WO1992008741A1 - Composes a liberation progressive d'oligemeres de la glucosamine, procede de preparation et applications - Google Patents
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- C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
Definitions
- glucosamine oligomers a central problem, as for chitosan, concerns the lifetime of said oligomers, as active agents or principles.
- this problem is in the present case exacerbated by the relatively low molecular weight of the oligomers considered. It is known in fact that these oligomers can be quickly entrained in solution, degraded, altered under the effect of different physical, chemical agents, etc. And it is therefore essential to find a form of these oligomers allowing progressive, controlled release , or delayed by these agents or active ingredients, "in situ", that is to say at the very place where they act or intervene.
- the dissolution of the new form identified previously generates a pseudo-equilibrium between the isomolecular aggregate or aggregates of the oligomer on the one hand, and the isolated form of the same oligomer " on the other hand, gradually leading to the dissociation of said aggregates, and the release of the isolated form of the same oligomer.
- the basic oligomer has a degree of polymerization of between 2 and 100, and preferably between 20 and 30
- the compound according to the invention is at . solid state, after precipitation followed by possible lyophilization
- the mixture of oligomers is separated by steric exclusion chromatography, in which case the elution phase of the chromatography is an ammonium acetate-acetic acid system
- the separation of the oligomer fractions can be obtained more quickly and with better efficiency, on steric exclusion chromatography columns of a particular type, identified below, and this for degrees of polymerization between 15 and 100.
- chitosans produced in France by the Abertechnologies Company.
- the anion associated with the ammonium form can be chosen from any of the acids. If we take the example of a chloride, the fraction is concentrated to the maximum, then precipitated with isopropyl alcohol, washed and dried. The precipitate is redissolved in water, and the solution is lyophilized, after addition of the stoichiometric amount (in very slight excess) of hydrochloric acid. It should however be noted that it is preferable to use strong, non-organic acids, which give much more stable salts in the solid state. For the free amino form, it is sufficient after concentration of the fraction, to add dilute ammonia until reaching a pH of 9,, where the precipitation is complete. The precipitate is then washed with water, then lyophilized after centrifugation and redispersion in water.
- the phenomenon also decreases when the solutions are heated, when the concentration is reduced, or when the solutions are allowed to age. However, in any case, it never disappears completely and there always exists " a pseudo-balance between the aggregated oligomers and the isolated oligomers. Thus, if the proportion of isolated oligomers increases with time, to the detriment of the aggregated oligomers, this increase does not exceed 25%, even after several weeks of storage of the solution. This effect is all the less important as the initial concentration of oligomer is high. The phenomenon observed is a pseudo equilibrium corresponding to a delayed dissolution mechanism.
- the fraction comprising the isolated oligomers is separated from the fraction containing all the aggregated oligomers, it is shown that in the second fraction the equilibrium is shifted towards the formation of isolated oligomers, after dissolution of this fraction without isolating it, and that on the other hand the first fraction corresponding to the isolated oligomers undergoes no modification in solution.
- the same solution after having been concentrated ten times, gives exactly the same chromatogram as that of the starting solution.
- the compounds according to the invention will be used as biostimulants or bioprotectors, either in solid form, in particular in the case of ornamental plants, or in foliar spraying where the mechanism of alternating solid solution will occur in situ .
- nmère we call any aggregation of n molecules of the same oiomer, between them.
- a chitosan sample from an Abertechnologies batch is totally deacetiated according to the method described by A. DOMARD et al., Int. J. Biol. Macromol. (1983) _5, 49.
- the totally deacetiated chitosan thus prepared is hydrolyzed according to the method proposed by A. DOMARD et al, Int. 3. Biol. Macromol. (1989) _U, 297, in 12 N hydrochloric acid at 72 ° C.
- An example of distribution obtained for a hydrolysis time of approximately 1 hour is given in FIG. 1.
- FIG. 6 makes it possible to highlight the decreasing proportion, with their mass, of the higher "n-mothers".
- iiii - The proportion of the main peak corresponding to the isolated molecules is always greater than or equal to 90%, when the oligomer has been isolated in acid form.
- a solution of a fraction centered on DP 39, prepared at a concentration of 25 g / 1 shows that the proportion of the peaks of "n-mothers" can exceed 65% of - the sample ( Figure 7).
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Abstract
La présente invention concerne des oligomères de la glucosamine de degrés de polymérisation relativement faibles, considérés en tant que principes ou agents actifs d'un traitement. Selon l'invention, on a mis en évidence qu'en laissant reposer après isolement de tels composés, on aboutissait à un mélange comprenant, d'une part au moins un agrégat isomoléculaire associant directement et uniquement par voie physique plusieurs molécules de l'oligomère de base, dont la masse moléculaire totale est un multiple de celle dudit oligomère de base, et d'autre part la forme isolée du même oligomère, c'est-à-dire à l'état non agrégé. Ce mélange aboutit en solution à un pseudo-équilibre des constituants identifiés précédemment. Il s'agit donc d'une forme retard des oligomères de la glucosamine.
