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WO1992020799A1 - Sequence d'acides amines d'anticorps monoclonal humain anticancer et sequence de bases d'adn codant pour ces acides amines - Google Patents

Sequence d'acides amines d'anticorps monoclonal humain anticancer et sequence de bases d'adn codant pour ces acides amines Download PDF

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WO1992020799A1
WO1992020799A1 PCT/JP1992/000650 JP9200650W WO9220799A1 WO 1992020799 A1 WO1992020799 A1 WO 1992020799A1 JP 9200650 W JP9200650 W JP 9200650W WO 9220799 A1 WO9220799 A1 WO 9220799A1
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WO
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ala
tyr
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PCT/JP1992/000650
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hideaki Hagiwara
Yasuyuki Aotsuka
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Individual
Original Assignee
Individual
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Publication date
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to antigens useful in a wide range of fields such as medical and pharmaceutical fields such as prevention, treatment and diagnosis of human diseases, pharmacology such as biochemical reagents and biopolymer purification reagents, and biochemical fields. It relates to the structure of the variable region of specific human immunoglobulin. More specifically, the present invention relates to a heavy chain of a cancer cell antigen-specific human immunoglobulin produced by a human Z human fusion cell line CL NZ SUZHI 1 of a B cell of a human uterine cancer patient and a human lymphoblast cell line. And the amino acid sequence of the light chain variable region and the nucleotide sequence of the gene.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-201994 Japanese Patent Publication No. 01-59878
  • Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 59-135898 and 59-137497 As disclosed in detail, a cell line CLNZSUZ HI 1 (ATCC No. HB8307) producing a human monoclonal antibody having high reactivity to human cancer cells was established.
  • the antibody (CLN-IgG) produced by this cell line has an antibody class of IgG, isotypes y1 and / c, and immunohistologically binds to the ⁇ antigen present on the surface of cancer cells.
  • more interesting findings have been obtained on the effect of suppressing the growth of cancer cells.
  • Monoclonal antibody-producing cell lines are generally known to decrease their antibody productivity with passage. Also, generally speaking, human hybridomas produce less antibody than mice. When human monoclonal antibodies are used for immunotherapy or diagnosis, a large amount of antibodies is required, and the solution of this problem is essential.
  • a main object of the present invention is to elucidate the gene structure of the light chain and heavy chain of the CLN-IgG monoclonal antibody.
  • the present inventors separated cDNAs encoding the light chain and heavy chain of the CLN-IgG monoclonal antibody, elucidated the DNA base sequence, and, based on the sequences, the light chain and heavy chain variable regions of the antibody.
  • the amino acid sequence of was determined, and the present invention was completed.
  • niRNA was prepared from CLNZSUZ HI1, and the cDNA A lambda phage 'library' prepared therefrom was screened by the plaque hybridization method, and the isolated phage clone was used. This was achieved by determining the nucleotide sequence of the inserted DNA.
  • the present invention will be described in more detail.
  • FIG. 2 shows a Kabat & Wu plot of 21 variable region sequences belonging to human heavy chain subgroup 3.
  • the DNA sequences of the light chain variable region and heavy chain variable region of the CLN-IgG monoclonal antibody can be determined using the human antibody gene fragment amplified by PCR (polymerase chain reaction) as a probe. It is determined by cloning the monoclonal antibody light chain and heavy chain cDNA and analyzing the DNA nucleotide sequence.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the cell line used in the present invention is a human Z human hybridoma obtained by fusing human uterine cancer patient lymphocytes and human lymphoblasts. Specifically, the cell line is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-201994 (Japanese Patent Publication No. 01-59878). Publication No. 2), which produces a human-type monoclonal antibody that specifically reacts with the cell surface antigen of cancer cells such as human brain tumors, lung cancer, stomach cancer, and malignant melanoma. It is.
  • This hybridoma is registered with ATCC (American Type Culture Collection) under the registration number HB8307.
  • the resulting poly (A) + RNA can be further used for preparing a cDNA library.
  • total RNA is extracted from CLN-SUZH11 hybridoma cells, and poly (A) + RNA is purified from this extract using an oligo dT cellulose column, and the following cDNA is prepared.
  • the library was used for construction.
  • an EcoRI linker can be ligated to the cDNA thus obtained, followed by digestion with EcoRI to introduce a sticky end.
  • the obtained fragment is ligated to an EcoRI site of an appropriate phage vector, for example, a ⁇ £ ⁇ 10 vector or an igtl1 vector, and then subjected to in vitro packaging to prepare a cDNA library. Can be made.
  • a human immunoglobulin light or heavy chain constant region or variable region gene or a fragment thereof, or a chemically synthesized oligonucleotide having a nucleotide sequence corresponding to the amino acid S sequence in that portion is used.
  • those labeled with 32 P, biotin or the like by the nick translation method can be used.
  • a fragment amplified by PCR in which the cDNA is subjected to type III and sequences corresponding to a part of the light chain and heavy chain of the antibody in a primer sequence is biotinylated by the nick translation method. Things can be used as probes.
  • the ICLN-G111 and the EcoRI fragment of ICLN-K411 obtained in the step [4] are recloned into pBluescript SK + and then infected with helper phage R408. Single-stranded DNA was prepared and its nucleotide sequence was determined by the Sanger method.
  • the method for obtaining the mRNA fraction from the human hypride dorma CLNZSUZ HI1 is as follows.
  • RNA was obtained from the total RNA fraction obtained by the above method by the method of Chirgwin [Chirgwin, J. ⁇ ⁇ , Przybyla, A. E-, MacDonald, RJ, & Rutter, WJ ( 1979) Biochemistry, 18, 5294-5299].
  • the solution is applied to an oligo (dT) cell source column that has been equilibrated with a binding buffer (0.5 M lithium chloride, 0.2% SDS, 1 OmM triethanolamine hydrochloride, pH 7.4) in advance. Further wash with 10 column volumes of binding buffer. You.
  • the poly (A) + RNA bound to the column is eluted with elution buffer (1 OmM triethanolamine hydrochloride, pH 7.4), and the RNA fraction is collected.
