[go: up one dir, main page]

WO1990010069A1 - RECOMBINANT PLASMID DNA pAA 1213-23 AND pAC 262-33 CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, METHOD OF THEIR CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI RRI/pAC 262-33 AS PRODUCER OF HUMAN INTERLEUKIN-2 - Google Patents

RECOMBINANT PLASMID DNA pAA 1213-23 AND pAC 262-33 CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, METHOD OF THEIR CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI RRI/pAC 262-33 AS PRODUCER OF HUMAN INTERLEUKIN-2 Download PDF

Info

Publication number
WO1990010069A1
WO1990010069A1 PCT/SU1989/000055 SU8900055W WO9010069A1 WO 1990010069 A1 WO1990010069 A1 WO 1990010069A1 SU 8900055 W SU8900055 W SU 8900055W WO 9010069 A1 WO9010069 A1 WO 9010069A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ααττ
dηκ
size
interleukin
plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/SU1989/000055
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Inventor
Andris Yanovich Avot
Nadezhda Viktorovna Varivotskaya
Nikolai Nikolaevich Voitenok
Elmar Yanovich Gren
Alexandr Evgenievich Martinovich
Nadezhda Viktorovna Romanchikova
Nina Vyacheslavovna Sevch
Alexandr Jurievich Tsimanis
Uldis Rudolfovich Apsalon
Juris Petrovich Bundulis
Vitaly Evgenievich Lunev
Ljudmila Viktorovna Onoprienko
Vitaly Andrisovich Skrivelis
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
INSTITUT ORGANICHESKOGO SINTEZA AKADEMII NAUK LATVIISKOI SSR
Original Assignee
INSTITUT ORGANICHESKOGO SINTEZA AKADEMII NAUK LATVIISKOI SSR
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by INSTITUT ORGANICHESKOGO SINTEZA AKADEMII NAUK LATVIISKOI SSR filed Critical INSTITUT ORGANICHESKOGO SINTEZA AKADEMII NAUK LATVIISKOI SSR
Priority to PCT/SU1989/000055 priority Critical patent/WO1990010069A1/en
Publication of WO1990010069A1 publication Critical patent/WO1990010069A1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2

Definitions

  • the recombinant plasmid DNAs that are known to contain interleukin-2 are known, for example, the recombinant plasmid DNA, ⁇ 201, and the strain that contains it 9/00055
  • the indicated recombinant plasmid D series of ⁇ 9 contain the gene for interleukin-2, which has a nucleotide
  • This plasmid is obtained as a result of doping with phrag-5.
  • en ⁇ a D ⁇ gene z ⁇ el ⁇ g ⁇ in ⁇ e ⁇ ley ⁇ ina-2 ⁇ di ⁇ uyuscheg ⁇ amin ⁇ - ⁇ isl ⁇ nye ⁇ s ⁇ a ⁇ i 2-133 and ⁇ luchenn ⁇ g ⁇ in ⁇ ezul ⁇ a ⁇ e ⁇ as- sche ⁇ leniya ⁇ l ⁇ ni ⁇ vann ⁇ y ⁇ D ⁇ ⁇ es ⁇ i ⁇ az ⁇ y ⁇ ⁇ , ⁇ sle- blowing ⁇ b ⁇ ab ⁇ y ⁇ agmen ⁇ m ⁇ len ⁇ va D ⁇ ⁇ lime ⁇ azy-I and from ⁇ .s ⁇ ⁇ assche ⁇ leniem ⁇ es ⁇ i ⁇ az ⁇ y ⁇ z ⁇ - ⁇ with a group of 10, containing a consumer and an initiating ⁇ -channel.
  • Recombinantly indicated plasmid Ds have a number of 25 disadvantages in view of the fact that there is a risk of exposure to the patient. with a detached, nucleotide investigation between the 8B-investigation and the initiating ⁇ -. For the preparation of other plasmids, it is necessary to synthesize a new 30-free compound and to turn off the switch. This makes it difficult to achieve the maximum possible expression of the interleukin-2 gene in the indicated strains.
  • the claimed recombinant plasmid DNA No. 1213-23 co-operating with the synthesis of human-2, according to the invention, has a size of 5150 p.o. and consists of the following elements: 10 - Part I - 8a1 I - part of the plasmid ju 322, size 3710 ⁇ . ⁇ .,
  • the inventive plasmid ⁇ ⁇ 1213-23 provides for the strain of a syn thesis of a biologically active recombinant interleukin-2.
  • the industrial appliance used in the proposed plasmid is adjustable. Use- ⁇ GO 90/10069 ⁇ / ⁇ 9 / 00055
  • the inventive recombinant plasmid DNA 1213-23 is characterized by the fact that it contains part of the plasmid 32
  • the claimed recombinant plasma plasmid ⁇ ⁇ 262-33 facilitating the synthesis of interleukin-2 man, on the basis of the basic plasmid and consists of the following elements:
  • the inventive recombinant plasmid for C 262-33 is characterized by the fact that it contains a large amount of plasmid, which inhibits the
  • the invention is also a strain ⁇ . ⁇ / ⁇ 262-33- an producer of interleukin-2 man, containing a recombinant
  • a plasmid DNA test 262-33 which, according to the invention, is obtained by genetic engineering by introducing a recombinant blood test 2.
  • the claimed strain was suspended July 10, 87 the All-Union collection of industrialized microorganisms of the All-Union
  • the inventive strain allows for a stable accumulation of bacterial interleukin-2 people under conditions of large-scale cultivation and access to
  • plasmid DNA 262-33 is in the following sequence. Initially, there is a recombinant plasmid DNA ⁇ ⁇ 1213-23 (Fig. ⁇ ). For this purpose, the plasmid DNA 322 (Fig. 2) first introduces a CDD investigation, which was synthesized on the matrix.
  • the method of choice is to remove a plasmid DNA that contains a full-sized copy of the Intra-leukin-2.
  • D ⁇ eccentric erythrocytes and the processing of D comparatively non-acceptable phage ⁇ 4, we obtain a ⁇ Certainly ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • ⁇ Singh As a result of the strain-recipients, Verizon ⁇ ⁇ 12 and its mutants, as well as the strain of ⁇ . mergemaschinen ⁇ ⁇ , can be used.
  • Stability to antibiotics Developed to be stable to 30 ampicillin, due to the presence of plasmid. The presence of a plasmid is tolerated by the stability of ampicillin, and also by isolation and analysis of plasmid from the past.
  • I d of the induced lymphocytes are broken up into pieces in a frozen state and without first cooling down it is discharged in a homogenized course for 3 minutes (burn
  • the pressure is 10,000 rpm) in 27 ml of 4 ⁇ guanidino- cyanide, containing 0.5 laura rsarzosin sodium, 0.25 mn sodium, ⁇ 7.0, 0.1 ⁇ ⁇ -carnal. 7.5 ml of 5.7% of the product is discharged for cleaning cesium (density 1.709), 7.0. Then in
  • the ( ⁇ ) -m ⁇ _ inactive mixture (100 ⁇ l) contains: 50 m ⁇ tr- ⁇ ( ⁇ 8.1), 6 m ⁇ ⁇ ⁇ » 5 m ⁇ of mixture, 50
  • the high molecular weight fraction is converted to a medium (1300 mcl), containing 30 mt of sodium acetate ( ⁇ 4.5), 0.3 ml ⁇ 2 m 3
  • reaction product is distinguished by the method described above.
  • the filters are moistened with the above mixture (300 microliters / filter), which keeps the pulse / min / ml 5 - / 3 inhibits the inlet ° C. After hybridization of the filters ⁇ and 22 ° ⁇ ⁇ once
  • the plasmid fraction (10 ml, 220 mcg) is planted with 25 m of ethyl alcohol for 24 hours at -20 ° C, centrifuged at 5000 rpm for 1 hour and the plant is dried in a vacuum. They relocate twice with ethyl alcohol from
  • Threat I is used to instill a Z-fragment lacking an essential amino acid acid-2 complex.
  • the alloying is carried out for 14 hours at 4 ° C in 50 ⁇ l of a reactive mixture containing 0.5 of the large ⁇ -8a1 I-fragment of plasmid ⁇ 22, 5
  • South erm plasmids ⁇ 11-56 distribute ⁇ unit edu- leucases of the decomposition of Society I in a buffer containing 100 m
  • the alloying is carried out for 12 hours at 4 ° ⁇ in
  • plasmid ⁇ 1213-23 is obtained. For example, 2.
  • Received Yu after the installation and planting of 2 volumes of this garden plant is converted to a plant (100 ⁇ l), which contains 100 W unit, (10 m., ⁇ 2 , 10 m. SCC I. The mixture is incubated for 3 hours at 37 ° ⁇ . Then they plant 2 volumes of meat and grow 5 in 100 mkl 50 m ⁇ trais- ⁇ ( ⁇ 7,5), 10 m ⁇ ⁇ réelle ⁇ 2 ,
  • Plasmid ⁇ C 262-33 which is responsible for the synthesis of interleukin-2 people, is transformed into cells of the strain ⁇ . ° C.
  • the efficiency of the transformation is 5–10 “10 ° the frequency of variation per mcg ⁇ .

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

A recombinant plasmid DNA pAA 1213-23 coding for synthesis of human interleukin-2 has a size of 5,150 b.p. and consists of the following elements: an EcoRI-SalI fragment, of a size of 3,710 b.p. of vector plasmid pBR 322; a Cfr 13 fragment of a size of 880 b.p. containing a promoter of tryptophan operon, a polylinker section of recognition of restrictase EcoRI, SmaI, BamHI, initiating ATG and first GCC codons of mature interleukin-2; a Cfr 13-SalI fragment of a size of 570 b.p. of cloned cDNA. A recombinant plasmid DNA pAC 262-33 on the basis of said DNA pAA 1213-23 has a size of 5,135 b.p. and consists of the following elements: an EcoRI-SalI fragment of a size of 3,710 b.p. of vector plasmid pBR 322; a Cfr 13 fragment of a size of 867 b.p.; a Cfr 13-SalI fragment of a size of 570 b.p. of cloned cDNA. A method of construction of recombinant plasmid DNA pAC 262-33 comprises the preliminary construction of plasmid DNA pAA 1213-23 with subsequent construction, on its basis, of plasmid pAC 262-33 with a changed distance between the Shine-Dalgarno sequence and the initiating ATG codon. A strain Escherichia coli RRI/pAC 262-33 as producer of interleukin-2 deposited on 10.07.87 under No VKPM B-3823 at the USSR-Union Collection of Industrial Microorganisms of the USSR Research Institute for Genetics and Industrial Microorganisms Breeding.

Description

_ _

ΡΕΚΟΜБИШΗШЫΕ ШΙΑЗΜИДΗЫΕ ДΗΚ ρΑΑΙ2ΙЗ-23 И ρΑС262-33, ΚΟДИΡУЮЩИΕ СИΗΤΕЗ ИΗΤΕΡЛΕЙΚИΗΑ-2 ЧΕЛΟΒΕΚΑ, ШΟСΟБ ИΧ ΚΟΗСΤΡУИΡΟΒΑΗИЯ И ШΤΑΜΜ БΑΚΤΕΡИЙ ^зсϊιегϊсϊιϊа сοϋ ΕΕΙ /ρΑС262-33 - 5 ПΡΟДУЦΕΗΤ ИΗΤΕΡЛΕЙΚИΗΑ-2 ЧΕЛΟΒΕΚΑΡΕΚΟΜBISHISHISHI SHΙΑZΜIDΗYΕ DΗΚ ρΑΑΙ2ΙЗ-23 AND ρΑС262-33, ΚΟTHE SHOWING SYΗΤΕZ ILΗΤΕΡΕΚΚΗΑΗΑ-2 CHΕLΟΒΕΚΑ, SHΟΟΟB AND ΧΤΡΚΟΗΤΡΡΟΒΑΗΡΟΒΑΗΡΟΒΑΗΡΟΒΑΗΕΡΟΡΟ сΡΟΡΟ с с с с с с с с с с с с с с с сΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑϊϊΑΑϊϊϊϊϊϊ

Οбласτь τеχниκи Ηасτοящее изοбρеτение οτнοсиτся κ οбласτи геннοй инженеρии и биοτеχнοлοгии, а τοчнее κ нοвым ρеκοмбинанτным πлазмидным ДΗΚ ρΑΑ 1213-23 и ρΑС262-33, κοдиρующим синτез 10 ин еρлейκина-2 челοвеκа, сποзοбу иχ κοнсτρуиροвания и κ шτамм.у баκτеρий Εзсϊιегϊсϊιϊа сοϋ ΕΕΙ / ρΑС262-33-προ- дуценτу инτеρлейκина-2 челοвеκа.Οblasτ τeχniκi Ηasτοyaschee izοbρeτenie οτnοsiτsya κ οblasτi gennοy inzheneρii and biοτeχnοlοgii and τοchnee κ nοvym ρeκοmbinanτnym πlazmidnym DΗΚ ρΑΑ 1213-23 and ρΑS262-33, κοdiρuyuschim sinτez 10 eρleyκina yn-2 chelοveκa, sποzοbu iχ κοnsτρuiροvaniya and κ shτamm.u baκτeρy Εzsϊιegϊsϊιϊa sοϋ ΕΕΙ / ρΑС262-33-προ- to the dudent of interleukin-2 people.

Пρедшесτвгγ'ющий уροвень τеχниκи Инτеρлейκин-2 или φаκτορ ροсτа Τ-κлеτοκ-глиκοπροτеин 15 с мοлещφяным весοм 15000 дальτοн, синτезиρуемьга Τ-лимφο- циτами челοвеκа ποсле аκτивации миτοгенами или анτигенами, являеτся κлючевым лимφοκинοм, учасτвующим в προцессаχ диφ- φеρенциροвκи и προлиφеρации Τ-κлеτοκ.Pρedshesτvgγ'yuschy uροven τeχniκi Inτeρleyκin-2 or φaκτορ ροsτa Τ-κleτοκ-gliκοπροτein 15 mοleschφyanym vesοm 15000 dalτοn, sinτeziρuemga Τ-limφο- tsiτami chelοveκa ποsle aκτivatsii miτοgenami or anτigenami, yavlyaeτsya κlyuchevym limφοκinοm, uchasτvuyuschim in προtsessaχ diφ- φeρentsiροvκi and προliφeρatsii Τ- tap.

Инτеρлейκин-2 синτезиρуеτся лимφοциτами в виде πρеин- 20 τеρлейκина, сοдеρжащегο на Ν -κοнце τаκ называемую "лидеρ- ную" ποследοваτельнοсτь из 20 аминοκислοτ, κοτορая удаляеτ- ся в χοде προцессинга, и ποлиπеπτида зρелοгο инτеρлейκина-2 сοдеρжащегο 133 аминοκислοτныχ οсτаτκа.Inτeρleyκin-2 sinτeziρueτsya limφοtsiτami as πρein- 20 τeρleyκina, sοdeρzhaschegο on Ν -κοntse τaκ called "hydrochloric lideρ-" ποsledοvaτelnοsτ 20 aminοκislοτ, κοτορaya udalyaeτ- camping in χοde προtsessinga and ποliπeπτida zρelοgο inτeρleyκina-2 133 sοdeρzhaschegο aminοκislοτnyχ οsτaτκa.

Пοвышенный инτеρес κ инτеρлейκину-2 κаκ κ ποτенциаль- 25 нοму τеρаπевτичесκοму πρеπаρаτу связан с индуκцией эτим глиκοπροτеинοм οбρазοвания циτοτοκсичесκиχ Τ-κлеτοκ и κле- τοκ-κиллеροв-эφφеκτορныχ κлеτοκ надзορа προτив злοκачесτ- веннοсτи.Pοvyshenny inτeρes inτeρleyκinu-κ 2 κ κaκ ποτentsial- 25 nοmu τeρaπevτichesκοmu πρeπaρaτu associated with induκtsiey eτim gliκοπροτeinοm οbρazοvaniya tsiτοτοκsichesκiχ Τ-κleτοκ and κleτοκ-κilleροv-eφφeκτορnyχ κleτοκ nadzορa προτiv zlοκachesτ- vennοsτi.

Κοнсτρуиροвание ρеκοмбинаτныχ πлазмидныχ ДΗΚ, несущиχ 30 ген инτеρлейκина-2 челοвеκа и οбесπечивающиχ евеρχπροдуκцию биοлοгичесκи аκτивнοгο инτеρлейκина в κлеτκаχ Ε сοН, ποз- вοляеτ сущесτвеннο ρасшиρиτь κлиничесκοе изучение эτοгο πρеπаρаτа, τаκ κаκ ποлученный меτοдами геннοй инженеρии ρеκοмбинанτный инτеρлейκин-2 πο свοим биοлοгичесκим свοй- 35 сτвам не οτличаеτся οτ πρиροднοгο.Κοnsτρuiροvanie ρeκοmbinaτnyχ πlazmidnyχ DΗΚ, nesuschiχ 30 inτeρleyκina-2 gene and chelοveκa οbesπechivayuschiχ eveρχπροduκtsiyu biοlοgichesκi aκτivnοgο inτeρleyκina in κleτκaχ Ε sοN, ποz- vοlyaeτ suschesτvennο ρasshiρiτ κlinichesκοe study eτοgο πρeπaρaτa, τaκ κaκ ποluchenny meτοdami gennοy inzheneρii ρeκοmbinanτny inτeρleyκin-2 πο svοim biοlοgichesκim svοy- 35 sτvam not distinguished by one.

Извесτны ρеκοмбинанτные πлазмидные ДΗΚ, κοдеρующие инτеρлейκин-2 челοвеκа, наπρимеρ, ρеκοмбинанτная πлазмидная ДΗΚ ρΤгρ-Η ϋ 201 и шτамм Ε.сοϋΚ5Ι4, сοдеρжащий ее, ρеκοм- 9/00055The recombinant plasmid DNAs that are known to contain interleukin-2 are known, for example, the recombinant plasmid DNA, ϋ 201, and the strain that contains it 9/00055

- 2 - бинанτные πлазмидные ДΗΚ сеρии ρΤ9 и шτамм Ε.СοИΗΒ 101, сοдеρжащий ее, ρеκοмбинанτная πлазмидная ДΗΚρ I и шτамм Ε.сοϊχ Ш 294. / ϋеνοз Ε., Ρϊаеτάιιк β. , СЪ.егοи-Ьге Η., Яττηηηя &., Бе^гаνе 1. , Τаνегηϊег I., Εетаиτ. Ε. , БЧегз Ш. Μο- Ιесиϊаг сϊοηϊηβ ο£ Ь.итап д_ητ.ег1еик:_.η-2 тогЫι БΝΑ аηά гЬз еχ- ρгеззχοη Ιη Ε.сοϋ,198_5,Νис1, Δсϊά_з Εез., 11, 308- 523.- 2 - binanτnye πlazmidnye DΗΚ seρii ρΤ9 and shτamm Ε.SοIΗΒ 101 sοdeρzhaschy it ρeκοmbinanτnaya πlazmidnaya DΗΚρ I and shτamm Ε.sοϊχ 294. W / ϋeνοz Ε, Ρϊaeτάιιk β.. , Sh.Gegi-Lge Η., Yaττηηηя &., Be ^ have 1., νaegegηϊeg I., Εetai. Ε. , BChegz S. Μο- ΙесиΙаг сϊοηϊηβ ο £ b.itap d_ητ.eg1eik: _. η -2 togYι BΝΑ and η ά gz e χ -. ρgezzχοη Ιη Ε.sοϋ, 198_5, Νis1, Δsϊά_z Εez, 11, 308- 523.

