WO1991013977A1 - Procede de stimulation artificielle de cellules et dispositif de culture d'ovocytes - Google Patents
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
Definitions
- the present invention relates to a method of artificial stimulation of cells, in particular of oocytes, said stimulation being modular over time, and to a cell culture device allowing the implementation of the method.
- the present invention relates to the stimulation of cells, in particular of oocytes or fertilized eggs, by a bio-chemical mechanism regulated under physiological conditions by an internal oscillator.
- This is in particular a procedure for cloning animal embryos and, in particular for obtaining competent recipient oocytes for transplanting a cell nucleus in a homogeneous state.
- the cloning of domestic animal embryos is the way to remedy the genetic variability induced by fertilization and to standardize the genetic improvements of a breed.
- the cloning of an embryo is a method which aims to obtain the most living animals following the transfer of the cell nuclei of this embryo (which contains several cells) into enucleated and activated oocytes.
- the two functions of fertilization are dissociated.
- mammalian eggs can be artificially activated by various physical or chemical stimuli, whether they are electric, thermal or osmotic shocks, enzymes or anesthetic agents (Kaufman MH 1983 - Early mammalian development - parthenogenetic studies - Cambridge University Press).
- activation is always identified with a unique stimulus, limited in time, supposed to mimic the penetration of the sperm into the egg. None of these treatments replicate the series of physiological changes that occur in the egg after penetration of the sperm.
- the procedures described in the publications are similar.
- the process is triggered by the sperm within seconds of fertilization.
- the chain of reactions that leads to the production of InsP3 appears to depend on an influx of calcium ions.
- InsP3 binds to a specific receptor that controls the activity of a calcium channel located on the intracellular membrane of an intracellular calcium reservoir.
- the calcium thus released activates specific proteins, which themselves activate specific processes, for example calcium-calmodulin complexation, kinase activation, etc.
- Calcium is considered to be the main activator of metabolism.
- This cycle of reactions is repeated at a frequency of the order of a minute lasting several hours (McCulloh et al. 1983; Igusa & Miyazaki, 1983-1986; Miyazaki et al. 1986; Miyazaki, 1988).
- GTP [S] guanosine -5'-0- (3-thiotriphosphate)
- mice The respective genetic contributions of the oocyte and the spermatozoon are well documented in mice. These studies show that the normal term development of an embryo depends on the permanent presence throughout the first cell cycle of the two parental pronuclei (PN) (Surani ⁇ 3c Barton 1983; McGrath & Solter, 1984; Surani et al. 1986; Mann ⁇ Jc Lovell - Badge, 1986, 1988).
- PN pronuclei
- Controlling activation understood as a rhythmic phenomenon extending over the entire first cell cycle is essential, not only to routinely produce activated and synchronous oocytes, but also to allow eggs "clones" to benefit from this type of imposed activation. to develop normally.
- the present invention therefore relates to a method of artificial stimulation, in particular in the long term, of a set of cells reproducing the effect of a biochemical regulatory mechanism, controlled under natural physiological conditions by an internal oscillator, characterized in that that it includes the following stages: a) the cells are placed in culture in vitro, for a determined time, b) the cells are placed in the pulse medium, after elimination of the culture medium, c) the cells are subjected to a pulse generated by an electric field , d) the cells are again placed in the culture medium, e) the preceding steps are repeated a certain number of times, and f) the cells are obtained in a homogeneous activated state.
- the elimination of the culture medium will preferably be completed by washing the cells with the pulse medium.
- This stimulation method although it can be used in a large number of methods, has been developed in the context of the activation of oocytes for the cloning of embryos. Recent studies have in fact shown that in mammalian eggs, fertilization is accompanied by a transient increase in the intracellular concentration of free calcium ([Ca] -], followed by a series of oscillations of this concentration , which lasts at least 4 hours.
- the process developed in the present invention will therefore make it possible to periodically stimulate the oocytes by influxes of calcium at the plasma membrane.
- a blastomer is then introduced under the pellucid zone and the cell fusion is carried out by the action of an electric field.
- the process can then be applied to cloned embryos thus obtained, in order to improve their development, that is to say to regularize cell divisions and obtain compaction.
- Stimulation by this process can be applied to freshly ovulated oocytes placed in the presence of an inhibitor, the expulsion of the second polar body, such as cytochalasin B, which maintains a diploid state.
- an inhibitor such as cytochalasin B
- the process was designed based on the effects of electric fields on plasma membranes.
- the process involves the combination of an in vitro culture method of a batch of oocytes (or embryos) by perfusion between two electrodes and a washing method with a non-conductive solution, containing calcium 0 to 30 ⁇ M , in which the pulses are delivered.
- a very weakly conductive solution for example an isotomic solution of glucose containing the Ca ions
- the concentration of Ca + ions is between 8 and 20 ⁇ M. Good results are obtained for example for a concentration of Ca ions equal to 10 ⁇ M or else 16 ⁇ M.
- the alternation of a culture period and a washing period makes it possible to frequently subject the oocytes to stimulation in a very well defined ionic medium.
- This process can extend to the stimulation of cells by a whole range of simple or complex ionic or molecular signals at variable concentrations which will be determined by the composition of the pulse medium. This process makes it possible to modulate the frequency of the signal by the duration between two washes, and its amplitude by the duration of the electrical pulse.
- One of the aspects of the present invention is the simultaneous treatment of a set of oocytes, which will thus be obtained, activated in the same physiological state.
- the core transplants can thus be performed on physiologically identical oocytes.
- the present invention therefore relates to a dynamic system, operating continuously and which can be automated, produced by a device allowing the automatic succession of the washing and stimulation stages and the acquisition of the stimulation parameters.
- This device is characterized by the fact that it immobilizes the cells during the different phases of the treatment.
- It consists of an enclosure comprising at least one fluid inlet (10, 11) and a fluid outlet (6) and, is characterized in that at the bottom of the enclosure there are one or more orifices ( 4) whose geometry is such that it opposes the passage of the cells and in that the liquid entering the enclosure is withdrawn, at least in part, through the orifices, creating a depression as it ensures substantially blocking the cells on the orifice (s), part of the fluid being evacuated by overflow.
- This device makes it possible to retain the cells without damaging them or introducing parasitic mechanical stress. In addition, it allows everything when to replace, remove or move cells. This device therefore makes it possible to successively place the cells in media of chemical composition of different natures, for periods and according to a variable frequency.
- the enclosure has on its internal walls two electrodes, preferably parallel, and the orifice (s) are aligned at equal distance from the electrodes, immersed in the medium corresponding to the phase of the treatment in progress.
- this device it is possible to cultivate the cells at will or else into the impulse medium to penetrate into the treated cell, an ion, a molecule, a complex chemical or biological substance.
- the device allows in particular the treatment in a single enclosure of a large number of oocytes, without the need to place them in separate compartments.
- the device comprises at least two fluid inlets, which can be superimposed.
- the evacuation of fluids can also be done laterally.
- Each medium arriving successively in the chamber corresponds to a separate injection tube.
- a suitable suction system on the culture medium inlet device allows the suction of a small quantity of the pulse medium which enters the inlet pipe of the culture medium. culture centre ; this prevents ions from the culture medium from entering the chamber during the washings.
- the circulation of the medium flows is represented by arrows in FIG. 3.
- the compositions of the culture media are known and depend on the cells in culture.
- the pulse medium is usually consisting of a non-ionic medium to ensure a field effect. It will be an isotonic solution for example of glucose.
- This device can be designed as an activation chamber, the capacity of which can be adapted to the number of cells which it is desired to treat simultaneously.
- the characteristics of the process using the device can vary widely and are generally only limited by conditions such as washing times. Thus, the frequency of the pulses is limited by the minimum washing time by the pulse medium.
- the parameters of the process and of the device, that is to say the inflows and outflows of fluid, as well as the frequency, the duration and the intensity of the electrical pulses arriving in the electrodes are managed by an electronic system.
- the characteristics of the electrical pulses in themselves can vary and depend on the cells and the objectives sought.
- the electric fields vary from 1 to 3 v. cm " and the dawn electric pulse duration from 10 ⁇ s to 2000 ⁇ s.
- the frequency and duration of the pulses can vary during different stages of the same stimulation process.
- the organization of the tubes which open into the chamber allows media to be injected without the oocytes being taken down by the gas bubbles which eventually form in the pipes.
- the distribution structure of the media makes it possible to considerably limit the ionic contamination of the stimulation medium by the ions of the culture medium.
- the media injection pumps can be controlled by a microcomputer which will determine the repeatable washing sequences while keeping the cells between the electrodes.
- This device can be applied to the treatment of cells with any substance that one wishes to penetrate into the intracellular space.
- the composition of the pulse medium will determine the penetration of this substance according to a concentration gradient.
- the culture medium will be replaced by the pulse medium and the electric field pulse will be triggered, the duration of the pulse determining the quantity of substance which penetrates.
- This pulse medium can then be removed and the cells returned to culture in an appropriate medium.
- the advantage of this system is that it allows simultaneous processing of a set of cells which are thus synchronized. It works continuously and avoids any manipulation of the cells, thus ensuring better reproducibility and greater speed of execution. This allows standardization of conditions and facilitates technology transfer. It is conceivable to make an ion or a simple molecule enter cells. This device can also be applied to the stimulation of cells by a more complex molecule, or to the penetration of DNA fragments, or episomes.