Description
COMPOSES A LIBERATION PROGRESSIVE D'OLIGOMERES DE LA GLUCOSAMINE, PROCEDE DE PREPARATION ET APPLICATIONS De manière générale, la présente invention concerne les oligomères de la glucosamine, en tant qu 'agents ou principes actifs dans différentes applications, notam ment thérapeutiques, cosmétiques, alimentaires et diététiques, et traitement des plantes et végétaux.
Par oligomère de la glucosamine, on entend un polymère de cette dernière, ayant un degré de polymérisation inférieur ou égal à 100, le distinguant des polymères de plus haut poids moléculaire, assimilables à des chitosanes pratiquement complètement N-désacétylés.
On pressent tout l'intérêt et l'action des oligomères de la glucosamine, quand on sait que dans beaucoup d'applications du chitosane, ce sont en fait les formes dégradées de ce dernier, correspondant à une diminution du degré de polymérisation, qui sont en fait actives. Ainsi, on se référera aux documents suivants :
- le document WO-A-8907395 démontrant qu'un chitosane a un effet bénéfique sur les plantes et végétaux, notamment leur croissance, leur résistance au gel, etc..
- la publication de MM. Thomas CHANDY et Chandra P. SHARMA, ayant pour titre "Chitosan as a biomaterial", BIOMAT. , ART. CEL LS,
ART.ORG., 18 (1), 1-24 (1990), qui indique le rôle favorable des chitosanes, notamment pour l'épithélisation, en particulier de tissus parodontaux, pour traiter les troubles du foie, les maladies osseuses.
Dans la présente discussion et description, on réservera le terme "chitosane", sans autre complément qualificatif, aux formes partiellement
(mais jamais totalement) N-désacétylées de la chitine. Dans la description ci-après, lorsque le chitosane est complètement désacétyié, ceci sera dit expressément.
Différents documents ont décrit, et on sait obtenir des oligomères de la glucosamine, selon le procédé général suivant :
- obtention d'un chitosane complètement désacétyié ; cf publication de MM. DOMARD et RINAUDO, ayant pour titre "Préparation and characterization of fully deacetylated chitosan", In 3. Biol.Macromol., 19S3, Vol 5, February
- puis hydrolyse ou dégradation enzymatique du chitosane complètement N-dé- sacétylé, pour obtenir un mélange d'oligomères de la glucosamine, de degrés de polymérisation différents ; séparation par chromatographie de ce mélange, pour obtenir différentes fractions d'oligomères ; isolement des oligomères des
différentes fractions séparées ; cf "Glucosamine oligomers : 1. Préparation and characterization", Int. J.Biol.Macromol., 1989, Vol I , October.
Dans toutes les applications exposées précédemment, mettant en oeuvre des oligomères de la glucosamine, un problème central, comme pour le chitosane, concerne la durée de vie desdits oligomères, en tant ^qu'agents ou principes actifs. Mais ce problème est dans le cas présent exacerbé par la masse moléculaire relativement faible des oligomères considérés. On sait en effet que ces oligomères peuvent être entraînés rapidement en solution, dégradés, altérés sous l'effet- de différents agents physiques, chimiques, etc.. Et il est donc essentiel de trouver une forme de ces oligomères permettant la libération progressive, contrôlée, ou retardée de ces agents ou principes actifs, "in situ", c'est-à-dire à l'endroit même où ils agissent ou interviennent.
S'agissant d'un chitosane, diverses solutions à effet retard ont été proposées, telles que réticulation entre elles des macromolécuies de degrés de polymérisation différents par l'intermédiaire de liaisons covalentes, complexation des mêmes macro molécules avec des métaux lourds, ou encore association de type électrostatique par polyanion-polycation. Ainsi, si on se réfère au document WO-A-8907395, on propose d'introduire dans la solution de chitosane traitante, un fixateur dont le rôle est d'empêcher, ou tout au moins limiter la dégradation du chitosane, une fois la solution traitante appliquée. Les fixateurs retenus sont choisis parmi l'oxyde de potassium tribasique, etc.... ; un tel fixateur interagit avec les différentes macromolécuies de chitosane, par réticulation ou complexation avec les métaux du fixateur, pour conduire à l'effet retard recherché. De telles solutions sont bien souvent inacceptables pour le milieu ou le substrat traité, notamment s'il est vivant, en raison de la toxicité des agents liants utilisés.
La présente invention a eu pour objet de trouver un moyen ou solution de libération contrôlée, souvent appelée "retard", remédiant aux inconvénients discutés précédemment, et spécifique aux oligomères de la glucosamine.