  • the resulting poly (A) + RNA solution is heat-treated at 100 ° C for 5 minutes, and the above-mentioned chromatography using an oligo (dT) cellulose column is repeated once again using a new column.
  • RNA For RNA, add 2.5 volumes of ethanol and 1/10 volume of 2M sodium acetate to the eluate, and recover as a precipitate after centrifugation at 10,000 xg. Dissolve the purified poly (A) + RNA precipitate in sterile pure water and store at 2 70 g at a concentration of 2 zg / zl.
  • cDNA was synthesized according to the protocol of Amersham's cDNA synthesis kit and 3.2 ⁇ g was recovered. After treating this cDNA fragment with EcoRI methylase, the EcoRI linker was ligated using T4 DNA ligase. After EcoR I digestion, a cDNA fraction having an EcoR I end was recovered using an Amersham column.
  • a sequence having a homology with the partial amino acid sequence of the CLN-IgG heavy chain determined in Example 3 was searched from the NBRF protein database (NBRF-PDB; National Biomedical Research Foundation Protein Data Base).
  • VH26 entity H3HU26, Accession number A02047) was found to have the highest homology. Therefore, it corresponds to the N-terminal amino acid 10 residues of the VH26 DNA sequence (ID name: HSIGHAU, Accession number M17747) in the EMBL DNA database (EMBL-GDB; European Molecular Biology Laboratory Gene data Base).
  • 30 nucleotides (Primer No. 1) were synthesized.
  • 30 nucleotides (primer No. 2) corresponding to 10 amino acid residues at the C-terminal side of the DNA sequence of the heavy chain 1 CHI domain (EMBL-GDB; ID name HS I GCC4, Accession number J00228) were synthesized.
  • the CLNZSUZ HI lcDNA library obtained in Example 2 was subjected to plaque hybridization using the biotinylated probe obtained in Example 4 to obtain 13 positive clones.
  • One of these clones had about 1.6K base pairs of imported DNA, and this phage was named; ICLN-G111.
  • CLNZSUZ HI lcDNA library obtained in Example 2 was subjected to plaque hybridization using the biotinylated probe obtained in Example 4 to obtain 27 positive clones.
  • Clone 411 in this contains about 1.0 K base pairs of imported DNA, and this phage was named CLN-K411.
  • variable regions there are regions (variable regions) in which the sequences are different from certain regions (constant regions).
  • variable regions the regions that are particularly rich in variability are called hyper-variable regions (Hv regions), and there are three heavy chains and three light chains. From the amino terminus, they are called Hvl, ⁇ 2, and Hv3, respectively.
  • Hv regions hyper-variable regions
  • Hvl, ⁇ 2, and Hv3 hyper-variable regions
  • CDR complementarity determining region
  • the amino acid sequence of the CLN-IgG light chain revealed that it belongs to kappa chain subgroup 1. Therefore, 24 sequences belonging to subgroup 1 contained in the NBRF-PDB (rel. 26) were arranged together with the CLN-IgG light chain, and the mutation degree was calculated at each position to create a Kabat & Wu plot (Fig. 1) From the results, Hvl, ⁇ 2, and Hv3 were determined as residue numbers 28 to 34, 50 to 56, and 91 to 96, respectively.
  • Hv2 Ala Ala Ser Ser Leu His Arg
  • the amino acid sequence of the heavy chain of CLN-IgG revealed that it belongs to Hv subgroup 3. Therefore, the Kabat & Wu plot was prepared by calculating the mutation degree at each position by juxtaposing the 21 sequences belonging to subgroup 3 contained in the NBRF-PDB (rel. 26) together with the CLN-IgG heavy chain (Fig. 2). , Up to residue number 96). As a result, Hvl and Hv2 were determined as residue numbers 31 to 35 and 49 to 59, respectively. Regarding Hv3, in the case of heavyweight, as shown in Table 3 below, it is difficult to exactly match the positions because the length of each sequence is significantly different.
  • the residue number is 1.0 for 96 cysteine, 2.1 for 97 glycine, 3.9 for 98 arginine, 29.3 for 99 valine, 18.4 for 109 tyrosine, 3.5 for 111 tributophan, 111 for 111 Glycine is 1.0.
  • the degree of mutation is high at residues 99 to 109, and this region is H Is equivalent to
  • Hv2 Ser Alalie Thr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Asn
  • Hv3 Val Pro Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Pro Leu Tyr 3 Table
  • CAK GYIWNGNWFDSWGQGTLVTVS was CAR FRQ PFVQFFDVFGQGTLVT Bur CAK LIAVAG - TRDFWGQGTLVTVSL Tur CAR LSVTAVAFDVWGQGTKVS Til CAK GKVSAYYFDYWGEGTLVTVS S zap CAR TRPGGYFSDVWGQGTLVS Nie CAR IRDTAMFFAHWGQGTLVTVS S Jon CAR VWS TSMDVWGQGTPVT Gal CAR GWGGGDYWGQGTLVTVST But CAR DLAAARLFGKGTTVTVS S
  • the elucidation of the CL N-IgG antibody and its gene structure makes it possible to introduce this gene into animal cells and host cells such as Escherichia coli and express it, thereby obtaining a large amount of the antibody. Furthermore, not only complete antibodies, but also certain antibody fragments, such as heavy chains only, light chains only, Fab fragments, F (ab) ' 2 fragments, FV fragments, domain fragments (dAb), CDR fragments and other antibody-derived fragments Can be obtained. Further, by causing artificial mutations in the antibody gene, complete antibodies or fragments derived from various antibodies whose amino acid sequences are partially different can be obtained.
  • CLN-IgG acts on human cancer cells such as human stomach cancer, lung cancer, brain tumor, and malignant melanoma, and suppresses the growth of these cancer cells by its own action. Is expected to kill cancer cells and further suppress cancer cell growth with the help of traps or K-cells and macrophages, and to kill cancer cells.
  • CLN-IgG gene by modifying the CLN-IgG gene and partially substituting the amino acids of the antibody, it is possible to further increase the activity of the antibody. For example, it can be modified so as to increase the binding affinity to an antigen, the anticancer activity via an immunocompetent cell, or the invasiveness to a tissue.
