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WO1992020783A1 - Verfahren zur bereitstellung von antigen-spezifischen b- und t-lymphozyten sowie davon erhaltene monoklonale antikörper - Google Patents

Verfahren zur bereitstellung von antigen-spezifischen b- und t-lymphozyten sowie davon erhaltene monoklonale antikörper Download PDF

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WO1992020783A1
WO1992020783A1 PCT/EP1992/001089 EP9201089W WO9220783A1 WO 1992020783 A1 WO1992020783 A1 WO 1992020783A1 EP 9201089 W EP9201089 W EP 9201089W WO 9220783 A1 WO9220783 A1 WO 9220783A1
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WO
WIPO (PCT)
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antigen
cells
lymphocytes
specific
mammals
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PCT/EP1992/001089
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English (en)
French (fr)
Inventor
Johann Hinrich Peters
Susanne Lenzner
Uwe Scholtes
Carl Watzek
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Idt AG fur In Vivo Diagnostik und Therapie
Original Assignee
Idt AG fur In Vivo Diagnostik und Therapie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin

Definitions

  • the present invention relates to a method for providing antigen-specific B and T lymphocytes, 5 in which body fluids and / or tissues from
  • Mammals isolated antigen-presenting cells and lymphocytes are incubated together for a specific adhesion and cultured according to conventional methods.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a method with which this can be avoided.
  • antigen-presenting cells and lymphocytes are isolated from various body fluids and / or tissues from mammals.
  • Blood, lymph, pleural, peritoneal and synovial fluid and cerebrospinal fluid are to be mentioned here in particular as body fluids.
  • the body fluids can be taken from both healthy and sick mammals. The same applies to
  • Tissues of which the spleen, lymph nodes, bone marrow, skin and tumors are to be specified.
  • mammals 5 are meant in particular humans, domestic and laboratory animals, whereby domestic animals are also to be understood as domestic animals.
  • body fluids and / or tissues can originate from one or more mammals. It is not imperative that, when using several mammals, they all belong to one of the groups mentioned above.
  • the method according to the invention is just as limited to
  • Mammals rather it includes all living things from the animal kingdom, from which the above cells can be isolated.
  • Ficoll-Hypaque centrifugation method can be used to isolate the antigen-presenting cells and the lymphocytes.
  • body fluids are used directly, while solid tissues and tumors are centrifuged only after individual preparation by comminution and digestion with conventional enzymes, such as collagenase dispase or trypsin, under conditions such as 1 h at 37 ° C.
  • the antigen-presenting cells and the lymphocytes are obtained in the interphase and then washed several times with a physiological buffer, for example PBS, pH 7.2.
  • the antigen-presenting cells are separated from the lymphocytes.
  • Known methods can be used for this.
  • the cells are in one
  • Culture vessel incubated with serum-free medium, for example RPMI 1640 or CG medium, under customary conditions, such as 37 ° C. and 5% CO.
  • the culture vessel has a coating with plasma or serum, which comes from the same mammal (autologous) or from the same species (allogeneic) from which the antigen-presenting cells and the lymphocytes have been isolated.
  • the antigen-presenting cells spontaneously adhere to the coating, whereas the lymphocytes remain in suspension. After an hour's incubation, the lymphocytes are pipetted off, while the antigen-presenting cells remain.
  • the lymphocytes are freed from suppressive cells, for which purpose they are treated, for example, with leucine methyl ester (1.25 mM) for 30 minutes at room temperature and then several times in the above-mentioned, serum-free cells
  • the antigen-presenting cells are activated, whereby they are treated differently according to their maturity.
  • Antigen-presenting cells made of solid tissue are mature in many cases and therefore highly active. In contrast, they are often not mature from body fluids and are therefore incubated for about 24 hours in the culture vessels specified above, e.g. CG medium specified above is used.
  • Factors for induction such as interleukin-1, interleukin-6, adenosine or dibutyryl-cAMP, are advantageously added.
  • antigen-presenting cells from bone marrow are usually still present as precursor cells and are therefore incubated in one of the media specified above for about 1 week.