Par la caractérisation d'une nouvelle forme physico-chimique des oligomères en question, mise en évidence par le protocole expérimental exposé ci-après, la présente invention a apporté une solution particulièrement simple au problème identifié précédemment. Cette nouvelle forme peut être obtenue, à l'état solide, selon le procédé général décrit précédemment, mais en observant, ce qui n'avait jamais été fait auparavant, un temps de repos ou latence pour le ou les
oligomeres isolés, avant toute utilisation ou consommation postérieure de l'oligomere.
La mise en solution de la nouvelle forme identifiée précédemment gén ère un pseudo-équilibre entre le ou les agrégats isomoléculaires de l'oligomere d'une part, et la forme isolée du même oligomère "d'autre part, conduisant progressivement à la dissociation desdits agrégats, et au relargage de la forme isolée du même oligomère.
On obtient ainsi une forme retard particulièrement efficace, sans aucune adjonction d'un agent liant ou réticulant, ou d'une autre nature ; dans la forme selon l'invention, les oligomères sont associés les uns aux autres, de manière isomoléculaire, c'est-à-dire avec le même degré de polymérisation ou l a même masse moléculaire, uniquement par des forces physiques qu 'il apparaît aujourd' hui difficile de caractériser, mais néanmoins existantes comme montré ci-après. Par "association directe", on entend le fait qu'entre les oligomères associés, de même degré de polymérisation, il n 'existe aucune liaison covalente directe ou indirecte, par un agent de réticulation par exemple. Comme montré ci-après, au surplus, la forme nouvelle selon l'invention, à l'état solide, se montre très stable dans le temps. La présente invention présente en outre les caractéristiques suivantes, considérées isolément ou en combinaison :
- le composé selon l'invention, mis en solution, comprend en mélange plusieurs agrégats isomoiéculaires constitués respectivement par des multiples différents de l'oligomere de base, par exemple dans des proportions pondérales décroissantes pour les multiples les plus élevés
- le composé selon l'invention comprend plusieurs oligomères de degrés de polymérisation respectivement différents, chaque oligomère étant présent en solution sous la forme d'un mélange d'au moins un agrégat isomoléculaire tel que défini précédem ment, et de la forme isolée dudit oligomère - les groupements aminés de l'oligomere sont sous forme neutre, à l'état -NH_, auquel cas, en solution, la proportion pondérale de l'agrégat associant deux molécules de l'oligomere de base est au moins égale à 1 0 %, ou les groupements aminés du même oligomère sont sous forme cationique, c'est-à-dire à l'état -NH,, auquel cas, en solution, la proportion pondérale de l'agrégat associant deux molécules de l'oligomere de base est au moins égale à 2 %
- l'oligomere de base a un degré de polymérisation compris entre 2 et
100, et de préférence compris entre 20 et 30
- le composé selon l'invention est à. l'état solide, après précipitation suivie d'une éventuelle lyophilisation
- dans ses différentes applications, le composé selon l'invention peut être utilisé sous forme dissoute dans un solvant, ou supporté dans" un ou sur un support en suspension dans un milieu de dispersion.
S'agissant du procédé selon l'invention, on peut en outre noter les caractéristiques complémentaires suivantes :
- le mélange d'oligomères est séparé par chromatographie d'exclusion stérique, auquel cas la phase d'élution de la chomatographie est un système acétate d'ammonium-acide acétique
- on isole les oligomères de même degré de polymérisation, sous forme neutre, c'est-à-dire à l'état -NF pour les groupements aminés, notamment par précipitation dans l'alcool isopropylique, puis traitement du précipité dans une solution ammoniacale
- on peut aussi isoler les oligomères de même degré de polymérisation sous forme cationique, c'est-à-dire à l'état -NH-, pour les groupements aminés, notamment par précipitation dans l'alcool isopropylique, puis traitement du précipité par un acide minéral fort. Dans un mode préférentiel de mise en oeuvre du procédé, on choisit pour la séparation des oligomères une colonne de chromatographie présentant en combinaison les caractéristiques suivantes :
- un support de silice greffée à l'aide de groupements organiques hydrophiles - un nombre de plateaux par mètre supérieur à 16 000
- un domaine de résolution compris entre DP 2 et DP 100 pour des polysaccharides.