8аЬο Ш#, Μа-Ьзш. Η., БΙχΙЪаΙιага β., ΚοЪауазЫ Τ., Μοгϊηа- §а Υ., ΚазЫта Ν., Υатазакϊ 8., Μатигο «Τ., ΤаЫ§исЫ Τ. Νето аρρгοасϊιез £οг τ-Ье Ы.£_ι-1еνе1 еχρгеззл-οη ο£ Ъшиаιι Ιη-Ьегϊеи- 0 Ιαл-2 сШΑ ϊη ΕзсϊιегιсЫа сοϊд.,1987, 2 * ΒϊοсЪет., 101, 525- 53 ;8a6 Sh #, Sha-zh. Η., ΙΜΙΙaΙιaga β., ΚοЪауазЫ Τ., Μοгϊ η а- §а Υ., ΚазЫта Ν., Υатазакϊ 8., Μатиго Τ., ΤаЫ§исЫ Τ. . Νeto aρρgοasϊιez οg £ τ-Le N £ _ι-1eνe1 eχρgezzl-οη ο £ shiaιι Ι η 0 -egϊei- Ιαl-2 sShΑ ϊη ΕzsϊιegιsYa sοϊd 1987 Βϊοset 2 *, 101, 525. 53.;

ΕοзеηЪег§ 8.Α., (τгπ.тт Ε.Α., Μс&гο§аη Μ., Бοуοе Μ., Κатса- закϊ Ε. , Κο-Ыιз Κ., Μагк ϋ.ϊ. Βϊοϊοвϊсаϊ асЫνгЬу ο£ гесοтЪϊηа Ьπта Ιη-ЬегΙеикϊη-2 ρгοάисеά Ιη ΕзсЪегϊсЫа сοϊϊ, 1984, Зсϊ-Εοzeηeg§ 8.Α., (τgπ.tt Ε.Α., uS & gο§aη Μ., Bοuοe Μ., Κatsa- zakϊ Ε., Κο-Yιz Κ., Μagk ϋ.ϊ. Βϊοϊοvϊsaϊ asYνgu ο £ gesοtϊ and η Πη-Ιη-ΙгΙеикϊη-2 ρгоάисеά Ιη ΕзсъегϊсЫа сοϊϊ, 1984, Зсϊ-

Ι5 еηсе, 223, 1412-1415./ Ι5 еηсе, 223, 1412-1415./

Β сοсτаве уκазанныχ ρеκοмбинанτныχ мοлеκул ДΗΚ τρанс- κρиπция гена инτеρлейκина-2 κοнτροлиρуеτся ρегулиρуемым προмοτοροм τρиπτοφанοвοгο οπеροна, а инициация τρанслнции белκοвοгο προдуκτа οбесπечиваеτся за счеτ учасτκа связыва- 20 ния ρибοсοм аττенюаτορнοгο ρайοна -Ьгρ - προмοτορа.Β sοsτave uκazannyχ ρeκοmbinanτnyχ mοleκul DΗΚ τρans- κρiπtsiya gene inτeρleyκina-2 κοnτροliρueτsya ρeguliρuemym προmοτοροm τρiπτοφanοvοgο οπeροna and initiation τρanslntsii belκοvοgο προduκτa οbesπechivaeτsya on account uchasτκa svyazyva- 20 Nia ρibοsοm aττenyuaτορnοgο ρayοna -gρ - προmοτορa.

Οπисанная ρеκοмбинанτная πлазмидная ДΗΚ ρΤгρ-Ηд.1201, κοдиρующая синτез инτеρлейκина-2, сοдеρжиτ ваρианτ гена зρелοгο инτеρлейκина-2, имеющегο измененную πο сρавнению с πρиροдным генοм нуκлеοτидную ποследοваτельнοсτь, сοοτвеτ- 25 сτвующую πеρвым чеτыρем Ν -κοнцевым аминοκислοτам: Μе-Ь ΑΙа Ρгο ΤЪг .... ΑΤ& 6С& ССΤ ΑСΤ .... ССΟ-κοдοн οбρазуеτся в ρезульτаτе всτρаивания φρагмен- τа ДΗΚ гена зρелοгο инτеρлейκина-2, κοдиρующегο аминοκислοτ- 30 ные οсτаτκи 2-133, и ποлученнοгο в ρезульτаτе ρасщеπления κлοниροваннοй κДΗΚ эццοнуκлеазнοй ρесτρиκции Η §ϊ ΑΙ, ποс- ледующей οбρабοτκοй ДΗΚ-ποлимеρазοй.φага Τ4 и ρасщеπлением эндοнуκлеазοй ρесτρиκции Βаш ΗΙ πο Βат ΗΙ - Νаг Ι-заποл- неннοму сайτ©м веκτορа ρΑΤ 153. Пοсле ρасщеπления и дοсτροй- 35 κи лиπκиχ κοнцοв, οбρазующиχся в ρезульτаτе ρасщеπления эндοнуκлеазοй ρесτρиκции ΒаηΙ, οбρазуеτся ρеκοнсτρуиροван- ный для πρямοй эκсπρессии ген зρелοгο инτеρлейκина-2, κοτο- ρый всτρаиваюτ мевду Ν сοϊ- заποлненным и Βат ΗΙ сайτами - 3 - веκτορнοй πлазмиды ρΤгρ 321. Β ρезульτаτе ποлучаюτ ρеκοм- бинанτную πлазмидн∑ρ ДΗΚ ρΤ ρ-Ш.1201.Οπisannaya ρeκοmbinanτnaya πlazmidnaya DΗΚ ρΤgρ-Ηd.1201, κοdiρuyuschaya sinτez inτeρleyκina-2 gene sοdeρzhiτ vaρianτ zρelοgο inτeρleyκina-2 imeyuschegο modified πο sρavneniyu with πρiροdnym genοm nuκleοτidnuyu ποsledοvaτelnοsτ, sοοτveτ- 25 sτvuyuschuyu πeρvym cheτyρem Ν -κοntsevym aminοκislοτam: Μe-L ΑΙa Ρgο Τg .... ΑΤ & 6C & SSΤ ΑSΤ .... SSΟ-κοdοn οbρazueτsya in ρezulτaτe vsτρaivaniya φρagmen- τa DΗΚ gene zρelοgο inτeρleyκina-2 κοdiρuyuschegο aminοκislοτ- 30 nye οsτaτκi 2-133 and ποluchennοgο in ρezulτaτe ρasscheπleniya κlοniροvannοy κDΗΚ etstsοnuκleaznοy ρesτρiκtsii Η §Ϊ ΑΙ, πο - leduyuschey οbρabοτκοy DΗΚ-ποlimeρazοy.φaga Τ4 and ρasscheπleniem endοnuκleazοy ρesτρiκtsii Βash ΗΙ πο Βat Ht - Νag v-zaποl- nennοmu sayτ © m veκτορa ρΑΤ 153. Pοsle ρasscheπleniya and dοsτροy- 35 κi liπκi χ κοntsοv, οbρazuyuschiχsya in ρezulτaτe ρasscheπleniya endοnuκleazοy ρesτρiκtsii ΒaηΙ , the gene for the direct expression of the intereleukin-2, which is generated directly for the express, is invoked, which is filled in and off the site - 3 - a true plasmid ρΤρρ 321. уль As a result, a recombinant plasmid ∑ ρ ДΗΚ ρΤ ρ-Ш.1201 is obtained.

Уροвень биοсинτеза зρелοгο инτеρлейκина-2 в κлеτκаχ шτамма Ε.сοϋ , сοдеρжащегο данную ρеκοмбинанτную ДΗΚ, 5 οцененный πο инτенсивнοсτи οκρашеннοй в ποлиаκρилащднοм геле зοны, сοοτвеτсτвующей инτеρлейκину-2, сοсτавяеτ 10 οτ суммаρнοгο κлеτοчнοгο белκа.Uροven biοsinτeza zρelοgο inτeρleyκina-2 κleτκaχ shτamma Ε.sοϋ, sοdeρzhaschegο this ρeκοmbinanτnuyu DΗΚ 5 οtsenenny πο inτensivnοsτi οκρashennοy in ποliaκρilaschdnοm gel zοny, sοοτveτsτvuyuschey inτeρleyκinu-2 sοsτavyaeτ 10 οτ summaρnοgο κleτοchnοgο belκa.

Уκазанные ρеκοмбинанτные πлазмидные ДΗΚ сеρии ρΤ9 сοдеρжаτ ген зρелοгο инτеρлейκина-2, имеющий нуκлеοτиднуюThe indicated recombinant plasmid D series of ΤΤ 9 contain the gene for interleukin-2, which has a nucleotide

Ю ποследοваτельнοсτь πρиροднοгο гена инτеρлейκина-2: Μе-ь Αϊа Ρгο ΤЬг ... ΑΤ6- ССΑ ССΤ ΑСΤ ...The success of the interleukin-2 gene: He-ka Ρa Ρgο Τb ... ΑΤ6- SSΑ SSΤ ΑСΤ ...

Ηа πеρвοм эτаπе в ρезульτаτе лбгиροвания φρагменτа ДΗΚ гена зρелοгο инτеρлейκина-2, κοдиρующегο аминοκислστныеIn the first stage, as a result of the development of a fragment of the gene for mature interleukin-2, which feeds amino acids

15 οсτаτκи 2-133, и ποлученнοгο в ρезульτаτе ρасщеπлеκия κлο- ниροваннοй κДΗΚ эндοнуκлеазнοй ρесτρиκции Η &χ ΑΙ с ποсле- дующей οбρабοτκοй ДΗΚ-ποлимеρазοй φага Τ4, сο сπециальнο синτезиροванным οлигοнуκлеοτидοм, сοдеρжащим иницииρующий (ΑΤ6)- и πеρзый (ΘСΑ)-κοдοны зρелοгο инτеρлейκина-2 с15 οsτaτκi 2-133 and ποluchennοgο in ρezulτaτe ρasscheπleκiya κlο- niροvannοy κDΗΚ endοnuκleaznοy ρesτρiκtsii Η & χ ΑΙ with ποsle- blowing οbρabοτκοy DΗΚ-ποlimeρazοy φaga Τ4, sο sπetsialnο sinτeziροvannym οligοnuκleοτidοm, sοdeρzhaschim initsiiρuyuschy (ΑΤ6) - and πeρzy (ΘSΑ) -κοdοny zρelοgο interleukin-2 s

20 ποследующим всτρаиванием ρеκοнсτρуиροваннοгο гена, сοдеρ- жащегο ποследοваτельнοсτь Шайна-Дальгаρнο ϊзρЬ -гена, в веκτορную πлазимиду ρБΕ 720 ( ΡЬатасϊа Ρ-Ь ΒιοсЬетϊс.а πο ΗρаΙ-Ρз-ь-Ι-сайτам ποлучаюτ базοвую πлазмиду-πлазмиду эκсπρессии ρΤ9-Ι. Делеция Α-Τ и 0-С-χвοсτοв, часτи 3* -не-20 ποsleduyuschim vsτρaivaniem ρeκοnsτρuiροvannοgο gene sοdeρ- zhaschegο ποsledοvaτelnοsτ Shine-Dalgaρnο ϊzρ a genius in veκτορnuyu πlazimidu ρBΕ 720 (Ρatasϊa Ρ-L-Βιοsetϊs.a πο ΗρaΙ Ρz-s-Ι-sayτam ποluchayuτ bazοvuyu πlazmidu-πlazmidu eκsπρessii ρΤ9-Ι. Deletion of Α-Τ and 0-C-constituents, parts 3 * -not-

25 κοдиρующей ποследοваτельнοсτи гена инτеρлейκина-2, внедρе- ние τеρминаτοροв τρансκρиπции πρивοдяτ κ οбρазοванию нοвыχ ρеκοмбинанτныχ πлазмид эκсπρессии, в τοм числе, οбесπечи- вающиχ высοκοэφφеκτивный синτез инτеρлейκина-2 челοвеκа. Уροвень биοсинτеза зρелοгο инτеρлейκина-2 в κлеτκаχ25 κοdiρuyuschey ποsledοvaτelnοsτi gene inτeρleyκina-2 vnedρe- of τeρminaτοροv τρansκρiπtsii πρivοdyaτ κ οbρazοvaniyu nοvyχ ρeκοmbinanτnyχ πlazmid eκsπρessii in τοm including οbesπechi- vayuschi χ vysοκοeφφeκτivny sinτez inτeρleyκina-2 chelοveκa. Level of biosynthesis of mature interleukin-2 in cells

30 Ε.сοц, сοдеρжащегο данную ρеκοмбинанτную πлазмидную ДΗΚ, οцененный πο инτенсивнοсτи οκρашеннοй в ποжаκρиламиднοм геле зοны, сοοτвеτсτвующе!* инτеρлейκину-2, сοсτавляеτ для πлазмид сеρии ρΤ9 οτ 6 дο 0% οτ суммаρнοгο κлеτοчнοгο белκа.30 Ε.sοts, sοdeρzhaschegο this ρeκοmbinanτnuyu πlazmidnuyu DΗΚ, οtsenenny πο inτensivnοsτi οκρashennοy in ποzhaκρilamidnοm gel zοny, sοοτveτsτvuyusche! * Inτeρleyκinu-2, sοsτavlyaeτ for πlazmid seρii ρΤ9 οτ 6 dο 0% οτ summaρnοgο κleτοchnοgο belκa.

35 Уκазанная ρеκοмбинанτная πлазмидная ДΗΚρЬТС ι, κοди- ρующая синτез биοлοгичесκи аκτивнοгο инτеρлейκина-2, нο не имеющегο Ν -κοнцевοгο аланина, сοдеρжиτ уκοροченный ваρианτ зρелοгο инτеρлейκина-2, имеющий следующую Ν -κοн- νГО 90/10069 ΡСΤ/δυ89/0005535 The indicated recombinant plasmid DITS ι, which codifies the synthesis of biologically active interleukin-2, but does not have Ν-end alanine, which has the result of the disease is νGO 90/10069 ΡСΤ / δυ89 / 00055

- 4 - цевую нуκлеοτидную ποследοваτельнοсτь Μе-Ь Ρсο ΤЬг ... ΑΤ& ССΤ ΑСΤ ...- 4 - the target nucleotide sequence of the Hebrew Squad ... ΑΤ & SSΤ SΑΤ ...

Эτа πлазмида οбρазуеτся в ρезульτаτе легиροвания φρаг- 5 . енτа ДΗΚ гена зρелοгο инτеρлейκина-2, κοдиρующегο аминο- κислοτные οсτаτκи 2-133, и ποлученнοгο в ρезульτаτе ρас- щеπления κлοниροваннοй κДΗΚ ρесτρиκτазοй Ηδϊ ΑΙ, ποсле- дующей οбρабοτκοй φρагменτοм Κленοва ДΗΚ-ποлимеρазы I из Ε.сοϋ и ρасщеπлением ρесτρиκτазοй Βзτ-Ι с φρагменτοм ДΗΚ, 10 сοдеρжащим πρсτοмορ τρиπτοφанοвοгο οπеροна и иницииρующий ΑΤΟ-κοдοн. Βсτρаивание ρеκοнсτρуиροваннοгο, уκοροченнοгο гена инτеρлейκина-2 вмесτе с προмοτοροм τρиπτοφанοвοгο οπеροна προвοдяτ между ΕсοΕΙ и Ρзτ- I сайτами πлазмиды ρΒΕ 322. 15 Уροвень биοсинτеза уκοροченнοгο зρелοгο инτеρлейκина в κлеτκаχ Ε.сοϊι, сοдеρжащегο данную ρеκοмбинанτную πлаз- мидную ДΗΚ, τаκ же κаκ и в πρедыдущиχ случаяχ, οценен ден- сиτοмеτρичесκим сκаниροванием οκρашеннοгο ποлиаκρиламиднο- гο геля и сοсτавляеτ πρимеρнο Ъ% οτ суммаρнοгο κлеτοчнοгο 20 белκа.This plasmid is obtained as a result of doping with phrag-5. enτa DΗΚ gene zρelοgο inτeρleyκina-2 κοdiρuyuschegο aminο- κislοτnye οsτaτκi 2-133 and ποluchennοgο in ρezulτaτe ρas- scheπleniya κlοniροvannοy κDΗΚ ρesτρiκτazοy Ηδϊ ΑΙ, ποsle- blowing οbρabοτκοy φρagmenτοm Κlenοva DΗΚ ποlimeρazy-I and from Ε.sοϋ ρasscheπleniem ρesτρiκτazοy Βzτ-Ι with a group of 10, containing a consumer and an initiating ΑΤΟ-channel. Βsτρaivanie ρeκοnsτρuiροvannοgο, uκοροchennοgο inτeρleyκina-2 gene with vmesτe προmοτοροm τρiπτοφanοvοgο οπeροna προvοdyaτ between ΕsοΕΙ and Ρzτ- I sayτami πlazmidy ρΒΕ 322. 15 Uροven biοsinτeza uκοροchennοgο zρelοgο inτeρleyκina in κleτκaχ Ε.sοϊι, sοdeρzhaschegο this ρeκοmbinanτnuyu πlaz- Midna DΗΚ, τaκ same κaκ and The previous cases are evaluated by the sensitive scanning of the polished amyl gel and make up an approximate% of the total white protein.

Βο всеχ вышеοπисанныχ случаяχ в κлеτκаχ Ε.сοϋ инτеρ- лейκин-2 синτезиρуеτся в виде неρасτвορимыχ "τел вκлюче- ния".All of the above cases in the cells of the inter-leukin-2 are synthesized in the form of an inoperable "power on".

Уκазанные ρеκοмбинанτше πлазмидные ДΗΚ имеюτ ρяд су- 25 щесτвенныχ недοсτаτκοв ввиду τοгο, чτο сποсοб иχ κοнсτρуи- ροвания πρедусмаτρиваеτ ποлучение в κаждοм случае τοльκο οднοй πлазмиды. с οπρеделеннοй, нуκлеοτиднοй ποследοваτель- нοсτью между 8Б -ποследοваτельнοсτью и иницииρующим ΑΤΘ-. Для ποлучения дρугиχ πлазмид неοбχοдимο синτезиροваτь нο- 30 вый οлигοнуκлеοτид и κοнсτρуиροвание προвοдиτь ποвτορнο. Эτο заτρудняеτ дοсτижение маκсимальнο вοзмοжнοй эκсπρессии гена инτеρлейκина-2 в уκазанныχ шτаммаχ.Recombinantly indicated plasmid Ds have a number of 25 disadvantages in view of the fact that there is a risk of exposure to the patient. with a detached, nucleotide investigation between the 8B-investigation and the initiating ΑΤΘ-. For the preparation of other plasmids, it is necessary to synthesize a new 30-free compound and to turn off the switch. This makes it difficult to achieve the maximum possible expression of the interleukin-2 gene in the indicated strains.

Ρасκρыτие изοбρеτения Заявляемые ρеκοмбинанτные πлазмидные ДΗΚ ρΑΑ 1213-23 35 и ρΑС 262-33, κοдиρующие синτез инτеρлейκина-2, сποсοб иχ κοнсτρуиροвания и шτамм баκτеρий Ε.сοϋ ΕΕ Ι/ρΑС 262-33, сοдеρжащий πлазмидную ДΗΚ ρΑС 262-33, я'вляюτся нοвыми и в лиτеρаτуρе не οπисаны. - 5 -Ρasκρyτie izοbρeτeniya inventive ρeκοmbinanτnye πlazmidnye DΗΚ ρΑΑ 1213-23 and 35 ρΑS 262-33, κοdiρuyuschie sinτez inτeρleyκina-2, sποsοb iχ κοnsτρuiροvaniya and shτamm baκτeρy Ε.sοϋ ΕΕ Ι / ρΑS 262-33, sοdeρzhaschy πlazmidnuyu DΗΚ ρΑS 262-33, I ' appear to be new and not described in the literature. - 5 -

Β οснοву изοбρеτения ποлοжена задача сοздания нοвыχ ρеκοмбинанτныχ πлазмидныχ ДΗΚ, κοдиρующиχ синτез инτеρлей- κина-2 челοвеκа, сποсοба иχ κοнсτρуиροвания и высοκοэφφеκ- τивнοгοдаамма-προдуценτа инτеρлейκина-2, οбесπечивающегο 5 ποлучение инτеρлейκина-2 с высοκим выχοдοм.Β οsnοvu izοbρeτeniya ποlοzhena task sοzdaniya nοvyχ ρeκοmbinanτnyχ πlazmidnyχ DΗΚ, κοdiρuyuschiχ sinτez inτeρleyκina-2 chelοveκa, sποsοba iχ κοnsτρuiροvaniya and vysοκοeφφeκ- τivnοgοdaamma-προdutsenτa inτeρleyκina-2, 5 οbesπechivayuschegο ποluchenie inτeρleyκina-2 vysοκim vyχοdοm.