  • Factors such as linoleic acid (4.ug/ml), vitamin D3 (2.5 M), vitamin E (0.1%), multi-CSF (2 U / ml) and M-CSF (3 U / ml ) added.
  • Added antigen is, for example, in the range from 1 ⁇ g to 10 ⁇ g / ml culture medium. It is added from a few minutes to 24 hours.
  • Whole or parts of cells, pathogens and / or biomolecules can be mentioned as antigen. Under cells there are both normal and to understand virus-modified and pathologically degenerate.
  • the pathogens include viruses, bacteria and allergens, while the biomolecules include antibodies, mediators, enzymes and neurotransmitters.
  • the antigens can be used as such alone or in combination with conventional carrier molecules, both of which are also used in mixtures with common adjuvants.
  • the antigen-presenting cells and the lymphocytes are incubated together for specific adhesion.
  • the cells are introduced into the culture vessels specified above, the lymphocytes being in a 10 to 1000-fold excess, and cultured with one of the media mentioned above.
  • the cultivation time is 15 minutes to 2 days at 37 ° C or a maximum of 24 hours at 4 ° C.
  • the non-adherent cells are separated from the adherent ones. To do this, wash the coated ones carefully by rinsing them carefully
  • the adherent cells are further cultivated by customary methods. They are incubated in the culture vessels specified above.
  • As the medium an above-mentioned one is used, to which factors that require proliferation, such as interleukin-2, -4 or -6, can be added.
  • a conditioned medium which is obtained, for example, from permanent cell cultures, can also be added.
  • the incubation leads to the proliferation of antigen-specific B and T lymphocytes. Unspecific lymphocytes are only formed in an extremely small amount. After 4 days of incubation, antibodies are obtained in the supernatants, the amount of which can be increased by further incubation. It is also advantageous to add fresh medium with proliferation-promoting factors every week. If necessary, antigen-presenting cells can also be added, but these should correspond to the originally used cells.
  • the antibodies obtained according to the invention are highly specific against the antigens used, in particular after cloning. It is then a monoclonal idiotype
  • Antibodies also anti-idiotype antibodies if an antibody has been used as the antigen.
  • the antigen-specific B and T lymphocytes obtained according to the invention are extremely homogeneous in themselves. After cloning, they are particularly suitable for the isolation of specific nucleic acid precursors, for example mRNA, which can then be used for gene cloning purposes and for the amplification of specific nucleic acid sequences using known techniques, for example PCR methods. Furthermore, the B- and T lymphocytes for adoptive immunotherapy. Furthermore, they can also be immortalized by conventional methods, such as fusion with hybridoma cells. The B lymphocytes obtained according to the invention can furthermore be cultured and expanded further by adding anti-CD40 antibodies.
  • Ficoll-Hypaque centrifugation method isolated and separated from each other in culture vessels with autologous plasma coating.
  • the lymphocytes were freed from suppressive cells by treatment with leucine methyl ester, while the antigen-presenting cells were incubated with 0, 1 and 10 ng tetanus toxoid / ml medium for 24 h as described above. The antigen was then washed out.
  • the antigen-presenting cells and the lymphocytes were incubated together with CG medium in the culture vessels described above.
  • the lymphocytes were in 200-fold excess. After 24 hours of incubation, the non- adherent cells removed by careful pipetting. Fresh medium supplemented with conditioned medium was added to the adherent cells. After 6 days of incubation, cell count, total antibody amount and specific
  • Antibody amount determined.
  • the specific antibody synthesis was determined in an ELISA using a tetanus toxoid bound to plastic as the antigen.
  • the non-specific antibody synthesis was also determined in an ELISA using a mouse antibody directed against human Ig.
  • antigen-specific B and T lymphocytes are preferably provided in the methods according to the invention, whereas non-antigen-specific ones are largely diluted.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bereitstellung Antigen-spezifischer B- und T-Lymphozyten, bei dem aus Körperflüssigkeiten und/oder Geweben von Säugetieren antigenpräsentierende Zellen und Lymphozyten isoliert, diese zu einer spezifischen Adhäsion gemeinsam inkubiert und nach üblichen Verfahren kultiviert werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die adhärenten Zellen von den nicht-adhärenten abgetrennt und nur die adhärenten Zellen, nicht aber die nicht-adhärenten kultiviert werden.