La présente invention est maintenant décrite de manière générale et expérimentale, en référence aux résultats des analyses chromatographiques et spectrales représentées par les figures 1 à 7 jointes, selon lesquelles :
- Figure 1 est le chromatogramme obtenu sur colonne "Protein-Pac " 200 SW (Waters), correspondant à la distribution totale d'un chitosane complètement désacétyié, hydrolyse par HC1 12N à 72°C pendant une heure
- Figure 2 est le chromatogramme obtenu sur colonne "Protein-Pack" 200 SW (Waters), correspondant à un oligomère de DP 39,5 avec un indice de polymolécularité de 1,03, préparé par un seul fractionnement de Phydrolysat, selon Figure 1
- Figure 3 est un cliché de diffraction des rayons X d'un oligomère de DP 39 isolé sous forme -NH~, et maintenu au repos pendant plusieurs mois
- Figure 4 est le chromatogramme obtenu sur colonne "Protein-Pack" 200 SW (Waters) d'un oligomère de DP 9 (C = 5 g/1) isolé sous forme -NH2, et maintenu au repos pendant 4 jours
- Figure 5 est le chromatogramme obtenu sur colonne "Protein-Pack" 200 SW (Waters) d'un oligomère de DP 39 (C = 5 g/1) isolé sous forme -NH2> et maintenu au repos pendant plusieurs mois
- Figure 6 est le chromatogramme obtenu sur colonne "Protein-Pack" WS 803 F (Shodex) d'un oligomère de DP 39 (C = 5 g/1) isolé sous forme
-NH-,, et maintenu au repos pendant plusieurs mois
- Figure 7 est le chromatogramme obtenu sur colonne "Protein-Pack" 200 SW (Waters) d'un oligomère de DP 39 (C = 25 g/1) isolé sous forme -NH2. Tout d'abord, le procédé d'obtention des composés selon la présente invention est de manière générale conforme à celui décrit dans la publication introduite précédemment, et ayant pour titre :"Glucosamine oligomers : 1. Préparation and characterization" ; mais comme déjà dit, c'est l'addition d'une étape de repos de l'oligomere isolé à l'état solide, qui a conduit à l'identification de la forme retard selon la présente invention.
La séparation des fractions d 'oligomères peut être obtenue pl us rapidement et avec une meilleure ef ficacité, sur des colonnes de chromatographie d'exclusion stérique d'un type particulier, identifié ci-après, et ce pour des degrés de polymérisation compris entre 15 et 100. On part de chitosanes produits en France par la Société Abertechnologies.
Leur masse moléculaire importe peu ; par contre, pour des raisons de commodité, il est préférable que leur taux d'acétylation résiduel soit inférieur à 15 % ou, mieux encore, inférieur à 3 %. Dans le premier cas, on pourra obtenir leur désacétylation totale après deux étapes successives, alors qu'une seule étape suffira dans le deuxième cas.
Les colonnes de chromatographie sélectionnées selon les caractéris¬ tiques précédentes sont par exemple celles de type "Frotein-Pack" 200 SW ou 300 SW vendues par la Société Waters (Millipore), ou WS S00 vendues par la Société Shodex, ou tout autre support de silice greffée à l'aide de substances organiques hydrophiles. Pour une séparation à l'échelle preparative, on utilise les systèmes correspondants existant dans le commerce. L'éluant de chroma¬ tographie est un tampon acétate d'ammonium/ acide acétique (0, 15 M en
acétate d'ammonium, à pH 4.5).
En utilisant un tampon acide acétique-acétate d'ammonium pour éluant, il est possible d'obtenir une séparation chromatographique des oligomères de la glucosamine, sur des colonnes de silice greffée, de type "Protein-Pack", telles que vendues par Waters ou Shodex. La séparation, obtenue selon un processus d'exclusion stérique, s'avère plus performante, tout en recouvrant un domaine de séparation beaucoup plus large que sur une colonne de type Biogel P60 ; un exemple de chromatogramme est donné sur la figure 1, pour un hydrolysat de chitosane d'environ une heure dans de l'acide chlorhydrique environ 12 N à 72°C. Les courbes d'étalonnage log (masse moléculaire) en fonction du volume d'élution montrent que la limite de séparation (volume exclu) correspond par exemple à un degré de polymérisation (DP) voisin de 100, pour une colonne de type 200 SW (Waters), et de 500 sur une colonne de type WS 803 F (Shodex). II est de plus possible, avec ce type de colonnes, de séparer une distribution donnée en fractions de polymolecularite très faible. Cette séparation s'avère là aussi beaucoup plus efficace qu'avec une colonne de type Biogel P60, puisqu'en une seule opération, il est possible, comme le montre l'exemple de la figure 2, de collecter une fraction de DP centré sur 39,5 avec un indice de polymolecularite égal à 1,03 ; ceci n'est habituellement obtenu qu'après trois fractionnements successifs sur une colonne du type Biogel P60.
Les composés contenus dans les fractions séparées par chromatographie peuvent être isolés selon deux types de structure : la structure saline ou cationique correspondant à la forme ammonium (-NI- ) de la fonction aminé primaire du motif glucosamine, et la structure neutre correspondant à la forme a iné libre (-NHL ) du même motif.