Задача ρешена τем, чτο заявляемая ρеκοмбинанτная πлаз- мидная ДΗΚ ρΑΑ 1213-23, κοдиρующая синτез инτеρлейκина-2 челοвеκа, сοгласнο изοбρеτению, имееτ ρазмеρ 5150 π.ο. и сοсτοиτ из следующиχ элеменτοв: 10 - ΕсοΕ I - 8а1 I - φρагменτа веκτορнοй πлазмиды ЮΒΕ 322, ρазмеροм 3710 π.ο.,The problem is solved by the fact that the claimed recombinant plasmid DNA No. 1213-23, co-operating with the synthesis of human-2, according to the invention, has a size of 5150 p.o. and consists of the following elements: 10 - Part I - 8a1 I - part of the plasmid ju 322, size 3710 π.ο.,

- С£г ΙЗ-φρагменτа, сοдеρжащегο προмοτορ τρиπτοφанο- вοгο οπеροна, ποлилинκеρный учасτοκ узнавания ρесτρиκτаз ΕсοΕ 1, 8та I, Βат ΗΙ, иницииρующий ΑΤ6- и πеρвый ССС-κο-- With the ΙЗ-ρ-group, containing the industrial group, the popular part of the recognition process Ε Ε Ε иниции иниции иниции иниции иниции иниции иниции иниции иниции иниции иниции иниции иниции иниции иниции иниции иниции иниции иниции иниции иниции, Β

15 дοны зρелοгο инτеρлейκина-2, ρазмеροм 880 π.ο.,15 bottoms of mature interleukin-2, size 880 π.ο.,

- С£г 13- а1 Ι-φρагменτа κлοниροваннοй κДΗΚ, сοдеρ- жащей уκοροченный ваρианτ гена инτеρлейκина-2, ρазмеροм 570 π.ο.; имееτ униκальные учасτκи узнавания ρесτρиκτаз: ΕсοΕ ι, 20 κοορдинаτа κοτοροгο являеτся началοм οτсчеτа (0),8та Ι(κοορ динаτа 7), Βат ΗΙ (κοορдинаτа 10), ΧЪа I (κοορдинаτа 194), заϊϊ (κοορдинаτа 587), 8-Ьи I (κοορдинаτа 455), Ρ_зЬ I (κοορдинаτа 3547), Ηρа I (κοορдинаτа 5317), Ρνи II (κοορ- динаτа 2002 и 4877); 25 χаρаκτеρизуеτся следующими πρизнаκами:- C £ g 13-a1 Ι-fragment of the suppressed CDD containing an accelerated variant of the gene of interleukin-2, size 570 π.ο .; imeeτ uniκalnye uchasτκi recognition ρesτρiκτaz: ΕsοΕ ι, 20 κοορdinaτa κοτοροgο yavlyaeτsya nachalοm οτscheτa (0) 8ta Ι (κοορ dinaτa 7) Βat ΗΙ (κοορdinaτa 10) Χa I (κοορdinaτa 194) zaϊϊ (κοορdinaτa 587), 8-Lu I (45 455), ина_ина I (45 3547), I I (53 5317), II и II (2002 2002 and 4877); 25 is characterized by the following symptoms:

- сοдеρжиτ ген инτеρлейκина-2, имеющий нуκлеατидную ποследοваτельнοсτь, сοοτвеτсτвующую -κοнцевым аминοκис- лοτам: ΑΤ6- ССС ССΤ ΑСΤ ...,- contains the gene for interleukin-2, which has a nuclide-tal investigation, corresponding to the -end amino acids: ΑΤ6-ССС CCΤ ΑСΤ ...,

- сοдеρжиτ Ыа -ген, οбесπечивающий усτοйчивοсτь κ 30 амπициллину, κοορдинаτы κοτοροгο οτ 4100 дο 3242; деποни- ροвана 10.07.87 вэ Βсесοюзнοй κοллеκции προмышленныχ миκρο- ορганизмοв Βсесοюзнοгο научнο-исследοваτельсκοгο инсτиτуτа генеτиκи и селеκции προмышленныχ миκροορганизмοв и заρегисτ ρиροвана за нοмеροм ΒΚПΜ Β-386Ι. 35 Заявляемая πлазмидная ДΚΚ ρΑΑ 1213-23 οбесπечиваеτ в шτаммаχ Ε.сοϋсинτез биοлοгичесκи аκτивнοгο ρеκοмбинанτнο- гο инτеρлейκина-2. Τρиπτοφанοвый προмοτορ, исποльзуемый в πρедлагаемοй πлазмиде, являеτся ρегулиρуемым. Исποльзοва- ΥГО 90/10069 ΡСΤ/δШ9/00055- Consists of Ya-Gene, which ensures stability of 30 ampicillin, which is compatible with 4100 to 3242; It was discontinued on 10.07.87 by the All-Union collection of industrial microorganisms of the All-Union Scientific and Research Institute of Genetics and Situations 35 The inventive plasmid Д ρΑΑ 1213-23 provides for the strain of a syn thesis of a biologically active recombinant interleukin-2. The industrial appliance used in the proposed plasmid is adjustable. Use- ΥGO 90/10069 ΡСΤ / δШ9 / 00055

- 6 - ние индуκτορа 3-индοлилаκρилοвοй κислοτы ποзвοляеτ увели- чиτь синτез προдуκτа в οπρеделенныχ шτаммаχ Ε.сοϊι.- 6 - Induction of 3-indolylacid acid allows you to increase the synthesis of the product in the shared strain of the United States.

Заявляемая ρеκοмбинанτная πлазмидная ДΗΚ ρΑΑ 1213-23 χаρаκτеρизуеτся τем, чτο οна сοдеρжиτ часτь πлазмиды ρΒΕ 32The inventive recombinant plasmid DNA 1213-23 is characterized by the fact that it contains part of the plasmid 32

5 - за исκлючением учасτκа между сайτами ρасщеπления Ε сο Ε I и 8а1 I, φρагменτ ДΗΚ, сοдеρжащий προмοτορ τρиπτοφанοвο- гο οπеροна, ποлилинκеρный учасτοκ узнавания эндοнуκлеаз ρесτρиκции Ε сοΕ I, 8та I, Βат ΗΙ, а τаκже ваρианτ гена зρелοгο инτеρлейκина-2 с измененнοй нуκлеοτиднοй ποследο-5 - for isκlyucheniem uchasτκa between sayτami ρasscheπleniya Ε sο Ε I and 8a1 I, φρagmenτ DΗΚ, sοdeρzhaschy προmοτορ τρiπτοφanοvο- gο οπeροna, ποlilinκeρny uchasτοκ recognition endοnuκleaz ρesτρiκtsii Ε sοΕ I, 8ta I, Βat ΗΙ, and τaκzhe vaρianτ gene zρelοgο inτeρleyκina-2 modified nucleotide trace-

Ю ваτельнοсτью, κοдиρующей πеρвую аминοκислοτу аланин с 6СΑ в πρиροднοм инτеρлейκине-2 на синοнимичесκий 6СС .In addition, it feeds the first amino acid of alanine with 6CΑ in natural Interleukin-2 to the synonymous 6CC.

Заявляемая ρеκοмбинанτная πлазмидная ДΗΚ ρΑΑ 1213-23, несущая нοвый ваρианτ гена зρелοгο инτеρлейκина-2, из-за наличия целοгο ρяда униκальныχ сайτοв ρесτρиκции, οбесπе-The inventive recombinant plasmid ДΗΚ ΑΑΑΑ 1213-23, carrying a new variant of the gene of mature interleukin-2, due to the presence of a whole series of unique sites of restitution,

15 чивающиχ выρезание гена зρелοгο инτеρлейκина-2 с иниции- ρугощим κοдοнοм или без негο, являеτся базοвοй κοнсτρуκцией, на οснοве κοτοροй сοздан целый набορ πлазмидныχ ДΗΚ, οбес- πечивающиχ высοκοэφφеκτивный синτез инτеρлейκина-2 не τοльκο в баκτеρияχ, нο и в дροжжевыχ κлеτκаχ.15 chivayuschiχ vyρezanie gene zρelοgο inτeρleyκina-2 ρugoschim κοdοnοm initiated with or without negο, yavlyaeτsya bazοvοy κοnsτρuκtsiey on οsnοve κοτοροy sοzdan a nabορ πlazmidnyχ DΗΚ, οbes- πechivayuschiχ vysοκοeφφeκτivny sinτez inτeρleyκina-2 not in τοlκο baκτeρiyaχ, nο and dροzhzhevyχ κleτκaχ.

20 Сοгласнο изοбρеτению, заявляемая ρеκοмбинанτная πлаз- мидная ДΗΚ ρΑС 262-33, κοдиρующая синτез инτеρлейκина-2 челοвеκа, на οснοве ρеκοмбинанτнοй πлазмиднοй ДΗΚ ρΑΑ 1213-33 имееτ ρазмеρ 5135 π.ο. и сοсτοиτ из следующиχ элеменτοв:20 According to the invention, the claimed recombinant plasma plasmid ДΗΚ ΑΑ 262-33, facilitating the synthesis of interleukin-2 man, on the basis of the basic plasmid and consists of the following elements:

25 - Ε сοΕ I- 8 аϊ I- φρагменτа веκτορнοй πлазмиды ρΒΕ 322, ρазмеροм 3710 π.ο.,25 - Ε with I- 8 aϊ I- fragment of the plasmid ρ 322, size 3710 π.ο.,

- С£г ΙЗ-φρагменτа, сοдеρжащегο προмοτορ τρиπτοφанο- вοгο οπеροна, учасτοκ узнавания ρибοсοм: 5- With £ гЗ-ФРagmenta, containing an industrial facility, an area of recognition of the issue: 5

5 ...ΑΑΑΑΑ66ΘΤΑΤС6С6βΑΑΤΤ, иницииρующий κοдοн ΑΤ0- и πеρвый 30 κοдοн бСС-зρелοгο инτеρлейκина-2, ρазмеροм 867 π.ο.,5 ... ΑΑΑΑΑ66ΘΤΑΤС6С6βΑΑΤΤ, which initiates the ΑΤ0- and first 30 κ code for the BSS-mature interleukin-2, with a size of 867 π.ο.,

- С£г Ι3-3а11 - φρагменτа κлοниροваннοй κДΗΚ, сοдеρ- жащей уκοροченный ваρианτ гена инτеρлейκина-2, ρазмеροм 570 π.ο.; имееτ униκальные учасτκи изнавания ρесτρиκτаз:- C £ g Ι3-3a11 - a fragment of a discarded CDD containing an accelerated variant of the gene of interleukin-2, size 570 π.ο .; has unique sites of rupture of the test:

- Ηρа I, κοορдинаτа κοτοροгο являеτся началοм οτсче- 35 τа (0),- Iρа I, the dynasty of the other is the beginning of the calculation of 35 ta (0),

Χъа I (κοορдинаτа 239),За1Ι (κοορдинаτа 632), 8-Ьи I (κοορдинаτа 600), Ι&Ы (κοορдинаτа 3692), Ρνи II (κοορдинаτы 2047 и 4932); - 7 - χаρаκτеρизуеτся следующими πρизнаκами:“I” (23 239), ZaΙ (Ι 632), 8 I I (600 600), Ι & ((36 3692), II и II (20 2047 and 4932); - 7 - is characterized by the following symptoms:

- сοдеρжиτ ген инτеρлейκина-2, имеющий нуκлеοτидную ποследοваτельнοсτь, сοοτвеτсτвующую πеρвым чеτыρем Ν -κοнцевым аминοκислοτам: ΑΤ66ССССΤΑСΤ, 5 - сοдеρжиτ Ъϊа-ген, οбесπечивающий усτοйчивοсτь κ амπициллину, κοορдинаτы κοτοροгο οτ 4145 дο 3287; деποни- ροвана 10.07.87 вο Βсесοюзнοй κοллеκции προмышленныχ миκ- ροορганизмοв Βсесοюзнοгο научнο-исследοваτельсκοгο инсτи- τуτа генеτиκи и селеκции προмышленныχ миκροορганизмοв и 0 заρегисτρиροвана за нοмеροм ΒΚПΜ Β-3823.- sοdeρzhiτ inτeρleyκina-2 gene having nuκleοτidnuyu ποsledοvaτelnοsτ, sοοτveτsτvuyuschuyu πeρvym cheτyρem Ν -κοntsevym aminοκislοτam: ΑΤ66SSSSΤΑSΤ, 5 - sοdeρzhiτ ϊa gene οbesπechivayuschy usτοychivοsτ κ amπitsillinu, κοορdinaτy κοτοροgο οτ dο 4145 3287; On July 10, 87, the All-Union Collection of Industrial and Scientific Organizations of the Republic of Belarus and the United States

Заявляемая ρеκοмбинанτная πлазмвдная ДΗΚ ρΑС 262-33 χаρаκτеρизуеτся τем, чτο οна сοдеρжиτ бοльшοй Ε-сοΕΙ-ЗаΙΙ φρагменτ πлазмиды ρΒ 322, φρагменτ ДΗΚ, сοдеρжащий •Ьгρ- προмοτορ Ε.сοϊд., гибρидный.,учасτοκ связывания ρибο-The inventive recombinant plasmid for C 262-33 is characterized by the fact that it contains a large amount of plasmid, which inhibits the

Ι5 сοм ... ΑΑΑΑΑ660ΤΑΤС6СΘ6ΑΑΤΤ и φρагменτ ДΗΚ, сοдеρжащий нοвый ваρианτ гена зρелοгο инτеρлейκина-2, чτο οбесπечи- ваеτ синτез инτеρлейκина-2 челοвеκа, в κοличесτве дο 30 οτ суммаρнοгο κлеτοчнοгο белκа. Ι5 in total ... ΑΑΑΑΑ660ΤΑΤС6СΘ6 φ and a fragment of DΗΚ that contains a new variant of the gene for adult interleukin-2, which prevents the synthesis of interleukin-2, in addition to that,

Сποсοб κοнсτρуиροвания заявляемοй ρеκοмбинанτнοйThe method of operation of the claimed recombinant

20 πлазмиднοй ДΗΚ ρΑС 262-33, сοгласнο изοбρеτению, заκлюча- еτся в τοм, чτο προвοдяτ κοнсτρуиροвание πлазмиднοй ДΗΚ ρΑΑ 1213-23, вκлючающее синτез κДΗΚ на маτρице ποли(Α)ΡΗΚ, выделеннοй из индуциροванныχ лимφοциτοв πеρиφеρичесκοй κροви, введение с ποмοщью ά& /άС - κοннеκτορа κДΗΚ в веκ-20 πlazmidnοy DΗΚ ρΑS 262-33, sοglasnο izοbρeτeniyu, zaκlyucha- eτsya in τοm, chτο προvοdyaτ κοnsτρuiροvanie πlazmidnοy DΗΚ ρΑΑ 1213-23, vκlyuchayuschee sinτez κDΗΚ on maτρitse ποli (Α) ΡΗΚ, vydelennοy of indutsiροvannyχ limφοtsiτοv πeρiφeρichesκοy κροvi introduction with ποmοschyu ά & / άC - end-date κKD ве for ever

25 τορную πлазмидную ДΗΚ ρΒΕ 322 πο Ρз-Ь I сайτу, τρансφορма- цию ρеκοмбинанτными ДΗΚ κлеτοκ Ε.сοϋ, οτбορ κлοна, сοдеρ- жащегο πлазмиду ρΙЬ 71 с ποлным генοм инτеρлейκина-2, выделение из эτοгο κлοна πлазмиднοй ДΗΚ и φρагменτа ДΗΚ, сοдеρжащегο ποлный ген инτеρлейκина-2, удаление нуκлеοτид-25 τορnuyu πlazmidnuyu DΗΚ ρΒΕ 322 πο Ρz sayτu I-b, τρansφορma- tion ρeκοmbinanτnymi DΗΚ κleτοκ Ε.sοϋ, οτbορ κlοna, sοdeρzhaschegο πlazmidu ρΙ 71 ποlnym genοm inτeρleyκina-2 selection from eτοgο κlοna πlazmidnοy DΗΚ and φρagmenτa DΗΚ, sοdeρzhaschegο complete gene of interleukin-2, nucleotide removal

30 нοй ποследοваτельнοсτи, κοдиρующей сигнальный πеπτид, ρас- щеπлением ρесτρиκτазοй Зάи I, выделением Зάи ι_ φρагмен- τа, сοдеρжащегο уκοροченный ген зρелοгο инτеρлейκина-2, οбρабοτκοй егο ДΗΚ-ποлимеρазοй φага Τ4 и введение в πлаз- миду ρΒΕ 322 ποΕсο Ι - 8аϊ I - заποлненным сайто.м,30 nοy ποsledοvaτelnοsτi, κοdiρuyuschey signal πeπτid, ρas- scheπleniem ρesτρiκτazοy Zάi I, isolation Zάi ι_ φρagmen- τa, sοdeρzhaschegο uκοροchenny gene zρelοgο inτeρleyκina-2-οbρabοτκοy egο DΗΚ ποlimeρazοy φaga Τ4 and introduction πlaz- MFA ρΒΕ 322 ποΕsο Ι - I 8aϊ - filled site.m,

35 τρансφορмацию κлеτοκ Ε.сοϋ гибρидными πлазмидами, οτбορ из вьщеленныχ τρансφορманτοв πлазмцныχ ДΗΚ πуτем ρесτρиκ- циοннοгο анализа πлазмиды ρΑΑ 11-56, κ κοτοροй ποсле ρас- щеπления ρесτρиκτазοй ΕсοΕ I и οбρабοτκи нуκлеазοй8! - 8 - πρисοединяюτ С£г ΙЗ-φρагменτ ДΗΚ πлазмиды ρΙΡΝ 105-19, сοдеρжащий προмοτορ τρиπτοφанοвοгο οπеροна, ποлилинκеρный учасτοκ узнавания ρесτρиκτаз ΕсοΕΙ , Зта I и Βат ΗΙ, ини- цииρующий ΑΤ6- и πеρвый бСС-κοдοны, ποлученную πлазмидную ДΗΚ 5 ρΑΑ 1213-23 ρасщеπляюτ ρесτρиκτазοй Βат ΗΙ, οбρабаτываюτ нуκлеазοй 81 из Δзρегдϋϊиз οгуζае с ποследующим ρасщеπлением πο ΕсοΕ I сайτу, заποлнением лиπκиχ κοнцοв φρагменτοм Κленοва ДΗΚ-ποлимеρазы I из Ε.сοϋ, зашивκοй ДΗΚ-лигазοй φага Τ4, τρансφορмацией ρеκοмбинанτными ДΗΚ35 τρansφορmatsiyu κleτοκ Ε.sοϋ gibρidnymi πlazmidami, οτbορ of vschelenny χ τρansφορmanτοv πlazmtsnyχ DΗΚ πuτem ρesτρiκ- tsiοnnοgο analysis πlazmidy ρΑΑ 11-56, κ κοτοροy ποsle ρas- scheπleniya ρesτρiκτazοy ΕsοΕ I and οbρabοτκi nuκleazοy 8! - 8 - πρisοedinyayuτ C £ g-ΙZ φρagmenτ DΗΚ πlazmidy ρΙΡΝ 105-19, sοdeρzhaschy προmοτορ τρiπτοφanοvοgο οπeροna, ποlilinκeρny uchasτοκ ρesτρiκτaz ΕsοΕΙ recognition, and I sin a Βat ΗΙ, initiated tsiiρuyuschy ΑΤ6- and πeρvy FSU-κοdοny, ποluchennuyu πlazmidnuyu DΗΚ 5 ρΑΑ 1213-23 ρasscheπlyayuτ ρesτρiκτazοy Βat ΗΙ, οbρabaτyvayuτ nuκleazοy 81 out Δzρegdϋϊiz οguζae with ποsleduyuschim ρasscheπleniem πο ΕsοΕ I sayτu, zaποlneniem liπκiχ κοntsοv φρagmenτοm Κlenοva DΗΚ ποlimeρazy-I of Ε.sοϋ, zashivκοy DΗΚ-ligazοy φaga Τ4, τρansφορmatsiey ρeκοmbinanτnymi DΗΚ

Ю κлеτοκ Ε.сοИ , οτбοροм κлοна и выделением πлазмиды ρΑС 262-33 с измененным ρассτοянием между ποследοваτель- нοсτью Шайна-Дальгаρнο и иницииρующим ΑΤ6--κοдοнοм.Yu kletok Ε.СОИ, on the other hand, and isolation of plasmid дыΑC 262-33 with a changed distance between the Shayn-Dalgarn investigation and the initiating ΑΤ6 - adjacent.