Description

Verfahren zur Bereitstellung von Antigen-spezifischen B- und T- ymphozyten sowie davon erhaltene monoklonale Anti¬ körper
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bereitstellung Antigen-spezifischer B- und T-Lymphozyten, 5 bei dem aus Körperflüssigkeiten und/oder Geweben von
Säugetieren antigenpräsentierende Zellen und Lymphozyten isoliert, diese zu einer spezifischen Adhäsion gemeinsam inkubiert und nach üblichen Verfahren kultiviert werden.
IQ Ein solches Verfahren ist aus Maeda, T. et al., Hybridoma,
Band 5, Nr. 1 (1986), 33-41 bekannt.
Es hat sich nun gezeigt, daß dieses Verfahren in großem Maße zu unspezifischen, nicht-Antigen-spezifischen B- und jg T-Lymphozyten führt.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgäbe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem dies vermieden werden kann. 0
Erfindungsgemäß wird dies dadurch erreicht, daß in obigem Verfahren die adhärenten Zellen von den nicht-adhärenten abgetrennt und nur die adhärenten Zellen, nicht aber die nicht-adhärenten kultiviert werden. 5
Erfindungsgemäß werden antigenpräsentierende Zellen und Lymphozyten aus verschiedenen Körperflüssigkeiten und/oder Geweben von Säugetieren isoliert. Als Körperflüssigkeit sind hier insbesondere Blut, Lymphe, Pleura-, Peritoneal- und 0 Gelenkflüssigkeit sowie Liquor cerebrospinalis zu nennen. Die Körperflüssigkeiten können sowohl gesunden wie auch kranken Säugetieren entnommen werden. Gleiches gilt auch für
Gewebe, von denen insbesondere Milz, Lymphknoten, Knochenmark, Haut und Tumore anzugeben sind. Als Säugetiere 5 sind insbesondere Mensch, Haus- und Labortier gemeint, wobei unter Haustier auch Nutztier zu verstehen ist.
Für das er indungsgemäße Verfahren können Körper- flüssigkeiten und/oder Gewebe von ein oder mehreren Säugetieren stammen. Es ist nicht zwingend, daß bei Verwendung mehrerer Säugetiere diese alle einer der vorstehend genannten Gruppen angehören. Genausowenig beschränkt sich das erfindungsgemäße Verfahren nur auf
Säugetiere, vielmehr umfaßt es alle Lebewesen des Tierreichs, aus denen obige Zellen isoliert werden können.
Zur Isolierung der antigenprasentierenden Zellen und der Lymphozyten können bekannte Verfahren, beispielsweise das Ficoll-Hypaque-Zentrifugationsverfahren, angewandt werden. Hierzu werden Körperflüssigkeiten direkt eingesetzt, während solide Gewebe und Tumore erst nach Einzelpräparation durch Zerkleinerung und Verdauung mit üblichen Enzymen, wie Kollagenase-Dispase oder Trypsin, unter Bedingungen, wie 1 h bei 37°C, zentrifugiert werden. Die antigenprasentierenden Zellen und die Lymphozyten werden in der Interphase erhalten und dann mehrmals einer Waschung mit einem physiologischen Puffer, beispielsweise PBS, pH 7.2, unterzogen.
Erfindungsgemäß werden die antigenprasentierenden Zellen von den Lymphozyten getrennt. Hierfür können bekannte Verfahren verwendet werden. Vorzugsweise werden die Zellen in einem
Kulturgefäß mit serumfreiem Medium, beispielsweise RPMI 1640 oder CG-Medium, unter üblichen Bedingungen, wie 37°C und 5 % C0_ inkubiert. Das Kulturgefäß weist eine Beschichtung mit Plasma oder Serum auf, wobei dieses aus dem gleichen Säuge- tier (autolog) oder einem der gleichen Spezies (allogen) stammt, aus dem die antigenprasentierenden Zellen und die Lymphozyten isoliert worden sind. Die antigenprasentierenden Zellen adhärieren spontan an die Beschichtung, wohingegen die Lymphozyten in Suspension bleiben. Nach einstündiger Inkubation werden die Lymphozyten abpipettiert, während die antigenprasentierenden Zellen zurückbleiben.