- This device will be used to carry out a cyclic stimulation of the cells, several basic sequences being carried out successively, the intensity, the duration and the frequency of the pulses controlled by means of a microcomputer.
- This device makes it possible to carry out the activation and synchronization process of oocytes, by repeated stimulations with Ca + , for the cloning of domestic animal embryos.
- An embodiment of the chamber is represented in figure
- the oocytes 1 are placed on a rectilinear slit 4, produced by the juxtaposition of two glass plates 3 and 5, the spacing of which is less than the diameter of the oocytes.
- the media, culture medium and pulse medium arrive in the upper part of the chamber each through a separate tube, respectively 10 and 11, avoiding reciprocal contamination.
- the medium 9 corresponding to the current treatment phase arrives continuously and is discharged through a tube 6 located at a lower level than that of the oocytes. This current of liquid keeps the oocytes pressed against the bottom of the chamber by suction.
- Enclosure 8 is thermostatically controlled at 38 ° C. Each medium arrives in the chamber after passing through a system retaining the large gas bubbles.
- This system consists of a glass balloon into which the liquid arrives. From this balloon leaves a gold rod perforated with small diameter holes; after passing through this rod, the gas bubbles of large size are retained and the liquid arrives in the chamber through a short tube.
- Oocytes can be immediately subjected to activation treatment, no aging period is necessary. They are subjected for 90 minutes to a series of pulses of electric field, at a rate of one pulse every 4 minutes, that is to say 22 pulses of decreasing duration dissipating a total energy 1250 ⁇ joules, of a total duration of 14 868 ⁇ s , the electric field has a value of 1.8 Kv. cm " .
- the culture medium is replaced by a pulse medium consisting of an isotonic glucose solution containing Cad-, l O ⁇ M.
- oocytes At the end of the activation treatment, all oocytes have two well-formed polar cells. A homogeneous population of activated oocytes in the same physiological state is therefore obtained at the same time, within a few minutes.
- the cell fusion is then carried out.
- the cell fusion method derives from Zimmerman's work on electric fields. The procedure has been refined. (Ozil and Modlinski 1986, J. Embryol.
- the oocytes were recovered from the oviducts 12-15 h after the projection by washing with a buffered phosphate saline solution (PBS). They were incubated for 5 minutes in hyaluronidase (300 i.u.ml-1 in PBS) to eliminate the follicular cells. After the treatment, the oocytes were cultured at 38 ° in B2 medium (Ménézo 1976) in an atmosphere containing 5% CO 2.
- PBS buffered phosphate saline solution
- the membrane permeability of freshly ovipressed rabbit oocytes was transiently increased by opening the pores by a pulse induced by an electric field in the presence of Ca “ " " 10 ⁇ M contained in a 0.3 M - 18 MOhm H20 glucose solution. (pulse medium) It is recognized that, while the pores are open, an ion flow circulates according to the concentration gradients through the cell membrane towards the interior of the cytosol as has already been shown in oocytes sea urchin (Rossignol et al, 1983), so the ion influx can be adjusted under these conditions either by the difference in ion concentration between the inside and outside of the cell or by the duration of the pulses.
- the amplitude of the ion signal was modulated over the duration of the pulse.
- the entire process was controlled by an IBM PC-AT 286 microcomputer via a Tektronix MI 5010 interface with a program written in MS-BASIC.
- the actual voltage and current between the electrodes were measured by a Tektronix 7704 1 oscilloscope mounted with a programmable digital converter 7D20 and an amplifier 7A22.
- the rhythm of the electrical pulses and the total duration of the treatment were the same for all the treatments, that is to say applying one pulse every four minutes for 90 minutes. These values were chosen because they agree well with the frequency and the average duration of the hyperpolarization of the membrane potential of rabbit oocytes during fertilization (22 biphasic oscillations of the membrane potential during the first 90 minutes after fusion sperm-egg, one pulse every 4 minutes -McCulloh et al., 1983).
- We know that the variation of the membrane potential reflects the passage of K based on calcium activated channels and that they therefore constitute a reliable indicator of [Ca + ]. (Miyazaki and Igusa 1982).
- the amplitude of electric fields (1.8 kVcm-1) was constant for all the experimental groups.
- the effect of the pulse duration was studied in the pulse medium containing 10 ⁇ M CaC12.
- the treatment for which the oocytes are not activated was considered to be the minimum duration and that resulting in the lysis of the oocytes was considered to be the maximum duration.
- a set of six treatments with 22 constant double pulses was chosen arbitrarily. These treatments have a pulse duration equal to 200, 300, 600, 900, 1200 and 1500 ⁇ s respectively-
- Processing with 22 double pulses of constant duration reveals the value of the pulse duration for which the maximum and minimum effects are recorded.
- These constant treatments do not produce a high activation rate with a uniform type of parthenogenetic egg.
- the oocytes were subjected to treatments in which the duration of the impulses gradually decreased according to a negative exponential relationship. Four treatments were tested in accordance with the maximum duration of the first pulse.
- FIG. 2 gives the curve of the pulse durations for these treatments.
- the coefficient b determines the duration of the first pulse.
- the coefficient c determines the duration of the last pulse.
- the eggs are treated in the presence of 8 ⁇ gml-1 of cytochaasin B in the culture medium to block the expulsion of the second polar globule and to obtain a uniform population of diploid parthenogenic eggs.
- Two treatments were applied to group C, treatment I which is the weak treatment with a total pulse duration equal to 11288 ⁇ s and treatment III which is the strong treatment with a duration of 14 868 ⁇ s.
- Parthenogenetic eggs were cultured in vitro up to the blastocyst stage and the influence of the two treatments was evaluated by the rate of blastocyst formation. Viability beyond the implantation of parthenogenetic embryos
- 4-cell stage embryos were transplanted into recipient oviducts.
- the fertilized eggs were also transplanted into the opposite horn of a few recipients in order to compare parthenogenetic development with normal development.
- the recipients were autopsied between day 8.5 and day 13 of gestation and the number of implantation sites for living fetuses was noted.
- the pulse medium does not contain electrolytes
- none of the oocytes (105) are activated.
- the experimental environment and the culture conditions that is to say the replacement of the culture medium before each pulse with a pulse medium containing no electrolytes and the treatment with relatively strong electrical pulses (2 x 1.8 kVcm-lx900 ⁇ s x 22 times, i.e. a total pulse duration of 30,600 ⁇ s) has no visible effect on freshly ovulated oocytes but the conditions do not allow development to be triggered.
- Table I summarizes the results of the experiment in which the activation rate was tested in relation to the pulse duration in the presence of 10 ⁇ M CaCl 2 .
- the appearance of pronuclei after 3 or 4 hours of culture serves as a marker for parthenogenetic activation.
- the activation rate is directly related to the duration of the pulse which indirectly controls stimulation by calcium.
- the duration of ionic stimuli influences not only the activation rate but also the nuclear configuration of parthenogenetically activated oocytes of similar postovulatory age.
- Freshly collected oocytes (13 h after the projection with a vasectomized male) are subjected to a standard treatment comprising 22 pulses (one every 4 minutes) and whose total duration is equal to 22,475 ⁇ s (working reference: lex 1370).
- the only variable is the calcium concentration in the pulse solution.
- Five values were chosen: 10, 12, 14, 16, 18, 20 ⁇ M of calcium.
- the table below summarizes the results.
- the washing parameters must therefore make it possible to limit the presence of residual culture medium at the time of the pulses.
- the presence of residual medium increases the number of ionic species capable of entering the oocyte at the time of electropermeabilization of the membrane.
- Freshly ovulated mouse oocytes (12 h post HCG) are subjected to treatments comprising 33 impulses, one every 4 minutes for 2 hours 12 minutes.
- the treatments are carried out for calcium concentrations in the pulse solution successively worth 4 ⁇ M, 8 ⁇ M, 12 ⁇ M, and 16 ⁇ M and for variable pulse durations.
- the dynamics of pronuclei formation can be controlled as a function of the calcium concentration in the pulse solution and the total duration of the electrical pulses (Vitullo, Ozil, 1991).
- Phorbol ester and sperm activate mouse oocytes by inducing sustained oscillations in cell Ca2 " , Nature 316, 541-542.
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de stimulation artificielle d'un ensemble de cellules reproduisant l'effet d'un mécanisme de régulation biochimique, contrôlé dans les conditions physiologiques naturelles par un oscillateur interne, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) les cellules sont placées en culture in vitro pendant un temps déterminé, b) les cellules sont placées dams le milieu d'impulsion, après élimination du milieu de culture, c) on soumet les cellules à une impulsion générée par un champ électrique, d) les cellules sont à nouveau placées dans le milieu de culture, e) on répète les étapes précédentes un certain nombre de fois, f) on obtient des cellules dans un état activé homogène. Elle concerne également un dispositif de culture d'ovocytes permettant la mise en ÷uvre du procédé.
Description
PROCEDE DE STIMULATION ARTIFICIELLE DE CELLULES ET DISPOSITIFDE CULTURE D'OVOCYTES
La présente invention concerne un procédé de stimulation artificielle des cellules en particulier d'ovocytes, ladite stimulation étant modulable dans le temps, et un dispositif de culture de cellules permettant la mise en oeuvre du procédé.
La présente invention se rapporte à la stimulation de cellules, en particulier d'ovocytes ou d'oeufs fécondés, par un mécanisme bio¬ chimique régulé dans les conditions physiologiques par un oscillateur interne.