L'anion associé à la forme ammonium peut être choisi parmi n'importe lequel des acides. Si l'on prend l'exemple d'un chlorure, la fraction est concentrée au maximum, puis précipitée par de l'alcool isopropylique, lavée et séchée. Le précipité est redissous dans l'eau, et la solution est lyophilisée, après addition de la quantité stoechiométrique (en très léger excès) d'acide chlorhydrique. Il faut toutefois noter qu'il est préférable d'utiliser des acides forts, non organiques, lesquels donnent des sels beaucoup plus stables à l'état solide. Pour la forme aminé libre, il suffit après concentration de la fraction, d'ajouter de l'ammoniaque dilué jusqu'à atteindre un pH de 9, , où la précipitation est totale. Le précipité est alors lavé à l'eau, puis lyophilisé
après centrifugation et redispersion dans l'eau.
Dans les deux cas, les composés solides obtenus sont stockés dans des flacons bouchés.
Si l'on considère les oligomères de la glucosamine, tels qu'obtenus précédemment, quel que soit leur degré de polymérisation (DP -2 à 100 par exemple), ou la forme selon laquelle ils sont isolés, on note l'apparition de structures cristallines dans les échantillons, avec un taux de cristallinité qui dépend de la durée de stockage de l'échantillon, atteignant un palier avant
3 mois. Cette cristallisation en phase solide évolue avec le temps, à partir de germes créés lors de l'isolement des composés, et grâce à l'intervention de molécules d'eau présentes dans les échantillons, à des teneurs toujours supérieures ou égales à 10 % en poids. Les clichés de diffraction de la figure 3 montrent que les- formes cristallines obtenues seraient en fait des allomorphes du chitosane, de type "tendon". Lorsqu'on dissout un oligomère de la glucosamine dans l'eau, immédiatement après son isolement, l'analyse chromatographique de la solution obtenue donne un chromatogramme tout-à-fait superposable à celui que l'on avait obtenu avant son isolement. Ce résultat est observé quelle que soit la forme (-NH., ou -NHL) de la fraction isolée, indépendamment des divers paramètres de préparation de la solution (pH, température, concentration, etc.).
Lorsqu'on opère de la même façon avec un oligomère ayant été stocké, sous forme solide, après plusieurs jours voire plusieurs mois, on obtient un chromatogramme comme ceux représentés sur la figure 4. Comme pour le cas précédent, on retrouve un pic correspondant exactement à la distribution dont est issu l'oligomere. Par contre, ce pic est accompagné d'une succession de pics secondaires, apparaissant à des volumes d'élution de masses moléculaires de plus en plus élevées, dont la proportion pondérale décroît avec celle-ci. La courbe d'étalonnage en masse de la colonne chromatographique utilisée permet de montrer que ces pics sont centrés sur des volumes d'élution correspondant à des masses molaires exactement multiples de celles du pic principal. On a ainsi une solution contenant une distribution d'agrégats isomoléculaires d'un même oligomère, qui a pour masse moléculaire celle de l'oligomere isolé contenu dans le pic principal. L'utilisation d'une colonne chromatographique ayant un domaine de séparation plus étendu (figure 4) permet de démontrer que l'on peut observer ainsi l'élution d'agrégats ayant jusqu 'à plus de quinze fois la masse moléculaire correspondant au pic
principal. Les spectres infra-rouges et RMN permettent de montrer qu'aucune modification de la structure chimique n'est intervenue, et que le phénomène n'est dû qu'à des associations réversibles d'oligomères, dépendant principa¬ lement de la structure du produit de départ (-NH ou NH?), et par suite de la nature et de l'énergie de la cohésion des cristaux contenus dans" l'échantillon solide du composé ayant servi à préparer les solutions. Ce phénomène a lieu de manière limitée avec un oligomère isolé sous forme acide, alors que pour le même oligomère isolé sous forme -NH-, selon les conditions, il peut représenter jusqu'à plus de 60 % du comportement de l'échantillon en solution (figure 7 ). Ce phénomène correspond donc à un processus de dissolution retard, et ne peut être comparé au comportement d'associations classiques des chitosanes de haute masse moléculaire, puisqu'il n'est pas créé dans la solution et évolue à l'inverse de ce qui est observé pour un chitosane de haut poids moléculaire. Ce phénomène diminue par exemple avec le temps, contrairement au processus observé avec un chitosane de haut poids molécu¬ laire.
Le comportement décrit ci-dessus existe pour tous les oligomères de DP compris entre 2 et 100, en particulier lorsqu'ils sont isolés sous forme -NH?, avec toutefois un optimum se situant dans le domaine des DP compris entre 20 et 30. Au-delà d 'un DP de 100, ce phénomène décroît progressivement lorsque la masse augmente.
