une des revendications 7 à 9, caractérisées en ce qu'elles comportent 1'information génétique pour coder pour une protéine ayant la séquence (X) en acides aminés.
11/ Séquences de nucleotides selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisées en ce qu'elles comportent au moins une partie de 1'enchaînement nucléotidique (XI), plus particulièrement, 1'enchaînement nucléotidique (XII).
12/ Séquences de nucleotides selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sont formées par, ou qu'elles comprennent, un enchaînement capable de s'hybrider, dans les conditions stringentes données dans la revendication 1, avec au moins une partie du quatrième exon du gène nov de poule, qui comprend l'enchaînement (XIII).
13/ Séquences de nucleotides selon la revendication 12, caractérisées en ce qu'elles sont capables de coder pour le fragment de protéine ayant une homologie d'au moins 86 % avec le fragment de protéine potentiel correspondant au quatrième exon du gène no___; de poule répondant à l'enchaînement (XIV) en acides aminés.
14/ Séquences de nucleotides selon la revendication 12 ou 13, caractérisées en ce qu'elles comportent l'information génétique pour coder pour une protéine ayant la séquence (XV) en acides aminés.
15/ Séquences de nucleotides selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisées en ce qu'elles sont formées par ou qu'elles comprennent 1'enchaînement nucléotidique ( VI).
16/ Séquences de nucleotides selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sont capables de s'hybrider, dans les conditions stringentes définies dans la revendication 1, avec au moins une partie du premier exon du gène nov de poule qui comprend la séquence nucléotidique (XVIII).
17/ Séquences de nucleotides selon la revendication 11, caractérisées en ce qu'elles comportent l'information génétique pour coder pour une protéine ayant une homologie d'au moins 30 % environ avec le fragment de protéine potentiel correspondant au premier exon du gène nov de poule, ce fragment présentant l'enchaînement .(XIX) en acides aminés.
18/ Séquences de nucleotides selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisées en ce qu'elles comportent 1'information génétique pour coder pour une protéine ayant la séquence (XX) en acides aminés.
19/ Séquences de nucleotides selon l'une des revendications 16 à 18, caractérisées en ce qu'elles comportent au moins une partie de l'enchaînement nucléotidique (XXI).
20/ Séquences de nucleotides selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sont capables de s'hybrider, dans les conditions stringentes définies dans la revendication 1, avec au moins une partie des troisième et quatrième exons du gène nov de poule qui comprennent la séquence nucléotidique (XXII).
21/ Séquences de nucleotides selon la revendication 20, caractérisées en ce qu'elles comportent l'information génétique pour coder pour une protéine ayant la séquence (XXIII) en acides aminés.
22/ Séquences de nucleotides selon l'une des revendications 20 à 21, caractérisées en ce qu'elles sont formées par ou qu'elles comprennent un enchaînement capable de s'hybrider dans les conditions stringentes définies dans la revendication 1, avec au moins une partie du troisième exon du gène nΩ_z de poule qui comprend la séquence nucléotidique (XXII).
23/ Séquences de nucleotides selon l'une des revendications 20 à 22, caractérisées en ce qu'elles comportent 1'information génétique pour coder pour une protéine ayant une homologie d'au moins 60 % environ avec le fragment de protéine potentiel correspondant au troisième exon du gène nov de poule répondant à la séquence (XXIII) en acides aminés.
24/ Séquences de nucleotides selon 1'une des revendications 20 à 22, caractérisées en ce qu'elles comportent l'information génétique pour coder pour une protéine ayant la séquence (XXIV) en acides aminés.
25/ Séquences de nucleotides selon l'une des revendications 20 à 24, caractérisées en ce qu'elles comportent au moins une partie de 1'enchaînement nucléotidique (XXV), plus particulièrement, l'enchaînement nucléotidique (XXVI).
26/ Séquences de nucleotides selon l'une des revendications 20 à 25, caractérisées en ce qu'elles sont formées par ou qu'elles comprennent un enchaînement capable de s'hybrider dans les conditions stringentes données dans la revendication 1 avec au moins une partie du quatrième exon du gène n_____ de poule, qui comprend 1'enchaînement de nucleotides (XXVII).