Il s'agit notamment d'une procédure de clonage des embryons d'animaux et, en particulier d'obtention d'ovocytes receveurs compétents pour la greffe d'un noyau cellulaire dans un état homogène.
Le clonage d'embryons d'animaux domestiques est la voie permettant de remédier à la variabilité génétique induite par la fécondation et de standardiser les améliorations génétiques d'une race.
Lors de la fécondation, l'entrée du spermatozoïde va avoir deux grandes fonctions :
- apport du génome haploïde mâle,
- activation du développement qui restructure le noyau mâle par le cytoplasme de l'ovocyte et favorise les interactions noyau-cytoplasme.
Il s'écoule en moyenne 12 à 20 heures entre la fécondation et la première division cellulaire, pendant lesquelles un ensemble de phénomènes ont lieu, les deux génomes paternel et maternel ayant des rôles complémentaires pour un développement ultérieur de l'embryon
(5urani et al. 1984, Nature 308, 548-550), mais on n'en connait pas le mécanisme exact. Le clonage d'un embryon est une méthode qui vise à obtenir le plus d'animaux vivants à la suite du transfert des noyaux cellulaires de cet embryon (qui contient plusieurs cellules) dans des ovocytes enuclées et activés. Les deux fonctions de la fécondation sont dissociées. AJin d'obtenir un développement ultérieur de l'oeuf, il faut procéder à une activation de l'ovocyte receveur avant la greffe nucléaire. L'activation peut aussi s'appliquer aux premières heures du développement de l'oeuf fécondé.
On sait que les oeufs de mammifères peuvent être activés artificiellement par différents stimulis physiques ou chimiques, qu'il s'agisse
de chocs électriques, thermiques ou osmotiques, d'enzymes ou d'agents anesthésiques (Kaufman MH 1983 - Early mammalian development - parthenogenetic studies - Cambridge University Press). Cependant, l'activation est toujours identifiée à un stimulus unique, limité dans le temps, supposé mimer la pénétration du spermatozoïde dans l'oeuf. Aucun de ces traitements ne reproduit la série de changements physiologiques se produisant dans l'oeuf après la pénétration du spermatozoïde.
On ne connait que quelques cas d'activation parthénogénétique de l'ovocyte de vache (Menezo et al. 1976 - Commission of the European Coimmuniτies, Agricultural research seminar, Egg transfer in Cattle. Eur
5491) ; aucune méthode vraiment fiable et précise d'activation des ovocytes de bovins n'est disponible. L'activation expérimentale par Téthanol présente de nombreux inconvénients : grande variabilité des résultats en fonction de l'âge des ovocytes (Cuthbertson, 1983 ; J. Exp. Zool. 226, 31 1-314).
En ce qui concerne le clonage d'embryons, les premiers résultats incontestés ont été obtenus par S. illadsen en 1986 chez la brebis. Ils ont été suivis par ceux de Prather et al en 1987 chez la vache, et en 1989 chez la truie. Chez la lapine, les premiers individus issus de clonage ont été obtenus par Stice et Robl en 1988. Les taux de succès de ces expériences rapportés dans les publications ne dépassent généralement pas 4 %. Toutefois, des sociétés américaines (Granada Genetics, Houston, Texas) ou Canadienne (Alta Genetics, Callgary, Alberta), semblent maîtriser la procédure de clonage chez les bovins. Il est dit qu'une centaine de veaux aurait déjà été obtenue sur le continent nord-américain. Cette prise en main industrielle reflète l'intérêt que suscite le clonage d'embryon chez les bovins. Mais les techniques ont-elles vraiment progressé ?
Les procédures décrites dans les publications se ressemblent. Les ovocytes utilisés ont subi une période de vieillissement de 6 à 10 heures. Ce veillissement est rendu nécessaire pour favoriser l'activation
(aucune technique classique d'activation ne permet d'activer des ovocytes fraîchement ovules même chez les bovins (Ware et al. 1989). Les chromosomes organisés sur la metaphase II sont prélevés en "aveugle" dans
la région du premier globule polaire, mais des techniques de visualisation des chromosomes par fluorescence sont mises en oeuvre. Une cellule embryonnaire provenant d'une morula est introduite sous la zone pellucide et la fusion est obtenue par des impulsions de champs électriques. L'activation de l'ovocyte est généralement provoquée par la procédure de fusion cellulaire ; dans certains cas, elle n'est pas décrite. Deux chercheurs ont pu obtenir un agneau à la suite du transfert dans un ovocyte d'un noyau provenant d'une cellule du bouton embryonnaire (Smith & Wilmut, 1989). Toutefois, le niveau des résultats et la complexité des mécanismes en jeu tels que le stade de différenciation du noyau, la phase du cycle cellulaire, l'état de l'ovocyte receveur, son âge, la procédure d'activation ne permettent pas de comprendre pourquoi certains embryons se développent et d'autres non. De nombreuses théories pour expliquer les échecs comme celle fondée sur l'activité de transcription du noyau transplanté ont été contredites par quelques résultats expérimentaux.
Des données nouvelles sont apparues sur les mécanismes physiologiques déclenchés par la fécondation et notamment en ce qui concerne les rythmes des variations de niveau du calcium libre et des seconds messagers comme l'Inositol ( l,6,5)-tri-phosphate (InsP3) (Cuthbertson et al. 1981 ; Cuthbertson & Cobbold, 1985 ; Miyaza i et al.
1986 ; Miyazaki, 1988). L'activité périodique de ces seconds messagers pourrait réguler les synthèses des acides nucléiques (ADN et ARNs) et des protéines (Basset et al. 1968 ; Rodan et al. 1978).
Le processus est déclenché par le spermatozoïde dans les secondes qui suivent la fécondation. La chaîne de réactions qui aboutit à la production d'InsP3 semble dépendre d'un influx d'ions calcium. L'InsP3 se lie à un récepteur spécifique qui contrôle l'activité d'un canal calcique situé sur la membrane intracellulaire d'un réservoir intracellulaire de calcium. Le calcium ainsi libéré active des protéines spécifiques, qui elles-mêmes activent des processus spécifiques, par exemple la complexation calcium- calmoduline, l'activation de kinase etc. Le calcium est considéré comme l'activateur principal du métabolisme. Ce cycle de réactions se reproduit à
une fréquence de l'ordre de la minute durant plusieurs heures (McCulloh et al. 1983 ; Igusa & Miyazaki, 1983-1986 ; Miyazaki et al. 1986 ; Miyazaki, 1988).
Cette activité rythmique, due à un système de signaux intracellulaires émis à une fréquence propre, semble dépendre de la présence de pronuclei mâle et femelle car elle n'a pu être observée sur des oeufs parthénogénétiques activés par des méthodes classiques (Cuthberston et al. 1981 ; Cuthbertson & cobbold, 1985 ; Miyazaki, 1988).
L'injection dans des ovocytes d'une protéine G (guanosine -5'-0-(3-thiotriphosphate) (GTP [S]) induit plusieurs cycles de libération de calcium, mais ne permet pas de maintenir cette activité au-delà du quatrième (Swann, Igusa <5 Miyazaki, 1989).
Les contributions génétiques respectives de l'ovocyte et du spermatozoïde sont très documentées chez la souris. Ces études montrent que le développement normal à terme d'un embryon dépend de la présence permanente durant tout le premier cycle cellulaire des deux pronuclei parentaux (PN) (Surani <3c Barton 1983 ; McGrath & Solter, 1984 ; Surani et al. 1986 ; Mann <Jc Lovell - Badge, 1986, 1988).
La production de jeunes par clonage ne peut être réalisée dans la pratique que si l'on dispose de procédés fiables et reproductibles. La qualité de l'activation de l'oeuf joue dans le développement un rôle important jusque là ignoré.
La maîtrise de l'activation comprise comme phénomène rythmique s'étendant sur tout le premier cycle cellulaire est essentielle, non seulement pour produire en routine des ovocytes activés et synchrones mais aussi pour faire bénéficier des oeufs "clones" de ce type d'activation imposée pour se développer normalement.
La présente invention concerne donc un procédé de stimula¬ tion artificiel, notamment à long terme, d'un ensemble de cellules reproduisant l'effet d'un mécanisme de régulation biochimique, contrôlé dans les conditions physiologiques naturelles par un oscillateur interne, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) les cellules sont placées en culture in vitro, pendant un temps déterminé, b) les cellules sont placées dans le milieu d'impulsion, après élimination du milieu de culture, c) on soumet les cellules à une impulsion générée par un champ électrique, d) les cellules sont à nouveau placées dans le milieu de culture, e) on répète les étapes précédentes un certain nombre de fois, et f) on obtient les cellules dans un état activé homogène.
L'élimination du milieu de culture sera de préférence complétée par un lavage des cellules par le milieu d'impulsion.
Ce procédé de stimulation bien qu'il puisse être utilisé dans un grand nombre de procédés, a été mis au point dans le cadre de l'activation des ovocytes en vue du clonage d'embryons. Des études récentes ont en effet montré que dans les oeufs de mammifères, la fécondation est accompagnée d'une augmentation transitoire de la concentration intracel- lulaire de calcium libre ([Ca ]-], suivie d'une série d'oscillations de cette concentration, qui dure au moins 4 heures.