Le phénomène diminue aussi lorsqu'on chauffe les solutions, lorsqu'on diminue la concentration, ou lorsqu'on laisse vieillir les solutions. Cependant, dans tous les cas, il ne disparaît jamais totalement et il existe toujours" un pseudo-équilibre entre les oligomères agrégés et les oligomères isolés. Ainsi, si la proportion d'oligomères isolés augmente avec le temps, au détriment des oligomères agrégés, cet accroissement ne dépasse pas 25 %, même après plusieurs semaines de stockage de la solution. Cet effet est d'autant moins important que la concentration initiale en oligomère est élevée. Le phénomène observé est un pseudo équilibre correspondant à un mécanisme de dissolution retard. En effet, si, par chromatographie, on sépare la fraction comprenant les oligomères isolés, de la fraction contenant tous les oligomères agrégés, on montre que dans la deuxième fraction l'équilibre est déplacé vers la formation d'oligomères isolés, après dissolution de cette fraction sans l'isoler, et que par contre la première fraction correspondant aux oligomères isolés ne subit aucune modification en solution. De plus, si l'on prépare une solution à une concentration donnée, la même solution, après
avoir été concentrée dix fois, redonne exactement le même chromatogramme que celui de la solution de départ.
. Enfin, si l'on isole les produits contenus dans une solution ayant vieilli de telle sorte que la proportion d'oligomères isolés ait largement augmenté, le processus de cristallisation à l'état solide se développe à nouveau, et le chromatogramme d'une solution (à la même concentration que ci-dessus) préparée par exemple une semaine après l'isolement montre à nouveau une augmentation de la part des oligomères agrégés.
Pour terminer, le mélange caractérisant la présente invention peut être obtenu de façon contrôlée, que ce soit en solution, à l'état solide, ou lors de processus alternant successivement solution et état solide.
L'invention décrite ci-dessus trouve un champ d'applications très large comprenant les domaines de la cosmétologie, la pharmacie, la médecine, l'agriculture et l'alimentation (diététique). D'une façon générale, l'utilisation des formes selon l'invention des oligomères de la glucosamine, et de leurs propriétés particulières, peut se faire : en solution, en émulsion, en encapsulation (liposomes, gels, etc.), ou à l 'état solide. L 'in vention concerne l 'utilisation des oligomères comme principes ou agents actifs, soit directement, soit avec un effet retard, seuls ou associés à d'autres principes ou agents actifs.
En pharmacie, en plus de ce qui a été énoncé dans le cas générai, on peut utiliser conjointement du chitosane, déjà connu pour favoriser le méca¬ nisme d'effet retard de divers principes actifs.
En médecine, elle s'applique plus particulièrement à la cicatrisation et à tout processus de développement cellulaire.
Dans l'agriculture, les composés selon l'invention seront utilisés comme biostimulants ou bioprotecteurs, soit sous forme solide, en particulier dans le cas des plantes d'ornement, soit en pulvérisation foliaire où le mécanisme d'alternance solution solide se produira in situ. Dans le processus expérimental décrit ci-après, par DP on entend un degré de polymérisation d'une molécule donnée, dans tous les cas où il sera inférieur ou égal à 15, alors qu'au dessus de cette valeur il correspondra à la moyenne géométrique du degré de polymérisation moyen en nombre et en poids (DP =y .\ln.Mp). Par "nmère" on appelle toute agrégation de n molécules du même oiigomère, entre elles.
EXEMPLE 1
Préparation des oligo mères
Un échantillon de chitosane provenant d'un lot Abertechnologies est désacétyié totalement selon la méthode décrite par A. DOMARD et col., Int. J. Biol. Macromol. (1983) _5, 49. Le chitosane totalement désacétyié ainsi préparé est hydrolyse selon la méthode proposée par A. DOMARD et col, Int. 3. Biol. Macromol. (1989) _U, 297, dans de l'acide chlorhydrique 12 N à 72°C. Un exemple de distribution obtenue pour un temps d'hydrolyse d'environ 1 heure est donné sur la figure 1.