  • cytotoxicity, enzymatic activity, immunity-inducing activity, etc. are added to an antibody molecule or a fragment thereof at the gene level by adding toxicity, enzyme activity, immunity-inducing activity, etc. to the antibody molecule or a fragment thereof at the gene level. It is conceivable to design a molecule having a higher anticancer activity.
  • Specific examples include the use of cancer-specific antibodies as carriers, for example, chemotherapeutic agent binding-human monoclonal antibody, interferon binding-human monoclonal antibody, high molecular weight toxin binding It is useful as a drug that induces cancer cell growth inhibition or death in the form of a monoclonal antibody, drug-containing ribosome binding-human monoclonal antibody, and the like.
  • radiosensitizers may be conjugated to antibodies and administered to patients, selectively accumulate in spheroid cells, and improve therapeutic and diagnostic effects.
  • a complete antibody may be used as a human monoclonal antibody, or as described above, for example, only a heavy chain, only a light chain, a Fab fragment, an F (ab) ' 2 fragment, Smaller fragments containing specific antigen recognition sites, such as v-fragments, domain fragments (dAbs), and CDR fragments can also be used.

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Description

明 細 書
抗癌ヒトモノクローナル抗体のァミノ酸配列及びそれをコードする D N A塩基配列 技術分野
本発明は、 たとえば、 ヒトの疾患の予防、 治療、 診断などの医学及び 薬学分野や、 生化学的試薬、 生体高分子の精製試薬などの薬理学、 生化 学分野などの広い分野において有用な抗原特異的ヒト免疫グロプリンの 可変領域の構造に関する。 さらに詳しくは、 本発明は、 ヒト子宮癌患者 の B細胞とヒ トリンパ芽球細胞株とのヒ ト Zヒ 卜融合細胞株 C L NZ S U Z H I 1が産生する癌細胞抗原特異的ヒト免疫グロプリンの重鎖及 び軽鎖可変領域のァミノ酸配列ならびにその遺伝子の塩基配列に関する。
背景技術
細胞融合あるいは細胞の不死化によるモノクロ一ナル抗体作成の技術 の開発以来、 多くの有用な抗体が主にマウスなどをつかって得られてき た。 そのなかでも悪性腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体は、 腫瘍抗 原の解析等の基礎研究への利用のほかに、 血清診断、 標識化抗体による 腫瘍の画像診断などに利用されはじめ、 その利用価値はきわめて高い。 しかし、 マウス等の異種抗体はヒ卜にとって異物であり、 ヒトに頻回投 与することは投与抗体に対する免疫反応を惹起し、 その結果、 副作用並 びに抗体の治療または予防効果の低下を引き起こす。 以上の点から、 ヒ トの癌の予防、 治療、 体内診断など、 実際に抗体をヒトに投与する臨床 分野を考えると、 ヒト型の抗体を用いることが望ましい。 しかし、 ヒ ト 型のモノクローナル抗体は、 その作成が困難であることから、 現在のと ころほとんど実用に供されていない。
このような状況の中で本発明者の一人は、 特開昭 58— 201994 号公報 （特公平 01— 59878号公報） 、 特開昭 59— 135898 号公報および特開昭 59— 137497号公報に詳しく開示されている ごとく、 ヒト癌細胞に高い反応性を有するヒトモノクローナル抗体を産 生する細胞株 CLNZSUZ HI 1 (ATCC No. HB 8307) を樹立した。 この細胞株が産生する抗体 （CLN— IgGと命名） は、 抗体クラスが IgG、 アイソタイプが y 1型および/ c型であり、 免疫組 織学的に癌細胞の表面に存在する瘙抗原に結合し、 なおかつ癌細胞の増 殖を抑制する効果をもっという興味ある知見が得られている。
このような技術背景の中で、 以下に述べる如き解決すべき課題がある。
1) モノクローナル抗体産生細胞株は、 一般に継代と共にその抗体産性 能の低下することが知られている。 また一般的に言って、 ヒトハイプリ ドーマはマウスのそれと比較して抗体の産生量が低い。 ヒトモノクロ一 ナル抗体を瘙洽療や診断に用いる場合、 大量の抗体が必要であり、 この 問題の解決は必須である。
2)現在の免疫学の知見によれば、 モノクローナル抗体がヒ 卜癌細胞に 結合し、 抗体それ自体の作用で癌細胞の増殖を抑制し、 あるいは癌細胞 を死滅させる機構が知られている。 更にはまた、 捕体もしくは K一細胞 やマクロファージなどの助けを借りて癌細胞の増殖を抑制し、 癌細胞の 死滅を引き起こすことが知られている。 しかし、 これらの効果は実際の ところ期待されるほど強力ではなく、 それゆえ更に抗体の抗癌活性を上 昇させる試みが必要である。
以上のような課題の解決手段、 すなわち抗体産生量の改善と抗体の抗 癌活性の上昇を具体化するひとつの手段として遺伝子操作による方法が ある。 例えば上記 1) の問題の場合、 抗体遺伝子をクローニングした後、 動物細胞や大腸菌などの宿主細胞に遺伝子を導入し、 抗体遺伝子を発現 させ、 抗体を多量に得る方法によって解決することが考えられ、 また上 記 2)の問題の場合、 抗体遺伝子を人為的に換えることによって、 抗体 の種々の機能、 たとえば抗原との結合親和性や、 免疫担当細胞を介した 抗癌活性あるいは組織浸潤性を上昇させるように改変したり、 さらには 本来抗体が持たない機能、 たとえば細胞毒性、 酵素活性、 免疫誘導活性 などを抗体分子もしくはその断片に付 inすることで、 より抗癌活性の高 い分子をデザィンすることが考えられる。
これらの目的を達成するためには、 抗体遺伝子の分離さらに構造の解 明が重要である。 しかしながら、 該 C LN— I gGモノクローナル抗体 を構成する軽鎖と重鎖の構造、 さらには抗原と特異的に結合する機能を 有する可変領域の遺伝子構造についてはこれまで全く知られていない。 そこで本発明の主たる目的は、 該 CLN— IgGモノクローナル抗体 の軽鎖と重鎖の遺伝子構造を解明することにある。