On ignore encore par quel moyen le spermatozoïde déclenche ces variations de [Ca ]., ainsi que les fonctions biologiques exactes de ces oscillations de Ca de longue durée. Cependant, elles semblent caracté¬ ristiques des oeufs fécondés et n'ont jamais été observées quand les ovocytes sont artificiellement activés (Miyazaki 1988 - 3. Cell. Biol. 106, 345-353).
Le procédé développé dans la présente invention va donc permettre de stimuler périodiquement les ovocytes par des influx de calcium au niveau de la membrane plasmique.
En effet, en introduisant dans le milieu d'impulsion des ions Ca +, ceux-ci vont pouvoir pénétrer dans la cellule par l'électroporation, c'est-à-dire la création de "pores" générées par l'impulsion électrique. Au-delà des phénomènes immédiats provoqués dans l'ovocyte comme l'expulsion du globule polaire, les effets de cette stimulation se manifesteront sur les stades ultérieurs du développement de l'embryon, alors même que le traitement a cessé. C'est ainsi que les phénomènes de compaction et de cavitation pourront être affectés.
Ce procédé peut s'appliquer aux ovocytes fraichement ovules, obtenus par stimulation hormonale de la femelle. L'activation des ovocytes dans les conditions définies de fréquence, d'intensité et de durée provoque l'expulsion du deuxième globule polaire. On peut alors prélever les chromosomes qui se trouvent en fin de télophase juste sous le deuxième globule polaire. On dispose d'ovocytes dans le même état physiologique possédant un pronucleus.
On introduit alors un blastomère sous la zone pellucide et on procède à la fusion cellulaire par action d'un champ électrique. Le procédé peut alors s'appliquer aux embryons clones ainsi obtenus, afin d'améliorer leur développement, c'est-à-dire de régulariser les divisions cellulaires et d'obtenir la compaction.
La stimulation par ce procédé peut s'appliquer à des ovocytes fraichement ovules placés en présence d'un inhibiteur, de l'expulsion du deuxième globule polaire, comme la cytochalasine B, qui maintient un état diploîde. On obtient ainsi une population d'embryons parthenogénétiques, qui pourront être implantés dans des femelles receveuses et présenteront un développement synchrone du foetus et des annexes embryonnaires.
Ces expériences d'abord menées sur des ovocytes de lapine ont été confirmées sur des ovocytes de souris, réputés réfractaires à l'activation juste après l'ovulation. Les performances du procédé sont donc reproduc¬ tibles d'une espèce à l'autre. La méthode d'activation pourra certainement s'appliquer à des ovocytes fraichement ovules de bovin ou d'ovin.
Si l'on soustrait les ovocytes en cours de traitement, ils régressent et on obtient certains artefacts, comme des ovocytes en metaphase III reproductibles à volonté, et qui offrent de nouvelles possibilités d'études, notamment sur la dynamique du cytosquelette et l'activation du génome.
Le procédé a été conçu sur la base des effets des champs électriques sur les membranes plasmiques.
Il a été montré (Zimmermann, 1982) que des impulsions de champs électriques de l'ordre de 1 à 3 kVcm-1 et d'une durée de quelques μs peuvent créer des micropores dans la membrane plasmique et établir une
communication directe entre les milieux intra et extra cellulaire. Il a été ainsi possible par exemple de faire pénétrer du calcium dans des ovocytes d'oursin en les exposant à des impulsions de champs électriques en présence d'ions calcium (Rossignol et al 1983). L'amplitude de ces influx peut être modulée par la durée de l'impulsion de champ électrique.
Le procédé implique la conjugaison d'une méthode de culture in vitro d'un lot d'ovocytes (ou embryons) par perfusion entre deux- électrodes et d'une méthode de lavage avec une solution non conductrice, contenant du calcium 0 à 30 μM, dans laquelle sont délivrées les impulsions. La présence d'une solution très faiblement conductrice, par exemple une solution isotomique de glucose contenant les ions Ca , au moment d'une impulsion permet de faire apparaître un champ électrique entre les électrodes. Une présence excessive d'ions diminue l'effet "champ élec¬ trique". De manière préférée, la concentration en ions Ca + est comprise entre 8 et 20 μM. De bons résultats sont obtenus par exemple pour une concentration en ions Ca valant 10 μM ou bien 16 μM. L'alternance d'une période de culture et d'une période de lavage permet de soumettre fréquemment les ovocytes à des stimulations dans un milieu ionique très bien défini.
Ce procédé peut s'étendre à la stimulation des cellules par toute une gamme de signaux simples ou complexes ioniques ou molécu¬ laires à des concentrations variables qui seront déterminés par la composition du milieu d'impulsion. Ce procédé permet de moduler la fréquence du signal par la durée entre deux lavages, et son amplitude par la durée de l'impulsion électrique.
Il est impératif de remplacer totalement le milieu de culture par la solution d'impulsion, car l'intensité du courant due à des excès d'ions provenant du milieu de culture détruirait les ovocytes. Juste après l'impulsion, la solution d'impulsion est remplacée par le milieu de culture, les ovocytes ne pouvant pas survivre dans la solution d'impulsion.
Ce procédé peut être piloté par l'intermédiaire d'un logiciel qui permettra de créer des traitement de stimulation selon des équations spécifiques, exporentielles, sinusoïdales, suites de Fourier ou autres.
L'un des aspects de la présente invention est le traitement simultané d'un ensemble d'ovocytes, qui seront ainsi obtenus, activés dans le même état physiologique. Les greffes de noyau pourront ainsi être réalisées sur des ovocytes physiologiquement identiques.
Lors du clonage, la séquence et les phases du cycle cellulaire durant lesquelles sont enchaînées les opérations ont des conséquences très importantes sur le remodelage des noyaux et sur le développement ultérieur.
Il est extrêmement intéressant de pouvoir standardiser les différentes phases du traitement des ovocytes, afin d'obtenir une bonne reproductibilité du procédé. La présente invention concerne donc un système dynamique, fonctionnant en continu et pouvant être automatisé, réalisé par un dispositif permettant la succession automatique des étapes de lavage, de stimulation et l'acquisition des paramètres de stimulation.
Ce dispositif est caractérisé par le fait qu'il assure l'immobi- lisation des cellules pendant les différentes phases du traitement.
Différents modes de réalisation de ce dispositif apparaissent sur les figures I et 3.
Il est constitué d'une enceinte comportant au moins une arrivée de fluide (10, 11) et une sortie de fluide (6) et, est caractérisé en ce qu'à la partie inférieure de l'enceinte se trouvent un ou plusieurs orifices (4) dont la géométrie est telle qu'elle s'oppose au passage des cellules et en ce que le liquide entrant dans l'enceinte est prélevé, au moins en partie, à travers les orifices, en créant une dépression telle qu'elle assure sensiblement le blocage des cellules sur le ou les orifices, une partie du fluide étant évacuée par débordement.
Ce dispositif permet de retenir les cellules sans les abimer ni introduire une contrainte mécanique parasite. En outre, il permet à tout
moment de replacer, prélever ou déplacer des cellules. Ce dispositif permet donc de placer successivement les cellules dans des milieux de composition chimique de différentes natures, durant des périodes et selon une fréquence variables. L'enceinte comporte sur ses parois internes deux électrodes, de préférence parallèles, et le ou les orifices sont alignés à égaie distance des électrodes, baignant dans le milieu correspondant à la phase du traitement en cours.
Grâce à ce dispositif, on peut à volonté cultiver ies cellules ou bien dans le milieu d'impulsion faire pénétrer dans la cellule traitée, un ion, une molécule, une substance chimique ou biologique complexe.
Ce dispositif permet en particulier le traitement dans une même enceinte d'un ensemble d'ovocytes, en grand nombre, sans qu'il soit nécessaire de les placer dans des compartiments séparés. En particulier, le dispositif comporte au moins deux arrivées de fluide, qui peuvent être superposées.
L'évacuation des fluides pourra également se faire latéra¬ lement.
A chaque milieu arrivant successivement dans la chambre, correspond une tubulure d'injection distincte.
Au moment de l'injection du milieu d'impulsion, un système d'aspiration adapté sur le dispositif d'arrivée du milieu de culture permet la succion d'une petite quantité du milieu d'impulsion qui pénètre dans la canalisation d'arrivée du milieu de culture ; on évite ainsi que les ions du milieu de culture pénètrent dans la chambre durant les lavages. La circulation des flux de milieu est représentée par des flèches sur la figure 3.
Ces milieux, aussi bien le milieu de culture que le milieu d'impulsion, sont en circulation continue, et c'est ce flux de liquide qui par effet de succion assure le maintien des ovocytes entre les électrodes pendant les renouvellements du milieu.
Les compositions des milieux de culture sont connues et dépendent des cellules en culture. Le milieu d'impulsion est généralement
constitué d'un milieu non ionique pour assurer un effet de champ. Il s'agira d'une solution isotonique par exemple de glucose.
La présence d'une grande quantité d'ions peut gravement nuire aux cellules lors de l'impulsion. Il est donc nécessaire de laver les cellules avec le milieu d'impulsion pour éliminer les ions contenus dans le milieu de cult ure.
Ce dispositif peut être conçu comme une chambre d'activation, dont la capacité peut être adaptée au nombre de cellules que l'on souhaite traiter simultanément. Les caractéristiques du procédé mettant en oeuvre le dispositif, peuvent varier largement et ne sont en général limitées que par des conditions telles que ies durées de lavage. Ainsi, la fréquence des impulsions est limitée par la durée de lavage minimum par le milieu d'impulsion. Les paramètres du procédé et du dispositif c'est-à-dire les arrivées et les sorties de fluide, de même que la fréquence, la durée et l'intensité des impulsions électriques arrivant dans les électrodes sont gérées par un système électronique.