27/ Séquences de nucleotides selon la revendication 14, caractérisées en ce qu'elles sont capables de coder pour le fragment de protéine ayant une homologie d'au moins 86 % avec le fragment de protéine potentiel correspondant au quatrième exon du gène nov de poule répondant à l'enchaînement (XXVIII) en acides aminés. 28/ Séquences de nucleotides selon la revendication 26 ou 27, caractérisées en ce qu'elles comportent 1'information génétique pour coder pour une protéine ayant la séquence (XXIX) en acides aminés.
29/ Séquences de nucleotides selon l'une des revendications 26 à 28, caractérisées en ce qu'elles sont formées par ou qu'elles comprennent l'enchaînement nucléotidique (XXX).
30/ Les ARN et séquences complémentaires des séquences selon l'une quelconque des revendications 1 à 29.
31/ Vecteurs recombinants de clonage et d'expression, capables de tranformer une cellule hôte appropriée, comportant au moins une partie d'une séquence de nucleotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 30 sous le contrôle d'éléments de régulation permettant son expression dans la cellule hôte.
32/ Souches de microorganismes transformées ou transfectées, caractérisées en ce qu'elles comportent une séquence de nucleotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 30 ou encore un vecteur recombinant selon la revendication
33/ Les protéines correspondant aux séquences nucléotidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 30.
34/ Les anticorps polyclonaux et monoclonaux caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement une protéine selon la revendication 33, ou un fragment d'une telle protéine.
35/ Sonde de détection, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie des séquences de nucleotides selon 1'une des revendications 1 à 30. 36/ Procédé de dépistage in vitro de la présence éventuelle dans un échantillon biologique de séquences de nucleotides complémentaires de celles selon 1'une quelconque des revendications 1 à 30, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- la mise en contact de l'échantillon biologique avec une sonde nucléotidique selon la revendication 35 dans des conditions permettant la production d'un complexe d'hybridation formé entre ladite sonde et ladite séquence de nucleotides,
- la détection du complexe d'hybridation, et
- le cas échéant l'amplification, avant l'étape de mise en contact, des séquences de nucleotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 30 susceptibles d'être contenues dans l'échantillon, à l'aide d'amorces susceptibles respectivement de se lier, d'une part à 1'extrémité 5' d'un brin de ladite séquence de nucleotides et, d'autre part, à l'extrémité 3' de l'autre brin de ladite séquence de nucleotides,
37/ Kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de dépistage in vitro de la présence éventuelle dans un échantillon biologique de séquences complémentaires des séquences selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 caractérisé en ce qu'il comprend :
une quantité déterminée d'une sonde nucléotidique selon la revendication 35,
un milieu approprié à la formation d'une réaction d'hybridation entre la séquence à détecter, et la sonde, et, avantageusement, des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation formés entre la séquence de nucleotides et la sonde lors de la réaction d'hybridation.
38/ Procédé de dépistage in vitro de la présence dans un échantillon biologique des protéines selon la revendication 33, caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en contact de l'échantillon avec un anticorps selon la revendication 34, dans des conditions permettant la production d'un complexe immunologique formé entre tout ou partie des protéines et cet anticorps, et
- la détection du complexe immunologique.
39/ Kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de dépistage in vitro de la présence éventuelle de protéines selon la revendication 21 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une quantité déterminée d'un anticorps selon la revendication 33,
avantageusement un milieu approprié à la formation d'une réaction immunologique entre au moins une partie d'une protéine et l'anticorps et, avantageusement,
des réactifs permettant la détection des complexes immunologiques formés entre au moins une partie de la protéine recherchée et l'anticorps lors de la réaction immunologique.
/ Procédé de détection dans un échantillon biologique de protéines selon la revendication 33, ou de leurs fragments, caractérisé par la mise en contact des protéines de l'échantillon, ou de leurs fragments, avec un IGF portant un groupe marqueur et le dosage de la quantité de produit fixé. 41/ Utilisation en tant qu'amorces dans des techniques d'amplification d'ADN, de type PCR, de deux amplimères d'environ 15 nucleotides, compris dans l'une des séquences selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, et distantes de 200 à 250 nucleotides environ, l'une des séquences étant capable de se lier à 1'extrémité 5' d'un brin de la séquence à amplifier et la deuxième séquence à 1'extrémité 3' de 1'autre brin.
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