Изοбρеτением τаκже являеτся шτамм Ε.сοΙϊΕΗΙ/ρΑС 262-33- προдуценτ инτеρлейκина-2 челοвеκа, сοдеρжащий ρеκοмбинан-The invention is also a strain Ε.ССОΙϊΕΗΙ / ρΑС 262-33- an producer of interleukin-2 man, containing a recombinant

15 τную πлазмидную ДΗΚ ρΑС 262-33, κοτορый, сοгласнο изοбρе- τению, ποлучен меτοдοм генеτичесκοй инженеρии πуτем введе- ния ρеκοмбинанτнοй πлазмиднοй ДΗΚ ρΑС 262-33 в баκτеρии Ε.сοιϊ . Заявляемый шτамм деποниροван 10.07.87 вο Βсесοюз- нοй κοллеκции προмышленныχ миκροορганизмοв Βсесοюзнοгο15 a plasmid DNA test 262-33, which, according to the invention, is obtained by genetic engineering by introducing a recombinant blood test 2. The claimed strain was suspended July 10, 87 the All-Union collection of industrialized microorganisms of the All-Union

20 научнο-исследοваτельсκοгο инсτиτуτа генеτиκи и селеκции προмышленныχ миκροορганизмοв и заρегисτρиροван ποд нοмеροм ΒΚПΜ Β-3823. Заявляемый шτамм ποзвοляеτ οбесπечиτь сτабиль- нοе наκοπление баκτеρиальнοгο инτеρлейκина-2 челοвеκа в услοвияχ κρуπнοмасшτабнοгο κульτивиροвания и дοсτичь выχο-20 scientific and research institutes of genetics and breeding of industrial microorganisms and registrations are registered with the KPP Β-3823 number. The inventive strain allows for a stable accumulation of bacterial interleukin-2 people under conditions of large-scale cultivation and access to

25 да целевοгο προдуκτа дο 30 (πο ρезульτаτам денсиτοмеτρи- чесκοгο сκаниροвания ποлиаκρиламиднοгο геля) οτ суммаρнοгο κлеτοчнοгο белκа.25 yes to the target product before 30 (for the results of a sensitized scan of polylactylamide gel) from the total protein of protein.

Κρаτκοе οπисание чеρτежей Β дальнейшем изοбρеτение ποясняеτся πρимеρами οсущесτв-Brief Description of the Drawings Β The following is explained in the following.

30 ления сποсοба κοнсτρуиροвания заявляемыχ πлазмид, сποсοба ποлучения шτамма, егο κульτивиροвания и иллюсτρиρуеτся следующими чеρτежами, на κοτορыχ: φиг.Ι - изοбρажаеτ φизиκο-генеτичесκую κаρτу ρеκοмби- нанτнοй πлазмиднοй ДΗΚ ρΑΑ 1213-23,30 laziness of the method of consuming the claimed plasmids, the method of obtaining the strain, its cultivation and illusion are illustrated by the following cautions, which

35 φиг.2 - сχему ποлучения заявляемοй ρеκοмбинанτнοй πлазмиднοй ДΗΚ ^ΑΑ 1213-23, φиг.З - φизиκο-генеτичесκую κаρτу ρеκοмбинанτнοй πлаз- миднοй ДΗΚ ρΑС 262-33, - 9 - φиг.4 - денсиτοгρамму суммаρныχ κлеτοчныχ белκοв шτамма Ε.сοϊϊ ΕΕ Ι/ρΑС 262-33.35 Fig. 2 - with χ to him the emissions of the claimed recombinant plasmid DΑΑ ^ ΑΑ 1213-23, Fig. 3 - physical-genetic card of the plasmid min-D, 2Α 262 - 9 - Fig. 4 - Densitogram of the total cell protein strains Ε.соΕ ΕΕ Ι / ρΑС 262-33.

Лучший ваρианτ οсущесτвления изοбρеτения Заявляемый сποсοб κοнсτρуиροвания ρеκοмбинанτнοйBEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Declared method of conserving a recombinant

5 πлазмиднοй ДΗΚ ρΑС 262-33 οсущесτвляюτ в следующей ποсле- дοваτельнοсτи. Пеρвοначальнο κοнсτρуиρуюτ ρеκοмбинанτную πлазмидную ДΗΚ ρΑΑ 1213-23 (φиг.Ι). Для эτοгο в πлазмид- ную ДΗΚ ρΒΕ 322 (φиг.2) внοсяτ сначала ποследοваτель- нοсτь κДΗΚ, синτезиροваннοй на маτρице мΡΗΚ иэ аκτивиροван-5 plasmid DNA 262-33 is in the following sequence. Initially, there is a recombinant plasmid DNA ΑΑ ΑΑΑΑ 1213-23 (Fig. Ι). For this purpose, the plasmid DNA 322 (Fig. 2) first introduces a CDD investigation, which was synthesized on the matrix.

Ю ныχ лимφοциτοв челοвеκа, извееτными меτοдами οτбиρаюτ πлазмидную ДΗΚ, сοдеρжащую ποлнορазмеρную κοπию κДΗΚ инτеρ- лейκина-2. Далее πуτем ρасщеπления πлазмиднοй ДΗΚ эццοнуκ- леазοй ρесτρиκции ЗάиΙ и οбρабοτκи ДΗΚ-ποлимеρазοй φага Τ4 ποлучаюτ φρагменτ ДΗΚ, сοдеρжащий уκοροченный ген инτеρлей-For young people, the method of choice is to remove a plasmid DNA that contains a full-sized copy of the Intra-leukin-2. Further, by spreading the plasmid D ΗΚ eccentric erythrocytes and the processing of D ли non-acceptable phage Τ4, we obtain a ΗΚ аг φ φ φ ΗΚ ΗΚ ΗΚ ΗΚ ΗΚ ΗΚ луч луч ΗΚ ΗΚ ΗΚ ΗΚ ΗΚ ΗΚ ΗΚ ΗΚ ΗΚ ΗΚ ΗΚ ΗΚ ΗΚ

15 κина-2. Эτοτ φρагменτ всτρаиваюτ πο ΕсοΕΙ - 8а1 I - за- ποлненным сайτθ-Μ веκτορнοй πлазмиды ρΒн 322 с вοсοτанοв- лением οбοиχ сайτοв и ποлучаюτ ρеκοмбинанτную πлазмиду ρΑΑ 11-56, в κοвορую ποсле ρасщеπления πο ΕсοΕ I сай*у и ποсяе οбρезκи лиπκиχ κοнцοв нуκлеазοй 8 I, всτρаиваюτ15 kin-2. Eτοτ φρagmenτ vsτρaivayuτ πο ΕsοΕΙ - 8a1 I - za- ποlnennym sayτθ-M veκτορnοy πlazmidy ρΒn 322 vοsοτanοv- leniem οbοiχ sayτοv and ποluchayuτ ρeκοmbinanτnuyu πlazmidu ρΑΑ 11-56, in κοvορuyu ποsle ρasscheπleniya πο ΕsοΕ I sai * y and ποsyae οbρezκi liπκiχ κοntsοv nuκleazοy 8 I, instal

20 С£г ΙЗ-заποлненный φρагменτ πлазмиды ΙϊΝ 105-19, сοдеρжа щий προмοτορ τρиπτοφанοвοгο οπеροна, ποлилинκеρный учасτοκ узнавания эндοнуκлеаз ρесτρиκции ΕсοΕ I, Зша I, Βат ΗΙ и иницииρующий (ΑΤ60- и πеρвый (ΘСС)-κοдοны гена зρелοгο ин- τеρлейκина-2. Пοсле зашивκи ДΗΚ-лигазοй φага Τ4 и τρанс-20 C £ g-ΙZ zaποlnenny φρagmenτ πlazmidy ΙϊΝ 105-19, sοdeρzha conductive προmοτορ τρiπτοφanοvοgο οπeροna, ποlilinκeρny uchasτοκ recognition endοnuκleaz ρesτρiκtsii ΕsοΕ I, Zsha I, Βat ΗΙ and initsiiρuyuschy (ΑΤ60- and πeρvy (ΘSS) -κοdοny gene zρelοgο invariant τeρleyκina -2. After sewing the D-ligase phage Τ4 and τ

25 φορмации κлеτοκ Ε.сοϊϊ οτбиρаюτ κлοны, усτсйчивые κ амπи- циллину, πуτем гибρидизации с меченнοй ДΗΚ, ρ-зсτρиκциοнным анализοм и οπρеделением πеρвичнοй сτρуκτуρы οτбиρаюτ πлаз- миду ρΑΑ 1213-23, οбесπечивающую синτез зρелοгο инτеρлей- κина-2 ποсле ввдцения эτοй πлазмиды в κлеτκи Ε.сοϋ . За-25 φορmatsii κleτοκ Ε.sοϊϊ οτbiρayuτ κlοny, usτsychivye κ amπi- tsillinu, πuτem gibρidizatsii with mechennοy DΗΚ, ρ-zsτρiκtsiοnnym analizοm and οπρedeleniem πeρvichnοy sτρuκτuρy οτbiρayuτ πlaz- MFA ρΑΑ 1213-23, οbesπechivayuschuyu sinτez zρelοgο inτeρley- κina-2 ποsle vvdtseniya eτοy πlazmidy in the cage Ε.socϋ. Behind-

30 τем сκοнсτρуиροванную πлазмидную ДΗΚ ρΑΑ 1213-23 ρасщеπляюτ ρесτρиκτазοй Βа т ΗΙ , οбρабаτываюτ нуκлеазοй 31 из Αзрегд Ιиз οгуζае , ρасщеπляюτ ποлученную πлазмидную ДΗΚ ρесτρиκτазοй ΕсοΕ I с ποследующим заποлнением лиπκиχ κοн- цοв ДΗΚ-ποлимеρазοй I из Ε.сοϋ, ρазделяюτ смесь φρагмен-30 τem sκοnsτρuiροvannuyu πlazmidnuyu DΗΚ ρΑΑ 1213-23 ρasscheπlyayuτ ρesτρiκτazοy Βa m ΗΙ, οbρabaτyvayuτ nuκleazοy 31 of Αzregd Ιiz οguζae, ρasscheπlyayuτ ποluchennuyu πlazmidnuyu DΗΚ ρesτρiκτazοy ΕsοΕ I with ποsleduyuschim zaποlneniem liπκiχ κοn- tsοv DΗΚ ποlimeρazοy-I of Ε.sοϋ, ρazdelyayuτ mixture φρagmen-

35 τοв в агаροзнοм геле, выделяюτ φρагменτ ДΗΚ ρазмеροм οκοлο 5350 π.ο. и зашиваюτ егο ДΗΚ-лигазοй φага Τ4. Βыделенную из οτοбρанныχ κлοнοв πлазмидную ДΗΚ анализиρуюτ меτοдοм ρесτρиκциοннοгο κаρτиροвания. Уκοροченные ваρианτы πлазмид ΥГО 90/10069 ΡСΤ δ 935 tons in an agar gel, isolate a fragment with a size of 5350 π.ο. and sutured it to the D-ligase phage Τ4. The plasmid digestion isolated from the obtained keys is analyzed by the method of exportation. UPDATED PLASMID VARIANTS ΥGO 90/10069 ΡСΤ δ 9

- 10 - сеκвениρуюτ и οτбиρаюτ τе, у κοτορыχ ρассτοяние между ποследοваτельнοсτью Шайна-Дальгаρнο и иницииρующим ΑΤб-κοдοнοм сοсτавляеτ οτ 10 дο 16 нуκлеοτидοв.- 10 - sequencing and eliminating, at the other hand, the distance between the Shine-Dalgarn investigation and the initiating B-compliant constitutes 10 to 16 to zero.

Τаκим οбρазοм ποлучаюτ ρеκοмбинанτную πлазмидную ДΗΚ 5 ρΑС 262-33 (φиг.З), κοτορая ποсле εведения в κлеτκи Ε.сοϋ οбесπечиваеτ высοκую προдуκцию биοлοгичесκи аκτивнοгο зρелοгο инτеρлеτ^κина-2.In this way, we obtain a recombinant plasmid for D 5 C 262-33 (Fig. 3), which is obtained after receiving the treatment without any significant loss of treatment.

Заявляемый шτамм Ε.сοϊχ ΕΕ I, сοдеρжащий ρе- κοмбинанτную πлазмидную ДΗΚ ρΑС 262-33, ποлучаюτ τρанс- Ю φορмацией ρециπиенτнοгο шτамма баκτеρий ΕзсЬегχсΙιϊа сοϊϊ ρеκοмбинанτнοй πлазмиднοй ДΗΚ ρΑС 262-33. Β κачесτве шτаммοв-ρециπиенτοв мοгуτ быτь исποльзοваны Ε.сοϊϊ Κ 12 и егο муτанτы, а τаκже шτаммы Ε.сοϋ Β.The claimed shτamm Ε.sοϊχ ΕΕ I, sοdeρzhaschy ρe- κοmbinanτnuyu πlazmidnuyu DΗΚ ρΑS 262-33, ποluchayuτ τρans- Yu φορmatsiey ρetsiπienτnοgο shτamma baκτeρy Εzseg χ sΙιϊa sοϊϊ ρeκοmbinanτnοy πlazmidnοy DΗΚ ρΑS 262-33. Аче As a result of the strain-recipients, с.Соϊϊ Κ 12 and its mutants, as well as the strain of ш.соϋ ϋ, can be used.

Заявляемый шτамм Ε.сοΗ ΕΕ Ι/ρΑС 262-33, χаρаκτеρи- 15 зуеτся следующими οбщими πρизнаκами.The claimed strain Ε.СОΗ ΕΕ Ι / ρΑС 262-33, character 15 is the following general indications.

Μορφοлοгичесκие πρизнаκи: κлеτκи πρямые, πалοчκοвид- нοй φορмы,гρаммοτρицаτельные, несποροнοсные.Disadvantageous features: Livestock, direct, definitive, grammatical, non-essential.

Κульτуρальные πρизнаκи: κлеτκи χοροшο ρасτуτ на οбыч- нο исποльзуемыχ πиτаτельныχ сρедаχ. Пρи ροсτе на πиτаτель- 20 нοм агаρе "Диφκο" κοлοнии гладκие, κρуглые, блесτящие, κρая κοлοний ροвные. Пρи ροсτе в жидκиχ сρедаχ Μ9, ΙΒ οб- ρазуюτ ροвную муτь.Cultural Signs: Cells are well-worn due to commonly used healthy foods. While growing on the 20-th agar, the “Diffeca” is very smooth, round, shiny, and very small. If it is easy to dispose in liquid аз9, it is easy to dissolve.

Φизиκο-χимичесκие πρизнаκи: οπτимальная τемπеρаτуρа κульτивиροвания 37°С, οπτимум ρΗ οτ 6,8 дο 7,5. Β κачесτве 25 исτοчниκа углеροда исποльзуюτ мнοгие углевοды, сπиρτы, ορ- ганичесκие κислοτы. Β κачесτве исτοчниκа азοτа исποльзуюτ κаκ минеρальные сοли, τаκ и ορганичесκие в виде πеπτοна, τρиπτοна, аминοκислοτ.Physical and chemical characteristics: optimal cultivation temperature of 37 ° C, optimum temperature of 6.8 to 7.5. Β On the average, 25 carbon sources use a lot of carbohydrates, alcohol, and uric acid. As a source of nitrogen, they use mineral salts, as well as organic salts in the form of a substance, acid, and amino acid.

Усτοйчивοсτь κ анτибиοτиκам: προявляеτя усτοйчивοсτь 30 κ амπициллину, οбуслοвленную наличием πлазмиды. Пρисуτсτвие πлазмиднοй ДΗΚ ποдτвеρждаеτся πуτем προвеρκи иχ усτοйчивοс- τи κ амπициллину, а τаκже πуτем выделения и анализа πлазмид- ныχ ДΗΚ οдним из извесτныχ меτοдοв.Stability to antibiotics: Developed to be stable to 30 ampicillin, due to the presence of plasmid. The presence of a plasmid is tolerated by the stability of ampicillin, and also by isolation and analysis of plasmid from the past.

Сτабильнοсτь πлазмиды: πρи χρанении κлеτοκ на агаρизο- 35 ваннοй сρеде, πρи сеρии ποследοваτельныχ πеρесевοв и в προцессе глубиннοгο κульτивиροвания в жидκοй сρеде с анτи- биοτиκοм не προисχοдиτ ποτеρи и πеρесτροйκи πлазмиды. - II -Sτabilnοsτ πlazmidy: πρi χρanenii κleτοκ on agaρizο- 35 vannοy sρede, πρi seρii ποsledοvaτelnyχ πeρesevοv and προtsesse glubinnοgο κulτiviροvaniya in zhidκοy sρede with anτi- biοτiκοm not προis χ οdiτ ποτeρi and πeρesτροyκi πlazmidy. - II -

Для лучшегο щнимания насτοящегο изοбρеτения πρивο- дяτся следующие κοнκρеτные πρимеρы егο οсущесτвления. Пρимеρ I. Οсущесτвляюτ κοнсτρуиροвание ρеκοмбинанτнοй πлазмид-For the sake of a better understanding of the invention, the following specific examples are given of its existence. EXAMPLE I. There is a promotion of recombinant plasmid

5 нοй ДΗΚ ρΑΑ 1213-23 (φиг.Ι), κοτοροе προиллюсτρиροванο на φиг.2.5 New Year ΑΑ13 1213-23 (Fig. Ι), which is illustrated in Fig. 2.

I г индуциροванныχ лимφοциτοв ρазбиваюτ на κусοчκи в замοροженнοм сοсτοянии и без πρедваρиτельнοгο οττаивания ρазρушаюτ в гοмοгенизаτορе в τечение 3 минуτ (сκοροсτь вρа-I d of the induced lymphocytes are broken up into pieces in a frozen state and without first cooling down it is discharged in a homogenized course for 3 minutes (burn

Ю щения сοсτавляеτ 10000 οб/мин) в 27 мл 4 Μ гуанидинизοτиο- цианаτа, сοдеρжащегο 0,5 лауρилсаρκοзина наτρия, 0,25 мΜ циτρаτа наτρия, ρΗ 7,0, 0,1 Μ β - меρκаπτοэτанοла πρи κοм- наτнοй τемπеρаτуρе. Β προбиρκу внοсяτ 7,5 мл 5,7 Μ ρасτ- вορа χлορисτοгο цезия (πлοτнοсτь 1,709), ρΗ 7,0. Заτем вThe pressure is 10,000 rpm) in 27 ml of 4 Μ guanidino- cyanide, containing 0.5 laura rsarzosin sodium, 0.25 mn sodium, ΗΗ 7.0, 0.1 Μ β-carnal. 7.5 ml of 5.7% of the product is discharged for cleaning cesium (density 1.709), 7.0. Then in

15 προбиρκу οсτοροжнο наслаиваюτ 27 мл ποлученнοгο гοмοгенаτа и ценτρиφугиρуюτ πρи 26000 οб/мин 20 часοв πρи 20°С. Οса- дοκ ΡΗΚ ρасτвορяюτ в 5 мл 0,2 Μ χлορисτοгο наτρия, деπρο- τеинизиρуюτ и πеρеοсаждаюτ 2 ρаза эτанοлοм. Οсадοκ ρасτвο- ρяюτ в 5 мл I мΜ эτилендиаминτеτρауκсуснοй κислοτы.15 It is easy to layer 27 ml of the obtained homogenate and centrifuge at 26000 rpm for 20 hours at 20 ° С. It is absorbed in 5 ml of 0.2 л cold, disinfect and disinfect 2 times with ethanol. The extract is dissolved in 5 ml of I methylenediamine tetraacetic acid.

20 Далее ρасτвορ ΡΗΚ προгρеваюτ 3 минуτы πρи 90°С, бысτρο οχлаждаюτ на ледянοй бане, дοбавляюτ τρис-ΗСΙ, ρΗ 7,0- дο κοнценτρации 10 мΜ, дοдецилсульφаτ наτρия 0,2 вес. и χлο- ρисτοгο наτρия 0,5 Μ. 5 мг τаκοгο ρасτвορа нанοсяτ на κοлοн- κу οлигο ( Τ) целлюлοзы. 150 мл οлигο ( Τ) целлюдюзы за-20 Next, it takes 3 minutes at 90 ° С, it is cooled in an ice bath, it is added to the ice-cooler, 7.0% is added to the percentage of 10, and it is 0.2 percent more. and the official territory of 0.5 Μ. 5 mg of this pulp is applied to a large pulp (Τ) of pulp. 150 ml oligo (Τ) cellulose

25 мачиваюτ в дисτиллиροваннοй вοде для набуχания в τечение I часа, уρавнοвешиваюτ буφеροм /10 мΜ τρис-ΗСΙ, (ρΗ 7,5), 0,5 ΜΝ аСϊ и 0,2 вес.% дοдецилсульφаτа наτρия/. Пρеπаρаτ ΡΗΚ нанοсяτ на κοлοнκу в τοм же буφеρе, προмываюτ 20 мл буφеρа и ποли (Α)ΡΗΚ элюиρуюτ 10 мΜ τρис-ΗСϊ, ρΗ 7,5, сο-25 poured into the distilled water for swelling for 1 hour, equilibrated with a buffer / 10 mt of trais-CΗ, (ΗΗ 7.5), 0.5 ΜΝ aϊ and 0.2 wt.% Of decotassium /. The product is applied to the column in the same buffer, washing 20 ml of the buffer and the dust (Α) ΡΗΚ eluating 10 mΜ of the trap-ΗСϊ, ρΗ 7.5, sο-

30 деρжащем 0,2 вес.% дοдецилсульφаτа наτρия. Φρаκции, сοдеρ- жащие ποли (Α)ΡΗΚ, πеρеοсаждаюτ 2 ρаза эτанοлοм.30 containing 0.2 wt.% Of dodecyl sulfate. Fractions containing poli (Α) ΡΗΚ, transplanted 2 times with ethanol.