Les caractéristiques des impulsions électriques en elles-mêmes peuvent varier et dépendre des cellules et des buts recherchés.
En général, les champs électriques varient de 1 à 3 v. cm" et l'impulsion électrique aube durée de 10 μs à 2 000 μs.
La fréquence et la durée des impulsions peuvent varier au cours des différentes étapes d'un même processus de stimulation. L'organisation des tubulures qui débouchent dans la chambre permet d'injecter des milieux sans que les ovocytes soient décrochés par les bulles de gaz qui finissent par se former dans les canalisations. De plus, la structure de distribution des milieux permet de limiter considérablement la contamination ionique du milieu de stimulation par les ions du milieu de culture.
Les pompes d'injection des milieux peuvent être commandées par un microordinateur qui déterminera les séquences de lavage répétables tout en maintenant les cellules entre les électrodes.
Ce dispositif pourra s'appliquer au traitement des cellules par toute substance que l'on souhaite faire pénétrer dans l'espace intracellu¬ laire. La composition du milieu d'impulsion déterminera la pénétration de cette substance selon un gradient de concentration.
Lors d'une culture cellulaire, on pourra provoquer, à un moment déterminé, qui peut être unique, l'entrée dans l'ensemble des cellules de la substance souhaitée. Pour cela on remplacera le milieu de culture par le milieu d'impulsion et on déclenchera l'impulsion de champ électrique, la durée de l'impulsion déterminant la quantité de substance qui pénètre. Ce milieu d'impulsion pourra alors être évacué et les cellules remises en culture dans un milieu approprié. L'avantage- de ce système est qu'il permet de traiter simultanément un ensemble de cellules qui sont ainsi synchronisées. Il fonctionne en continu et évite toute manipulation des cellules, assurant ainsi une meilleure reproductibilité et une plus grande rapidité d'exécution. Ceci permet une standardisation des conditions et facilite le transfert de technologies. On peut envisager de faire pénétrer dans les cellules un ion ou une molécule simple. Ce dispositif peut aussi s'appliquer à la stimulation des cellules par une molécule plus complexe, ou à la pénétration de fragments d'ADN, ou d'épisome.
Ce dispositif sera utilisé pour réaliser une stimulation cyclique des cellules, plusieurs séquences de base étant réalisées successivement, l'intensité, la durée et la fréquence des impulsions pilotées par l'intermédiaire d'un microordinateur.
Ce dispositif permet la réalisation du procédé d'activation et de synchronisation d'ovocytes, par des stimulations répétées par Ca +, en vue du clonage d'embryons d'animaux domestiques. Un mode de réalisation de la chambre est représenté en figure
1.
Les ovocytes 1 sont placés sur une fente rectiligne 4, réalisée par la juxtaposition de deux plaques de verre 3 et 5, dont l'écartement est inférieur au diamètre des ovocytes. Les milieux, milieu de culture et milieu d'impulsion, arrivent dans la partie supérieure de la chambre chacun par une tubulure distincte, respectivement 10 et 1 1, évitant une contamination réciproque.
Le milieu 9 correspondant à la phase de traitement en cours arrive en continu et est évacué par une tubulure 6 située à un niveau plus bas que celui des ovocytes. Ce courant de liquide maintient par succion les ovocytes plaqués sur le fond de la chambre.
Sur les parois internes de la chambre se trouvent deux électrodes de platine 2 et 7, parallèles, de 1 cm de long. L'enceinte 8 est thermostatée à 38°C. Chaque milieu arrive dans la chambre après passage par un système retenant les bulles de gaz de taille importante.
Ce système est constitué d'un ballon de verre dans lequel le liquide arrive. De ce ballon part une tige d'or perforée de trous de petit diamètre ; après passage à travers cette tige, les bulles de gaz de taille importante sont retenues et le liquide arrive dans la chambre par une tubulure courte.
Des lapines ont été superovulées par injection de FSH et de
LH, et les ovocytes prélevés dans les oviductes. Après traitement 5 mn par la hyaluronidase, les ovocytes sont placés dans la chambre d'activation, dans le milieu B2 (Menezo, 1976 - C. Hebd. Seanc. Acad. Sci. Paris 282,
1967-1970) à 38°C, dans une atmosphère à 5 % de C02.
Les ovocytes peuvent immédiatement être soumis au traitement d'activation, aucune période de viell ssement n'est nécessaire.
Ils sont soumis pendant 90 minutes à une série d'impulsions de champ électrique, à un rythme d'une impulsion toutes les 4 minutes, soit 22 impulsions de durée décroissante dissipant une énergie totale 1250 μjoules, d'une durée totale de 14 868 μs, le champ électrique a une valeur de 1,8 Kv. cm" .
Avant chaque impulsion, le milieu de culture est remplacé par un milieu d'impulsion constitué d'une solution isotonique de glucose contenant Cad-, l OμM.
A la fin du traitement d'activation, tous les ovocytes ont deux globules polaires bien formés. On obtient donc au même moment, à quelques minutes près, une population homogène d'ovocytes activés dans le même état physiologique. Cela présente deux atouts : le premier est de pouvoir toujours réaliser les greffes de noyau dans des oeufs physiologi- quement identiques, le second, plus pratique, est de pouvoir opérer au moment où les chromosomes (haploïdes) se trouvent tous en fin de télophase juste sous le deuxième globule polaire. Ce repérage naturel de l'endroit où se trouvent les chromosomes facilite leur retrait en "aveugle" et permet, sans avoir recours à des techniques de marquage fluorescent, d'enchaîner rapidement les étapes de manipulations. On peut alors effectuer le prélèvement des chromosomes. On remarque que les deux globules polaires ne sont pas toujours accolés (certains sont à l'opposé l'un de l'autre, c'est pourquoi le premier globule polaire n'est pas un bon marqueur de l'endroit où se trouvent les chromo¬ somes maternels). L'efficacité de cette opération, vérifiée par la présence ultérieure d'un pronucleus, est supérieure à 80 %. Un blastomère est ensuite introduit sous la zone pellucide. Quinze à 20 ovocytes peuvent être manipulés en 1 heure.
On procède ensuite à la fusion cellulaire. La méthode de fusion cellulaire dérive des travaux de Zimmerman sur les champs électriques. La procédure a été affinée. (Ozil et Modlinski 1986, J. Embryol.
Exp. Morph. 96, 211-228).
On obtient 100 % de fusion. Il sera possible de réaliser automatiquement, sous le contrôle d'un logiciel, l'alignement et la fusion cellulaire dans la chambre de stimulation. Cette procédure permettra de limiter la durée des manipulations et de standardiser les conditions expérimentales.
EXEMPLE I
MATERIELS ET METHODES
On a induit une superovulation chez les femelles de lapin sexuellement matures d'espèces variées par injection sous-cutanée d'hormone stimulant le follicule (FSH) et d'hormone lutéinisante (LH) en accord avec la technique décrite par ennely et Foote (1965) et modifée par Thibault (communication personnelle). Les femelles ont reçu 2 mg de FSH en cinq injections à 12 heures d'intervalle : 0,250, 0,250, 0,650, 0,650 et 0,250 mg. 12 heures plus tard, avant la saillie par un mâle vasectomisé, on leur a injecté 0,33 mg de LH.
Les ovocytes ont été récupérés à partir des oviductes 12-15 h après la saillie par lavage par une solution saline de phosphate tamponné (PBS). Ils ont été incubés pendant 5 minutes dans l'hyaluronidase (300 i.u.ml-1 dans du PBS) pour éliminer les cellules folliculaires. Après le traitement, les ovocytes ont été cultivés à 38° dans du milieu B2 (Ménézo 1976) dans une atmosphère à 5 % de C02.
Méthode et procédure expérimentale
La perméabilité membranaire des ovocytes de lapin fraiche¬ ment ovuiées a été transitoirement augmentée par ouverture des pores par une impulsion induite par un champ électrique en présence de Ca """ 10 μM contenu dans une solution de glucose 0,3 M - 18 MOhm H20 (milieu d'impulsion). Il est admis que, pendant que les pores sont ouverts, un flux d'ions circule selon les gradients de concentration à travers la membrane cellulaire vers l'intérieur du cytosol comme cela a déjà été montré dans des ovocytes d'oursin (Rossignol et al, 1983). Ainsi, l'influx ionique peut être ajusté dans ces conditions soit par la différence de concentration ionique entre l'intérieur et l'extérieur de la cellule soit par la durée des impulsions.
La procédure expérimentale pour un flux ionique induit électriquement était similaire à celle précédemment décrite pour la fusion par champ électrique d'embryons de lapin à deux cellules (Ozil et Modlinski 1986). Les ovocytes sont cultivés avec du milieu Ml (Whittingham, 1 71 ) à 38°C dans une chambre spécialement conçue. Avant chaque impulsion, le
milieu de culture est automatiquement remplacé par le milieu d'impulsion. Les détails de la chambre sont décrits dans la figure 1. Chaque impulsion était composée de deux impulsions alternatives afin d'éviter " une éiectrophorèse latérale " (Jaffe 1977) des protéines de membrane qui pourrait intervenir après plusieurs impulsions de la même polarité (Poo,
1981 ). L'amplitude du signal ionique était modulé à travers la durée de l'impulsion. Le processus en entier était contrôlé par un micro-ordinateur IBM PC-AT 286 par l'intermédiaire d'une interface Tektronix MI 5010 avec un programme écrit en MS-BASIC. Le voltage réel et le courant entre les électrodes étaient mesurés par un oscilloscope Tektronix 7704 1 monté avec un convertisseur numérique programmable 7D20 et un amplificateur 7A22.