Erfindungsgemäß werden die Lymphozyten von supprimierenden Zellen befreit, wozu sie beispielsweise mit Leucin- methylester (1,25 mM) , 30 min bei Raumtemperatur behandelt und dann mehrfach in vorstehend angegebenem, serumfreien
Medium gewaschen werden.
Die antigenprasentierenden Zellen werden dagegen aktiviert, wobei sie entsprechend ihres Reifezustands unterschiedlich behandelt werden. Antigenpräsentierende Zellen aus solidem Gewebe sind vielfach ausgereift und somit hochaktiv. Im Gegensatz dazu sind sie aus Körperflüssigkeiten oftmals nicht ausgereift und werden daher etwa 24 h in vorstehend angegebenen Kulturgefäßen inkubiert, wobei z.B. vorstehend angegebenes CG-Medium verwendet wird. Vorteilhafterweise werden hierbei Faktoren zur Induktion, wie Interleukin-1, Interleukin-6, Adenosin oder Dibutyryl-cAMP, zugegeben. Desweiteren liegen antigenpräsentierende Zellen aus Knochenmark zumeist noch als Vorläuferzellen vor und werden daher in einem der vorstehend angegebenen Medien etwa 1 Woche inkubiert. Diesem werden Faktoren, wie Linolsäure (4.ug/ml), Vitamin D3 (2,5 M) , Vitamin E (0,1 %) , Multi-CSF (2 U/ml) und M-CSF (3 U/ml) zugegeben.
Erfindungsgemäß wird den antigenprasentierenden Zellen
Antigen zugegeben. Seine Menge liegt z.B. im Bereich von 1 pg - 10 .ug/ml Kulturmedium. Es wird wenige Minuten bis 24 Stunden zugegeben. Als Antigen sind ganze oder Teile von Zellen, Krankheitserregern und/oder Biomolekülen zu nennen. Unter Zellen sind dabei sowohl normale wie auch virusmodifizierte und krankhaft entartete zu verstehen. Die Krankheitserreger umfassen Viren, Bakterien und Allergene, während zu den Biomolekülen Antikörper, Mediatoren, Enzyme und Neurotransmitter zu rechnen sind.
Die Antigene können als solche allein oder gekoppelt mit üblichen Carriermolekülen eingesetzt werden, wobei beide auch in Gemischen mit gängigen Adjuvantien verwendet werden.
In manchen Fällen kann es aber von Vorteil sein, auf die Zugabe von Antigen zu verzichten, insbesondere dann, wenn die antigenprasentierenden Zellen bereits im Organismus hinreichend mit Antigen in Kontakt gekommen sind. Dies ist insbesondere bei aus einem Tumor und aus rheumatischem Gewebe isolierten Zellen der Fall. Desweiteren kann es hier, wie auch in anderen Fällen, von Vorteil sein, ganz auf die vorstehend angegebene Trennung von antigenprasentierenden Zellen und Lymphozyten zu verzichten und die aus dem Ficoll-Hypaque-Zentrifugations- verfahren erhaltene Interphase direkt weiter zu verwenden.
Erfindungsgemäß werden die antigenprasentierenden Zellen und die Lymphozyten zu einer spezifischen Adhäsion gemeinsam inkubiert. Hierzu werden die Zellen in vorstehend angegebene Kulturgefäße eingebracht, wobei die Lymphozyten in 10- bis 1000-fachem Überschuß vorliegen, und mit einem der vorstehend genannten Medien kultiviert. Als Kultivierungszeit sind 15 min bis 2 Tage bei 37°C oder maximal 24 h bei 4°C anzugeben.
Erfindungsgemäß werden die nicht-adhärenten Zellen von den adhärenten abgetrennt. Hierzu werden erstere durch vorsichtiges Spülen von den an den beschichteten
Kulturgefäßen adhärenten Zellen abgezogen. Desweiteren werden, wenn schwimmende, aneinander adhärente Zellen vorliegen, die nicht-adhärenten durch eine wenige Minuten dauernde Geschwindigkeits-Sedimentation bei 1 bis 1500 g abgetrennt.