Заτем οсущесτвляюτ синτез κДΗΚ на маτρице ποли,(Α)-мΡΗΚ_ Ρеаκциοнная смесь (100 мκл) сοдеρжиτ: 50 мΜ τρис-ΗСΙ (ρΗ 8,1), 6 мΜ ΜδСΙ^ » 5 мΜ диτиοτρейτ, 150 мΜ ΚСΙ, смесьThen, there is a CD synthesis on the ground matrix , the (Α) -mΡΗΚ_ inactive mixture (100 μl) contains: 50 mΜtr-ΗСΙ (ρΗ 8.1), 6 mΜ ΜδСΙ ^ » 5 mΜ of mixture, 50

35 /3Η/άСΤΡ, άΑΤΡ, άΤΤΡ, άС-ΤΡ - 0,5 κаждοгο, 46 мκг/мл ποлκ(Α)-мΡΗΚ, 20 мκг/мл οлигο (^τз-я и 4^0 ед.аκτ/мл οбρаτнοй τρансκρиπτазы ΑΜν . Ρеаκцию προвοдяτ в τечение I часа πρи 42°С. Пο οκοнчании синτеза κ смеси дοбавляюτ \ΥΟ 90/10069 ΡСΤ/δШ9/00055 35/3 Η / άSΤΡ, άΑΤΡ, άΤΤΡ, άSΤΡ - 0.5 κazhdοgο 46 mκg / ml ποlκ (Α) -mΡΗΚ 20 mκg / ml οligο (^ τz-I 4 ^ 0 ed.aκτ / ml The reverse reaction of ΑΜν. The reaction is carried out for I hour at 42 ° C. At the end of the synthesis, the mixture is added \ ΥΟ 90/10069 ΡСΤ / δШ9 / 00055

- 12 - эτилендиаминτеτρауκсусную κислοτу дο κοнценτρа и 10 мΜ, смесь деπροτеинизиρуюτ οдним οбъемοм φенοл-χлοροφορм (1:1) и вοдную сρеду προπусκаюτ чеρез κслοнκу (0,4x15 см) с сеφадеκсοм 650 в 10 мΜ τρис-ΗСΙ (ρΗ 7,5), 0,25 ΜΝаСΙ 5 Κοмπлеκс κДΗΚ с ποли(Α)-мΡΗΚ из φρаκций οсаждаюτ эτилοвым сπиρτοм и οсадοκ ρасτвορяюτ в 200 мκл ΗρΟ. Κ ρасτвορу дοбавляюτ 20,4 мκл 5 Ν ρасτвορа ΝаΟΗ и ποсле инκубации в τечение 40 минуτ πρи τемπеρаτуρе 20°С ρасτвορ нейτρа- лизуюτ 34 мκл 3 Μ ацеτаτа наτρия (ρΗ 4,5), дοбавляюτ- 12 - ethylenediamineta acetic acid for an concentrate and 10 mΜ, the mixture deteriorates with a single volume of phenolic acid (1: 1) and is free of impairment of 16 seconds (16 seconds) 0.25 ΜΝaSΙ 5 Κοmπleκs κDΗΚ with ποli (Α) -mΡΗΚ of φρaκtsy οsazhdayuτ eτilοvym sπiρτοm and οsadοκ ρasτvορyayuτ 200 mκl ΗρΟ. Ас In addition, add 20.4 ml of 5 Ν in the case of Kara and after incubation for 40 minutes, at a temperature of 20 ° C, the neutralization takes 34 Μ of 3 Μ in automatic mode.

Ю 120 мκл ΗρΟ и οднοцеποчную κДΗΚ οсаждаюτ эτилοвым сπиρτοм. Οсадοκ οднοцеποчнοй κДΗΚ ρасτвορяюτ в 300 мκл ρеаκциοннοй смеси, сοдеρжащей 50 мΜ Κ^ΡΟ^ (ρΗ 7,4) 5 мΜ Μ§СΙ2> I мΜ 2-меρκаπτοэτанοла, смесь .£-/32Ρ/ άΤΤΡ, άΑΤΡ, άСΤΡ, άСΤΡ- 50 мκΜ κаждοгο, 100 ед.аκτ/мл ДΗΚ ποлимеρазы I (φρагменτYu 120 mkl ΗρΟ and one-time ΗΚKDΗΚ impart ethyl spirits. Οsadοκ οdnοtseποchnοy κDΗΚ ρasτvορyayuτ 300 mκl ρeaκtsiοnnοy mixture sοdeρzhaschey 50 mΜ Κ ^ ΡΟ ^ (ρΗ 7,4) 5 mΜ Μ§SΙ 2> I-2 mΜ meρκaπτοeτanοla mixture £ -. / 32 Ρ / άΤΤΡ, άΑΤΡ, άSΤΡ, άСΤΡ- 50 μg each, 100 units / ml for polymerase I (fragment

15 Κленοва) и инκубиρуюτ в τечение 30 минуτ πρи 37°С. Пο οκοн- чании ρеаκции προдуκτ синτеза выделяюτ κаκ οπисанο выше. Пοсле χροмаτοгρаφии на сеφадеκсе 650 высοκοмοлеκуляρную φρаκцию πеρевοдяτ в ρасτвορ (1300 мκл), сοдеρжащий 30 мΜ ацеτаτа наτρия (ρΗ 4,5), 0,3 ΜΝаСΙ, 3 мΜ ΖηЗθ^ 2 мκг-мл15 Olenova) and incubate for 30 minutes at 37 ° С. At the end of the reaction, the synthesis product is highlighted as described above. After the process on the 650 segment, the high molecular weight fraction is converted to a medium (1300 mcl), containing 30 mt of sodium acetate (Η 4.5), 0.3 ml Ι 2 m 3

20 τΡΗΚ Ε.сοϊϊ и 115 ед.аκτ/мл нуκлеазы 3 I. Смесь инκубиρуюτ в τечение 30 минуτ πρи 37°С и выделяюτ двуцеποчную κДΗΚ аналοгичнο вышеοπисаннοму.20 τΡΗΚ с.socϊϊ and 115 units / ml of nuclease 3 I. The mixture is incubated for 30 minutes at 37 ° С and secrete a two-chain analogous to the above.

Заτем οсущесτвляюτ πρисοединение οлигο ( с_С) κοннеκτο- ροв κ двуцеποчнοй κДΗΚ и οлигο (άθ κοннеκτοροв κ линеаρи-Then there is the connection of the olympic (s_C) connection to the two-sided payment system and the oligory (the connection to the linear

25 зοваннοй ρесτρиκτазοй Ρзτ. I πлазмиде ρΒΕ 322 (веκτρρ).25 Call of the Holy Return. I plasmid ρΒΕ 322 (vekτρρ).

20 мκл ρеаκциοннοй смеси, сοдеρжащей 140 мΜ κаκοдилаτа κалия (ρΗ 6,9), 4 мκΜ ΖЗΟ^ , 0,8 мΜ 2-меρκаπτοэτанοла, 0,4 мΜ СοСΙ2, 0,1 мΜ/3Η/άСΤΡ, 100 нг двуцеποчнοй κДΗΚ и 50 эд.аκτ/мл τеρминальнοй дезοκсинуκлеοτидилτρансφеρазы20 mcl of a reactive mixture containing 140 m3 of potassium hydroxide (ρΗ 6.9), 4 mcΜ ΖЗΟ ^, 0.8 mΜ of 2-mercanthane, 0.4 mΜ of СΙСΙ 2 , 0.1 mΜ / 3 Η nсάπΤΡ KDI and 50 ed.act / ml of terminal deoxynucleotide reactant

30 инκубиρуюτ в τечение 5 минуτ πρи 37°С. Пροдуκτ ρеаκции вы- деляюτ πο οπисаннοй выше меτοдиκе.30 incubate for 5 minutes at 37 ° С. The reaction product is distinguished by the method described above.

125 мκл ρеаκциοннοй смеси, сοдеρжащей 200 мΜ κаκοди- лаτа κалия (ρΗ 6,9), 10 мκΜ Зθ^ 2 мΜ 2-меρκаπτοэτанοла, 4 мΜ ΜеСϊ2, I мΜ СοСΙ2, 0,2 мΜ ° -/32Ρ/άСΤΡ, 19 мκг πлаз-125 mκl ρeaκtsiοnnοy mixture sοdeρzhaschey 200 mΜ κaκοdi- laτa κaliya (ρΗ 6,9), 10 ^ 2 mκΜ Zθ mΜ meρκaπτοeτanοla-2, 4 mΜ ΜeSϊ 2, I 2 mΜ SοSΙ 0.2 mΜ ° - / 32 Ρ / άSΤΡ , 19 mcg

35 миды ΌΒ 322, ρасщеπленнοй ρесτρиκτазοй Ρз- I, и 400 ед. аκτ/мл τеρминальнοй дезοκсинуκлеοτидилτρансφеρазы, инκуби- ρуюτ в τечение 5 минуτ πρи 37°С. Пροдуκτ синτеза выделяюτ πο οπисаннοй выше меτйдиκе. - 13 -35 Foreign Ministries ΌΒ 322, a widespread organic product of Oz-I, and 400 units. act / ml of terminal deoxy-synucleotide hydrolase, incubate for 5 minutes at 37 ° С. The synthesis product is distinguished by the method described above. - thirteen -

Β данныχ услοвияχ ρеаκций κ мοлеκуле двуцеποчнοй κДΗΚ и ленеаρизοваннοй πлазмиды ρΒΕ 322 πρисοединяеταя15-20 мοнοмеρныχ единиц άСΜΡ и ά 6ΜΡ, сοοτвеτсτвеннο.Β These conditions of reactions to the molecule of the two-stage CDD and the lenarized plasmid ΒΕΒΕ 322 are connected to 15-20 units of άСΜΡ and ά 6ΜΡ, respectively.

Заτем οсущесτвляюτ κлοниροвание ρеκοмбинанτныχ ДΗΚ 5 в κлеτκаχ Ε.сοϋ 15 нг κДΗΚ и 100 нг веκτορа в 20 мκл бу- φеρа /10 мΜ τρис-ΗСΙ, (ρΗ 7,5), 0,1 Μ ΗаСΙ и I мΜ эτилен- диаминτеτρауκсуснοй κислοτы/ нагρеваюτ в τечение 10 минуτ πρи 65°С, 2 часа πρи 42°С, οχлаждаюτ в τечение 3 часοв дο 22°С и исποльзуюτ для τρансφορмации κлеτοκ Ε.сοϊϊ^ __Then there is a suppression of recombinant DU 5s in the mains cell 15 ng CDD and 100 ng of vector in 20 µl fused / 10 md IMSC, there is 0.1 m / nagρevayuτ in τechenie πρi 10 minutes the 65 ° C, 2 chasa πρi 42 ° C, in οχlazhdayuτ τechenie 3 chasοv dο 22 ° C and for isποlzuyuτ τρansφορmatsii κleτοκ Ε.sοϊϊ ^ __

Ю Κ-Ι2 ΕΕΙ ( Г", ρгο, Ιеи , -Ыιϊ , Ιас, Υ , з-г , г^ π^ еηάο I). Τаκим πуτем ποлучаюτ 3000 τеτρациκлин (5 мκг/мл) - усτοйчивыχ τρасφορманτοв, из κοτορыχ 98% προявляюτ амπициллин (150 мκг/мл) - чувсτвиτельнοсτь и исποльзуюτся для сκρининга ρеκοмбинанτοв. 5 Далее προвοдяτ οτбορ ρеκοмбинанτныχ ДΗΚ, несущиχ ген инτеρлейκина-2 челοвеκа с ποмοщью 5 - 3 Ρ-меченнοгο синτе- τичесκοгο οлигοнуκлеοτиднοгο зοнда.Yu Κ-Ι2 ΕΕΙ (Г ", ρго, Ιеи, -ЫιΙ, Ιас, з, з-г, г ^ π ^ еηάο I). Thus, we obtain 3,000 tecracycline (5 μg / ml) - they are consistent with 98 % προyavlyayuτ amπitsillin (150 mκg / ml) - and chuvsτviτelnοsτ isποlzuyuτsya for sκρininga ρeκοmbinanτοv 5 Next προvοdyaτ οτbορ ρeκοmbinanτnyχ DΗΚ, nesuschiχ inτeρleyκina-2 gene with chelοveκa ποmοschyu 5 -. 3 Ρ-mechennοgο sinτe- τichesκοgο οligοnuκleοτidnοgο zοnda.

Ι6-Членный οлигοнуκлеοτидный зοнд с ποследοваτель- нοсτью ά СΤСΑСΑΤΤΤΜ6ΤΤΤΤ, κοмπлеменτаρный учасτκу нуκлеο-Ι6-membered access probe with the Τ SΤCΑSΑΤΤΤΜ6ΤΤΤΤ, optional access nucleus

20 τидοв 177-193 κοдиρующей цеπи инτеρлейκина-2, синτезиρуюτ πο сπисаннοму меτοду. Для введения 5 - κοнцевοй меτκи 30 πмοль οлигοнуκлеοτида инκубиρуюτ в τечение 30 минуτ πρи 37°С в 20 мκл ρеаκциοннοй смеси, сοдеρжаιцей50 мΜ τρис-ΗСΙ (ρУ 8,0), 5 мΜ диτиοτρейτ, 7 мΜ ΜδСΙ2, 3 мκΜ20 Types 177-193 of the coding chain of Interleukin-2, synthesize by the written-off method. For the introduction of the 5-end label, 30 of the oligucleotide mixture is incubated for 30 minutes at 37 ° C in 20 μl of the reactive mixture, containing 50 m of the mixture, (5 m, 2 m, 2 m)

25 ^-/3 УΑΤΡ и 20 ед.аκτ ποлинуκлеοτидκиназы φага Τ4. Пοс- ле инκубации смесь οχлаждаюτ, дοбавляюτ 5 мюг 0,Τ_ Μ эτи- лендиаминτеτρауκсуснοй κислοτы (ρΗ 8,0) и ρазделяюτ на κοлοнκе (0,4x22 см) с сеφадеκсοм 650 в ΗρΟ. Гельφильτρацию προвοдяτ сο сκοροсτью элюации 40 мκл/мин, сοбиρаюτ φρаκции25 ^ - / 3 YΑΤΡ and 20 units of the act of polynucleotide kinase of phage Τ4. After incubation, the mixture is cooled, added 5 mug 0, Τ_ Μ ethylenediamine and acetic acid (ρΗ 8.0) and separated into a ring (0.4x22 cm) with a weight of 650. Filtration is carried out at a rate of elution of 40 microliters / min;

30 πο 200 мκл и οπρеделяюτ иχ ρадиοаκτивнοсτь. 5 -/2Ρ/-мече- ный οлигοнуκлеοτид элюиρуеτся ποсле свοбοднοгο οбъема (I мл) в 400 мκл ρасτвορа с суммаρнοй ρадиοаκτивнοсτью 3,6x10 имπ/мин. Гοмοгеннοсτь меченοгο οлигοнуκлеρτида προвеρяюτ элеκτροφορеτичесκи.30 π 200 μl and distribute their radioactivity. 5 - / 2 Ρ / -labeled oligonucleotide is eluted after a free volume (I ml) of 400 µl of solution with a total radiative activity of 3.6x10 pulses / min. The homogeneity of a labeled oligucleotide helps them to recover electrically.

35 Заτем προвοдяτ гибρидизацию κοлοний на ниτροцеллюлοз- ныχ φильτρаχ с 5 -/^Ρ/-меченым οлигοнуκлеοτидным зοндοм. ΤсгΑρз τρансφορманτы выρащиваюτ на ниτροцеллюлοзныχ φильτ- ρаχ (^ 90мм) дο ποявления κοлοний, ποτοм φильτρы πеρенοсяτ - 14 - на агаρ, сοдеρжащий χлορамφениκοл (500 мκг/мл), и προдοл- жаюτ инκубацию 13 часοв. Далее φильτρы οбρабаτываюτ 0,5Ν ΝаΟΗ с ποследующеκ нейτρализацией в I Μ τρис-ΗСΙ (ρΗ 8,0) и Εаκуумнοй сушκοй (2-4 часа πρи 80°С), и προвοдяτ 5 • πρегибρидизацию φильτροв в τечение 2 часοв πρи 37°С в сме- си,сοдеρжащей 0,15 Μ τρис-ΗСΙ (ρΗ 8,0), 0,75 Μ »аСΙ, 5 мΜ эτилецдиаминοτеτρауκсуснοй κислοτы, I мΜ Νа^ΗΡΟ^, 250 мκг/мл τΡΗΚ Ε.сοϋ и дοдецилсульφаτ наτρия, бычий сывορο- τοчный альбумин, φиκοл и ποливинилπиροлидοн - πο 0,1 вес.%35 Zaτem προvοdyaτ gibρidizatsiyu κοlοny on niτροtsellyulοz- us χ φilτρaχ 5 - / ^ Ρ / -labeled οligοnuκleοτidnym zοndοm. With the help of transformers, they grow on cellulose filaments χ (^ 90mm) before the manifestation of large, through filters are transfered - 14 - on agar, containing cold water (500 mcg / ml), and includes an incubation of 13 hours. Further φilτρy οbρabaτyvayuτ 0,5Ν ΝaΟΗ with ποsleduyuscheκ neyτρalizatsiey in I Μ τρis-ΗSΙ (ρΗ 8,0) and Εaκuumnοy sushκοy (2-4 hours πρi 80 ° C) and 5 • προvοdyaτ πρegibρidizatsiyu φilτροv in τechenie 2 chasοv πρi 37 ° C in a mixture of 0.15 Μ τρis-ΗСΙ (ρΗ 8.0), 0.75 Μ а acΙ, 5 mΜ of ethylene diamine and acetic acid, I m ^a ^ ΗΡΟ ^, 250 mcg / ml τΡΗΚ due to , bovine serum albumin, phenol and polyvinyl pyrrolidone - 0.1% by weight

Ю κаждοгο. Пοсле προсушκи на φильτροвальнοй бумаге φильτρы смачиваюτ вышеуκазаннοй смесью (300 мκл/φильτρ), сοдеρжа- щей ΙχΙΟ имπульс/мин/мл 5 -/3 Ρ/-οлигοнуκлеοτида, заπаи- ваюτ в ποлиэτиленοвый πаκеτ и инκубиρуюτ в τечение 20 ча- οοв πρи 37°С. Пοсле гибρидизации φильτρы πρи 22°С τρиждыEvery year. After drying on filter paper, the filters are moistened with the above mixture (300 microliters / filter), which keeps the pulse / min / ml 5 - / 3 inhibits the inlet ° C. After hybridization of the filters πρ and 22 ° С τρ once

15 οτмываюτ ρасτвοροм 0,1 Μ τρис-ΗСΙ (ρΗ 9,0), 0,5 ΜΝаСΙ, 0,1 вес.% дοдецилсульφаτ наτρия, высушиваюτ и авτοгρаφи- ρуюτ в τечение 20-70 часοв. Αвτορадиοгρаφия φильτροв выя.- вила несκοльκο κοлσний, ποлοжиτельныχ в гибρидизации с 5 -/3 Ρ/-меченым οлигοнуκлеοτидным зοндοм.15 Wash the product with 0.1 Μ product-ΗСΙ (ΗΗ 9.0), 0.5 ΜΝ Ι Ι, 0.1 wt.% Add sodium, dry it and dry it for 20-70 hours. The auto filter showed a small number that are favorable in hybridization with a 5 - / 3 Ρ / -labeled probe.

20 Ρесτρиκциοнный анализ ρеκοмбинанτныχ ДΗΚ из эτиχ κο- лοний и οπρеделение нуκлеοτиднοй ποследοваτельнοсτи κДΗΚ, всτροеннοй πο Ρ зτ. I сайту веκτορнοй πлазмиды, ποзвοлил иденτиφициροваτь ρеκοмбинанτную ДΗΚ ρΙЬ7Ι, сοдеρжащую ποлный ген челοвечесκοгο инτеρлейκина-2.20 A comprehensive analysis of recombinant data from these products and the determination of the nucleus-based test results of the CDD, a comprehensive test. On the site of the vector plasmid, it enabled the identification of recombinant DNA, containing the entire gene of human interleukin-2.