Le rythme des impulsions électriques et la durée totale du traitement étaient les mêmes pour tous ies traitements, c'est-à-dire appliquer une impulsion toutes les quatres minutes pendant 90 minutes. Ces valeurs ont été choisies parce qu'elles s'accordent bien avec la fréquence et la durée moyenne de l'hyperpolarisation du potentiel de membrane des ovocytes de lapin pendant la fécondation (22 oscillations biphasiques du potentiel membranaire pendant les premières 90 minutes suivant la fusion sperme-oeuf, une impulsion toute les 4 minutes -McCulloh et al., 1983). On sait que la variation du potentiel de membrane reflète le passage de K basé sur des canaux activés par le calcium et qu'elles constituent donc un indicateur fiable de [Ca +]. (Miyazaki et Igusa 1982). L'amplitude de champs électriques ( 1.8 kVcm-1) était constante pour tout les groupes expérimentaux.
Traitement des ovocytes
Les effets des différents paramètres du traitement sur l'activation des ovocytes ont été étudiés dans quatre groupes expérimen- taux.
Groupe A - Environnement expérimental
Afin de tester l'effet des conditions expérimentales (perfusion continue, remplacement du milieu de culture et impulsions électriques), des ovocytes fraichement ovules et des oeufs fécondés soumis à 22 doubles impuisions de 900 μs dans le milieu d'impulsion dépourvu de Ca + (la première impulsion est donnée 13 à 15 heures après la saillie). Après le traitement, les oeufs fécondés ont été transférés dans des receveuses pour déterminer la survie à terme. Les ovocytes non fécondés ont été cultivés in vitro et le taux d'activation parthénogénétique a été noté.
Groupe B - ions calcium et durée des impuisions
L'effet de la durée des impulsions a été étudié dans le milieu d'impulsion contenant du CaC12 10 μM. Le traitement pour lequel ies ovocytes ne sont pas activés a été considéré comme étant la durée minimum et celui résulta nt dans la lyse des ovocytes a été considéré comme étant la durée maximum. Un jeu de six traitements avec 22 doubles impulsions constantes a été choisi arbitrairement. Ces traitements ont une durée d'impulsions égale à 200, 300, 600, 900, 1200 et 1500 μs respective-
" ment. L'effet de la présence d'ions Na+ et Mg à une concentration de 10 μM dans le milieu d'impulsion a été testé avec 22 doubles impulsions constantes d'une durée de 900 μs.
Groupe C - modulation des impulsions et type d'activation parthéno¬
génétique
Le traitement avec 22 doubles impulsions de durée constante révèle la valeur de la durée de l'impulsion pour laquelle les effets maximum et minimum sont enregistrés. Ces traitements constants ne produisent pas un taux élevé d'activation avec un type uniforme d'oeufs parthénogénétiques. Afin de vérifier si une réduction progressive des
stimuli calcium dans un traitement donné a un effet sur le type de réaction parthénogénétique, les ovocytes ont été soumis à des traitements dans lesquels la durée des impulsions décroissait peu à peu selon une relation exponentielle négative. Quatre traitements ont été testés en accord avec la durée maximum de la première impulsion. La figure 2 donne la courbe des durées d'impulsions pour ces traitements.
Une relation exponentielle négative (D(u)=e (axutb)+c) entre l'indice de l'impulsion ( 1 à 22) et la durée d'impulsion (1500 μs à 200 μs) a été choisie arbitrairement pour trouver la valeur de chaque impulsion au cours du traitement.
Avec D(u) : durée d'impulsion du cycle (u). Le coefficient a détermine la pente de décroissance de cette relation.
Le coefficient b détermine la durée de la première impulsion. Le coefficient c détermine la durée de la dernière impulsion.
Les coefficients a et c sont constants et égaux respectivement à -0,4 et 200. b = 5,9920 pour le traitement I = 6,5510 pour le traitement II = 6,9080 pour le traitement III
= 7,1700 pour le traitement IV. Groupe D - Modulation du champ électrique et développement in vitro
Les oeufs sont traités en présence de 8 μgml-1 de cytocha- lasine B dans le milieu de culture pour bloquer l'expulsion du second globule polaire et obtenir une population uniforme d'oeufs partheno¬ genetiques diploides. Deux traitements ont été appliqués au groupe C, le traitement I qui est le tra itement faible avec une durée totale d'impulsion égaie à 1 1 228 μs et le traitement III qui est le traitement fort avec une durée de 14 868μs. Les oeufs parthenogenetiques ont été cultivés in vitro jusqu'au stade blastocyste et l'influence des deux traitements a été évalué par le taux de formation de blastocyste.
Viabilité au delà de l'implantation des embryons parthenogenetiques
diploides
Les embryons au stade 4-cellules ont été transplantés dans ies oviductes de receveuses. Les oeufs fécondés ont également été transplantés dans la corne opposée de quelques receveuses afin de comparer le développement parthénogénétique au développement normal. Les receveu¬ ses ont été autopsiées entre le jour 8.5 et le jour 13 de la gestation et le nombre de sites d'implantation de foetus vivants a été noté.
RESULTATS
Groupe A - Effet de l'environnement expérimental (contrôles)
Quant le milieu d'impulsion ne contient pas d'électrolytes, aucun des ovocytes (105) n'est activé. L'environnement expérimental et les conditions de culture c'est-à-dire le remplacement du milieu de culture avant chaque impulsion par un milieu d'impulsion ne contenant pas d'électrolytes et le traitement par des impulsions électriques relativement fortes (2 x 1.8 kVcm-lx900μs x 22 fois, c'est-à-dire une durée totale d'impulsions de 30 600 μs) n'a pas d'effet visible sur les ovocytes fraîchement ovules mais les conditions ne permettent pas de déclencher le développement. Par contre 41 % (9/22) des oeufs fécondés traités de la même manière se sont développés à terme démontrant ainsi que le traitement par des impulsions électriques de haut voltage n'a pas d'effet contraire sur la capacité de développement des ovocytes fécondés. Il n'était pas possible de remplacer totalement le milieu de culture par le milieu d'impulsion avant chaque impulsion. Le courant mesuré pendant l'impulsion révèle que la conductivité du milieu d'impulsion est au moins de 15 % supérieure à celle du milieu d'impulsions mesurée entre les électrodes avant expérience et avant la première injection de milieu de culture. Pendant l'expérimentation, des ions provenant du milieu de culture sont encore présents pendant les impulsions et ceci modifie le signal ionique. Ces variations du micro-environnement n'apparaissent pas comme ayant un quelconque effet significatif sur l'activation ou le développement embryonnaire. Dans cette série d'expérimentations, les oeufs sont lavés par
le milieu d'impulsion pendant 45 secondes toutes les quatre minutes. Cette période pendant laquelle les oeufs ne sont pas dans le milieu de culture n'a pas d'effet significatif sur l'activation ou sur la survie à terme.
Groupe B - ions calcium et durée de l'impulsion
Le tableau I résume les résultats de l'expérimentation dans lequel le taux d'activation a été testé en relation avec la durée d'impulsion en présence de CaCl2 10 μM. L'apparition de pronuclei après 3 ou 4 heures de culture sert de marqueur pour l'activation parthénogénétique. Ces résultats montrent clairement que l'activation parthénogénétique est déclenchée quand le milieu d'impulsion contient Ca 10 μM.
De plus, le taux d'activation est directement relié à la durée de l'impulsion qui contrôle indirectement la stimulation par le calcium. La durée des stimuli ioniques n'influence pas seulement le taux d'activation mais aussi la configuration nucléaire des ovocytes parthénogénétiquement activés d'âge postovuiatoire semblables.
Plus la durée d'impulsion est longue, plus la proportion d'oeufs activés est élevée mais plus la proportion d'ovocytes contenant des micronuciei est importante.
Groupe C - modulation des impulsions et type d'activation parthéno-
génétique.
Les résultats sont résumés dans le tableau II. La relation entre le type d'activation parthénogénétique et chaque traitement est également montrée dans le tableau III. Quand la durée de l'impulsion est réduite, tous les ovocytes sont activés et la majorité (91 %) d'entre . eux ont un pronucieus unique et deux globules polaires quand la méiose est terminée.
Ainsi, la modulation des stimuli de calcium à travers la durée de l'impulsion semble être effective et influence les premières étapes du développement.
Dans cette étude, l'âge des ovocytes était similaire et ne peut donc pas affecter les résultats.
Groupe D - Effet de la modulation de champ électrique sur le
développement in vitro d'ovocytes activés par parthénogenèse.
Les résultats sont résumés dans le tableau III. Aucune différence visible dans le développement de chaque groupe n'a pu être notée jusqu'à la troisième division. Dans les embryons parthenogenetiques produits par le traitement I, une proportion plus faible d'embryons présente une compaction et ceux qui se compactent sont irréguliers. Par contre, la majorité des embryons produits par le traitement III se compacte et se développe jusqu'au stade de blastocyste. Ces résultats montrent que la forme du stimulus d'activation a un effet profond sur la capacité des embryons parthenogenetiques à se développer jusqu'au stade de blastocyste in vitro.