発明の開示
本発明者らは、 該 C LN— I gGモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖 をコードする cDNAを分離し、 該 DNA塩基配列を解明し、 またその 配列より該抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のァミノ酸配列を決定し本発明 を完成するに至った。
具体的には、 CLNZSUZ HI 1より niRNAを調製し、 そこか ら作成した cDN Aラムダファージ 'ライブラリ一を、 プラークハイブ リダイゼーシヨン法によりスクリーニングし、 単離したファージクロー ンの揷入 DNAの塩基配列を決定することにより達成された。 以下本発 明について更に詳細に説明する。
図面の簡単な説明 - 図 1は、 ヒト c鎖サブグループ 1に属する 24の可変領域配列の Kab at & Wu plotを示す。
図 2は、 ヒト重鎖サブグループ 3に属する 21の可変領域配列の Kab at & Wu plotを示す。
発明の詳細な記述
本発明によれば、 CLN— IgGモノクローナル抗体軽鎖可変領域お よび重鎮可変領域の DN A塩基配列は、 PCR法 （ポリメラーゼ鎖反応 法） により増幅したヒト抗体遺伝子断片をプローブとして、 CLN— I gGモノクローナル抗体軽鎮および重鎖の cDNAをクローニングし、 該 DNA塩基配列を解析することにより決定される。 以下、 これらの工程 について更に詳細に説明する。
[1] mRNA単離精製
本発明において使用される細胞株は、 ヒト子宮癌患者リンパ球とヒト リンパ芽球を融合させたヒト Zヒトハイプリ ドーマであり、 具体的には 特開昭 58— 201994号公報 （特公平 01— 59878号公報） に 詳しく開示され、 ヒト脳腫瘍、 肺ガン、 胃ガン、 悪性黒色腫などのごと き癌細胞の細胞表面抗原に特異的に反応するヒト型モノクローナル抗体 を産生するハイブリ ドーマ CLN— SUZ HI 1である。 このハイブ リ ドーマは ATCC (American Type Culture Collection) に登録 番号 HB 8307として登録されている。
この細胞を適当な条件下、 例えば温度 37°C、 炭酸ガス濃度 5%の条 件下、 5%牛胎児血清を含む培養液、 たとえば RDF培地中で培養増殖 させ、 得られる細胞を遠心分離によって集めた後、 細胞から常法、 例え ば Hanらのグァニジゥムチオシァネート法 [Han, J. H.， S tratowa, C.， & Rutter, W. J. (1987) Biochemistry, 26， 16 17-1625] により全 RNAを抽出し、 ついでこれを常法、 例えば オリゴ dTセルロースを用いる吸着カラムクロマトグラフィまたはバッチ 法によりポリ （A) +RN A画分を分離精製する。
得られるポリ （A) +RNAはさらに cDNAライブラリーの作製に利 用することができる。 本発明においては、 具体的には CLN— SUZ H 11ハイプリ ドーマ細胞から全 RNAを抽出し、 この抽出物からオリ ゴ dTセルロースカラムを用いてポリ （A) +RNAを精製し、 以下の cD NAライブラリーの作製に供した。
[2] cDNAライブラリーの作製
[1] の工程で得られるポリ （A) +RNAを铸型とし、 ポリ Aに対 応ずるオリゴ dT、 あるいは抗体の定常領域に対応すると考えられる塩基 配列を有する合成ヌクレオチドをプライマーとして、 dATP、 dGTP、 dTTP、 dCTPの存在下で逆転写酵素により mR N Aと相補的な一本 鎖 DN Aを合成する。 次いで大腸菌 RN A分解酵素 Hで RN Aを断片化 した後、 この一本鎖 DNAを铸型として、 大腸菌 DNAポリメラーゼ I を用いて二本鎖 cDNAを合成する。 こうして得られる cDNAに、 たと えば EcoR I リンカーを連結後、 EcoR I消化することによって粘着末 端を導入することができる。 得られる断片を適当なファージベクター、 たとえば λ£ΐ10ベクター、 igtl 1ベクターなどの EcoR I部位に連 結した後、 インビトロパッケージングを行い、 cDNAライブラリーを 作製することができる。
本発明の具体的操作においては、 [1] の工程で得られるポリ （A) + RNAを鋅型とし cDNAを合成し、 この cDNAを; Igtl 0ベクタ に連結し cDN Aライブラリーを作製した。
[3] プローブの作製
プローブとしては、 ヒト免疫グロプリン軽鎖又は重鎖の定常領域ある いは可変領域の遺伝子もしくはその断片、 あるいはその部分のァミノ酸 S列に対応する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成したも のを、 たとえばニックトランスレーション法により32 P、 ピオチンなど で標識を行ったものを用いることができる。
本発明において好適には、 cDNAを鍀型に、 抗体の軽鎖および重鎖 の一部に相当する配列をブライマ一にして行つた P C Rにより増幅され た断片を、 ニックトランスレーション法によりピオチン化したものをプ ローブとすることができる。
[4] cDNAのクローニング
[2] の工程で得られる cDNAライブラリーを、 [3] の工程で得 られるプローブを用いることにより目的とするクローンの選択を行う。 例えば [2] の工程で得られる cDNAライブラリーの； Igtl 0ファー ジを大腸菌株 （C600H — ) に感染させることでプラークを形成さ せ、 さらにプラークハイブリダイゼーション法によって陽性クローンを 選別する。 これにより、 CLN— IgG重鎖 cDNAクローンとして； I C LN— Gl 11が、 CLN— IgG軽鎖 cDNAクローンとして； I CLN -K411が選択され塩基配列決定に供された。
[5] 塩基配列の決定 [4] の工程で得られる cDNAクローンは、 たとえば pUC18のよ うなプラスミッ ドベクターや Ml 3ファージなどのファージベクターあ るいは pUC 118、 pBluescript SK+などのファージミッ ドベクタ 一に再クローン化し、 得られるサブクローンの挿入部分の DN A塩基配 列をマキサム、 ギルバ一ト法ゃサンガー法を用いて塩基配列を決定する ことができる。
本発明の具体的操作においては、 [4] の工程で得られる； I C LN— G 111および; I C LN-K411の EcoR I断片を、 pBluescript SK +に再クローン化後、 ヘルパーファージ R 408感染により一本鎖 DNAを調製し、 サンガー法によりその塩基配列を決定した。
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例
実施例 1 ：ハイプリ ドーマ CLN SUZ HI 1からの mRNA (ポ リ （A) +RNA) の単離精製
ヒ トヒ トハイプリ ドーマ CLNZSUZ HI 1から mRNA分画を 得た方法は以下のとおりである。