L'étude chromatographique est réalisée avec des solutions à 5g/l, dont on injecte 20 μl dans une- colonne "Protein Pack" 200 SW Waters (Millipore), avec un débit de 0,5 mi/minute et un enregistrement de 1 cm/minute. Les oligomères de DP ^ 15 sont préparés selon la méthode décrite précédemment. Pour les fractions de DP-^ 15, un exemple de séparation est réalisé en injectant 20 ul de solution à 50g/l d'un hydrolysat donné. On collecte plusieurs fois de suite une fraction, toujours la même, correspondant à un intervalle de 250 ul de volume élue. La solution est ensuite concentrée et réinjectée pour analyse. Un exemple de fraction obtenue est représentée sur la figure 2. Le calcul des masses moyennes à l'aide de la courbe d'étalonnage M=f (Log Ve) donne pour cet exemple DPp = 40,2 et DPn = 38,9, soit un indice de polymolecularite Ip = 1,033, largement inférieur à 1,1. L'opération est avantageusement réalisée sur du matériel préparatif. Quels qu'ils soient, les oligomères peuvent être isolés sous forme acide, après concentration des solutions les contenant jusqu'à la limite de solubilité de l 'acétate d'ammonium, en utilisant l'alcool isopropylique comme précipitant. La suspension est alors lavée et centrifugée trois fois de suite avec cet alcool, puis lyophilisée après redissolution dans l'eau. Après une nouvelle dissolution, on ajoute la quantité d'acide choisi (à peine supérieure à la stoechiométrie) de façon à préparer un forme saline donnée. Le produit est alors isolé par lyophilisation. On tiendra compte du fait que certaines formes salines sont instables au cours du temps et libèrent l'acide en régénérant la forme aminé libre. Le chlorhydrate peut être, par exemple, considéré comme stable. Pour la forme -NH_, dans le cas des oligomères de DP-<.15, la forme saline acétate, initialement obtenue après lyophilisation du précipité dans l'isopropanol, est dissoute dans l'eau et portée à pH = 9,5 à l'aide d'une
solution diluée d'ammoniaque, puis lyophilisée. Pour les DP "^ 15, on peut après concentration de la solution initiale précipiter les oligomères, en ajoutant de l'ammoniaque dilué jusqu'à atteindre un pH de 9,5. Le précipité obtenu est alors centrifugé puis lavé plusieurs fois à l'eau à pH = 9,5, et lyophilisé après redispersion dans de l'eau.
EXEMPLE 2
Cristallisation à l 'état solide des oligomères de la glucosam ine
Tout oligomère de la glucosamine de DP compris entre 2 et 100, quelle que soit sa structure chimique (-NH, ou -NH_), donne après plusieurs mois de stockage un cliché de diffraction des rayons X (sous forme de poudre) mettant en évidence la présence de structures cristallines. La figure 3 donne un exemple de cliché réalisé avec une fraction de DP 39, ayant été stockée plusieurs mois après avoir été isolée sous la forme aminé libre. La même étude réalisée sous la forme (-NH,+) donne aussi une raie intense à 4,35 Λ.
EXEMPLE 3
Phénomènes de dissolution retard
i - Un oligomère de DP 9 isolé sous forme -NH_ donne, après 4 jours de stockage, le chromatogramτιe représenté sur la figure 4 où l'on note, en plus du pic principal ceux correspondant aux volumes d'élution des "n-mères" de DP 18, 27 et 36, soit des "dimères", "trimères" et "tétramέres" du DP 9.
ii - Une fraction d'oligomères centrée sur DP 39, isolée sous forme -NH_, à l 'état solide, donne après 6 mois de stockage le chromatogramme représenté sur la figure 5, où l'on note en plus du pic principal correspondant aux molécules isolées, la présence de pics centrés sur les volumes d'élution de molécules de DP S I , 1 19, etc., correspondant au "dimère", "trimère", etc. de l 'oligomere de DP 39.
iii - L'utilisation d'une colonne de domaine de séparation plus large
(figure 6) permet de mettre en évidence la proportion décroissante, avec leur masse, des "n-mères" supérieurs.
iiii - La proportion du pic principal correspondant aux molécules isolées est toujours supérieure ou égale à 90 %, lorsque l'oligomere a été isolé sous forme acide. Lorsqu'il a été isolé sous forme aminé libre, une solution d'une fraction centrée sur DP 39, préparée à une concentration de 25 g/1, montre que la proportion des pics des "n-mères" peut dépasser 65 % de -l'échantillon (figure 7 ).
EXEMPLE 4
Stabilité du phénomène
i - Rôle de la concentration
Le rôle de la concentration sur la distribution des molécules entre le pic correspondant aux molécules isolées et ceux des "n-mères" est donné dans l'exem le re résenté dans le tableau ci-dessous our une fraction de DP 39.
Inversement, si l'on prépare une solution à une concentration donnée par exemple à 5 g/1, et si on la concentre ensuite 10 fois (50g/l) à l 'evaporateur rotatif, les chromatogramτιes obtenus à partir des deux solutions sont tout à fait superposables.
ii - L'effet du vieillissement des solutions avec le temps est illustré dans le tableau ci-dessous pour une fraction de DP 54 préparée à 5 g/1.
De plus, une solution de la fraction de DP 39 préparée à 2°C montre un accroissement de 12 % de la proportion des pics des masses supérieures, par rapport à la proportion que l'on obtient à la température ambiante.