Viabilité post-implantation des oeufs parthenogenetiques diploïdes.
13 receveuses sont devenues gravides et ont été autopsiées entre le jour 8.5 et le jour 13. Les résultats sont résumés dans le tableau IV. Bien que les embryons parthenogenetiques soient plus petits que les embryons de contrôle, ils apparaissent morphologiquement normaux selon les critères définis pour le lapin. Le rapport entre la taille des annexes embryonnaires et celle du foetus est grossièrement équivalent pour les embryons obtenus par fécondation ou par parthénogenèse.
Ainsi, il semble que le développement général des embryons parthenogenetiques, le foetus et ses tissus trophobiastiques soit ralenti. Les foetus morts ont plusieurs anomalies et il n'était pas possible de les classifier.
Tableau 1 -
Effet de la présence d'ions calcium et durée de l'impulsion électrique sur l'activation des ovocytes de lapin
Durée Nombre Nombre % % d'ovocytes activés avec d'impulsion d'ovocytes lysés (96) activés l PN+PB1 2PN 2PN#
(μs) <5 PB2 +PB 1 *PB 1
200 μs 47 0 (0) 13 83 17 0 300 μs 99 0 (0) 62 68 25 7 600μs 85 0 (0) 98 71 19- 10 900 μs 63 0 (0) 100 62 14 24 1 200 μs 97 5 (5) 100 57. 29 14 1 500 μs 50 3 (6) 100 30 17 53
Tableau 2 - Effet de la modulation du champ électrique sur l'activation
Traitement Nombre % % ovocytes actives avec d'ovocytes activation 1 PN+PB1 2PN 2PN#
&PB2 -PB1 -PB1
I 86 88 83 9 8
II 151 99 89 9 1 III 118 100 91 9 0 IV 96 100 70 25 5
# Pronuclei anormaux, petits micronuclei
Tableau 3 -
Effet de la modulation de champ électrique sur le développement d'oeufs parthenogenetiques in vitro
Traitement Nombre Nombre Nombre Nombre d'ovocytes activation cultivés morulae blastocystes compact (%) (%)
98 91 69 25(36) 23 (33)
III 352 100 244 244( 100) 216 (88)
Tableau 4 - Développement post-implantation d'oeufs parthenogenetiques soumis au traitement III.
Jour de l'autopsie J 8-9 J 9-10 J 10-11 J 12-13 Total
Nombre d'oeufs transférés 21 26 50 68 165
Nombre d'implan¬ tations 9 3 15 23 50
% cumulé (42,8) (21,2) (27,8) (30,3)
Nombre de foetus vivants 8 3 7 0 18
% cumulé (88,8) (91,6) (66,6) (36)
EXEMPLE II
DEVELOPPEMENT PARTHENOGETIQUE
Des ovocytes fraîchement collectés ( 13 h après la saillie avec un mâle vasectomisé) sont soumis à un traitement standard comprenant 22 impulsions (une toutes les 4 minutes) et dont leur durée totale est égale à 22 475μs (référence de travail : lex 1370).
La concentration en calcium dans la solution d'impulsion est l'unique variable. Cinq valeurs ont été choisies : 10, 12, 14, 16, 18, 20μM de calcium. Le tableau ci-dessous récapitule les résultats.
Sur un total de 23 transplantation, le taux de gestation global, tous traitements confondus, est de 74 %. Parmi les receveuses qui sont devenues gravides, le taux d'implantation enregistré au 1,5e jour de gestation (la durée de gestation chez la lapine est de 29 jours) est de 28 %.
La présence de foetus a pu être observée dans 64 % des cas et 28 % d'entre eux étaient encore vivants au moment de l'autopsie. Ces résultats globaux sont nettement au-dessus des résultats obtenus par les méthodes classiques : chez les souris, l'obtention de foetus à J 11 est très rare. Toutefois, le résultat le plus important réside dans l'effet de la concentration en calcium au moment des impulsions sur le dévelop¬ pement post-implantatoire. La figure 2 montre clairement que les taux d'implantation et de survie à 311 dépendent directement de ce paramètre. Le développement optimum a été obtenu avec une concentration de 16μM. Dans ce cas, nous avons obtenu un taux d'implantation record de 38 % (31 implantations sur 81 oeufs transplantés), dont 26 % de foetus. La comparaison morphologique des différents foetus obtenus révèle q_e c'est avec 16μM de calcium que les foetus ont la taille la plus grande.
Par ailleurs, nous avons observé que la présence de milieu de culture résiduel dans la proportion de 1/10000 en plus des 16μM de calcium est capable de modifier considérablement le développement car les annexes embryonnaires se développent mais les foetus sont pratiquement inexis¬ tants.
Les paramètres de lavage doivent donc permettre de limiter la présence de milieu de culture résiduel au moment des impulsions. La présence de milieu résiduel augmente le nombre d'espèces ioniques susceptibles de pénétrer dans l'ovocyte au moment de l'électroperméabi- lisation de la membrane.
EXEMPLE III
ACTIVATION DE L'OVOCYTE DE SOURIS FRAICHEMENT OVULE
Des ovocytes de souris fraîchement ovules (12 h post HCG) sont soumis à des traitements comprenant 33 impuisions, une toutes les 4 minutes durant 2 heures 12 minutes.
Les traitements sont menés pour des concentrations en calcium dans la solution d'impulsion valant successivement 4μM, 8μM, 12μM, et 16μM et pour des durées d'impulsions variables.
Les dynamiques de formation du pronucléus peuvent être contrôlées en fonction de la concentration en calcium dans la solution d'impulsion et la durée totale des impulsions électriques (Vitullo, Ozil, 1991 ).
Basset, CA. and Hermann, I. ( 1968). The effect of electrostatic fields on macromolecular synthesis by fibroblast in vitro. J. Cell Biol. 39.9A.
Cuthbertson, K.5.R. Whittingham, D.G. <$c Cobbold, P.H. ( 1981). Free Ca2~ increases in exponential phases during mouse oocyte activation. Nature 294, 754-757.
Cuthbertson, K.S.R. 6c Cobbold, P.H. ( 1985). Phorbol ester and sperm activate mouse oocytes by inducing sustained oscillations in cell Ca2 ", Nature 316, 541-542.
Cuthbertson, K.S.R. (1983). Parthenogenetic activation of mouse oocytes in vitro with ethanol and benzyl alcohol. J. Exp. Zool. 226, 31 1-314.
Igusa.Y. & Miyazaki, S.I. (1983). Effect of alterated extraceliular and intracellular calcium concentration on hyperpolarizing responses of the hamster egg. J. Physiol. 340 61 1-632.
Igusa.Y. & Miyazaki. S.I. (1986) Periodic increase of cytoplasmic free calcium in fertilized hamster eggs measured with calcium-sensitive électrodes. J. Physiol. 377, 193-205.
Jaffe, F.L. (1977). Eiectrophoresis along ceil membranes. Nature 265,600-
602.
Kaufman, M.H., Barton, S.C & Surani, M.A.H. (1977). Normal postimplanta¬ tion development of mouse parthenogenetic embryos to the foreliab bud stage. Nature 265, 53-55.
Kaufman, M. H. (1983). Early mammalian development : parthenogenetic studies. Cambridge University Press.
Kennelly, J.J. <5c Foote, R.H. ( 1965). Superovulatory response of pre- and post-puberal rabbits to commercially available gonadotrophins. J. Reprod. Fert. 9, 177-188.
Mann, J.R. & Lovell-badge, R. ( 1986). Inviability of parthenogenones is determined by pronuclei, not egg cytoplasm. Nature 310, 66-67.
McCulloh, D.H., Rexroad. CE. Jr <$c Levitan H. ( 1983). Insémination of rabbit egg is associated with slow depolarization and répétitive diphasic membrane potentials. Devi. Biol. 95 372-377.
McGrath, J. 6c. Solter, D. ( 1984). Completion of mouse embryogenesis requires both maternai and paternal génomes. Cell 37, 179-163.
Ménézo.Y. (1976). Mise au point d'un milieu artificiel défini pour la survie et la maturation des gamètes et pour la culture de l'oeuf fécondé. Cr. hebd. Séanc. Acad. Sci. Paris, 282, 1967-1970.
Miyazaki, 5.1. Igusa, Y. (1982). Ca-mediated activation of a K current at fertilization of golden hamster eggs.
Proc. natn. Acad. Sci. USA. 79, 931-935.
Miyazaki, S.I. Hashimoto, N. Yoshimoto, Y. Kishimoto, T., Igusa, Y., & Miramoto, Y. (1986). Temporall and spatial dynamics of the periodic increase in intracellular free calcium at fertilization of golden hamster eggs. Devl. Biol. 1 18, 259-267.
Miyazaki, S.I. (1988). Inositol 1,4,5. Triphosphate-induced calcium release and nucleotide-binding protein-mediated periodic calcium rises in golden hamster eggs. J. Cell. Biol. 106, 345-353.
Ozil J.P. 6c Modlinsky, J. ( 1986). Effects of electric field on fusion ans survival of 2-cell rabbit embryos. J. Embryol. exp. Morph. 96, 21 1-228.