CLNZSUZ HI 1細胞から、 グァニジゥムチオシァネート法 [Han, J. H.， S tratowa, C, & Rutter, W. J. (1987). Biochemistry, 26, 1617— 1625] により、 全 RN Aを調整 した。 培養細胞 109個を遠心分離で集め生理食塩水で洗浄する。 80 Orpmで遠心し集めた細胞の沈殿に、 あらかじめ氷冷しておいた 8%2 —メルカプトエタノールを含む 5 Mグァニジゥムチオシァネートを 20 ml加え、 すみやかにホモジヱナイズする。 その細胞破砕液を、 あらか じめ 7.5m 1のエタノールを入れ一 20°Cに冷やしておいたポリプロ ピレン遠心チューブに入れて混合し、 即座に 10, 00 Orpmで 5分間遠 心する。 得られた沈殿にあらかじめ氷冷しておいた 8 % 2—メルカプト エタノールを含む 5Mグァニジゥムチオシァネートを 10m 1加えホモ ジェナイズした後、 そこへ 1M酔酸 0.25m 1と 7.5m 1の冷ェタノ ールを加え、 一 20°Cで一晩放置する。 10， 00 Orpmで 10分間遠心 分離し得られた沈殿を 10mM2—メルカブトエタノールを含む 6M塩 酸グァニジン 10mlに溶解し、 さらに 1M酔酸 0.25m 1と 5m 1 の冷エタノールを加え一 20でで 3時間放置する。 10, 00 Orpmで 1 0分間遠心分離し得られた沈殿を 6M塩酸グァニジン 5m 1に溶解し 1 MS ^酸 0.125m 1と 2.5m 1の冷エタノールを加え一 20ででさら に 3時間放置する。 10, 00 Orpraで 10分間遠心分離し得られた沈殿 を滅菌純水 5 m 1に溶解し、 2 M酢酸ナトリウム 0.5 m 1および冷ェ タノール 12.5m 1加え一 20でで全 RNA分画として保存する。
ポリ （A) +RNAは、 上述の方法で得られた全 RNA分画から Chir gwinの方法 [ C hirgwin, J . Μ·， P rzybyla, A. E -， MacDonald, R. J., & Rutter, W. J. (1979) Biochemistry, 18， 5294-5299] を用いて調製した。 まず CLNZSUZ HI 1 細胞の全 RNA9mgを純水に解かし 2.5mg/m 1とする。 100 °Cで 5分間熱処理し、 氷上で急冷した後、 5M塩化リチウム、 10% SDS、 1Mトリエタノールアミン塩酸 pH7.4をそれぞれ最終濃度 0. 5M、 0.2%、 1 OmMになるように加える。 その溶液を、 あらかじめ 結合緩衝液 （0.5M塩化リチウム、 0.2%SDS、 1 OmMトリエタ ノールアミン塩酸、 pH7.4) で平衡化しておいたオリゴ （dT)セル口 ースカラムにかける。 さらにカラム体積の 10倍の結合緩衝液で洗浄す る。 カラムに結合したポリ （A) +RNAを溶出緩衝液 （1 OmMトリエ タノールアミン塩酸、 pH7.4) で溶出し、 RNA分画を集める。 得ら れたポリ （A) +RNA溶液は 100°Cで 5分間熱処理した後、 上述の オリゴ （dT)セルロースカラムを用いたクロマトグラフィーを新しい力 ラムをつかってもう一度繰り返す。 RNAは、 溶出液に 2.5倍量のェ タノールと 1/10量の 2M酢酸ナトリウムを加え、 10, 000 xgの遠心 分離した後の沈殿として回収する。 精製ポリ （A) +RNA沈殿を滅菌 純水に溶解し 2 zg/ zlの濃度で一 70°Cで保存する。
実施例 2 ： CLN/SUZ HI 1ライブラリーの作成
実施例 1で得られたポリ （A) +RNA4 /gを用い、 アマシャム社の cDNA合成キッ トのプロトコールに従い、 cDNAを合成し 3.2〃g回 収した。 この cDNA断片を EcoR Iメチラーゼ処理後、 EcoR Iリン カーを T4 DNA ligaseを用いて連結した。 EcoR I消化後、 アマ シャム社製カラムにより EcoR I末端を有する cDN A分画を回収した。 この cDNA 10 Ongを； Igtl 0ベクタ一 （ストラタジーン社製） 1 /zg に連結後、 in vitroパッケージングをパッケージングキッ ト （G I GA PACK GOLD ;ストラタジーン社製） を用いて行い CLNZSU Z Hl lcDNAライブラリー 7.8x 106pfu//zg DNAを作成 した。
実施例 3 ：プロテインシーケンサーによる CLN— IgGのアミノ酸配 列の決定
精製 CLN— IgGを還元後、 ゲルろ過により精製した重鎖および軽 鎖のそれぞれ 30〃gをプロテインシーケンサー 477 A (アプライ ト バイオシステムズ社製） にかけ、 N末端からのアミノ酸配列を約 30残 基決定した。 また重鎖を臭化シアンによりメチォニン特異的に切断し断 片を逆相液体ク口マトグラフィで分離精製後、 同様に一部のァミノ酸配 列を決定した。
実施例 4 ：プローブの作成法
(1) 重鎮のプローブ
実施例 3で決定した CLN— IgG重鎮の部分アミノ酸配列とホモ口 ジーをもつ配列を NBRF蛋白質データベース （NBRF— PDB ； N ational Biomedical Research Foundation Protein Data Base) から検索した結果、 ヒ ト免疫グロプリン germ line VH26 (ェントリ 一名 H3HU26、 Accession number A02047) が最も高いホモロジ一 を持つことが明らかとなった。 そこで EMBL DNAデータベース （E MB L— G D B ； European Molecular Biology Laboratory Gene deta Base) にある VH26の DNA配列 （I D名 HS I GHAU, A ccession number M17747) のうちから N末端アミノ酸 10残基に相当す る 30ヌクレオチド （プライマ一 No. 1) を合成した。 また重鎮ァ 1 C H I ドメインの DNA配列 （EMBL— GDB ; I D名 HS I GCC4, Accession number J00228) の C末端側ァミノ酸 10残基に相当する 3 0ヌクレオチド （プライマー No.2) を合成した。
合成 DNA (プライマー No. 1)
5' -GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGC-3'
合成 DNA (プライマー No.2)
5'-AACTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGG-3'
この 2種類のブライマ，を用いて実施例 2で調製した CLNZSUZ HI lcDNA4ngをテンプレートに PCR (ポリメラーゼ鎖反応） を 行った。 その結果、 約 660塩基対の断片 （PCRy C3) が増幅され、 塩基配列決定により抗体重鎖 y 1 CHI ドメインおよび可変領域に相 当することがあきらかとなった。 このァ C 3をニック トランスレーシヨ ンの方法でピオチン化しプローブ （ピオチン化 PCRy C3) を得た。
(2) 軽鎖のプローブ
実施例 3で決定した CLN— IgG軽鎖の部分アミノ酸配列とホモ口 ジーをもつ配列を NBRF蛋白質データベースから検索した結果、 Dau di細胞由来のヒ ト免疫グロプリン （ェントリ一名 K 1 HUD I、 Acces sion number A01884) の配列と最も高いホモロジ一があった。 そこで E MB L DNAデータベースにある Daudi抗体軽鎖の DNA配列 （ I D 名 HSVK02, Accession number X00966) のうちから N末端アミノ 酸 10残基に相当する 30ヌクレオチド （プライマー No.3) を合成し た。 また軽鎮 （/c鎖） Cドメインの DN A配列 （EMBL— GDB ； I D名 HS I GK1, A ccession number V00557) の C末端側アミノ酸 1 0残基に相当する 30ヌクレオチド （プライマー No.4) を合成した。 合成 DNA (プライマー No.3)