Erfindungsgemäß werden die adhärenten Zellen weiter nach üblichen Verfahren kultiviert. Sie werden in vorstehend angegebenen Kulturgefäßen inkubiert. Als Medium wird ein vorstehend genanntes verwendet, dem proliferationsfordernde Faktoren, wie Interleukin-2, -4 oder -6 zugegeben werden können. Auch kann ein konditioniertes Medium, das beispielsweise von permanenten Zellkulturen gewonnen wird, zugesetzt werden. Die Inkubation führt zur Proliferation von antigenspezifischen B- und T-Lymphozyten. Unspezifische Lymphozyten werden nur in äußerst geringer Menge gebildet. Nach 4-tägiger Inkubation werden Antikörper in den Überständen erhalten, deren Menge durch weitere Inkubation gesteigert werden kann. Vorteilhaft ist es auch, jeweils nach einer Woche frisches Medium mit proliferationsfordernden Faktoren zuzugeben. Gegebenenfalls können auch antigenpräsentierende Zellen zugegeben werden, wobei diese jedoch den ursprünglich eingesetzten entsprechen sollen.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Antikörper sind insbesondere nach Klonierung hochspezifisch gegen die verwendeten Antigene. Es handelt sich dann um monoklonale Idiotyp-
Antikörper, ferner auch um Anti-Idiotyp-Antikörper, wenn als Antigen ein Antikörper eingesetzt worden ist.
Die erfindungsgemäß erhaltenen, antigenspezifischen B- und T-Lymphozyten sind in sich äußerst homogen. Sie eignen sich insbesondere nach Klonierung zur Isolierung von spezifischen Nukleinsäurevorstufen, beispielsweise mRNA, die dann für Genklonierungszwecke und zur Vermehrung spezifischer Nukleinsäuresequenzen über bekannte Techniken, beispielsweise PCR-Verfahren genutzt werden können. Ferner eignen sich die erfindungsgemäß hergestellten B- und T-Lymphozyten zur adoptiven Immuntherapie. Desweiteren können sie auch durch übliche Verfahren, wie Fusion mit Hybridomzellen, immortalisiert werden. Die erfindungsgemäß erhaltenen B-Lymphozyten können darüberhinaus durch Zugabe von Anti-CD40-Antikörpern weiter kultiviert und expandiert werden.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Isolierung, Trennung und Behandlung von antigen¬ prasentierenden Zellen und Lymphozyten aus Blut
Aus gesunden, mit Tetanusantigen immunisierten Spendern wurden, wie vorstehend beschrieben, antigenpräsentierende Zellen und Lymphozyten über das
Ficoll-Hypaque-Zentrifugationsverfahren isoliert und in Kulturgefäßen mit autologer Plasmabeschichtung voneinander getrennt. Die Lymphozyten wurden durch Behandlung mit Leucin- methylester von supprimierenden Zellen befreit, während die antigenprasentierenden Zellen 24 h, wie vorstehend beschrieben, mit 0, 1 und 10 ng Tetanustoxoid/ml Medium inkubiert wurden. Das Antigen wurde anschließend ausgewaschen.
Beispiel 2
Gemeinsame Inkubation der antigenprasentierenden Zellen und der Lymphozyten sowie anschließende Abtrennung der nicht- adhärenten Zellen.
Die antigenprasentierenden Zellen und die Lymphozyten wurden in vorstehend beschriebenen Kulturgefäßen mit CG-Medium gemeinsam inkubiert. Die Lymphozyten lagen in 200-fachem Überschuß vor. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die nicht- adhärenten Zellen durch vorsichtiges Pipettieren entfernt. Den adhärenten Zellen wurde frisches Medium, ergänzt mit konditioniertem Medium, zugegeben. Nach 6 Tagen Inkubation wurden Zellzahl, Gesamtantikörpermenge und spezifische
Antikörpermenge bestimmt. Die spezifische AntikörperSynthese wurde in einem ELISA mittels eines an Plastik gebundenen Tetanustoxoids als Antigen bestimmt. Die unspezifische Antikörpersynthese wurde ebenfalls in einem ELISA bestimmt, bei dem ein gegen humanes Ig gerichteter Maus-Antikörper verwendet wurde.