Rodan, G.A., Bourret, L.A. 6c Norton, L.A. ( 1978). DNA Synthesis in cartilage cells is stimuiated by osciliating electric fields. Science 199, 690-692.
Rossignol, D.P., Decker, G.L, Lennarz, W.J., Isong, T. Y., 6c Teissié, J. ( 1983). Induction of calcium-dépendant, localized cortical granule breakdown in sea-urchin eggs by voltage pulsation Biochim. biophys. Acta. 763, 346-355.
Smith, L.C. & Wiimut, I. (1989). Influence of nuclear and cytoplasmic activity on the developement in vivo of sheep embryos after nuclear transplantation. Biol. Reprod. 40, 1027-1035.
Stice S.L. d Robl. J.M. ( 1988). Nuclear reprogramming in nuclear transplant rabbit embryos. Biol. reprod. 39,657-664.
Surani, M.A.H. & Barton, S.C. ( 1983). Developement of gynogenetic eggs in the mouse. Implication for pa rthenogenetic embryos. Science 222, 1034-1036.
Surani, M.A.H., Barton S.C. 6c Norris, M.L. ( 1984). Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the génome during gametogenesis. Nature 308, 548-550.
Swann, K., Igusa, Y. & Myayazaki, S.I. ( 1989). Evidence for an inhibitory effect of protéine kinase C on G-protein-mediated répétitive calcium transients in hamster eggs. The EMBO journal vol. 8, N° 12 in press.
Vitullo A, Ozil J.P. (1991). Publication en préparation.
Ware, C.B., Barnes, F.L.Maiki-Laurila, M., 6c First, N.L. ( 1989). Age dépendance of bovine oocyte activation. Gamète, res. 22, 265-275.
Whittingham, D.G. ( 1971 ). Culture of mouse Ova. J. reprod. Fert. Suppl. 14, 7-21.
Willadsen, S. . ( 1986). Nuclear transplantation in sheep embryons. Nature
320, 63-65.
Zimmermann, U. ( 1982). Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochim. Biophys. Acta. 694 227-277.
Claims
1. Procédé de stimulation artificielle d'un ensemble de cellules reproduisant l'effet d'un mécanisme de régulation biochimique, contrôlé dans les conditions physiologiques naturelles par un oscillateur interne, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) les cellules sont placées en culture in vitro pendant un temps déterminé, b) les cellules sont placées dans le milieu d'impulsion, après élimination du milieu de culture, c) on soumet les cellules à une impulsion générée par un champ électrique, d) les cellules sont à nouveau placées dans le milieu de culture, e) on répète les étapes précédentes un certain nombre de fois, f) on obtient des cellules dans un état activé homogène.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on l'applique à des ovocytes animaux fraîchement ovules.
3. Procédé selon l'une des revendications l et 2, caractérisé en ce que l'impulsion provient d'un champ de 1 à 3 kV.cm" .
4. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'impulsion de champ électrique a une durée de 10 μs à 2000 μs.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la fréquence des impulsions est modulée par la durée entre deux lavages.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la fréquence et la durée des impulsions peuvent varier au cours des différentes étapes d'un même processus de stimulation.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu d'impulsion est constitué d'un milieu sensiblement non ionique.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le milieu d'impulsion contient un ion ou un mélange d'ions, une molécule, une substance chimique ou biologique complexe, qui va pénétrer dans la cellule traitée.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le composé pénétrant dans la cellule a un rôle de messager.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le milieu d'impulsion est constitué d'une solution isotonique de glucose et contient des ions Ca .
11. Procédé selon l'une des revendication 1 à 10, caractérisé
_> en ce que la concentration en ions Ca est comprise entre 8 et 30 μM.
12. Procédé selon l'une des revendications 6 à 1 1 , caractérisé en ce que les ovocytes sont traités par un inhibiteur de l'expulsion du globule polaire et constitueront une population d'oeufs parthenogenetiques diploïdes.
13. Procédé selon les revendications 1 et 3 à 1 1, caractérisé en ce qu'après l'étape f) on prélève les chromosomes de l'ovocyte, sous le deuxième globule polaire, ces ovocytes servant ensuite ,de récepteur pour une greffe de noyau provenant d'embryons à cloner.
14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les cellules traitées sont des oeufs greffés.
15. Dispositif destiné notamment à la culture des ovocytes, permettant la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à i ^, du type comportant au moins une enceinte destinée à recevoir les ovocytes, ladite enceinte comportant au moins une arrivée de fluide et une sortie de fluide, caractérisé en ce que à la partie inférieure de l'enceinte se trouvent un ou plusieurs orifices dont la géométrie est telle qu'elle s'oppose au passage des ovocytes et en ce que le fluide entrant dans l'enceinte est prélevé, au moins en partie, à travers les orifices, en créant une dépression telle qu'elle assure sensiblement le blocage des ovocytes sur le ou les orifices, une partie du fluide étant évacuée par débordement, et en ce que l'enceinte comporte deux parois latérales sur lesquelles sont placées des électrodes.
16. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce que les électrodessont parallèles, et en ce que le ou les orifices sont alignés à égale distance des électrodes.
17. Dispositif selon l'une des revendications 15 et 16, caractérisé en ce qu'il comporte au moins deux arrivées de fluide.
18. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que les deux arrivées de fluide sont superposées.
19. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisé en ce que l'orifice est un orifice unique constitué par une fente rectiligne dont la largeur est inférieure au diamètre des ovocytes et dont la longueur permet de traiter dans la même enceinte un grand nombre d'ovocytes.
20. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 19, caractérisé en ce que l'enceinte peut être isolée et placée dans une atmosphère de composition définie et/ou stérile.
21. Dispositif selon l'une des revendication 15 à 20, caractérisé en ce que le fluide arrive dans l'enceinte par une tubulure courte, après passage par un système évitant l'arrivée de bulles de gaz de taille importante.
22. Dispositif selon la revendication 21, caractérisé en ce que le système est constitué d'un ballon de verre dans lequel arrive le fluide et d'une tuyauterie d'évacuation qui comprend un tube perforé de trous de très petit diamètre qui débouchent au voisinage du centre du ballon, ladite tuyauterie se raccordant sur la tubulure.
23. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 22, caractérisé en ce que l'arrivée supérieure permet l'injection de milieu d'impulsion et en ce que l'arrivée inférieure est munie d'un système d'aspiration permettant la succion d'une petite quantité du milieu d'impulsion, lors de l'injection dudit milieu d'impulsion.
24. Dispositif selon l'une des revendications 16 à 23, caractérisé en ce que la fréquence, la durée et l'intensité des impulsions arrivant dans les électrodes sont variables et gérées par un système électronique.
25. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 24, caractérisé en ce qu'il permet de réaliser l'alignement des ovocytes et la fusion cellulaire par action d'une impulsion calibrée, générée par un champ électrique.
26. Dispositif selon la revendication 25, caractérisé en ce que le traitement de fusion cellulaire est automatiquement géré par un système électronique.
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4133081A1 (de) * | 1991-10-01 | 1993-04-15 | Fischer Karl Heinz Dipl Ing | Verfahren und einrichtung zur beeinflussung von bio-chemischen reaktionen |
| JP2006094783A (ja) * | 2004-09-29 | 2006-04-13 | Fujitsu Ltd | 細胞給排・捕捉装置及び細胞給排・捕捉方法 |
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| US7527965B2 (en) * | 2002-05-21 | 2009-05-05 | Institut National De La Recherche Agronomique | Cell culture device |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4894343A (en) * | 1986-11-19 | 1990-01-16 | Hitachi, Ltd. | Chamber plate for use in cell fusion and a process for production thereof |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Biological Abstracts, volume 82, 1986, J.P. Ozil: "Effects of electric field on fusion rate and survival of 2-cell rabbit embyos", voir page 213 * |
| Biological Abstracts, volume 90, avril 1990, J.P. Ozil: "The parthenogenetic development of rabbit oocytes after; repetive pulsatile electrical stimulation", voir page 261 * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4133081A1 (de) * | 1991-10-01 | 1993-04-15 | Fischer Karl Heinz Dipl Ing | Verfahren und einrichtung zur beeinflussung von bio-chemischen reaktionen |
| DE4133081C2 (de) * | 1991-10-01 | 1998-10-15 | Fischer Karl Heinz Dipl Ing | Verfahren und Einrichtung zur Beeinflussung von biochemischen Reaktionen |
| US7201836B2 (en) | 1997-12-17 | 2007-04-10 | Molecular Devices Corporation | Multiaperture sample positioning and analysis system |
| US7244349B2 (en) | 1997-12-17 | 2007-07-17 | Molecular Devices Corporation | Multiaperture sample positioning and analysis system |
| US7387715B2 (en) | 1997-12-17 | 2008-06-17 | Molecular Devices Corporation | Sample positioning and analysis system |
| US10006902B2 (en) | 1998-06-12 | 2018-06-26 | Sophion Bioscience A/S | High throughput screen |
| US7067046B2 (en) | 2000-08-04 | 2006-06-27 | Essen Instruments, Inc. | System for rapid chemical activation in high-throughput electrophysiological measurements |
| US7527965B2 (en) * | 2002-05-21 | 2009-05-05 | Institut National De La Recherche Agronomique | Cell culture device |
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| EP1866408A4 (fr) * | 2005-03-30 | 2012-08-01 | Georgia Tech Res Inst | Dispositif electronique de manipulation de cellules et procede associe |
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