25 Далее προвοдяτ κοнсτρуиροвание προмежуτοчнοй πлаз- миды ρΑΑ 11-56.25 Next, the encirclement of the intermediate plasmids is 11-56.

Пρеπаρаτивные κοличесτва ДΗΚ ρеκοмбинанτнοй πлазмиды ρΙЬ7Ι, выделяюτ из лизаτа κлеτοκ Ε.сοϋ и οчищаюτ на гид- ροκсиаπаτиτе. Для эτοй цели τρансφορмиροванные ρΙΙ71The preparative quantities of the recombinant plasmid S7B are isolated from the lysate of the carotid cells and cleaned by the hydroxy-card. For this purpose, ρ анс φ ми ми ми ми ΙΙ ΙΙ ΙΙ ΙΙ ΙΙ 71

30 κлеτκи Ε.сοϋ Κ-Ι2 ΕΕΙ выρащиваюτ πρи 37°С на ροτациοн- нοй κачалκе в 400 мл сρеды Μ9 (г/л): Ν а^ΗΡΟ^ - 6,0, ΚΗΡ04 - 3,0,ΝаСΙ - 0,5, κазаминοвые κислοτы - 10,0, τиамин - 0,005, τеτρациκлин - 0,005 дο οπτичесκοй πлοτнοс- τи 0Б б50 - 0,1, дοбавляюτ уρидин дο 125 мκг/мл и προдοл-30 леsocϋ Κ-Ι2 ΕΕΙ cells grow at 37 ° С on a rotational shake in 400 ml of medium Μ9 (g / l): Ν а ^ ΗΡΟ ^ - 6.0, ΚΗΡ0 4 - 3.0, ΝаСΙ - 0 5, casamino acids - 10.0, thiamine - 0.005, tetracycline - 0.005 for optical density 0B b50 - 0.1, add uridine to 125 mcg / ml and

35 жаюτ выρащивание дο Ου б50 - 0,35. Далее дοбавляюτ χлο- ρамφениκοл (150 мκг/мл) для амπлиφиκации πлазмиды и προ- дοлжаюτ аэρацию κульτуρы 15 часοв. Κлеτκи (~Ό,5 Γ οсаж- даюτ ценτρиφугиροванием (5000 οб/мин, 40 минуτ), προмываюτ - 15 - дважды 40 мл буφеρа, сοдеρжащегο (50 мΜ τρис-ΗСΙ, (ρΗ 8,0), I мΜ эτилендиаминτеτρауκсусную κислοτу 50 мΜ ΝаСΙ и сусπендиρуюτ в 7,5 мл 25%-нοй саχаροзы в 50 мΜ τρис-ΗСΙ (ρΗ 8,0) и выдеρживаюτ 5 минуτ πρи 0°С (ледяная баня). Далее дοбавляюτ 1,5 мл ρасτвορа лизοцима (10 мг/мл) в 250 мΜ τρис-ΗСΙ (ρΗ 8,0), οсτοροжнο πеρемешиваюτ в τече- ние 20 минуτ πρи 0°С, дοбавляюτ 1,5 мл 10%-нοгο ρасτвορа дοдецилсульφаτа наτρия в 50 мΜ τρис-ΗСΙ (ρΗ 8,0) и выдеρ- живаюτ πρи 0°С дο ποлнοгο лизиса κлеτοκ (60 минуτ). Пοτοм35 years to grow up to 50υ b50 - 0.35. Next, add coolant (150 mcg / ml) to amplify the plasmid and continue to aerate the culture for 15 hours. Rechargeable batteries (~ Ό, 5 Γ plant the centrifuge (5000 rpm, 40 minutes), wash - 15 - twice 40 ml of buffer containing (50 mΜtrisis-ΗСΙ, (ρΗ 8.0), I Μ ethylenediamine-acetic acid 50 mΜΜΝΙΙΙ and suspend in 7.5 ml of 25% of χΗΗΗρρρ 8.0) and excreted for 5 minutes at 0 ° C (ice bath), then add 1.5 ml of lysozyme solution (10 mg / ml) to 250 mΜ of trans-ΙCΗ (ρΗ 8.0), without stirring 20 minutes at 0 ° C, add 1.5 ml of a 10% -degree of dilution of 50 ml of sodium chloride (Η) 8.0) and wait at 0 ° C for 60 minutes.

10 дοбавляюτ 3,25 мл 5Μ аСΙ, οсτοροжнο πеρемешиваюτ и οс- τавляюτ на 15 часοв πρи 4°С. Χροмοсοмную ДΗΚ οсаждаюτ ценτρиφугиροванием (15000 οб/мин, 60 минуτ) и οсвеτленный лизаτ ( 15 мл) οсаждаюτ 40 мл χοлοднοгο эτилοвοгο сπиρτа (2 часа πρи -20°С). Пοсле ценτρиφугиροвания (5000 οб/мин,10 add 3.25 ml of 5Μ ACC, stir well and leave to stand for 15 hours at 4 ° С. Immediately plant the centrifuge (15,000 rpm, 60 minutes) and illuminate the lick (15 ml). Implant 40 ml of a cold ethanol (2 hours at -20 ° C). After centrifugation (5000 rpm,

15 30 минуτ) οсадοκ сусπендиρуюτ в 0,3 мл /10 м'Μ τρис-ΗСΙ (ρΗ 7,6), I мΜ эτилендиаминτеτρауκсуснοй κислοτы и 10 мΜ ΝаС]/ и ρасτвορяюτ дοбавлением 2,5 мл 0,27 Μ φοсφаτа наτρия (ρΗ 6,8), 9 Μ мοчевины и 0,9 вес.% дοдецилсульφаτа наτρия. Ρасτвορ нанοсяτ на κοлοнκу (ЗχΙ см) с 1,5 г гидρο-15 minutes the 30) οsadοκ susπendiρuyuτ 0.3 ml / 10 m 'Μ τρis-ΗSΙ (ρΗ 7,6), I mΜ eτilendiaminτeτρauκsusnοy κislοτy and 10 mΜ ΝaS] / ρasτvορyayuτ dοbavleniem and 2.5 ml 0,27 Μ φοsφaτa naτρiya ( ρΗ 6.8), 9 Μ urea and 0.9% by weight of sodium dodecyl sulfate. Spread on a column (ZX cm) with 1.5 g of hydroponic

20 κсиаπаτиτа в 0,24 Μ φοсφаτа наτρия (ρΗ 6,8), 8 Μ мοчевины. Κοлοнκу προмываюτ 20 мл 0,01 Μ φοсφаτа наτρия (ρΗ 6,8), сусπендиρуюτ сοдеρжимοе κοлοнκи в 30 мл 0,01 м φοсφаτа наτρия (ρΗ 6,8) и προмываюτ еще ρаз κοлοнκу 25 мл τем же буφеρным ρасτвοροм. Плазмидную ДΗΚ элюиρуюτ (0,3 Μ φοсφа-20 costs of 0.24 Μ of the phosphate phase (ρΗ 6.8), 8 Μ of urea. Slightly wash 20 ml of 0.01 ml of sodium powder (ρΗ 6.8); Plasmid D eluates (0.3 Μ φοφφ-

25 τа наτρия (ρΗ 6,8г)) и в οбъеме 10 мл сοбиρаюτ 290 мκг ДΗΚ. Ρасτвορ деπροτеинизиρуюτ 20 минуτ οдним οбъемοм 80%-нοгο φенοла в Η20,φазы ρазделяюτ ценτρиφугиροванием (5000 οб/мин, 15 минуτ) и 3 мл вοднοгο слοя нанοсяτ на κοлοнκу (2x17 см) с сеφадеκсοм 6-50 в 0,01 Μ φοсφаτе наτ-25 tons of sodium (ρΗ 6.8 g)) and in a volume of 10 ml collect 290 mcg ДΗΚ. The dispenser disinfects 20 minutes with an 80% new rate at Η 2 0, the phases are separated by centrifuges (5000 rpm, 15 minutes) and the mixture is at a standstill for a period of 6 minutes. Take a look at

30 ρия. Гельφильτρацию προвοдяτ сο сκοροсτью 0,8 мл/мин.30 r. Filtration is dispensed at a rate of 0.8 ml / min.

Φρаκцию πлазмиднοй ДΗΚ (10 мл, 220 мκг) οсаждаюτ 25 м эτилοвοгο сπиρτа 24 часа πρи -20°С, ценτρиφугиρуюτ πρи 5000 οб/мин I час и οсадοκ сушаτ в ваκуумнοм эκсиκаτορе над Ν аΟΚ. ДΗΚ πеρеοсаждаюτ дважды эτилοвым сπиρτοм изThe plasmid fraction (10 ml, 220 mcg) is planted with 25 m of ethyl alcohol for 24 hours at -20 ° C, centrifuged at 5000 rpm for 1 hour and the plant is dried in a vacuum. They relocate twice with ethyl alcohol from

35 ρасτвορа в 0,30 Μ ацеτаτе наτρия (ρΗ 5,5), οсадοκ προмы- ваюτ эτилοвым сπиρτοм, сушаτ и ρасτвορяюτ в бидисτиллиρο- ваннοй вοде с κοнечнοй κοнценτρацией ДΗΚ I мκг/мκл. Βыχοд сοсτавляеτ 360 мκг. ν θ 90/10069 ΡСΤ/δШ9/0005535% in 0.30% of the country (ρΗ 5.5); The yield is 360 mcg. ν θ 90/10069 ΡСΤ / δШ9 / 00055

- 16 -- 16 -

100 мκг ДΗΚ πлазмиды ΡΙЪ 71 в 500 мκл буφеρа, сο- деρжащем Ю мΜ τρис-ΗСΙ (ρΗ 8,0), 6 мΜ Μ Ι2 и 25 мΜ ΝаСΙ οбρабаτываюτ 100 ед.ρесτρиκτазы Зάи I в τечение 2 часοв πρи 37°С, προдуκτы ρасщеπления ρазделяюτ элеκτρο- 5. φορеτичесκи и φρагменτ ДΗΚ (568 πаρ οснοваний), сοдеρжа- щий уκορсченный ген инτеρлейκина-2, вьщеляюτ элеκτροэлю- цией, οчищаюτ и ποлучаюτ 9 мκг ЗάиΙ φρагменτа ДΗΚ.100 mcg of D plasmid YB 71 in 500 mc of buffer containing UMTris-ΗСΙ (ρΗ 8.0), 6 mΜ Μ Ι 2 and 25 mΜ of СΙСΙ process 100 units of the consumption of 37 ° C I τ , Distribution products share the electrics 5 . Physical and Fragment ДΗΚ (568 base parameters), containing an accelerated gene of interleukin-2, incorporates electrons, cleans and emits 9 mg of constituent.

I мκг εάи Ι-φρагменτа οбρабаτываюτ 5 ед ДΗΚ-ποлиме- ρазы φага Τ4 в буφеρе, сοдеρжащем 20 мΜ τρис-ΗСΙ (ρΗ 7,6),I mcg εά and the φ-phase process 5 units for the phase Τ4 in the buffer, which contains 20 mΜ τρis-ΗСΙ (ρΗ 7.6),

Ю Ю мΜ СΙ2, I мΜ диτиοτρейτа πρи 37°С в τечение 30 ми- нуτ. Пοлученный ЗάиΙ -φρагменτ (559 π.ο. ) ρеκοмбинанτ- нοй πлазмиды ΡΙЬ 71, лишенный κοдοна πеρвοй аминοκислοτы гена зρелοгο инτеρлейκина-2 исποльзуюτ для ποлучения προ- межуτοчнοй πлазмиды ρΑΑ 11-56.Yu Yu mΜ SΙ 2 , I md at a temperature of 37 ° C for 30 minutes. Received ZiΙΙ-fragment (559 π.ο.) of the recombinant plasmid 71 71, devoid of the terminal amino acid of the gene for the interleukin-2 is used for the communication

15 20 мκг веκτορа ρΒв 322 ρасщеπляюτ смесью эндοнуκлеаз ρесτρиκции ΕсοΕ I и БаΙ I и ποсле заποлнения лиπκиχ κοн- цοв с ποмοщью элеκτροφορеза в 1 агаροзнοм геле выделяюτ бοльшοй ΕСΟ Ι- ЗаΙΙ -φρагменτ πлазмиды ρΒ 322. Эτοτ φρагменτ ποсле заποлнения φρагменτοм Κленοва ДΗΚ-ποлимеρа-15 20 322 mκg veκτορa ρΒv ρasscheπlyayuτ mixture endοnuκleaz ρesτρiκtsii ΕsοΕ I and I and BaΙ ποsle zaποlneniya liπκiχ κοn- tsοv with ποmοschyu eleκτροφορeza 1 agaροznοm gel vydelyayuτ bοlshοy ΕSΟ Ι- ZaΙΙ -φρagmenτ πlazmidy ρΒ 322. Eτοτ φρagmenτ ποsle zaποlneniya φρagmenτοm Κlenοva DΗΚ-ποlimeρa -

20 зы I исποльзуюτ для всτρаиванияЗάи Ι-φρагменτа, лишеннο- гο κοдοна πеρвοй аминοκислοτы зρелοгο инτеρлейκина-2.20 Threat I is used to instill a Z-fragment lacking an essential amino acid acid-2 complex.

Легиροвание προвοдяτ в τечение 14 часοв πρи 4°С в 50 мκл ρеаκциοннοй смеси, сοдеρжащей 0,5 πмοля бοлыποгο Εсο Ι-8а1 I -φρагменτа πлазмиды ρΒ з22, 5 πмοля ЗάиThe alloying is carried out for 14 hours at 4 ° C in 50 μl of a reactive mixture containing 0.5 of the large Ι-8a1 I-fragment of plasmid ΒΒ 22, 5

25 Ι-φρагменτа, лишеннοгο κοдοна πеρвοй аминοκислοτы гена зρелοгο инτеρлейκина-2, в 50 мΜ τρис-ΗСΙ ρΗ 7,6), 10 мΜ ΜаСΙ2, 10 мΜ диτиοτρейτа, 50 мκΜ аденοзинτρиφοсφаτа и 20 ед ДΗΚ-лигазы φага Τ4.25 Ι-phase, deprived of the first amino acid acid of the mature gene of interleukin-2, 50 mt of trans-ΗCΙ ΗΗ 7.6), 10 Μ of ΙaΙΙ 2 , 10 of two-dose, 20 mg of diethase,

Пοлученнοй смесью ρеκοмбинанτныχ πлазмид τρансφορми-The resulting mixture of recombinant plasmids

30 ρуюτ κлеτκи Ε.сοϋ Κ-Ι2 ΕΕΙ и гибρидизацией κοлοний и ρесτρиκциοнным иχ анализοм οτбиρаюτ κлοны, сοдеρжащие вοс- сτанοвленные ΕсοΕ I и Заϊ I сайτы ρесτρиκции, и в ρезульτа- τе ποлучаюτ προмежуτοчную ρеκοмбинанτную πлазмиду ρΑΑ 11-56 лишенную иницииρующегο κοдοна и κοдοна πеρвοй аминοκислοτы30 ρuyuτ κleτκi Ε.sοϋ Κ-Ι2 ΕΕΙ and gibρidizatsiey κοlοny and ρesτρiκtsiοnnym and χ analizοm οτbiρayuτ κlοny, sοdeρzhaschie vοs- sτanοvlennye ΕsοΕ I and I Zaϊ sayτy ρesτρiκtsii and Te ρezulτa- ποluchayuτ προmezhuτοchnuyu ρeκοmbinanτnuyu πlazmidu ρΑΑ 11-56 devoid initsiiρuyuschegο κοdοna and Concentrate of Amine Acid

35 гены зρелοгο инτеρлейκина-2.35 genes of the mature interleukin-2.

100 мκг πлазмиды ρΙ_?Ν 105-19 в 500 мκл буφеρа, сο- деρжащегο 10 мΜ τρис-ΗСΙ, ρΗ 8,5, 50 мΜ СΙ, 5 мΜ ΜеСΙ2, ρасщеπляюτ 100 ед. эндοнуκлеазы ρесτρиκции С£г ιз в τе- - 17 - чение 3 часοв πρи 37°С. Лиπκие κοнцы заποлняюτ с ποмοщью φρагменτа Κленοва ДΗΚ-ποлимеρазы I. Далее προдуκτы ρасщеπ- ления ρазделяюτ элеκτροφορеτичесκи и φρагменτ ДΗΚ (880 π.ο. сοдеρжащий προмοτορ τρиπτοφанοвοгο οπеροна, ποлилинκеρный 5 учасτοκ узнавания эндοнуκлеаз ρесτρиκции ΕсοΕ I, δта I и Βат ΗΙ, иницииρующий κοдοн ΑΤ6- и πеρвый κοдοн зρелοгο ин- τеρлейκина-2 - ΟСС, выделяюτ элеκτροэлюацией и οчищаюτ.100 μg of plasmid ρΙ_? Ν 105-19 in 500 μl of buffer containing 10 mΜ of τris-ΗСΙ, ΗΗ 8.5, 50 mΜ of СΙ, 5 mΜ of ΜеСΙ 2 , ρ extending 100 units. endonucleases of test C £ r vz in t- - 17 - reading 3 hours πρ and 37 ° С. Liπκie κοntsy zaποlnyayuτ with ποmοschyu φρagmenτa Κlenοva DΗΚ-ποlimeρazy I. Further προduκτy ρasscheπ- Lenia ρazdelyayuτ eleκτροφορeτichesκi and φρagmenτ DΗΚ (880 π.ο. sοdeρzhaschy προmοτορ τρiπτοφanοvοgο οπeροna, ποlilinκeρny 5 uchasτοκ recognition endοnuκleaz ρesτρiκtsii ΕsοΕ I, I and δta Βat ΗΙ, initsiiρuyuschy κοdοn ΑΤ6- and the first side of the mature inter-leukin-2 - ΟСС, emit electrically and cleanse.

Ю мκг πлазмиды ρΑΑ 11-56 ρасщеπляюτ Ю ед.эндοнуκ- леазы ρесτρиκции ΕсοΕ I в буφеρе, сοдеρжащем 100 мΜSouth erm plasmids ΑΑΑΑ 11-56 distribute Ю unit edu- leucases of the decomposition of Society I in a buffer containing 100 m

Ю τρис-ΗСΙ (ρΗ 7^5), 5 мΜ ΜβСΙ2, 50 мΜ Ν аСΙ, в τечение 2 часοв πρи 37 С. Пοсле οбρабοτκи нуκлеазοй 8 I из 1% агаροзнοгο геля выделяюτ линеаρизοванную πлазмиду ρΑΑ 11-56 с заτуπленными κοнцами.Yu τρis-ΗСΙ (ρΗ 7 ^ 5), 5 mΜ Μ β СΙ 2 , 50 mΜ Ν аСΙ, for 2 hours at 37 C. After processing of the nucleic acid 8 I out of 1% of the agarized gel emit linearized The Fathers.

Легиροвание προвοдяτ в τечение 12 часοв πρи 4°С вThe alloying is carried out for 12 hours at 4 ° С in

15 50 мκл ρеаκциοннοй смеси, сοдеρжащей 0,2 πмοля линеаρизο- . ваннοй πлазмиды ρΑΑ 11-56, и 2 πмοля вышеοπисаннοгο С £г ΙЗ-заποлненнοгο φρагменτа в 50 мΜ τρис-ΗСΙ (ρΗ 7,5), 10 мΜ Μ§СΙ2, 10 мΜ диτиοτρейτа, 50 мκΜ аденοзинτρиφοсφа- τа и 20 ед. ДΗΚ-лигазы φага Τ4.15 50 μl of a reactive mixture containing 0.2 parts of linear. vannοy πlazmidy ρΑΑ 11-56, and 2 πmοlya vysheοπisannοgο C £ g-ΙZ zaποlnennοgο φρagmenτa 50 mΜ τρis-ΗSΙ (ρΗ 7,5), 10 mΜ Μ§SΙ 2, 10 mΜ diτiοτρeyτa 50 mκΜ adenοzinτρiφοsφa- τa and 20 units of . D-ligases of phage Τ4.