Die Ergebnisse in der Figur zeigen folgendes: In Abwesenheit von antigenprasentierenden Zellen (m-AC) findet sich in den gespülten Ansätzen keine signifikante spezifische Anti¬ körpersynthese, während diese in den Ansätzen in Anwesenheit von m-AC (schraffierte Säulen) vorliegt. Bei Zugabe von 10 ng/ l Antigen ist die Ausbeute am höchsten. Bei 1 ng/ml stark, und selbst ohne Zugabe des Antigens findet sich eine signifikante, spezifische Antikörperproduktion. Die
Gesamtantikörpermenge (rechte Ordinate) ist in diesen Ansätzen außerordentlich niedrig (A ) • In den nicht-gespülten Kontrollen, bei denen also adhärente und nicht-adhärente Zellen vorliegen, finden sich zwar signifikante Mengen von spezifischem Antikörper, jedoch liegt auch eine sehr hohe Menge an nicht-spezifischen Antikörpern vor. Gleichzeitig ist die Zellzahl in den nicht-gespülten Kontrollen etwa um den Faktor 10 höher als in den gespülten Ansätzen.
Dies unterstreicht, daß in den erfindungsgemäßen Verfahren antigenspezifische B- und T-Lymphozyten bevorzugt bereitgestellt, nicht-antigenspezifische dagegen weitgehend ausverdünnt werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bereitstellung Antigen-spezifischer B- und T-Lymphozyten, bei dem aus Körperflüssigkeiten und/oder Geweben von Säugetieren antigenpräsentierende Zellen und Lymphozyten isoliert, diese zu einer spezifischen Adhäsion gemeinsam inkubiert und nach üblichen Verfahren kultiviert werden, dadurch gekennzeichnet, daß die adhärenten Zellen von den nicht-adhärenten getrennt und nur die adhärenten Zellen, nicht aber die nicht- adhärenten kultiviert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeiten Blut, Lymphe, Pleura-, Peritoneal- und Gelenkflüssigkeit sowie Liquor cereprospinalis umfassen.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewebe Milz, Lymphknoten, Knochenmark, Haut und Tumore umfassen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Säugetiere Mensch, Haus- und Labortier umfassen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche l und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeiten und/oder
Gewebe aus ein oder mehreren Säugetieren stammen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 5, dadurch gekennzeichnet, daß vor Inkubation zur Adhäsion die antigenprasentierenden Zellen aktiviert und die
Lymphozyten von supprimierenden Zellen befreit werden,
7. Verfahren nach Anspruch 6,. dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung der antigenprasentierenden Zellen die Zugabe von Antigen umfaßt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Antigen ganze oder Teile von Zellen, Krankheits¬ erregern und/oder Biomolekülen zugegeben werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen normale, virusinfizierte und krankhaft entartete, die Krankheitserreger Viren, Bakterien und Allergene und die Biomoleküle Antikörper, Mediatoren, Enzyme und Neurotransmitter umfassen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation zur Adhäsion in mit Plasma oder Serum beschichteten Kulturgefäßen erfolgt, wobei das Plasma oder Serum zumindest aus einem der Säugetiere stammt, das zur Isolierung der antigen¬ prasentierenden Zellen, und Lymphozyten herangezogen worden ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 -10, dadurch gekennzeichnet, daß die üblichen Kultivierungsverfahren die Klonierung und Fusion mit Myelomzellen umfassen.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 10, dadurch gekennzeichnet, daß die üblichen Kultivierungsverfahren für die B-Lymphozyten die Klonierung und Zugabe von Anti-CD 40 Antikörpern umfassen.
13. Antikörper, erhalten nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 12.
PCT/EP1992/001089 1991-05-16 1992-05-18 Verfahren zur bereitstellung von antigen-spezifischen b- und t-lymphozyten sowie davon erhaltene monoklonale antikörper Ceased WO1992020783A1 (de)

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