Claims
REVENDICATIONS
1/ Composé comprenant au moins un oligomère de la glucosamine de degré de polymérisation relativement faible, caractérisé en ce que, mis en solution, il comprend en mélange, d'une part au moins un agrégat isomoléculaire associant directement et uniquement par voie physique plusieurs molécules de l'oligomere de base, dont la masse moléculaire totale est un multiple de celle dudit oligomère de base, et d'autre part la forme isolée dudit oligomère de base, c'est-à-dire à l'état non agrégé.
2/ Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, mis en solution, il comprend en mélange plusieurs agrégats isomoléculaires, constitués respectivement par des multiples différents de l'oligomere de base.
3/ Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend plusieurs oligomères de degrés de polymérisation respectivement différents, chaque oligomère étant présent en solution sous la forme d'un mélange d'au moins un agrégat isomoléculaire et de la forme isolée dudit oligomère.
4/ Composé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les groupements aminés de l'oligomere sont sous forme neutre, à l'état -NH„.
5/ Composé selon la revendication 4, caractérisé en ce que, en solution, la proportion pondérale de l'agrégat associant deux molécules de l'oligomere de base est au moins égale à 10 %.
6/ Composé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les groupements aminés de l'oligomere sont sous forme cationique, à l'état -NH,.
7/ Composé selon la revendication 6, caractérisé en ce que, en solution, la proportion pondérale de l'agrégat associant deux molécules de l'oligomere de base est au moins égale à 2 %.
8/ Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'oligomere de base a un degré de polymérisation compris entre 2 et 100, et de préférence compris entre 20 et 30.
9/ Composé selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il est sous forme solide.
10/ Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est sous forme dissoute dans un solvant, ou supporté dans ou sur un support en suspension dans un milieu de dispersion.
11/ Produit de traitement comprenant à titre d'agent actif au moins un oligomere de la glucosamine de degré de polymérisation relativement faible, caractérisé en ce que l'agent actif est un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, permettant une libération progressive dudit oligomère.
12/ Produit selon la revendication 11 , en tant que médicament. 13/ Produit selon la revendication 1 1., en tant que produit agrochimique ou phytosanitaire.
14/ Produit selon la revendication I I , en tant qu'aliment ou produit diététique.
15/ Produit selon la revendication 1 1 , en tant que produit cosmétique. 16/ Procédé pour la préparation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 h 10, caractérisé en ce que :
- de manière connue en soi, on obtient ou on part d'un chitosane complètement désacétyié, on hydrolyse ce dernier pour obtenir un mélange d'oligomères de la glucosamine, de degrés de polymérisation respectivement di fférents, on sépare ce mélange pour obtenir différentes fractions d 'oligomères, on isole les oligomères des différentes fractions séparées
- de manière nouvelle, on laisse reposer un oligomere ainsi isolé, à l 'état solide, pour obtenir un mélange, notamment cristallisé, d'au moins un agrégat et de la forme isolée dudit oligomère.
17/ Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'on sépare le mélange d'oligomères par chromatographie, d'exclusion stérique.
18/ Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on choisit une colonne de chromatographie présentant en combinaison les caractéristiques suivantes :
- elle est obtenue à partir d'un support de silice greffée à l'aide de groupements organiques hydrophiles
- elle présente un nombre de plateaux par mètre au moins égal à 16000. - son domaine de résolution est compris entre DP 2 et DP 100 pour des polysaccharides.
19/ Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la phase d'élution de la chromatographie est un système acétate d'am onium-acide acétique. 20/ Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'on isole les oligomères de même degré de polymérisation, sous forme neutre, c'est-à-dire à l 'état -NH_ pour les groupements aminés, notamment par précipitation dans l 'alcool isopropyl ique, puis traitement du préci pité dans une solut ion ammoniacale. 21 / Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'on isole les oligomères de même degré dε polymérisation sous forme cationique, c'est-à-dire à l'état -NH, pour les groupements aminés, notamment par
précipitation dans l'alcool isopropylique, puis traitement du précipité par un acide minéral fort.
22/ Procédé de mise en oeuvre d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ledit composé est mis en solution ou en suspension, et éventuellement mélangé à d'autres- produits, du type excipient, adjuvant, et conditionné dans une forme d'administration ou traitement.
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| INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES vol. 11, no. 5, Octobre 1989, ATKINS ED., US pages 297 - 302; A. DOMARD ET AL.: 'Glucosamine oligomers: 1. preparation and characterization' cité dans la demande voir abrégé voir page 298, colonne de droite, ligne 3. SA 53961 030ligne 20; figure 1 * |
| WORLD PATENTS INDEX LATEST ; Section Ch, Week 8903, Derwent Publications Ltd., London, GB; Class C, AN 89-20572& JP,A,63 297 305 (KATAKURA CHIKKARIN) 5 Décembre 1988 voir abrégé * |
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Also Published As
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| FR2669340B1 (fr) | 1993-01-22 |
| FR2669340A1 (fr) | 1992-05-22 |
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