5' -GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCC-3'
合成 DNA (プライマー No.4)
5' -CTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGT-3'
この 2種類のプライマーを用いて実施例 2で調製した CLN/SUZ
HI icDNA4ngをテンプレー卜に PC Rを行った。 その結果、 約 660塩基対の断片 （PCR c A4) が増幅され、 塩基配列決定により 抗体軽鎖 （Λ鎖） Cドメインおよび可変領域に相当することが明らかと なった。 この PCR c 4をニック トランスレーションの方法でピオチン 化しプローブ （ピオチン化 PC R c A 4) を得た。
実施例 5： cDNAのクローニング
(1)重鎮 cDN Aのクローニング
前記実施例 2で得られた CLNZSUZ HI lcDNAライブラリ —に対して実施例 4で得られたピオチン化プローブを用いてプラークハ イブリダイゼーシヨンを行い 13個の陽性クローンを得た。 この中のク ローンのひとつは約 1.6K塩基対の揷入 DNAを持っており、 このフ ァージを； I CLN— G 111と命名した。
(2)軽鎖 cDN Aのクローニング
前記実施例 2で得られた CLNZSUZ HI lcDNAライブラリ 一に対して実施例 4で得られたビォチン化プロ一ブを用いてプラークハ イブリダィゼーシヨンを行い 27個の陽性クローンを得た。 この中のク ローン 411は約 1.0K塩基対の揷入 DNAを持っており、 このファ —ジを； CLN— K411と命名した。
実施例 6 ：塩基配列の決定
実施例 5においてクローン化したス CLN— Gl 11および； ICLN -K411の EcoR I断片をファージミッ ド Bluescript SK +に再ク ローン化した。 このファージミツ ドで形質転換した大腸菌 XL 1- Blue にヘルパーファージ R 408を感染させ、 一本鎖 DN Aを調整し、 サン ガー法 [Sanger, F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74 ; 5463 (1977) ] により塩基配列を決定した。 その結果得 られた CLN— IgG軽鎖 cDNAクローンの可変領域の塩基配列および それから予測されるアミノ酸配列を以下に示す。 第 1表： C L N - I g G重鎖（y )可変領域断片
AGC CCA GCC CTG GGA TTT TCA GGT GTT TTC ATT TGG TGA TCA GGA CTG AAC AGA GAA CTC
- 19 - 10 - 1
ACC ATG GAC TTT GGG CTG AGC TGG CTT TTT CTT GTG GCT ATT TTA AAA GGT GTC CAG TGT
Met Asp Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu al Ala l ie Leu Lys Gly Val Gin Cys
10 20
GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GAC TTG GTA CAG CCT GGG GGG TCG CTG AGA CTC
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
30 40
TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGC AAC TAT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala
50 60
CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC TCA GCG ATT ACT CCT AGT GGT GGT AGT ACA AAT TAT
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala l ie Thr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr
70 80
GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC CAG AAT ACA CTG TAT
Ala Asp Ser al Lys Gly Arg Phe Thr l ie Ser Arg Asp Asn Ser Gin Asn Thr Leu Tyr
90 100
CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GTC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GGG AGA GTC CCA
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Arg al Pro
110 120
TAT AGA AGC ACT TGG TAC CCT TTA TAT TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA
Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Pro Leu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
GCC
Ala
JDd、
66卜 OAV
SJV sAq aてェ ηιε) Ι¾Λ sAq Jtii Λχο VOO VW DIiV 0V0 Si〇 SW 00V OOD
ATO Ato am ani, 3X1 c <j 33W u o neq sAo JAJ, xAjj ν[ί Β ν atld Js¾ η ο VOO DDO οω ODV 0Ji¾ iYi OVO JiD 001, OVJi JIVOJ JIOV VOO JnLJi .LVO ¾vo οοτ 06
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また、 CLN— I gG重鎖および軽鎖のサブグループを決定するため コンピューター検索を行い相同性の高い遺伝子を調べた結果、 CLN— IgG重鎖可変領域はサブグループ 3に、 まだ軽鎖 （ 鎖） 可変領域は サブグループ 1に属することが明かとなった。
実施例 7 ：超可変領域の決定
種々の抗体の重鎖及び軽鎖のァミノ酸配列を各々比較す と、 配列が 一定の領域 （定常領域） と異なっている領域 （可変領域） が存在するこ とがわかる。 可変領域の中でも特に変異性に富んでいるところを超可変 領域 （hyper-variable region, Hv領域） と呼び、 重鎖及び軽鎖それぞ れ 3箇所ずつ存在する。 アミノ末端から、 それぞれ Hv l、 Ην 2、 H v 3と呼ぶ。 これらの超可変領域は抗原との結合部位を形づくり、 抗原 決定基と直接接触するアミノ酸残基を含んでいると考えられている。 そ のため超可変領域は、 相補性決定領域 （CDR ； Complementarity det erraining region) とも呼ばれ、 抗体の抗原特異性を支配している領域 である。