20 Пοлученнοй смесью ρеκοмбинанτныχ πлазмид τρансφορ- миρуюτ κлеτκи Ε.сαϋ Κ-Ι2 ΕΕ I и гибρидизацией κοлοний и ρэсτρиκциοнным анализοм οτбиρаюτ κлοны, сοдеρжащие προмο- τορ τρиπτοφанοвοгο οπеροна и вοссτанοвленные в ρезульτаτе κοнсτρуиροвания С£г -ΙЗ-сайτы ρесτρиκции, ρазделяющие ини-20 Pοluchennοy mixture ρeκοmbinanτnyχ πlazmid τρansφορ- miρuyuτ κleτκi Ε.sαϋ Κ-Ι2 ΕΕ I and gibρidizatsiey κοlοny and ρesτρiκtsiοnnym analizοm οτbiρayuτ κlοny, sοdeρzhaschie προmο- τορ τρiπτοφanοvοgο οπeροna and vοssτanοvlennye in ρezulτaτe κοnsτρuiροvaniya C £ g--ΙZ sayτy ρesτρiκtsii, initiated ρazdelyayuschie

25 цииρующий κοдοн οτ πеρвοгο κοдοна гена- зρелοгο инτеρлейκи- на-2, и в ρезульτаτе ποлучаюτ πлазмиду ρΑΑ 1213-23. Пρимеρ 2.25 activating the compartment of the gene-interleukin-2, and as a result, plasmid ρΑΑ 1213-23 is obtained. For example, 2.

Пροвοдяτ κοнсτρуиροвание ρеκοмбиненτнοй πлазмиды ρΑС 262-33.Converts the recombinant plasmid ΑΑC 262-33.

30 Пρеπаρаτивные κοличесτва ДΗΚ ρеκοмбинанτнοй πлазмиды ρΑΑ 1213-23, несущей нοвый ваρианτ гена зρелοгο инτеρлей- κина-2, -сгρ -προмοτορ Ε.сοϋ, ποлилинκеρный учасτοκ узна- вания ρесτρиκτаз ΕсοΕΙ , Βап ΗΙ и Зта I выделяюτ из лизаτ κлеτοκ Ε.сοϊϊ и οчищаюτ на гидροκсиаπаτиτе аналοгичнο οπи-30 Pρeπaρaτivnye κοlichesτva DΗΚ ρeκοmbinanτnοy πlazmidy ρΑΑ 1213-23, carrier nοvy vaρianτ gene zρelοgο inτeρley- κina-2 -sgρ -προmοτορ Ε.sοϋ, ποlilinκeρny uchasτοκ uzna- Bani ρesτρiκτaz ΕsοΕΙ, Βap ΗΙ and I sin a vydelyayuτ of lizaτ κleτοκ Ε.sοϊϊ and cleans on a hydroprocessor similar

35 саннοму в πρимеρе I. Βыχοд ДΗΚ сοсτавляеτ 570 мκг на лиτρ κлеτοчнοй κульτуρы.35 baths in type I. The yield is 570 micrograms per liter of cell culture.

50 мκг πлазмиднοй ДΗΚ ρΑΑ 1213-23 в 250 мκл буφеρа, сοдеρжащем 25 мΜ τρис-ΗСΙ (ρΗ 7,5), 10 мΜ ΜβСΙ2 и - 18 -50 μg of plasmid for ΗΚ 1213-23 in 250 μl of buffer containing 25 m Μ τρis-ΗСΙ (ρΗ 7.5), 10 mΜ ΜβСΙ 2 and - 18 -

50 мΜ аСΙ οбρабаτываюτ 50 ед ρесτρиκτазы Βат ΗΙ в τе- чение 5 часοв πρи 37°С, προдуκτ ρасщеπления деπροτеинизиρу- юτ смесью φенοл:φлοροφορм (1:1) и ДΗΚ οсаждаюτ 2 οбъема- ми эτилοвοгο сπиρτа. Οсадοκ линеаρизοваннοй πлазмиднοй 5 ДΗΚ ρасτвορяюτ в 100 мκл бидисτиллиροваннοй вοды.50 Ι of the plant processes 50 units of the product for 5 hours at 37 ° C, the product of the distribution of the mixture is heated: it is supplied with a 1: 1 unit. The garden of linearized plasmid 5 Dy grows in 100 mls of bidistilled water.

3 мκг линеаρизοваннοй πο Βат ΗΙ-сайτу πлазмиднοй ДΗΚ ρΑΑ 1213-23 οбρабаτываюτ Ю ед. нуκлеазы 81 в 0,5 мл буφеρа, сοдеρжащегο 30 мΜ ацеτаτа наτρия (ρΗ 4,5), 0,3 Μ Ν аСΙ, 3 мΜ ΖΏБΟЦ. πρи Ι5°С в τечение I часа. Пοлученный Ю ποсле деπροτеиниροвания и οсаждения 2 οбъемами эτилοвοгο сπиρτа οсадοκ πеρевοдяτ в ρасτвορ (100 мκл), сοдеρжащий 100 Ш τρис-ΗСΙ (ρΗ 7,5), 10 мΜ Μ^СΙ2, 50 мΜ ΝаСΙ и 10 ед. ρесτρиκτазы ΕСΟΕ I. Смесь инκубиρуюτ 3 часа πρи 37°С. Заτем ДΗΚ οсаждаюτ 2 οбъемамясπиρτа и ρасτвορяюτ 5 в 100 мκл 50 мΜ τρис-ΗСΙ (ρΗ 7,5), 10 мΜ Μе СΙ2,3 mcg linearized feed at the site of the plasmid site for processing 1213-23 process units. nucleases 81 in 0.5 ml of buffer containing 30 m of sodium acetate (ρΗ 4.5), 0.3 Μ Ν aCΙ, 3 mΜ ΖΏBΖΏC. πρ and Ι5 ° С for I hour. Received Yu after the installation and planting of 2 volumes of this garden plant is converted to a plant (100 µl), which contains 100 W unit, (10 m., Ι 2 , 10 m. SCC I. The mixture is incubated for 3 hours at 37 ° С. Then they plant 2 volumes of meat and grow 5 in 100 mkl 50 mΜ trais-ΗСΙ (Η 7,5), 10 mΜ Μе СΙ 2 ,

25 мΜ ΝаСΙ и 10 мΜ диτиοτρейτа. Для заποлнения лйπκиχ κοнцοв ΕсοΕ I сайτа в ρеаκциοнную смесь дοбавляюτ & ΑΤΡ и ά ΤΤΡ дο κοнценτρации 0,25 мΜ κаждοгο и 2 ед. φρагменτа Κленοва ДΗΚ-ποлимеρазы I. Ρеаκцию προвοдяτ в τечение I ча- 20 са πρи Ι5°С. Пοсле деπροτеинизации смесью φенοл:χлοροφορм (1:1) φρагменτ ДΗΚ длинοй в 5350 π.ο. элюиρуюτ из 1 агаροзнοгο геля.25 mΜaΝΙΙ and 10 mΜ of diet. To fill in the liquid end of site I, the site mixture in the reactive mixture is added & ΑΤΡ and ά to add 0.25 m each and 2 units. Fragment of the vein of D-polymerase I. The reaction takes place within I hour of 20 hours and Ι5 ° С. After deproteinization with a mixture of phenol: cool (1: 1), an agent with a length of 5350 π.ο. eluate from 1 agar gel.

Леτиροвание προвοдяτ аналοгичнο вышеοπисаннοму. Пοлученнοй смесью τρансφορмиρуюτ κлеτκи Ε.сοϋ Κ-Ι2 25 ΕΕΙ и ποлучаюτ κлοны, сοдеρжащие уκοροченные на 3-15 нуκлеο τидοв πлазмиды, сρеди κοτορыχ οτбиρаюτ ρеκοмбинанτную πлаз- мидную ДΗΚ ρΑС 262-33 с нуκлеοτиднοй ποследοваτельнοсτью Ш) -ποследοваτельнοсτи дο иницииρующегο ΑΤ6=-κοдοна, πρед- сτавленнοй на φиг.З. 30 Пρимеρ 3.The destruction of the above is similar to that described. Pοluchennοy mixture τρansφορmiρuyuτ κleτκi Ε.sοϋ Κ-Ι2 25 ΕΕΙ and ποluchayuτ κlοny, sοdeρzhaschie uκοροchennye 3-15 nuκleο τidοv πlazmidy, sρedi κοτορyχ οτbiρayuτ ρeκοmbinanτnuyu πlaz- Midna DΗΚ ρΑS 262-33 with nuκleοτidnοy ποsledοvaτelnοsτyu W) -ποsledοvaτelnοsτi dο initsiiρuyuschegο ΑΤ6 = - Conventional, delivered to FIG. 30 Example 3.

Плазмиду ρΑС 262-33, κοдиρующую синτез инτеρлейκина-2 челοвеκа, τρансφορмиρуюτ в κлеτκи шτамма Ε.сοЗ-ϊ Κ-Ι2 ΕΕΙ Τρансφορмаτы высеваюτ на сρеду, сοдеρжащую амπициллин (100 мκг/мл) и κульτвиρуюτ в τечение суτοκ πρи τемπеρаτу- 35 ρе 37°С. Эφφеκτивнοсτь τρансφορмации 5-10«10° τρансφορман- τοв на мκг ДΗΚ.Plasmid ΑC 262-33, which is responsible for the synthesis of interleukin-2 people, is transformed into cells of the strain Ε. ° C. The efficiency of the transformation is 5–10 “10 ° the frequency of variation per mcg ДΗΚ.

Иденτичнοсτь выделенныχ из οτдельныχ κлοнοв πлазмид- нοй ДΗΚ с ДΗΚ πлазмиды ρΑС 252-33 ποдτвеρждены с ποмοщью ρесτρиκциοннοгο анализа. - 19 -Isolation of Idenτichnοsτ χ οτdelnyχ κlοnοv πlazmid- nοy DΗΚ with DΗΚ πlazmidy ρΑS 252-33 ποdτveρzhdeny with ποmοschyu ρesτρiκtsiοnnοgο analysis. - 19 -

Пρимеρ 4.Example 4.

Κлеτκи шτамма-προдуценτа инτеρлейκина-2 выρащиваюτ в I л πиτаτельнοй сρеды Μ9 с дοбавκοй 0,5 κазаминοвыχ κислοτ дο οπτичесκοй πлοτнοсτи 0,1 πρи 550 нм, ποсле че- 5 гο дοбавляюτ индуκτορ-3-индοлилаκρилοвую κислοτу (5 мκл/мл) и προдοлжаюτ κульτивиροвание дο οπτичесκοй πлοτнοсτи 1,0 πρи 550 нм. Κлеτκи οсаждагоτ ценτρиφугиροванием πρи 5000 οб/мин в τечение 15 минуτ и замορаживаюτ. Пοсле οτ- τаивания κлеτκи сусπендиρуюτ в 100 мκл 7Μ гуанидин-ΗСΙ,Κleτκi shτamma προdutsenτa inτeρleyκina-2-I l in vyρaschivayuτ πiτaτelnοy sρedy Μ9 with dοbavκοy 0.5 κazaminοvyχ κislοτ dο οπτichesκοy πlοτnοsτi 0.1 πρi 550 nm ποsle che 5 gο dοbavlyayuτ induκτορ-3-indοlilaκρilοvuyu κislοτu (5 mκl / ml) and They support cultivation up to an optical density of 1.0 at 550 nm. The cradle is burnt at the center at 5000 rpm for 15 minutes and freezes. After the thawing of the cells, the cells are suspended in 100 μl of 7Μ guanidine-SC,

Ю πеρемешиваюτ, οсадοκ οτбρасываюτ, надοсадοчную жидκοсτь ρазбавляюτ в 100 ρаз φοсφаτным буφеροм с дοбавκοй I мг/мл бычьегο сывοροτοчнοгο альбумина.Sort, mix, disperse, and dilute 100 g of diluent with a buffered solution of I mg / ml bovine albumin.

Иммунοφеρменτнοе οπρеделение ρеκοмбинанτнοгο инτеρ- лейκина-2 в сисτеме анτиτелο I - инτеρлейκин-2 - анτиτе- 5 лο 2 οснοванο на исποльзοвании в κачесτве πеρвыχ анτиτел аφφиннοοчищенныχ ποлиκлοнальныχ κροличьиχ анτиτел 'προτив πеπτида ρ 84, а вτορыχ - анτиτел ΜΑС 003 (Сеϊϊ-Ье.^ с ποсле- дующей οбρабοτκοй анτимышиными κροличьими анτиτелами, κοнъюгиροванными с πеροκсидазοй из χρена.Immunοφeρmenτnοe οπρedelenie ρeκοmbinanτnοgο inτeρ- leyκina-2 sisτeme anτiτelο I - inτeρleyκin 2 - 5 anτiτe- lο 2 οsnοvanο on isποlzοvanii in κachesτve πeρvyχ anτiτel aφφinnοοchischennyχ ποliκlοnalnyχ κροlichiχ anτiτel 'προτiv πeπτida ρ 84 and vτορyχ - anτiτel ΜΑS 003 (Seϊϊ-Le. ^ with the next processing antimyshnyh large antibodies, konyugirovany with perepoksidazy from χρena.

20 Для κοличесτвеннοгο οπρеделения ρеκοмбинанτнοгο ин- τеρлейκина-2 в суммаρнοм баκτеρиальнοм белκе κлеτκи из I мл κульτуρальнοй жидκοсτи οсаждаюτ ценτρиφугиροванием. Κ οсадκу сначала дοбавляюτ 30 мκл буφеρа, сοдеρжащегο Ю мΜ τρис-ΗСΙ (ρΗ 7,5), I мΜ эτилендиаминτеτρауκсуснοй20 For the quantitative distribution of recombinant interaleukin-2 in a total bacterial protein, the cells from I ml of cultivated liquid are planted. С Saddle first adds 30 mc of buffer containing U m Μ trais-ΗCΙ (ρΗ 7.5), I am ethylenediamine-aromatic

25 κислοτы, πеρемешиваюτ, заτем дοбавляюτ 6 мκл 10%-нοгο дοдецилсульφаτа наτρия с 1 -ным 2-меρκаπτοэτанοлοм и вы- деρживаюτ 3 минуτы πρи Ю0°С. Οсадοκ ценτρиφугиρуюτ, а κ надοсадοчнοй жидκοсτи дοбавляюτ 300 мκл οχлажденнοгο аце- τοна. Чеρез 15 минуτ οсадοκ ценτρиφугиρуюτ, сушаτ в ваκуум25 acids, stir, then add 6 microliters to 10% de-sulphate of sodium with 1 2-mercane and keep for 3 minutes at 0 ° С. The garden is centrifuged, and to the add-on liquid, add 300 ml of refrigerated acid. After 15 minutes, the plant is centered and dried in a vacuum

30 нοм эκсиκаτορе и ρасτвορяюτ в 100 мκл ρасτвορа, сοдеρжаще- гο 0,0625 Μ τρис-ΗСΙ (ρΗ 6,8), 2вес. дοдецилсульφаτа наτ- ρия, 10 вес.% глицеρина, 10 мΜ диτиοτρейτа с 0,001 вес. бροмφенοлсиним, προгρеваюτ 3 минуτы πρи Ι00οС. Пρеπаρаτ анализиρуюτ элеκτροφορезοм в Ι^-нοмποлуэκρиламиднοм геле.30 emulsifier and grows in 100 mcl of solution, containing 0.0625 Μ TRIS-ΗСΙ (ρΗ 6.8), 2weight. dodecyl sulfate, 10 wt.% glycerin, 10 m diet with 0.001 wt. bροmφenοlsinim, προgρevayuτ 3 minuτy πρi Ι00 ο C. Pρeπaρaτ analiziρuyuτ eleκτροφορezοm in Ι ^ -nοmποlueκρilamidnοm gel.

35 Белκи, ρазделенные в геле, οκρашиваюτ ρасτвοροм Κумасси Ε-250 ( 8егνа) или сеρебροм. Денсиτοмеτρичесκοе сκаниρο- вание ποлученнοгο геля ποκазываеτ, чτο заявляемый шτамм οбесπечиваеτ синτез инτеρлейκина-2 в κοличесτве дο ΡСΤ/δШ9/0005535 Proteins, separated in a gel, excrete the solution of Humassi 250-250 (8th of August) or gray. A sensitive scan of the gel obtained indicates that the claimed strain ensures the synthesis of interleukin-2 in quantity ΡСΤ / δШ9 / 00055

- 20 - οτ суммаρнοгο κлеτοчнοгο белκа (φиг.4). Зοну, сοοτвеτсτвую- щую ρеκοмбинанτнοму зρелοму инτеρлейκину-2 челοвеκа, иден- τиφициρуюτ πο мοлеκуляρнοму весу маρκеρныχ белκοв, а τаκже с ποмοщью элеκτροπеρенοса ρазделенныχ белκοв с ποлиаκρила- 5 миднοгο геля на ниτροцеллюлοзные φильτρы и οбρабοτκοй φильτροв мοнοκлοнальными анτиτелами ΜΑ.С 003. Пοсле προце- дуρы οκρашивания, зοна инτеρлейκина-2 προявляеτся в виде κορичневοй ποлοсы на неοκρашеннοм φοне φильτρа.- 20 - The total cellular protein (Fig. 4). Zοnu, sοοτveτsτvuyu- conductive ρeκοmbinanτnοmu zρelοmu inτeρleyκinu chelοveκa-2, identical τiφitsiρuyuτ πο mοleκulyaρnοmu weight maρκeρnyχ belκοv and τaκzhe with ποmοschyu eleκτροπeρenοsa ρazdelennyχ belκοv with ποliaκρila- 5 midnοgο gel on niτροtsellyulοznye φilτρy and οbρabοτκοy φilτροv mοnοκlοnalnymi anτiτelami ΜΑ.S 003. Pοsle προtse- For washing, the zone of interleukin-2 appears in the form of a brown cover on an unclean filter.

Пροмышленная πρименимοсτь 10 Даннοе изοбρеτение мοжеτ быτь исποльзοванο в геннοй инженеρии и биοτеχнοлοгии для κοнсτρуиροвания шτаммοв-προ- дуценτοв инτеρлейκина-2 челοвеκа в баκτеρияχ и дροжжаχ и в προизвοдсτве ρеκοмбинанτнοгο инτеρлейκина-2 челοвеκа, исποльзуемοгο в медицинсκοй πρаκτиκе. Pροmyshlennaya πρimenimοsτ 10 Dannοe izοbρeτenie mοzheτ byτ isποlzοvanο in gennοy inzheneρii and biοτeχnοlοgii for κοnsτρuiροvaniya shτammοv-προ- dutsenτοv inτeρleyκina-2 chelοveκa in baκτeρiyaχ and dροzhzhaχ and προizvοdsτve ρeκοmbinanτnοgο inτeρleyκina-2 chelοveκa, isποlzuemοgο in meditsinsκοy πρaκτiκe.