C LN— I gGの超可変領域を決定するために Kabat & Wuプロッ ト を用いた。 [Kabat, E. A., Wu, T. Τ. , Bilofsky, Η. Varia ble Regions of I mmunoglobulin Chains (Medical Comput. S yst eras, Bolt, B eranek & Newman, Cambridge, 1976) ] これは 種々の抗体の配列を並べて、 各位置ごとに変異度を計算してプロッ 卜す るものである。 ここでいう変異度とは、 「任意の位置における出現アミ ノ酸の種類数」 と 「その位置で最も頻繁に出現するアミノ酸の頻度」 の 比であり、 理論的に 1から 400の値をとる。 変異度の値が大きい領域 が超可変領域である。 (1) CLN— IgG軽鎖の超可変領域の決定
CLN- IgG軽鎖のアミノ酸配列から、 カッパ鎖サブグループ 1に 属することが明かとなった。 そこで NBRF— PDB (rel.26) に含ま れているサブグループ 1に属する 24の配列を CLN— IgG軽鎖と共 に並べ、 各位置で変異度を計算し Kabat & Wuプロットを作製した（図 1) 。 その結果から、 Hvl、 Ην2、 Hv 3をそれぞれ残基番号 28 から 34、 50から 56、 91から 96と決定した。
CLN— IgG軽鎖の超可変領域
H V 1 ： Asp lie Ser Asn Tyr Leu Ala
H v 2 ： Ala Ala Ser Ser Leu His Arg
H v 3 ： Tyr Mer Thr Tyr Pro lie
(2) CLN— IgG重鎮の超可変領域の決定
CLN- IgG重鎖のァミノ酸配列から、 Hvサブグループ 3に属す ることが明かとなった。 そこで NBRF— PDB (rel.26) に含まれて いるサブグループ 3に属する 21の配列を CLN— IgG重鎮と共に並 ベ、 各位置で変異度を計算し Kabat & Wuプロッ トを作製した （図 2、 残基番号 96まで表示）。 その結果、 Hvl、 Hv 2をそれぞれ残基番 号 31から 35、 49から 59と決定した。 Hv 3に関しては、 重鎮の 場合、 下記第 3表に示すごとく、 各配列間で顕著に鎖長が異なるため位 置を正確にあわせることが困難である。 ギヤップを考慮せずに変異度を 計算すると、 残基番号 96システィンが 1. 0、 97グリシンが 2.1、 98アルギニンが 3.9、 99バリンが 29.3、 109チロシンが 18. 4、 110トリブトファンが 3.5、 111グリシンが 1.0となる。 明 かに残基番号 99から 109までの位置で変異度が高く、 この領域が H に相当する。
CLN- I gG重鎖の超可変領域
H V 1 ： Asn Tyr Ala Met Ser
H v 2 : Ser Ala lie Thr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Asn H v 3 ： Val Pro Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Pro Leu Tyr 3 表
Kol CARDGGHGFCSSASCFGPDYWGQGTPVTVS S
Bro CARSPVSLVDGWLYYYYGSVWGQGTL
Cam CAR DRPLYGDYRAFNYWGQGTLVTVS S
Tro CAA TDDFDWSTFSLDYWGEGDLVTVS S
Tei CAR VTPAAASLTFSAV GQGTLVT
Pom CAR DAGPY VS PTFF AH YGQGTLVT
Ga CAR SGIALGSVAGTDYWGEGTLVTISS
Lay CAR DAGPYVSPTFFAHWGQGTLVT
Hil CAR DPDIIiTAFSFD YWGQGVLiVTVS S
99 i09
CLN CG - PYRST YPLWGQGTLVTVS SAS
Dob CAK GYIWNGNWFDSWGQGTLVTVS was CAR FRQ PFVQFFDVFGQGTLVT Bur CAK LIAVAG - TRDFWGQGTLVTVSL Tur CAR LSVTAVAFDVWGQGTKVS Til CAK GKVSAYYFDYWGEGTLVTVS S zap CAR TRPGGYFSDVWGQGTLVS Nie CAR IRDTAMFFAHWGQGTLVTVS S Jon CAR VWS TSMDVWGQGTPVT Gal CAR GWGGGDYWGQGTLVTVST But CAR DLAAARLFGKGTTVTVS S
WEA CAR - GWLLNWGQGTLVTVS S 産業上の利用可能性
C L N- I gG抗体及びその遺伝子構造が明かになったことによって、 この遺伝子を動物細胞や大腸菌などの宿主細胞に導入し発現させ、 抗体 を多量に得ることが可能となる。 更には完全抗体のみならず、 ある種の 抗体断片、 たとえば重鎮のみ、 軽鎖のみ、 Fab断片、 F (ab)' 2断片、 F V断片、 ドメイン断片 （dAb)、 C D R断片などの各種抗体由来断片を 得ることが可能となる。 また更に抗体遺伝子に人為的突然変異を起こす ことにより、 ァミノ酸配列の一部異なる完全抗体もしくは各種抗体由来 断片を得ることができる。
現在までの研究の結果、 C L N— I gGは、 たとえばヒト胃ガン、 肺 ガン、 脳腫瘍、 悪性黒色腫などのごときヒト癌細胞に働き、 それ自体の 作用でこれら癌細胞の増殖を抑制し、 或は癌細胞を死滅させ、 さらには 捕体もしくは K—細胞やマクロファージなどの助けを借りて癌細胞の増 殖を抑制し、 癌細胞の死滅を引き起こすことが期待される。 しかし、 C L N - I gGの遺伝子を改変し抗体のアミノ酸を一部置換することによ り、 更に抗体の活性を上昇させることが可能である。 たとえば抗原との 結合親和性や、 免疫担当細胞を介した抗癌活性、 あるいは組織への浸潤 性などが上昇するように改変できる。 さらには、 たとえば細胞毒性、 酵 素活性、 免疫誘導活性などを抗体分子もしくはその断片に遺伝子レベル で付加する毒性、 酵素活性、 免疫誘導活性などを抗体分子もしくはその 断片に遺伝子レベルで付加することで、 より抗癌活性の高い分子をデザ インすることが考えられる。 具体例を挙げれば、 癌特異的抗体をキヤリ ァ一として利用して、 例えば化学療法剤結合ーヒトモノクローナル抗体、 インターフェロン結合ーヒトモノクローナル抗体、 高分子毒素結合ーヒ トモノクローナル抗体、 薬物入りリボゾーム結合ーヒ トモノクローナル 抗体、 などの形で癌細胞の増殖抑制や死滅を誘導する薬剤として有用で ある。 また、 抗体に放射線感受性物質を結合させて患者に投与し、 釋細 胞に選択的に集積させ、 治療、 診断の効果を上げることも考えられる。 このような癌に対する利用に際しては、 ヒ トモノクローナル抗体として 完全な抗体を用いてもよいし、 前述したとおり、 例えば重鎖のみ、 軽鎖 のみ、 F ab断片、 F (ab)' 2断片、 F v断片、 ドメイン断片 （dAb) 、 C D R断片などの特異的抗原認識部位を含むより小さな断片を用いること もできる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 下記のアミノ酸配列
H V 1 ： Asn Tyr Ala Met Ser
H v 2 : Ser Ala lie Thr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Asn
H v 3 ： Val Pro Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Pro Leu Tyr を有する超可変領域 Hvl、 Hv2及び Hv3から選ばれる少なくとも 1つの 超可変領域を含むことを特徵とする免疫グロプリン重鎖可変領域断片。
2. 下記のアミノ酸配列
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Asp10
Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu20
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Plie Thr Phe Ser30
Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin. Ala40
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala50
ェ le Thr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie70
Ser Arg Asp Asn Ser Gin Asn Thr Leu Tyr80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp90
Thr Ala al Tyr Tyr Cys Gly Arg Val Pro100
Tyr Arg Ser 1¾r Trp Tyx Pro Leu Tyr Trp110
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser120
Ala を有する免疫グロプリン重鎮可変領域断片。
3. 下記のアミノ酸配列 H V 1 ： Asn Tyr Ala Met Ser
H v 2 : Ser Ala lie Thr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Asn H v 3 ： Val Pro Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Pro Leu Tyr を有する超可変領域 H vl、 Η ν2及び Η ν3から選ばれる少なくとも 1つの 超可変領域をコードする塩基配列を含むことを特徵とする免疫グロプリ ン重鎖可変領域の少なくとも一部をコードする D N A及び R N A断片。
4. 請求の範囲第 2項記載のアミノ酸配列をコードする D N A及び R N A塩基配列。
5. 下記の塩基配列
10 20 30 40 50 60
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGACTTGGTACAGCCTGGGGGGTCGCTGAGACTC
7 0 80 90 100 110 120
TCCTGTGCAGCCTCTGGAT CACCTTCAGCAACTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
130 140 150 160 17 0 180
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCGATTACTCCTAGTGGTGGTAGTACAAATTAT
190 200 210 220 230 240
GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCCAGAATACACTGTAT
250 260 270 280 290 300
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGGGAGAGTCCCA
310 320 330 . 340 350 360
TATAGAAGCACTTGGTACCCTTTATATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
GCC
を有する請求の範囲第 4項記載の D N A塩基配列及びこれに対応する R N A塩基配列。
6. 下記のアミノ酸配列
H V 1 ： Asp lie Ser Asn Tyr Leu Ala
H v 2 : Ala Ala Ser Ser Leu His Arg
H v 3 ： Tyr Met Thr Tyr Pro lie
を有する超可変領域 H vl、 H v2及び H v3から選ばれる少なくとも 1つの 超可変領域を含むことを特徴とする免疫グロプリン軽鎖可変領域断片。
7 . 下記のアミノ酸配列 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 10
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val hr 20 lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Ser 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gin Gin Lys Pro 0 Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie Tyr Ala 50 Ala Ser Ser Leu His Arg Lys Val Pro Thr 60
Gin Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 70
Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyx Tyr Cys Leu Gin 90
Tyr Met Thr Tyr Pro lie Thr PHe Gly Gl 100
Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg
を有する免疫グロプリン軽鎖可変領域断片。
8. 下記のアミノ酸配列
H V 1 ： Asp He Ser Asn Tyr Leu Ala
H v 2 ： Ala Ala Ser Ser Leu His Arg
H v 3 ： Thr Met Thr Tyr Pro lie
を有する超可変領域 H vl、 H v2及び H v3から選ばれる少なくとも 1つの 超可変領域をコードする塩基配列を含むことを特徴とする免疫グロブリ ン軽鎮可変領域の少なくとも一部をコ一ドする D N A及び R N A断片。
9. 請求の範囲第 7項記載のアミノ酸配列をコードする D NA及び R NA塩基配列。
1 0. 下記の塩基配列 10 20 30 40 50 60
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
7 0 80 9 0 100 110 120
ATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGACA TAGTAATTATTTAGCCTGG T CAGCAGAAACCA
130 140 150 160 170 " 180
GGGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGT GCACAGGAAGGTCCCAACA
19 0 200 210 22 0 230 240
CAATTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT
250 260 ' 270 280 290 300
GAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCTACAGTATATGACTTACCCTATCACCTTCGGCGGA
310 320
GGGACCAAGGTGGAGATCAAACGA を有する請求の範囲第 9項記載の D N A塩基配列及びこれに対応する R N A塩基配列。
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