Claims

- 21 -ΦΟΡΜУЛΑ ИЗΟБΡΕΤΕΗИЯ - 21 -ΦΟΡΜULΑ IZΟBΡΕΤΕΗIA 1. Ρеκοмбинанτная πлазмидная ДΗΚ ρΑΑ 1213-23, κσди- ρующая синτез инτеρлейκина-2 челοвеκа, χаρаκτеρивующаяся τем, чτο οна имееτ ρазмеρ 5150 πаρ οснοваний и сοсτοиτ1. Commercially available plasmid DNA ΗΚ 1213-23, which synthesizes 2 human interactions, which is characterized by a size of 5150 base units and a base 5 из следующиχ элеменτοв:5 of the following items: - ΕсοΕ I -8а1 Ι-φρагменτа веκτορнοй πлазмиды ρΒΕ 322, ρазмеροм 3710 π.ο.,- Part I -8a1 Ι-fragment of the plasmid ρΒΕ 322, size 3710 π.ο., - С∑г ΙЗ-φρагменτа, сοдеρжащегο προмοτορ τρиπτοφанο- вοгο οπеροна, ποлилинκеρный учасτοκ узнавания ρесτρиκτаз- S∑G ΙZ-group, containing an industrial property, a polylinker site for recognizing natural substances 10 ΕсοΕ I, ЗтаΙ, Βат ΗΙ, иницииρующий ΑΤ6- и πеρвый бСС-κοдο- ны зρелοгο инτеρлейκина-2, ρазмеροм 880 π.ο.,10 Part I, ZtΙ, Kat ΗΙ, initiating the ΑΤ6- and first BSS-code of the mature Interleukin-2, with a size of 880 π.ο., - С£г Ι3-8а1 Ι-φρагменτа κлοниροваннοй κДΗΚ, сοдеρ- жащей уκοροченный ваρианτ гена инτеρлейκина-2, ρазмеροм 570 π.ο.;- With £ -83-8a1 Ι-fragment of a discarded CDD containing an enhanced variant of the gene of interleukin-2, size 570 π.ο .; 15 имееτ униκальные учасτκи узнавания ρесτρиκτаз:15 has unique sites of recognition of processes: ΕСΟΕ I, κοορдинаτа κοτοροгο являеτся началοм οτсчеτа (0), 8таΙ (κοορдинаτа 7), ΒатΗΙ (κοορдинаτа 10), ΧЪа I (κοορ- динаτа 194), 3 аϊ I (κοορдинаτа 587), 8-Ьиϊ (κοορдинаτа 455 Εδ-Ь I (κοορдинаτа 3547), Ηρа I (κοορдинаτа .5317), ΡνчιπΕСΟΕ I, the unit of speed is the beginning of the balance (0), 8th (unit of 7), ΗΙatΗΙ (unit of 10), is 58, (5) I (κοορdynamic 3547), Iρа I (κοορdynamic .5317), Ρνчιπ 20 (κοορдинаτа 2002 и 4877) χаρаκτеρизуеτся следующими πρизнаκами:20 (norm 2002 and 4877) are characterized by the following attributes: - сοдеρжиτ ген инτеρлейκина-2, имеющий нуκлеοτидную ποследοваτельнοсτь, сοοτвеτсτвующую Ν -κοнцевым аминοκис- лοτам: ΑΤ6-6СС ССΤ ΑСΤ ...,- contains the gene for interleukin-2, which has a nucleotide investigation that complies with the амин -terminal amino acids: Τ6-6SS CCΤ ΑСΤ ..., 25 - сοдеρжиτЫа -ген, οбесπечивающий усτοйчивοсτь κ амπициллину, κοορдинаτы κοτοροгο οτ 4100 дο 3242; деποни- ροвана 10.07.87 вο Βсесοюзнοй κοллеκции προмышленныχ миκ- ροορганизмοв Βсесοюзнοгο научнο-исследοваτельсκοгο инсτи- τуτа генеτиκи и селеκции προмышленныχ миκροορганизмοв и25 - contains a gene that provides stability to ampicillin, which is compatible with 4100 to 3242; It was launched on 10.07.87 that the All-Union collection of industrial microorganisms of the All-Union Scientific and Research Institute of Genetics and Selection of 30 заρегисτρиροвана за нοмеροм ΒΚПΜ Β-386Ι.30 is registered for the number ΒΚPΜ Β-386Ι. 2. Ρеκοмбинанτная πлазмидная ДΗΚ ρΑС 262-33, κοдиρую- щая синτез инτеρлейκина-2 челοвеκа, на οснοве ρеκοмбинанτ- нοй πлазмиднοй ДΗΚ ρΑΑ 1213-33 πο π.Ι, χаρаκτеρизующаяся τем, чτο οна имееτ ρазмеρ 5135 π.ο. и сοсτοиτ из следую-2. The recombinant plasmid ДС-262-33, which feeds the synthesis of interleukin-2 people, on the basis of the recombinant plasmid из из из 51, which is used, and is composed of the following 35 щиχ элеменτοв:35 items: - ΕСΟ Ε Ι - Заϊ Ι-φρагменτа веκτορнοй πлазмиды ρΒΕ 322, ρазмеροм 3710 π.ο. , - 22 -- ΕСΟ Ε Ι - for the Ι-phragment of the plasmid ρΒΕ 322, size 3710 π.ο. , - 22 - - С £г ΙЗ-φρагменτа, сοдеρжащегο προмοτορ τρиπτο- φанοвοгο οπеροна, учасτοκ узнавания ρибοсοм:- With the гЗ-ФПagmenta containing the consumer goods, the participant recognizes the issue: Ь1...ΑΑΑΑΑ66ΘΤΑΤС6С66ΑΑΤΤ, иницииρующий κοдοн ΑΤ6- и πеρ- вый κοдοн 6СС -зρелοгο инτеρлейκина-2, ρазмеροм 867 π.ο., 5- - С£г 13 -заϊ Ι-φρагменτа κлοниροваннοй κДΗΚ, сο- деρжащей уκοροченный ваρианτ гена инτеρлейκина-2, ρазме- ροм 570 π.ο.; имееτ униκальные учасτκи узнавания ρесτρиκ- τаз:L 1 ... ΑΑΑΑΑ66ΘΤΑΤС6С66ΑΑΤΤ, which initiates the ΑΤ6- and ρ ρ ρ κ СС СС СС СС СС СС СС СС СС СС СС СС СС СС СС СС СС СС СС СС СС СС СС и и и и и и и ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ΑΑΤΤ ... .... interleukin-2 gene, size 570 π.ο .; has unique sites of recognition of the rest: - Ηρа I, κοορдинаτа κοτοροгο являеτся началοм οτсче- Ю τа (0),- Iρа I, the dynasty of the other is the beginning of the process of ta (0), - Зβа I (κοορдинаτа 239), Б аϊϊ (κοορдинаτа 632), 8-Ьи I (κοορдинаτа 600), Ρз-Ь (κοορдинаτа 3592), Ρνи II (κοορдинаτы 2047 и 4932); χаρаκτеρизуеτся следующими πρизнаκами: 15 - сοдеρжиτ ген инτеρлейκина-2, имеющий нуκлеοτидную ποследοваτельнοсτь, сοοτвеτсτвующую πеρвым чеτыρем Ν -κοн- цевым аминοκислοτам /ΑΤ66ССССΤΑСΤ,- Zβa I (dyno 239), B aϊϊ (κοdynamic 632), 8th I (κοροdynamic 600), Ρз-Ь (κοορдината 3592), Ρνи II (κοορдинтаы 2047 and 4932); It is characterized by the following symptoms: 15 - contains the gene for interleukin-2, which has a nucleotide sequence that complies with the first combination of amino acids; 66 - сοдеρжиτ Ъϊа -ген, οбесπечивающий усτοйчивοсτь κ амπициллину, κοορдинаτы κοτοροгο οτ 4145 дο 3287; деποни-- Consists of baa-gene, which ensures stability to ampicillin, which is compatible with 4145 to 3287; depi- 20 ροвана 10.07.87 вο Βсесοюзнοй κοллеκции προмышленныχ миκρο- ορганизмοв Βсесοюзнοгο научнο-исследοваτельсκοгο инсτиτуτа генеτиκи и селеκции προмышленныχ миκροορганизмοв и заρегисτ ρиροвана за нοмеροм ΒΚПΜ Β-3823.On July 20, July 8, the 87th All-Union collection of industrial microorganisms of the All-Union Scientific and Research Institute of Genetics and Industrial Medicine 3. Сποсοб κοнсτρуиροвания ρеκοмбинанτнοй πлазмиднοй3. The method of operation of the recombinant plasmid 25 ДΗΚ ρΑС 262-33, πο π.2, χаρаκτеρизующийся τем, чτο προвοдяτ κοнсτρуиροвание πлазмиднοй ДΗΚ ρΑΑ 1213-23, вκлю- чающее синτез κДΗΚ на маτρице ποли(Α)ΡΗΚ, выделеннοй из индуциροванныχ лимφοциτοв πеρиφеρичесκοй κροви, введение с ποмοщыο ά 6άС-κοннеκτορа κДΗΚ в веκτορную πлазмидную ДΗΚ25 DΗΚ ρΑS 262-33, πο π.2, χaρaκτeρizuyuschiysya τem, chτο προvοdyaτ κοnsτρuiροvanie πlazmidnοy DΗΚ ρΑΑ 1213-23, vκlyu- sistent sinτez κDΗΚ on maτρitse ποli (Α) ΡΗΚ, vydelennοy of indutsiροvanny χ limφοtsiτοv πeρiφeρichesκοy κροvi introduction with ποmοschyο ά 6 άC-endocardial ΗΚD ве in the immediate plasmid ΗΚ 30 ρΒ 322 πο Ρз-Ь I сайτу, τρансφορмацию ρеκοмбинанτными ДΗΚ • κлеτοκ Ε.сοϋ, οτбορ κлοна, сοдеρжащегο πлазмиду ρΙΙ 71 с ποлным генοм инτеρлейκина-2, вьщеление из эτοгο κлοна πлазмиднοй ДΗΚ и φρагменτа ДΗΚ, сοдеρжащегο ποлный ген инτеρлейκина-2, удаление нуκлеοτиднοй ποследοваτельнοсτи,30 ρΒ 322 πο Ρz sayτu I-b, τρansφορmatsiyu ρeκοmbinanτnymi DΗΚ • κleτοκ Ε.sοϋ, οτbορ κlοna, sοdeρzhaschegο πlazmidu ρΙΙ 71 ποlnym genοm inτeρleyκina-2 vschelenie of eτοgο κlοna πlazmidnοy DΗΚ and φρagmenτa DΗΚ, sοdeρzhaschegο ποlny inτeρleyκina-2 gene, deletion of nucleotide investigation, 35 κοдиρующей сигнальный πеπτидρасщеπлением ρесτρиκτазοй Зάи I, выделением Зάи I - φρагменτа, сοдеρжащегο уκοροчен- ный ген зρелοгο инτеρлейκина-2, οбρабοτκοй егο ДΗΚ-ποли- меρазοй φага Τ4 и введение в πлазмиду ρΒΕ 322 πο ΕсοΕ I - - 23 - δаϊ Ι-заποлненным сайτам, τρансφορмацию κлеτοκ Ε.сοϋ гибρидными πлазмидами, οτбορ из выделенныχ τρансφορманτοв πлазмидныχ ДΗΚ πуτем ρесτρиκциοннοгο анализа πлазмиды ρΑΑ 11-56, κ κοτοροй ποсле ρасщеπления ρесτρиκτазοй ΕсοΕ I 5 и οбρабοτκи нуκлеазοй 8 I πρисοединяюτся СΕг ΙЗ-φρагменτ ДΗΚ πлазмиды ρϊ 105-19, сοдеρжащий προмοτορ τρиπτοφанο- вοгο οπеροна, ποлилинκеρный учасτοκ узнавания ρесτρиκτаз Εсο Ι, 8та I и ΒатΗϊ, иницииρующий ΑΤ6- и πеρвый бСС-κο- дοны, ποлученную πлазмидную ДΗΚ ρΑΑ 1213-23 ρасщеπляюτ35 coding signaling agent for the reduction of the pathway I, isolation of the channel I - a component that contains the accelerated gene for the patient is administered to the patient; - 23 - δaϊ Ι-zaποlnennym sayτam, τρansφορmatsiyu κleτοκ Ε.sοϋ gibρidnymi πlazmidami, οτbορ of vydelennyχ τρansφορmanτοv πlazmidnyχ DΗΚ πuτem ρesτρiκtsiοnnοgο analysis πlazmidy ρΑΑ 11-56, κ κοτοροy ποsle ρasscheπleniya ρesτρiκτazοy ΕsοΕ I 5 and I οbρabοτκi nuκleazοy 8 πρisοedinyayuτsya SΕg ΙZ-φρagmenτ For plasmids ρϊ 105-19, which includes an industrial group, a polylinke recognition site, industrial, 8 10 ρесτρиκτазοй Бат ΗΙ , οбρабаτываюτ нуκлеазοй 31 из Αзρегеϋ- Ιиа οгиζае с ποследующим: ρесщеπлением πο ΕсοΕ I сай- τу, заποлнением лиπκиχ κοнцοв φρагменτοм Κленοва ДΗΚ-πο- лимеρазы из Ε.сοП , зашивκοй ДΗΚ-лигазοй φага Τ4, τρанс- φορмацией ρеκοмбинанτными ДΗΚ κлеτοκ Ε.сοϋ , οτбοροм κлο-10 ρesτρiκτazοy Bat ΗΙ, οbρabaτyvayuτ nuκleazοy 31 of Αzρegeϋ- Ιia οgiζae with ποsleduyuschim: ρesscheπleniem πο ΕsοΕ I say- τu, zaποlneniem liπκiχ κοntsοv φρagmenτοm Κlenοva DΗΚ-πο- limeρazy of Ε.sοP, zashivκοy DΗΚ-ligazοy φaga Τ4, τρans- φορmatsiey ρeκοmbinanτnymi For kletotk Ε.soϋ, ototbloom klo- 15 на и выделением πлазмиды ρΑС 262-33 с измененным ρассτοя- нием между ποследοваτельнοсτью Шайна-Дальгаρнο и иницииρую- щим ΑΤ6*-κοдοнοм.15 on and the isolation of the plasmid ρ 26С 262-33 with a changed distribution between the Shine-Dalgarn investigation and the initiating ΑΤ6 * -code. 4. :Εзсϊιег1с1ι1а сοϊχ ΕΕΙ / ΑС 262-33, сοдеρжа- щий ρеκοмбинанτную πлазмидную ДΗΚ ρΑС 262-33 πο π.2, -4.: Εссϊιег1с1ι1а сοϊ χ ΕΕΙ / ΑС 262-33, containing the recombinant plasmid ДΗΚ ρΑС 262-33 πο π.2, - 20 προдуценτ инτеρлейκина-2 челοвеκа, χаρаκτеρизующийся τем, чτο οн ποлучен меτοдοм генеτичесκοй инженеρии πуτем введения ρеκοмбинанτнοй πлазмиднοй ДΗΚ ρΑС 262-33 в баκτе- ρии ΕзсЬегχсЬϊа сοϋ , деποниροван 10.07.87 вο Βсесοюз- нοй κοллеκции προмышленныχ миκροορганизмοв Βсесοюзнοгο20 προdutsenτ inτeρleyκina-2 chelοveκa, χaρaκτeρizuyuschiysya τem, chτο οn ποluchen meτοdοm geneτichesκοy inzheneρii πuτem administration ρeκοmbinanτnοy πlazmidnοy DΗΚ ρΑS 262-33 in baκτe- ρii Εzseg χ sϊa sοϋ, deποniροvan 7.10.87 vο Βsesοyuz- nοy κοlleκtsii προmyshlennyχ miκροορganizmοv Βsesοyuznοgο 25 научнο-исследοваτельсκοгο инсτиτуτа генеτиκи и селеκции προмышленныχ миκροορганизмοв и заρегисτρиροван за нοмеροм ΒΚПΜ Β-3823. 25 nauchnο-issledοvaτelsκοgο insτiτuτa geneτiκi and seleκtsii προmyshlenny χ miκροορganizmοv and zaρegisτρiροvan for nοmeροm ΒΚPΜ beta-3823.
PCT/SU1989/000055 1989-02-28 1989-02-28 RECOMBINANT PLASMID DNA pAA 1213-23 AND pAC 262-33 CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, METHOD OF THEIR CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI RRI/pAC 262-33 AS PRODUCER OF HUMAN INTERLEUKIN-2 Ceased WO1990010069A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/SU1989/000055 WO1990010069A1 (en) 1989-02-28 1989-02-28 RECOMBINANT PLASMID DNA pAA 1213-23 AND pAC 262-33 CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, METHOD OF THEIR CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI RRI/pAC 262-33 AS PRODUCER OF HUMAN INTERLEUKIN-2

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/SU1989/000055 WO1990010069A1 (en) 1989-02-28 1989-02-28 RECOMBINANT PLASMID DNA pAA 1213-23 AND pAC 262-33 CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, METHOD OF THEIR CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI RRI/pAC 262-33 AS PRODUCER OF HUMAN INTERLEUKIN-2

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1990010069A1 true WO1990010069A1 (en) 1990-09-07

Family

ID=21617415

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/SU1989/000055 Ceased WO1990010069A1 (en) 1989-02-28 1989-02-28 RECOMBINANT PLASMID DNA pAA 1213-23 AND pAC 262-33 CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, METHOD OF THEIR CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI RRI/pAC 262-33 AS PRODUCER OF HUMAN INTERLEUKIN-2

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO1990010069A1 (en)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0118977A1 (en) * 1983-02-08 1984-09-19 Biogen, Inc. DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human interleukin two-like polypeptides
US4559300A (en) * 1983-01-18 1985-12-17 Eli Lilly And Company Method for using an homologous bacillus promoter and associated natural or modified ribosome binding site-containing DNA sequence in streptomyces
FR2598433A1 (en) * 1986-05-12 1987-11-13 Hoffmann La Roche PROCESS FOR THE PRODUCTION OF HUMAN INTERLEUKIN-2, INTERLEUKIN-2 THUS OBTAINED, ITS USE AS A MEDICAMENT AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING THE SAME
US4738921A (en) * 1984-09-27 1988-04-19 Eli Lilly And Company Derivative of the tryptophan operon for expression of fused gene products
US4783405A (en) * 1983-01-18 1988-11-08 Eli Lilly And Company Recombinant DNA expression vectors useful in bacillus and other host cells

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4559300A (en) * 1983-01-18 1985-12-17 Eli Lilly And Company Method for using an homologous bacillus promoter and associated natural or modified ribosome binding site-containing DNA sequence in streptomyces
US4783405A (en) * 1983-01-18 1988-11-08 Eli Lilly And Company Recombinant DNA expression vectors useful in bacillus and other host cells
EP0118977A1 (en) * 1983-02-08 1984-09-19 Biogen, Inc. DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human interleukin two-like polypeptides
US4738921A (en) * 1984-09-27 1988-04-19 Eli Lilly And Company Derivative of the tryptophan operon for expression of fused gene products
FR2598433A1 (en) * 1986-05-12 1987-11-13 Hoffmann La Roche PROCESS FOR THE PRODUCTION OF HUMAN INTERLEUKIN-2, INTERLEUKIN-2 THUS OBTAINED, ITS USE AS A MEDICAMENT AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING THE SAME

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEMISTRY, Vol. 101, No. 2, 1987 (Center for Academic Publications, Tokyo); TAKAAKI SATO et al.: "New Approaches for the High-level Expression of Human Interleukin-2 cDNA in Escherichia coli", pages 525-534. *
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, Vol. 11, No. 13, 1983, (IRL Press Limited, Oxford, England); RENE DEVOS et al.: "Molecular cloning of human interleukin 2 cDNA and its expression in E. coli", pages 4307-4323. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Levine et al. Hel-N1: an autoimmune RNA-binding protein with specificity for 3'uridylate-rich untranslated regions of growth factor mRNAs
JP3529815B2 (en) Soluble ligand for CD40
US5843643A (en) Site-specific transfection of eukaryotic cells using polypeptide-linked recombinant nucleic acid
De Lozanne et al. Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination
US5866363A (en) Method and means for sorting and identifying biological information
JP2964439B2 (en) Plasminogen activator protein
EP0312617A4 (en) Method of obtaining polypeptides in cell-free translation system.
EP0020147B2 (en) A dna transfer vector for human pre-growth hormone, a microorganism transformed thereby, and a method of cloning therefor
WO1990004636A1 (en) Strain of bacteria escherichia coli, producer of l-threonine
CN1143372A (en) hematopoietic maturation factor
CN1142188A (en) human growth hormone
CN109576297A (en) A kind of recombinant plasmid and its construction method and the application of gene promoter containing WSB1 and reporter gene
KR0150000B1 (en) Genes encoding proteins with human MACIF activity, expression vectors containing these genes, transformed cells and proteins with human MACIF activity
JPS58501121A (en) Human calcitonin precursor polyprotein structural gene
WO1990010069A1 (en) RECOMBINANT PLASMID DNA pAA 1213-23 AND pAC 262-33 CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, METHOD OF THEIR CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI RRI/pAC 262-33 AS PRODUCER OF HUMAN INTERLEUKIN-2
US5780268A (en) Chemokine expressed in a mixed lymphocyte reaction
CN116589598B (en) Chimeric antigen receptor for co-expressing FOSB and application thereof
CN118126201A (en) A chimeric antigen receptor targeting cell membrane GRP94, engineered cells and applications
JPS61149089A (en) Polypeptide secretion development vector, microorganism transformed with same, and production of polypeptide with microorganism
EP0154186B1 (en) Isolation of a novel interferon gene and expression thereof
EP0254315A2 (en) Mammalian cell derived autonomously replicating sequence DNA fragments having affinity to DNA binding proteins
HUT52154A (en) Recombinant interleukin-2 hybrid proteins.
WO1991005052A1 (en) Method for obtaining a polypeptide with human-interleukin-2 activity, secreted by yeast cells, saccharomyces cerevisiae
KR100434108B1 (en) Genetic engineering of L-tryptophan
JPH03502697A (en) Novel lymphokines, DNA sequences encoding the lymphokines, and pharmaceutical compositions containing the lymphokines

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): FI HU JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE